CN1929734A - 含卵泡抑素区的蛋白质 - Google Patents
含卵泡抑素区的蛋白质 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1929734A CN1929734A CN 03808989 CN03808989A CN1929734A CN 1929734 A CN1929734 A CN 1929734A CN 03808989 CN03808989 CN 03808989 CN 03808989 A CN03808989 A CN 03808989A CN 1929734 A CN1929734 A CN 1929734A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gasp1
- leu
- pro
- ala
- val
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及用包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质GASP1调节生长和分化因子－8(GDF－8)的水平或活性。更具体而言，本发明涉及GASP1在治疗与GDF－8水平或活性的调节相关的病症方面的用途。本发明可用于治疗肌肉疾病和病症，尤其是肌肉组织的增加将有利于治疗的疾病。本发明也可用于治疗与代谢、脂肪组织及骨变性相关的疾病和病症。
Description
本申请要求2002年2月21日提交的美国临时申请No.60/357,845，和2002年12月20日提交的美国临时申请No.60/434,644的权益。
发明领域
本发明涉及用包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质调节生长和分化因子-8(GDF-8)的水平或活性。更具体而言，本发明涉及包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质，不包括卵泡抑素本身，在治疗与GDF-8水平或活性的调节相关病症方面的用途。本发明可用于治疗肌肉疾病和病症，尤其是肌肉组织的增加将有利于治疗的疾病。本发明也可用于治疗与代谢、脂肪组织及骨变性相关的疾病和病症。
发明背景
生长和分化因子-8(GDF-8)也被称为myostatin，是结构相关的生长因子组成的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员，其中所有的结构相关生长因子均具有重要的生理学生长调节和形态发生特性(Kingsley et al.(1994)Genes Dev.，8：133-46；Hoodless et al.(1998)Curr.Topics Microbiol.Immunol.，228：235-72)。GDF-8是骨骼肌群的负调节因子，在鉴定可调节骨骼肌群生物学活性的因子方面具有相当大的重要性。例如，GDF-8高度表达于发育中和成熟的骨骼肌内。在转基因小鼠体内GDF-8无效突变的特征为骨骼肌的显著肥大和增生(McPherron et al.(1997)Nature，387：83-90)。类似的骨骼肌群增加现象在牛体内自然发生的GDF-8突变中也很显著(Ashmore et al.(1974)Growth，38：501-507；Swatland and Kieffer(1994)J.Anim.Sci.，38：752-757；McPherron and Lee(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，94：12457-12461；及Kambadur et al.(1997)Genome Res.，7：910-915)。最近的研究也显示与人体HIV感染相关的肌肉消耗伴随着GDF-8蛋白表达的提高(Gonzalez-Cadavid et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，95：14938-43)。此外，GDF-8可调节肌特异酶(如肌酸激酶)的生成，和调节成肌细胞的增殖(WO 00/43781)。
许多人类和动物病症都与肌肉组织的丧失或功能性损伤有关。迄今为止，针对这些病症的可靠或有效疗法非常少。不过，与这些病症相关的可怕症状可通过实施增加该病症患者体内肌肉组织数量的疗法基本上得以减轻。虽然不能治愈病症，但该疗法将有效提高这些患者的生命质量，并改善这些疾病的某些影响。因此，本领域需要确定可促使这些病症患者体内肌肉组织全面增加的新疗法。
除了在骨骼肌内具有生长调节和形态发生特性外，GDF-8也与其它许多生理过程(如葡萄糖体内平衡)和异常状况，如2型糖尿病及脂肪组织病症的发展，如肥胖症有关。例如，GDF-8调节前成脂肪细胞分化为脂肪细胞(Kim et al.(2001)B.B.R.C.281：902-906)。因此，GDF-8的调节作用也可能可用于治疗这些疾病。
GDF-8蛋白作为前体蛋白被合成，由氨基末端前肽与羧基末端成熟区组成(McPherron and Lee，(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，94：12457-12461)。裂解前，前体GDF-8蛋白形成了同型二聚体。继而，氨基末端前肽与成熟区裂解分开。裂开的前肽可能仍与成熟区二聚体非共价结合，钝化了其生物学活性(Miyazono et al.(1988)J.Biol.Chem.，263：6407-6415；Wakefield et al.(1988)J.Biol.Chem.，263：7646-7654；和Brown et al.(1990)Growth Factors，3：35-43)。人们认为是两个GDF-8前肽与GDF-8成熟二聚体结合(Thies et al.(2001)Growth Factors，18：251-259)。因该钝化特性，前肽被称为“潜在结合肽”(LAP)，成熟区与前肽的复合体通常被称为“小潜伏复合体”(Gentry and Nash(1990)Biochemistry，29：6851-6857；Derynck et al.(1995)Nature，316：701-705；和Massague(1990)Ann.Rev.Cell Biol.，12：597-641)。已知也有其它蛋白质可与GDF-8或结构相关蛋白质结合，并抑制它们的生物学活性。这种抑制性蛋白包括卵泡抑素(Gamer et al.(1999)Dev.Biol.，208：222-232)。GDF-8的成熟区被认为在移除前肽时可作为同型二聚体具有活性。
显然，GDF-8与许多关键性生物过程的调节有关。因其在这些过程中的关键功能，GDF-8可能是理想的治疗干预对象。具体而言，可抑制GDF-8活性的治疗剂可用于治疗某些增加肌肉组织将有利于治疗的人类或动物病症。
已知包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质在许多生物过程中起作用，尤其是在TGF-β超家族信号调节和细胞外基质介导过程，如细胞粘附的调节中。卵泡抑素、卵泡抑素相关基因(FLRG、FSRP)和卵泡抑素相关蛋白(FRP)均与TGF-β信号连接，或者是借助于TGF-β的转录调节(Bartholin et al.(2001)Oncogene，20：5409-5419；Shibanumaet al.(1993)Eur.J.Biochem.217：13-19)，或者是借助于其对抗TGF-β信号途径的能力(Phillips and de Kretser(1998)Front.Neuroendocrin.，19：287-322；Tsuchida et al.(2000)J.Biol.Chem.，275：40788-40796；Patel et al.(1996)Dev.Biol.，178：327-342；Amthoret al.(1996)Dev.Biol.，178：343-362)。括号内的蛋白质名称为可选名称。
包含至少一个卵泡抑素区的胰岛素生长因子结合蛋白7(IGFBP7，mac25)与胰岛素结合，阻断了其与胰岛素受体随后的相互作用。此外，IGFBP7已显示可与TGF-β家族成员，即活化素结合(Kato(2000)Mol.Med.，6：126-135)。
分泌自神经细胞的集聚素和集聚素相关蛋白含有超过9个的卵泡抑素区，可促进与突触形成相关的乙酰胆碱受体和其它分子的聚集。已有人提出卵泡抑素区可能在使生长因子定位于突触方面起作用(Patthy et al.(1993)Trends Neurosci.，16：76-81)。
骨联蛋白(SPARC，BM40)和hevin(SC1，mast9，QR1)是可与细胞外基质蛋白相互作用，并调节细胞生长和粘着的密切相关蛋白(Motamed(1999)Int.J.Biochem.Cell.Biol.，31：1363-1366；Girardand Springer(1996)J.Biol.Chem.，271：4511-4517)。这两种蛋白质均包含至少一个卵泡抑素区。
其它卵泡抑素区蛋白也已有描述或公开于NCB1数据库(NationalCenter for Biotechnology Information，Bethesda，Maryland，USA)，但其功能目前尚未知。这些蛋白质包括U19878(G01639，非常类似于tomoregulin-1)、T46914、人类GASP1(GDF连接血清蛋白1；此文有所描述；图7)、人类GASP2(WFIKKN；Trexler et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，98：3705-3709；图9)，和testican(SPOCK)蛋白质的蛋白聚糖家族(Alliel et al.(1993)Eur.J.Biochem.，214：347-350)。对应于小鼠GASP1(图6)和小鼠GASP2(图8)的氨基酸和核苷酸序列也可由Celera数据库(Rockville，MD)得以确定。如此处所描述的，除了摆动密码子中某些并不会改变预测氨基酸序列的碱基取代外，克隆小鼠GASP1的核苷酸序列与预测Celera序列相匹配(见图13)。
发明概述
相应地，本发明涉及除卵泡抑素之外，具有一个独特结构特征，即存在至少一个卵泡抑素区的蛋白质。卵泡抑素本身并不被涵盖于本发明。包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可特异地与下列无论哪一种形式的成熟GDF-8蛋白或其片段反应，即单体形式、二聚体活性形式，或GDF-8潜伏复合体中的复合形式。包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可与成熟GDF-8蛋白上的表位结合，与未结合相同蛋白质的成熟GDF-8蛋白相比，前一种情况可令与GDF-8相关的一种或多种生物学活性降低。
本发明提供了调节GDF-8对细胞的效应的方法。该方法包括施用有效量的包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质。本发明也包括通过施用编码了包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的DNA分子，从而在细胞内表达蛋白质的方法。
根据本发明，包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可以按治疗有效剂量施用于患者，以治疗或预防那些增加肌肉组织将有利于治疗的医学病症。实施方案包括对含有与GDF-8的产生、代谢或活性相关的细胞和组织的疾病、病症及损伤的治疗。
包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可以被制备到药物制剂中。该药物制剂可包含其它组分，该组分应可用于结合下列无论哪一种形式的成熟GDF-8蛋白或其片段，即单体形式、二聚体活性形式或GDF-8潜伏复合体中的复合形式。
此外，包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可作为诊断工具定量或定性地检测下列无论哪一种形式的成熟GDF-8蛋白或其片段，即单体形式、二聚体活性形式或GDF-8潜伏复合体中的复合形式。例如，包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可用于检测细胞、体液、组织或器官中GDF-8蛋白的存在、缺乏情况或数量。所检测成熟GDF-8蛋白的存在情况或数量可能与此处所列的一种或多种医学病症相关联。
包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可以被提供到于诊断试剂盒中，以检测下列无论哪一种形式的成熟GDF-8蛋白或其片段，即单体形式、二聚体活性形式，或GDF-8潜伏复合体中的复合形式，并可帮助将结果与此处所描述的一种或多种医学状况联系起来。该试剂盒可以包括至少一种已标记或未标记的上述蛋白质，即包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质，以及至少一种可与该蛋白质结合的物质，如标记抗体。该试剂盒也可包括便于比较实验检测结果的合适生物学标准和对照样品。也可包括缓冲剂或洗涤溶液，以及使用该试剂盒的说明书。还可包括若干可用于实施实验的结构零件，如棍、珠、纸、柱体、小瓶或凝胶。
附图简述
图1所示为从野生型小鼠血清中抗体纯化GDF-8复合体的结果。银染色还原胶显示了利用与琼脂糖珠共价偶联的JA16单克隆抗体从野生型小鼠血清中纯化获得的蛋白质。平行进行利用模拟偶联珠的对照纯化(0)。随后采用缓冲液(模拟洗脱)、竞争肽和SDS样品缓冲液进行洗脱，明显可见两条从JA16结合珠上用肽特异洗脱的蛋白质条带(箭头所示)。
图2所示为对正常小鼠血清来源的亲和纯化样品中成熟和未加工GDF-8的鉴定结果。图2A所示为由可见于该亲和纯化样品中12kDa条带所鉴定的GDF-8衍生肽(SEQ ID NO：19)的代表性MS/MS图谱。N末端片段离子(b离子)与C末端片段离子(y离子)均可见。值得注意的是，最强烈的y片段离子生成自脯氨酸残基前的断裂，该断裂为含脯氨酸肽的一般特性。图2B所示为以可识别GDF-8成熟区的多克隆抗体为探针的蛋白质印迹分析结果，证实该亲和纯化样品中存在GDF-8。成熟和未加工形式的GDF-8均可见。
图3所示为GDF-8前肽和卵泡抑素样相关基因(FLRG)结合到分离自正常小鼠血清的循环GDF-8。显示了在36kDa条带中鉴定的GDF-8前肽(SEQ ID NO：23)(图3A)和FLRG(SEQ ID NO：30)(图3C)衍生肽的代表性MS/MS图谱。图3B所示为以可特异识别GDF-8前肽区的多克隆抗体为探针，对亲和纯化的GDF-8复合体进行的蛋白质印迹分析，证实了质谱对GDF-8复合体中该蛋白质的鉴定结果。曝光时间较长时，截短的前肽和未加工的GDF-8均可见，未加工的GDF-8也可见于SDS洗脱样品中。图3D所示为以FLRG的单克隆抗体为探针，对亲和纯化的GDF-8复合体进行蛋白质的印迹分析。
图4所示为大规模纯化GDF-8的完整分析结果，该分析可鉴定GDF-8前肽、FLRG和一种新蛋白质是血清中主要的GDF-8结合蛋白。将由阴性对照和JA16免疫沉淀的肽洗脱样品获得的银染胶分为13份。用胰蛋白酶消化每一份中的蛋白质，并利用纳米流-LC-MS/MS和数据库搜索进行鉴定。独特出现于JA16样品的蛋白质仅包括未加工和成熟GDF-8、GDF-8前肽、FLRG和一种新的多区域蛋白酶抑制因子(GDF连接血清蛋白1，GASP1)。从凝胶的标注区域可鉴定出这些蛋白质。
图5所示为一种可与血清中GDF-8结合的新的多区域蛋白酶抑制因子，GASP1。图5A(被指定为SEQ ID NO：31的肽)和5B(被指定为SEQ ID NO：33的肽)显示了图4银染胶的条带3中所鉴定的两种GASP1肽的代表性MS/MS图谱。
图6A所示为小鼠GASP1的预测核苷酸序列。图6B所示为小鼠GASP1的预测可选核苷酸序列。图6C所示为由图6A和6B所显示核苷酸序列编码的预测氨基酸序列。分别由两个核苷酸序列编码的蛋白质序列一致，是因为其核苷酸差异全部存在于摆动密码子位置中。卵泡抑素区以粗体和下划线显示。
图7A所示为人类GASP1的预测核苷酸序列。图7B所示为相应的预测氨基酸序列。卵泡抑素区以粗体和下划线显示。图7C所示为利用一个可选起始位点预测的人类GASP1核苷酸序列。图7D所示为相应的预测氨基酸序列。卵泡抑素区以粗体和下划线显示。该序列的末端由星号标示。
图8A所示为小鼠GASP2的预测核苷酸序列，图8B所示为相应的预测氨基酸序列。卵泡抑素区以粗体和下划线显示。
图9A所示为人类GASP2的预测核苷酸序列，图9B所示为相应的预测氨基酸序列。卵泡抑素区以粗体和下划线显示。
图10所示为在许多成体组织中及发育期间表达的小鼠GASP1。该图显示了小鼠GASP1的组织表达分布图。GASP1的一个551bp片段扩增自Clontech公司的一系列标准化首链cDNA(Palo Alto，CA)。扩增一部分甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)作为对照。已知G3PDH在骨骼肌中表达高，而在睾丸中表达低。该一系列cDNA除针对G3PDH外，还对β-肌动蛋白、磷脂酶A2和核糖体蛋白S29进行了标准化。
图11所示为分离自人类血清的蛋白质。JA16免疫沉淀或对照样品(0)中的蛋白质洗脱于模拟PBS洗脱、竞争肽洗脱或SDS洗脱过程中。用胰蛋白酶消化凝胶标示区中的蛋白质，并利用LS-MS/MS和数据库搜索分析。JA16样品中存在，而对照样品中无的蛋白质为成熟GDF-8(条带16)、GDF-8前肽和FLRG(条带11)，和人类GASP1(条带4)。图11B所示为以可识别成熟GDF-8的抗体为探针，对相同JA16免疫沉淀进行蛋白质印迹分析的结果。可见与分离自人类血清的成熟和未加工GDF-8对应的条带。
图12所示为GDF-8衍生肽和分离自条带4、11和16(图11)的相关蛋白质的代表性质谱图。显示了该肽序列、N末端(b离子)和C末端(y离子)。表1提供了所鉴定肽的完整列表。所示图谱分别来自GASP1肽(SEQ ID NO：44)(图12A)、FLRG肽(SEQ ID NO：41)(图12B)、GDF-8前肽肽(SEQ ID NO：24)(图12C)和成熟GDF-8肽(SEQ ID NO：13)(图12D)。
图13所示为克隆小鼠GASP1的核苷酸(SEQ ID NO：48)和氨基酸(SEQ ID NO：49)序列。下划线标出了通过质谱分析在JA16亲和纯化样品中鉴定出的肽。序列末端由星号标示。
图14A所示为GASP1的区域结构。GASP1在氨基酸29后具有一个信号序列/裂解位点。此外，GASP1含有两个Kunitz/BPTI丝氨酸蛋白酶抑制因子区、一个卵泡抑素区(包括一个Kazal丝氨酸蛋白酶抑制因子基序)和一个netrin区，可抑制金属蛋白酶。图14B所示为由小鼠和人类基因组序列预测的GASP1和GASP2的系统树。小鼠与人类GASP1有90％的一致性。GASP1与GASP2有54％的一致性。
图15所示为重组生成的GASP1分别与GDF-8和GDF-8前肽结合。(A)JA16被用于免疫沉淀模拟或GASP1-V5-His所转染COS细胞条件培养基中的GDF-8，该条件培养基补充有重组纯化的GDF-8和/或前肽。抗V5(上排)、抗GDF-8(中排)，或抗前肽多克隆抗体的蛋白质印迹被用于确定这些蛋白质是否存在于免疫沉淀中。(B)重组生成的GASP1蛋白是由抗V5标记抗体从模拟或GASP1-V5-His条件培养基中免疫沉淀的，该条件培养基补充有重组纯化的GDF-8和/或前肽。免疫沉淀通过蛋白质印迹分析，如(A)。
图16所示为GASP1抑制GDF-8和高度相关BMP-11的生物学活性，而不抑制活化素或TGF-β的生物学活性。将来自模拟(空心圆)或GASP1-V5-His(实心方框)转染物的不同稀释度条件培养基分别和(A)10ng/ml GDF-8、(B)10ng/ml BMP-11、(C)10ng/ml活化素或(D)0.5ng/ml TGF-β进行温育。继而在A204(A-C)或RD(D)细胞中对这些样品进行荧光素酶报告物活性分析，以确定所添加生长因子的活性。荧光素酶活性以相对荧光素酶单位表示。各生长因子单独产生的活性由实心方框和短虚线表示。未添加任何生长因子时，分析中的背景活性低，如无标记符号的长虚线所示。
图17所示为GASP1抑制GDF-8的潜力。在RD细胞中进行(CAGA)12(SEQ ID NO：53)荧光素酶报告物分析，检验可知已纯化GASP1可抑制20ng/ml myostatin。GDF-8单独产生的活性由实心方框和短虚线表示。未添加生长因子时的活性由长虚线表示。
定义
术语“卵泡抑素区”指一个氨基酸区，或编码一个氨基酸区的核苷酸区，其特征为富含半胱氨酸的重复(片段)。卵泡抑素区典型地包括一个65-90的氨基酸跨距，并含有10个保留半胱氨酸残基，以及一个类似于Kazal丝氨酸蛋白酶抑制因子区的区域。通常，半胱氨酸残基之间的环状区在卵泡抑素区中表现出序列可变性，但某些保守性是明显的。第4与第5个半胱氨酸之间的环状结构往往较小，仅含1或2个氨基酸。第7和第8个半胱氨酸之间的环状结构中的氨基酸通常被最大程度地保留，含有一个共有序列，即(G，A)-(S，N)-(S，N，T)-(D，N)-(G，N)，及相继的(T，S)-Y基序。第9和第10个半胱氨酸之间的区域通常含有一个包含两个疏水残基(特定地V，I或L)的基序，其中这两个疏水残基被另一个氨基酸分隔开。
术语“包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质”指包含至少一个，也可能超过一个卵泡抑素区的蛋白质。该术语也指这种蛋白质的任何变体(包括片段；存在取代、添加或缺失突变的蛋白质；和融合蛋白)，该变体保留已知与天然蛋白相关的生物学活性，尤其是那些属于GDF-8结合活性的生物学活性，并且包括氨基酸序列已经由保守或非保守性变化修饰获得的序列。这些蛋白质可能有多种来源，天然或合成的。可能是人类的，或来源自动物，包括牛、鸡、鼠类、大鼠、猪、绵羊、火鸡、狒狒和鱼。卵泡抑素本身未涵盖于本发明。
术语“GDF-8”或“GDF-8蛋白”指一种特异性生长和分化因子。该术语包括该蛋白质的全长未加工前体形式，和翻译后裂解产生的成熟和前肽形式。该术语也指GDF-8的任何片段，该片段保留了已知与该蛋白质相关的生物学活性，包括氨基酸序列已经由保守或非保守性变化修饰获得的序列。GDF-8分子可能有多种来源，天然或合成的。可能是人类的，或来源自动物，包括牛、鸡、鼠类、大鼠、猪、绵羊、火鸡、狒狒和鱼。McPherron et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：12457-12461中描述了多种GDF-8分子。
“成熟GDF-8”指裂解自GDF-8前体蛋白羧基末端区的蛋白质。成熟GDF-8的存在形式可能为单体、同型二聚体，或GDF-8潜伏复合体中的复合形式。根据体内或体外条件，成熟GDF-8可在任意几种或全部的上述不同形式之间建立平衡。人们认为具有生物学活性的是同型二聚体形式。生物学活性形式的成熟GDF-8也被称为“活性GDF-8”。
“GDF-8前肽”指裂解自GDF-8前体蛋白氨基末端区的多肽。GDF-8前肽可与成熟GDF-8上的前肽结合区结合。
“GDF-8潜伏复合体”指成熟GDF-8同型二聚体与GDF-8前肽之间形成的蛋白质复合体。人们认为是两个GDF-8前肽与同型二聚体中的两个成熟GDF-8分子连接，形成了无活性的四聚复合体。潜伏复合体可能包括其它的GDF抑制因子以取代一个或多个GDF-8前肽，或者是除一个或多个GDF-8前肽之外另外包括这些GDF抑制因子。
术语“GDF-8活性”指活性GDF-8蛋白所关联的一种或多种生理学生长调节或形态发生活性。例如，活性GDF-8为骨骼肌的负调节因子。活性GDF-8也可调节肌特异酶(如肌酸激酶)的产生、刺激成肌细胞增殖，并调节前脂细胞分化为脂细胞。GDF-8也被认为可提高对胰岛素的灵敏度，及外周组织，尤其是在骨骼肌或脂细胞中的葡萄糖摄取。相应地，GDF-8生物学活性包括但不仅限于抑制肌肉形成、抑制肌细胞生长、抑制肌肉发育、减少肌肉质量、调节肌特异酶、抑制成肌细胞增殖、调节前脂细胞分化为脂细胞、提高对胰岛素的灵敏度、调节葡萄糖摄取、葡萄糖体内平衡，以及调节神经元细胞的发育和维持。
术语“已分离”或“已纯化”指基本上脱离其自然环境的分子。例如，已分离蛋白基本上不含其来源的细胞或组织中所含有的细胞物质或其它杂质蛋白。术语“基本上不含细胞物质”指已分离蛋白的纯度至少为70％-80％(w/w)、至少80％-89％(w/w)、至少90％-95％(w/w)或至少96％、97％、98％、99％或100％(w/w)的制剂。
术语“LC-MS/MS”指程序化设定用于分离特定质量/电荷比的分子离子，断裂该离子，并记录该断裂离子质量/电荷比的液相色谱及相连的质谱仪。分析肽样品时，该技术可通过液相色谱，继而记录断裂离子质量，随后确定该肽序列，从而实现复杂样品的上游分离。
术语“MS/MS”指利用质谱仪分离特定质量/电荷比的分子离子、断裂该离子，并记录该断裂离子质量/电荷比的方法。断裂离子提供了有关肽序列的信息。
术语“治疗”指治疗方法和预防性措施。需要治疗的对象可包括已患有特定医学病症的个体，以及可能最终患有该病症的个体(即需要预防性措施的个体)。术语“治疗”包括可确定病症潜在原因的措施，以及可缓解医学病症的症状，但并不一定影响其病因的措施。因此，生命质量的提高和症状的缓解均被认为是治疗，即可消除病症原因的措施。
术语“医学病症”指肌肉、骨或葡萄糖体内平衡的病症，包括与GDF-8和/或TGF-β超家族的其它成员(如BMP-11)相关的病症。这种病症实例包括但不仅限于代谢疾病和下述病症，诸如胰岛素依赖性(1型)糖尿病、非胰岛素依赖性(2型)糖尿病、高血糖症、葡萄糖耐量低减、代谢综合征(如X综合征)、创伤(如灼伤或氮不平衡)导致的胰岛素抗性，以及脂肪组织病症(如肥胖症)；肌肉和神经肌肉病症如肌营养不良(包括但不仅限于严重或良性的X连锁肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩肱骨营养不良、强直性肌营养不良、远端肌营养不良、进行性营养不良眼肌麻痹、眼咽肌营养不良、杜兴型肌营养不良和Fakuyama型先天性肌营养不良)；肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)；肌萎缩；器官萎缩；脆弱；腕管综合征；充血性阻塞性肺疾病；先天性肌病；先天肌强直；家族周期性麻痹；阵发性肌红蛋白尿；重症肌无力；Eaton-Lambert综合征；继发性肌无力；去神经支配萎缩；突发性肌萎缩；和少肌症(sarcopenia)、恶病质及其它肌肉消耗综合征。其它实例包括尤其出现于过中年和/或绝经后妇女中的骨质疏松症；糖皮质激素诱导的骨质疏松症；骨质减少；骨关节炎；与骨质疏松相关的骨折；及肌肉组织的创伤或慢性损伤。还有进一步的实例包括因长时间的糖皮质激素治疗、未成熟的性腺衰竭、雄激素抑制、维生素D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进症、营养不良及神经性厌食症导致的低骨量。
术语“质量上的增加”指采用包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质治疗后，与治疗前的肌肉质量相比更多量肌肉的出现。
术语“治疗效果”指病症症状的改善，病症的发展减缓或终止。该治疗效果是通过比较施用至少一种包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的之前和之后，病症的某一方面，如肌肉量的数量变化而得以确定。
术语“调节”指通过提高、降低或抑制蛋白质的活性、行为或数量而改变其特性。例如，包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可通过抑制GDF-8的活性实现对其的调节。
术语“稳定化修饰”指本领域已知或此处所描述的具有下述功能的任意修饰，即可稳定蛋白质、延长蛋白质体外半衰期、延长蛋白质循环半衰期和/或减少蛋白质水解降解。稳定化修饰包括但不仅限于融合蛋白(包括例如，包括一种包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质和另一种蛋白质的融合蛋白)、糖基化位点的修饰(包括例如在包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质中添加一个糖基化位点)和糖类部分的修饰(包括例如，从包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质中移除糖类部分)。在包括融合蛋白的稳定化修饰情况中(如另一蛋白与包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质融合)，另一蛋白可被称为“稳定部分”或“稳定蛋白”。例如，包含至少一个卵泡抑素区的人类蛋白质可与IgG分子融合，其中IgG充当了稳定蛋白或稳定部分。此处所用的“稳定部分”除指融合蛋白中的另一蛋白外，也包括非蛋白质修饰，如糖类部分或非蛋白质聚合物。
术语“IgG分子的Fc区”指本领域技术人员所熟知的同型IgG免疫球蛋白的Fc区。IgG分子的Fc区是IgG分子(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)中负责提高IgG分子体内血清半衰期的部分。
“体外半衰期”指在活体环境外测定的蛋白质稳定性。测定体外半衰期的实验是本领域所熟知的，包括但不仅限于SDS-PAGE、ELISA、基于细胞的实验、脉冲追踪、蛋白质印迹、RNA印迹等。这些及其它有用的实验均是本领域所熟知的。
“体内半衰期”指蛋白质在机体内的稳定性。体内半衰期可通过许多本领域已知的方法测定，包括但不仅限于体内血清半衰期、循环半衰期和此处实施例中提到的实验。
“体内血清半衰期”指蛋白质在机体血液中循环的半衰期。测定体内血清半衰期可利用本领域已知的方法。例如，给动物施用放射性蛋白质，并随时间监测血清中标记蛋白的量。
所给出下表可用于识别本说明书和附图中所列的序列，列有SEQID NO、附图位置及序列描述。
| SEQ IDNO： | 参考 | 说明 |
| 1 | 图6A | 预测小鼠GASP1核苷酸序列 |
| 2 | 图6B | 预测小鼠GASP1可选核苷酸序列 |
| 3 | 图6C | 由SEQ ID NOS：1和2编码的预测小鼠GASP1氨基酸序列 |
| 4 | 图7A | 预测人类GASP1核苷酸序列 |
| 5 | 图7B | 由SEQ ID NO：4编码的预测人类GASP1氨基酸序列 |
| 6 | 图7C | 预测人类GASP1核苷酸序列，可选起始位点 |
| 7 | 图7D | 预测人类GASP1氨基酸序列，由SEQ ID NO：6编码的可选起始位点 |
| 8 | 图8A | 预测小鼠GASP2核苷酸序列 |
| 9 | 图8B | 由SEQ ID NO：8编码的预测小鼠GASP2氨基酸序列 |
| 10 | 图9A | 预测人类GASP2核苷酸序列 |
| 11 | 图9B | 由SEQ ID NO：10编码的预测人类GASP2氨基酸序列 |
| 12 | 实施例2 | 竞争肽 |
| 13-20 | 表1，实施例5，6 | 小鼠GDF-8肽 |
| 21-27 | 表1，实施例5，6 | 小鼠GDF-8前肽肽 |
| 28-30 | 表1，实施例5 | 小鼠FLRG肽 |
| 31-35 | 表1，实施例5，7 | 小鼠GASP1肽 |
| 36-37 | 表1，实施例8 | 人类GDF-8肽 |
| 38-39 | 表1，实施例8 | 人类GDF-8前肽肽 |
| 40-42 | 表1，实施例8 | 人类FLRG肽 |
| 43-45 | 表1，实施例8 | 人类GASP1肽 |
| 46 | 实施例7 | 正向引物 |
| 47 | 实施例7 | 反向引物 |
| 48 | 图13 | 克隆小鼠GASP1核苷酸序列 |
| 49 | 图13 | 由SEQ ID NO：48编码的克隆小鼠GASP1氨基酸序列 |
| 50 | 实施例9 | 正向引物 |
| 51 | 实施例9 | 反向引物 |
| 52 | 实施例9 | 举例说明的N末端肽序列 |
| 53 | 实施例11 | 合成寡核苷酸 |
发明详述
包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质
本发明涉及除卵泡抑素之外，具有独特结构特征，即包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质。卵泡抑素本身并不被本发明涵盖。包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质被认为可结合并抑制GDF-8。包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质实例包括但不仅限于卵泡抑素样相关基因(FLRG)、FRP(flik，tsc36)、集聚素、骨联蛋白(SPARC，BM40)、hevin(SC1，mast9，QR1)、IGFBP7(mac25)和U19878。包含图6和7所提供核苷酸和氨基酸序列的GASP1，以及包含图8和9所提供核苷酸和氨基酸序列的GASP2都是包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的其它实例。
如上所述，卵泡抑素区的定义是特征为具有富半胱氨酸重复的氨基酸区，或用于编码该氨基酸区的核苷酸区。卵泡抑素区典型地包含一个65-90的氨基酸跨距，并含有10个保留半胱氨酸残基，以及一个类似Kazal丝氨酸蛋白酶抑制因子区的区域。通常，半胱氨酸残基之间的环状区在卵泡抑素区中表现出序列可变性，但具有某些明显的保守性。第4和第5个半胱氨酸之间的环状结构往往较小，仅含1或2个氨基酸。第7和第8个半胱氨酸之间的环状结构中的氨基酸通常被最大程度地保留，含有一个共有序列，即(G，A)-(S，N)-(S，N，T)-(D，N)-(G，N)，及相继的(T，S)-Y基序。第9和第10个半胱氨酸之间的区域通常含有一个包含两个疏水残基(特定地V，I或L)的基序，其中这两个疏水残基被另一个氨基酸分隔开。
包含至少一个卵泡抑素区，并可与GDF-8结合的蛋白质可通过利用多种方法得以分离。例如，本发明所例示的，可利用GDF-8亲和纯化方法。此外，可利用cDNA库的低严格度筛选，或利用探针定向于卵泡抑素区的变性PCR技术。当更多的基因组数据均可被利用时，可通过采用许多序列分布图和分析程序，诸如MotifSearch(GeneticsComputer Group，Madison，WI)、ProfileSea rch(GCG)和BLAST(NCBI)进行相似度搜索，以发现包含与已知卵泡抑素区显著同源区域的新蛋白质。
本领域技术人员应认识到，在GDF-8或包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质中，其各自的氨基酸序列均可能存在许多保守性变化，但其生物学特性未改变。这种保守性氨基酸修饰基于氨基酸侧链取代的相对相似度，例如，其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。具有多种上述特征的典型保守性取代是本领域技术人员所熟知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。此外，包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可被用于生成包含至少一个卵泡抑素区的功能片段。人们预期这种片段可结合并抑制GDF-8。本发明的一种实施方案中，包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可与下列无论哪一种形式的成熟GDF-8或其片段特异性结合，即单体形式、活性二聚体形式，或GDF-8潜伏复合体中的复合形式，亲和力为0.001-100nM，或0.01-10nM或0.1-1nM。
核苷酸和蛋白质序列
虽然不总是需要，但如果要求的话，本领域任何一位普通技术人员均可确定包含至少一个卵泡抑素区的新蛋白质的氨基酸或核酸序列。例如，本发明提供了分别对应GASP1和GASP2的氨基酸和核苷酸序列，如图6-9所示。
本发明也包括上述核酸和氨基酸序列的变体、同源物和片段。例如，上述核酸或氨基酸序列可能包含与天然蛋白的核酸或氨基酸序列存在至少70％-79％，或至少80％-89％、至少90％-95％、至少96％-100％一致性的序列。本领域任何一位技术人员均应认识到，与GDF-8结合的区域可耐受的序列变异量要少于蛋白质中该结合不涉及的其它部分可耐受的序列变异量。因此，蛋白质的这些未结合区可能存在大量变异，而并未显著改变该蛋白质的结合特性。不过，本领域任何一位技术人员也应认识到，可对蛋白质进行若干改变，以特异性地提高该蛋白质与其目标的亲和力。这种提高亲和力的改变典型地通过可能于结合区进行的蛋白质改变，并检测其与GDF-8结合的能力或强度，从而根据经验得以确定。上述改变无论发生于结合区内或外，均被涵盖于本发明范畴内。
相对序列相似度或一致性可利用Sequence Analysis SoftwarePackageTM的“Best Fit”或“Gap”程序(Version 10；Genetics ComputerGroup，Inc.，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，WI)得以确定。“Gap”利用Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970)以发现匹配数目最多，空位差异最小的两个序列比对。“BestFit”执行的是两个序列之间最相似片段的最佳比对。最佳比对是通过插入空位，利用Smith和Waterman的局部同源算法(Smith和Waterman，1981；Smith，et al.，1983)最大化匹配数目而得以确定。
上述序列分析软件包含有大量其它的有用序列分析工具，可用于鉴定本发明所公开核苷酸和氨基酸序列的同源物。例如，“BLAST”程序(Altschul，et al.，1990)在特定数据库(如保存于NCBI的序列数据库)中搜索与查询序列(肽或核酸)相似的序列；“FastA”(Lipman和Pearson，1985；也见Pearson和Lipman，1988；Pearson，et al.，1990)执行Pearson和Lipman搜索查询序列与一组相同类型序列(核酸或蛋白质)之间的相似度；“TfastA”执行Pearson和Lipman搜索蛋白质查询序列与任意组核苷酸序列之间的相似度(该程序进行比较前，将核苷酸序列翻译成共计6个可读框)；“FastX”执行Pearson和Lipman搜索核苷酸查询序列与一组蛋白质序列之间的相似度，并考虑到移码因素。“TfastX”执行Pearson和Lipman搜索蛋白质查询序列与任意组核苷酸序列之间的相似度，并考虑移码因素(该程序进行比较前，翻译了核酸序列的两条链)。
修饰的蛋白质
本发明涵盖包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质片段。该片段可能包括所有或一部分卵泡抑素区。该片段可能包括卵泡抑素区与N末端之间，和/或卵泡抑素区与C末端之间的所有序列、一部分序列，或不包括其间的任何序列。
本领域普通技术人员应当理解的是，蛋白质结构中的某些氨基酸可以被取代为其它氨基酸，但对该蛋白质的活性，如包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的结合特性无不利影响。因此，发明者设想可以对包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的氨基酸序列，或编码该蛋白质的DNA序列进行若干改变，而其生物学效用或活性无显著损失。该改变可能包括缺失、插入、截短、取代、融合、基序序列混排等。
进行上述改变时，可能需考虑氨基酸的亲水指数。该亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性是本领域通常认可的(Kyte和Doolittle(1982)J.Mol.Biol.，157：105-132)。人们认为氨基酸的相对亲水特性促成了相应蛋白质次级结构的形成，并依次限定了该蛋白质与其它分子，如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等分子的相互作用。
基于疏水性和电荷特性，每一氨基酸均被指定有一个亲水指数(Kyte和Doolittle，1982)；分别为异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸盐(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸盐(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。进行氨基酸取代改变时，其亲水指数可在±2、±1和±0.5内。
本领域技术人员也应理解的是，相似氨基酸的取代可基于亲水性有效进行。U.S.Patent 4,554,101陈述的是蛋白质受其连接氨基酸的亲水性所控制的最大局部平均亲水性与该蛋白质的生物学特性相关。
如U.S.Patent 4,554,101所述，下列氨基酸残基的亲水性数值分别为：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。进行氨基酸取代改变时，其亲水性数值可在±2、±1和±0.5内。
修饰可以是保守性的，以使该蛋白质的结构或生物学功能不受变化的影响。这种保守性氨基酸修饰是基于氨基酸侧链取代的相对相似度，例如，其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。具有上述多种特征的典型保守性取代是本领域技术人员熟知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的氨基酸序列可以被修饰，而具有大量保守性变化，只要对该蛋白质与其目标的结合无不利影响即可。这种改变可以被导入在包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的结合部分内部或外部。例如，可对被导入该蛋白质抗原结合部分内的改变进行设计，从而提高该蛋白质对其目标的亲和性。
稳定化修饰
稳定化修饰可使蛋白质稳定，延长蛋白质的体外和/或体内半衰期，延长蛋白质的循环半衰期和/或减少蛋白质的水解降解。这种稳定化修饰包括但不仅限于融合蛋白、糖基化位点的修饰和糖类部分的修饰。稳定剂蛋白可以是可提高修饰的GDF前肽的整体稳定性的任意蛋白质。本领域任何一位普通技术人员均应认识到的是，融合蛋白可在前肽部分与稳定化部分之间任选地包含一个接头肽。如本领域所熟知的，融合蛋白可通过下述步骤制备，即将第二个蛋白质连同第一个蛋白质一起融合在框架内，使获得的翻译蛋白包含第一和第二个蛋白质。例如，在本发明中，融合蛋白可通过下述步骤制备，即将包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质融合到第二个蛋白质上(如一个稳定剂蛋白质部分)。如此制备该融合蛋白，可使获得的翻译蛋白包含前肽部分和稳定剂部分。
包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可糖基化或与白蛋白或非蛋白质聚合物连接。例如，如U.S.专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337所陈述的，包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可以与多种非蛋白质聚合物中的任意一种，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯连接。通过与聚合物共价结合，可化学修饰蛋白质，从而延长例如，其循环半衰期。聚合物及将其与肽连接的方法也参见U.S.Pat.Nos.4,766,106、4,179,337、4,495,285和4,609,546。
包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可聚乙二醇化。聚乙二醇化是一种将聚乙二醇(PEG)与蛋白质连接，以延长该蛋白质体内半衰期的方法。包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的聚乙二醇化可减少获得最佳抑制GDF-8效果所需施用蛋白质的剂量或频率。对该技术的评论见Bhadra et al.(2002)Pharmazie，57：5-29和Harris et al.(2001)Clin.Pharmacokinet.，40：539-551。
包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可连接至IgG分子的Fc区。包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可被融合邻接于IgG分子的Fc区，或借助于一个接头肽与IgG分子的Fc区连接。这种接头肽的应用是蛋白质生物化学领域所熟知的。Fc区可能来源自例如，IgG1或IgG4。
包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可以被修饰，从而具有改变的糖基化模式(即由原始或天然糖基化模式改变而来)。此处所用“改变的”意指存在一个或多个糖类部分的缺失，和/或原始蛋白质添加了一个或多个糖基化位点。
蛋白质的糖基化典型地是N连接或O连接。N连接指糖类部分与天冬酰胺残基的侧链结合。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸均是可用于将糖类部分酶促结合至天冬酰胺侧链的识别序列，其中X为除脯氨酸外的任意氨基酸。因此，多肽中只要存在上述任意一种三肽序列，便可创建出一个潜在的糖基化位点。O连接糖基化指下列几种糖之一，即N-酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖与羟基氨基酸的结合，该羟基氨基酸最常见的是丝氨酸或苏氨酸，也可采用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
在包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质中添加糖基化位点可通过下述方法轻易实现，即改变其氨基酸序列，以使其包含一个或多个上述的三肽序列(对N连接糖基化位点而言)。该改变也可通过在原始蛋白质的序列中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基而得以实现(对O连接糖基化位点而言)。为方便起见，该蛋白质氨基酸序列可通过DNA水平的变化得以改变。
增加蛋白质中糖类部分数目的另一种方式是通过化学或酶促方法将糖苷偶联至该蛋白质的氨基酸残基上。上述操作的优势是无需在具有N或O连接糖基化能力的宿主细胞中生成GDF肽抑制因子。根据所用的偶联模式，糖类可与下列基团结合，即(a)精氨酸和组氨酸、(b)自由羧基团、(c)自由巯基团，如半胱氨酸的巯基团、(d)自由羟基团，如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的羟基团、(e)芳香残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。上述方法的描述参见WO 87/05330，以及Aplin和Wriston(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.，22：259-306。
将包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质中存在的任何糖类部分移除可通过化学或酶促方法实现。化学去糖基化要求将蛋白质暴露于三氟甲磺酸或等效化合物。该处理可裂解除连接糖(N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺)外的大部分或全部糖类，并同时保留完整氨基酸序列。
化学去糖基化作用如Hakimuddin et al.(1987)Arch.Biochem.Biophys.，259：52，以及Edge et al.(1981)Anal.Biochem.，118：131所描述。对GDF肽抑制因子上的糖类部分的酶促裂解可通过利用多种内和外糖苷酶实现，如Thotakura et al.(1987)Meth.Enzymol.，138：350所描述。
包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可与白蛋白或白蛋白衍生物连接。将蛋白质和多肽与白蛋白或白蛋白衍生物连接的方法是本领域所熟知的，见例如U.S.Patent No.5,116,944。
药物组合物
本发明提供了含有包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的组合物。该组合物可能适于药物用途并对患者施用。该组合物典型地含有一种或多种包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质，以及一种药物可接受赋形剂。此处所用术语“药物可接受赋形剂”包括适合药物给药的任意一种溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这种介质和药剂作为药物活性底物的应用是本领域所熟知的。该组合物也可含有其它可提供补充、额外或加强的治疗功能的活性化合物。该药物组合物也可连同给药说明书一起被置于容器、包装或分配器内。
本发明的药物组合物经配制后与其预设的给药途径相容。实现给药的方法是本领域普通技术人员已知的。例如，可经由静脉内、肌肉内或皮下给药。
皮下应用的溶液或悬液典型地包括一种或多种下列组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；鳌合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节渗透压的物质，如氯化钠或右旋糖。pH可由酸或碱调节，如盐酸或氢氧化钠。该制剂可被封装入安瓿瓶、一次性注射器、玻璃或塑料制的多次剂量瓶中。
适合注射的药物组合物包括无菌水溶液或分散体系，以及临时制备无菌可注射溶液或分散体系所用的无菌粉末。对静脉内给药而言，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所有情况中的组合物均必须无菌，并应为具有易注射性的流体。在生产和保存条件下必须稳定，且必须进行保存以免遭微生物，如细菌和真菌的作用污染。载体可为含有例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其合适的混合物。合适的流动性可通过例如利用涂层，如卵磷脂，通过在分散体系的情况中维持必需的颗粒尺寸，以及利用表面活性剂而得以维持。预防微生物作用可通过利用多种抗细菌和抗真菌剂实现，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。许多情况中的组合物可包括等渗剂，例如糖类、多元醇，如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可注射组合物的延迟吸收可通过在该组合物中加入可延迟吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶而得以实现。
一种实施方案中，包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质是与可保护化合物不被肌体快速清除的载体一起制备的，如控释配方，包括植入和微胶囊化的送递体系。生物可降解、生物相容的聚合物可被利用，如乙烯醋酸乙烯共聚物、聚酐、聚羟基乙酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备上述配方的方法对本领域技术人员而言是浅显的。材料也可通过商业渠道获得自Alza Corporation和Nova Pharmaceutical，Ind.。含有包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的脂质体悬液也可作为药物可接受载体应用。其制备可根据本领域技术人员已知的方法，例如U.S.Patent No.4,522,811所描述的方法进行。
在治疗上有用的药剂，如生长因子(如BMPs、TGF-β、FGF、IGF)、细胞因子(如白细胞间介素和CDFs)、抗生素及其它有益于所治疗症状的治疗剂均可被任选地包括在含有至少一个卵泡抑素区的蛋白质中，或与其同时或相继施用。
将组合物配制成剂量单位形式尤其有利于剂量施用的方便和均匀。此处所用剂量单位形式指就待治疗对象而言，适合作为单一剂量的物理不连续单位；每一单位含有预定量的活性化合物，该预定量是经过计算当与必需药物载体结合时可获得预期治疗效果的量。针对本发明剂量单位形式的说明书受限于并直接基于活性化合物的独特特征和欲实现的特定治疗效果，以及将该活性化合物组合用于个体治疗领域时存在的固有局限性。
治疗适应症
包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可用于预防、诊断或治疗人类或动物的多种医学病症。相应地，本发明提供了治疗与肌细胞和组织相关疾病和病症的方法，包括对患者施用一定量足以改善疾病症状，且包括至少一种含有至少一个卵泡抑素区的蛋白质的组合物。上述病症包括肌营养不良症，包括但不仅限于严重或良性X连锁肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩肱骨营养不良、强直性肌营养不良、远端肌营养不良、进行性营养不良眼肌麻痹、眼咽肌营养不良、杜兴型肌营养不良和Fakuyama型先天性肌营养不良；肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)；肌萎缩；器官萎缩；脆弱；腕管综合征；充血性阻塞性肺疾病；先天性肌病；先天肌强直；家族周期性麻痹；阵发性肌红蛋白尿；重症肌无力；Eaton-Lambert综合征；继发性肌无力；去神经支配萎缩；突发性肌萎缩；和少肌症、恶病质及其它肌肉消耗综合征。本发明也涉及肌肉组织的创伤或慢性损伤。
除提供针对肌肉疾病和病症的疗法之外，本发明也提供了预防或治疗病症的葡萄糖体内平衡所导致的代谢疾病或病症。这种疾病或病症包括代谢疾病和病症(如胰岛素依赖性(1型)糖尿病、非胰岛素依赖性(2型)糖尿病)、高血糖症、葡萄糖耐量低减、代谢综合征(如X综合征)、创伤导致的肥胖症和胰岛素抗性(如灼伤或氮不平衡)、脂肪组织病症(如肥胖症)，或骨变性疾病(如骨质疏松症，尤其在过中年和/或绝经后妇女中出现；糖皮质激素诱导的骨质疏松症；骨质减少；骨关节炎；与骨质疏松相关的骨折)。进一步的实例还包括因长时间的糖皮质激素治疗、未成熟的性腺衰竭、雄激素抑制、维生素D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进症、营养不良及神经性厌食症导致的低骨量。
正常的葡萄糖体内平衡必须借助于可应答血液葡萄糖水平细微变化的胰腺β细胞，对胰岛素分泌进行精细调谐。胰岛素的基本作用之一是刺激组织，尤其是肌肉和脂肪对血液中葡萄糖的摄取。
相应地，本发明提供了治疗糖尿病和相关病症，如肥胖症或高血糖症的方法，方法包括对患者施用一定量足以改善疾病症状，且包括至少一种包含了至少一个卵泡抑素区的蛋白质的组合物。2型或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)的特征尤其在于下述三点，即(1)对作用于外周组织，尤其是骨骼肌和脂细胞中葡萄糖摄取的胰岛素具有抗性，(2)胰岛素作用削弱，从而抑制了肝葡萄糖的产生，以及(3)胰岛素分泌失调(DeFronzo(1997)Diabetes Rev.5：177-269)。因此，2型糖尿病患者可依照本发明接受治疗，即通过施用包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质，从而提高对胰岛素的敏感度及细胞的葡萄糖摄取。
类似地，以胰岛素功能障碍(如抗性、无活性或缺乏)和/或转运进入细胞的葡萄糖不足为特征的其它疾病和代谢病症也可依照本发明接受治疗，即通过施用包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质，从而提高对胰岛素的敏感度及细胞的葡萄糖摄取。
利用蛋白质治疗的方法
包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可被用于抑制或降低与GDF-8蛋白质相关的一种或多种活性(无论其是否为单体形式、二聚体活性形式或GDF-8潜伏复合体当中的复合形式)，该抑制或降低是相对于未结合相同蛋白质的GDF-8蛋白质而言。一种实施方案中，成熟GDF-8蛋白质与包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质结合时，其活性与未结合含一个卵泡抑素区的蛋白质的成熟GDF-8蛋白质相比，至少被抑制50％，或至少60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86或88％，或者至少90、91、92、93或94％，或至少95-100％。
包括含有至少一个卵泡抑素区的蛋白质的药物制剂是按治疗有效剂量施用的。此处所用蛋白质的“有效量”指足以降低GDF-8的活性，从而实现预期生物学效果的剂量。该预期生物学效果可为任意治疗效果，包括肌肉质量的增加、肌肉强度的提高、代谢改善、肥胖倾向减弱或葡萄糖体内平衡改善。这些改善可通过多种方法检测，包括测量瘦和胖体重(如双重x射线扫描分析)、肌肉强度、血清脂质、血清瘦素、血清葡萄糖、糖化血红蛋白、葡萄糖耐受性及在糖尿病的继发性并发症方面的改善。
通常，治疗有效剂量可随着患者的年龄、健康状况、性别及该患者医学病症的严重程度而变化。该剂量可由医师确定，如有必要，可进行调整以实现治疗的观测效果。施用至少一种包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质所用的合适剂量范围可为5mg-100mg、15mg-85mg、30mg-70mg或40mg-60mg。蛋白质可按单一剂量施用，或定时施用，如每天一次、每周一次和每月一次。剂量时间表可根据该蛋白质与GDF-8的亲和性、蛋白质的半衰期或患者病症的严重程度进行调整。通常，该组合物是作为推注剂量施用，可使给药后包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的循环水平的最大化持续最长时间。
本发明化合物的毒性和治疗功效可通过在细胞培养或实验动物中进行的标准药物操作得以确定，如确定LD50(导致50％群体死亡的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比率为治疗指数，可表达为比率LD50/ED50。包含至少一个卵泡抑素区，并可表现出大治疗指数的蛋白质可以被应用。
由细胞培养实验和动物研究获得的数据可用于评估在人类中应用的剂量范围。本发明化合物的剂量可在一定循环浓度范围内，该循环浓度范围包括ED50，且具有很少毒性或无毒性。剂量可根据所应用的剂量形式和采用的给药途径在该范围内变化。对本发明应用的包含至少一个卵泡抑素区的任意蛋白质而言，治疗有效剂量可从细胞培养实验获得最初的估计。一个剂量可以被配制在动物模型体内，以获得循环血浆浓度范围，该范围包括在细胞培养中测定的IC50(即可实现最大症状抑制的一半效果的测试蛋白质浓度)。血浆水平可借助于例如高效液相色谱测定。任何特定剂量的效果均可通过合适的生物检定进行监测。合适的生物检定实例包括GDF-8蛋白质/受体结合实验、肌酸激酶实验、基于脂细胞葡萄糖摄取的实验及免疫学实验。
施用DNA的方法
本发明也提供了用于在体内产生包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的基因疗法。该疗法可通过将多聚核苷酸序列导入此处所列存在病症的细胞或组织中，从而实现其治疗效果。
包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的多聚核苷酸序列的送递可利用重组表达载体，如嵌合病毒或胶体分散体系得以实现。目标脂质体可被用于治疗性送递该多聚核苷酸序列。基因疗法可利用的多种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘或RNA病毒，如逆转录病毒。逆转录病毒载体可以是鼠类或鸟类逆转录病毒的衍生物。可插入单个外源基因的逆转录病毒载体实例包括但不仅限于：莫洛尼氏鼠类白血病毒(MoMuLV)、哈维鼠类肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠类乳腺肿瘤病毒(MuMTV)和劳氏肉瘤病毒(RSV)。许多其它的逆转录病毒载体也可整合多个基因。这些载体均可转移或整合一个用于选择性标记的基因，从而使转导细胞可以被识别并传代。通过将我们感兴趣的GDF前肽多聚核苷酸序列连同另一个基因，例如编码与特定靶细胞上受体对应的配体的基因一起插入病毒载体中，该载体便具有了靶特异性。
逆转录病毒载体可通过连接例如，一种糖、糖脂或蛋白质从而具有靶特异性。定位可通过利用抗体实现。本领域技术人员应认识到特定多聚核苷酸序列可以被插入逆转录病毒基因组中，或附着在病毒包膜上，从而实现该逆转录病毒载体的靶特异性送递，其中该逆转录病毒载体含有包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的多聚核苷酸。一种实施方案中，该载体的目标为肌细胞或肌肉组织。
由于重组逆转录病毒是有缺陷的，因而需要含特定质粒的辅助细胞系，该质粒在LTR(长末端重复序列)中调节序列的控制下，可编码逆转录病毒的全部结构基因。该质粒缺失了一个核苷酸序列，该序列可使包装机制识别壳体化所需的RNA转录产物。缺失了包装信号的辅助细胞系包括但不仅限于例如PSI.2、PA317和PA12。这些细胞系因基因组未被包装而生成了空病毒体，如果将逆转录病毒载体导入具有完整包装信号的细胞中，但由我们感兴趣的其它基因取代结构基因，则该载体可以被包装并生成载体病毒体。
可选地，其它组织培养细胞可利用编码了逆转录病毒结构基因gag、pol和env的质粒，通过常规磷酸钙转染方法被直接转染。继而利用包含我们感兴趣的基因的载体质粒转染这些细胞。所获细胞将逆转录病毒载体释放进培养基中。
对包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的多聚核苷酸而言，另一个定位送递体系是胶体分散体系。胶体分散体系包括大分子复合体、纳米胶囊、微球、珠、包括水包油乳剂、微胶粒、混合的微胶粒和脂质体在内的脂质基础体系。脂质体是可作为体外和体内送递载体应用的人工膜载体。RNA、DNA和完整病毒体均可被密封于水性溶液内，并以生物学活性形式被送递至细胞(见例如Fraley，et al.(1981)TrendsBiochem.Sci.，6：77)。利用脂质体载体有效基因转移的方法是本领域已知的(见例如Mannino，et al.(1988)Biotechniques，6：682)。脂质体组合物通常是由磷脂与类固醇，尤其是胆固醇结合形成。其它磷脂或脂质也可被应用。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在情况。
可用于生成脂质体的脂质实例包括磷脂酰化合物，如磷脂酰甘油、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。举例说明的磷脂包括卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂和二硬脂酰卵磷脂。本领域已知脂质体的定位也可能基于例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性。
存在大量方法可将表达包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质的细胞送递至可调节GDF-8应答的位点。本发明的一种实施方案中，表达卵泡抑素蛋白质的细胞可通过直接应用实现送递，例如，直接将含该细胞的样品注射进组织损伤位点。该细胞可以是已纯化的。可将该细胞悬浮于特定培养基或基质中送递，培养基或基质可部分地阻碍细胞迁移率，从而将其定位于损伤位点。该特定培养基或基质可以是半固体，如糊剂或凝胶，包括凝胶样多聚体。可选地，该培养基或基质可以是固体形式，即可允许细胞迁移进入固体基质，将细胞保留的同时可实现细胞增殖的多孔固体。
检测和分离GDF-8的方法
包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可被用于检测体内或体外GDF-8的存在或水平。通过将这种蛋白质的存在或水平与医学病症联系起来，本领域任何一位技术人员均可诊断出相关的医学病症。此处列出了可利用包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质诊断的医学病症。
这些检测方法是本领域熟知的，包括ELISA、放射免疫实验、免疫印迹、蛋白质印迹、免疫荧光、免疫沉淀及其它类似技术。包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质可进一步被提供在诊断试剂盒中，该试剂盒合并了一种或多种上述技术以检测GDF-8。该试剂盒可包含其它组分、包装、说明书或其它可用于检测该蛋白质和使用该试剂盒的材料。
包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质用于诊断用途时，将其修饰后可能是理想的，例如采用配体基团(如生物素)或可检测标记基团(如荧光基团、放射性同位素或酶)修饰。如需要，可采用常规技术标记该蛋白质。合适的标记包括荧光团、生色团、放射性原子、电子密度试剂、酶和具有特异性结合配偶体的配体。酶典型地是利用其活性得以检测。例如，辣根过氧化物酶通常是利用其将3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)转化为兰色颜料，可利用分光光度计定量的能力而得以检测。其它合适的结合配偶体包括生物素和抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素、IgG和蛋白质A，以及本领域已知的诸多受体-配体对。其它置换和可能性应是本领域普通技术人员易于理解，且被认为属于本发明范畴的等效物。
包含至少一个卵泡抑素区的蛋白质或其片段也可被用于在纯化过程中分离GDF-8。一类方法中，蛋白质可通过例如，被加入柱或树脂中而得以固定。利用该蛋白质与GDF-8结合，并继而在特定条件下使其释放已结合的GDF-8。该方法可用于GDF-8的商业化生产。
下述实施例提供了本发明的实施方案。本领域任何一位普通技术人员均应理解的是，在不改变本发明精神或范畴的条件下可以作出多种修改和变化。这些修改和变化被认为是属于本发明范畴的。下述实施例并不以任何方式对本发明构成限制。应当理解的是，本说明书和权利要求中的所有数字均由术语“大约”修饰，例如剂量的小变化，可认为是属于本发明范畴的。
实施例
实施例1：JA16结合珠的纯化
于MilliQ-H2O中洗涤N-琥珀酰亚胺活化珠(4％珠状琼脂糖，Sigma H-8635，St Louis MO)，并按特定比例与抗GDF-8JA16单克隆抗体(100mM MOPS中的浓度为3-4μg/μl，pH7.5)混合，使每毫升树脂中JA16的终浓度为10mg，于4℃培养4小时。采用100mM MOPSpH7.5和磷酸盐缓冲盐水(PBS)粗略洗涤珠体(Ausubel et al.，(1999)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons)，并置于PBS中4℃条件下保存直至使用。对照珠制备方法一致，但无JA16抗体。
实施例2：亲和纯化
采用15ml正常Balb/C小鼠血清(Golden West Biologicals，Temecula CA)或30ml收集的正常人类血清(ICN Biomedical，AuroraOH)，于4℃条件下培养共计40μl包装的JA16结合珠或对照珠3小时。于大约10ml冷的1％Triton X-100/PBS中洗涤珠体两次，再于大约10ml冷的0.1％Triton X-100/PBS中洗涤两次，以及于大约1ml的冷PBS中洗涤两次。蛋白质在下述三个连续步骤中从珠体被洗脱出来。首先，对珠体进行‘模拟洗脱’，即将100μl PBS加入珠体中，并于4℃培养30分钟。收集上清液，并与30μl 4×LDS样品缓冲液(Invitrogen，Carlsbad CA)混合。其次，对珠体进行‘肽洗脱’，即将100μl含1μg/μl竞争肽(序列：DFGLDSDEHSTESRSSRYPLTVDFEAFGWD-COOH(SEQ IDNO：12))的PBS加入珠体中，并再次于4℃培养30分钟。如前收集上清液。再次，对珠体进行‘SDS洗脱’技术处理，即将30μl 4×LDS缓冲液(Invitrogen)和100μl PBS加入珠体中，并在将上清液转移进新试管前加热至80℃持续10分钟。
每一洗脱步骤中洗脱出的蛋白质的银染胶如图1所示。如图1所示，该银染胶中大约为12和36kDa的两条蛋白质条带是被特异洗脱自JA16结合珠，而非未结合对照珠。
实施例3：质谱分析
采用NuPage 10×还原剂(Invitrogen)于80℃条件下还原样品10分钟，并采用110μM碘乙酰胺于22℃、黑暗条件下烷基化30分钟。根据生产商的推荐方法，立即将样品上样至MES缓冲体系中的10％NuPage Bis-Tris凝胶上(Invitrogen)，并采用无戊二醛体系(Shevchenko，et al.，(1996)Anal.Chem.，68：850-858)进行银染色。切除条带，并于Abimed Digest Pro(Langenfeld，Germany)或ProGestInvestigator(Genomics Solutions，Ann Arbor MI)中采用测序级修饰的胰蛋白酶(Promega，Madison WI)进行消化。通过蒸发缩减已消化样品的体积，并补充1％乙酸至终体积大约20μl。将样品(5-10μl)上样至在Picofrit针(New Objectives，Woburn MA)中填充的内径为10cm×75μm的C18反相柱中。采用LCQ Deca或LCQ Deca XP(Finnigan，San Jose CA)质谱仪收集MS/MS数据，并利用Sequest程序(Finnigan)基于NCBI无冗余数据库进行搜索。如无另外指明，此文所列所有肽序列均与MS/MS图谱对应，通过人工检验以及在Sequest计分系统中获得的Xcorr评分＞2.5，可认定该MS/MS图谱具有高精度。
实施例4：蛋白质印迹实验
将蛋白质转移至0.45μm硝酸纤维素膜(Invitrogen)上，并采用封闭缓冲液(含5％脱脂奶粉的Tris缓冲盐水(TBS：10mM Tris-Cl，pH7.5，150mM NaCl))于4℃条件下封闭过夜。继而于室温下，采用以1∶1000稀释度稀释于封闭缓冲液中的初级抗体作为探针探查印迹1-3小时，并采用TBS洗涤5次，继而于室温下，采用封闭缓冲液中的辣根过氧化物酶结合的二级抗体作为探针探查1-3小时，如前进行洗涤。利用West Pico Substrate(Pierce)通过放射自显影检测信号。
实施例5：GDF-8的分离
利用上述实施例所描述方法进行分离GDF-8的实验。由于还原形式的GDF-8为12kDa，我们推测图1所示银染胶较低条带中的蛋白质为成熟GDF-8。为证实该假设，我们切除该条带，采用胰蛋白酶消化，并通过LC-MS/MS获得相应肽的MS/MS图谱。对应6个胰蛋白酶肽的MS/MS图谱证实从凝胶该区域中分离获得的是成熟GDF-8，如图2A和表1所示。
表1列出了从小鼠和人类血清的JA16免疫沉淀中发现的GDF-8(SEQ ID NO：13-20)、GDF-8前肽(SEQ ID NO：21-27)、FLRG(SEQID NO：28-30)和GASP1(SEQ ID NO：31-35)衍生的肽。在蛋白质序列前直接加入的氨基酸如每个肽所对应的括号所示，并列出了肽的电荷状态(z)以及Sequest程序的相关系数(Xcorr，可信度的衡量标准)。表中的序列列表编号仅指分离的肽及其序列。序列前所加括号中的氨基酸并不被包括在肽中，仅供参考。所有图谱均通过人工检验证实。
有趣的是，蛋白质印迹也含有与未加工全长GDF-8对应的条带(43kDa)，意味着该分子的相同部分在未经过蛋白水解加工的情况下被分泌进入血清(图2B)。未加工GDF-8的存在由质谱分析结果证实(数据未显示)。因此，亲和纯化方法可有效地从正常小鼠血清中分离GDF-8。
尽管JA16抗体可识别GDF-8和高度相关蛋白质BMP/GDF-11，我们仍未在质谱分析的亲和纯化样品中发现BMP-11肽存在的迹象。
表1：JA16免疫沉淀中鉴定的肽
| 小鼠血清 | z | Xcorr | |
| GDF-8(成熟) | (K)ANYCSGECEFVFLQK(SEQ ID NO：13) | 3+ | 4.63 |
| (K)MSPINMLYFNGK(SEQ ID NO：14) | 2+ | 3.81 | |
| (R)DFGLDCDEHSTESR(SEQ ID NO：15) | 2+ | 3.47 | |
| (K)ANYCSGECEFVFLQK(SEQ ID NO：16) | 2+ | 3.31 | |
| (K)M*SPINMLYFNGK(SEQ ID NO：17) | 3+ | 2.95 | |
| (R)YPLTVDFEAFGWDWIIAPK(SEQ ID NO：18) | 2+ | 2.86 | |
| (K)M*SPINM*LYFNGK(SEQ ID NO：19) | 2+ | 2.51 | |
| (R)GSAGPCCTPTK(SEQ ID NO：20) | 2+ | 2.43 | |
| GDF-8(前肽) | (K)LDM*SPGTGIWQSIDVK(SEQ ID NO：21) | 2+ | 3.82 |
| (K)ALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVK(SEQ ID NO：22) | 3+ | 3.17 | |
| (K)LDMSPGTGIWQSIDVK(SEQ ID NO：23) | 2+ | 2.98 | |
| (R)ELIDQYDVQR(SEQ ID NO：24) | 2+ | 2.97 | |
| (K)TPTTVFVQILR(SEQ ID NO：25) | 2+ | 2.91 | |
| (K)AQLWIYLRPVK(SEQ ID NO：26) | 2+ | 2.77 | |
| (K)EGLCNACAWR(SEQ ID NO：27) | 2+ | 2.75 | |
| 卵泡抑素样相关基因(FLRG) | (R)PQSCLVDQTGSAHCVVCR(SEQ ID NO：28) | 3+ | 3.34 |
| (K)DSCDGVECGPGK(SEQ ID NO：29) | 2+ | 2.99 | |
| (K)SCAQVVCPR(SEQ ID NO：30) | 2+ | 2.59 | |
| 新的多区域 | (R)ECETDQECETYEK(SEQ ID NO：31) | 2+ | 2.98 |
| (R)ADFPLSVVR(SEQ ID NO：32) | 2+ | 2.56 | |
| 蛋白酶抑制因子(GASP1) | (R)EACEESCPFPR(SEQ ID NO：33) | 2+ | 2.95 |
| (R)SDFVILGR(SEQ ID NO：34) | 2+ | 2.73 | |
| (R)VSELTEEQDSGR(SEQ I D NO：35) | 2+ | 3.88 |
M*＝氧化的蛋氨酸
| 人类血清 | z | Xcorr | |
| GDF-8(成熟) | (K)ANYCSGECEFVFLQK(SEQ ID NO：36) | 2+ | 4.21 |
| (R)DFGLDCDEHSTESR(SEQ ID NO：37) | 3+ | 2.08 | |
| GDF-8(前肽) | (K)ALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVK(SEQ ID NO：38) | 3+ | 3.71 |
| (R)ELIDQYDVQR(SEQ ID NO：39) | 2+ | 3.01 | |
| 卵泡抑素样相关基因(FLRG) | (R)PQSCVVDQTGSAHCVVCR(SEQ ID NO：40) | 3+ | 3.37 |
| (R)CECAPDCSGLPAR(SEQ ID NO：41) | 2+ | 3.21 | |
| (R)LQVCGSDGATYR(SEQ ID NO：42) | 2+ | 3.06 | |
| 多区域蛋白酶抑制因子(GASP1) | (R)VSELTEEPDSGR(SEQ ID NO：43) | 2+ | 2.44 |
| (R)CYMDAEACSK(SEQ ID NO：44) | 2+ | 2.69 | |
| (K)GITLAVVTCR(SEQ ID NO：45) | 2+ | 2.42 |
实施例6：与GDF-8结合的蛋白质的分离
证实亲和纯化技术可成功地从正常小鼠血清中分离GDF-8后，我们继续鉴定了在自然条件下与GDF-8结合的蛋白质。如上所述方法分析图1所示银染胶上的36kDa条带。通过质谱分析鉴定了凝胶该区域内特异于JA16免疫纯化样品的两种蛋白质。确定是GDF-8前肽和卵泡抑素样相关基因(FLRG)。分别从这些蛋白质中鉴定的肽如表1所示(SEQ ID NO：13-27)。从高精度MS/MS图谱中发现6种来源自GDF-8前肽的独特肽，以及三种来源自FLRG的独特肽；代表性的肽如图3A和3C所示。此外，这两种蛋白质的存在是通过利用分别特异于GDF-8前肽和FLRG的多克隆抗体进行蛋白质印迹分析证实的(图3B和3D)。因此，体内循环GDF-8似乎可在体内与GDF-8前肽和FLRG结合。
实施例7：结合GDF-8的新蛋白质的分离
为表征体内循环GDF-8复合体中的主要组成，通过采用琼脂糖结合的抗GDF-8单克隆抗体JA16进行亲和纯化，从野生型小鼠血清中分离获得了天然GDF-8及其相关蛋白质。分别采用PBS缓冲液(模拟洗脱)、可与GDF-8竞争结合JA16的肽，以及SDS洗涤剂对JA16所结合蛋白质进行相继的洗脱步骤。浓缩这些样品，上样至一维SDS-PAGE凝胶上，并通过银染色显影(图4)。可见两条独特对应JA16已纯化样品的条带-----被鉴定为GDF-8的12kDa条带，以及含有GDF-8前肽和FLRG的36kDa条带。
为确定是否可鉴定其它在体内与GDF-8结合的蛋白质，我们按比例提高纯化倍数大约5倍，并利用质谱分析搜索存在于JA16免疫复合物中，而不存在于阴性对照中的蛋白质。为实现该目标，我们将分子量对应于10-200kDa之间的银染胶区域切分为13份，如图4所示。对每一份进行胶内胰蛋白酶消化和LC-MS/MS。尽管在这些样品中已鉴定出上述全部蛋白质(成熟GDF-8、GDF-8前肽、未加工GDF-8和FLRG)(图4)，在将所获MS/MS图谱与已知蛋白质的无冗余NCBI数据库对照时，仍未显示出特异于JA16免疫沉淀的其它任何蛋白质。于JA16免疫复合物和阴性对照样品中均发现的背景蛋白质包括丰富的血清蛋白质，如白蛋白、免疫球蛋白及补体蛋白质。在JA16样品中未发现TGF-β超家族的其它成员，包括高度相关蛋白质BMP-11/GDF-11的存在迹象。因此，在这些实验中JA16抗体特异性地纯化了GDF-8。
有趣的是，尽管JA16可于体外免疫沉淀GDF-8/卵泡抑素复合体，但我们在GDF-8免疫复合物中仍未发现卵泡抑素的存在迹象(数据未显示)。卵泡抑素已显示可通过与拮抗GDF-8与ActRIIB受体的连接，从而抑制GDF-8的活性(Lee and McPherron(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，98：9306-9311)。我们的结果表明在正常状态下，卵泡抑素并未在调节循环GDF-8复合体活性方面发挥重要作用。
由于通过该MS/MS操作对蛋白质的鉴定取决于所搜索数据库的内容，我们通过比较收集自13个样品的MS/MS图谱与预测自Celera小鼠基因组序列的蛋白质数据库，进一步分析了图4中的数据。该分析鉴定了特异于JA16纯化样品的另一种蛋白质，将其称为GDF相关血清蛋白质1(GASP1)。对该蛋白质进行最初的鉴定后，便可利用公共基因组测序成果，将其序列编号为gi|20914039，并添加进NCBI nr数据库内。
基于高精度MS/MS图谱鉴定了GASP1序列所对应的5种肽(表1(SEQ ID NO：31-35)；图5A和B)。于条带3中发现了GASP1肽所对应的图谱，含有70-80kDa蛋白质。不过，未见该蛋白质所对应的特定条带，可能是该范围内的背景免疫球蛋白和白蛋白过多所致(见图4)。超过2.3的Sequest Xcorr计分通常被认为对2+离子显著。意外的是，这些实验中鉴定的一种肽(序列为ECETDQECETYEK(SEQ IDNO：31))跨越了编码该蛋白质的两个外显子之间的结合点，验证了该实施例中Celera基因预测算法的准确性。
在实际克隆GASP1之前预测GASP1转录产物和蛋白质的序列(图6)。GASP1被预测为571个氨基酸的蛋白质，其预测分子量为63kDa。其推断信号序列/裂解位点位于N末端，且两个用于N糖基化的可能位点位于氨基酸314和514处。利用Pfam和BLAST分析GASP1蛋白质序列(根据Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.，215：403-410；Batemanet al.(2002)Nucleic Acids Res.，30：276-280中的技术)，结果显示GASP1含有许多保守区域，包括一个WAP区、一个卵泡抑素/Kazal区、一个免疫球蛋白区、两个纵列Kunitz区和一个netrin区(图14A)。最初于乳清酸性蛋白质中鉴定出的WAP区含有形成一个由四个二硫化物组成的中心所需的8个半胱氨酸，并通常被发现存在于具有抗蛋白酶活性的蛋白质中(Hennighausen and Sippel(1982)Nucleic AcidsRes.，10：2677-2684；Seemuller et al.(1986)FEBS Lett.，199：43-48)。一般认为卵泡抑素区介导了GDF-8与GASP1之间的相互作用。卵泡抑素区的C末端区域含有类似于Kazal丝氨酸蛋白酶抑制因子区的部分。该区域位于GASP1中时，比位于卵泡抑素或FLRG中更与Kazal区密切相关，表明存在该区域具有其它蛋白酶抑制因子功能的可能性。最初于牛胰腺胰蛋白酶抑制因子中鉴定出的Kunitz区也抑制丝氨酸蛋白酶，说明该区位于GASP1中时，很可能在调节此类蛋白质方面发挥了作用。此外，金属蛋白酶的抑制涉及到netrin区(Banyai andPatty，1999；Mott et al.，2000)。因此，基于这些保守区域的存在，GASP1很可能抑制蛋白酶的活性，并可能调节GDF-8加工或潜在GDF-8复合体的活化。
对小鼠Celera转录产物数据库的BLAST搜索发现了与GASP1存在＞50％一致性的蛋白质，在此处被称为GASP2。GASP2含有与GASP1相同的区域结构，表明这两种蛋白质定义了一个含两个成员的多价蛋白酶抑制因子家族(图14B)。有趣的是，在我们的JA16纯化样品中发现的肽仅对应于GASP1，而不对应于GASP2。该结果表明GASP1与GASP2很可能具有不同的生物学特异性。GASP1与GASP2均存在于人体中(同小鼠具有＞90％的一致性)。目前，NCBI nr数据库可提供人类GASP1的序列，编号为gi|18652308。尽管GDF-8在人类血清中的浓度远低于在小鼠血清中发现的浓度(Hill et al.(2002)J.Biol.Chem.，277：40735-40741)，蛋白质的质谱分析仍令我们可以从人类血清来源的JA16免疫沉淀中鉴定出GASP1人类同源物所对应的3种肽(表1)。在相应的阴性对照中未发现这些肽中的任意一种。此外，在这些实验中也未发现人类GASP2的存在迹象。因此，小鼠与人类中均存在GASP1与GDF-8之间的相互作用。
GDF-8差不多全部在骨骼肌中生成。为确定GASP1 mRNA的组织分配情况，由小鼠多个组织和不同阶段的胚胎生成的首链cDNA扩增GASP1的一个551bp的片段(图10)。采用Advantage cDNA PCR试剂盒(Clontech)，并根据生产商的推荐方法，由标准化的小鼠首链cDNA组(Clontech，Palo Alto CA)扩增一个小鼠GASP1片段(正向引物：5’TTGGCCACTGCCACCACAATCTCAACCACTT3’(SEQ IDNO：46)；反向引物：5’TCTCAGCATGGCCATGCCGCCGTCGA3’(SEQ ID NO：47))。GASP1的表达范围似乎相当广泛，在骨骼肌和心脏中的表达尤其高。在脑、肺和睾丸中也有显著表达。与之相比，肝脏与肾脏表达GASP1 mRANA的水平相对较低。在发育过程中，GASP1 mRNA的水平仍然相当恒定，可能在小鼠胚胎形成的第7和第11天稍微有所提高。
实施例8：人类和小鼠血清中的GDF-8
GDF-8在人类血清中的浓度远低于在小鼠血清中发现的浓度。由于GDF-8可能是治疗目标，因而需要确定人体中循环GDF-8复合体的组成。该认识将确定小鼠模型的有效性，并可能识别出可选治疗目标。因此，采用人类血清对GDF-8重复进行以JA16为基础的亲和纯化。由于GDF-8在人类血清中的水平低于在小鼠血清中的水平，因而未观察到成熟GDF-8和GDF-8前肽/FLRG所对应的条带(图11A)。不过，采用多克隆抗体进行的蛋白质印迹分析识别出了GDF-8的成熟区，表明在JA16纯化样品中存在成熟和未加工的GDF-8(图11B)。
我们利用质谱分析方法的高灵敏性鉴定与成熟GDF-8共同纯化所获的蛋白质。将分别从阴性对照和JA16结合珠洗脱的肽洗脱样品所对应凝胶切分为16份。对这几份凝胶进行胶内胰蛋白酶消化、纳米流LC-MS/MS，并如上所述进行Sequest分析。
有趣的是，仅特定于JA16样品，而阴性对照中未鉴定出的肽为成熟GDF-8、GDF-8前肽、人类FLRG和GASP1的人类同源物。分别从这些蛋白质中发现的肽列于表1(SEQ ID NO：36-45)，代表性MS/MS图谱如图12所示。因此，在小鼠和人类体内似乎均存在GDF-8复合体。
实施例9：小鼠GASP1的克隆和表征
鉴定了预测的GASP1序列之后，需要确定小鼠GASP1的实际序列。基于Celera预测序列，通过采用PfuTurbo聚合酶(Stratagene)及引物(fp：5’CACCATGTGTGCCCCAGGGTATCATCGGTTCTGG3’(SEQ ID NO：50)；rp：5’TTGCAAGCCCAGGAAGTCCTTGAGGAC3’(SEQ ID NO：51))进行PCR，从小鼠心脏QUICKCLONE cDNA(Clontech)扩增GASP1编码序列。将该反应所获PCR产物上样在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，对应的是单独的主要条带，大约有1700个碱基对。继而根据生产商的推荐方法，将扩增的DNA克隆进pcDNA3.1D/V5-His-TOPO载体(Invitrogen)的TOPO位点，从而使该载体包括一个框架内C末端V5-His标记。对插入的全长cDNA的双链进行测序。小鼠GASP1克隆的核苷酸序列如图13所示。该克隆除了在摆动密码子中存在某些并不会改变预测氨基酸序列的碱基取代外，与预测Celera序列是匹配的(即288C：G；294G：A；615G：A；738A：G；768C：T；1407A：G；1419A：G和1584C：G，其中指示位置的首个碱基是由Celera报告的，第二个碱基获得自该克隆的测序；见图6A和B)。
为确定GASP1蛋白质的N末端加工，我们采用编码小鼠GASP1(GASP1-V5-His)的哺乳动物表达载体转染COS1细胞，其中该小鼠GASP1是采用C末端V5-His标记克隆的。48小时后收获无血清条件培养基，并通过蛋白质印迹分析，采用抗V5多克隆抗体(Sigma)进行分析。更具体而言，利用FuGENE 6试剂(Roche)，在无血清Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基中，由GASP1-V5-His/pcDNA3.1D-V5-His-TOPO或空载体转染COS1细胞后48小时收集条件培养基。
电泳结果可见大约80kDa的一条单独条带，证实GASP1被分泌进入条件培养基中(数据未显示)。将大约10ml条件培养基上样至His-亲和柱，并通过反相色谱进一步纯化。该纯化方案在考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶上获得了预期大小的全长GASP1的条带。对该条带的Edman测序证实N末端序列为L-P-P-I-R-Y-S-H-A-G-I(SEQ IDNO：52)。因此，GASP1的氨基酸1-29构成了加工和分泌期间被移除的信号序列。
实施例10：重组所获GASP1与GDF-8前肽和成熟GDF-8的结合
继而应确定的是重组所获GASP1具有与分离自小鼠血清的GASP1相同的GDF-8结合模式。为采用重组蛋白质进行免疫沉淀，将获得自载体或GASP1所转染细胞的400μl条件培养基与1.2μg重组纯化的GDF-8和/或GDF-8前肽蛋白质混合(Thies et al.，2001)。4℃条件下，采用补加条件培养基培养JA16(10μl包装体积)或抗V5(30μl)所结合的琼脂糖珠2小时，并于冷的含1％Triton的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次，于PBS中洗涤两次。将珠体重新悬浮于50μl含DTT的1×LDS缓冲液中。如前所述进行蛋白质印迹分析(Hill et al.，2002)。
为证实并进一步表征GDF-8与GASP1之间的相互作用，我们采用获得自载体对照或GASP1-V5-His所转染COS1细胞的条件培养基温育已纯化的重组GDF-8和已纯化的重组GDF-8前肽。继而采用已结合JA16的琼脂糖珠免疫沉淀GDF-8，并利用蛋白质印迹分析寻找GASP1与GDF-8前肽的共纯化(图15A)。GASP1(泳道3)和GDF-8前肽(泳道1)均可与GDF-8共同免疫沉淀，证明GDF-8可与这两种蛋白质相互作用。在缺乏GDF-8的JA16免疫沉淀中未检测到GASP1或前肽(泳道4)，排除了这些实验中非特异性结合的可能性。当三种蛋白质均存在时，GASP1和GDF-8前肽均可与GDF-8一起沉淀，说明这些蛋白质可能形成一种三元复合体(泳道5)。不过，该实验并未排除GASP1和前肽均与单个GDF-8分子上的相同表位结合的可能性。
为进一步证实GASP1与GDF-8之间的相互作用，我们通过将补充有GDF-8和/或GDF-8前肽重组蛋白质的条件培养基中的GASP1沉淀，以进行反向免疫沉淀。为实现该实验，我们采用了琼脂糖结合的单克隆抗体，该抗体直接与GASP1上C末端V5-His标记的V5表位对应。结果与预期相同，GDF-8与GASP1共同免疫沉淀(图15B，泳道3和5)，进一步证实这些蛋白质之间的直接相互作用。令人惊讶的是，GDF-8前肽甚至在GDF-8存在的情况下也可与GASP1共纯化(泳道4)，说明GDF-8前肽可与GASP1直接结合。因此，GASP1可分别与GDF-8和GDF-8前肽结合。而另一种卵泡抑素区蛋白质FLRG则仅与成熟GDF-8结合(Hill et al.(2002)J.Biol.Chem.，277：40735-40741)。同时添加GDF-8与前肽时，与仅添加前肽时相比，前一种情况中与GASP1结合的前肽始终少于后一种情况。该观测结果表明GASP1不可与GDF-8小潜伏复合体结合。
实施例11：GASP1介导的对GDF-8和BMP-11，而非活化素或TGF-β1的活性的抑制
将荧光素酶报告构建体pGL3-(CAGA)12(SEQ ID NO：53)(Dennler et al.(1998)EMBO J.，17：3091-3100)瞬间转染进A204或RD横纹肌肉瘤细胞中。采用10ng/ml GDF-8、10ng/ml BMP-11、10ng/m1rh活化素A(R&D Systems)，或0.5ng/ml rh TGF-β1(R&DSystems)于37℃温育来源自载体或GASP1所转染细胞的条件培养基的稀释液30分钟。根据Thies et al.(2001)Growth Factors，18：251-259和Zimmers et al.(2002)Science，296：1486-1488所描述方法测量荧光素酶活性。该实验中，A204细胞可应答GDF-8、BMP-11和活化素，但对TGF-β1的应答不佳。RD细胞可应答GDF-8和TGF-β1。因此，我们采用A204细胞以检验GASP1对GDF-8、BMP-11和活化素的抑制能力，以及RD细胞监测TGF-β和GDF-8的活性的能力。对GDF-8的结果由A204细胞显示，但与RD细胞所显示结果相似。每一实验均生成一个标准曲线，该标准曲线可测量上述各生长因子诱导所产生荧光素酶活性的浓度依赖性(数据未显示)。所用生长因子的浓度在该曲线的线性范围内，因此，浓度的小变化可导致荧光素酶活性的可测量变化。
在(CAGA)12(SEQ ID NO：53)荧光素酶转录报告实验中，两种卵泡抑素区蛋白质，即卵泡抑素和FLRG均可抑制GDF-8活性，而且还抑制相关蛋白质，即活化素和BMP-11的生物学活性。在(CAGA)12(SEQ ID NO：53)报告实验中也检验了GASP1对GDF-8、BMP-11、活化素和TGF-β1活性的抑制能力。
采用已纯化的重组GDF-8(10ng/ml)、BMP-11(10ng/ml)、活化素(10ng/ml)或TGF-β1(0.5ng/ml)温育V5-His标记GASP1或载体对照所转染COS细胞的条件培养基的不同稀释液，并分析表达(CAGA)12(SEQ ID NO：53)报告构建体的横纹肌肉瘤细胞中生长因子的活性。GASP1以浓度依赖方式有效抑制了GDF-8的活性(图16A)。GASP1在该实验中也类似地抑制了BMP-11的活性(图16B)，可能与预期的一样，因为成熟GDF-8与BMP-11均高度保守，仅存在11个氨基酸的差异。令人惊讶的是，GASP1并不抑制活化素或TGF-β1的活性(图16C和D)，说明了卵泡抑素本身未能证实的很高水平的特异性。因此，GASP1在其对GDF-8和BMP-11的抑制方面表现了特异性。
通过在报告基因实验中确定抑制GDF-8的IC50，以评估GASP1对GDF-8的亲和性。在钴亲和柱上，并如前所述方法进行洗脱，从条件培养基中纯化获得了GASP1-V5-His蛋白质。通过采用BioSep3000柱(Phenomenex)在PBS中进行的尺寸排阻色谱，进一步纯化含GASP1的馏分。如图17所示，GASP1抑制GDF-8的IC50大约为3nM。
实施例12：肌肉病症的治疗
根据表2，GASP1可以被施用给患有与GDF-8机能相关的疾病或病症的患者。对患者一次性或定期地，如每天一次施用该组合物，其疾病或病症的症状便可得以改善。例如，通过测量肌肉质量、肌肉活性和/或肌肉紧张性便可知与肌肉病症相关的症状被改善了。说明本发明的组合物可用于治疗与GDF-8机能相关的疾病或病症，如肌肉病症。
表2：GASP1的施用
| 患者 | 疾病 | 给药途径 | 剂量 | 给药频率 | 预测结果 |
| 1 | 肌营养不良症 | 皮下 | 25mg | 每天一次 | 肌肉量增加，肌肉活性提高 |
| 2 | “ | “ | 50mg | “ | “ |
| 3 | “ | “ | 50mg | 每周一次 | “ |
| 4 | “ | “ | 50mg | 每月一次 | “ |
| 5 | “ | 肌肉内 | 25mg | 每天一次 | “ |
| 6 | “ | 50mg | “ | ||
| 7 | “ | “ | 50mg | 每周一次 | “ |
| 8 | “ | “ | 50mg | 每月一次 | “ |
| 9 | “ | 静脉内 | 25mg | 每天一次 | “ |
| 10 | “ | 50mg | “ | “ | |
| 11 | “ | “ | 50mg | 每周一次 | “ |
| 12 | “ | 50mg | 每月一次 | “ | |
| 13 | 糖尿病 | 皮下 | 50mg | 每天一次 | 血糖水平的控制改善 |
| 14 | “ | “ | 50mg | 每周一次 | “ |
| 15 | “ | 肌肉内 | 50mg | “ | “ |
| 16 | “ | 静脉内 | 50mg | “ | “ |
| 17 | 肥胖症 | 皮下 | 50mg | 每天一次 | 减重，肌肉量增加 |
| 18 | “ | 肌肉内 | 50mg | 每周一次 | “ |
| 19 | 静脉内 | 50mg | “ |
贯穿本申请所引用的所有文献、专利和已公开专利申请的全部内容均被引入在此，以供参考。上述详细描述仅为例证。可以对上述实施方案进行大范围的变换和修改。因此，应当理解的是，下述权利要求，包括所有等效物旨在定义本发明的范畴。
序列表
<110>HILL，JENNIFER J.
WOLFMAN，NEIL M.
<120>含卵泡抑素区的蛋白质
<130>08702.0015-00
<140>
<141>
<150>60/357,846
<151>2002-02-21
<150>60/434,645
<151>2002-12-20
<160>53
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1716
<212>DNA
<213>小鼠(Mus sp.)
<400>1
atgtgtgccc cagggtatca tcggttctgg tttcactggg ggctgctgtt gctgctgctc 60
ctcgaggctc cccttcgagg cctagcactg ccacccatcc gatactccca tgcgggcatc 120
tgccccaacg acatgaaccc caacctctgg gtggatgccc agagcacctg caagcgagag 180
tgtgaaacag accaggaatg tgagacctat gagaaatgct gccccaatgt gtgtgggacc 240
aagagctgtg tggcagcccg ctacatggat gtgaaaggga agaagggccc tgtgggcatg 300
cccaaggagg ccacatgtga ccatttcatg tgcctgcagc agggctctga gtgtgacatc 360
tgggacggcc agcccgtgtg taagtgcaaa gatcgctgtg agaaggagcc cagcttcacc 420
tgtgcctctg atggccttac ctactacaac cgttgcttca tggacgccga agcctgctcc 480
aagggcatca cactgtctgt ggtcacctgt cgttatcact tcacctggcc taacaccagc 540
cctccaccgc ctgagaccac ggtgcatccc accaccgcct ctccggagac tctcgggctg 600
gacatggcag ccccggccct gctcaaccac cctgtccatc agtcagtcac cgtgggtgag 660
actgtgagtt tcctctgtga cgtggtaggc cggcctcggc cagagctcac ttgggagaaa 720
cagctggagg accgagaaaa tgttgtcatg aggcccaacc acgtgcgcgg taatgtggtg 780
gtcactaaca ttgcccagct ggtcatctac aacgtccagc cccaggatgc tggcatatac 840
acctgtacag ctcgaaatgt cgctggtgtc ctgagggctg acttcccgtt gtcggtggtc 900
aggggtggtc aggccagggc cacttcagag agcagtctca atggcacagc ttttccagca 960
acagagtgcc tgaagccccc agacagtgag gactgtggag aggagcagac acgctggcac 1020
ttcgacgccc aggctaacaa ctgcctcact ttcacctttg gccactgcca ccacaatctc 1080
aaccactttg agacctacga ggcctgtatg ctggcttgta tgagtgggcc attggccacc 1140
tgcagcctgc ctgccctgca agggccttgc aaagcttatg tcccacgctg ggcctacaac 1200
agccagacag gcctatgcca gtccttcgtc tatggcggct gtgagggcaa cggtaacaac 1260
tttgaaagcc gtgaggcttg tgaggagtcg tgtcccttcc cgaggggtaa ccagcactgc 1320
cgggcctgca agccccggca aaaacttgtt accagcttct gtcggagtga ctttgtcatc 1380
ctgggcaggg tctctgagct gaccgaagag caagactcag gccgtgccct ggtgaccgtg 1440
gatgaggtct taaaagatga gaagatgggc ctcaagtttc tgggccggga gcctctggaa 1500
gtcaccctgc ttcatgtaga ctggacctgt ccttgcccca acgtgacagt gggtgagaca 1560
ccactcatca tcatggggga ggtcgacggc ggcatggcca tgctgagacc cgatagcttt 1620
gtgggggcat cgagcacacg gcgggtcagg aagctccgtg aggtcatgta caagaaaacc 1680
tgtgacgtcc tcaaggactt cctgggcttg caatga 1716
<210>2
<211>1716
<212>DNA
<213>小鼠
<400>2
atgtgtgccc cagggtatca tcggttctgg tttcactggg ggctgctgtt gctgctgctc 60
ctcgaggctc cccttcgagg cctagcactg ccacccatcc gatactccca tgcgggcatc 120
tgccccaacg acatgaaccc caacctctgg gtggatgccc agagcacctg caagcgagag 180
tgtgaaacag accaggaatg tgagacctat gagaaatgct gccccaatgt gtgtgggacc 240
aagagctgtg tggcagcccg ctacatggat gtgaaaggga agaaggggcc tgtaggcatg 300
cccaaggagg ccacatgtga ccatttcatg tgcctgcagc agggctctga gtgtgacatc 360
tgggacggcc agcccgtgtg taagtgcaaa gatcgctgtg agaaggagcc cagcttcacc 420
tgtgcctctg atggccttac ctactacaac cgttgcttca tggacgccga agcctgctcc 480
aagggcatca cactgtctgt ggtcacctgt cgttatcact tcacctggcc taacaccagc 540
cctccaccgc ctgagaccac ggtgcatccc accaccgcct ctccggagac tctcgggctg 600
gacatggcag ccccagccct gctcaaccac cctgtccatc agtcagtcac cgtgggtgag 660
actgtgagtt tcctctgtga cgtggtaggc cggcctcggc cagagctcac ttgggagaaa 720
cagctggagg accgagagaa tgttgtcatg aggcccaacc acgtgcgtgg taatgtggtg 780
gtcactaaca ttgcccagct ggtcatctac aacgtccagc cccaggatgc tggcatatac 840
acctgtacag ctcgaaatgt cgctggtgtc ctgagggctg acttcccgtt gtcggtggtc 900
aggggtggtc aggccagggc cacttcagag agcagtctca atggcacagc ttttccagca 960
acagagtgcc tgaagccccc agacagtgag gactgtggag aggagcagac acgctggcac 1020
ttcgacgccc aggctaacaa ctgcctcact ttcacctttg gccactgcca ccacaatctc 1080
aaccactttg agacctacga ggcctgtatg ctggcttgta tgagtgggcc attggccacc 1140
tgcagcctgc ctgccctgca agggccttgc aaagcttatg tcccacgctg ggcctacaac 1200
agccagacag gcctatgcca gtccttcgtc tatggcggct gtgagggcaa cggtaacaac 1260
tttgaaagcc gtgaggcttg tgaggagtcg tgtcccttcc cgaggggtaa ccagcactgc 1320
cgggcctgca agccccggca aaaacttgtt accagcttct gtcggagtga ctttgtcatc 1380
ctgggcaggg tctctgagct gaccgaggag caagactcgg gccgtgccct ggtgaccgtg 1440
gatgaggtct taaaagatga gaagatgggc ctcaagtttc tgggccggga gcctctggaa 1500
gtcaccctgc ttcatgtaga ctggacctgt ccttgcccca acgtgacagt gggtgagaca 1560
ccactcatca tcatggggga ggtggacggc ggcatggcca tgctgagacc cgatagcttt 1620
gtgggggcat cgagcacacg gcgggtcagg aagctccgtg aggtcatgta caagaaaacc 1680
tgtgacgtcc tcaaggactt cctgggcttg caatga 1716
<210>3
<211>571
<212>PRT
<213>小鼠
<400>3
Met Cys Ala Pro Gly Tyr His Arg Phe Trp Phe His Trp Gly Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Leu Arg Gly Leu Ala Leu Pro Pro
20 25 30
Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn Asp Met Asn Pro Asn
35 40 45
Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Lys Arg Glu Cys Glu Thr Asp
50 55 60
Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro Asn Val Cys Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val Lys Gly Lys Lys Gly
85 90 95
Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp His Phe Met Cys Leu
100 105 110
Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly Gln Pro Val Cys Lys
115 120 125
Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp
130 135 140
Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Phe Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser
145 150 155 160
Lys Gly Ile Thr Leu Ser Val Val Thr Cys Arg Tyr His Phe Thr Trp
165 170 175
Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr Val His Pro Thr Thr
180 185 190
Ala Ser Pro Glu Thr Leu Gly Leu Asp Met Ala Ala Pro Ala Leu Leu
195 200 205
Asn His Pro Val His Gln Ser Val Thr Val Gly Glu Thr Val Ser Phe
210 215 220
Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu Leu Thr Trp Glu Lys
225 230 235 240
Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg Pro Asn His Val Arg
245 250 255
Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu Val Ile Tyr Asn Val
260 265 270
Gln Pro Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Val Ala
275 280 285
Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Arg Gly Gly Gln
290 295 300
Ala Arg Ala Thr Ser Glu Ser Ser Leu Asn Gly Thr Ala Phe Pro Ala
305 310 315 320
Thr Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp Cys Gly Glu Glu Gln
325 330 335
Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn Cys Leu Thr Phe Thr
340 345 350
Phe Gly His Cys His His Asn Leu Asn His Phe Glu Thr Tyr Glu Ala
355 360 365
Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala Thr Cys Ser Leu Pro
370 375 380
Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Val Pro Arg Trp Ala Tyr Asn
385 390 395 400
Ser Gln Thr Gly Leu Cys Gln Ser Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly
405 410 415
Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro
420 425 430
Phe Pro Arg Gly Asn Gln His Cys Arg Ala Cys Lys Pro Arg Gln Lys
435 440 445
Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val Ile Leu Gly Arg Val
450 455 460
Ser Glu Leu Thr Glu Glu Gln Asp Ser Gly Arg Ala Leu Val Thr Val
465 470 475 480
Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Arg
485 490 495
Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp Trp Thr Cys Pro Cys
500 505 510
Pro Asn Val Thr Val Gly Glu Thr Pro Leu Ile Ile Met Gly Glu Val
515 520 525
Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser Phe Val Gly Ala Ser
530 535 540
Ser Thr Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val Met Tyr Lys Lys Thr
545 550 555 560
Cys Asp Val Leu Lys Asp Phe Leu Gly Leu Gln
565 570
<210>4
<211>1923
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(732)
<223>a，t，c或g
<400>4
atgaatccca acctctgggt ggacgcacag agcacctgca ggcgggagtg tgagacggac 60
caggagtgtg agatggacca ggtgagtggg atccagaagc cacagtgtga ggcagaccag 120
gtgaatgggg tccagaagcc gcaatgtgag atggaccaga agtgggagtg tgaggttgac 180
caggtgagtg gggtccagaa gccggtgtgt gaggcggacc aggtgagtgg ggtccagaag 240
ccacagtgtg agatggacca ggtgagtggg atccagaagc tggagtgtga ggcggaccag 300
aagtgggagt atgaggtgga ccaggtgagt ggggtccaga agccacagtg tgagatggac 360
caggtgagtg ggatccagaa gctggagtgt gaggcggacc aggagtgtga gacctatgag 420
aagtgctgcc ccaacgtatg tgggaccaag agctgcgtgg cggcccgcta catggacgtg 480
aaagggaaga agggcccagt gggcatgccc aaggaggcca catgtgacca cttcatgtgt 540
ctgcagcagg gctctgagtg tgacatctgg gatggccagc ccgtgtgtaa gtgcaaagac 600
cgctgtgaga aggagcccag ctttacctgc gcctcggacg gcctcaccta ctataaccgc 660
tgctacatgg atgccgaggc ctgctccaaa ggcatcacac tggccgttgt aacctgccgc 720
tatcacttca cntggcccaa caccagcccc ccaccacctg agaccaccat gcaccccacc 780
acagcctccc cagagacccc tgagctggac atggcggccc ctgcgctgct caacaaccct 840
gtgcaccagt cggtcaccat gggtgagaca gtgagcttcc tctgtgatgt ggtgggccgg 900
ccccggcctg agatcacctg ggagaagcag ttggaggatc gggagaatgt ggtcatgcgg 960
cccaaccatg tgcgtggcaa cgtggtggtc accaacattg cccagctggt catctataac 1020
gcccagctgc aggatgctgg gatctacacc tgcacggccc ggaacgtggc tggggtcctg 1080
agggctgatt tcccgctgtc ggtggtcagg ggtcatcagg ctgcagccac ctcagagagc 1140
agccccaatg gcacggcttt cccggcggcc gagtgcctga agcccccaga cagtgaggac 1200
tgtggcgaag agcagacccg ctggcacttc gatgcccagg ccaacaactg cctgaccttc 1260
accttcggcc actgccaccg taacctcaac cactttgaga cctatgaggc ctgcatgctg 1320
gcctgcatga gcgggccgct ggccgcgtgc agcctgcccg ccctgcaggg gccctgcaaa 1380
gcctacgcgc ctcgctgggc ttacaacagc cagacgggcc agtgccagtc ctttgtctat 1440
ggtggctgcg agggcaatgg caacaacttt gagagccgtg aggcctgtga ggagtcgtgc 1500
cccttcccca gggggaacca gcgctgtcgg gcctgcaagc ctcggcagaa gctcgttacc 1560
agcttctgtc gcagcgactt tgtcatcctg ggccgagtct ctgagctgac cgaggagcct 1620
gactcgggcc gcgccctggt gactgtggat gaggtcctaa aggatgagaa aatgggcctc 1680
aagttcctgg gccaggagcc attggaggtc actctgcttc acgtggactg ggcatgcccc 1740
tgccccaacg tgaccgtgag cgagatgccg ctcatcatca tgggggaggt ggacggcggc 1800
atggccatgc tgcgccccga tagctttgtg ggcgcatcga gtgcccgccg ggtcaggaag 1860
cttcgtgagg tcatgcacaa gaagacctgt gacgtcctca aggagtttct tggcttgcac 1920
tga 1923
<210>5
<211>640
<212>PRT
<213>人
<400>5
Met Asn Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Arg Arg Glu
1 5 10 15
Cys Glu Thr Asp Gln Glu Cys Glu Met Asp Gln Val Ser Gly Ile Gln
20 25 30
Lys Pro Gln Cys Glu Ala Asp Gln Val Asn Gly Val Gln Lys Pro Gln
35 40 45
Cys Glu Met Asp Gln Lys Trp Glu Cys Glu Val Asp Gln Val Ser Gly
50 55 60
Val Gln Lys Pro Val Cys Glu Ala Asp Gln Val Ser Gly Val Gln Lys
65 70 75 80
Pro Gln Cys Glu Met Asp Gln Val Ser Gly Ile Gln Lys Leu Glu Cys
85 90 95
Glu Ala Asp Gln Lys Trp Glu Tyr Glu Val Asp Gln Val Ser Gly Val
100 105 110
Gln Lys Pro Gln Cys Glu Met Asp Gln Val Ser Gly Ile Gln Lys Leu
115 120 125
Glu Cys Glu Ala Asp Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro
130 135 140
Asn Val Cys Gly Thr Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val
145 150 155 160
Lys Gly Lys Lys Gly Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp
165 170 175
His Phe Met Cys Leu Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly
180 185 190
Gln Pro Val Cys Lys Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe
195 200 205
Thr Cys Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr Met Asp
210 215 220
Ala Glu Ala Cys Ser Lys Gly Ile Thr Leu Ala Val Val Thr Cys Arg
225 230 235 240
Tyr His Phe Thr Trp Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr
245 250 255
Met His Pro Thr Thr Ala Ser Pro Glu Thr Pro Glu Leu Asp Met Ala
260 265 270
Ala Pro Ala Leu Leu Asn Asn Pro Val His Gln Ser Val Thr Met Gly
275 280 285
Glu Thr Val Ser Phe Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu
290 295 300
Ile Thr Trp Glu Lys Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg
305 310 315 320
Pro Asn His Val Arg Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu
325 330 335
Val Ile Tyr Asn Ala Gln Leu Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr Cys Thr
340 345 350
Ala Arg Asn Val Ala Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val
355 360 365
Val Arg Gly His Gln Ala Ala Ala Thr Ser Glu Ser Ser Pro Asn Gly
370 375 380
Thr Ala Phe Pro Ala Ala Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp
385 390 395 400
Cys Gly Glu Glu Gln Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn
405 410 415
Cys Leu Thr Phe Thr Phe Gly His Cys His Arg Asn Leu Asn His Phe
420 425 430
Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala
435 440 445
Ala Cys Ser Leu Pro Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Ala Pro
450 455 460
Arg Trp Ala Tyr Asn Ser Gln Thr Gly Gln Cys Gln Ser Phe Val Tyr
465 470 475 480
Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys
485 490 495
Glu Glu Ser Cys Pro Phe Pro Arg Gly Asn Gln Arg Cys Arg Ala Cys
500 505 510
Lys Pro Arg Gln Lys Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val
515 520 525
Ile Leu Gly Arg Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Pro Asp Ser Gly Arg
530 535 540
Ala Leu Val Thr Val Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu
545 550 555 560
Lys Phe Leu Gly Gln Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp
565 570 575
Trp Ala Cys Pro Cys Pro Asn Val Thr Val Ser Glu Met Pro Leu Ile
580 585 590
Ile Met Gly Glu Val Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser
595 600 605
Phe Val Gly Ala Ser Ser Ala Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val
610 615 620
Met His Lys Lys Thr Cys Asp Val Leu Lys Glu Phe Leu Gly Leu His
625 630 635 640
<210>6
<211>1731
<212>DNA
<213>人
<400>6
atgtgggccc caaggtgtcg ccggttctgg tctcgctggg agcaggtggc agcgctgctg 60
ctgctgctgc tactgctcgg ggtgcccccg cgaagcctgg cgctgccgcc catccgctat 120
tcccacgccg gcatctgccc caacgacatg aatcccaacc tctgggtgga cgcacagagc 180
acctgcaggc gggagtgtga gacggaccag gagtgtgaga cctatgagaa gtgctgcccc 240
aacgtatgtg ggaccaagag ctgcgtggcg gcccgctaca tggacgtgaa agggaagaag 300
ggcccagtgg gcatgcccaa ggaggccaca tgtgaccact tcatgtgtct gcagcagggc 360
tctgagtgtg acatctggga tggccagccc gtgtgtaagt gcaaagaccg ctgtgagaag 420
gagcccagct ttacctgcgc ctcggacggc ctcacctact ataaccgctg ctacatggat 480
gccgaggcct gctccaaagg catcacactg gccgttgtaa cctgccgcta tcacttcacc 540
tggcccaaca ccagcccccc accacctgag accaccatgc accccaccac agcctcccca 600
gagacccctg agctggacat ggcggcccct gcgctgctca acaaccctgt gcaccagtcg 660
gtcaccatgg gtgagacagt gagtttcctc tgtgatgtgg tgggccggcc ccggcctgag 720
atcacctggg agaagcagtt ggaggatcgg gagaatgtgg tcatgcggcc caaccatgtg 780
cgtggcaacg tggtggtcac caacattgcc cagctggtca tctataacgc ccagctgcag 840
gatgctggga tctacacctg cacggcccgg aacgtggctg gggtcctgag ggctgatttc 900
ccgctgtcgg tggtcagggg tcatcaggct gcagccacct cagagagcag ccccaatggc 960
acggctttcc cggcggccga gtgcctgaag cccccagaca gtgaggactg tggcgaagag 1020
cagacccgct ggcacttcga tgcccaggcc aacaactgcc tgaccttcac cttcggccac 1080
tgccaccgta acctcaacca ctttgagacc tatgaggcct gcatgctggc ctgcatgagc 1140
gggccgctgg ccgcgtgcag cctgcccgcc ctgcaggggc cctgcaaagc ctacgcgcct 1200
cgctgggctt acaacagcca gacgggccag tgccagtcct ttgtctatgg tggctgcgag 1260
ggcaatggca acaactttga gagccgtgag gcctgtgagg agtcgtgccc cttccccagg 1320
gggaaccagc gctgtcgggc ctgcaagcct cggcagaagc tcgttaccag cttctgtcgc 1380
agcgactttg tcatcctggg ccgagtctct gagctgaccg aggagcctga ctcgggccgc 1440
gccctggtga ctgtggatga ggtcctaaag gatgagaaaa tgggcctcaa gttcctgggc 1500
caggagccat tggaggtcac tctgcttcac gtggactggg catgcccctg ccccaacgtg 1560
accgtgagcg agatgccgct catcatcatg ggggaggtgg acggcggcat ggccatgctg 1620
cgccccgata gctttgtggg cgcatcgagt gcccgccggg tcaggaagct tcgtgaggtc 1680
atgcacaaga agacctgtga cgtcctcaag gagtttcttg gcttgcactg a 1731
<210>7
<211>576
<212>PRT
<213>人
<400>7
Met Trp Ala Pro Arg Cys Arg Arg Phe Trp Ser Arg Trp Glu Gln Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Pro Pro Arg Ser
20 25 30
Leu Ala Leu Pro Pro Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn
35 40 45
Asp Met Asn Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Arg Arg
50 55 60
Glu Cys Glu Thr Asp Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro
65 70 75 80
Asn Val Cys Gly Thr Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val
85 90 95
Lys Gly Lys Lys Gly Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp
100 105 110
His Phe Met Cys Leu Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly
115 120 125
Gln Pro Val Cys Lys Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe
130 135 140
Thr Cys Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr Met Asp
145 150 155 160
Ala Glu Ala Cys Ser Lys Gly Ile Thr Leu Ala Val Val Thr Cys Arg
165 170 175
Tyr His Phe Thr Trp Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr
180 185 190
Met His Pro Thr Thr Ala Ser Pro Glu Thr Pro Glu Leu Asp Met Ala
195 200 205
Ala Pro Ala Leu Leu Asn Asn Pro Val His Gln Ser Val Thr Met Gly
210 215 220
Glu Thr Val Ser Phe Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu
225 230 235 240
Ile Thr Trp Glu Lys Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg
245 250 255
Pro Asn His Val Arg Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu
260 265 270
Val Ile Tyr Asn Ala Gln Leu Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr Cys Thr
275 280 285
Ala Arg Asn Val Ala Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val
290 295 300
Val Arg Gly His Gln Ala Ala Ala Thr Ser Glu Ser Ser Pro Asn Gly
305 310 315 320
Thr Ala Phe Pro Ala Ala Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp
325 330 335
Cys Gly Glu Glu Gln Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn
340 345 350
Cys Leu Thr Phe Thr Phe Gly His Cys His Arg Asn Leu Asn His Phe
355 360 365
Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala
370 375 380
Ala Cys Ser Leu Pro Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Ala Pro
385 390 395 400
Arg Trp Ala Tyr Asn Ser Gln Thr Gly Gln Cys Gln Ser Phe Val Tyr
405 410 415
Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys
420 425 430
Glu Glu Ser Cys Pro Phe Pro Arg Gly Asn Gln Arg Cys Arg Ala Cys
435 440 445
Lys Pro Arg Gln Lys Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val
450 455 460
Ile Leu Gly Arg Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Pro AsP Ser Gly Arg
465 470 475 480
Ala Leu Val Thr Val Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu
485 490 495
Lys Phe Leu Gly Gln Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp
500 505 510
Trp Ala Cys Pro Cys Pro Asn Val Thr Val Ser Glu Met Pro Leu Ile
515 520 525
Ile Met Gly Glu Val Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser
530 535 540
Phe Val Gly Ala Ser Ser Ala Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val
545 550 555 560
Met His Lys Lys Thr Cys Asp Val Leu Lys Glu Phe Leu Gly Leu His
565 570 575
<210>8
<211>1659
<212>DNA
<213>小鼠
<400>8
atgcctgccc cacagccatt cctgcctctg ctctttgtct tcgtgctcat ccatctgacc 60
tcggagacca acctgctgcc agatcccgga agccatcctg gcatgtgccc caacgagctc 120
agcccccacc tgtgggtcga cgcccagagc acctgtgagc gtgagtgtac cggggaccag 180
gactgtgcgg catccgagaa gtgctgcacc aatgtgtgtg ggctgcagag ctgcgtggct 240
gcccgctttc ccagtggtgg cccagctgta cctgagacag cagcctcctg tgaaggcttc 300
caatgcccac aacagggttc tgactgtgac atctgggatg ggcagccagt ttgtcgctgc 360
cgtgaccgct gtgaaaaaga acccagcttc acatgtgctt ctgatggcct tacctattac 420
aaccgctgct acatggacgc agaagcctgc ctgcggggtc tccacctgca cgttgtaccc 480
tgtaagcaca ttctcagttg gccgcccagc agcccgggac cacccgagac cactgctcgc 540
ccaacccctg gggctgctcc catgccacct gccctgtaca acagcccctc accacaggca 600
gtgcatgttg gggggacagc cagcctccac tgtgatgtta gtggccgtcc accacctgct 660
gtgacctggg agaagcagag ccatcagcgg gagaacctga tcatgcgccc tgaccaaatg 720
tatggcaacg tggttgtcac cagtatcgga cagctagtcc tctacaatgc tcagttggag 780
gatgcgggcc tgtatacctg cactgcacga aacgctgccg gcctgctgcg ggccgacttt 840
cccctttccg ttttacagcg ggcaactact caggacaggg acccaggtat cccagccttg 900
gctgagtgcc aggccgacac acaagcctgt gttgggccac ctactcccca tcatgtcctt 960
tggcgctttg acccacagag aggcagctgc atgacattcc cagccctcag atgtgatggg 1020
gctgcccggg gctttgagac ctatgaggca tgccagcagg cctgtgttcg tggccccggg 1080
gatgtctgtg cactgcctgc agttcagggg ccctgccagg gctgggagcc acgctgggcc 1140
tacagcccac tgctacagca gtgccacccc tttgtataca gtggctgtga aggaaacagc 1200
aataactttg agacccggga gagctgtgag gatgcttgcc ctgtaccacg cacaccaccc 1260
tgtcgtgcct gccgcctcaa gagcaagctg gctctgagct tgtgccgcag tgactttgcc 1320
atcgtgggga gactcacaga ggtcctggag gagcccgagg ctgcaggcgg catagctcgt 1380
gtggccttgg atgatgtgct aaaggacgac aagatgggcc tcaagttctt gggcaccaaa 1440
tacctggagg tgacattgag tggcatggac tgggcctgcc catgccccaa cgtgacagct 1500
gtcgatgggc cactggtcat catgggtgag gttcgtgaag gtgtggctgt gttggacgcc 1560
aacagctatg tccgtgctgc cagcgagaag cgagtcaaga agattgtgga actgctcgag 1620
aagaaggctt gtgaactgct caaccgcttc caagactag 1659
<210>9
<211>552
<212>PRT
<213>小鼠
<400>9
Met Pro Ala Pro Gln Pro Phe Leu Pro Leu Leu Phe Val Phe Val Leu
1 5 10 15
Ile His Leu Thr Ser Glu Thr Asn Leu Leu Pro Asp Pro Gly Ser His
20 25 30
Pro Gly Met Cys Pro Asn Glu Leu Ser Pro His Leu Trp Val Asp Ala
35 40 45
Gln Ser Thr Cys Glu Arg Glu Cys Thr Gly Asp Gln Asp Cys Ala Ala
50 55 60
Ser Glu Lys Cys Cys Thr Asn Val Cys Gly Leu Gln Ser Cys Val Ala
65 70 75 80
Ala Arg Phe Pro Ser Gly Gly Pro Ala Val Pro Glu Thr Ala Ala Ser
85 90 95
Cys Glu Gly Phe Gln Cys Pro Gln Gln Gly Ser Asp Cys Asp Ile Trp
100 105 110
Asp Gly Gln Pro Val Cys Arg Cys Arg Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro
115 120 125
Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr
130 135 140
Met Asp Ala Glu Ala Cys Leu Arg Gly Leu His Leu His Val Val Pro
145 150 155 160
Cys Lys His Ile Leu Ser Trp Pro Pro Ser Ser Pro Gly Pro Pro Glu
165 170 175
Thr Thr Ala Arg Pro Thr Pro Gly Ala Ala Pro Met Pro Pro Ala Leu
180 185 190
Tyr Asn Ser Pro Ser Pro Gln Ala Val His Val Gly Gly Thr Ala Ser
195 200 205
Leu His Cys Asp Val Ser Gly Arg Pro Pro Pro Ala Val Thr Trp Glu
210 215 220
Lys Gln Ser His Gln Arg Glu Asn Leu Ile Met Arg Pro Asp Gln Met
225 230 235 240
Tyr Gly Asn Val Val Val Thr Ser Ile Gly Gln Leu Val Leu Tyr Asn
245 250 255
Ala Gln Leu Glu Asp Ala Gly Leu Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Ala
260 265 270
Ala Gly Leu Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Leu Gln Arg Ala
275 280 285
Thr Thr Gln Asp Arg Asp Pro Gly Ile Pro Ala Leu Ala Glu Cys Gln
290 295 300
Ala Asp Thr Gln Ala Cys Val Gly Pro Pro Thr Pro His His Val Leu
305 310 315 320
Trp Arg Phe Asp Pro Gln Arg Gly Ser Cys Met Thr Phe Pro Ala Leu
325 330 335
Arg Cys Asp Gly Ala Ala Arg Gly Phe Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Gln
340 345 350
Gln Ala Cys Val Arg Gly Pro Gly Asp Val Cys Ala Leu Pro Ala Val
355 360 365
Gln Gly Pro Cys Gln Gly Trp Glu Pro Arg Trp Ala Tyr Ser Pro Leu
370 375 380
Leu Gln Gln Cys His Pro Phe Val Tyr Ser Gly Cys Glu Gly Asn Ser
385 390 395 400
Asn Asn Phe Glu Thr Arg Glu Ser Cys Glu Asp Ala Cys Pro Val Pro
405 410 415
Arg Thr Pro Pro Cys Arg Ala Cys Arg Leu Lys Ser Lys Leu Ala Leu
420 425 430
Ser Leu Cys Arg Ser Asp Phe Ala Ile Val Gly Arg Leu Thr Glu Val
435 440 445
Leu Glu Glu Pro Glu Ala Ala Gly Gly Ile Ala Arg Val Ala Leu Asp
450 455 460
Asp Val Leu Lys Asp Asp Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Thr Lys
465 470 475 480
Tyr Leu Glu Val Thr Leu Ser Gly Met Asp Trp Ala Cys Pro Cys Pro
485 490 495
Asn Val Thr Ala Val Asp Gly Pro Leu Val Ile Met Gly Glu Val Arg
500 505 510
Glu Gly Val Ala Val Leu Asp Ala Asn Ser Tyr Val Arg Ala Ala Ser
515 520 525
Glu Lys Arg Val Lys Lys Ile Val Glu Leu Leu Glu Lys Lys Ala Cys
530 535 540
Glu Leu Leu Asn Arg Phe Gln Asp
545 550
<210>10
<211>1695
<212>DNA
<213>人
<400>10
atgcccgccc tacgtccact cctgccgctc ctgctcctcc tccggctgac ctcgggggct 60
ggcttgctgc cagggctggg gagccacccg ggcgtgtgcc ccaaccagct cagccccaac 120
ctgtgggtgg acgcccagag cacctgtgag cgcgagtgta gcagggacca ggactgtgcg 180
gctgctgaga agtgctgcat caacgtgtgt ggactgcaca gctgcgtggc agcacgcttc 240
cccggcagcc cagctgcgcc gacgacagcg gcctcctgcg agggctttgt gtgcccacag 300
cagggctcgg actgcgacat ctgggacggg cagcccgtgt gccgctgccg cgaccgctgt 360
gagaaggagc ccagcttcac ctgcgcctcg gacggcctca cctactacaa ccgctgctat 420
atggacgccg aggcctgcct gcggggcctg cacctccaca tcgtgccctg caagcacgtg 480
ctcagctggc cgcccagcag cccggggccg ccggagacca ctgcccgccc cacacctggg 540
gccgcgcccg tgcctcctgc cctgtacagc agcccctccc cacaggcggt gcaggttggg 600
ggtacggcca gcctccactg cgacgtcagc ggccgcccgc cgcctgctgt gacctgggag 660
aagcagagtc accagcgaga gaacctgatc atgcgccctg atcagatgta tggcaacgtg 720
gtggtcacca gcatcgggca gctggtgctc tacaacgcgc ggcccgaaga cgccggcctg 780
tacacctgca ccgcgcgcaa cgctgctggg ctgctgcggg ctgacttccc actctctgtg 840
gtccagcgag agccggccag ggacgcagcc cccagcatcc cagccccggc cgagtgcctg 900
ccggatgtgc aggcctgcac gggccccact tccccacacc ttgtcctctg gcactacgac 960
ccgcagcggg gcggctgcat gaccttcccg gcccgtggct gtgatggggc ggcccgcggc 1020
tttgagacct acgaggcatg ccagcaggcc tgtgcccgcg gccccggcga cgcctgcgtg 1080
ctgcctgccg tgcagggccc ctgccggggc tgggagccgc gctgggccta cagcccgctg 1140
ctgcagcagt gccatccctt cgtgtacggt ggctgcgagg gcaacggcaa caacttccac 1200
agccgcgaga gctgcgagga tgcctgcccc gtgccgcgca caccgccctg ccgcgcctgc 1260
cgcctccgga gcaagctggc gctgagcctg tgccgcagcg acttcgccat cgtggggcgg 1320
ctcacggagg tgctggagga gcccgaggcc gccggcggca tcgcccgcgt ggcgctcgag 1380
gacgtgctca aggatgacaa gatgggcctc aagttcttgg gcaccaagta cctggaggtg 1440
acgctgagtg gcatggactg ggcctgcccc tgccccaaca tgacggcggg cgacgggccg 1500
ctggtcatca tgggtgaggt gcgcgatggc gtggccgtgc tggacgccgg cagctacgtc 1560
cgcgccgcca gcgagaagcg cgtcaagaag atcttggagc tgctggagaa gcaggcctgc 1620
gagctgctca accgcttcca ggactagccc ccgcaggggc ctgcgccacc ccgtcctggt 1680
gaataaacgc actcc 1695
<210>11
<211>548
<212>PRT
<213>人
<400>11
Met Pro Ala Leu Arg Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg Leu
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ala Gly Leu Leu Pro Gly Leu Gly Ser His Pro Gly Val
20 25 30
Cys Pro Asn Gln Leu Ser Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr
35 40 45
Cys Glu Arg Glu Cys Ser Arg Asp Gln Asp Cys Ala Ala Ala Glu Lys
50 55 60
Cys Cys Ile Asn Val Cys Gly Leu His Ser Cys Val Ala Ala Arg Phe
65 70 75 80
Pro Gly Ser Pro Ala Ala Pro Thr Thr Ala Ala Ser Cys Glu Gly Phe
85 90 95
Val Cys Pro Gln Gln Gly Ser Asp Cys Asp Ile Trp Asp Gly Gln Pro
100 105 110
Val Cys Arg Cys Arg Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe Thr Cys
115 120 125
Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr Met Asp Ala Glu
130 135 140
Ala Cys Leu Arg Gly Leu His Leu His Ile Val Pro Cys Lys His Val
145 150 155 160
Leu Ser Trp Pro Pro Ser Ser Pro Gly Pro Pro Glu Thr Thr Ala Arg
165 170 175
Pro Thr Pro Gly Ala Ala Pro Val Pro Pro Ala Leu Tyr Ser Ser Pro
180 185 190
Ser Pro Gln Ala Val Gln Val Gly Gly Thr Ala Ser Leu His Cys Asp
195 200 205
Val Ser Gly Arg Pro Pro Pro Ala Val Thr Trp Glu Lys Gln Ser His
210 215 220
Gln Arg Glu Asn Leu Ile Met Arg Pro Asp Gln Met Tyr Gly Asn Val
225 230 235 240
Val Val Thr Ser Ile Gly Gln Leu Val Leu Tyr Asn Ala Arg Pro Glu
245 250 255
Asp Ala Gly Leu Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Ala Ala Gly Leu Leu
260 265 270
Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Gln Arg Glu Pro Ala Arg Asp
275 280 285
Ala Ala Pro Ser Ile Pro Ala Pro Ala Glu Cys Leu Pro Asp Val Gln
290 295 300
Ala Cys Thr Gly Pro Thr Ser Pro His Leu Val Leu Trp His Tyr Asp
305 310 315 320
Pro Gln Arg Gly Gly Cys Met Thr Phe Pro Ala Arg Gly Cys Asp Gly
325 330 335
Ala Ala Arg Gly Phe Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Gln Gln Ala Cys Ala
340 345 350
Arg Gly Pro Gly Asp Ala Cys Val Leu Pro Ala Val Gln Gly Pro Cys
355 360 365
Arg Gly Trp Glu Pro Arg Trp Ala Tyr Ser Pro Leu Leu Gln Gln Cys
370 375 380
His Pro Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe His
385 390 395 400
Ser Arg Glu Ser Cys Glu Asp Ala Cys Pro Val Pro Arg Thr Pro Pro
405 410 415
Cys Arg Ala Cys Arg Leu Arg Ser Lys Leu Ala Leu Ser Leu Cys Arg
420 425 430
Ser Asp Phe Ala Ile Val Gly Arg Leu Thr Glu Val Leu Glu Glu Pro
435 440 445
Glu Ala Ala Gly Gly Ile Ala Arg Val Ala Leu Glu Asp Val Leu Lys
450 455 460
Asp Asp Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Thr Lys Tyr Leu Glu Val
465 470 475 480
Thr Leu Ser Gly Met Asp Trp Ala Cys Pro Cys Pro Asn Met Thr Ala
485 490 495
Gly Asp Gly Pro Leu Val Ile Met Gly Glu Val Arg Asp Gly Val Ala
500 505 510
Val Leu Asp Ala Gly Ser Tyr Val Arg Ala Ala Ser Glu Lys Arg Val
515 520 525
Lys Lys Ile Leu Glu Leu Leu Glu Lys Gln Ala Cys Glu Leu Leu Asn
530 535 540
Arg Phe Gln Asp
545
<210>12
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：举例说明的竞争肽
<400>12
Asp Phe Gly Leu Asp Ser Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Ser Ser
1 5 10 15
Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp
20 25 30
<210>13
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠
<400>13
Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys
1 5 10 15
<210>14
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>14
Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys
1 5 10
<210>15
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠
<400>15
Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg
1 5 10
<210>16
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠
<400>16
Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys
1 5 10 15
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>17
Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys
1 5 10
<210>18
<211>19
<212>PRT
<213>小鼠
<400>18
Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile
1 5 10 15
Ala Pro Lys
<210>19
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>19
Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys
1 5 10
<210>20
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>20
Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys
1 5 10
<210>21
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
<400>21
Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys
1 5 10 15
<210>22
<211>28
<212>PRT
<213>小鼠
<400>22
Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro
1 5 10 15
Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys
20 25
<210>23
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
<400>23
Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys
1 5 10 15
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
<400>24
Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg
1 5 10
<210>25
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>25
Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg
1 5 10
<210>26
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>26
Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val Lys
1 5 10
<210>27
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
<400>27
Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg
1 5 10
<210>28
<211>18
<212>PRT
<213>小鼠
<400>28
Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys Val Val
1 5 10 15
Cys Arg
<210>29
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>29
Asp Ser Cys Asp Gly Val Glu Cys Gly Pro Gly Lys
1 5 10
<210>30
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>30
Ser Cys Ala Gln Val Val Cys Pro Arg
1 5
<210>31
<211>13
<212>PRT
<213>小鼠
<400>31
Glu Cys Glu Thr Asp Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys
1 5 10
<210>32
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>32
Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Arg
1 5
<210>33
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>33
Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro Phe Pro Arg
1 5 10
<210>34
<211>8
<212>PRT
<213>小鼠
<400>34
Ser Asp Phe Val Ile Leu Gly Arg
1 5
<210>35
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>35
Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Gln Asp Ser Gly Arg
1 5 10
<210>36
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>36
Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys
1 5 10 15
<210>37
<211>14
<212>PRT
<213>人
<400>37
Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg
1 5 10
<210>38
<211>28
<212>PRT
<213>人
<400>38
Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro
1 5 10 15
Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys
20 25
<210>39
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>39
Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg
1 5 10
<210>40
<211>18
<212>PRT
<213>人
<400>40
Pro Gln Ser Cys Val Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys Val Val
1 5 10 15
Cys Arg
<210>41
<211>13
<212>PRT
<213>人
<400>41
Cys Glu Cys Ala Pro Asp Cys Ser Gly Leu Pro Ala Arg
1 5 10
<210>42
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>42
Leu Gln Val Cys Gly Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Arg
1 5 10
<210>43
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>43
Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Pro Asp Ser Gly Arg
1 5 10
<210>44
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>44
Cys Tyr Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser Lys
1 5 10
<210>45
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>45
Gly Ile Thr Leu Ala Val Val Thr Cys Arg
1 5 10
<210>46
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>46
ttggccactg ccaccacaat ctcaaccact t 31
<210>47
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>47
tctcagcatg gccatgccgc cgtcga 26
<210>48
<211>1716
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1713)
<400>48
atg tgt gcc cca ggg tat cat cgg ttc tgg ttt cac tgg ggg ctg ctg 48
Met Cys Ala Pro Gly Tyr His Arg Phe Trp Phe His Trp Gly Leu Leu
1 5 10 15
ttg ctg ctg ctc ctc gag gct ccc ctt cga ggc cta gca ctg cca ccc 96
Leu Leu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Leu Arg Gly Leu Ala Leu Pro Pro
20 25 30
atc cga tac tcc cat gcg ggc atc tgc ccc aac gac atg aac ccc aac 144
Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn Asp Met Asn Pro Asn
35 40 45
ctc tgg gtg gat gcc cag agc acc tgc aag cga gag tgt gaa aca gac 192
Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Lys Arg Glu Cys Glu Thr Asp
50 55 60
cag gaa tgt gag acc tat gag aaa tgc tgc ccc aat gtg tgt ggg acc 240
Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro Asn Val Cys Gly Thr
65 70 75 80
aag agc tgt gtg gca gcc cgc tac atg gat gtg aaa ggg aag aag ggg 288
Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val Lys Gly Lys Lys Gly
85 90 95
cct gta ggc atg ccc aag gag gcc aca tgt gac cat ttc atg tgc ctg 336
Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp His Phe Met Cys Leu
100 105 110
cag cag ggc tct gag tgt gac atc tgg gac ggc cag ccc gtg tgt aag 384
Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly Gln Pro Val Cys Lys
115 120 125
tgc aaa gat cgc tgt gag aag gag ccc agc ttc acc tgt gcc tct gat 432
Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp
130 135 140
ggc ctt acc tac tac aac cgt tgc ttc atg gac gcc gaa gcc tgc tcc 480
Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Phe Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser
145 150 155 160
aag ggc atc aca ctg tct gtg gtc acc tgt cgt tat cac ttc acc tgg 528
Lys Gly Ile Thr Leu Ser Val Val Thr Cys Arg Tyr His Phe Thr Trp
165 170 175
cct aac acc agc cct cca ccg cct gag acc acg gtg cat ccc acc acc 576
Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr Val His Pro Thr Thr
180 185 190
gcc tct ccg gag act ctc ggg ctg gac atg gca gcc cca gcc ctg ctc 624
Ala Ser Pro Glu Thr Leu Gly Leu Asp Met Ala Ala Pro Ala Leu Leu
195 200 205
aac cac cct gtc cat cag tca gtc acc gtg ggt gag act gtg agt ttc 672
Asn His Pro Val His Gln Ser Val Thr Val Gly Glu Thr Val Ser Phe
210 215 220
ctc tgt gac gtg gta ggc cgg cct cgg cca gag ctc act tgg gag aaa 720
Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu Leu Thr Trp Glu Lys
225 230 235 240
cag ctg gag gac cga gag aat gtt gtc atg agg ccc aac cac gtg cgt 768
Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg Pro Asn His Val Arg
245 250 255
ggt aat gtg gtg gtc act aac att gcc cag ctg gtc atc tac aac gtc 816
Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu Val Ile Tyr Asn Val
260 265 270
cag ccc cag gat gct ggc ata tac acc tgt aca gct cga aat gtc gct 864
Gln Pro Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Val Ala
275 280 285
ggt gtc ctg agg gct gac ttc ccg ttg tcg gtg gtc agg ggt ggt cag 912
Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Arg Gly Gly Gln
290 295 300
gcc agg gcc act tca gag agc agt ctc aat ggc aca gct ttt cca gca 960
Ala Arg Ala Thr Ser Glu Ser Ser Leu Asn Gly Thr Ala Phe Pro Ala
305 310 315 320
aca gag tgc ctg aag ccc cca gac agt gag gac tgt gga gag gag cag 1008
Thr Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp Cys Gly Glu Glu Gln
325 330 335
aca cgc tgg cac ttc gac gcc cag gct aac aac tgc ctc act ttc acc 1056
Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn Cys Leu Thr Phe Thr
340 345 350
ttt ggc cac tgc cac cac aat ctc aac cac ttt gag acc tac gag gcc 1104
Phe Gly His Cys His His Asn Leu Asn His Phe Glu Thr Tyr Glu Ala
355 360 365
tgt atg ctg gct tgt atg agt ggg cca ttg gcc acc tgc agc ctg cct 1152
Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala Thr Cys Ser Leu Pro
370 375 380
gcc ctg caa ggg cct tgc aaa gct tat gtc cca cgc tgg gcc tac aac 1200
Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Val Pro Arg Trp Ala Tyr Asn
385 390 395 400
agc cag aca ggc cta tgc cag tcc ttc gtc tat ggc ggc tgt gag ggc 1248
Ser Gln Thr Gly Leu Cys Gln Ser Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly
405 410 415
aac ggt aac aac ttt gaa agc cgt gag gct tgt gag gag tcg tgt ccc 1296
Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro
420 425 430
ttc ccg agg ggt aac cag cac tgc cgg gcc tgc aag ccc cgg caa aaa 1344
Phe Pro Arg Gly Asn Gln His Cys Arg Ala Cys Lys Pro Arg Gln Lys
435 440 445
ctt gtt acc agc ttc tgt cgg agt gac ttt gtc atc ctg ggc agg gtc 1392
Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val Ile Leu Gly Arg Val
450 455 460
tct gag ctg acc gag gag caa gac tcg ggc cgt gcc ctg gtg acc gtg 1440
Ser Glu Leu Thr Glu Glu Gln Asp Ser Gly Arg Ala Leu Val Thr Val
465 470 475 480
gat gag gtc tta aaa gat gag aag atg ggc ctc aag ttt ctg ggc cgg 1488
Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Arg
485 490 495
gag cct ctg gaa gtc acc ctg ctt cat gta gac tgg acc tgt cct tgc 1536
Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp Trp Thr Cys Pro Cys
500 505 510
ccc aac gtg aca gtg ggt gag aca cca ctc atc atc atg ggg gag gtg 1584
Pro Asn Val Thr Val Gly Glu Thr Pro Leu Ile Ile Met Gly Glu Val
515 520 525
gac ggc ggc atg gcc atg ctg aga ccc gat agc ttt gtg ggg gca tcg 1632
Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser Phe Val Gly Ala Ser
530 535 540
agc aca cgg cgg gtc agg aag ctc cgt gag gtc atg tac aag aaa acc 1680
Ser Thr Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val Met Tyr Lys Lys Thr
545 550 555 560
tgt gac gtc ctc aag gac ttc ctg ggc ttg caa tga 1716
Cys Asp Val Leu Lys Asp Phe Leu Gly Leu Gln
565 570
<210>49
<211>571
<212>PRT
<213>小鼠
<400>49
Met Cys Ala Pro Gly Tyr His Arg Phe Trp Phe His Trp Gly Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Leu Arg Gly Leu Ala Leu Pro Pro
20 25 30
Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn Asp Met Asn Pro Asn
35 40 45
Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Lys Arg Glu Cys Glu Thr Asp
50 55 60
Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro Asn Val Cys Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val Lys Gly Lys Lys Gly
85 90 95
Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp His Phe Met Cys Leu
100 105 110
Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly Gln Pro Val Cys Lys
115 120 125
Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp
130 135 140
Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Phe Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser
145 150 155 160
Lys Gly Ile Thr Leu Ser Val Val Thr Cys Arg Tyr His Phe Thr Trp
165 170 175
Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr Val His Pro Thr Thr
180 185 190
Ala Ser Pro Glu Thr Leu Gly Leu Asp Met Ala Ala Pro Ala Leu Leu
195 200 205
Asn His Pro Val His Gln Ser Val Thr Val Gly Glu Thr Val Ser Phe
210 215 220
Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu Leu Thr Trp Glu Lys
225 230 235 240
Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg Pro Asn His Val Arg
245 250 255
Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu Val Ile Tyr Asn Val
260 265 270
Gln Pro Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Val Ala
275 280 285
Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Arg Gly Gly Gln
290 295 300
Ala Arg Ala Thr Ser Glu Ser Ser Leu Asn Gly Thr Ala Phe Pro Ala
305 310 315 320
Thr Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp Cys Gly Glu Glu Gln
325 330 335
Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn Cys Leu Thr Phe Thr
340 345 350
Phe Gly His Cys His His Asn Leu Asn His Phe Glu Thr Tyr Glu Ala
355 360 365
Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala Thr Cys Ser Leu Pro
370 375 380
Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Val Pro Arg Trp Ala Tyr Asn
385 390 395 400
Ser Gln Thr Gly Leu Cys Gln Ser Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly
405 410 415
Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro
420 425 430
Phe Pro Arg Gly Asn Gln His Cys Arg Ala Cys Lys Pro Arg Gln Lys
435 440 445
Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val Ile Leu Gly Arg Val
450 455 460
Ser Glu Leu Thr Glu Glu Gln Asp Ser Gly Arg Ala Leu Val Thr Val
465 470 475 480
Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Arg
485 490 495
Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp Trp Thr Cys Pro Cys
500 505 510
Pro Asn Val Thr Val Gly Glu Thr Pro Leu Ile Ile Met Gly Glu Val
515 520 525
Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser Phe Val Gly Ala Ser
530 535 540
Ser Thr Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val Met Tyr Lys Lys Thr
545 550 555 560
Cys Asp Val Leu Lys Asp Phe Leu Gly Leu Gln
565 570
<210>50
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>50
caccatgtgt gccccagggt atcatcggtt ctgg 34
<210>51
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>51
ttgcaagccc aggaagtcct tgaggac 27
<210>52
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：举例说明的N末端肽序列
<400>52
Leu Pro Pro Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile
1 5 10
<210>53
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>53
cagacagaca gacagacaga cagacagaca gacagacaga cagacaga 48
Claims (47)
1.一种药物组合物，包括
i)GASP1和
ii)至少一种药物可接受载体。
2.权利要求1的组合物，其中GASP1具有稳定化修饰。
3.权利要求2的组合物，其中该修饰是与IgG分子Fc区的融合。
4.权利要求3的组合物，其中IgG分子为IgG1或IgG4，或其衍生物。
5.权利要求4的组合物，其中IgG分子为IgG1或其衍生物。
6.权利要求3的组合物，其中IgG分子是借助于一个接头肽与GASP1融合。
7.权利要求2的组合物，其中该修饰包括一个改变的糖基化位点。
8.权利要求2的组合物，其中该修饰包括至少一个糖类部分。
9.权利要求2的组合物，其中该修饰包括白蛋白或白蛋白衍生物。
10.权利要求2的组合物，其中该修饰包括一个非蛋白质聚合物。
11.权利要求2的组合物，其中该修饰包括聚乙二醇化。
12.一种诊断试剂盒，包括GASP1和选自下组的至少一种其它试剂盒成分：
i)至少一种可结合GASP1的物质；
ii)至少一种缓冲剂和/或溶液；和
iii)至少一种结构成分。
13.一种重组细胞，包含编码GASP1的核酸。
14.权利要求13的重组细胞，其中GASP1具有稳定化修饰。
15.一种调节GDF-8的方法，包括施用GASP1，并使GASP1与GDF-8相互作用。
16.一种治疗医学病症患者的方法，包括施用治疗有效剂量的GASP1，并使GASP1与GDF-8相互作用。
17.一种治疗医学病症患者的方法，包括施用编码GASP1的核酸，使该核酸可以被翻译成GASP1，并使翻译的GASP1与GDF-8相互作用。
18.一种表达编码GASP1的核酸的方法，包括对细胞施用编码GASP1的核酸，使该核酸进入细胞，并使该细胞表达GASP1。
19.权利要求16、17或18的方法，其中GASP1具有稳定化修饰。
20.权利要求19的方法，其中该修饰是与IgG分子Fc区的融合。
21.权利要求20的方法，其中IgG分子为IgG1或IgG4，或其衍生物。
22.权利要求21的方法，其中IgG分子为IgG1或其衍生物。
23.权利要求20的方法，其中IgG分子是借助于一个接头肽与GASP1融合。
24.权利要求19的方法，其中该修饰包括一个改变的糖基化位点。
25.权利要求19的方法，其中该修饰包括至少一个糖类部分。
26.权利要求19的方法，其中该修饰包括白蛋白或白蛋白衍生物。
27.权利要求19的方法，其中该修饰包括一个非蛋白质聚合物。
28.权利要求19的方法，其中该修饰包括聚乙二醇化。
29.权利要求16的方法，其中患者在治疗上将受益于肌肉组织质量或数量上的增加。
30.权利要求16的方法，其中该病症为肌肉病症。
31.权利要求30的方法，其中肌肉病症为肌营养不良症。
32.权利要求31的方法，其中该肌营养不良症选自严重或良性的X连锁肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩肱骨营养不良、强直性肌营养不良、远端肌营养不良、进行性营养不良眼肌麻痹、眼咽肌营养不良、杜兴型肌营养不良，以及Fakuyama型先天性肌营养不良。
33.权利要求30的方法，其中该病症选自肌萎缩性脊髓侧索硬化、充血性阻塞性肺疾病、先天性肌病、先天肌强直、家族周期性麻痹、阵发性肌红蛋白尿、重症肌无力、Eaton-Lambert综合征、继发性肌无力、去神经支配萎缩、器官萎缩、脆弱、腕管综合征、肌肉萎缩症、阵发性肌萎缩症、少肌症、恶病质及其它肌肉消耗综合征。
34.权利要求30的方法，其中该病症为选自肌肉组织的创伤和慢性损伤的肌肉病症。
35.权利要求16的方法，其中该病症为代谢疾病或病症。
36.权利要求35的方法，其中该病症为胰岛素依赖性(1型)糖尿病、非胰岛素依赖性(2型)糖尿病、高血糖症、葡萄糖耐量低减、代谢综合征(如X综合征)、创伤(如灼伤或氮不平衡)导致的胰岛素抗性或肥胖症。
37.权利要求16的方法，其中该病症为脂肪组织病症，如肥胖症。
38.权利要求16的方法，其中该病症为骨变性疾病，如骨质疏松症、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、骨质减少、骨关节炎或与骨质疏松相关的骨折，或其它病症，包括因长时间的糖皮质激素治疗、未成熟的性腺衰竭、雄激素抑制、维生素D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进症、营养不良及神经性厌食症导致的低骨量。
39.权利要求16的方法，其中GASP1是一次性施用，或以每天、每周或每月的间隔施用。
40.权利要求16的方法，其中GASP1的施用剂量为5-100mg。
41.权利要求16的方法，其中GASP1的施用剂量为15-85mg。
42.权利要求16的方法，其中GASP1的施用剂量为30-70mg。
43.权利要求16的方法，其中GASP1的施用剂量为40-60mg。
44.权利要求1的组合物，其中GASP1选自下组：
i)SEQ ID NO：5；
ii)SEQ ID NO：7；和
iii)i)或ii)的取代、添加和/或缺失突变体。
45.权利要求1的组合物，其中GASP1由选自下组的核苷酸序列编码：
i)SEQ ID NO：4；
ii)SEQ ID NO：6；和
iii)编码由i)或ii)所编码序列的取代、添加和/或缺失突变体的核苷酸序列；和
iv)编码与i)或ii)所编码氨基酸相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
46.一种药物组合物，包括
i)GASP1的一个片段，选自
a)SEQ ID NO：5的氨基酸174-239，代表卵泡抑素区；
b)SEQ ID NO：7的氨基酸110-175，代表卵泡抑素区；和
c)a)或b)的取代、添加和/或缺失突变体；和
ii)至少一种药物可接受载体。
47.权利要求46的组合物，其中GASP1片段由选自下组的核苷酸序列编码：
i)SEQ ID NO：4的核苷酸520-717，编码卵泡抑素区；
ii)SEQ ID NO：6的核苷酸328-525，编码卵泡抑素区；
iii)编码由i)或ii)所编码序列的取代、添加和/或缺失突变体的核苷酸序列；和
iv)编码与i)或ii)所编码氨基酸相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US35784502P | 2002-02-21 | 2002-02-21 | |
| US60/357,845 | 2002-02-21 | ||
| US60/434,644 | 2002-12-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1929734A true CN1929734A (zh) | 2007-03-14 |
Family
ID=37859455
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 03808989 Withdrawn CN1929734A (zh) | 2002-02-21 | 2003-02-21 | 含卵泡抑素区的蛋白质 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1929734A (zh) |
| ZA (1) | ZA200406542B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107636154A (zh) * | 2015-03-26 | 2018-01-26 | 阿塞勒隆制药公司 | 促滤泡素抑制素相关的融合蛋白及其用途 |
| CN111936617A (zh) * | 2018-03-16 | 2020-11-13 | 益缪索夫特公司 | 经遗传工程化以分泌卵泡抑素的b细胞以及使用所述b细胞来治疗卵泡抑素相关的疾病、病况、病症及增强肌肉生长和力量的方法 |
-
2003
- 2003-02-21 CN CN 03808989 patent/CN1929734A/zh not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-08-17 ZA ZA200406542A patent/ZA200406542B/en unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107636154A (zh) * | 2015-03-26 | 2018-01-26 | 阿塞勒隆制药公司 | 促滤泡素抑制素相关的融合蛋白及其用途 |
| CN111936617A (zh) * | 2018-03-16 | 2020-11-13 | 益缪索夫特公司 | 经遗传工程化以分泌卵泡抑素的b细胞以及使用所述b细胞来治疗卵泡抑素相关的疾病、病况、病症及增强肌肉生长和力量的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA200406542B (en) | 2007-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1173033C (zh) | Tnf/ngf超家族受体和可溶性寡聚tnf/ngf超家族受体的调节剂 | |
| CN1268744C (zh) | 新的神经营养因子 | |
| CN1262688A (zh) | 整合蛋白结合肽及其应用 | |
| CN1446227A (zh) | 新型成纤维细胞生长因子(fgf23)及其使用方法 | |
| CN100345978C (zh) | 间变性淋巴瘤激酶测定法、试剂和它们的组合物 | |
| CN1141059A (zh) | P53-结合多肽和编码该多肽的多核苷酸 | |
| CN1739788A (zh) | Trip－br功能的调节和治疗增殖性紊乱的方法 | |
| CN1091469A (zh) | Ptp 1d：一种新蛋白质酪氨酸磷酸 | |
| CN1229498C (zh) | 重组的核糖核酸酶蛋白质 | |
| CN1529753A (zh) | 疾病相关蛋白质 | |
| CN1161468C (zh) | Mpl配体类似物 | |
| CN1303435A (zh) | Tao蛋白激酶及其使用方法 | |
| CN1886148A (zh) | 被设计用于破坏NEMO寡聚化的肽对NF－κB活化的选择性抑制 | |
| CN1993048A (zh) | 包含促滤泡素抑制素结构域的蛋白质 | |
| CN1929734A (zh) | 含卵泡抑素区的蛋白质 | |
| CN1187447C (zh) | Mpl配体类似物 | |
| CN1735687A (zh) | Mk2相互作用蛋白 | |
| CN1708589A (zh) | Cns中crh应答基因 | |
| CN1359421A (zh) | 新型多肽及其dna | |
| CN1207387C (zh) | 新型多肽及其编码基因 | |
| CN1894278A (zh) | 特异性抑制Akt活性的多肽 | |
| CN1112127A (zh) | 新的蛋白质p140多肽及编码该多肽的DNA | |
| CN1201009C (zh) | 组氨酸蛋白磷酸酶 | |
| CN1436239A (zh) | 新酶基因及其表达产物 | |
| CN1932016A (zh) | 影响sre活性的多核苷酸及其编码多肽和用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C04 | Withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |