BR102019009665A2

BR102019009665A2 - Modificação da proteína precursora beta amiloide (app) através da edição de base usando o sistema crispr/cas9

Info

Publication number: BR102019009665A2
Application number: BR102019009665-9A
Authority: BR
Inventors: Jacques P. Tremblay; Joel Rousseau; Antoine GUYON
Original assignee: Jacques P. Tremblay; Joel Rousseau; Antoine Guyon; Marcello Bossois De Melo Ferreira; Patricia Frozi Schlinkert
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-05-13
Publication date: 2022-02-08
Also published as: WO2020124257A1; US20220033846A1; CA3123639A1

Abstract

modificação da proteína precursora beta amiloide (app) através da edição de base usando o sistema crispr/cas9. são reportados métodos e produtos (grnas e proteínas recombinantes) para diminuição dos níveis de produção de peptídeos aß amiloidogênicos produzidos por uma célula, ou a agregação de peptídeos aß, bem como o uso de tais métodos e produtos, por exemplo para o tratamento da doença de alzheimer e/ou o declínio cognitivo em um indivíduo disto necessitado.

Description

MODIFICAÇÃO DA PROTEÍNA PRECURSORA BETA AMILOIDE (APP) ATRAVÉS DA EDIÇÃO DE BASE USANDO O SISTEMA CRISPR/CAS9

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se à introdução de modificações no gene da Proteína Precursora Beta Amiloide via edição de bases utilizando o sistema CRISPR/CAS9, bem como às suas utilizações, por exemplo para diminuir a produção de peptídeos Aβ amiloidogênicos, e para prevenir ou tratar a doença de Alzheimer e/ou o declínio cognitivo relacionado com a idade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Mais de 5% da população do mundo ocidental acima dos 60 anos sofre de demência. Dois terços destes casos são devidos à doença de Alzheimer (DA)6-8. A prevalência de DA duplica a cada 5 anos após os 65 anos de idade. Assim, em pessoas com mais de 90 anos de idade, há uma prevalência de mais de 25%8 . O diagnóstico de DA é confirmado por duas principais marcas histopatológicas: placas senis, que são depósitos extracelulares de peptídeos (Aβ) amiloides e emaranhados neurofibrilares, que são inclusões somáticas da proteína tau associada a microtúbulos.

A hipótese da cascata amiloide: estrutura e processamento metabólico da Proteína Precursora β Amiloide (APP)

[0003] O papel da agregação e depósito do peptídeo β amiloide (βA) na DA é amplamente aceito. Esses peptídeos tóxicos são produzidos pelo processamento metabólico da proteína APP. A APP é uma proteína integral de membrana expressa em muitos tecidos e concentrada nas sinapses dos neurônios. A proteólise da APP gera peptídeos βA contendo 37 a 49 aminoácidos. A forma de fibrila amiloide (também denominada corpos amiloides) desses peptídeos é o principal componente das placas amiloides encontradas nos cérebros de pacientes com DA.

[0004] Alterações genéticas na APP são suficientes para causar a Doença de Alzheimer Familiar (FAD) de início precoce. Anormalidades induzidas por peptídeos βA agregados têm sido ligadas a degeneração sináptica e neurítica. Isso é consistente com o padrão de degeneração que caracteriza os neurônios afetados na DA.

[0005] A formação de placas amiloides é uma característica patológica central da DA. Estas placas consistem principalmente de peptídeos βA9 . Os peptídeos βA são formados através do processamento proteolítico sequencial da proteína APP pela β-secretase e ɣ-secretase10 (Figura 1). O complexo γ-secretase inclui presenilina-1 e presenilina-2. β-secretase, também chamada de enzima de clivagem da proteína precursora amiloide no sítio beta 1 (BACE1), foi originalmente identificada há cerca de duas décadas atrás11,12. Ela cliva a APP principalmente em um sítio único (localizado entre os aminoácidos 671 e 672). No entanto, o complexo de γ-secretase cliva o fragmento carboxi-terminal resultante em vários locais, especialmente nas posições 40 e 42. A clivagem por essa enzima leva à formação dos peptídeos amiloide Aβ1-40 e Aβ1-4210. O processamento alternativo de APP pela α-secretase impede a formação de peptídeos βA porque o sítio α está localizado dentro de peptídeos βA. O potencial neurotóxico dos peptídeos βA resulta de suas propriedades bioquímicas que favorecem a agregação em oligômeros insolúveis e protofibrilas. Esses oligômeros e protofibrilas se acumulam em placas senis e neuríticas. Estas placas, juntamente com uma redução da depuração de Aβ do cérebro, conduzem à acumulação extracelular de Aβ em corpos amiloides. Isso leva à ativação de cascatas neurotóxicas e, finalmente, a alterações do citoesqueleto, disfunção neuronal e morte celular.

[0006] A hipótese da cascata amiloide é baseada principalmente em achados de estudos in vivo e in vitro, e é ainda reforçada pela descoberta de mutações genéticas associadas à DA familiar de início precoce. As DAs familiares (FADs) são formas graves da doença, nas quais a amiloidogênese intracerebral maciça ocorre prematuramente como consequência de mutações que afetam o metabolismo da APP (isto é, mutações no gene APP no cromossomo 21 e nos genes das presenilinas 1 e 2 (PSEN-1 e PSEN-2) nos cromossomos 14 e 1, respectivamente). Atualmente, duas proteínas são consideradas intimamente envolvidas na depuração dos peptídeos βA do cérebro: a apolipoproteína E (APOE) e a enzima de degradação da insulina (IDE). Polimorfismos genéticos desfavoráveis (como o alelo ε4 da APOE) e condições patológicas relacionadas à homeostase anormal de IDE (por exemplo, diabetes mellitus) também favorecem a clivagem amiloidogênica da APP e/ou diminuem a depuração de βA do cérebro. Isso facilita o acúmulo de βA nos tecidos neurais e promove efeitos da cascata amiloide a jusante13 .

[0007] Existe assim a necessidade de métodos e produtos para reduzir a produção de peptídeos Aβ tóxicos, e para a prevenção e tratamento de condições relacionadas tais como AD e declínio cognitivo relacionado com a idade.

[0008] A presente descrição refere-se a um número de documentos e entradas de banco de dados de sequências, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência na sua totalidade.

ESTADO DA TÉCNICA

[0009] São citadas abaixo referências bibliográficas que serão referenciadas no decorrer do relatório descritivo pela numeração de indexação aqui utilizada, de modo a melhor esclarecer o escopo da proteção almejada pelos requerentes da presente invenção:

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] A presente invenção refere-se à introdução de modificações no gene da Proteína Precursora β Amiloide (APP) via edição de bases usando o sistema CRISPR/CAS9, bem como suas utilizações, por exemplo para diminuir a produção de peptídeos β amiloidogénicos, e para prevenir ou tratar a doença de Alzheimer e/ou o declínio cognitivo relacionado com a idade.

[0011] Outros objetos, vantagens e características da presente invenção se tornarão mais evidentes após a leitura da seguinte descrição não restritiva de suas formas de realização específicas, dadas a título de exemplo apenas com referência aos desenhos em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0012] Nos desenhos anexos, que acompanham a presente descrição:

[0013] A Figura 1 mostra as vias para o processamento metabólico da proteína precursora amiloide (APP). A figura ilustra as duas rotas metabólicas mais proeminentes e os derivados proteolíticos da APP. A APP é substrato para ambas α-, β- e/ou γ-secretase. Assim, as duas vias (não amiloidogênica (também chamada amiloidolítica) e a amiloidogênica) são mutuamente exclusivas. A enzima de clivagem do sítio 1 de APP (BACE1) é a única protease aspártica conhecida com atividade da β-secretase. Os fragmentos C83 e C99 (também conhecidos como fragmentos carboxi-terminais α e β) são substratos para a γ-secretase, um complexo proteico que inclui pelo menos 4 proteínas diferentes: faringe anterior defeituosa 1, nicastrina, presenilina 1 (PS-) ou presenilina 2 (PS-2) e potenciador de presenilina-2. AICD é o domínio intracitoplasmático da APP. A figura foi adaptada de E.A. Bignante et al22 .

[0014] A Figura 2 é uma representação esquemática da estrutura do domínio da proteína precursora Amiloide (APP). O domínio E1 contém o Domínio do tipo Fator de Crescimento (GFLD) e o Domínio de Ligação ao Cobre (CuBD). O domínio acídico (AcD) e o domínio inibitório do tipo Kunitz (inibidor da protease Kunitz [KPI], não presente nos neurônios) ligam os domínios E1 e E2. O domínio E2 contém 2 subestruturas de bobina enrolada conectadas através de uma hélice contínua. A sequência de aminoácidos dos domínios amilóide β (Aβ) / transmembrana / intracelular (domínio citoplasmático de APP [AICD]) é mostrada na parte inferior da figura. Os asteriscos denotam aminoácidos substituídos em formas familiares de variantes AD e APP. Setas indicam locais de clivagem para ambas as secretases e caspases. Os motivos de ligação para proteínas Go/s heterotriméricas (Go/s-BM) e proteínas de suporte (SP-BM; e.g., Fe65, proteínas da família Mint / X11, Dab1, c-Jun quinase N-terminal) estão sublinhadas. A sequência Aβ está também sublinhada. De E.A. Bignante et al.22

[0015] A figura 3 mostra a sequência complete de aminoácidos da proteína precursora β amiloide (APP) gene (NCBI Sequência Referência NG_007376.1). O A em negrito é uma alanina na posição 673 a ser mutada para uma treonina T ou uma valina V) para proteger da doença de Alzheimer. O H em negrito é a histidina na posição 684 a ser mutada para uma arginina (R) para proteger da doença de Alzheimer.

[0016] A Figura 4 ilustra a estrutura de BE3, CDA1-BE3 e Alvo-AID-BE3. De Komor et al23 .

[0017] A Figura 5 ilustra parte do éxon 16 da APP. A) ilustra a fita antisense. Existem 5 citidinas próximas umas das outras, as quais podem ser desaminadas pela edição base do SpCas9. B) a posição destas 5 citidinas no éxon 16 do tipo selvagem do gene APP e os códons de aminoácidos correspondentes (de E665 a F675). C) desaminação de C1, C2 e C5 é mostrada a desaminação de todas as 5 citidinas em timidinas muda os códons e assim o aminoácido resultante, com exceção da citidina 5, para a qual a mudança para uma timidina não altera o aminoácido resultante, que permanece uma lisina (K). A desaminação da citidina 2 no códon antisense para alanina muda o códon na posição 673 para um códon de treonina. O local de corte da BACE1 entre a metionina 671 e o ácido aspártico 672 está indicado.

[0018] A Figura 6 mostra eficiência de desaminação em células HEK293T com uma ou duas cópias de gRNA. Plasmídeos que codificam para as diversas citidinas desaminases e para um gRNA (lado esquerdo da figura) ou dois gRNAs (lado direito da figura) foram transfectados em células HEK293T. O DNA foi extraído 3 dias depois, o exon 16 do APP foi amplificado por PCR e analisado por sequenciamento profundo. As sequências foram analisadas por computador para estabelecer a percentagem das citidinas 1 a 5 (figura 5; barras em cada agrupamento correspondem a C1-C5 da esquerda para a direita), que foram transformadas numa timidina com diferentes enzimas desaminases (BE4_SpCas9nEQR com um gRNA tendo como alvo 20 nucleotídeos, BE4_SpCas9nVQR com um gRNA tendo como alvo 20 nucleotídeos, BE4_SpCas9nVQR com um gRNA tendo como alvo 21 nucleotídeos, BE3_SpCas9nVQR com um gRNA tendo como alvo 20 nucleotídeos, BE3_SpCas9nVQR com um gRNA tendo como alvo 21 nucleotídeos).

[0019] A Figura 7 mostra a eficiência de desaminação em células SH-SY5Y and HEK293T com duas cópias de gRNA. Plasmídeos codificando para várias enzimas desaminases e duas cópias de gRNA foram transfectados em neuroblastomas SH-SY5Y (lado esquerdo) e em células HEK293T (lado direito). Os gRNAs alvejaram ambos os nucleotídeos 19, 20, 21 ou 22. O DNA foi extraído 3 dias depois e o éxon, 16 da APP foi amplificado por PCR e analisado por sequenciamento profundo. As sequências foram analisadas por computador para estabelecer a percentagem das citidinas 1 a 5 (figura 5; barras em cada agrupamento correspondente a C1-C5 da esquerda para a direita), as quais foram transformadas numa timidina com diferentes enzimas desaminases (Target-AID-SpCas9nEQR, Target-AID-SpCas9nVQR, BE3_SpCas9nVQR).

[0020] A Figura 8 mostra a eficiência de desaminação em células SH-SY5Y com duas cópias de gRNA. Os plasmídeos que codificam para vias enzimas desaminases e um gRNA foram transfectados em neuroblastomas SH-SY5Y. Os gRNAs tinham como alvos 19, 20, 21 ou 22 nucleotídeos. O DNA foi extraído 3 dias depois, o éxon 16 do APP foi amplificado por PCR e analisado por sequenciamento profundo. As sequências foram analisadas por computador para estabelecer a percentagem das citidinas 1 a 5 (figura 5; barras em cada agrupamento correspondem a C1-C5 da esquerda para a direita), que foram transformadas numa timidina com duas enzimas desaminase diferentes (YE1- BE3_SpCas9nVQR e BE3_SpCas9nVQR). O WT ilustra os resultados em células que não foram transfectadas.

[0021] A Figura 9 mostra a eficiência de desaminação em células SH-SY5Y com duas cópias de gRNA. Os plasmídeos codificando para várias enzimas deaminases e duas cópias de gRNA foram transfectados em neuroblastomas SH-SY5Y. Os gRNAs tinham como alvo 19 nucleotídeos. O DNA foi extraído 3 dias depois, o éxon 16 do APP foi amplificado por PCR e analisado por sequenciamento profundo. As sequências foram analisadas por computador para estabelecer a percentagem das citidinas 1 a 5 (figura 5; barras em cada agrupamento correspondem a C1-C5 da esquerda para a direita), as quais foram trocadas por uma timidina com duas enzimas desaminases diferentes (BE3_SpCas9nEQR, BE3_SpCas9nVQR, BE3_SaCas9nKKH). O WT ilustra os resultados em células que não foram transfectadas.

[0022] A Figura 10 mostra a eficiência de desaminação em células HEK293T com duas cópias de gRNA. Os plasmídeos codificando para várias enzimas desaminases e duas cópias de gRNA foram transfectados em células HEK293T. Os gRNAs tinham como alvo 19, 20, 21 ou 22 nucleotídeos. O DNA foi extraído 3 dias depois, o éxon 16 do APP foi amplificado por PCR e analisado por sequenciamento profundo. As sequências foram analisadas por computador para estabelecer a percentagem das citidinas 1 a 5 (figura 5; barras em cada agrupamento correspondem a C1-C5 da esquerda para a direita), os quais foram trocados por uma timidina com duas enzimas desaminases (Target-AIDSpCas9nVQR and BE4_SpCas9nVQR). WT mostra os resultados em células que não foram trasfectadas.

[0023] A Figura 11 mostra a eficiência de desaminação em células SH-SY5Y com duas cópias de gRNA. Os plasmídeos codificando para várias enzimas desaminases e duas cópias de gRNA foram transfectados em neuroblastomas SH-SY5Y. Os gRNAs tiveram como alvo 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos. O DNA foi extraído 3 dias após, o éxon do APP foi amplificado por PCR e analisado por sequenciamento profundo. As sequências foram analisadas por computador para estabelecer o percentual das citidinas 1 a 5 (figura 5; barras em cada grupo corresponde a C1 – C5 da esquerda para a direita), as quais foram trocadas por uma timidina com duas enzimas transaminases diferentes (Target-AIDSpCas9nVQR e BE3_SpCas9nVQR). O WT ilustra os resultados em células que não foram transfectadas.

[0024] A Figura 12 mostra a eficiência de desaminação em células HEK293T com duas cópias de gRNA. Os plasmídeos codificando para as enzimas TargetAID-SpCas9nVQR e duas cópias de gRNA foram transfectadas em células HEK293T. Os gRNAs tiveram como alvo 19 nucleotídeos. O DNA foi extraído 3 dias depois. O éxon do APP foi amplificado por PCR e analisado por sequenciamento profundo. As sequências foram analisadas por computador para estabelecer o percentual das citidinas 1 a 5 (figura 5; barras em cada grupo corresponde a C1-C5 da esquerda para a direita), as quais foram trocadas por uma timidina. Mais de 50% das citidinas 1 e 2 (figura 5) foram desaminadas.

[0025] A Figura 13 mostra a eficiência de desaminação em células SHSY5Y. As células SH-SY5Y foram transfectadas com um plasmídeo de APP contendo a mutação FAD e com o plasmídeo Target-AID-SpCas9nVQR contendo2 cópias de sgRNA alvejando 19 nucleotídeos. Os resultados do sequenciamento profundo mostraram uma forte atividade global de desaminação.

[0026] A Figura 14 mostra a eficiência de desaminação em células SHSY5Y. As células SH-SY5Y foram transfectadas com um plasmídeo de APP contendo a mutação FAD e com o plasmídeo Target-AID-SpCas9nVQR contendo 2 cópias de sgRNA alvejando 19 nuclotídeos. Diferentes padrões de desaminação foram obtidos com os plasmídeos APP contendo diferentes mutações FAD. Barras em cada agrupamento para C1-C5 da esquerda para a direita. De fato, C1 não foi frequentemente desaminada como C2. As dez melhores mutações FAD mostraram entre 5.3-19.4% de desaminação de C2.

[0027] A Figura 15 mostra a eficiência de desaminação de C2 nos níveis dos peptídeos Aß42 em células SH-SY5Y. As células SH-SY5Y contendo o transgene Target-AID-SpCas9nVQR e o gene codificando para o sgRNA alvejando 17 nucleotídeos foram transfectados com um plasmídeo contendo o gene APP do tipo selvagem sozinho (lado esquerdo) e co-transfectado com plasmídeos codificando para o gene APP do tipo selvagem e um sgRNA (lado direito) para permitir a desaminação do nucleotídeo C2 e assim induzir a mutação A673T. A introdução da mutação A673T reduziu cerca de 40% a concentração de peptídeos no sobrenadante celular.

[0028] A Figura 16 mostra o efeito da desaminação de C2 nos níveis do peptídeo Aß42 em células SH-SY5Y. As células SH-SY5Y contendo o transgene Target-AID-SpCas9nVQR e o gene codificando para o sgRNA alvejando 19 nucleotídeos foram transfectados somente com um plasmídeo contendo o gene APP contendo as mutações NL/F/G (lado esquerdo) e co-transfectado com plasmídeos codificando para aquele gene APP mutado e um sgRNA (lado direito) para permitir a desaminação do nucleotídeo C2 e assim induzir a mutação A673T. A indução da mutação A673T reduziu cerca de 43% a concentração dos peptídeos Aß42 no sobrenadante celular.

[0029] A Figura 17 mostra o efeito de desaminação de C2 nos níveis do peptídeo Aß42 em células SH-SY5Y. As células SH-SY5Y contendo o transgene Target-AID-SpCas9nVQR e o gene codificando para o sgRNA alvejando 19 nucleotídeos foram transfectados com um plasmídeo contendo o gene APP com a mutação V717I (lado esquerdo) ou co-transfectado com plasmídeos codificando para este gene APP mutado e um sgRNA (lado direito) para permitir a desaminção de C2 e assim induzir a mutação A673T. A indução da mutação A673T reduziu em 24% a concentração dos peptídeos Aß42 no sobrenadante celular.

[0030] A Figura 18 ilustra o final do éxon 16 e o início do intron 16 do gene APP. Os aminoácidos correspondentes a cada códon estão ilustrados na parte inferior. Os códons para alanina na posição 673 e para histidina na posição 684 estão indicados. As posições de NGAN PAM para o SpCas9nVQR permitindo testar várias citidinas desaminases (isto é, BE3_SpCas9nVQR, o YE1- BE3_SpCas9nVQR, BE4-Gam_SpCas9nVQR e o Target-AID_SpCas9nVQR) para desaminar a citidina em timina no códon alanina (GCA) para produzir o códon (GTA) para valina. A figura também ilustra a posição do NGAN PAM e do NNNAAT PAM, os quais permitem a desaminação da adenosina em uma inosina (equivalente a guanina) e modifica o códon histidina (CAT) em um códon (CGT) para arginina com adenosina desaminase apropriada.

[0031] A Figura 19 ilustra os resultados de uma citidina desaminase experimental objetivando modificar a alanina (na posição 673) códon (GCA) em uma valina códon (GTA) pela desaminação da citidina número 1 (na posição 2 da sequência do protoespaçador) em uma timina. Um percentual de 27,82% de C foi trocado para T usando Target-AID_SpCas9n. O percentual muito baixo do segundo C (0,27%) do Segundo C no motivo do protoespaçador foi trocado por um T. A outra citinina desaminase tem muito pouco efeitos. Em um segundo experimento usando o Target-AID_SpCas9n 18,48% do primeiro C foram desaminados.

[0032] A Figura 20 ilustra os resultados de um experimento com uma adenosine desaminase (ADAR2) visando modificar uma histidina (da posição 684) códon (CAT) em uma arginina códon (CGT). Dois diferentes gRNAs foram usados. Para o primeiro gRNA o A para ser desaminado estava na posição 35 e para o segundo gRNA o A para ser desaminado estava na posição 45. O g RNA com o A na posição 35 deu melhores resultados do que o gRNA com o A na posição 45.

[0033] A Figura 21 mostra as sequências de nucleotídeo e aminoácidos do éxon 16 do APP (NCBI sequência de referência NG_007376.1). A673 e H884 são mostrados em negrito.

[0034] A Figura 22 mostra uma sequência parcial do gene APP tipo selvagem (nucleotídeos 277141 a 279540 de NCBI NG_007376.1/GI: 166795291) a qual inclui a sequência parcial do intron 15 (SEQ ID NO:36), seguida da sequência completa do éxon 16 (nucleotídeos 278148-278248) e a sequência parcial do intron 16.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES CONSTRUTIVAS DEFINIÇÕES

[0035] O uso dos termos "um" e "uma" e "o/a" e referências similares no contexto da descrição da tecnologia (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) são construídas para cobrir ambos o singular e o plural, a menos que de outra forma indicados aqui ou claramente contraditórios pelo contexto.

[0036] O uso da palavra "um" ou "uma" quando usada em conjunção com o termo “compreendendo” nas reivindicações e/ou a especificação pode significar “um”, mas isto também é consistente com o significado de “um ou mais”, “pelo menos um”, e “um ou mais de um”. Similarmente a palavra “outra” pode significar pelo menos a segunda ou mais

[0037] Como usada nesta especificação e reivindicações, as palavras “compreendendo” (e qualquer forma de compreendendo tais como “compreende” ou “compreendem”), “tendo” (e qualquer forma de tendo, tais como “ter” e “tem”), “incluindo” (e qualquer forma de incluindo tais como “incluir” ou “inclui”) ou “contendo” (e qualquer forma de contendo tais como conter ou contém), são construídos como termos abertos, de entendimento livre (isto é significado “incluindo, mas não limitados a”) a menos que notados de outra forma.

[0038] A citação de faixas de valores aqui, são meramente intencionadas a servir como forma de se referir individualmente a cada valor separado, caindo dentro da faixa, a menos que definido de outra forma aqui, cada valor separado é incorporado dentro da especificação como se fosse individualmente depositado aqui. Todos os subgrupos de valores dentro das faixas são também incorporados dentro de uma especificação como se eles fossem individualmente citados aqui.

[0039] Todos os métodos ou processos descritos aqui podem ser feitos em qualquer ordem adequada, a menos que de outro modo indicado aqui ou de outra forma claramente contradito pelo contexto. Além disso, em formas de realização, vários passos podem ser repetidos, para aumentar a recuperação e purificação.

[0040] O uso de qualquer ou todos os exemplos, ou exemplar de linguagem (isto é, “tal como”) dado aqui, tem a intenção meramente de melhor esclarecer a invenção e não colocar uma limitação no escopo da mesma, a menos que reivindicado de outra forma.

[0041] Nenhuma linguagem na especificação deve ser construída como indicador de qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da descrição.

[0042] Como utilizado aqui, quando se referindo a valores numéricos ou percentagens, o termo “cerca de” tem seu significado ordinário e inclui variações devido ao método utilizado, para determinar os valores ou percentagens, variância estatística e erro humano. Além disso, cada parâmetro numérico nesta submissão deve, pelo menos, ser construída a luz de um número significante de dígitos reportados e pela aplicação de técnicas comuns de arredondamento. Em formas de realização, isto pode significar mais ou menos 10% do valor numérico qualificado.

[0043] A menos que sejam definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém de formação ordinária na arte para a qual esta invenção pertence.

[0044] É para ser compreendido que a presente invenção não está limitada às formas de realização particulares descritas abaixo, pois variações destas formas de realização podem ser alcançadas e ainda estarem dentro do escopo da presente invenção. É também para ser compreendido que a terminologia empregada é para o propósito da descrição das formas de realização particulares e não tenciona ser limitante.

[0045] A fim de prover um entendimento claro e consistente dos termos usados na presente especificação várias definições são fornecidas abaixo. Além disso, a menos que definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado comumente entendido por alguém de formação ordinária na arte para a qual esta invenção pertence.

[0046] Como utilizado aqui, quando se referindo a valores numéricos ou percentagens, o termo “cerca de” tem seu significado ordinário e inclui variações devido ao método utilizado, para determinar os valores ou percentagens, variância estatística e erro humano. Além disso, cada parâmetro numérico nesta submissão deve, pelo menos, ser construída a luz de um número significante de dígitos reportados e pela aplicação de técnicas comuns de arredondamento.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO ILUSTRATIVAS

[0047] A presente invenção relata a uma modificação direcionada do gene da Proteína Precursora β Amiloide (APP), em formas de realização a modificação do gene APP selvagem ou um gene APP contendo a mutação da Doença de Alzheimer Familiar (FAD), para introduzir uma ou mais mutações protetoras que podem proteger contra a Doença de Alzheimer (AD) e/ou declínio cognitivo relacionado com a idade ou deficiência. Em formas de realização, qualquer uma das três mutações protetivas pode ser introduzida. Em formas de realização, tais mutações protetoras incluem a mutação Islandesa (A673T)1,2, a mutação A673V3,4 e a mutação H684R5 . A mutação A673T reduz a secreção e o acúmulo do peptídeo tóxico β amiloide (Aβ1-42) em células humanas1,2. O H684R5 facilita a clivagem da proteína APP pela BACE1 na posição β’ aumentando assim a formação dos peptídeos Aβ11-xx, os quais não são amiloidogênicos. A mutação A673V3,4 também previne a DA somente em carreadores heterozigotos fazendo as placas amiloides menos estáveis.

[0048] Em formas de realização, a presente invenção relata a modificação do éxon 16 do gene APP em um ou mais pares de nucleotídeos para converter C/G para T/A e/ou A/T para G/C. Em formas de realização, tais modificações resultam na troca de uma Alanina para uma Treonina ou Valina na posição 673 e/ou uma Histidina para uma Arginina na posição 684. A última modificação da Histidina na posição 684 em uma Arginina também foi feita no mRNA da APP.

[0049] Em um aspecto, a presente invenção relata a introdução de uma ou mais modificações no gene APP ou no mRNA pela edição de base usando desaminases sítio específicas citidina ou adenosina. As modificações introduzidas são desenhadas para diminuir a produção dos peptídeos Aβ amiloidogênicos (isto é, pela redução do processamento de APP pela BACE1, pelo favorecimento da formação de peptídeos não amiloidogênicos ou diminuindo a estabilidade dos corpos amiloides). Em um aspecto, o RNA guia (gRNA) pode ser desenhado e usado em combinação com a nuclease Cas9 (isto é, uma Cas9 nicase) fusionada a uma enzima citidina desaminase para modificar especificamente a citidina (C) em uma timina (T) no gene alvo APP. Em outro aspecto da invenção, um RNA guia (gRNA) pode ser desenhado e usado em combinação com a nuclease Cas9 (isto é, uma Cas9 nicase) fusionada com uma enzima adenosina desaminase para modificar especificamente uma adenosina (A) em uma inosina (I), a qual é similar a uma guanina (G) no gene alvo APP. A última modificação também pode ser feita no mRNA do APP com REPAIRv214 ou a enzima ADAR215 . O gene alvo ou o mRNA assim modificado irá reduzir o nível ou a agregação dos peptídeos Aβ amiloidogênicos produzidos pela célula. A presente invenção ainda relata o uso de tais gRNAs, sítio específicos citidina ou adenosina desaminases, REPAIRv2 e ADAR2 para a prevenção do tratamento da doença de Alzheimer e/ou declínio cognitivo relacionado à idade.

[0050] Por conseguinte, em um aspecto, a presente invenção prove um método para a diminuição do processamento da proteína APP em peptídeos Aβ pela célula, pela introdução de pelo menos uma modificação no genoma da célula ou nos mRNAs da célula, onde estas modificações diminuiriam a quantidade ou a agregação dos peptídeos Aβ amiloidogênicos produzidos pela célula.

[0051] Em uma forma de realização, o gene alvo codifica a proteína APP.

Mutações de APP que são responsáveis pela Doença de Alzheimer Familiar Precoce

[0052] Mais de trinta mutações codificantes no gene APP já foram identificadas11. Vinte e cinco destas mutações são patogênicas, usualmente resultando em Doença de Alzheimer Familiar de Origem Precoce Autossômica Dominante (FAD) (Figura 2). Substituições em ou próximas aos sítios β- e γ- proteolíticos resultam em uma superprodução de qualquer um dos dois Aβ ou uma troca na taxa Aβ1-40:Aβ1-42 para a formação de mais peptídeo amiloidogenico Aβ1-42. Por outro lado, as substituições dentro dos peptídeos βamiloides resultam na formação de peptídeos Aβ, que agregam mais facilmente16. As mutações no gene APP são também responsáveis pela forma comum de início tardio da DA.

Mutações que protegem contra a Doença de Alzheimer (DA): A673T, A673V e H684R

[0053] Mutação A673T: Jonsson et al.2 procuraram variantes de baixa frequência no gene APP, as quais reduzem significativamente o risco de doença de Alzheimer. Eles estudaram variantes de codificação em APP em dados de sequência do genoma completo obtidos a partir de 1.795 islandeses. Eles relataram uma mutação de codificação, i.e., uma substituição de alanina para treonina na posição 673 no gene APP (A673T), que protege contra AD. Essa mutação é adjacente ao sítio da aspartil-protease na APP e está localizada na posição 2 do peptídeo β amiloide, a proximidade da mutação A673T ao sítio proteolítico da BACE1 pode sugerir que essa variante possa resultar em uma clivagem prejudicada da APP pela BACE1. A mutação A673T reduz em cerca de 40% a formação dos peptídeos Aβ in vitro2 . O forte efeito protetor da mutação A673T contra a DA forneceu uma prova de princípio de que a redução da clivagem da APP pode proteger contra a doença. Além disso, a mutação A673T também protege contra o declínio cognitivo em idosos sem uma forma familiar de DA. Os carreadores da mutação A673T têm uma chance 1,47 vezes maior de atingir a idade de 85 anos do que os não carreadores. Jonsson et al.2 concluíram que a mutação A673T confere uma forte proteção contra a AD. Kero et al.1 encontraram a variante A673T em uma pessoa que faleceu com 104,8 anos de idade com pouca patologia β-amiloide. Esta observação suporta o conceito de que esta variante protege o cérebro contra a patologia β-amiloide e DA.

[0054] Mutação A673V: Di Fede et al.17 descobriram que a mutação A673V causa FAD apenas no estado homozigoto consistente com uma herança recessiva. A mutação A673V APP aumenta a produção de β-amilóide (Aβ) e aumenta marcadamente a agregação e as propriedades fibrilogênicas tanto de Aβ1-40 como Aβ1-424,17,18. No entanto, a co-incubação de peptídeos mutantes e de tipo selvagem confere instabilidade aos agregados Aβ e, assim, inibe a amiloidogênese e a neurotoxicidade3,19,20. O efeito altamente amiloidogênico da mutação A673V no estado homozigoto e seu efeito anti-amiloidogênico na heterozigose é responsável pelo padrão autossômico recessivo de herança. Cimini et al.20 fundiram os seis primeiros resíduos do Aβ1-42A2V para TAT (Aβ1- 6A2VTAT (D)) para gerar um peptídeo permeável às células, o que conferiu neuroproteção in vitro e in vivo contra sinaptopatia.

[0055] Mutação H684R: A clivagem no sítio β’ do APP de camundongo é mais comum do que a clivagem correspondente da APP humana. Assim, os camundongos normais não acumulam placas amiloides e não desenvolvem DA. Existem três aminoácidos que diferem entre a proteína APP humana e de camundongo próxima aos sítios β e β' isto é, Arg na posição 676 na APP humana (hAPP) é Gly (R676G) no APP do camundongo, Tyr681 é Phe (Y681F), e His na posição 684 é Arg (H684R). Kimura et al.5 descobriram que a substituição H684R na proteína APP humana facilitou a clivagem no sítio β' independentemente da origem da espécie de BACE1, aumentando assim significativamente o nível de Aβ11-XX amiloidolítico e diminuindo o nível do Aβ1-XX amiloidogênico.

[0056] Em uma forma de realização, os métodos aqui descritos compreendem proporcionar a célula com uma desaminase citidina ou adenosina sítio específica, alvejar especificamente uma sequência de ácido nucleico no gene APP ou na sequência de mRNA da célula.

[0057] Em uma forma de realização, a endonuclease sítio específica é a Cas9 nicase fusionada com uma citidina desaminase (e.g., APOBEC1 (complexo 1 de edição de apolipoproteína B) ou Target-AID) ou uma adenosina desaminase tal como as ABE7.1021, REPAIRv214 ou ADAR215 .

[0058] Em uma forma de realização, pelo menos uma modificação induzida pela citidina ou adenosina desaminase resulta numa sequência polinucleotídica do gene APP codificando para a proteína APP em que a alanina na posição 673 e/ou a histidina na posição 684 foi substituída por outro aminoácido. Em uma forma de realização, pelo menos uma modificação troca a alanina na posição 673 da proteína APP por uma treonina ou uma valina, e/ou troca a histidina na posição 684 por uma arginina. Em outra forma de realização, pelo menos uma modificação induzida pelo complexo citidina ou adenosina desaminase, o REPAIRv2 ou ADAR2 resulta na modificação de um ou mais aminoácidos reconhecidos por uma α, β ou ɣ secretase na proteína APP codificada pela sequência do gene polinucleotídico APP. Em outra forma de realização, pelo menos uma modificação reduz o risco de desenvolver doença de Alzheimer.

[0059] Em uma forma de realização, a desaminase citidina ou adenosina sítio específica é uma Cas nicase (isto e, derivada de ambas SpCas9, SaCas9, CjCas9, ScCas9, CasX, CasY, Cpf1, eSpCas9, eSaCas9, HiFi Cas9™ (IDT Inc.) fusionadas a uma ADAR2 desaminase ou uma REPAIRv2 desaminase e o método compreende ainda prover a célula com pelo menos RNA guia (gRNA) contendo uma região semente de nucleotídeos complementar à sequência alvo no gene polinucleotídico endógeno de APP ou à sequência de mRNA da célula.

[0060] Em uma forma de realização, o RNA guia (gRNA) compreende uma região nucleotídica semente de pelo menos 8 nucleotídeos perfeitamente complementar à sequência de ácido nucléico alvo no gene polinucleotídico endógeno APP onde a sequência de ácido nucleico alvo é imediatamente adjacente a um motivo protoespaçador adjacente (PAM) reconhecido por um complexo de ribonucleoproteínas Cas compreendendo a nicase Cas9 derivada de uma nuclease Cas9 (isto e, SpCas9, SaCas9, ScCas9, CasX, CasY, Cpf1, eSpCas9, eSaCas9, HiFi Cas9TM). As sequências que codificam algumas dessas enzimas foram otimizadas para humanos: hSpCas9, hSaCas9, hCjCas9.

[0061] Em uma forma de realização, o PAM compreende uma AAA, AAG, ACA, ATG, CC, CAA, CCN, GAA, GAT, GGA, GGC, GGT, GTA, GTC, GTT, TCN, NG, NGG, NNG, NAG, NGA, NNAGAA, NNGAAT, NNGAGT, NNGGAT, NNGGGT, NNNAAT NNNAGT, NNNGAT, NNNGCA, NNNGGT, NNNNACA, NNNNACAC, NNNNATAC, NNNNGAAT, NNNNGATT, NNNNGCAC, NNNNGTAC, NNNNGTAT, NNNNGTTT, TGA, TGC, TGT, TTA, TTC, TTT, TTTA ou uma sequência TTTC.

[0062] Em uma forma de realização, a sequência alvo de ácido nucléico do gRNA acima mencionado está localizada na sequência gênica polinucleotídica de APP.

[0063] Em uma forma de realização, a sequência alvo de ácido nucléico do gRNA acima mencionada compreende as seguintes sequências de ácidos nucléicos da sequência genética polinucleotídica do gene APP humano tendo o número de referência NCBI NG_007376.1. (A sequência PAM está em negrito).

[0064] Para a mutação A673T:

• ATTCTGCATCCATCTTCACTTCAGAG
• TTCTGCATCCATCTTCACTTCAGAG
• TCTGCATCCATCTTCACTTCAGAG
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• TTCTGCATCCAGATTCACTTCAGAGAT
• TCTGCATCCAGATTCACTTCAGAGAT
• CTGCATCCAGATTCACTTCAGAGAT
• TGCATCCAGATTCACTTCAGAGAT
• GCATCCAGATTCACTTCAGAGAT

[0065] Para a mutação A673V:

• ATGGATGCAGAATTCCGACATGAC
• TGGATGCAGAATTCCGACATGAC
• GGATGCAGAATTCCGACATGAC
• GATGCAGAATTCCGACATGAC
• ATGCAGAATTCCGACATGAC
• TGCAGAATTCCGACATGAC

[0066] Para a mutação H684R:

• TGAAGTTCATCATCAAAAATTGG
• GAAGTTCATCATCAAAAATTGG
• AAGTTCATCATCAAAAATTGG
• AGTTCATCATCAAAAATTGG
• GTTCATCATCAAAAATTGG
• TTCATCATCAAAAATTGG
• CATCATCAAAAATTGGTACGTAAAAT
• ATCATCAAAAATTGGTACGTAAAAT
• TCATCAAAAATTGGTACGTAAAAT
• CATCAAAAATTGGTACGTAAAAT
• ATCAAAAATTGGTACGTAAAAT
• TCAAAAATTGGTACGTAAAAT

[0067] Em uma forma de realização, pelo menos uma modificação dentro da sequência gênica polinucleotídica de APP endógeno da célula é introduzida por edição de base

[0068] Noutro aspecto, a presente invenção fornece um gRNA como aqui definido, o qual nas formas de realização pode ser utilizado nos métodos aqui descritos. A presente invenção também fornece um vetor contendo um ácido nucléico que codifica um gRNA aqui descrito. Também fornece células contendo esse ácido nucleico ou vetor. Em uma forma de realização, o vetor é um vetor viral. Em uma forma de realização, o vetor viral é um vetor lentiviral, vetor viral adeno associado (AAV), vetor adenovírus viral ou vetor herpes vírus. Em uma forma de realização, os vetores são partículas tipo vírus (VLPs), vesículas extracelulares ou exossomos.

[0069] Em uma forma de realização particular, os vetores acima mencionados ainda contêm um ácido nucleico codificando para uma desaminase sítio específica. Em uma forma de realização, o vetor ainda contém um ácido nucleico codificando para uma nicase cas9 fusionada com uma citidina desaminase ou uma adenosina desaminase, uma adenosina desaminase REPAIRv2 ou adenosina desaminase ADAR2.

[0070] Num aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo: i) um ou mais dos gRNAs acima mencionados, ii) uma citidina ou uma adenosina desaminase, iii) um ou mais dos vetores acima mencionados, e um transportador, tal como um transportador biologicamente aceitável ou um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0071] Em uma forma de realização, a composição contém ainda uma desaminase sítio específica ou um ácido nucleico que codifica uma desaminase sítio específica. Em uma modalidade, a desaminase sítio especifica é uma nuclease Cas9 inativa ou uma nicase fusionada com uma citidina desaminase ou uma adenosina desaminase.

[0072] Em uma forma de realização, a presente refere-se aos gRNAs acima mencionados, ácidos nucleicos, vetores, células hospedeiras e/ou composições para uso na diminuição do processamento da Proteína Precursora Amiloide (APP) em peptídeos Aβ amiloidogênicos por uma célula, ou para diminuir a produção de peptídeos Aβ amiloidogênicos por uma célula.

[0073] Em outra forma de realização, a presente invenção refere-se aos gRNAs acima mencionados, ácidos nucléicos, vetores, células hospedeiras e/ou composições para uso e tratamento ou prevenção da Doença de Alzheimer ou declínio cognitivo relacionado com a idade em um indivíduo que dela necessite.

[0074] Num aspecto relacionado, a presente invenção diz respeito aos acima mencionados gRNAs, vetores, células hospedeiras e/ou composições para a preparação de um medicamento para diminuir o processamento da Proteína Precursora Amiloide (APP) em peptídeos Aβ amiloidogénicos pela célula.

[0075] A presente invenção se refere também aos acima mencionados gRNAs, desaminases, vetores, células hospedeiras e/ou composições acima mencionadas para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção da doença de Alzheimer ou declínio cognitivo relacionado com a idade em indivíduo dele necessitado.

[0076] A presente invenção refere-se ainda à utilização dos acima mencionados gRNAs, desaminases, vetores, células hospedeiras e/ou composições para diminuir o processamento da Proteína Precursora β Amiloide (APP) no peptídeo Aβ pela célula.

[0077] Em outra forma de realização, a presente invenção relata o uso dos acima mencionados gRNAs, desaminases, vetores, células hospedeiras e/ou composições para prevenir ou tratar a Doença de Alzheimer ou declínio cognitivo relacionado a idade em um indivíduo que necessite.

[0078] Em outra forma de realização, a presente invenção relata um método de prevenir ou tratar a Doença de Alzheimer ou declínio cognitivo relacionado a idade em um indivíduo que necessite, compreendendo a introdução na célula ou colocando a célula do indivíduo em contato com os acima mencionados gRNAs, desaminases, vetores, células hospedeiras e/ou composições.

[0079] Em uma forma de realização dos métodos acima mencionados, a célula é de um indivíduo necessitado. Em uma forma de realização particular, o indivíduo necessitado é um indivíduo sob risco de desenvolver a Doença de Alzheimer.

[0080] A presente invenção mostra que é possível introduzir uma ou mais modificações num gene alvo ou mRNA envolvido na produção de peptídeos Aβ por edição gênica utilizando uma ou mais desaminases sítio especificas. As modificações introduzidas são projetadas especificamente para diminuir a produção de peptídeos Aβ amiloidogênicos.

[0081] Os requerentes mostram aqui que o gene polinucleotídico de APP endógeno ou a sequência de mRNA dentro de uma célula podem ser eficientemente modificados geneticamente para introduzir uma ou mais modificações projetadas para diminuir a produção de peptídeo Aβamiloidogênico. As modificações são introduzidas permitindo à célula contendo a desaminase sítio específica, alvejar especificamente a sequência gene polinucleotídico da APP endógeno ou do mRNA.

[0082] Uma reação de desaminação é produzida pela desaminase sítio específica na sequência do gene polinucleotídico da APP endógena ou sequência de mRNA, modificando assim as mesmas.

[0083] Usando tais métodos, modificações no gene alvo ou mRNA podem ser feitas para corrigir uma mutação endógena associada a um risco aumentado de produção ou acumulação de peptídeo Aβ amiloidogénico ou para introduzir uma ou mais modificações que diminuem a expressão ou processamento de APP em peptídeos Aβ amiloidogênicos ou produção de peptídeos Aβ amiloidogênicos.

[0084] Por exemplo, as mutações no gene APP associadas a formas familiares da Doença de Alzheimer podem ser corrigidas de acordo com a presente invenção alvejando o gene da APP endógeno ou o mRNA com uma desaminase alterando o códon mutado para o tipo selvagem. Noutro aspecto da presente invenção, o gene APP pode ser modificado para introdução de uma mutação protetora associada com níveis diminuídos de produção ou acúmulo de peptídeos Aβ-amiloidogênicos.

[0085] Como aqui utilizado, os termos “gene APP”, “ácido nucleico APP” e “sequência polinucleotídica APP” são utilizados de forma intercambiável e referem-se à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína precursora amiloide (Entrez 351; Ensembl ENSG00000142192; UniProt P05067; RefSeq mRNA NM_000484; RefSeq (protein) NP_000475). Um ácido nucleico de APP de tipo selvagem é um ácido nucleico, que possui a sequência nucleotídica do gene APP encontrado naturalmente em indivíduos e que não contém mutações (na região codificadora da proteína APP ou em qualquer outra parte do gene APP), que estejam associadas a um risco aumentado de desenvolver a Doença de Alzheimer. Um ácido nucleico de APP do tipo selvagem inclui assim variantes alélicas não associadas a formas familiares da Doença de Alzheimer e codifica a proteína APP do tipo selvagem (isto é, NM_000484.3; Uniprot P05067 e Figura 3). Em uma forma de realização particular a sequência de ácido do nucléico de APP de tipo selvagem tem a sequência da Sequência de Referência NCBI: NG_007376.1. A sequência polinucleotídica do gene APP endógeno em uma célula se refere à sequência de ácido nucleico de APP não modificada encontrada em tal célula.

[0086] Muitas mutações que causam a doença de Alzheimer foram relatadas no gene da APP e estas podem ser corrigidas de acordo com a presente invenção. Num aspecto particular da presente invenção, a correção envolve a substituição do(s) nucleotídeo(s) mutado(s) pelo(s) nucleotídeo(s) normalmente encontrado(s) no gene APP. Em outro aspecto, a correção envolve a substituição dos nucleotídeos mutados por nucleotídeos que codificam os aminoácidos do tipo selvagem da proteína APP. Nesse caso, os nucleotídeos de substituição podem ser os mesmos que os encontrados na sequência de ácido nucléico de APP de tipo selvagem ou podem ser diferentes (por exemplo, devido a degenerescência dos códons), desde que a sequência corrigida codifique a proteína APP de tipo selvagem. As mutações nos éxons que codificam a proteína APP, no promotor ou em qualquer outra sequência reguladora no gene APP modulando a expressão da proteína APP, podem ser direcionadas de acordo com a presente invenção. Por exemplo, mutações em qualquer dos 18 éxons do gene APP podem ser alvejadas e corrigidas de acordo com a presente invenção (isto é, mutações no éxon 1, éxon 2, éxon 3, éxon 4, éxon 5, éxon 6, éxon 7, éxon 8, éxon 9, éxon 10, éxon 11, éxon 12, éxon 13, éxon 14, éxon 15, éxon 16, éxon 17 e éxon 18). A modificações introduzidas na porção da sequência polinucleotídica do gene que codifica para a proteína APP (isto é, sequência de éxons) será refletida na proteína APP expressa pela célula (isto é, a célula normalmente irá expressar a proteína APP modificada/corrigida).

[0087] Exemplos não limitantes de mutações na proteína APP que podem ser corrigidas incluem: KM670 / 671NL (12), Ala673Val (13), His677Arg (14), Asp678Asn (15), Asp678His (16), Glu682Lys (17), Ala692Gly ( 18), Glu693Gln (19), Glu693Gly (20), Glu693del (21), Asp694Asn (22), Leu705Val (23), Ala713Thr (24), Ala713Thr (25), Ala713Val (26), Thr714Ala (27), Thr714Ile (28), Val715Met (29), Ile716Val (30), Ile716Phe (31), Val717Ile (32), Val717Leu (33), Val717Phe (34), Val717Gly (35), Leu723Pro (36), Lys724Asn (37) e His733Pro (38). Todas as mutações localizadas entre os aminoácidos 656 e 688 estão localizadas no éxon 16 do gene APP. Verificou-se que este éxon é eficientemente direcionado e substituído utilizando uma forma de realização do método da presente invenção.

[0088] Outras mutações associadas com Doença de Alzheimer, tais como as encontradas nos genes da Presenilina 1 (PS1) e Presenilina 2 (PS2) também podem ser corrigidas usando os métodos aqui descritos.

[0089] Além de corrigir mutações associadas ao aumento do risco de desenvolver a doença de Alzheimer (por exemplo, mutações associadas a formas familiares da DA), também é possível introduzir uma ou mais modificações no gene da APP, que são conhecidas por proteger contra a doença de Alzheimer. Uma dessas modificações é a substituição da alanina na posição 673 da sequência da proteína APP por uma treonina (substituição A673T no éxon 16). Verificou-se que a presença da variante A673T nos indivíduos reduz o risco de desenvolver a doença de Alzheimer e protege contra o declínio cognitivo relacionado com a idade. A substituição A673T é adjacente ao sítio de clivagem da β-secretase na APP e resulta em uma redução de 40% na formação de peptídeos β-amiloides tóxicos nas células 293T. A segunda modificação é a troca de uma alanina na posição 673 da sequência de proteína APP por uma valina (substituição A673V no éxon 16). Embora a mutação induza a Doença de Alzheimer quando o indivíduo é homozigoto para a mutação, esta mutação em humanos heterozigotos, é protetora contra a DA3-5,20. A terceira modificação é a substituição de uma histidina na posição 684 da sequência proteica da APP por uma Arginina (substituição H684R no éxon 16). Na proteína APP humana, BACE1 normalmente corta entre o aminoácido metionina, na posição 671 e asparagina na posição 672, a mutação H684R favorece o corte entre o aminoácido tirosina na posição 681 e ácido glutâmico na posição 682 levando assim a formação de peptídeos Aβ11-xx mais curtos, os quais são amiloidogênicos5 .

[0090] A introdução das substituições A673T, A673V ou H684H de acordo com a presente invenção pode ser feita sozinha no gene APP ou em combinação com uma ou mais modificações que visem, por exemplo, a correção de mutações endógenas associadas a um risco aumentado de desenvolvimento de DA ou declínio cognitivo relacionado à idade ou a introdução de mutações, que previnem a DA. Por exemplo, mutações associadas a um risco aumentado de desenvolvimento de DA presente no éxon 16 podem ser vantajosamente corrigidas ao mesmo tempo que a substituição protetora A673T, A673V ou H684H são introduzidas no gene da APP. Evidentemente, mutações localizadas em outro lugar (isto é, em éxons outros que não sejam o éxon 16) também podem ser correntemente corrigidas.

[0091] Modificações no gene APP ou outros genes associados com DA podem ser feitas em células (neurônios) de um sujeito necessitado. Como aqui utilizado, “um sujeito necessitado” é um sujeito, que pode se beneficiar de uma produção reduzida de peptídeos Aβ amiloidogênicos. Exemplos não limitantes de um indivíduo necessitado incluem um indivíduo possuindo células com um elevado nível de produção de peptídeos Aβ amiloidogênicos (expressão e/ou maturação de APP) ou atividade em comparação com células de um indivíduo normal. Em uma modalidade, o indivíduo disso necessitado é um indivíduo sadio (isto é, um sujeito em risco de desenvolver DA ou declínio cognitivo relacionado à idade) um indivíduo já diagnosticado com DA ou declínio cognitivo relacionado com a idade ou um indivíduo que não tenha sido diagnosticado com DA e que não tem uma mutação conhecida por aumentar o risco de DA. Como aqui utilizado, um sujeito em risco de desenvolver DA ou declínio cognitivo relacionado com a idade, é um sujeito que ainda não foi diagnosticado com a doença ou condição, mas que, devido a certos fatores (idade, história familiar, hereditariedade) é provável que desenvolver de doença ou condição mais tarde em sua vida. Em uma modalidade, o sujeito sob risco é um sujeito com uma mutação nos genes APP, PS-1 e/ou PS-2. Noutra modalidade, o sujeito em risco é um sujeito com uma mutação no gene APOE-e4. Noutra modalidade, o sujeito em risco é um sujeito que tem pelo menos um membro da família (isto é, mãe, pai, irmão, irmã ou filho) diagnosticado com doença de Alzheimer ou declínio cognitivo relacionado com a idade. Em uma forma de realização, o sujeito em risco é um indivíduo que tenha uma mutação associada com a doença de Alzheimer precoce ou com a doença de Alzheimer familiar (FAD). Em uma forma de realização, o indivíduo é um mamífero, preferencialmente um humano.

[0092] Modificações associadas com DA (isto é, APP, PS-1 e PS-2) de acordo com a presente invenção podem ser usadas para prevenir ou tratar a Doença de Alzheimer ou o declínio cognitivo relacionado à idade. Conforme usados aqui, os termos “prevenção, prevenindo e prevenir” significam que a(s) modificação(ões), previne(m) ou retarda(m) o início da doença. Como aqui utilizado, os termos “tratar /tratando /tratamento” inclui casos em que a(s) modificação(ões) genética(s) reduz(em) parcialmente ou completamente a progressão da doença e casos em que os sintomas associados à doença são reduzidos parcial ou completamente (i.e. um ou mais sintomas associados à neurotoxicidade do peptídeo Aβ).

[0093] Preferencialmente, uma ou mais modificações no gene alvo (isto é, APP) em células (isto é, neurônios) de um indivíduo são introduzidas o mais cedo possível após a identificação de um risco de desenvolvimento de DA ou logo após o diagnóstico de DA. Em uma modalidade particular, esta ou estas modificação(ões) genética(s) nas células são feitas após a detecção pela Imagem de Ressonância Magnética (IRM) de placas contendo depósitos extracelulares de peptídeos β (Aβ) amiloides no cérebro do indivíduo.

[0094] Métodos para introduzir uma ou mais modificações genéticas de acordo com a presente invenção preferencialmente envolvem a edição de base (BE). O tratamento proposto requer a modificação de pares de bases no gene alvo (por exemplo, APP) utilizando Cas nicase especificamente concebida fundida com uma desaminase, tal como a REPAIRv2 desaminase ou a ADAR2 desaminase. A introdução de um SSB permite modificar o gene alvo para, por exemplo, reduzir a formação de peptídeos Aβ tóxicos (isto é, corrigindo uma ou mais mutações endógenas em um gene alvo, que estão associadas com um risco aumentado de desenvolver DA e/ou introduzindo uma modificação protetora no gene alvo, o que reduz a formação de placa Aβ nos neurônios).

[0095] Embora as modificações genéticas no gene alvo sejam preferencialmente introduzidas pela edição de bases HR, SSBs em células, o DNA também pode ser reparado espontaneamente por Junção Terminal Não Homóloga (NHEJ) levando à presença de micro-inserções ou micro-deleções (INDELs) no gene alvo. Embora estas formas de modificações genéticas não sejam preferidas, elas podem, no entanto, ser úteis para prevenir a formação do peptídeo Aβ (isto é, por exemplo, reduzindo completamente ou parcialmente o nível de APP sintetizado nas células ou pela prevenção de um corte da proteína APP pela β-secretase.

[0096] Vários tipos de endonucleases ou nicases podem ser fundidas com uma desaminase para induzir uma mutação de base em sítio(s) específico(s) selecionado(s) em gene(s) alvo(s) ou mRNA(s) (isto é, APP, PS-1, PS-2 , etc.). Exemplos não limitantes de endonucleases e nickases úteis incluem meganucleases, nucleases dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras tipo ativadoras de transcrição (TALENs), as Cas nucleases, as Cas nicases ou uma Cas nuclease inativa usada com RNA guia (gRNA) no Sistema agrupado de repetição de palíndromos curtos (CRISPR)24-26. Cada uma destas tecnologias pode ser utilizada para modificar um gene alvo de acordo com a presente invenção.

[0097] Preferencialmente, a presente invenção utiliza o sistema CRISPR (isto é, combinação de gRNA e nicase Cas fundidos com uma desaminase, a REPAIRv2 desaminase ou a ADAR2 desaminase) para introduzir uma ou mais modificações genéticas em um gene ou mRNA alvo (e.g., APP). Os requerentes demonstram aqui que os gRNAs específicos podem ser rapidamente produzidos e utilizados com uma desaminase para modificar eficientemente o gene APP endógeno em células humanas.

O SISTEMA CRISPR

[0098] Descobertas recentes no campo da imunidade bacteriana levaram ao desenvolvimento de um novo sistema para controlar a expressão gênica nas células. Bactérias e archaeas desenvolveram defesas imunes adaptativas denominadas Sistemas de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas Regularmente e Interespaçadas (CRISPR). Os quais, usam crRNAs e proteínas Cas para degradar sequências complementares presentes no DNA27 viral e plasmídeo invasor. Jinek et al.28 e Mali et al.27 projetaram um sistema CRISPR bacteriano tipo II usando RNA guia personalizado (gRNA) para induzir quebras de fita dupla no DNA.

[0099] A presente invenção mostra aqui pela primeira vez que o Cas9 pode ser fundido com uma desaminase para modificar eficientemente um gene alvo (por exemplo, APP) nas células. Consequentemente, uma modificação protetora foi introduzida no gene APP (isto é, a mutação A673T, A673V ou H684H no éxon 16 do gene APP). Esta modificação mostrou reduzir a formação de peptídeo Aβ amiloidogênico nas células.

[0100] Assim, em um aspecto, métodos da presente invenção envolvem o desenho de um ou mais gRNAs para induzir a modificação de um par de bases no gene APP ou um nucleotídeo no mRNA. Os gRNA(s) que têm como alvo uma região de interesse e Cas nicase (por exemplo, Cas9n) fundida com uma desaminase, a desaminase REPAIRV2 ou ADAR2 são então utilizados para introduzir a(s) modificação(ões) desejada(s) no gene endógeno dentro da célula. A presente invenção relata ainda o uso de tais modificações genéticas, tais como para reduzir a formação de peptídeos Aβ amiloidogênicos nas células de um indivíduo que necessite disto, tal como para o tratamento da Doença de Alzheimer e para o declínio cognitivo relacionado à idade.

[0101] Para induzir uma modificação de par de bases no DNA em um sítio específico, a proteína Cas9-desaminase requer a presença de um gRNA e um motivo protoespaçador adjacente (PAM) imediatamente após a sequência de nucleotídeos alvo do gRNA29. O PAM é a sequência de nucleotídeos adjacente à sequência nucleotídica visada pelo gRNA. Proteínas Cas diferentes requerem um PAM diferente. Consequentemente, a seleção de uma sequência alvo polinucleotídica específica (isto é, na sequência de ácido nucleico da APP) por um gRNA é geralmente baseada na proteína Cas recombinante utilizada.

[0102] Em uma forma de realização, a proteína Cas recombinante que pode ser utilizada de acordo com a presente invenção é i) derivada de uma Cas de ocorrência natural; e ii) tem uma atividade de nicase para introduzir um corte de fita única (SSB) no DNA celular quando na presença de gRNA (s) apropriado (s). Noutra forma de realização, a proteína Cas é a proteína Cas9 com uma atividade de nicase [39]. De acordo com a presente invenção, a proteína Cas pode ser derivada de qualquer fonte de ocorrência natural. Em outra forma de realização, a adenosina pode ser modificada numa inosina que é bioquimicamente lida como guanosina, visando o gene ou mRNA com um gRNA e com uma adenosina desaminase, tal como ADAR2 ou REPAIRv2.

[0103] Por exemplo, as proteínas Cas9 são proteínas efetoras naturais induzidas por numerosa espécie de bactérias incluindo Streptococcus pyogenes30 , Streptococcus thermophilus31 , Campylobacter jejuni32 , Staphylococcus aureus33 , Streptococcus canis34 e Neisseria meningitides29 . Assim, em uma forma de realização, a proteina Cas9 da presente invenção é uma Cas9 nicase derivada de uma bactéria acima mencionada. Em uma forma de realização, a proteína Cas9 recombinante da presente modalidade é um códon humano otimizado spCas9 derivado das bactérias acima mencionadas.

[0104] Embora uma perfeita homologia entre o gRNA e a sequência de DNA no gene alvo seja preferida, uma incompatibilidade entre o o gRNA e o par de base alvo na sequência do gene de interesse também é permitido, uma vez que ainda permita uma hibridização entre o gRNA e a sequência de DNA alvo seguida do reconhecimento pela Cas9 e introdução da modificação de um nucleotídeo no DNA alvo ou mRNA. Uma sequência semente de 8 a 12 nucleotídeos no gRNA perfeitamente complementar a sequência alvo (isto é, gene APP ou sequência de mRNA) é preferida para o reconhecimento próprio da sequência alvo. Em geral, a atividade do gRNA é inversamente correlacionada com o número de desemparelhamentos. Preferivelmente, o gRNA da presente invenção compreende 7 desemparelhamentos, 6 desemparelhamentos, 5 desemparelhamentos, 4 desemparelhamentos, 3 desemparelhamentos, mais preferencialmente 2 desemparelhamentos, ou menos, e ainda mais preferivelmente nenhum emparelhamento errado, com a correspondente sequência alvo correspondente. Naturalmente, quanto menor o número de nucleotídeos no gRNA, menor o número de incompatibilidades toleradas. É aceito que a afinidade de ligação depende da soma das combinações de gRNA-DNA ou gRNA-mRNA correspondentes.

[0105] Além das desaminases fundidas com as nicases derivadas de Cas9, outras desaminases podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção para introduzir modificação sítio específica de nucleotídeo no DNA ou mRNA. Tal desaminase pode ser fundida com as nicases de Cas9, mas também pode ser fundida com meganucleases, nucleases de dedo de zinco e nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs).

[0106] As proteínas desaminases recombinantes da presente invenção preferivelmente compreendem pelo menos um Sinal de Localização Nuclear (NLS) para direcionar a proteína para o núcleo da célula. Assim, tal como aqui utilizado, a expressão “sinal de localização nuclear” ou “NLS” se refere a uma sequência de aminoácidos, a qual “marca” uma proteína para importação no núcleo da célula por transporte nuclear. Tipicamente, este sinal consiste em uma ou mais sequências curtas de lisinas ou argininas carregadas positivamente, expostas na superfície da proteína. Diferentes proteínas localizadas no núcleo podem compartilhar o mesmo NLS. Um NLS tem a função oposta de um sinal de exportação nuclear, que direciona as proteínas para fora do núcleo. Os NLSs clássicos podem ser classificados como monopartites ou bipartites. O primeiro NLS a ser descoberto foi a sequência PKKKRKV no SV40 Large T-antigen (um NLS monopartite). O NLS da nucleoplasmina, KR [PAATKKAGA] KKKK, é o protótipo do sinal bipartite universal: dois grupos de aminoácidos básicos, separados por um espaçador de cerca de 10 aminoácidos.

[0107] Existem muitos outros tipos de NLS, os quais são qualificados como “não clássicos”, tais como o domínio acídico M9 do hnENP A1, a sequência KIPIK no repressor de transcrição de levedura Matα2, os sinais complexos de U snRNPs, bem como a recentemente identificada classe de NLSs conhecida como PY- NLSs. Assim, qualquer tipo de NLS (clássica ou não clássica) pode ser utilizado de acordo com a presente invenção, desde que atinja a proteína de interesse no núcleo de uma célula alvo. Em outra forma de realização, o NLS é derivado do antígeno T grande do vírus símio 40. Em outra forma de realização, o NLS da proteína recombinante da presente invenção compreende a seguinte sequência de aminoácidos: SPKKKRKVEAS. Em uma forma de realização, o NLS contém a sequência KKKRKV. Em uma forma de realização, o NLS contém a sequência SPKKKRKVEASPKKKRKV. Em outra forma de realização, o NLS contém a sequência KKKRK.

[0108] A proteína desaminase da presente invenção pode ser opcionalmente acoplada de forma vantajosa a um domínio de transdução de proteína para assegurar a entrada da proteína nas células alvo. Alternativamente, o ácido nucleico que codifica para o gRNA e para a desaminase pode ser distribuído em células alvo utilizando vários vetores virais, partículas semelhantes a vírus (VLP) ou exossomas.

[0109] Os domínios de transdução de proteínas (PTD) podem ter vias origens e permitem a entrega intracelular de uma dada terapêutica, facilitando a translocação da proteína/polipeptídio para dentro de uma membrana celular, membrana de organela ou membrana de vesícula. PTD refere-se a um polipeptídio, polinucleotídeo, hidrato de carbono ou composto orgânico ou inorgânico que facilita a passagem de uma bicamada lipídica, micélio, membrana celular, membrana de organela ou membrana de vesícula. Um PTD ligado a outra molécula facilita a passagem da molécula por uma membrana, por exemplo, indo do espaço extracelular para o espaço intracelular, ou citosol para dentro de uma organela incluindo a mitocôndria.

[0110] Em uma forma de realização, um PTD é covalentemente ligado ao terminal amino de uma proteína recombinante da presente invenção. Em outra forma de realização, um PTD é covalentemente ligado ao terminal carboxil de uma proteína recombinante da presente invenção. Os domínios de transdução de proteína exemplificativos incluem mas não se limitam a um domínio de transdução de proteína mínimo undecapeptídeo (correspondendo aos resíduos 47-57 de HIV-1 TAT contendo YGRKKRRQRRR; uma sequência de poliarginina compreendendo um número de argininas suficientes para dirigir a entrada numa célula (isto é, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 10-50 argininas), um domínio VP22 (49), um domínio de transdução de proteína de Drosophila Antennapedia (50), um peptídeo truncado de calcitonina humana (51), RRQRRTSKLMKR; Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL; KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA; e RQIKIWFQNRRMKWKK. Exemplares adicionais de PTDs incluem, mas não estão limitados a KKRRQRRR, RKKRRQRRR ou um homopolímero de arginina de 3 a 50 resíduos de arginina.

[0111] Outros exemplos não limitantes de PTD incluem um peptídeo de escape endosomal. Exemplos não limitantes de tais peptídeos de escape endossomal são listados na Tabela 1 abaixo.

[0112] Em uma forma de realização, o domínio de transdução da proteína é TAT ou Pep-1. Em uma forma de realização, o domínio de transdução de proteína é TAT e contém a sequência SGYGRKKRRQRRRC. Em outra forma de realização, o domínio de transdução da proteína é TAT e contém a sequência YGRKKRRQRRR. Em outra forma de realização, o domínio de transdução da proteína é TAT e contém a sequência KKRRQRRR. Em outra forma de realização, o domínio de transdução da proteína é Pep-1 e contém a sequência KETWWETWWTEWSQPKKKRKV.

[0113] Adicionalmente ou alternativamente para os domínios de transdução de proteínas acima mencionados, a nicase (isto é, nicase Cas9) proteína recombinante ou ácido nucléico e gRNA(s) da presente invenção podem ser acoplados a lipossomas para facilitar adicionalmente a sua posterior entrega nas células.

[0114] As construções genéticas que codificam para uma desaminase, de acordo com a presente invenção podem ser feitas utilizando síntese gênica convencional ou montagem modular.

[0115] Em um aspecto, os gRNAs e as proteínas desaminases recombinantes da presente invenção podem ser usadas para diminuir a produção de peptídeos Aβ amiloidogênicos tóxicos. Em outro aspecto, os gRNAs e a proteína desaminase recombinante da presente invenção pode ser usada para diminuir a clivagem de APP no sítio da beta secretase (isto é, entre os aminoácidos 671 e 672 da APP) inibindo assim completamente ou parcialmente a produção de peptídeos Aβ amiloidogênicos. Como aqui utilizado, a expressão “diminuindo” em “diminuindo a expressão de peptídeos Aβ amiloidogênicos numa célula” pretende incluir circunstâncias onde, na ausência de um gRNA e de uma proteína desaminase da presente invenção, os peptídeos Aβ amiloidogênicos são expressos em certa quantidade (valor de base), os quais são diminuídos em sua presença. Isto compreende a diminuição/ redução/ inibição da maturação (clivagem) em peptídeos Aβ amiloidogênicos completa ou parcialmente nas células. A célula pode ser uma célula que expresse um nível normal de APP ou peptídeos Aβ amiloidogênicos ou um nível anormal/maior de peptídeos Aβ amiloidogênicos (em comparação com condições normais).

[0116] Em uma modalidade, o gRNA e a desaminase da presente invenção podem ser utilizados para diminuir a produção de peptídeos Aβ amiloidogênicos.

[0117] Em uma forma de realização, a presente invenção refere-se a um método de diminuição da expressão de peptídeos amiloidogênicos, produção ou acúmulo em um indivíduo necessitado do mesmo compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um gRNA, uma proteína desaminase recombinante da presente invenção, de modo a introduzir uma ou mais modificações genéticas em um gene alvo (isto é, APP, PS-1 ou PS-2). Em uma forma de realização, a proteína recombinante desaminase e o gRNA são especificamente projetados para atravessar a membrana plasmática e alcançar o núcleo. Em uma forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma proteína desaminase recombinante e um gRNA da presente invenção em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização, o método da presente invenção corrige uma mutação presente num gene alvo, o qual está associado a um risco acrescido de desenvolver a Doença de Alzheimer. Em uma forma de realização, a mutação aumenta a expressão ou maturação da APP em polipeptídios Aβ tóxicos. Em outra forma de realização, o método da presente invenção introduz uma modificação em um gene alvo ou mRNA, a qual protege contra a doença de Alzheimer (isto é, reduz o risco de desenvolvimento da doença de Alzheimer). Em uma forma de realização, a modificação diminui a produção de peptídeos Aβ amiloidogênicos através da modificação de um ou mais dos sítios de clivagem das beta e gama secretases na proteína APP, reduzindo desse modo a secreção do peptídeo Aβ amiloidogênico. Em uma modalidade, a modificação é uma modificação nos aminoácidos 673 ou 684 ou outros aminoácidos próximos daquela posição na proteína APP, que reduz o corte pela beta-secretase. Em uma modalidade, a modificação substitui uma alanina na posição 673 por uma treonina ou uma valina. Em outra modalidade, a modificação substitui uma histidina na posição 684 por uma arginina.

Otimização da degeneração de códon

[0118] Porque várias proteínas nucleases sítio específicas, tais como Cas9, são normalmente expressas em bactérias, pode ser vantajoso modificar as suas sequências de ácido nucléico para expressão ótima em células eucarióticas (e.g., células de mamíferos). Isto foi feito para a modalidade da nuclease Cas9 e proteínas desaminases da presente invenção aqui descrita.

[0119] A degenerescência de códons pode também ser utilizada para distinguir dois ácidos nucleicos que codificam para a mesma proteína. Por exemplo, a sequência de ácido nucleico do doador da presente invenção pode conter uma ou mais modificações em relação a sequência do gene alvo do tipo selvagem, a qual não traduz em modificações ao nível de aminoácidos.

[0120] Por conseguinte, o quadro de códons seguinte (Tabela 2) pode ser utilizado, num esquema mutagênico sítio dirigido, para produzir ácidos nucleicos codificando as mesmas sequências de aminoácidos ligeiramente diferentes de um dado ácido nucléico:

Similaridade de Sequência

[0121] "Homologia" e "homólogo" se referem à similaridade entre dois peptídeos ou duas moléculas de ácido nucléico. A homologia pode ser determinada comparando cada posição nas sequências alinhadas. Um grau de homologia entre ácido nucleico ou entre sequências de aminoácidos é uma função do número de nucleotídeos ou aminoácidos idênticos ou correspondentes em posições partilhadas pelas sequências. Como o termo é aqui utilizado, uma sequência de ácido nucleico é "homóloga" a outra sequência se as duas sequências forem substancialmente idênticas e a atividade funcional das sequências for conservada (como aqui utilizado, o termo "homólogo" não infere parentesco evolutivo, mas, em vez disso, refere-se à identidade substancial da sequência). Duas sequências de ácido nucleico são consideradas substancialmente idênticas se, quando idealmente alinhadas (com intervalos permitidos), elas compartilham pelo menos cerca de 50% de similaridade ou identidade de sequência, ou se as sequências compartilham motivos funcionais definidos. Em modalidades alternativas, a similaridade de sequências otimamente alinhadas pode ser de pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%. Por uma questão de brevidade, as unidades (por exemplo, 66, 67 … 81, 82 … 91, 92% ...) não foram sistematicamente citadas, mas são consideradas, no entanto, no âmbito da presente invenção.

[0122] Ácidos nucleicos substancialmente complementares são ácidos nucleicos em que o complemento de uma molécula é substancialmente idêntico à outra molécula. Duas sequências de ácidos nucleicos ou de proteínas são consideradas substancialmente idênticas se, quando idealmente alinhadas, elas partilham pelo menos cerca de 70% de identidade da sequência. Em uma forma de realização alternativa, a identidade da sequência pode, por exemplo, ser pelo menos de 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. O alinhamento ideal de sequências para comparações de identidade pode ser conduzido usando uma variedade de algoritmos, como o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman35, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch36, a busca pelo método de similaridade de Pearson e Lipman37 e as implementações computorizadas destes algoritmos (tais como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software Genetics de Wisconsin, Genetics Computer Group, Madison, WI, EUA). A identidade da sequência pode também ser determinada usando o algoritmo BLAST, descrito em Altschul et al.38 (usando as configurações padrão publicadas). O software para executar a análise BLAST pode estar disponível através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (na Internet em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). O algoritmo BLAST envolve primeiro a identificação de pares de sequência de pontuação alta (HSPs) identificando palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta que corresponde ou satisfaz algum valor limiar de valor positivo T quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é referido como a palavra vizinha no limiar da pontuação de palavras da vizinhança. O sucesso das palavras vizinhas iniciais atua como sementes para iniciar pesquisas para encontrar HSPs mais longos. As palavras atingidas são estendidas em ambas as direções ao longo de cada sequência, na medida em que a pontuação de alinhamento cumulativo pode ser aumentada. A extensão da palavra acertos em cada direção é interrompida quando os seguintes parâmetros são atendidos: a pontuação cumulativa de alinhamento cai pela quantidade X de seu valor máximo atingido; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontuação negativa; ou o fim de qualquer sequência é alcançado. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. Uma medida da similaridade estatística entre duas sequências usando o algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P (N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos ocorreria por acaso. Em formas de realização alternativas da invenção, sequências de nucleotídeos ou aminoácidos são consideradas substancialmente idênticas se a menor probabilidade de soma numa comparação das sequências teste for inferior a cerca de 1, de preferencialmente inferior a cerca de 0,1, mais preferencialmente inferior a cerca de 0,01 e ainda mais preferencialmente inferior a cerca de 0,001.

[0123] Uma indicação alternativa de que dois ácidos nucléicos são substancialmente complementares e que as duas sequências hibridem uma com a outra sob rigor moderado, ou condições preferencialmente rigorosas. A hibridização de sequências ligadas a filtros em condições de rigor moderado pode, por exemplo, ser realizada em NaHPO4 0,5 M, Sódio Dodecil Sulfato 7% (SDS), EDTA 1 mM a 65°C e lavagem em 0.2 x SSC/0.1% SDS at 42°C (64). Alternativamente, a hibridização de sequências ligadas a filtros em condições de rigor moderado pode, por exemplo, ser realizada em 0.5 M NaHPO4, 7% SDS, 1 mM EDTA at 65°C, e lavagem em 0.1 x SSC/0.1% SDS a 68°C (64). As condições de hibridação podem ser modificadas de acordo com métodos conhecidos, dependendo da sequência de interesse. Geralmente, as condições rigorosas são selecionadas para serem cerca de 5°C inferiores ao ponto de fusão térmica para a sequência específica a uma força iônica e pH definidos.

[0124] Em outro aspecto, a invenção proporciona ainda um ou mais ácidos nucléicos que codificam para as Cas acima mencionadas ou proteínas desaminases recombinantes e sequências de gRNA. A invenção também fornece um vetor contendo um ou mais dos ácidos nucléicos mencionados acima. Em uma forma de realização, o vetor contém ainda um elemento regulador da transcrição operacionalmente ligado ao ácido nucléico acima mencionado. Uma primeira sequência de ácido nucléico está ligada de forma operacional a uma segunda sequência de ácido nucléico quando a primeira sequência de ácido nucléico colocada numa relação funcional com a segunda sequência de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência codificante se o promotor afetar a transcrição ou expressão das sequências codificantes. Geralmente, as sequências de DNA “operacionalmente ligadas” estão contíguas e, onde é necessário, para unir as regiões codificantes de duas proteínas, na fase de leitura. No entanto, uma vez que, por exemplo, os intensificadores geralmente funcionam quando separados dos promotores por várias kilobases e as sequências intrônicas podem ter comprimentos variáveis, alguns elementos polinucleotídicos podem ser operativamente ligados, mas não contíguos. "Elemento regulador da transcrição" é um termo genérico que se refere a sequências de DNA, tais como sinais de iniciação e terminação, intensificadores e promotores, sinais de processamento, sinais de poliadenilação, que induzem ou controlam a transcrição de sequências codificantes de proteínas com as quais estão operacionalmente ligados.

[0125] Como indicado acima, os ácidos nucléicos recombinantes de gRNAs e Cas ou desaminase da presente invenção podem ser entregues nas células utilizando vários vetores virais. Por conseguinte, preferencialmente, o vetor acima mencionado para introduzir o ácido nucleico de gRNA e ou Cas e/ou desaminase que codifica a sequência de Cas9 ou de desaminase da presente invenção numa célula alvo (preferivelmente um neurónio) é um vetor viral. Exemplos não limitantes de vetores virais incluem retrovírus, lentivírus, herpes vírus, adenovírus ou vírus adeno associados, bem conhecidos no estado da técnica. Herpes vírus, adenovírus, vírus adeno associados e vetores virais derivados de lentivírus têm mostrado infectar eficientemente células neuronais. Preferencialmente, o vetor viral é episcopal e não citotóxico para as células. Em uma forma de realização, o vetor viral é um vírus AAV ou Herpes. Os genes Cas9 nicase e/ou desaminase ou Cas9 nicase e/ou a proteína desaminase também podem ser entregues às células por partículas semelhantes a vírus (VLP), exossomos ou outras vesículas extracelulares, tais como exossomos.

[0126] Ainda noutro aspecto, a presente invenção proporciona uma célula (isto é, uma célula hospedeira, uma célula recombinante) contendo o gene alvo modificado ou o mRNA. A invenção proporciona ainda um sistema de expressão recombinante, vetores e células hospedeiras, tais como os descritos acima, para a expressão/produção de uma proteína recombinante, utilizando por exemplo meios de cultura, produção, métodos de isolamento e purificação bem conhecidos na arte.

[0127] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição (isto é, uma composição farmacêutica) contendo o gRNA acima mencionado e uma nicase recombinante (isto é, Cas9) fundida com um ácido nucléico ou proteína desaminase. Em uma forma de realização, a composição contém os vetores virais acima mencionados, partículas semelhantes a vírus (VLP), exossomas ou outras vesículas extracelulares para direcionar o gRNA, nicase (isto é, Cas9n), a REPAIRv2 desaminase ou a ADAR2 desaminase para dentro de uma célula. Em uma forma de realização, a composição ainda contém um ou mais carreadores, excipientes, e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

[0128] Como aqui utilizado, “farmaceuticamente aceitável” (ou “biologicamente aceitável”) refere-se a materiais caracterizados pela ausência de efeitos biológicos tóxicos ou adversos (ou limitados) in vivo. Se referem a esses compostos, composições e/ou formas de dosagem, que são, dentro do escopo do julgamento médico correto, adequados para uso em contato com fluidos biológicos e/ou tecidos e/ou órgãos de um indivíduo (isto é, humanos, animal) sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação benefício / risco razoável.

[0129] A presente invenção proporciona ainda um kit ou pacote contendo o gRNA acima mencionado a nicase recombinante e/ou a proteína desaminase ou composição, juntamente com instruções para reduzir níveis de produção dos peptídeos Aβ amiloidogênicos (expressão ou maturação) numa célula ou para o tratamento da doença de Alzheimer doença ou declínio cognitivo relacionado com a idade.

[0130] A presente invenção é ilustrada em mais detalhes pelos seguintes exemplos não limitantes.

EXEMPLOS Exemplo 1: Efeito da mutação A673 na formação de peptídeos Aβ em APP contendo mutações FAD

[0131] Nosso primeiro experimento teve como objetivo verificar se a mutação islandesa (A673T) reduziu a formação dos peptídeos Aβ40 e Aβ42 quando uma mutação FAD também estava presente no gene APP. Isto foi testado construindo vários plasmídeos contendo o gene APP com uma a três mutações FAD com ou sem uma mutação islandesa adicional. Estes plasmídeos foram então transfectados em células 293T ou em células SH-SY5Y e a concentração dos peptídeos Aβ40 e Aβ42 foi medida no meio de cultura 3 dias depois.

[0132] O plasmídeo utilizado como esqueleto foi pcDNA6/V5-His da Invitrogen Inc. Um cDNA APP695 foi inserido por ligação entre os sítios de corte Kpn1 e Xba1. Este plasmídeo foi então mutado com o kit de mutagênese Q5 da New England Biology Inc. (NEB), a fim de criar uma mutação pontual única responsável pela forma familiar da doença de Alzheimer (FAD). Várias mutações nos éxons 16 e 17 do APP, conhecidas por induzir um FAD pelo aumento da patogenicidade do Alzheimer, foram criadas: KM670/671NL39, A673V40 , H677R41, D678H (Chen et al., 2012), D678N42, E682K43, A692G44, E693del45 , E693G46, D694N47, A713T48, T714A49, T714I50, V715A51, V715M52, I716F53 , I716M54, I716T55, I716V56, V717F57, V717G58, V717I59, V717L60, T7119P61 , M722K62, L723P63, K724N64 .

[0133] Plasmídeos contendo 2 ou 3 mutações FAD também foram criados porque vários modelos de DA de camundongos continham estas combinações de mutações

[0134] A fim de determinar o efeito protetor da mutação islandesa A673T, foi também feito outro conjunto de plasmídeos com cDNA de APP contendo não apenas uma ou várias mutações de FAD mas também uma mutação islandesa adicional (A673T).

Transfecção em células SH-SY5Y ou 293T de plasmídeos que codificam para o cDNA APP695 contendo uma ou várias mutações FAD contendo ou não a mutação islandesa

[0135] O reagent de transfecção (Lipofectamine 2000™) e (Opti-MEM-1™ culture media) foram comprados da Life Technologies Inc.

[0136] No dia anterior à transfecção, 100.000 células 293T ou SH-SY5Y foram semeadas por poço em placas de 24 poços em meio DMEM (DMEM F12 para células SH-SY5Y) meio suplementado com 10% de FBS e antibióticos (penicilina / estreptomicina 1X). Na manhã seguinte, o meio de cultura foi trocado por 500 µL de meio DMEM (DMEM F12 para células SH-SY5Y) suplementado com 10% de FBS sem antibióticos. A placa foi incubada a 37°C na incubadora durante o tempo necessário para preparar a solução de transfecção. Para a transfecção, as soluções A e B foram as primeiras a serem preparadas. A solução A, continha 48 µL de Opti-MEM™ e 2 µL de Lipofectamine™ 2000 para um volume final de 50 µL. A solução B foi preparada da seguinte forma: um volume de solução de DNA contendo 150 ng a 800 ng de DNA foi misturado com um volume de Opti-MEM™ para obter um volume final de 50 µL. Para cada cotransfeção, foram utilizadas diversas quantidades dos plasmídeos. As soluções A e B foram então misturadas por inversão e incubadas à temperatura ambiente durante 20 minutos. 100 µL da solução misturada foram então adicionados a cada poço. A placa incubada foi deixada na incubadora de CO2 por um período de 4 a 6 horas. O meio foi trocado por 1 mL de DMEM (DMEM F12 para células SH-SY5Y) suplementado com 10% de FBS e antibióticos. A placa foi incubada por 72 horas no incubador de CO2 antes da extração do DNA genômico. Os sobrenadantes coletados, foi adicionado um inibidor de protease (PMSF 1 mM, Fluoreto de fenilmetano sulfonil ou fluoreto de fenilmetilsulfonil) e este foi armazenado a -80°C.

[0137] As concentrações dos peptídeos Aβ38, Aβ40 e Aβ42 foram medidas com o kit para ensaio de doenças neurodegenerativas Meso Scale Discovery Inc. (MSD) (usando ambos os anticorpos 6E10 ou o 4G8 para a imunoprecipitação preliminar). Os resultados do experimento (Tabela 3) mostraram que as concentrações dos peptídeos Aβ40 and Aβ42 nos sobrenadantes foram diminuídas para a maioria das células transfectadas com um plasmídeo que codifica o cDNA da APP contendo não apenas uma ou várias mutações FAD mas também a Mutação islandesa (A673T), comparada com células transfectadas com o cDNA de APP do tipo selvagem ou com um cDNA de APP contendo apenas uma ou várias mutações FAD. Assim, a mutação A673T reduz a formação de peptídeos Aβ mesmo na presença de uma mutação FAD e, portanto, deve prevenir ou diminuir a progressão da doença de Alzheimer com a mutação FAD.

EXEMPLO 2: Introdução da mutação A673T via edição de base usando o sistema CRISPR/Cas9

[0138] O segundo experimento teve como objetivo introduzir a mutação islandesa (A673T) no gene APP, utilizando uma citidina desaminase sítioespecífica fundida com uma Cas nickase (Cas9n). O códon de alanina na posição 673 é 5’GCA3’, o códon antisense é, portanto, 5’TGC3’. O nosso objetivo foi modificar a citidina do códon antisense para uma timidina, produzindo assim o códon antisense 5’TGT3’. O códon sense será então 5’ACA3’ que codifica a treonina. Para este experimento, as células 293T ou SH-SY5Y foram cotransfectadas com um plasmídeo que codifica uma Cas9n/Citidina-desaminase e o plasmídeo pBSU6 que codifica para um gRNA direcionado para uma sequência específica do gene APP.

[0139] As citidinas desaminases sítio específicas são enzimas de fusão, que incluem uma nuclease Cas9 mutada (D10A) para gerar uma nicase Cas9 (Cas9n). Esta Cas9n pode ser fundido com várias desaminases (o APOBEC1 ou a citidina desaminase induzida por ativação (Target-AID ou CDA1)) e vários comprimentos de espaçadores (Figura 4). As enzimas híbridas resultantes designadas como BE3, BE4 e Target-AID. Para os nossos experimentos, nós também geramos genes que codificam várias novas desaminases Cas9 híbridas, incluindo não apenas a Cas9 nicase de Streptococcus pyogenes, como também a Cas9 nicase de Staphylococcus aureus e uma variante da SaCas9 nicase denominada KKH SaCas9, que reage com NNNRRT PAMs65 .

[0140] As modificações da nuclease SpCas9 (designadas sob os nomes VQR e EQR) foram anteriormente produzidas para detectar vários PAMs66. A variante VQR robustamente reatora com NGAN PAMs e a variante EQR sendo mais específica para um NGAG PAM. Várias citidinas desaminase Cas9 também foram previamente descritas67,68. Uma variante de SaCas9, denominada SaCas9-KKH, também foi produzida65,69. Assim, produzimos também enzimas híbridas adicionais, incluindo estas variantes SpCas9 e SaCas9. A lista dos desaminases que produzimos e testamos é a seguinte: BE3_SpCas9nVQR, BE3_SpCas9nEQR, BE3_SaCas9nKKH, YE1-BE3, YE1-BE3_SpCas9nVQR, YE1- BE3_SpCas9nEQR, YE1-BE3_SaCas9nKKH, BE4-Gam_SpCas9nVQR, BE4- Gam_SpCas9nEQR, Target-AID SpCas9nVQR, Target-AID SpCas9nEQR, TargetAID SaCas9nKKH, hADAR2, REPAIRv2, ABE6.3, ABE7.8, ABE7.9, ABE7.10. Dois espaçadores de 17 pb e 22 pb de comprimento foram testados para influenciar a janela de conversão. Um ou dois RNAs guia foram inseridos em um plasmídeo pBSU6 modificado.

[0141] 1) A BE3_SpCas9nVQR (SEQ ID NOs: 3 e 4) é uma variante de BE3, a qual contém uma proteína SpCas9n com 3 aminoácidos mutados D1135V/R1335Q/T1337R. Esta enzima SpCas9nVQR foi produzida porKleinstiver et al.66 O gene para estava disponível em Addgene Inc. como Pbk-VQR-BE3 (#85171).

[0142] 2) A BE3_SpCas9nEQR (SEQ ID NOs: 5 e 6) é uma variante de BE3, a qual contém uma proteína SpCas9n com 3 aminoácidos mutados D1135V/R1335Q/T1337R. Esta enzima SpCas9nEQR foi produzida porKleinstiver et al.66 O gene para esta enzima estava disponível na Addgene Inc. como pBKEQR-BE3 (# 85172).

[0143] 3) A BE3_SaCas9nKKH (SEQ ID NOs: 7 e 8) é uma variante de BE3, a qual contém uma proteína SaCas9n (de Staphylococcus aureus) com 3 aminoácidos mutados E782K/N968K/R1015H. Esta enzima SaCas9nKKH foi produzida por Kleinstiver et al.65 O gene para esta enzima estava disponível na Addgene Inc. como pJL-SaKKH-BE3 (#85170).

[0144] 4) A YE1-BE3 (SEQ ID NOs: 9 e 10) é uma variante de BE3, a qual contém 2 aminoácidos mutados (W90Y/R126E) nas sequências rAPOBEC1. O gene para esta enzima estava disponível na Addgene Inc. como as pBK-YE1- BE3 (#85174). Nós usamos este plasmídeo para construir todas as outras variantes contendo a desaminase YE1 rAPOBEC1.

[0145] 5) A YE1-BE3_SpCas9nVQR (SEQ ID NOs: 11 e 12) é uma variante de YE1-BE3 que foi feita em nosso laboratório. A versão rAPOBEC1 em plasmídeo pBK-VQR-BE3 foi substituída pela versão YE1 do plasmídeo YE1- BE3.

[0146] 6) A YE1-BE3_SpCas9nEQR (SEQ ID NOs: 13 e 14) é uma variante de YE1-BE3 que foi feita em nosso laboratório. A versão rAPOBEC1 em plasmídeo pBK-EQR-BE3 foi substituída pela versão YE1 do plasmídeo YE1- BE3.

[0147] 7) A YE1-BE3_SaCas9nKKH (SEQ ID NOs: 15 e 16) é uma variante de BE3_SaCas9nKKH que foi feita em nosso laboratório. A versão rAPOBEC1 em plasmídeo BE3_SaCas9nKKH foi substituída pela versão YE1 do plasmídeo YE1-BE3.

[0148] 8) A BE4-Gam_SpCas9nVQR (SEQ ID NOs: 17 e 18) é uma variante de BE4-Gam disponível em Addgene Inc. # 100806 que foi feita em nosso laboratório por mutagênese PCR dirigida para criar uma mutação VQR no gene SpCas9n.

[0149] 9) A BE4-Gam_SpCas9nEQR (SEQ ID NOs: 19 e 20) é uma variante de BE4-Gam disponível em Addgene Inc # 100806. Esta variante foi feita em nosso laboratório por mutagênese PCR dirigida para criar uma mutação EQR no gene SpCas9n.

[0150] 10) A Target-AID SpCas9nVQR (SEQ ID NOs: 21 e 22) é uma variante da enzima Target-AID descrita por Komor et al.23 Como mostrado na figura 1, a enzima original Target-AID contém o SpCas9n(D10A), um ligante de 105 aminoácidos, CDA1 (isto é, uma citidina desaminase induzida por ativação (AID) que foi modificada por Nishida et al.67), um ligante de 11 aminoácidos e o UGI. O plasmídeo original chamado nCas9-PmCDA1-UGI disponível em Addgene Inc. #76620 foi modificado por mutagênese PCR dirigida para criar a versão VQR do SpCas9n.

[0151] 11) A Target-AID SpCas9nEQR (SEQ ID NOs: 23 e 24) é uma variante da enzima Target-AID descrita por Komor et al.23 A enzima Target-AID contém um SpCas9n(D10A), um ligante de 105 aminoácidos, CDA1 (isto é, uma citidina desaminase induzida por ativação (AID) que foi modificada por Nishida et al.67), e um ligante de 11 aminoácidos UGI. O plasmídeo original, chamado de nCas9- PmCDA1-UGI e gRNA(HPRT)(Target-AID) disponível em Addgene Inc. #76620 foi modificado por mutagênese PCR dirigida para criar a versão EQR da SpCas9n.

[0152] 12) A Target-AID SaCas9nKKH (SEQ ID NOs: 25 e 26) é uma variante do plasmídeo original chamado Target-AID disponível em Addgene Inc. #76620. O foi substituído pelo SaCas9nKKH. Em resumo, o SpCas9n foi removido pelo corte do plasmídeo com duas enzimas de restrição. A SpCas9n do plasmídeo #76620 foi substituída pela SaCas9nKKH.

[0153] 13) A hADAR2 (SEQ ID NOs: 27 e 28) é um membro da adenosine desaminase agindo no RNA (ADR) de uma família de enzimas, as quais mediam a edição endógena de transcritos via desaminação hidrolítica da adenosina para inosina, uma nucleobase que é funcionalmente equivalente a guanosina na tradução e processamento. Existem dois ADR ortólogos funcionais, ADR1 e ADR2, os quais consistem em domínio de fita dupla na região N-terminal ligação de RNA e um domínio C-terminal de desaminação catalítica.

[0154] 14) A REPAIRv2 (SEQ ID NOs: 29 e 30) foi produzida por Cox et al.14 usando um esquema racional de mutagenese para melhorar a especificidade das fusões dCas13b-ADAR2DD para gerar uma enzima 919 vezes mais específica. Addgene plasmid #pC0055).

[0155] 15) Os ABE6.3 (SEQ ID Nos: 31 e 32), ABE7.8 (SEQ ID Nos: 33 e 34), ABE7.9 (SEQ ID Nos: 35 e 36), ABE7.10 (SEQ ID Nos: 37 e 38) são várias enzimas DNA adenosinas desaminases que foram produzidas por Gaudelli et al.21 por mutagenese de um RNA de transferência adenosina desaminase. Os plasmídeos codificantes foram obtidos de AddGene inc. (respectivamente, #102916, #102917, #102918 e #102919).

[0156] Vários SpCas9 RNAs guia VQR/EQR alvejando sequências de 17 a 22 nucleotídeos foram testadas:

• ATTCTGCATCCATCTTCACTTCAGAG
• TTCTGCATCCATCTTCACTTCAGAG
• TCTGCATCCATCTTCACTTCAGAG
• CTGCATCCATCTTCACTTCAGAG
• TGCATCCATCTTCACTTCAGAG
• GCATCCATCTTCACTTCAGAG

[0157] Vários RNAs guia SaCas9 foram testados:

• ATTCTGCATCCATCTTCACTTCAGAGAT
• TTCTGCATCCATCTTCACTTCAGAGAT
• TCTGCATCCATCTTCACTTCAGAGAT
• CTGCATCCATCTTCACTTCAGAGAT
• TGCATCCATCTTCACTTCAGAGAT
• GCATCCATCTTCACTTCAGAGAT

Resultados de Desaminação

[0158] A Figura 5, seção superior, ilustra a sequência de DNA, fitas sense e antisense do éxon 16 de APP tipo selvagem. A seção inferior da figura ilustra a total desaminação (conversão de C para T) das 5 citidinas (C1 a C5) localizadas dentro da janela de conversão da citidina desaminase APOBEC1 e AID. A desaminação da citidina C1 na fita antisense modifica o códon do ácido glutâmico (GAA) na posição 674 para um códon de lisina (AAA). A desaminação da citidina C2 na fita antisense troca o códon alanina (GCA) na posição 673 para um códon de treonina (ACA), induzindo assim a mutação islandesa A673T. A desaminação de C3 na fita antisense muda o códon de ácido aspártico (GAT) na posição 672 para um códon de asparagina (AAT). A desaminação do nucleotídeo C4 muda o códon de metionina (ATG) na posição 671 em um códon de isoleucina (ATA). A desaminação do nucleotídeo C5 é uma mutação silenciosa que não modifica o aminoácido resultante (lisina) na posição 670.

[0159] O objetivo do tratamento proposto para Alzheimer é desaminar o maior percentual de C2 e os menores porcentuais dos outros quatro C para gerar a mutação islandesa A673.

Descrição do Experimento

[0160] 100.000 células 293T ou SH-SY5Y por poço foram plaqueadas em placa de 24 poços. Estas células foram transfectadas com um plasmídeo codificando para uma Cas9-desaminase e um sgRNA. As células foram incubadas a 37°C. As células foram destacadas 72 horas depois, realizando movimentos para cima e para baixo em 1 mL de meio de cultura com uma pipeta. Essas células foram transferidas para um tubo Eppendorf e centrifugadas a 8.000 RPM por 10 minutos. O meio sobrenadante foi cuidadosamente removido sem perturbar o grumo de células. Este grupamento de células foi lavado uma vez com 1 mL de solução de HBSS e centrifugados a 8.000 RPM durante 10 minutos. O HBSS foi então cuidadosamente removido sem perturbar o grupamento de células. As células foram lisadas com 100 µL de tampão de lise contendo Sarkosyl a 1% e EDTA 0,5 M pH8 suplementado com 10 µL de solução de proteinase K (20 mg/mL). Esses tubos foram incubados a 56°C por 15 minutos. 400 µL de Tris 50 mM pH 8 foram então adicionados a cada tubo. Em seguida, adicionou-se 500 µl de uma mistura de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (respectivamente 25:24:1). Os tubos foram centrifugados a 16.000 RPM durante 2 minutos. A fase superior aquosa foi transferida para um novo tubo. 50 µL de NaCl 5 M foram adicionados a cada tubo e misturados completamente. Adicionou-se um (1) mL de etanol gelado a 100% a cada tubo e misturou-se para a precipitação do DNA genômico. Os tubos foram centrifugados a 16.000 RPM durante 7 minutos e o etanol foi cuidadosamente removido para evitar danos aos sedimentos de DNA. Estes sedimentos de DNA foram lavados uma vez com 400 µL de etanol a 70%. Os tubos foram centrifugados a 16.000 RPM durante 5 minutos e o etanol foi removido para permitir secar rapidamente o sedimento de DNA por liofilização. O DNA foi solubilizado em 50-100 µL de água esterilizada e armazenado a -20ºC até que a quantificação fosse realizada. As soluções de DNA foram dosadas a 260 nm em espectrofotômetro.

Amplificação por PCR

[0161] Para a amplificação de PCR foi utilizada a seguinte mistura: DNA genômico (25 ng/µl, 2 µl), tampão 5X HF PhusionTM (10 µL), dNTP 10 mM (1 µL), iniciador direto (100 ng/µL), iniciador reverso ( 100 ng/µL, 1 µL), água (34,75 µL) e enzima PhusionTM (2U/µL, 0,25 µL). A amplificacão por PCR foi a seguinte: desnaturação a 98°C por 30 s, seguido por (98°C - 10 seg, 60°C - 20 seg e 72°C de 45 seg. a 1 min) por 35 ciclos; e 72°C por 5 minutos como ciclo final de elongamento.

Ensaio da nuclease surveyor para confirmação da modificação do genoma

[0162] Após a transfecção, as células SH-SY5Y ou 293T foram incubadas a 37°C durante 72 horas e o DNA genômico foi extraído como descrito acima. A região genômica do éxon 16 do gene APP foi amplificada por PCR com diferentes iniciadores diretos Fb, Fc e diferentes iniciadores inversos Rb, Rc utilizando a PhusionTM DNA Polymerase (New England Biolabs Inc.) como descrito na seção de amplificação genômica por PCR. Após a amplificação por PCR, 20 µL de produtos de PCR não purificados foram aquecidos a 95°C durante 5 minutos e resfriados lentamente (5°C durante 30 segundos) a 25°C utilizando um termociclador. Após a formação de heteroduplexes, 1 µL de enzima surveyor (Transgenomics Inc. Omaha, NE, EUA) e 1 µL do potenciador no tampão Phusion™ HF (NEB Inc.) foram adicionados a cada tubo para obter uma concentração final de 1X. As misturas foram incubadas a 42°C durante 25 a 60 minutos. Foram adicionados 5 µL de tampão carregamento a cada tubo. Todas as análises de Surveyor foram feitas em géis de agarose a 2% contendo solução de coloração de Ácido Nucleico RedSafe™ (Froggabio Inc., Toronto, ON, Canadá) para visualização por UV.

Análise por sequenciamento profundo

[0163] Amostras para o sequenciamento profundo foram preparadas por uma reação de PCR com iniciadores especiais contendo sequências de código de barras (BCS) para permitir o sequenciamento subsequente.
BCS1: ACACTGACGACATGGTTCTACA
BCS2: TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT

[0164] As sequências de DNA foram analisadas com o sequenciador ilumina. Aproximadamente 10.000 leituras foram obtidas por amostra.

Resultados

[0165] Os resultados de sequenciamento profundo permitiram determinar a percentagem de desaminação (isto é, uma citidina trocada por uma timidina) obtida para cada citidina (C1 a C5) presente na janela alvo. Como indicado na figura 6, os melhores percentuais de desaminação foram obtidos com a enzima Cas9-VQR-BE3 com um gRNA visando 20 nucleotídeos. Os melhores percentuais de desaminação foram obtidas quando duas sequências codificando para um gRNA estavam presentes no plasmídeo. No entanto, com esta enzima, o nucleotídeo C1 foi desaminado mais frequentemente do que o nucleotídeo C2.

[0166] A experiência foi assim repetida com várias Cas9-desaminases. O Target-AID-Cas9-VQR permitiu desaminar o maior percentual de citidinas (Figura 7). Com esta enzima, o mesmo perfil de desaminação foi observado nas células 293T e nas células SH-SY5Y. No entanto, um maior porcentual de desaminação foi obtido nas células 293T, porque essas células foram transfectadas de forma mais eficiente. Os percentuais de desaminação de C1 e C2 foram maiores nas células SH-SY5Y e 293T com Target-AID-Cas9VQR desaminase do que com as outras variantes (Figura 7).

[0167] A variante YE1 do APOBEC1 contém 2 mutações W90Y e R126E. Nós também testamos esta variante YE1 fundida com vários SpCas9n. A variante YE1 fundida com a variante SpCas9n foi relatada por criar uma janela de conversão mais estreita70. Contudo, esta variante de citidina desaminase produziu uma percentagem muito baixa de conversão de citidina em timina no éxon 16 do gene APP (Figura 8).

[0168] No geral, a variante EQR de SpCas9 e SaCas9 desaminase produziu taxas de desaminação mais baixas do que a variante VQR de SpCas9 VQR (Figura 9)

[0169] O comprimento do guia (isto é, o número de nucleotídeos aos quais o gRNA se liga) também desempenha um papel importante na eficácia da desaminação e no intervalo de conversão. Assim, nós testamos a ligação de gRNAs a 19, 20, 21 ou 22 nucleotídeos. A melhor desaminação do nucleotídeo C2 foi obtida com o Target-AID Cas9-VQR numa ligação com gRNA com 19 nucleotídeos (Figura 10).

[0170] O experimento foi repetido com Target-AID-Cas9VQR, BE3-Cas9VQR combinado com gRNA visando 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos. O maior percentual de desaminação dos nucleotídeos C1 e C2 foi obtida com o Target-AID-Cas9VQR usado com gRNAs direcionados a 19 ou 20 nucleotídeos (Figura 11). As variantes BE3-Cas9VQR (Figura 11) e BE4-Cas9VQR (Figura 10) mostraram um perfil diferente das variantes do Target-AID. Assim, BE3-Cas9VQR e BE4- Cas9VQR promovem a desaminação C1 e C3, enquanto a Target-AID promove a desaminação C1 e C2.

[0171] Os melhores resultados foram obtidos com a nickase Target-AIDSpCas9nVQR em combinação com o gRNA reagindo com 19 nucleotídeos (Figura 12). De fato, mais de 50% de C1 e C2 foram modificados em timinas.

EXEMPLO 3: Desaminação de APP contendo uma mutação FAD

[0172] A experiência seguinte foi desaminar diretamente plasmídeos codificando para a APP contendo uma mutação responsável pela Doença de Alzheimer Familiar (FAD). Nós selecionamos as 10 mutações FAD para as quais a presença da mutação A673T adicional levou, em experiências preliminares, a uma forte redução da formação dos peptídeos Aβ42. Células SH-SY5Y foram transfectadas com um destes plasmídeos APP contendo uma mutação FAD, com o plasmídeo Target-AID-SpCas9nVQR contendo duas cópias do sgRNA tendo como alvo 19 nucleotídeos. O sobrenadante da cultura celular foi colhido para analisar com Meso Scale Discovery (MSD) a concentração dos peptídeos Aβ40 e Aβ42. O DNA genômico e o DNA plasmidial também foram extraídos para sequenciamento profundo. Os resultados de sequenciamento profundo mostraram uma forte atividade global de desaminação (Figura 13).

[0173] Curiosamente, como observado na figura 14, encontramos diferentes perfis de desaminação com plasmídeos da APP contendo diferentes mutações FAD. De fato, C1 não é tão frequentemente desaminado quanto C2, o que corresponde ao nosso objetivo de produzir a mutação A673T. As dez melhores mutações de FAD mostraram entre 5,3 e 19,4% de desaminação de C2, apesar do fato de que as células transfectadas não foram selecionadas.

[0174] Nós produzimos com infecção por lentivírus diferentes linhagens celulares SH-SY5Y que expressam constitutivamente Target-AID-SpCas9nVQR com um sgRNA direcionado para 17 (veja a figura 8) ou 19 nucleotídeos. Estas células foram subsequentemente transfectadas com plasmídeos da APP que codificam para uma das 10 mutações de FAD ou para as três mutações (a mutação sueca KM670/671NL, a mutação Ártica E693G e a mutação Beyreuther/Ibérica I716F) presentes no NL/G/F Modelo de murinho da doença de Alzheimer desenvolvido por Saito et al.71 Este experimento produziu resultados muito interessantes (Figuras 15, 16 e 17).

[0175] Nós Observamos decréscimos do peptídeo Aβ42 no meio de cultura: 40% com plasmídeos codificadores para APP do tipo selvagem, 43% com um plasmídeo APP codificador das mutações NL/G/F presentes no modelo murino de Alzheimer e 24% com plasmídeo APP contendo a mutação de Londres (V717I), outro modelo murino de Alzheimer para o qual obtivemos recentemente células da empresa Remynd na Bélgica.

EXEMPLO 4: Induzindo a mutação APP A673V

[0176] O códon alanina na posição 673 é GCA, assim foi possível desaminar a citidina numa timidina para produzir o códon GTA para a valina. Nós testamos diferentes enzimas Cas9n-citidina desaminase: BE3_SpCas9n, BE4- Gam_SpCas9n e Target AID_SpCas9n para direcionar um NGG PAM na fita sense. Também testamos as variantes BE3_SpCas9n-VQR, BE4- Gam_SpCas9n-VQR, Target-AID_SpCas9n-VQR visando um NGAN PAM na fita sense

[0177] Transfectamos assim as células SH-SY5Y do neuroblastoma humano com um plasmídeo codificando para cada uma das desaminases listadas acima e para um gRNA dirigido aos 20 nucleotídeos 5’ do seu respectivo PAM. As sequências alvo dos gRNAs são 5'GCAGAATTCCGACATGACTC3' para o NGG PAM (este PAM é indicado na figura 18), 5’ATGGATGCAGAATTCCGACA3' para o NGAN PAM e 5 'TGCAGAATTCCGACATGACT3' para o NNNRRT PAM (ver Tabela 4). O DNA foi extraído 3 dias depois e o éxon 16 do gene APP foi amplificado por PCR. Entre todas as variantes, apenas BE4-Gam_SpCas9n e Target AID_SpCas9n deram resultados positivos com a enzima Surveyor. Os amplicons foram enviados para sequenciamento profundo para obter 10.000 sequências para avaliar o percentual da mutação pretendida. A Tabela 5 apresenta os resultados para o Alvo AID_SpCas9n, que foi a desaminase mais eficiente para modificar o primeiro C na sequência alvo. Tal como indicado nessa tabela, 27,82% da primeira citidina localizada na posição 2 do protoespaçador foi desaminada para uma timidina. As outras citidinas na sequência do protoespaçador não foram desaminadas em comparação com o controle negativo não tratado. Os resultados são ilustrados na figura 19. Assim, a desaminação do primeiro C na sequência do protoespaçador de TargetAID_SpCas9n permite mudar o códon de alanina (GCA) na posição 673 para um códon GTA para valina. Esta mutação A673V é protetora para Alzheimer quando em heterozigose.

EXEMPLO 5: Induzindo a mutação APP H684R

[0178] A mutação H684R requereu a desaminação do A no códon histidina CAT na posição 684 (figura 18) para produzir o códon CGT para a arginina. Isso foi feito usando o editor de base de adenina (ABE)21. Esta enzima de edição de base usou a enzima SpCas9 e, portanto, exigiu um NGG PAM. Havia um tipo PAM a 12 nucleótidos do alvo A (Figura 18). Assim, o alvo A estava na posição 9 na sequência protoespaçadora 5'TGAAGTTCATCATCAAAAAT3', alvo de um gRNA (sublinhado na figura 18).

[0179] Como a eficácia de várias ABEs variou dependendo da posição do alvo A no protoespaçador, foram testadas diferentes variantes ABE produzidas por Gaudelli et al.21 (ABE6.3, ABE7.8, ABE7.9 e ABE7.10). Os plasmídeos que codificam estes diferentes editores base de adenosina foram obtidos de AddGene Inc. respectivamente plasmídeos #102916, 102917, 102918 e 102674.

[0180] Nós testamos também uma adenosina desaminase fundida com a variante KKH de SaCas969, uma vez que havia uma NNNRRT PAM (Figura 18) em 19 nucleotídeos do alvo A. A sequência protoespaçadora visada pelo sgRNA é sublinhada e é: CATCATCAAAAATTGGTACG.

[0181] O experimento foi realizado em SH-SY5Y e o éxon 16 foi amplificado por PCR e sequenciado em profundidade para estabelecer a porcentagem de mutação A para G.

EXEMPLO 6: Indução da mutação APP H684R no mRNA

[0182] Para produzir a mutação desejada H684R, o nucleotídeo A no códon histidina CAT na posição 684 do mRNA teve que ser modificado para G para produzir um códon CGT para a arginina. 100.000 células de neuroblastoma SHSy5y foram plaqueadas, por poço, numa placa de 24 poços. No dia seguinte, estas células foram transfectadas com 400 ng de plasmídeo dPspCas13bADAR2DD (REPAIRv2, Addgene # 103871) e 400 ng de Cas13crRNA codificando para uma guia de 50 nucleotídeos direcionado para o mRNA da APP. Duas versões do RNA guia foram testadas visando diferentes partes do mRNA da APP. Para um dos RNA guia, o alvo A estava na frente da posição 35. Para o outro RNA guia, o alvo A estava na posição 45. No RNA guia, o nucleotídeo na frente do alvo A era um C (em negrito nas sequências) para criar uma incompatibilidade. A sequência que codifica um gRNA no qual a incompatibilidade está na posição 45 é:
5’ GATGACGAACTTCATATCCTGAGTCATGTCGGAATTCTGCATCCATCTTC 3’.

[0183] Enquanto a sequência de codificação para o gRNA em que a incompatibilidade está na posição 35 é:
5’ GACCAATTTTTGATGACGAACTTCATATCCTGAGTCATGTCGGAATTCTGC 3’

[0184] Um controle foi transfectado com 400 ng do plasmídeo dPspCas13bADAR2DD (REPAIRv2) e 400 ng de plasmídeo eGFP em vez do plasmídeo Cas13CrRNA. Um outro controle foi transfectado com 800 ng de plasmídeo eGFP sozinho. 72 horas após a transfecção, o RNA foi extraído com reagente Trizol. Para cada amostra, 1 g de RNA foi transcrito reversamente. O cDNA de cada amostra foi amplificado por PCR utilizando um iniciador específico para o éxon 14 e éxon 17 do cDNA de APP. No final 5’ do iniciador direto e no final 3’ dos iniciadores reversos, sequências necessárias para o sequenciamento profundo Illumina foram adicionados.

[0185] Os resultados do sequenciamento profundo indicaram que o nucleotídeo A no códon CAT da histidina no mRNA foi modificado para um G para produzir um códon CGT para arginina em 1,3% das sequências (Tabela 6). Assim, é possível introduzir pela edição de base do RNA uma mutação H684R, a qual é protetora contra a Doença de Alzheimer.

[0186] O âmbito das reivindicações não deve ser limitado pelas formas de realização preferidas apresentadas nos exemplos, mas deve ser dada a interpretação mais ampla consistente com a descrição como um todo.

Claims

Um MÉTODO PARA DIMINUIR O PROCESSAMENTO DA PROTEÍNA PRECURSORA AMILOIDE (APP) NO PEPTÍDEO Aβ AMILOIDOGÊNICO POR UMA CÉLULA OU A AGREGAÇÃO DO PEPTÍDEO Aβ, caracterizado por compreender o fornecimento da referida célula com:
a. a1) pelo menos um gRNA compreendendo uma região semente de pelo menos 18 nucleotídeos consecutivos de uma sequência alvo numa sequência polinucleotídica codificando a APP endógena presente na referida célula, onde a sequência alvo da sequência do gRNA contígua a um motivo adjacente protoespaçador (PAM) na sequência polinucleotídica do gene APP endógeno em que a referida PAM reconhecida por um complexo ribonucleoproteico compreendendo uma nicase Cas9; ou
a2) um vetor contendo uma sequência de ácido nucléico correspondente a do gRNA para expressar o gRNA; e
b. b1) uma proteína de fusão Cas nicase-desaminase contendo (i) um domínio polipeptídico Cas nicase e (ii) um domínio polipeptídico citidina desaminase ou um domínio polipeptídico adenosina desaminase; ou
b2) um vetor contendo um ácido nucléico codificando a proteína de fusão Cas-nicase desaminase, para a expressão da proteína de fusão Cas-nicase desaminase; e
em que pelo menos uma modificação é introduzida na sequência alvo do polinucleótido codificando a APP, em que a pelo menos uma modificação compreende a desaminação de uma citidina numa timidina ou uma adenosina numa inosina, e em que a pelo menos uma modificação diminui o processamento de APP em peptídeo Aβ amiloidogénico pela célula ou a agregação do peptídeo Aβ; e em que se o nucleotídeo codificando APP é mRNA e a pelo menos uma modificação compreende a desaminação de uma adenosina numa inosina, o gRNA compreende ainda um emparelhamento de citidina com a adenosina a ser desaminada para uma inosina na sequência alvo.
MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido domínio polipeptídico Cas nickase compreender uma SpCas9 nicase, uma SaCas9 nicase, uma CjCas9 nicase. ScCas9 nicase, CasX nicase, CasY nicase, Cpf1 nicase, eSaCas9 nicase, eSpCas9 nicase ou uma HiFi Cas9 nicase.
MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida proteína de fusão Cas nickase-desaminase ser SpCas9n VQR BE3, SpCas9n EQR BE3, SaCas9n-KKH BE3, YE1-SpCas9n VQR BE3, YE1-SpCas9n EQR BE3, YE1-SaCas9n-KKH BE3, SpCas9n VQR BE4, SpCas9n EQR BE4, SaCas9n-KKH BE4, Target-AID SpCas9n VQR, Target-AID SpCas9n EQR, Target-AID SaCas9n-KKH ou Target-AID-BE3.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a sequência de ácido nucleico correspondente ao gRNA e a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão Cas nicasedesaminase estarem compreendidas no mesmo vetor.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por pelo menos uma modificação estar localizada no intron 15, éxon 16, intron 16, éxon 17 e/ou intron 17 da sequência polinucleotidica que codifica a APP.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a referida pelo menos uma modificação resultar em pelo menos uma substituição de aminoácidos na região definida pelos aminoácidos nas posições 656 a 688 na proteína APP, em que as referidas posições de aminoácidos estão em relação à sequência da proteína APP, conforme estabelecido na SEQ ID NO: NG_007376.1 (Fig. 3).
MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a referida pelo menos uma substituição de aminoácido corresponder a pelo menos uma substituição na posição de aminoácido 670, 671, 673, 678, 682, 684, 692, 693, 694, 704, 711, 712, 713, 714, 715 e/ou 684 da proteína APP.
MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por pelo menos uma substituição de aminoácido introduzir uma treonina na posição 673.
MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por pelo menos uma substituição de aminoácido introduzir uma valina na posição 673.
MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por pelo menos uma substituição de aminoácido introduzir uma arginina na posição 684.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado por a referida pelo menos uma modificação no gene ou mRNA da APP resultar em uma modificação de um ou mais aminoácidos reconhecidos por uma secretase α, β ou γ na proteína APP codificada pelo referido gene polinucleotídico APP ou sequência de mRNA presente na referida célula.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado por a referida pelo menos uma modificação corrigir uma mutação associada a um risco aumentado de desenvolvimento da doença de Alzheimer presente na referida sequência polinucleotídica do gene APP endógeno presente na referida célula.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado por a referida pelo menos uma modificação resultar em uma mutação que reduz o risco de desenvolvimento da doença de Alzheimer por meio da redução da formação ou da agregação de peptídeos amiloidogênicos.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por a referida célula ser de um indivíduo tendo pelo menos um membro da família que tenha sido diagnosticado com doença de Alzheimer.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por a referida célula ser de um indivíduo tendo pelo menos uma mutação associada à doença de Alzheimer de início precoce.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por a referida célula ser de um indivíduo que tem uma chance de desenvolver uma forma esporádica da doença de Alzheimer.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado por a sequência de RNA guia (gRNA) conter pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da sequência alvo no gene polinucleotídico endógeno APP ou mRNA.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por o PAM ser AAA, AAG, ACA, ATG, CC, CAA, CCN, GAA, GAT, GGA, GGC, GGT, GTA, GTC, GTT, TCN, NG, NGG, NNG, NAG, NAG, NNAGAA, NNGAAT, NNGAGT, NNGGAT, NNGGGT, NNNAAT NNNAGT, NNNGAT, NNNGCA, NNNGGT, NNNNACA, NNNNACAC, NNNNATAC, NNNNGAAT, NNNNGATT, NNNNGCAC, NNNNGTAC, NNNNGTAT, NNNNGTTT, TGA, TGC, TGT, TTA, TTC, TTT, TTTA ou uma sequência TTTC.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado por o polinucleotídeo que codifica a APP ser um gene polinucleotídico da APP ou um mRNA da APP.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado por a sequência alvo do referido gRNA estar localizada em um éxon ou em um intron do polinucleótido que codifica a APP.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por a sequência alvo estar localizada entre os nucleotídeos 270798 e 294050 do gene APP (ACESSO NG_007376.1).
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado por o referido pelo menos um gRNA conter a seguinte sequência de ácido nucléico:
- - SpCas9 VQR gRNAs para a mutação A673T: AUUCUGCAUCCAUCUUCACUUC;
- - SaCas9 gRNAs para a mutação A673T: AUUCUGCAUCCAUCUUCACUUC;
- - Target AID_SpCas9n gRNA para a mutação A673V: GCAGAAUUCCGACAUGACUC;
- - SpCas9 gRNA para a mutação H684R: UGAAGUUCAUCAUCAAAAAU;
- - SaCas9 KKH gRNA para a mutação H684R: CAUCAUCAAAAAUUGGUACG;
- - SpCas9 para ABE6.3, ABE7.8, ABE7.9 e ABE7.10 para a mutação H684R no DNA: UGAAGUUCAUCAUCAAAAAUGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGC AUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGC;
- - Adenosina desaminase fusionada com SaCas9KKH para a mutação H684R no DNA: CAUCAUCAAAAAUUGGUACGGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUC UACUAAAACAAGGCAAAATGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUG GCGAGA;
- - SpCas13b-ADAR2DD (REPAIRv2) para a mutação H684R no mRNA: GAUGACGAACUUCAUAUCCUGAGUCAUGUCGGAAUUCUGCAUCCA UCUUC;
- - SpCas13b-ADAR2DD (REPAIRv2) para a mutação H684R no mRNA: ACCAAUUUUUGAUGACGAACUUCAUAUCCUGAGUCAUGUCGGAAU UCUGC;
- - ADAR2 gRNA para a mutação H684R: 5’GUGGAAUAGUAUAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUCCCA CUUUUUGAUGACGAACUUC3’ onde a sequência sublinhada é complementar a sequência alvo no mRNA da APP, e o C negrito um desfasamento para o nucleotídeo A a ser alterado num G no mRNA de APP; e
- - REPAIRv2 gRNA para a mutação H684R: 5’ACCAAUUUUUGAUGACGAACUUCAUAUCCUGAGUCAUGUUGUGG AAGGUCCAGUUUUGGGGGCUAUUACAACA3’
em que a sequência sublinhada é complementar da sequência alvo no mRNA da APP e o C negrito um desfasamento para o nucleotídeo A a ser alterado num G no mRNA de APP.
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado por a proteína de fusão Cas nicase-desaminase ainda conter um domínio de transdução de proteína (PTD).
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado por a proteína de fusão Cas nickase-desaminase ainda conter um sinal de localização nuclear (NLS).
MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado por o vetor ser um vetor viral, uma partícula semelhante a vírus (VLP), uma vesícula extracelular ou um exossomo.
MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o referido vetor viral ser um vetor lentiviral, vetor viral, vetor viral adeno-associado, vetor viral de adenovírus ou vetor viral de vírus herpes.
Um gRNA, caracterizado por ser definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 22.
Um ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, caracterizado por compreender uma sequência nucleotídica correspondente ao gRNA da reivindicação 27 para expressar o gRNA.
Um ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, caracterizado por codificar a proteína de fusão Cas nicase-desaminase definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.
Um VETOR, caracterizado por compreender o ácido nucleico isolado da reivindicação 28 e/ou o ácido nucleico isolado da reivindicação 29.
VETOR, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por o vetor ser um vetor viral, uma partícula semelhante a vírus (VLP), uma vesícula extracelular ou um exossomo.
VETOR, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o vetor viral ser um vetor lentiviral, vetor viral adeno-associado, vetor viral de adenovírus ou vetor viral de vírus de herpes.
Um SISTEMA, caracterizado por compreender:
- i) o gRNA da reivindicação 27,
- ii) a proteína de fusão Cas nicase-desaminase definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24,
- iii) o ácido nucleico isolado da reivindicação 28 ou 29,
- iv) um vetor de qualquer uma das reivindicações 30 a 32, ou
- v) qualquer combinação de (i) a (iv).
Uma COMPOSIÇÃO caracterizada por conter um carreador biologicamente aceitável ou um carreador farmaceuticamente aceitável e:
- i) o gRNA da reivindicação 27,
- ii) a proteína de fusão Cas nicase-desaminase definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24,
- iii) o ácido nucleico isolado da reivindicação 28 ou 29,
- iv) o vetor de qualquer uma das reivindicações 30 a 32, ou
- v) qualquer combinação de (i) a (iv).
O gRNA da reivindicação 27, a proteína de fusão Cas nicase-desaminase definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, o ácido nucléico isolado da reivindicação 28 ou 29, o vetor de qualquer uma das reivindicações 30 a 32, o sistema da reivindicação 33, e/ou a composição da reivindicação 34 caracterizado por serem usados para diminuição do processamento da Proteína Precursora Amilóide (APP) em peptídeo Aβ amiloidogenico por uma célula ou a agregado de peptídeos Aβ.
O gRNA da reivindicação 27, a proteína de fusão Cas nicase-desaminase definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, o ácido nucléico isolado da reivindicação 28 ou 29, o vetor de qualquer uma das reivindicações 30 a 32, o sistema de reivindicação 33, e/ou a composição da reivindicação 34 caracterizado por serem usados para a preparação de um medicamento para diminuir o processamento da Proteína Precursora Amiloide (APP) no peptídeo Aβ amiloidogénico por uma célula ou a agregação do peptídeos Aβ.
O gRNA, proteína de fusão Cas nicase-desaminase, ácido nucleico isolado, vetor, sistema e/ou composição para utilização da reivindicação 35 ou 36, caracterizado por a célula ser de um indivíduo tendo pelo menos um membro da família que tenha sido diagnosticado com Doença de Alzheimer.
O gRNA, proteína de fusão Cas nicase-desaminase, ácido nucleico isolado, vetor, sistema e/ou composição para utilização da reivindicação 35 ou 36, caracterizado por a célula ser de um indivíduo tendo pelo menos uma mutação associada com a doença de Alzheimer de início precoce.
O gRNA da reivindicação 27, a proteína de fusão Cas nicase-desaminase definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, o ácido nucléico isolado da reivindicação 28 ou 29, o vetor de qualquer uma das reivindicações 30 a 32, o sistema de reivindicação 33, e/ou a composição da reivindicação 34, caracterizado por serem para o uso no tratamento ou prevenção da doença de Alzheimer ou declínio cognitivo relacionado com a idade num indivíduo disso necessitado.
O gRNA da reivindicação 27, a proteína de fusão Cas nicase-desaminase definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, o ácido nucléico isolado da reivindicação 28 ou 29, o vetor de qualquer uma das reivindicações 30 a 32, o sistema de reivindicação 33, e/ou a composição da reivindicação 34, caracterizado por serem para utilização na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção da doença de Alzheimer ou declínio cognitivo relacionado com a idade num indivíduo disso necessitado.
O gRNA, proteína de fusão Cas nicase-desaminase, ácido nucleico isolado, vector, sistema e / ou composição para utilização da reivindicação 39 ou 40, caracterizado por o indivíduo necessitado do mesmo ser um indivíduo tendo pelo menos um membro da família (por exemplo, mãe, pai, irmão, irmã ou filho), que tenha sido diagnosticado com doença de Alzheimer.
Uso do gRNA da reivindicação 27, da proteína de fusão Cas nicasedesaminase definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, do ácido nucléico isolado da reivindicação 28 ou 29, do vetor de qualquer uma das reivindicações 30 a 32, do sistema de acordo com a reivindicação 33, e/ou da composição da reivindicação 34, caracterizado por ser para diminuir o processamento da Proteína Precursora Amiloide (APP) em peptídeos Aβ amiloidogenicos por uma célula ou agregado de peptídeos Aβ.
Uso do gRNA da reivindicação 27, da proteína de fusão Cas nicasedesaminase definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, do ácido nucléico isolado da reivindicação 28 ou 29, do vetor de qualquer uma das reivindicações 30 a 32, do sistema de acordo com a reivindicação 33, e/ou da composição da reivindicação 34, caracterizado por ser para o preparo de um medicamento para diminuir processamento da Proteína Precursora Amiloide (APP) em peptídeos Aβ amiloidogênicos por uma célula ou agregado de peptídeos Aβ.
Uso do gRNA, da proteína de fusão Cas nicase-desaminase, do ácido nucléico isolado, do vetor, do sistema e ou da composição, de acordo com as reivindicações 42 ou 43, caracterizado por a célula ser de um indivíduo que tenha pelo menos um membro da família que tenha sido diagnosticado com doença de Alzheimer.
Uso do gRNA, da proteína de fusão Cas nicase-desaminase, do ácido nucléico isolado, do vetor, do sistema e ou da composição, de acordo com as reivindicações 42 ou 43, caracterizado por a célula ser de um indivíduo contendo pelo menos uma mutação associada com doença de Alzheimer de início precoce.
Uso do gRNA da reivindicação 27, da proteína de fusão Cas nicasedesaminase definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, do ácido nucleico isolado da reivindicação 28 ou 29, do vetor de qualquer uma das reivindicações 30 a 32, do sistema de acordo com a reivindicação 33, e/ou da composição de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por ser para tratamento ou prevenção da doença de Alzheimer ou declínio cognitivo relacionado com a idade num sujeito que dele necessite
Uso do gRNA, da proteína de fusão Cas nicase-desaminase definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, do ácido nucleico isolado da reivindicação 28 ou 29, do vetor de qualquer uma das reivindicações 30 a 32, do sistema de acordo com a reivindicação 33, e/ou da composição de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento ou prevenção da doença de Alzheimer ou declínio cognitivo relacionado com a idade em um indivíduo que dela necessite.
Uso do gRNA, da proteína de fusão Cas nicase-desaminase, do ácido nucléico isolado, do vetor, do sistema e ou da composição, de acordo com as reivindicações 46 ou 47, caracterizado por o referido indivíduo necessitado disto ser um indivíduo tendo pelo menos um membro da família (isto é, uma mãe, pai, irmão, filha ou filho), o qual tenha sido diagnosticado com doença de Alzheimer.
Uso do gRNA, da proteína de fusão Cas nicase-desaminase, do ácido nucléico isolado, do vetor, do sistema e ou da composição, de acordo com as reivindicações 46 ou 47, caracterizado por o referido indivíduo necessitado disto ser um indivíduo tendo pelo menos uma mutação associada com a doença de Alzheimer de início precoce.
Um MÉTODO de decréscimo do processamento da Proteína Precursora Amilóide (APP) em peptídeos Aβ amiloidogênicos por uma célula ou a agregação de peptídeos Aβ, caracterizado por compreender a introdução em uma célula ou contato de uma célula com o gRNA da reivindicação 27, a proteína de fusão Cas nicase-desaminase definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, um ácido nucleico isolado das reivindicações 28 ou 29, o vetor de uma das reivindicações 30 a 32, o sistema da reivindicação 33, e/ou a composição da reivindicação 34.