CN111378051B - Pe-p2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了PE‑P2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用。所述PE‑P2引导编辑系统包括融合蛋白、pegRNA；所述融合蛋白为依次由Cas9切刻酶或其变体、反转录酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白组成的融合蛋白或依次由筛选标记蛋白、自切割寡肽、Cas9切刻酶或其变体和反转录酶组成的融合蛋白。本发明通过自剪切多肽P2A使得PE‑P1系统中的RT、Cas9n(H840A)和HPT三者融合表达，并将sgRNA骨架替换为了esgRNA骨架，得到PE‑P2引导编辑系统。与PE‑P1引导编辑系统相比，本发明的PE‑P2引导编辑系统不仅可提高编辑靶点的编辑效率，还实现了不可编辑靶点的有效编辑。

Description

PE-P2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及PE-P2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用。

背景技术

CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9 protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。2016年和2017年相继报道的胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器虽可以精确的实现胞嘧啶(Cytosine，C)到胸腺嘧啶(Thymine，T)以及腺嘌呤(Adenine，A)到鸟嘌呤(Guanine，G)的转换，且不产生DSB也不引入DNA模板，但无法实现嘌呤和嘧啶之间的颠换，即无法实现A到T的替换、T到A的替换、C到G的替换、G到C的替换、A到C的替换、T到G的替换、C到A的替换、G到T的替换。同时，碱基编辑器只能编辑活性窗口内的C或T，而且当活性窗口内存在多个C或多个T时，容易产生靶标C或T与非靶标C或T共编辑而不能最终得到预期编辑产物。所有这些弊端大大限制了碱基编辑器的实际应用。

2019年，David Liu实验室报道了一种新的基因组编辑技术，即引导编辑技术(Prime editing)，开发了三种引导编辑器(Prime editor，PE)，分别是PE1、PE2和PE3。所有这三种PE均为反转录酶(reverse transcriptase，RT)与Cas9 H840A切口酶(Cas9n(H840A))融合在一起，使用引导编辑技术向导RNA(prime editing guide RNA，pegRNA)实现基因组编辑。pegRNA除了包含通常的向导RNA(sgRNA)外，还包含一段含有目标碱基突变的RT模板以及引物结合位点(primer binding site，PBS)。实验表明该技术可在动物细胞基因组中实现所有12种碱基替换类型的编辑，打破了传统碱基编辑器的限制，大大提高了碱基编辑范围。

目前，虽然引导编辑技术可以实现所有类型的碱基替换，但仍然存在碱基编辑效率不高，或是部分位点不能被编辑的问题。

发明内容

第一方面，本发明保护一种成套系统。

本发明保护的成套系统包括融合蛋白或与所述融合蛋白相关的生物材料、pegRNA或与所述pegRNA相关的生物材料；

所述融合蛋白为依次由Cas9切刻酶或其变体、反转录酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白组成的融合蛋白或依次由筛选标记蛋白、自切割寡肽、Cas9切刻酶或其变体和反转录酶组成的融合蛋白。

上述成套系统中，所述Cas9切刻酶可为Cas9n(H840A)；

所述Cas9切刻酶变体包括来源于细菌的Cas9(如SaCas9、SaCas9-KKH等)，识别不同PAM的Cas9变体(如xCas9、Cas9-NG、Cas9-VQR、Cas9-VRER等)，Cas9高保真酶变体(如HypaCas9、eSpCas9(1.1)、Cas9-HF1等)等。

进一步的，所述Cas9切刻酶为Cas9n(H840A)；所述Cas9n(H840A)为A1)或A2)：

A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

更进一步的，所述Cas9n(H840A)的编码基因为a1)或a2)或a3)：

a1)序列1第3013-7113位所示的cDNA分子或DNA分子；

a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Cas9n(H840A)的cDNA分子或DNA分子；

a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Cas9n(H840A)的cDNA分子或DNA分子。

上述方法中，所述反转录酶可为来源于病毒中的反转录酶，如来源于莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，M-MLV)的反转录酶、来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)的反转录酶等，也可为来源于细菌中的病毒，如来源于大肠杆菌中的反转录酶等。

进一步的，所述反转录酶为来源于莫洛尼小鼠白血病病毒的反转录酶(M-MLVRT)；所述M-MLV RT为B1)或B2)：

B1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

B2)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

更进一步的，所述M-MLV RT的编码基因为b1)或b2)或b3)：

b1)序列1第7213-9243位所示的cDNA分子或DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述M-MLV RT的cDNA分子或DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述M-MLV RT的cDNA分子或DNA分子。

上述方法中，所述自切割寡肽可为来源于病毒基因组的2A自切割寡肽，如口蹄疫病毒(FMDV)(F2A)肽、马A型鼻炎病毒(ERAV)(E2A)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thoseaasigna virus)(T2A)肽、猪捷申病毒-1(PTV-1)(P2A)肽、泰勒病毒2A肽以及脑心肌炎病毒2A肽。

进一步的，所述自切割寡肽为来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽(P2A)；所述P2A的氨基酸序列为C1)或C2)：

C1)氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；

C2)将序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

更进一步的，所述P2A的编码基因为c1)或c2)或c3)：

c1)序列5第8674-8730位所示的cDNA分子或DNA分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述P2A的cDNA分子或DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述P2A的cDNA分子或DNA分子。

上述成套系统中，所述筛选剂抗性蛋白为潮霉素磷酸转移酶；

进一步的，所述潮霉素磷酸转移酶为D1)或D2)：

D1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；

D2)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

更进一步的，所述潮霉素磷酸转移酶的编码基因为d1)或d2)或d3)：

d1)序列1第11665-12690位所示的cDNA分子或DNA分子；

d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述潮霉素磷酸转移酶的cDNA分子或DNA分子；

d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述潮霉素磷酸转移酶的cDNA分子或DNA分子。

上述成套系统中，所述pegRNA依次由靶点序列(记作靶点序列甲)、sgRNA骨架或esgRNA骨架、RT序列和PBS序列组成。

所述RT序列为靶点序列3’端3个碱基及其后连续的一段基因组序列的反向互补序列，且在其中引入目标突变，作为反转录酶的反转录模板，反转录出cDNA，然后作为修复模板，对基因组DNA进行修复。所述RT序列大小进一步可为8-34bp。

所述PBS序列(引物结合位点序列)为5’端第n个碱基到第17个碱基靶点序列的反向互补序列(1≤n<17)。

所述RT序列和所述PBS序列的设计方法或原理可参照现有技术中已报道的有关于引导编辑技术(Prime editing，PE)中与pegRNA的RT序列和PBS序列相关的设计方法或原理。

所述sgRNA骨架为E1)或E2)或E3)：

E1)将序列1第570-645位中的T替换为U得到的RNA分子；

E2)将E1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

E3)与E1)或E2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；

所述esgRNA骨架为F1)或F2)或F3)：

F1)将序列5第10512-10597位中的T替换为U得到的RNA分子；

F2)将F1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

F3)与F1)或F2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。

上述成套系统还可包括如下G1)或G2)：

G1)sgRNA或与所述sgRNA相关的生物材料；

G2)esgRNA或与所述esgRNA相关的生物材料。

所述G1)中，所述sgRNA依次由靶点序列(记作靶点序列乙)和上述sgRNA骨架组成。该sgRNA用于产生非编辑链切口，非编辑链切口位点可以随意选择。所述靶点序列甲与所述靶点序列乙分别位于目标DNA的两条链上，二者可以互补重合或部分互补重合，也可以有一定距离。

所述G2)中，所述esgRNA依次由靶点序列(记作靶点序列丙)和上述esgRNA骨架组成。该esgRNA用于产生非编辑链切口，非编辑链切口位点可以随意选择。所述靶点序列甲与所述靶点序列丙分别位于目标DNA的两条链上，二者可以互补重合或部分互补重合，也可以有一定距离。

上述成套系统的用途具体如下：

S1)生物体或生物细胞基因组序列的编辑；

S2)制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；

S3)提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率；

S4)制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品。

第二方面，本发明保护上述成套系统或上述成套系统中的融合蛋白在S1)-S4)任一种中的应用：

S1)生物体或生物细胞基因组序列的编辑；

S2)制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；

S3)提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率；

S4)制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品。

第三方面，本发明保护如下T1)-T4)所述的方法：

T1)基因组序列的编辑方法或提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白和上述pegRNA；所述pegRNA靶向靶点序列甲，用于实现对基因组序列的编辑；

T2)基因组序列的编辑方法或提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白、上述pegRNA和上述sgRNA；所述pegRNA靶向靶点序列甲，用于实现对基因组序列的编辑；所述sgRNA靶向靶点序列乙，用于在非编辑链上产生切口，以提高目标突变的编辑效率。

T3)基因组序列的编辑方法或提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白、上述pegRNA和上述esgRNA；所述pegRNA靶向靶点序列甲，用于实现对基因组序列的编辑；所述esgRNA靶向靶点序列丙，用于在非编辑链上产生切口，以提高目标突变的编辑效率。

T4)生物突变体的制备方法，包括如下步骤：按照T1)-T3)所述的方法对生物体的基因组进行编辑，获得生物突变体。

上述方法中，所述T1)中，所述使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白和上述pegRNA的方法为将上述融合蛋白的编码基因和转录上述pegRNA的DNA分子导入目的植物中。

所述T2)中，所述使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白、上述pegRNA和上述sgRNA的方法为将上述融合蛋白的编码基因、转录上述pegRNA的DNA分子和转录上述sgRNA的DNA分子导入目的植物中。

所述T3)中，所述使生物体或生物细胞表达上述融合蛋白、上述pegRNA和上述esgRNA的方法为将上述融合蛋白的编码基因、转录上述pegRNA的DNA分子和转录上述esgRNA的DNA分子导入目的植物中。

进一步的，所述T3)中，所述融合蛋白的编码基因、所述转录上述pegRNA的DNA分子和所述转录上述esgRNA的DNA分子通过重组表达载体导入目的植物中。所述融合蛋白的编码基因、所述转录上述pegRNA的DNA分子和所述转录上述esgRNA的DNA分子可通过同一个重组表达载体导入目的植物中，也可通过两个或者多个重组表达载体共同导入目的植物中。

在本发明的具体实施例中，所述融合蛋白的编码基因、所述转录上述pegRNA的DNA分子和所述转录上述esgRNA的DNA分子通过同一个重组表达载体导入目的植物中。所述重组表达载体包括依次由启动子、Cas9n(H840A)的编码基因、反转录酶M-MLV RT的编码基因、自切割寡肽P2A的编码基因、筛选剂抗性蛋白HPT的编码基因和终止子组成的表达盒，依次由启动子、所述转录esgRNA的DNA分子和poly T组成的表达盒和依次由启动子、所述转录pegRNA的DNA分子和poly T组成的表达盒。

更进一步的，所述重组表达载体为PE-P2-1载体、PE-P2-2载体、PE-P2-3载体、PE-P2-4载体或PE-P2-5载体。所述PE-P2-1重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-01，所述PE-P2-2重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-02，所述PE-P2-3重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-03，所述PE-P2-4重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-04，所述PE-P2-5重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-05。

所述PE-P2-1重组表达载体的核苷酸序列为序列表中的序列5。所述PE-P2-1重组表达载体中pegRNA-01所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列具体见表1。

所述PE-P2-2重组表达载体的核苷酸序列为将所述PE-P2-1重组表达载体序列中pegRNA-01所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-02所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。所述PE-P2-2重组表达载体中pegRNA-02所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT序列与PBS序列具体见表1。

所述PE-P2-3重组表达载体的核苷酸序列为将所述PE-P2-1重组表达载体序列中pegRNA-01所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-03所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。所述PE-P2-3重组表达载体中pegRNA-03所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT序列与PBS序列具体见表1。

PE-P2-4重组表达载体的核苷酸序列为将所述PE-P2-1重组表达载体序列中pegRNA-01所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-04所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。所述PE-P2-4重组表达载体中pegRNA-04所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT序列与PBS序列具体见表1。

PE-P2-5重组表达载体的核苷酸序列为将所述PE-P2-1重组表达载体序列中pegRNA-01所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-05所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。所述PE-P2-5重组表达载体中pegRNA-05所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT序列与PBS序列具体见表1。

上述任一所述成套系统或应用或方法中，所述基因组序列的编辑包括所述基因组序列的碱基替换(如单碱基替换和多碱基替换)、碱基插入(如单碱基插入和多碱基插入)和碱基删除(如单碱基删除和多碱基删除)。在本发明的具体实施例中，所述基因组序列的编辑为基因组序列的碱基替换。

上述任一所述成套系统或应用或方法中，所述生物体为X1)或X2)或X3)或X4)：X1)植物或动物；X2)单子叶植物或双子叶植物；X3)禾本科植物；X4)水稻。所述生物细胞为Y1)或Y2)或Y3)或Y4)：Y1)植物细胞或动物细胞；Y2)单子叶植物细胞或双子叶植物细胞；Y3)禾本科植物细胞；Y4)水稻细胞。

本发明通过自剪切多肽(a self-cleavage 2A peptide)P2A使得PE系统中的RT和Cas9n(H840A)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)三者融合表达，且将sgRNA替换为esgRNA，提供了PE-P2引导编辑系统。与PE-P1引导编辑系统相比，本发明的PE-P2引导编辑系统不仅可提高编辑靶点的编辑效率，还实现了不可编辑靶点的编辑。

附图说明

图1为两种引导编辑系统PE-P1和PE-P2的表达载体的结构示意图。

图2为pegRNA向导的Cas9n(H840A)切割位点示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

引物对OsALS-1由引物OsALS-1-F：5’-gcgcccgattctctatgtc-3’和引物OsALS-1-R：5’-tcctgccatcaccatccag-3’组成，用于扩增靶点OsALS-1。

引物对OsALS-2由引物OsALS-2-F：5’-gtcatcaccaaccacctcttcc-3’和引物OsALS-2-R：5’-gacatagagaatcgggcgc-3’组成，用于扩增靶点OsALS-2。

引物对OsACC由引物OsACC-F：5’-gtgctggacaagtgtggtttc-3’和引物OsACC-R：5’-gatcgtgattcttcccagtcc-3’组成，用于扩增靶点OsACC。

引物对OsDEP1由引物OsDEP1-F：5’-cgtgctctaccaattgctgta-3’和引物OsDEP1-R：5’-atatcttcacggtctattggcg-3’组成，用于扩增靶点OsDEP1。

以下实施例中，

引导编辑器碱基替换效率＝发生目标突变的阳性T0苗数/分析的总阳性T0苗数×100％。

日本晴水稻：参考文献：梁卫红,王高华,杜京尧,等.硝普钠及其光解产物对日本晴水稻幼苗生长和5种激素标记基因表达的影响[J].河南师范大学学报(自然版),2017(2):48-52.；公众可以从北京市农林科学院获得。

恢复培养基：含有200mg/L特美汀的N6固体培养基。

筛选培养基：含有50mg/L潮霉素的N6固体培养基。

分化培养基：含有2mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。

生根培养基：含有0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。

实施例1、PE-P2引导编辑系统的表达载体的构建及其在提高碱基编辑效率中的应用

一、两种引导编辑系统PE-P1和PE-P2的表达载体的设计与构建

1、两种引导编辑系统PE-P1和PE-P2的表达载体的设计

两种引导编辑系统PE-P1和PE-P2的表达载体的结构示意图如图1所示。

引导编辑系统PE-P1的表达载体包括pegRNA表达盒、sgRNA表达盒、由Cas9n(H840A)和M-MLV RT组成的融合蛋白的表达盒和筛选剂抗性蛋白表达盒。

引导编辑系统PE-P2包括pegRNA表达盒、esgRNA表达盒、由Cas9n(H840A)、M-MLVRT、自剪切多肽P2A和筛选剂抗性蛋白组成的融合蛋白的表达盒。

2、两种引导编辑系统PE-P1和PE-P2的表达载体的构建

人工合成如下重组载体，各载体均为环状质粒：

引导编辑系统PE-P1的重组表达载体共计5个，分别是PE-P1-1载体，PE-P1-2载体，PE-P1-3载体，PE-P1-4载体和PE-P1-5载体。

引导编辑系统PE-P2的重组表达载体共计5个，分别是PE-P2-1载体，PE-P2-2载体，PE-P2-3载体，PE-P2-4载体和PE-P2-5载体。

将PE-P1-1重组表达载体和PE-P2-1重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-01，将PE-P1-2重组表达载体和PE-P2-2重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-02，将PE-P1-3重组表达载体和PE-P2-3重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-03，将PE-P1-4重组表达载体和PE-P2-4重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-04，将PE-P1-5重组表达载体和PE-P2-5重组表达载体中的pegRNA记作pegRNA-05。

PE-P1-1重组表达载体的序列为序列表中的序列1。其中，序列1的第84-549位为OsU6a启动子的核苷酸序列，第550-569位为产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列，第570-645位为产生非编辑链切口的sgRNA骨架序列，第646-654位为Poly T；序列1的第655-1035位为OsU3启动子的核苷酸序列，第1036-1055位为pegRNA-01靶点序列，第1056-1131位为pegRNA-01所对应的sgRNA骨架序列，第1132-1158位为pegRNA-01上的RT序列与PBS序列，第1159-1166位为Poly T；序列1的第1173-2886位为OsUbq3启动子的核苷酸序列，第3013-7113位为Cas9n(H840A)蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列2所示的Cas9n(H840A)蛋白质；序列1的第7213-9243位为M-MLV RT蛋白质的编码序列，编码序列3所示的M-MLV RT蛋白质；序列1的第9397-9591位为35S终止子序列；序列1的第9666-11658位为ZmUbi1启动子的核苷酸序列，第11665-12690位为潮霉素磷酸转移酶的编码序列，编码序列4所示的潮霉素磷酸转移酶蛋白质；序列1的第12717-12932位为CaMV35S polyA的核苷酸序列。PE-P1-1重组表达载体中产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列具体见表1。

PE-P1-2重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P1-1重组表达载体序列中产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-02所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P1-2重组表达载体中pegRNA-02所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT序列与PBS序列具体见表1。

PE-P1-3重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P1-1重组表达载体序列中产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-03所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P1-3重组表达载体中pegRNA-03所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT序列与PBS序列具体见表1。

PE-P1-4重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P1-1重组表达载体序列中产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-04所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P1-4重组表达载体中pegRNA-04所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT序列与PBS序列具体见表1。

PE-P1-5重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P1-1重组表达载体序列中产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-05所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P1-5重组表达载体中pegRNA-05所对应的产生非编辑链切口的sgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT序列与PBS序列具体见表1。

PE-P2-1重组表达载体的核苷酸序列为序列表中的序列5。其中，序列5的第102-2073位为ZmUbi1启动子的核苷酸序列，第2293-6393为Cas9n(H840A)蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列2所示的Cas9n(H840A)蛋白质；序列5的第6493-8523位为M-MLVRT蛋白质的编码序列，编码序列3所示的M-MLV RT蛋白质；序列5的第8674-8730位为P2A的编码序列，编码序列6所示的蛋白质；序列5的第8731-9756位为潮霉素磷酸转移酶的编码序列，编码序列4所示的潮霉素磷酸转移酶蛋白质；序列5的第9763-10017位为Nos终止子序列；序列5的第10026-10491位为OsU6a启动子的核苷酸序列，第10492-10511位为产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列，第10512-10597位为产生非编辑链切口的esgRNA骨架序列，第10598-10604位为Poly T；序列5的第10605-10985位为OsU3启动子的核苷酸序列，第10986-11005位为pegRNA-01靶点序列，第11006-11091位为pegRNA-01所对应的esgRNA骨架序列，第11092-11118位为pegRNA-01上的RT序列与PBS序列，第11119-11126位为Poly T。PE-P2-1重组表达载体中产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列具体见表1。

PE-P2-2重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-02所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P2-2重组表达载体中pegRNA-02所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-02靶点序列和pegRNA-02上的RT序列与PBS序列具体见表1。

PE-P2-3重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-03所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P2-3重组表达载体中的pegRNA-03所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-03靶点序列和pegRNA-03上的RT序列与PBS序列具体见表1。

PE-P2-4重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-04所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P2-4重组表达载体中的pegRNA-04所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-04靶点序列和pegRNA-04上的RT序列与PBS序列具体见表1。

PE-P2-5重组表达载体的核苷酸序列为将PE-P2-1重组表达载体序列中pegRNA-01所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-01靶点序列和pegRNA-01上的RT序列与PBS序列分别替换为pegRNA-05所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT序列与PBS序列，且保持其他序列不变后得到的序列。PE-P2-5重组表达载体中的pegRNA-05所对应的产生非编辑链切口的esgRNA靶点序列、pegRNA-05靶点序列和pegRNA-05上的RT序列与PBS序列具体见表1。

各载体的pegRNA上的靶点序列和RT序列与PBS序列，以及用于产生非编辑链切口的sgRNA或esgRNA靶点序列如表1所示。

表1、编辑靶点的详细信息

二、水稻阳性T0苗的获得

将步骤一获得的PE-P1-1载体，PE-P1-2载体，PE-P1-3载体，PE-P1-4载体，PE-P1-5载体，PE-P2-1载体，PE-P2-2载体，PE-P2-3载体，PE-P2-4载体和PE-P2-5载体分别按照如下步骤1-8进行操作：

1、将载体导入农杆菌EHA105(上海唯地生物技术有限公司的产品，CAT#:AC1010)，得到重组农杆菌。

2、采用培养基(含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的YEP培养基)培养重组农杆菌，28℃，150rpm震荡培养至OD₆₀₀为1.0-2.0，室温条件下，10000rpm离心1min，用侵染液(将N6液体培养基中的糖替换为葡萄糖和蔗糖，葡萄糖和蔗糖在侵染液中的浓度分别为10g/L和20g/L)重悬菌体并稀释至OD₆₀₀为0.2，得到农杆菌侵染液。

3、水稻品种日本晴成熟种子去壳脱粒，置于100mL三角瓶中，加入70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(v/v)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于N6固体培养基上，28℃暗培养4-6周，得到水稻愈伤。

4、完成步骤3后，将水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液甲(农杆菌侵染液甲为向农杆菌侵染液中加入乙酰丁香酮得到的液体，乙酰丁香酮的添加量满足乙酰丁香酮与农杆菌侵染液的体积比为25μl：50ml)中浸泡10min，然后，放在铺有两层灭菌滤纸的培养皿(内含约200ml不含农杆菌的侵染液)上，21℃暗培养1天。

5、取步骤4得到的水稻愈伤放入恢复培养基上，25-28℃暗培养3天。

6、取步骤5得到的水稻愈伤，置于筛选培养基上，28℃暗培养2周。

7、取步骤6得到的水稻愈伤，再次置于筛选培养基上，28℃暗培养2周，得到水稻抗性愈伤。

8、取步骤7得到的水稻抗性愈伤放入分化培养基上，25℃光照培养1个月左右，将分化出来的小苗移至生根培养基上，25℃光照培养2周，获取水稻T0苗。

三、结果分析

1、每载体分别取步骤二所获得的水稻T0苗的基因组DNA作为模板，对于OsALS-1靶点，采用引物对OsALS-1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于OsALS-2靶点，采用引物对OsALS-2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于OsACC靶点，采用引物对OsACC进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于OsDEP1靶点，采用引物对OsDEP1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2、将步骤1得到的PCR扩增产物进行Sanger测序及分析。测序结果只针对各pegRNA区进行分析。分别统计各靶点发生目标碱基替换的T0苗数，计算得出引导编辑器碱基替换效率，结果见表2。

结果表明，对所有四个靶点，五种pegRNA设计，引导编辑系统PE-P2的碱基替换效率均较PE-P1高。增效最高高达21.7倍(OsALS-1靶点，pegRNA-04设计)。而且引导编辑系统PE-P1不能对靶点OsACC和OsDEP1进行目标突变的碱基编辑，而引导编辑系统PE-P2能够实现对二者的编辑，且对OsDEP1靶点的编辑效率高达9.1％。相对于引导编辑系统PE-P1，引导编辑系统PE-P2不仅提高了碱基编辑效率，而且对部分不能编辑的靶点实现了有效编辑。

表2、不同类型引导编辑器对水稻内源靶点的编辑效率汇总

注：紧邻pegRNA向导的Cas9n(H840A)产生的切口位点处的靶点序列的第18位碱基记为+1，下游按照顺序依次计数(图2)。sgRNA切口位置，表示在互补链选择的靶点产生的切口的位置，计数方式同上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> PE-P2引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19449

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg 60

cggacgtttt taatgtaggt acctggaatc ggcagcaaag gattttttcc tgtagttttc 120

ccacaaccat tttttaccat ccgaatgata ggataggaaa aatatccaag tgaacagtat 180

tcctataaaa ttcccgtaaa aagcctgcaa tccgaatgag ccctgaagtc tgaactagcc 240

ggtcacctgt acaggctatc gagatgccat acaagagacg gtagtaggaa ctaggaagac 300

gatggttgat tcgtcaggcg aaatcgtcgt cctgcagtcg catctatggg cctggacgga 360

ataggggaaa aagttggccg gataggaggg aaaggcccag gtgcttacgt gcgaggtagg 420

cctgggctct cagcacttcg attcgttggc accggggtag gatgcaatag agagcaacgt 480

ttagtaccac ctcgcttagc tagagcaaac tggactgcct tatatgcgcg ggtgctggct 540

tggctgccga tatctcgctc tcacattccg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 600

aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttttaggaat 660

ctttaaacat acgaacagat cacttaaagt tcttctgaag caacttaaag ttatcaggca 720

tgcatggatc ttggaggaat cagatgtgca gtcagggacc atagcacaag acaggcgtct 780

tctactggtg ctaccagcaa atgctggaag ccgggaacac tgggtacgtt ggaaaccacg 840

tgtgatgtga aggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg ggccatgaag 900

cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac gacaacaaag 960

actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa aagagttgtg 1020

cagatgatcc gtggcgggta tggtggtgca atggggtttt agagctagaa atagcaagtt 1080

aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg caaacctatc 1140

ctccaattgc accaccattt ttttttaagc ttacaaattc gggtcaaggc ggaagccagc 1200

gcgccacccc acgtcagcaa atacggaggc gcggggttga cggcgtcacc cggtcctaac 1260

ggcgaccaac aaaccagcca gaagaaatta cagtaaaaaa aaagtaaatt gcactttgat 1320

ccacctttta ttacctaagt ctcaatttgg atcaccctta aacctatctt ttcaatttgg 1380

gccgggttgt ggtttggact accatgaaca acttttcgtc atgtctaact tccctttcag 1440

caaacatatg aaccatatat agaggagatc ggccgtatac tagagctgat gtgtttaagg 1500

tcgttgattg cacgagaaaa aaaaatccaa atcgcaacaa tagcaaattt atctggttca 1560

aagtgaaaag atatgtttaa aggtagtcca aagtaaaact tatagataat aaaatgtggt 1620

ccaaagcgta attcactcaa aaaaaatcaa cgagacgtgt accaaacgga gacaaacggc 1680

atcttctcga aatttcccaa ccgctcgctc gcccgcctcg tcttcccgga aaccgcggtg 1740

gtttcagcgt ggcggattct ccaagcagac ggagacgtca cggcacggga ctcctcccac 1800

cacccaaccg ccataaatac cagccccctc atctcctctc ctcgcatcag ctccaccccc 1860

gaaaaatttc tccccaatct cgcgaggctc tcgtcgtcga atcgaatcct ctcgcgtcct 1920

caaggtacgc tgcttctcct ctcctcgctt cgtttcgatt cgatttcgga cgggtgaggt 1980

tgttttgttg ctagatccga ttggtggtta gggttgtcga tgtgattatc gtgagatgtt 2040

taggggttgt agatctgatg gttgtgattt gggcacggtt ggttcgatag gtggaatcgt 2100

ggttaggttt tgggattgga tgttggttct gatgattggg gggaattttt acggttagat 2160

gaattgttgg atgattcgat tggggaaatc ggtgtagatc tgttggggaa ttgtggaact 2220

agtcatgcct gagtgattgg tgcgatttgt agcgtgttcc atcttgtagg ccttgttgcg 2280

agcatgttca gatctactgt tccgctcttg attgagttat tggtgccatg ggttggtgca 2340

aacacaggct ttaatatgtt atatctgttt tgtgtttgat gtagatctgt agggtagttc 2400

ttcttagaca tggttcaatt atgtagcttg tgcgtttcga tttgatttca tatgttcaca 2460

gattagataa tgatgaactc ttttaattaa ttgtcaatgg taaataggaa gtcttgtcgc 2520

tatatctgtc ataatgatct catgttacta tctgccagta atttatgcta agaactatat 2580

tagaatatca tgttacaatc tgtagtaata tcatgttaca atctgtagtt catctatata 2640

atctattgtg gtaatttctt tttactatct gtgtgaagat tattgccact agttcattct 2700

acttatttct gaagttcagg atacgtgtgc tgttactacc tatctgaata catgtgtgat 2760

gtgcctgtta ctatcttttt gaatacatgt atgttctgtt ggaatatgtt tgctgtttga 2820

tccgttgttg tgtccttaat cttgtgctag ttcttaccct atctgtttgg tgattatttc 2880

ttgcagtacg taatggacta caaggaccac gacggcgact acaaggatca tgacatcgac 2940

tacaaggacg acgacgacaa gatggctcct aagaagaagc ggaaggttgg tattcacggg 3000

gtgcctgcgg ctgacaagaa gtactccatc ggcctcgaca tcggcaccaa cagcgtcggc 3060

tgggcggtga tcaccgacga gtacaaggtc ccgtccaaga agttcaaggt cctgggcaac 3120

accgaccgcc actccatcaa gaagaacctc atcggcgccc tcctcttcga ctccggcgag 3180

acggcggagg cgacccgcct caagcgcacc gcccgccgcc gctacacccg ccgcaagaac 3240

cgcatctgct acctccagga gatcttctcc aacgagatgg cgaaggtcga cgactccttc 3300

ttccaccgcc tcgaggagtc cttcctcgtg gaggaggaca agaagcacga gcgccacccc 3360

atcttcggca acatcgtcga cgaggtcgcc taccacgaga agtaccccac tatctaccac 3420

cttcgtaaga agcttgttga ctctactgat aaggctgatc ttcgtctcat ctaccttgct 3480

ctcgctcaca tgatcaagtt ccgtggtcac ttccttatcg agggtgacct taaccctgat 3540

aactccgacg tggacaagct cttcatccag ctcgtccaga cctacaacca gctcttcgag 3600

gagaacccta tcaacgcttc cggtgtcgac gctaaggcga tcctttccgc taggctctcc 3660

aagtccaggc gtctcgagaa cctcatcgcc cagctccctg gtgagaagaa gaacggtctt 3720

ttcggtaacc tcatcgctct ctccctcggt ctgaccccta acttcaagtc caacttcgac 3780

ctcgctgagg acgctaagct tcagctctcc aaggatacct acgacgatga tctcgacaac 3840

ctcctcgctc agattggaga tcagtacgct gatctcttcc ttgctgctaa gaacctctcc 3900

gatgctatcc tcctttcgga tatccttagg gttaacactg agatcactaa ggctcctctt 3960

tctgcttcca tgatcaagcg ctacgacgag caccaccagg acctcaccct cctcaaggct 4020

cttgttcgtc agcagctccc cgagaagtac aaggagatct tcttcgacca gtccaagaac 4080

ggctacgccg gttacattga cggtggagct agccaggagg agttctacaa gttcatcaag 4140

ccaatccttg agaagatgga tggtactgag gagcttctcg ttaagcttaa ccgtgaggac 4200

ctccttagga agcagaggac tttcgataac ggctctatcc ctcaccagat ccaccttggt 4260

gagcttcacg ccatccttcg taggcaggag gacttctacc ctttcctcaa ggacaaccgt 4320

gagaagatcg agaagatcct tactttccgt attccttact acgttggtcc tcttgctcgt 4380

ggtaactccc gtttcgcttg gatgactagg aagtccgagg agactatcac cccttggaac 4440

ttcgaggagg ttgttgacaa gggtgcttcc gcccagtcct tcatcgagcg catgaccaac 4500

ttcgacaaga acctccccaa cgagaaggtc ctccccaagc actccctcct ctacgagtac 4560

ttcacggtct acaacgagct caccaaggtc aagtacgtca ccgagggtat gcgcaagcct 4620

gccttcctct ccggcgagca gaagaaggct atcgttgacc tcctcttcaa gaccaaccgc 4680

aaggtcaccg tcaagcagct caaggaggac tacttcaaga agatcgagtg cttcgactcc 4740

gtcgagatca gcggcgttga ggaccgtttc aacgcttctc tcggtaccta ccacgatctc 4800

ctcaagatca tcaaggacaa ggacttcctc gacaacgagg agaacgagga catcctcgag 4860

gacatcgtcc tcactcttac tctcttcgag gatagggaga tgatcgagga gaggctcaag 4920

acttacgctc atctcttcga tgacaaggtt atgaagcagc tcaagcgtcg ccgttacacc 4980

ggttggggta ggctctcccg caagctcatc aacggtatca gggataagca gagcggcaag 5040

actatcctcg acttcctcaa gtctgatggt ttcgctaaca ggaacttcat gcagctcatc 5100

cacgatgact ctcttacctt caaggaggat attcagaagg ctcaggtgtc cggtcagggc 5160

gactctctcc acgagcacat tgctaacctt gctggttccc ctgctatcaa gaagggcatc 5220

cttcagactg ttaaggttgt cgatgagctt gtcaaggtta tgggtcgtca caagcctgag 5280

aacatcgtca tcgagatggc tcgtgagaac cagactaccc agaagggtca gaagaactcg 5340

agggagcgca tgaagaggat tgaggagggt atcaaggagc ttggttctca gatccttaag 5400

gagcaccctg tcgagaacac ccagctccag aacgagaagc tctacctcta ctacctccag 5460

aacggtaggg atatgtacgt tgaccaggag ctcgacatca acaggctttc tgactacgac 5520

gtcgacgcca ttgttcctca gtctttcctt aaggatgact ccatcgacaa caaggtcctc 5580

acgaggtccg acaagaacag gggtaagtcg gacaacgtcc cttccgagga ggttgtcaag 5640

aagatgaaga actactggag gcagcttctc aacgctaagc tcattaccca gaggaagttc 5700

gacaacctca cgaaggctga gaggggtggc ctttccgagc ttgacaaggc tggtttcatc 5760

aagaggcagc ttgttgagac gaggcagatt accaagcacg ttgctcagat cctcgattct 5820

aggatgaaca ccaagtacga cgagaacgac aagctcatcc gcgaggtcaa ggtgatcacc 5880

ctcaagtcca agctcgtctc cgacttccgc aaggacttcc agttctacaa ggtccgcgag 5940

atcaacaact accaccacgc tcacgatgct taccttaacg ctgtcgttgg taccgctctt 6000

atcaagaagt accctaagct tgagtccgag ttcgtctacg gtgactacaa ggtctacgac 6060

gttcgtaaga tgatcgccaa gtccgagcag gagatcggca aggccaccgc caagtacttc 6120

ttctactcca acatcatgaa cttcttcaag accgagatca ccctcgccaa cggcgagatc 6180

cgcaagcgcc ctcttatcga gacgaacggt gagactggtg agatcgtttg ggacaagggt 6240

cgcgacttcg ctactgttcg caaggtcctt tctatgcctc aggttaacat cgtcaagaag 6300

accgaggtcc agaccggtgg cttctccaag gagtctatcc ttccaaagag aaactcggac 6360

aagctcatcg ctaggaagaa ggattgggac cctaagaagt acggtggttt cgactcccct 6420

actgtcgcct actccgtcct cgtggtcgcc aaggtggaga agggtaagtc gaagaagctc 6480

aagtccgtca aggagctcct cggcatcacc atcatggagc gctcctcctt cgagaagaac 6540

ccgatcgact tcctcgaggc caagggctac aaggaggtca agaaggacct catcatcaag 6600

ctccccaagt actctctttt cgagctcgag aacggtcgta agaggatgct ggcttccgct 6660

ggtgagctcc agaagggtaa cgagcttgct cttccttcca agtacgtgaa cttcctctac 6720

ctcgcctccc actacgagaa gctcaagggt tcccctgagg ataacgagca gaagcagctc 6780

ttcgtggagc agcacaagca ctacctcgac gagatcatcg agcagatctc cgagttctcc 6840

aagcgcgtca tcctcgctga cgctaacctc gacaaggtcc tctccgccta caacaagcac 6900

cgcgacaagc ccatccgcga gcaggccgag aacatcatcc acctcttcac gctcacgaac 6960

ctcggcgccc ctgctgcttt caagtacttc gacaccacca tcgacaggaa gcgttacacg 7020

tccaccaagg aggttctcga cgctactctc atccaccagt ccatcaccgg tctttacgag 7080

actcgtatcg acctttccca gcttggtggt gatagcggtg gctccagcgg tggtagcagc 7140

ggtagcgaaa ctccagggac ctcggaatcg gcgactccag aatccagtgg gggtagcagc 7200

ggcggatcca gcaccctcaa tatcgaggac gagtacaggc tgcatgagac atccaaggag 7260

ccggacgtgt cactcggctc tacatggctg agcgatttcc cacaggcctg ggcggagaca 7320

ggcggcatgg gcctcgcggt caggcaggcg ccgctcatca ttccactgaa ggcgacctcc 7380

acaccggtca gcatcaagca gtacccaatg tcacaggagg cacggctcgg catcaagcca 7440

cacattcaga ggctcctgga ccagggcatt ctggtccctt gccagagccc gtggaacacc 7500

cctctcctgc cggtgaagaa gcctggcaca aatgactaca ggccggtcca ggatctcagg 7560

gaggtgaaca agcgcgtcga ggatatccat ccgaccgtgc cgaacccata caatctcctg 7620

tcaggcctcc cgccatctca ccagtggtac accgtcctcg acctgaagga tgcgttcttc 7680

tgcctcaggc tgcatccaac aagccagcct ctcttcgcct tcgagtggcg cgatccagag 7740

atgggcattt caggccagct cacctggaca cggctgccac agggcttcaa gaactctcct 7800

accctcttca atgaggcgct ccatcgggac ctggccgatt tcaggatcca gcaccctgac 7860

ctcattctcc tgcagtacgt ggacgatctc ctgctcgccg cgacatcaga gctggattgc 7920

cagcagggca ccagggccct gctccagaca ctcggcaatc tgggctaccg ggcctctgcg 7980

aagaaggccc agatctgcca gaagcaggtg aagtacctcg gctacctgct caaggaggga 8040

cagaggtggc tgacagaggc aaggaaggag acagtcatgg gccagcctac cccgaagaca 8100

cctcggcagc tcagggagtt cctgggcaag gccggattct gcaggctctt cattccagga 8160

ttcgcggaga tggcggcgcc actctaccct ctgaccaagc cgggcacact gttcaactgg 8220

ggcccagacc agcagaaggc gtaccaggag attaagcagg cactgctcac agcacctgcg 8280

ctcggcctgc cggacctcac aaagccattc gagctgttcg tggatgagaa gcagggctac 8340

gcgaagggag tcctgacaca gaagctggga ccatggaggc gcccagtggc ctacctctca 8400

aagaagctcg acccagtggc ggccggatgg cctccgtgcc tgaggatggt ggcggccatt 8460

gccgtcctca ccaaggatgc cggcaagctg acaatgggcc agcctctcgt gattctggcg 8520

ccgcatgcgg tggaggccct ggtcaagcag ccacctgata ggtggctgtc caacgcgcgc 8580

atgacccact accaggccct gctcctggac acagataggg tccagttcgg accagtggtg 8640

gcactcaatc ctgccacact gctgccactc cctgaggagg gcctgcagca taactgcctc 8700

gatattctgg cggaggccca tggcacccgg ccagacctca cagatcagcc gctgccagac 8760

gccgatcaca cctggtacac agatggctca tctctcctgc aggagggcca gaggaaggcc 8820

ggagcagccg tgaccacaga gacagaggtc atctgggcaa aggccctccc agcgggcacc 8880

tcagcacaga gggccgagct cattgcactg acacaggcgc tcaagatggc cgagggcaag 8940

aagctgaatg tgtacacaga ctccaggtac gcattcgcca cagcacacat ccatggcgag 9000

atttacaggc ggaggggatg gctcacatca gagggaaagg agatcaagaa caaggatgag 9060

attctcgcgc tcctgaaggc cctcttcctg cctaagcgcc tgtcaatcat tcactgccca 9120

ggacatcaga agggacactc agccgaggca aggggaaata ggatggcaga ccaggcggcc 9180

aggaaggcag cgatcaccga gacaccagat acctccacac tcctgattga gaactccagc 9240

cctgacgatg acaaaatggc accgaagaaa aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa 9300

aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa 9360

aaaaggaagg tcggaatcca tggctagtcc cggaccctga aatcaccagt ctctctctac 9420

aaatctatct ctctctataa taatgtgtga gtagttccca gataagggaa ttagggttct 9480

tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt 9540

aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca aaatccagtg gggcgcccga 9600

cctgtactcg cgaaggttaa cttacagaga gtgtccgggc gcgcctggtg gatcgtccgc 9660

ctaggctgca gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat 9720

gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt 9780

atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac 9840

aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca 9900

attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc 9960

tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat 10020

ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct 10080

attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt 10140

agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt 10200

aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc 10260

gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa 10320

gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc 10380

gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc 10440

ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc agctacgggg gattcctttc 10500

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cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa 10620

atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccccccctct 10680

ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt 10740

catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat 10800

gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat 10860

cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt 10920

tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc 10980

gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt 11040

cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat 11100

ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc 11160

gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt 11220

ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg 11280

gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt 11340

gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta 11400

tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca 11460

tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt 11520

gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct 11580

gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt 11640

ttggtgttac ttctgcagga gctcatgaaa aagcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag 11700

aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa 11760

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tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc 11880

ccgattccgg aagtgcttga cattggggag tttagcgaga gcctgaccta ttgcatctcc 11940

cgccgttcac agggtgtcac gttgcaagac ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttcta 12000

caaccggtcg cggaggctat ggatgcgatc gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg 12060

ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt caatacacta catggcgtga tttcatatgc 12120

gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg caaactgtga tggacgacac cgtcagtgcg 12180

tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg ctttgggccg aggactgccc cgaagtccgg 12240

cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac aatgtcctga cggacaatgg ccgcataaca 12300

gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc ggggattccc aatacgaggt cgccaacatc 12360

ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg gagcagcaga cgcgctactt cgagcggagg 12420

catccggagc ttgcaggatc gccacgactc cgggcgtata tgctccgcat tggtcttgac 12480

caactctatc agagcttggt tgacggcaat ttcgatgatg cagcttgggc gcagggtcga 12540

tgcgacgcaa tcgtccgatc cggagccggg actgtcgggc gtacacaaat cgcccgcaga 12600

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caagctcgag tttctccata ataatgtgtg agtagttccc agataaggga attagggttc 12780

ctatagggtt tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg 12840

taaaatactt ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt actaaaatcc 12900

agatcccccg aattaattcg gcgttaattc agcctgcagg catgcaagct tggcactggc 12960

cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc 13020

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ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg ctagagcagc ttgagcttgg atcagattgt 13140

cgtttcccgc cttcagttta aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct 13200

aagagaaaag agcgtttatt agaataacgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc 13260

gttcgtccat ttgtatgtgc atgccaacca cagggttccc ctcgggatca aagtactttg 13320

atccaacccc tccgctgcta tagtgcagtc ggcttctgac gttcagtgca gccgtcttct 13380

gaaaacgaca tgtcgcacaa gtcctaagtt acgcgacagg ctgccgccct gcccttttcc 13440

tggcgttttc ttgtcgcgtg ttttagtcgc ataaagtaga atacttgcga ctagaaccgg 13500

agacattacg ccatgaacaa gagcgccgcc gctggcctgc tgggctatgc ccgcgtcagc 13560

accgacgacc aggacttgac caaccaacgg gccgaactgc acgcggccgg ctgcaccaag 13620

ctgttttccg agaagatcac cggcaccagg cgcgaccgcc cggagctggc caggatgctt 13680

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acccgcgacc tactggacat tgccgagcgc atccaggagg ccggcgcggg cctgcgtagc 13800

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gcgcacgccc gcgagctgat cgaccaggaa ggccgcaccg tgaaagaggc ggctgcactg 14040

cttggcgtgc atcgctcgac cctgtaccgc gcacttgagc gcagcgagga agtgacgccc 14100

accgaggcca ggcggcgcgg tgccttccgt gaggacgcat tgaccgaggc cgacgccctg 14160

gcggccgccg agaatgaacg ccaagaggaa caagcatgaa accgcaccag gacggccagg 14220

acgaaccgtt tttcattacc gaagagatcg aggcggagat gatcgcggcc gggtacgtgt 14280

tcgagccgcc cgcgcacgtc tcaaccgtgc ggctgcatga aatcctggcc ggtttgtctg 14340

atgccaagct ggcggcctgg ccggccagct tggccgctga agaaaccgag cgccgccgtc 14400

taaaaaggtg atgtgtattt gagtaaaaca gcttgcgtca tgcggtcgct gcgtatatga 14460

tgcgatgagt aaataaacaa atacgcaagg ggaacgcatg aaggttatcg ctgtacttaa 14520

ccagaaaggc gggtcaggca agacgaccat cgcaacccat ctagcccgcg ccctgcaact 14580

cgccggggcc gatgttctgt tagtcgattc cgatccccag ggcagtgccc gcgattgggc 14640

ggccgtgcgg gaagatcaac cgctaaccgt tgtcggcatc gaccgcccga cgattgaccg 14700

cgacgtgaag gccatcggcc ggcgcgactt cgtagtgatc gacggagcgc cccaggcggc 14760

ggacttggct gtgtccgcga tcaaggcagc cgacttcgtg ctgattccgg tgcagccaag 14820

cccttacgac atatgggcca ccgccgacct ggtggagctg gttaagcagc gcattgaggt 14880

cacggatgga aggctacaag cggcctttgt cgtgtcgcgg gcgatcaaag gcacgcgcat 14940

cggcggtgag gttgccgagg cgctggccgg gtacgagctg cccattcttg agtcccgtat 15000

cacgcagcgc gtgagctacc caggcactgc cgccgccggc acaaccgttc ttgaatcaga 15060

acccgagggc gacgctgccc gcgaggtcca ggcgctggcc gctgaaatta aatcaaaact 15120

catttgagtt aatgaggtaa agagaaaatg agcaaaagca caaacacgct aagtgccggc 15180

cgtccgagcg cacgcagcag caaggctgca acgttggcca gcctggcaga cacgccagcc 15240

atgaagcggg tcaactttca gttgccggcg gaggatcaca ccaagctgaa gatgtacgcg 15300

gtacgccaag gcaagaccat taccgagctg ctatctgaat acatcgcgca gctaccagag 15360

taaatgagca aatgaataaa tgagtagatg aattttagcg gctaaaggag gcggcatgga 15420

aaatcaagaa caaccaggca ccgacgccgt ggaatgcccc atgtgtggag gaacgggcgg 15480

ttggccaggc gtaagcggct gggttgtctg ccggccctgc aatggcactg gaacccccaa 15540

gcccgaggaa tcggcgtgac ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc 15600

tgggtgatga cctggtggag aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg 15660

aggcagaagc acgccccggt gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat 15720

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aaccagattt tttcgttccg atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca 15840

tggacgtggc cgttttccgt ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct 15900

acgagcttcc agacgggcac gtagaggttt ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt 15960

gggattacga cctggtactg atggcggttt cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc 16020

gggaagggaa gggagacaag cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca 16080

agttctgccg gcgagccgat ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa acctgcattc 16140

ggttaaacac cacgcacgtt gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg 16200

tgacggtatc cgagggtgaa gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg 16260

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gcaagaaccc ggacgtgctg acggttcacc ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg 16380

gccgttttct ctaccgcctg gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt 16440

tcaagacgat ctacgaacgc agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg 16500

tgcgcaagct gatcgggtca aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc 16560

aggctggccc gatcctagtc atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg 16620

gttcctaatg tacggagcag atgctagggc aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa 16680

aagttctctt tcctgtggat agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc 16740

ggaacccgta cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga 16800

ctgatataaa agagaaaaaa ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa 16860

ctcttaaaac ccgcctggcc tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc 16920

aaaaagcgcc tacccttcgg tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta 16980

tcgcggccgc tggccgctca aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg 17040

gacaagccgc gccgtcgcca ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc ctgcctcgcg 17100

cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct 17160

tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc 17220

gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta 17280

actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc 17340

acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 17400

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 17460

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 17520

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 17580

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 17640

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 17700

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 17760

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 17820

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 17880

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 17940

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 18000

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 18060

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 18120

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 18180

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gcattctagg tactaaaaca 18240

attcatccag taaaatataa tattttattt tctcccaatc aggcttgatc cccagtaagt 18300

caaaaaatag ctcgacatac tgttcttccc cgatatcctc cctgatcgac cggacgcaga 18360

aggcaatgtc ataccacttg tccgccctgc cgcttctccc aagatcaata aagccactta 18420

ctttgccatc tttcacaaag atgttgctgt ctcccaggtc gccgtgggaa aagacaagtt 18480

cctcttcggg cttttccgtc tttaaaaaat catacagctc gcgcggatct ttaaatggag 18540

tgtcttcttc ccagttttcg caatccacat cggccagatc gttattcagt aagtaatcca 18600

attcggctaa gcggctgtct aagctattcg tatagggaca atccgatatg tcgatggagt 18660

gaaagagcct gatgcactcc gcatacagct cgataatctt ttcagggctt tgttcatctt 18720

catactcttc cgagcaaagg acgccatcgg cctcactcat gagcagattg ctccagccat 18780

catgccgttc aaagtgcagg acctttggaa caggcagctt tccttccagc catagcatca 18840

tgtccttttc ccgttccaca tcataggtgg tccctttata ccggctgtcc gtcattttta 18900

aatataggtt ttcattttct cccaccagct tatatacctt agcaggagac attccttccg 18960

tatcttttac gcagcggtat ttttcgatca gttttttcaa ttccggtgat attctcattt 19020

tagccattta ttatttcctt cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa 19080

ttataacaag acgaactcca attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa 19140

aacagctttt tcaaagttgt tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat 19200

tttgaaaccg cggtgatcac aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac 19260

cctccgcgag atcatccgtg tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc 19320

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actgatgggc tgcctgtatc gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt 19440

tggctggct 19449

<210> 2

<211> 1367

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly

1 5 10 15

Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys

20 25 30

Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly

35 40 45

Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys

50 55 60

Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe

85 90 95

Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His

100 105 110

Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His

115 120 125

Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser

130 135 140

Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met

145 150 155 160

Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp

165 170 175

Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn

180 185 190

Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys

195 200 205

Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu

210 215 220

Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu

225 230 235 240

Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp

245 250 255

Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp

260 265 270

Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu

275 280 285

Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile

290 295 300

Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met

305 310 315 320

Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp

340 345 350

Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln

355 360 365

Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly

370 375 380

Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys

385 390 395 400

Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly

405 410 415

Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu

420 425 430

Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro

435 440 445

Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met

450 455 460

Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val

465 470 475 480

Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn

485 490 495

Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu

500 505 510

Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr

515 520 525

Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys

530 535 540

Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val

545 550 555 560

Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser

565 570 575

Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr

580 585 590

Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn

595 600 605

Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu

610 615 620

Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His

625 630 635 640

Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr

645 650 655

Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys

660 665 670

Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala

675 680 685

Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys

690 695 700

Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His

705 710 715 720

Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile

725 730 735

Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg

740 745 750

His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr

755 760 765

Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu

770 775 780

Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val

785 790 795 800

Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln

805 810 815

Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu

820 825 830

Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp

835 840 845

Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly

850 855 860

Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn

865 870 875 880

Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe

885 890 895

Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys

900 905 910

Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys

915 920 925

His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu

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Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys

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Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu

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Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val

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Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val

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Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

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Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn

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Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr

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Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu

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Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys

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Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu

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Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser

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Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe

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Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu

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Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe

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Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu

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Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn

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Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg

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Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr

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Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile

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Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe

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Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr

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tcagcacaga gggccgagct cattgcactg acacaggcgc tcaagatggc cgagggcaag 8220

aagctgaatg tgtacacaga ctccaggtac gcattcgcca cagcacacat ccatggcgag 8280

atttacaggc ggaggggatg gctcacatca gagggaaagg agatcaagaa caaggatgag 8340

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aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa 8640

aaaaggaagg tcggaatcca tggcggatca ggagccacca acttctccct cctcaagcag 8700

gccggcgacg tggaggagaa cccgggccca atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct 8760

gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca gctctcggag 8820

ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta 8880

aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc 8940

gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt ggggagttta gcgagagcct gacctattgc 9000

atctcccgcc gttcacaggg tgtcacgttg caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct 9060

gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg 9120

agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc 9180

atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc 9240

agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa 9300

gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc 9360

ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc 9420

aacatcttct tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag 9480

cggaggcatc cggagcttgc aggatcgcca cgactccggg cgtatatgct ccgcattggt 9540

cttgaccaac tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag 9600

ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc 9660

cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac 9720

cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag aaatagacta gttcccgatc gttcaaacat 9780

ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata 9840

atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat 9900

gaggtgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa 9960

aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagacct 10020

gcaggtggaa tcggcagcaa aggatttttt cctgtagttt tcccacaacc attttttacc 10080

atccgaatga taggatagga aaaatatcca agtgaacagt attcctataa aattcccgta 10140

aaaagcctgc aatccgaatg agccctgaag tctgaactag ccggtcacct gtacaggcta 10200

tcgagatgcc atacaagaga cggtagtagg aactaggaag acgatggttg attcgtcagg 10260

cgaaatcgtc gtcctgcagt cgcatctatg ggcctggacg gaatagggga aaaagttggc 10320

cggataggag ggaaaggccc aggtgcttac gtgcgaggta ggcctgggct ctcagcactt 10380

cgattcgttg gcaccggggt aggatgcaat agagagcaac gtttagtacc acctcgctta 10440

gctagagcaa actggactgc cttatatgcg cgggtgctgg cttggctgcc gatatctcgc 10500

tctcacattc cgtttcagag ctatgctgga aacagcatag caagttgaaa taaggctagt 10560

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt ttttaggaat ctttaaacat 10620

acgaacagat cacttaaagt tcttctgaag caacttaaag ttatcaggca tgcatggatc 10680

ttggaggaat cagatgtgca gtcagggacc atagcacaag acaggcgtct tctactggtg 10740

ctaccagcaa atgctggaag ccgggaacac tgggtacgtt ggaaaccacg tgtgatgtga 10800

aggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg ggccatgaag cctttcagga 10860

catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac gacaacaaag actagtatta 10920

gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa aagagttgtg cagatgatcc 10980

gtggcgggta tggtggtgca atggggtttc agagctatgc tggaaacagc atagcaagtt 11040

gaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg caaacctatc 11100

ctccaattgc accaccattt ttttttggca tgcaagcttg gcactggccg tcgttttaca 11160

acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc 11220

tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg 11280

cagcctgaat ggcgaatgct agagcagctt gagcttggat cagattgtcg tttcccgcct 11340

tcagtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa gagaaaagag 11400

cgtttattag aataacggat atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt tcgtccattt 11460

gtatgtgcat gccaaccaca gggttcccct cgggatcaaa gtactttgat ccaacccctc 11520

cgctgctata gtgcagtcgg cttctgacgt tcagtgcagc cgtcttctga aaacgacatg 11580

tcgcacaagt cctaagttac gcgacaggct gccgccctgc ccttttcctg gcgttttctt 11640

gtcgcgtgtt ttagtcgcat aaagtagaat acttgcgact agaaccggag acattacgcc 11700

atgaacaaga gcgccgccgc tggcctgctg ggctatgccc gcgtcagcac cgacgaccag 11760

gacttgacca accaacgggc cgaactgcac gcggccggct gcaccaagct gttttccgag 11820

aagatcaccg gcaccaggcg cgaccgcccg gagctggcca ggatgcttga ccacctacgc 11880

cctggcgacg ttgtgacagt gaccaggcta gaccgcctgg cccgcagcac ccgcgaccta 11940

ctggacattg ccgagcgcat ccaggaggcc ggcgcgggcc tgcgtagcct ggcagagccg 12000

tgggccgaca ccaccacgcc ggccggccgc atggtgttga ccgtgttcgc cggcattgcc 12060

gagttcgagc gttccctaat catcgaccgc acccggagcg ggcgcgaggc cgccaaggcc 12120

cgaggcgtga agtttggccc ccgccctacc ctcaccccgg cacagatcgc gcacgcccgc 12180

gagctgatcg accaggaagg ccgcaccgtg aaagaggcgg ctgcactgct tggcgtgcat 12240

cgctcgaccc tgtaccgcgc acttgagcgc agcgaggaag tgacgcccac cgaggccagg 12300

cggcgcggtg ccttccgtga ggacgcattg accgaggccg acgccctggc ggccgccgag 12360

aatgaacgcc aagaggaaca agcatgaaac cgcaccagga cggccaggac gaaccgtttt 12420

tcattaccga agagatcgag gcggagatga tcgcggccgg gtacgtgttc gagccgcccg 12480

cgcacgtctc aaccgtgcgg ctgcatgaaa tcctggccgg tttgtctgat gccaagctgg 12540

cggcctggcc ggccagcttg gccgctgaag aaaccgagcg ccgccgtcta aaaaggtgat 12600

gtgtatttga gtaaaacagc ttgcgtcatg cggtcgctgc gtatatgatg cgatgagtaa 12660

ataaacaaat acgcaagggg aacgcatgaa ggttatcgct gtacttaacc agaaaggcgg 12720

gtcaggcaag acgaccatcg caacccatct agcccgcgcc ctgcaactcg ccggggccga 12780

tgttctgtta gtcgattccg atccccaggg cagtgcccgc gattgggcgg ccgtgcggga 12840

agatcaaccg ctaaccgttg tcggcatcga ccgcccgacg attgaccgcg acgtgaaggc 12900

catcggccgg cgcgacttcg tagtgatcga cggagcgccc caggcggcgg acttggctgt 12960

gtccgcgatc aaggcagccg acttcgtgct gattccggtg cagccaagcc cttacgacat 13020

atgggccacc gccgacctgg tggagctggt taagcagcgc attgaggtca cggatggaag 13080

gctacaagcg gcctttgtcg tgtcgcgggc gatcaaaggc acgcgcatcg gcggtgaggt 13140

tgccgaggcg ctggccgggt acgagctgcc cattcttgag tcccgtatca cgcagcgcgt 13200

gagctaccca ggcactgccg ccgccggcac aaccgttctt gaatcagaac ccgagggcga 13260

cgctgcccgc gaggtccagg cgctggccgc tgaaattaaa tcaaaactca tttgagttaa 13320

tgaggtaaag agaaaatgag caaaagcaca aacacgctaa gtgccggccg tccgagcgca 13380

cgcagcagca aggctgcaac gttggccagc ctggcagaca cgccagccat gaagcgggtc 13440

aactttcagt tgccggcgga ggatcacacc aagctgaaga tgtacgcggt acgccaaggc 13500

aagaccatta ccgagctgct atctgaatac atcgcgcagc taccagagta aatgagcaaa 13560

tgaataaatg agtagatgaa ttttagcggc taaaggaggc ggcatggaaa atcaagaaca 13620

accaggcacc gacgccgtgg aatgccccat gtgtggagga acgggcggtt ggccaggcgt 13680

aagcggctgg gttgtctgcc ggccctgcaa tggcactgga acccccaagc ccgaggaatc 13740

ggcgtgacgg tcgcaaacca tccggcccgg tacaaatcgg cgcggcgctg ggtgatgacc 13800

tggtggagaa gttgaaggcc gcgcaggccg cccagcggca acgcatcgag gcagaagcac 13860

gccccggtga atcgtggcaa gcggccgctg atcgaatccg caaagaatcc cggcaaccgc 13920

cggcagccgg tgcgccgtcg attaggaagc cgcccaaggg cgacgagcaa ccagattttt 13980

tcgttccgat gctctatgac gtgggcaccc gcgatagtcg cagcatcatg gacgtggccg 14040

ttttccgtct gtcgaagcgt gaccgacgag ctggcgaggt gatccgctac gagcttccag 14100

acgggcacgt agaggtttcc gcagggccgg ccggcatggc cagtgtgtgg gattacgacc 14160

tggtactgat ggcggtttcc catctaaccg aatccatgaa ccgataccgg gaagggaagg 14220

gagacaagcc cggccgcgtg ttccgtccac acgttgcgga cgtactcaag ttctgccggc 14280

gagccgatgg cggaaagcag aaagacgacc tggtagaaac ctgcattcgg ttaaacacca 14340

cgcacgttgc catgcagcgt acgaagaagg ccaagaacgg ccgcctggtg acggtatccg 14400

agggtgaagc cttgattagc cgctacaaga tcgtaaagag cgaaaccggg cggccggagt 14460

acatcgagat cgagctagct gattggatgt accgcgagat cacagaaggc aagaacccgg 14520

acgtgctgac ggttcacccc gattactttt tgatcgatcc cggcatcggc cgttttctct 14580

accgcctggc acgccgcgcc gcaggcaagg cagaagccag atggttgttc aagacgatct 14640

acgaacgcag tggcagcgcc ggagagttca agaagttctg tttcaccgtg cgcaagctga 14700

tcgggtcaaa tgacctgccg gagtacgatt tgaaggagga ggcggggcag gctggcccga 14760

tcctagtcat gcgctaccgc aacctgatcg agggcgaagc atccgccggt tcctaatgta 14820

cggagcagat gctagggcaa attgccctag caggggaaaa aggtcgaaaa gttctctttc 14880

ctgtggatag cacgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg aacccgtaca 14940

ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggtcacacat gtaagtgact gatataaaag 15000

agaaaaaagg cgatttttcc gcctaaaact ctttaaaact tattaaaact cttaaaaccc 15060

gcctggcctg tgcataactg tctggccagc gcacagccga agagctgcaa aaagcgccta 15120

cccttcggtc gctgcgctcc ctacgccccg ccgcttcgcg tcggcctatc gcggccgctg 15180

gccgctcaaa aatggctggc ctacggccag gcaatctacc agggcgcgga caagccgcgc 15240

cgtcgccact cgaccgccgg cgcccacatc aaggcaccct gcctcgcgcg tttcggtgat 15300

gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 15360

gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 15420

gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat 15480

cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 15540

ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 15600

tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 15660

aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 15720

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 15780

aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 15840

ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 15900

tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 15960

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 16020

ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 16080

tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 16140

ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 16200

tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 16260

aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 16320

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 16380

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat tcatccagta 16440

aaatataata ttttattttc tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct 16500

cgacatactg ttcttccccg atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat 16560

accacttgtc cgccctgccg cttctcccaa gatcaataaa gccacttact ttgccatctt 16620

tcacaaagat gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct 16680

tttccgtctt taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc 16740

agttttcgca atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc 16800

ggctgtctaa gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga 16860

tgcactccgc atacagctcg ataatctttt cagggctttg ttcatcttca tactcttccg 16920

agcaaaggac gccatcggcc tcactcatga gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa 16980

agtgcaggac ctttggaaca ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg tccttttccc 17040

gttccacatc ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt 17100

cattttctcc caccagctta tataccttag caggagacat tccttccgta tcttttacgc 17160

agcggtattt ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta gccatttatt 17220

atttccttcc tcttttctac agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt ataacaagac 17280

gaactccaat tcactgttcc ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc 17340

aaagttgttt tcaaagttgg cgtataacat agtatcgacg gagccgattt tgaaaccgcg 17400

gtgatcacag gcagcaacgc tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat 17460

catccgtgtt tcaaacccgg cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat cggtaacatg 17520

agcaaagtct gccgccttac aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac tgatgggctg 17580

cctgtatcga gtggtgattt tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg gctggct 17637

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

Claims (16)

1.成套系统，其包括融合蛋白、pegRNA和esgRNA；

所述融合蛋白为依次由Cas9切刻酶、反转录酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白组成的融合蛋白或依次由筛选标记蛋白、自切割寡肽、Cas9切刻酶和反转录酶组成的融合蛋白；

所述Cas9切刻酶为Cas9n H840A；

所述Cas9n H840A的氨基酸序列如序列2所示；

所述反转录酶为M-MLV RT；

所述M-MLV RT的氨基酸序列如序列3所示；

所述自切割寡肽为来源于病毒基因组的2A自切割寡肽；所述来源于病毒基因组的2A自切割寡肽为来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽；

所述筛选标记蛋白为潮霉素磷酸转移酶；

所述潮霉素磷酸转移酶的氨基酸序列是序列4所示；

所述pegRNA依次由靶点序列、esgRNA骨架、RT序列和引物结合位点PBS序列组成；

所述esgRNA骨架为将序列5第10512-10597位中的T替换为U得到的RNA分子。

2.根据权利要求1所述的成套系统，其特征在于：所述Cas9n H840A的编码基因为序列1第3013-7113位所示的cDNA分子或DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的成套系统，其特征在于：所述M-MLV RT的编码基因为序列1第7213-9243位所示的cDNA分子或DNA分子。

4.根据权利要求1或2所述的成套系统，其特征在于：所述来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽的氨基酸序列的氨基酸序列是序列6所示；

或，所述来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽的编码基因为序列5第8674-8730位所示的cDNA分子或DNA分子。

5.根据权利要求1或2所述的成套系统，其特征在于：所述潮霉素磷酸转移酶的编码基因为序列1第11665-12690位所示的cDNA分子或DNA分子。

6.权利要求1-5任一所述的成套系统在S1）-S4）任一种中的应用：

S1）生物体或生物细胞基因组序列的编辑；

S2）制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；

S3）提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率；

S4）制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品；

所述生物体为植物；所述生物细胞为植物细胞。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述基因组序列的编辑为基因组序列的碱基替换。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；和/或，所述植物细胞为单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物；或，所述单子叶植物细胞为禾本科植物细胞。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述禾本科植物为水稻；或，所述禾本科植物细胞为水稻细胞。

11.基因组序列的编辑方法或提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使生物体或生物细胞表达权利要求1所述的成套系统；所述生物体为植物；所述生物细胞为植物细胞。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述基因组序列的编辑为基因组序列的碱基替换。

13.生物突变体的制备方法，包括如下步骤：利用权利要求1所述的成套系统对生物体的基因组进行编辑，获得生物突变体；

所述生物体为植物。

14.根据权利要求11-13任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述禾本科植物为水稻。

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