CN117363588A - 一种表达四半胱氨酸标签重组蓝舌病毒的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种表达四半胱氨酸标签重组蓝舌病毒的制备方法及应用。本发明通过在野生型蓝舌病毒非结构蛋白NS1的第493位氨基酸后插入四半胱氨酸(Tetracysteine，TC)标签，构建获得了重组蓝舌病毒BTV‑1S6‑493TC；所述重组蓝舌病毒与野生型蓝舌病毒的生物学特性没有明显区别，并且表达TC标签的重组蓝舌病毒能被双砷染料(ReAsH)染色，TC标记的NS1蛋白可显示荧光，可用于BTV感染的可视化定量检测以及NS1蛋白的定位和示踪研究。
Description
本案是原申请的分案申请，原专利号：2023101158083；原专利名称：一种用于荧光染色的重组蓝舌病毒及其构建方法；原申请日：2023年2月15日。
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种表达四半胱氨酸标签重组蓝舌病毒的制备方法及应用。
背景技术
蓝舌病是由蓝舌病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的一种严重侵害羊、牛、鹿等反刍动物的烈性传染病，世界动物卫生组织(WOAH)将其列为法定通报的动物传染病，我国将其列为二类动物传染病。BTV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的代表性成员，是一种由库蠓(Culicoides)传播的虫媒病毒，目前已发现29种不同的血清型，型与型之间不能交叉免疫。
BTV粒子为二十面立体对称，无囊膜，其基因组由10个(S1～S10)分节段的线性双链RNA(dsRNA)组成。BTV基因组编码7种结构蛋白(VP1～VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4)；BTV粒子具有双层衣壳，VP2和VP5组成外层衣壳，内层衣壳由VP3和VP7组成。BTV脱去外层衣壳后形成病毒核心粒子，3种酶蛋白VP1、VP4、VP6位于核心粒子内部；其中非结构蛋白NS1蛋白由S6基因编码，是所有BTV编码蛋白中表达量最高的蛋白，约占病毒总蛋白的25％。NS1蛋白在BTV感染的细胞质中可以多聚体形式形成微管结构，这些微管的直径约为52nm、长约1000nm，这是BTV感染细胞后最显著的特征之一，微管在BTV感染细胞后2～4小时出现且存在于整个感染复制周期。NS1蛋白富含半胱氨酸，不同血清型BTV的NS1蛋白中16个半胱氨酸都是保守的，表明NS1含有一个由二硫键连接的高度有序的结构；而且不同血清型BTV的NS1蛋白的氨基酸序列高度保守，同源性99％以上。
目前关于BTV定量检测方法有qRT-PCR、噬斑实验、免疫荧光、TCID50等方法。然而，由于BTV已经发现29种血清型，每种血清型中不同病毒分离株的基因也有差异，因此，qRT-PCR法需要设计合成特异性引物和探针，成本较高，且可能会出现非特异性扩增。免疫荧光法需要制备或购买病毒特异性的抗体，易出现非特异性结合，而且不能对感染细胞中的活病毒进行实时定量和定位。噬斑实验和TCID50方法操作过程繁琐，技术要求比较高，增加了实验操作产生的误差，准确性和可重复性比较低。
近年来，对于病毒的可视化定量主要基于对编码荧光蛋白(FluorescentProtein，FP)的重组病毒进行定量，即通过基因工程的手段将表达GFP的基因与病毒蛋白基因融合，可以实现对病毒的特定蛋白进行荧光标记，然而这种标记方法在BTV的应用存在很大局限性。BTV的基因组由10个大小不等(0.8-3.9kb)的双链RNA组成，其容纳外源基因的能力非常有限，由于荧光蛋白分子量通常在27ku～37ku，病毒大量表达荧光蛋白会影响标记病毒的感染力及复制能力，至今未见表达荧光蛋白的重组蓝舌病毒被拯救成功的报道。
本发明意外发现在蓝舌病毒非结构蛋白NS1的第156位和/或第493位氨基酸后插入四半胱氨酸(Tetracysteine，TC)标签，且可以被拯救成功，构建获得的重组蓝舌病毒BTV-1S6-156TC或BTV-1S6-493TC与野生型蓝舌病毒的生物学特性没有明显区别，并且表达TC标签的重组蓝舌病毒能被双砷染料(ReAsH)染色，TC标记的NS1蛋白可显示荧光，可用于BTV感染的可视化定量检测以及NS1蛋白的定位和示踪研究。
发明内容
针对上述技术问题，本发明意外发现在野生型蓝舌病毒非结构蛋白NS1的第156位氨基酸或493位氨基酸后插入TC标签，成功构建获得了重组蓝舌病毒BTV-1S6-156TC和BTV-1S6-493TC；所述重组蓝舌病毒与野生型蓝舌病毒的生物学特性没有明显区别，并且表达TC标签的重组蓝舌病毒能被双砷染料(ReAsH或FlAsH)染色，TC标记的NS1蛋白可显示荧光，可用于BTV感染的可视化定量检测和NS1蛋白的定位和示踪研究。具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种用于荧光染色的重组蓝舌病毒，所述重组蓝舌病毒为在野生型蓝舌病毒非结构蛋白NS1的第156位氨基酸或493位氨基酸后插入TC标签获得。
优选地，所述TC标签为一个由四个半胱氨酸组成的发夹结构，其氨基酸序列为CCPGCC。
优选地，所述在野生型蓝舌病毒为蓝舌病毒血清1型。
优选地，所述在野生型蓝舌病毒为BTV-1(GS/11)。
第二方面，本发明提供了一种重组蓝舌病毒的构建方法，所述方法为：通过基因工程手段在野生型蓝舌病毒非结构蛋白NS1的第156位氨基酸或493位氨基酸后插入TC标签获得重组蓝舌病毒。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)在野生型蓝舌病毒S6基因CDS序列的第468位碱基后或第1479位碱基后插入TC标签的基因序列，构建获得含有TC标签的蓝舌病毒S6基因转录质粒；体外转录生成含有TC标签的S6 mRNA；
(2)分别构建野生型蓝舌病毒基因S1-S5、S7-S10的转录质粒，体外转录成mRNA转录本；
(3)将步骤(1)所述含有TC标签的S6 mRNA以及步骤(2)所述的mRNA转录本共转染细胞，筛选获得重组蓝舌病毒。
优选地，所述步骤(1)中含有TC标签的蓝舌病毒S6基因转录质粒的构建方法为：
以野生型蓝舌病毒S6基因为模板，通过PCR基因定点突变技术在野生型蓝舌病毒S6基因CDS序列的第468位碱基后和/或第1479位碱基后插入TC标签的基因序列，构建获得含有TC标签的蓝舌病毒S6基因转录质粒；所述TC标签的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述在野生型蓝舌病毒为蓝舌病毒血清1型。
优选地，所述在野生型蓝舌病毒为BTV-1(GS/11)。
优选地，所述S6基因CDS序列位于S6基因全长的第35-1693位碱基处。
优选地，所述步骤(3)中的细胞为BHK-21细胞。
第三方面，本发明提供了一种上述第二方面所述方法构建获得的重组蓝舌病毒。
第四方面，本发明提供了上述第一方面或第三方面所述的重组蓝舌病毒具有如下任一所述的用途：
(1)在蓝舌病毒可视化定量检测中的应用；
(2)在蓝舌病毒NS1蛋白动态表达、定位和示踪研究中的应用。
本发明的有益效果是：(1)本发明意外发现只有在野生型蓝舌病毒非结构蛋白NS1的第156或第493位氨基酸后插入TC标签，才能拯救获得的重组蓝舌病毒，且重组病毒BTV-1S6-156TC和BTV-1S6-493TC均能被双砷染料(ReAsH)染色，TC标记的NS1蛋白可显示荧光，可用于BTV的可视化定量检测；(2)而且所述重组蓝舌病毒不影响原有野生型蓝舌病毒NS1蛋白的结构和功能；(3)重组蓝舌病毒还可以应用于NS1蛋白在细胞中的动态表达、定位和示踪研究，为深入揭示BTV复杂的感染致病机制提供研究工具和技术平台。
附图说明
图1 BTV-1S1-S10、S6-156TC和S6-493TC体外转录生成的RNA转录本；
图2转染细胞后拯救病毒形成的细胞病变；其中A为未转染BHK-21细胞；B为重组病毒BTV-1S6-156TC；C为重组病毒BTV-1S6-493TC；
图3病毒dsRNA电泳图；其中1为BHK-21细胞对照；2为野生型重组BTV-1；3为重组病毒BTV-1S6-156TC；4为重组病毒BTV-1S6-493TC；
图4重组BTV感染BHK-21细胞后的ReAsH荧光染色；其中A为野生型重组BTV-1感染BHK-21细胞；B为BTV-1S6-156TC感染BHK-21细胞；C为BTV-1S6-493TC感染BHK-21细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
以下实施例以蓝舌病毒血清1型BTV-1(GS/11)为例，本发明利用生物信息学软件结合已发表的BTV-1NS1(S6基因编码)相关文献，在S6基因上设计了2个四半胱氨酸(TC)标签序列(氨基酸序列为CCPGCC)的插入位点，分别为NS1蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的156位(对应S6基因CDS序列的第468位碱基，或S6基因全长的第502位碱基)和493位氨基酸(对应S6基因CDS序列的第1479位碱基，或S6基因全长的第1513位碱基)后，设计带有编码TC标签序列(TGTTGTCCCGGGTGTTGT，SEQ ID NO.2所示)的定点突变引物，以野生型S6基因转录质粒为模板，通过PCR基因定点突变技术构建含有T7启动子和TC标签的S6基因转录质粒，酶切线性化后用T7聚合酶转录试剂盒进行体外转录，生成含有TC序列的S6 mRNA，对BTV-1其他10个野生型基因(S1-S10)转录质粒进行酶切线性化，体外转录成每个基因的mRNA转录本(图1所示)，共转染BHK-21细胞，转染细胞后3天出现明显的细胞病变(CPE)(图2所示)，分别收集病变细胞，经过3轮噬斑纯化，分别获得了两株NS1重组突变病毒BTV-1S6-156TC和BTV-1S6-493TC。提取重组病毒的dsRNA进行基因组电泳分析(图3所示)。利用重组病毒感染BHK-21细胞，感染后用双砷染料(ReAsH)对重组病毒染色，两株表达TC标签的重组病毒均能被双砷染料(ReAsH)染色，TC标记的NS1蛋白可显示荧光(图4所示)。具体实施方式如下：
实施例1重组蓝舌病毒的构建
1.构建方法
在BTV-1S6基因上设计了3个TC标签序列(氨基酸序列为CCPGCC)的插入位点，分别为其编码NS1蛋白的156位氨基酸(对应S6基因CDS序列的第468位碱基，或S6基因全长的第502位碱基)后、第493位氨基酸(对应S6基因CDS序列的第468位碱基，或S6基因全长的第502位碱基)后和第552位氨基酸(对应S6基因CDS序列的第1656位碱基，或S6基因全长的第1690位碱基)后。
设计带有编码TC标签序列(TGTTGTCCCGGGTGTTGT)的定点突变引物，以野生型S6基因转录质粒为模板，通过PCR基因定点突变技术构建分别含有T7启动子和TC标签的NS1基因转录质粒S6-156TC、S6-493TC和S6-552TC，酶切线性化后用T7聚合酶转录试剂盒进行体外转录，生成含有TC序列的S6 mRNA，对BTV-1全部10个野生型基因(S1～S10)转录质粒进行酶切线性化，体外转录成每个基因的mRNA转录本，结果如图1所示。
将S6-156TC mRNA、S6-493TC mRNA和S6-552TC mRNA分别与野生型S1～S5、S7～S10mRNA共转染BHK-21细胞，连续观察转染细胞3-5天。
提取重组病毒感染细胞的RNA，利用S6基因片段特异引物对其进行RT-PCR扩增并进行测序验证TC标签的插入位置是否正确，同时提取重组病毒的dsRNA进行基因组电泳分析。
利用测序正确的含有TC标签的重组病毒感染BHK-21细胞，感染后利用双砷染料(ReAsH)对重组病毒染色，同时用Hoechst对细胞核进行染色，观察重组病毒NS1蛋白的荧光染色情况。
2.结果分析
转染细胞3天后，含有S6-156TC mRNA、S6-493TC mRNA的转染孔分别出现明显的细胞病变(CPE)，而含有S6-552TC mRNA转染孔未出现CPE，表明在蓝舌病毒非结构蛋白NS1的第552位氨基酸后插入TC标签影响了重组病毒的拯救(结果如图2所示)，只有本申请所述的在蓝舌病毒非结构蛋白NS1的第156位氨基酸后或第493位氨基酸后插入TC标签，才能获得成功拯救的重组蓝舌病毒。分别收集出现CPE的转染孔细胞，经过3轮噬斑纯化，获得了重组蓝舌病毒BTV-1S6-156TC和BTV-1S6-493TC。
分别提取重组蓝舌病毒BTV-1S5-156TC、BTV-1S5-493TC感染细胞的总RNA，利用BTV-1S6基因特异引物经RT-PCR扩增，获得PCR产物后进行序列测定，结果显示，两株拯救的重组蓝舌病毒分别在NS1的156位氨基酸后和493位氨基酸后正确插入了TC标签。
通过对重组蓝舌病毒双链RNA基因组电泳和噬斑分析，发现两株重组的带有TC标签的重组蓝舌病毒与野生型蓝舌病毒BTV-1没有明显区别(结果如图3所示)，表明拯救的重组蓝舌病毒可以用于病毒感染细胞的荧光可视化定量测定和NS1蛋白的表达分布及示踪实验。
用共聚焦显微镜观察发现，两株表达TC标签的重组蓝舌病毒和野生型蓝舌病毒BTV-1的细胞核均被Hoechst染色为蓝色；而且只有本申请所述的两株表达TC标签的重组蓝舌病毒被双砷染料(ReAsH)染色，TC标记的NS1蛋白可显示紫色荧光(结果如图4所示)；同时可利用荧光显微镜的荧光强度分析模块软件对其进行定量。综上所述，两株表达TC标签的重组蓝舌病毒可用于BTV感染的可视化定量检测以及NS1蛋白的定位和示踪研究。
本发明虽然以BTV-1(GS/11)为例，但是在BTV-1与其他血清型NS1氨基酸序列高度保守(同源性达99％以上)的基础上，本发明所述方案同样适用于其他血清型蓝舌病毒。
Claims (7)
1.一种用于荧光染色的重组蓝舌病毒，其特征在于，所述重组蓝舌病毒是在野生型蓝舌病毒非结构蛋白NS1的第493位氨基酸后插入TC标签获得；所述TC标签的氨基酸序列为CCPGCC；所述野生型蓝舌病毒为蓝舌病毒BTV-1型；所述非结构蛋白NS1的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的重组蓝舌病毒，其特征在于，所述野生型蓝舌病毒为BTV-1分离株GS/11。
3.一种重组蓝舌病毒的构建方法，其特征在于，所述方法为：通过基因工程手段在野生型蓝舌病毒非结构蛋白NS1的第493位氨基酸后插入TC标签获得；所述TC标签的氨基酸序列为CCPGCC；所述野生型蓝舌病毒为蓝舌病毒BTV-1型；所述非结构蛋白NS1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)在野生型蓝舌病毒S6基因CDS序列的第1479位碱基后插入TC标签的基因序列，构建获得含有TC标签的蓝舌病毒S6基因转录质粒；体外转录生成含有TC标签的S6 mRNA；
(2)分别构建野生型蓝舌病毒基因S1-S5、S7-S10的转录质粒，体外转录成mRNA转录本；
(3)将步骤(1)所述含有TC标签的S6 mRNA以及步骤(2)所述的mRNA转录本共转染细胞，筛选获得重组蓝舌病毒。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中含有TC标签的蓝舌病毒S6基因转录质粒的构建方法为：
以野生型蓝舌病毒S6基因为模板，通过PCR基因定点突变技术在野生型蓝舌病毒S6基因CDS序列的第1479位碱基后插入TC标签的基因序列，构建获得含有TC标签的蓝舌病毒S6基因转录质粒；所述TC标签的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述野生型蓝舌病毒为BTV-1分离株GS/11。
7.如权利要求1-2任一所述的重组蓝舌病毒在蓝舌病毒BTV-1型可视化定量检测或在蓝舌病毒BTV-1型NS1蛋白动态表达、定位和示踪研究中的应用。
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