CN105219887B - 用于分型检测猪博卡病毒的引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于分型检测猪博卡病毒的引物组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于分型检测猪博卡病毒的引物组、试剂盒及检测方法，属于病毒检测技术领域。所述引物组包括具有如Seq ID No.1至Seq ID No.6所示核苷酸序列的分别对应1型、2型、3型PBoV的上下游引物对。所述试剂盒包括所述引物组。本发明还提供了基于所述引物组和/或试剂盒的用于分型检测猪博卡病毒PBoV基因型的方法。采用本发明所述的引物组、试剂盒和/或方法鉴别博卡病毒PBoV亚型，具有特异性好、灵敏度高、准确性好、简捷高效等优点，为临床检测提供了新的可靠的技术手段。

Description

用于分型检测猪博卡病毒的引物组、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于分型检测猪博卡病毒的引物组、试剂盒及PCR方法。
背景技术
博卡病毒(bocavirus)为细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属的成员。猪博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)是2009年在患有仔猪断奶后多系统衰竭综合征的猪淋巴结中，通过随机置换扩增的方法和高通量测序技术在瑞典首次发现(Blomstrom A L,BelakS,Fossum C,et al.,2009)。其基因组大小在5.2kb左右，为无囊膜的单股线状DNA病毒(Mckillen J,Mcneilly F,Duffy C,et al.,2011)。PBoV除了与细小病毒科其他成员共有两个开放阅读框外(编码非结构性蛋白NS1的ORF1和编码重叠的衣壳蛋白VP1和VP2的ORF2)，其在非结构性和结构性编码区之中有第三个博卡病毒特征性的开放阅读框ORF3(Zeng S,Wang D,Fang L,et al.,2011)，编码一个高度磷酸化的非结构性蛋白质NP1。
研究人员起初按照病毒发现时间的先后顺序，根据ICTV(InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses,http://www.ictvdb.org/)的分类标准，当NS1基因的核苷酸同源性低于95％时，则定义为不同的基因型(翟少伦，陈胜男，魏文康，2012；ChengW X,Li J S,Huang C P,et al.,2010)。近年来，新的序列甚至新的基因型不断被发现，研究人员通过对基因组序列及NS1/VP1/NP1基因序列遗传进化分析发现，猪博卡病毒属总能出现明显的3个聚簇，根据发现的先后顺序，研究人员将这些聚簇定为3个型：PBoV1、PBoV2和PBoV3(Yang W Z,Yu J M,Li J S,et al.,2012；Xiao C T,Halbur P G,Opriessnig T,2013)。
PBoV自2009年发现以来，国内外许多国家均报道了它的流行。在临床样品中，经常能检测到不同亚型的PBoV感染，证明PBoV存在共感染的情况。Jiang等2014年的研究也揭示了共感染这一现象，PBoV的共感染在一定程度上，增加了不同PBoV基因型间发生重组的机率，易产生新的基因型，进而加速PBoV的序列进化。因此，对感染了PBoV的临床样品进行病毒基因型的分型确认检测显得十分必要。然而，PBoV基因型较多，研究认为，其可以分为PBoV1、PBoV2和PBoV3型。其中，PBoV3型是最大的一个聚簇，其又分为PBoV3A、PBoV3B、PBoV3C、PBoV3D和PBoV3E 5个亚型[7]，3型序列间同源性在76％到87.9％之间(周宏专，2014)。由于PBoV基因型众多，给临床检测带来一定困难。中国专利申请201410801967.X公开了一种猪博卡病毒1型、2型和3型多重PCR检测方法，即采用具有如下序列的三对引物：
PBoV1-F/R：TCAATGGTACGTGCCGATAT/TTATTCTGCTTCGCCTGGTT；
PBoV2-F/R：GAGGTATTCAGCCAGCACAT/AGYTCCTGCGGTTCTGTTTC；
PBoV3-F/R：TYTTGAACATCCAGGGCTAC/CCATACACCTTBACCGCVTK对PBoV1型、2型、3型进行多重PCR检测，但是，其仅仅采用已知的阳性PBoV1型、2型、3型质粒验证了上述引物能扩增出不同大小的条带，而没有给出上述引物在实际的猪粪便样品中的准确性检测数据；此外，采用上述引物的多重PCR方法，其检出限分别为8.189pg/ml(PBoV1)、10.28pg/ml(PBoV2)和9.405pg/ml(PBoV3)，灵敏度不算太高。
因此，目前市面上急需一种可以准确、有效、更灵敏地针对PBoV基因型进行分型检测的产品。
发明内容
本发明针对上述现有技术客观存在的缺陷和不足，提供了一种用于猪博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)分型检测引物组及基于该引物组的试剂盒。
本发明的技术方案如下：
用于分型检测猪博卡病毒PBoV基因型的引物组，包括如下核苷酸序列的分别对应1型、2型、3型PBoV的上下游引物对：
PBoV1F：GYGCCAAAACCAAGGTGCAA
PBoV1R：GAGCCTGTATCACCTATGTCA
PBoV2F：CTACAAGGGYGCTACACAC
PBoV2R：ATCCACGTTGTAGTAKGTGCT
PBoV3F：GTGATCAAGACTTTATCGACTCT
PBoV3R：GCYCCYTGTTCRTTATYWYCCA。
用于分型检测猪博卡病毒PBoV基因型的试剂盒，其包括上述的引物组。
所述试剂盒还包括用于PCR反应和/或电泳所需的试剂，包括但不限于DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、PCR反应缓冲液等等。
用于分型检测猪博卡病毒PBoV基因型的方法，采用上述的引物组或上述的试剂盒进行如下步骤：
(1)采用所述引物组对提取自待测样品的DNA进行PCR扩增；
(2)对扩增产物进行凝胶电泳。
所述PCR扩增的反应体系为：12.5μL的2×Es Taq Master Mix，终浓度分别为0.2μmol/L的PBoV1F/PBoV1R引物对，终浓度分别为0.2μmol/L的PBoV2F/PBoV2R引物对，终浓度分别为0.8μmol/L的PBoV3F/PBoV3R引物对，终浓度为0.8ng/μL的DNA模板，双蒸水补足至25μL。
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸35s，共35个循环；72℃延伸5min。
所述凝胶电泳检测指，采用含0.5μg/ml EB的1.5％的琼脂糖凝胶，于100V恒功率电泳分离，最后紫外灯下显影并拍照。
所述待测样品为包括但不限于猪粪便样品。
所述试剂盒的制备方法，组装试剂盒的试剂中包括上述的引物组。
所述组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂。
本发明根据PBoV的序列特性，提供了一组针对三种不同基因型的PBoV进行分型检测的引物组，包含分别扩增1/2/3型PBoV特异性片段的三对上下游引物对，它们的核苷酸序列分别如Seq ID No.1至Seq ID No.6所示。所述三对引物分别扩增出的1/2/3型PBoV特异性片段的长度分别为645bp、352bp、259bp。由此可见，利用本发明所述的引物组可以通过本领域常规的PCR、电泳等手段获知DNA模板中PBoV的具体基因型，并判断DNA模板所对应的临床样品感染的PBoV类型。具体而言，电泳结果仅显示有645bp的条带，则临床样品感染的是1型PBoV；电泳结果仅显示有352bp的条带，则临床样品感染的是2型PBoV；电泳结果仅显示有259bp的条带，则临床样品感染的是3型PBoV；若电泳结果出现645bp、352bp两种条带，说明临床样品为1型和2型PBoV共感染的情况；若电泳结果显示有645bp、259bp两种条带，则对应的临床样品为1型和3型PBoV混合感染；若电泳结果出现352bp和259bp两种条带，则说明临床样品为2型和3型PBoV共感染；若645bp、352bp、259bp三种条带均出现，则临床样品混合感染了三种亚型的PBoV。
基于上述的具有如Seq ID No.1至Seq ID No.6所示核苷酸序列的引物组，本发明还提供了包含所述引物组的试剂盒。所述试剂盒还可以包括本领域常规的、用于进行PCR扩增和/或电泳的试剂。采用本发明所述的试剂盒可以较为便捷有效地准确检测出临床样品中所感染的PBoV基因型，从而判断所述临床样品具体被哪种亚型的PBoV所感染。
进一步地，基于所述引物组和/或试剂盒，本发明还建立了一套用于分型检测猪博卡病毒PBoV基因型的三重PCR方法，在同一反应体系中可以同时检测3种基因型的猪博卡病毒。实验证实，本发明设计的3对引物，在进行三重PCR检测时，未见非特异性扩增(图3)，其扩增片段大小分别为632bp，352bp和259bp，能够在凝胶电泳中区分目的片段(图5)，且在58℃退火条件下能够扩增出清晰条带(图2)，达到了实验预期目的。更重要的是，经验证数据证明，与现有技术相比，本发明所述的引物组、试剂盒和/或基于它们的检测方法，具有更高的敏感性，可用于临床样品的检测。本发明检测方法的建立为猪博卡病毒三种不同基因型的高效检测提供了有效手段。
本发明还请求保护所述引物组和/或试剂盒的制备方法，任何出于商业目的的生产和/或销售本发明所述用于分型检测猪博卡病毒PBoV基因型的引物组和/或试剂盒的行为均属于本发明请求保护的范围。所述行为包括，组装试剂盒的试剂中包括本发明所述的引物组，和/或在用于分型检测猪博卡病毒PBoV基因型的商品包装内装有本发明所述的引物组。
本发明采集了京津冀地区猪腹泻样品，并利用本发明所述的引物组和/或试剂盒，采用了本发明所述的方法对上述样品进行PBoV基因型检测，结果与单项PCR检测结果相比，准确率达到100％。
本发明提供的用于分型检测猪博卡病毒PBoV基因型的引物组、试剂盒及基于它们的检测方法具有特异性好、灵敏度高、准确性好、简捷高效等优点，为临床检测提供了新的可靠的技术手段。
附图说明
图1是三重PCR反应体系中引物量的筛选结果，其中M:DL2000 DNA Marker；1～8：PBoV1/PBoV2/PBoV2引物量：0.5μL/0.5μL/1.5μL，0.5μL/0.5μL/2μL，0.5μL/1μL/1.5μL，0.5μL/1μL/2μL，1μL/0.5μL/1.5μL，1μL/0.5μL/2μL，1μL/1μL/1.5μL，1μL/1μL/2μL。
图2是三重PCR反应体系中退火温度的筛选结果，其中M:DL2000 DNA Marker；1～12：退火温度：48.0℃，48.3℃，49.0℃，50.2℃，51.7℃，53.3℃，54.7℃，56.3℃，57.8℃，59.0℃，59.7℃，60.0℃。
图3是三重PCR特异性试验检测结果，其中M:DL2000 DNA Marker；1：pEASY-BT1/pEASY-BT2/pEASY-BT3混合质粒模板；2～4：分别为pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3质粒模板；5～9：分别为PEDV、TGEV、PKoV、PCV和PRV的cDNA或DNA模板。
图4是三重PCR敏感性试验检测结果，其中M:DL2000DNA Marker；1-8：100-107倍稀释模板DNA。
图5是临床样品检测结果，其中M:DL2000DNA Marker；1-12：12份临床粪便样品，13为阴性样品。三重PCR检测(A)、PBoV1型检测(B)、PBoV2型检测(C)及PBoV3型检测(D)
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。
生物样品
分别含有PBoV1、PBoV2和PBoV3型VP1蛋白编码片段的阳性质粒pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3由本实验室构建保存。猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪库布病毒(PKoV)、猪圆环病毒(PCV)和伪狂犬病毒(PRV)的cDNA/DNA样品由本实验室制备保存。
其中，阳性质粒pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3的构建方法是：
根据GenBank上公布的PBoV序列，HQ291308(PBoV1型)、HQ291309(PBoV2型)和JF713714(PBoV3型)，分别设计引物对如下：
P11F ATGAATCAATTGTTTCCTGTGG，
P11R TTAGTTGATTCTGTTCATTCC；
P12F ATGGCACCCACGAATAGAAAGC，
P12R TTACAATACACGATTAATTCCG；
P13F ATGAGTCTTAAGCGCGGTCAG，
P13R TCACAGAACTTTTTCCAGC。
扩增片段大小分别为1863bp(PBoV1型)、2115bp(PBoV2型)和2052bp(PBoV3型)。按照pEASY-T5Zero Cloning Kit(购自北京全式金生物技术有限公司)试剂盒说明书克隆该片段，鉴定阳性后，分别命名为pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3。
临床粪便样品来源于2015年2月至8月间京津冀地区的部分腹泻猪场。
试剂与耗材
2×Es Taq MasterMix购自康为世纪生物制品有限公司，质粒提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒、Top10感受态细胞和病毒DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，DL2000DNA Marker购自TaKaRa有限公司。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规实验条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中所述的条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
实施例1、本发明所述的引物组
根据GenBank上公布的PBoV相关的序列信息(表1)，利用Lasergene软件套装中的Megalign软件，分析不同型PBoV的保守区，在病毒保守区分析的基础之上，利用Oligo 7软件设计简并引物(表2)，并由Invitrogen公司合成。
表1本试验参考的PBoV序列
Table 1 PBoV sequences used in this study
表2本试验所用的引物
由此得到本发明所述的引物组，包括分别对应1/2/3型PBoV的具有如表2中Seq IDNo.1至Seq ID No.6所示核苷酸序列的三对上下游引物对。该引物组可用于分型检测猪博卡病毒PBoV三种基因型。
实施例2、本发明所述的试剂盒
基于实施例1得到的引物组，组装本发明所述的用于分型检测猪博卡病毒PBoV基因型的试剂盒。所述试剂盒包括：包含了分别对应1/2/3型PBoV的具有如表2中Seq ID No.1至Seq ID No.6所示核苷酸序列的三对上下游引物对在内的引物组。
所述试剂盒还包括：PCR反应和/或电泳所需的试剂。具体地，所述用于PCR反应的常规试剂包括：10×Buffer、dNTP、Taq酶等，也可以是常见的可商购获得的PCR试剂盒、PCR反应Mix等，如2×Es Taq Master Mix；所述电泳所需的试剂包括电泳缓冲液、琼脂糖、溴化乙锭(EB)等。
实施例3、本发明所述引物组/试剂盒的性能验证
1方法
1.1标准品的制备
将含有PBoV1、PBoV2和PBoV3型VP1蛋白编码片段的阳性质粒pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3，用核酸分析仪检测浓度。根据浓度测定结果，将阳性质粒用ddH2O稀释，并将3种质粒浓度都稀释至20ng/μL，再将其等量混合即为质粒标准品。
1.2反应条件的优化
本发明建立的PCR反应体系为25μL，其中加入2×Es Taq Master Mix 12.5μL，pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3阳性混合质粒模板3μL，引物的起始浓度均为10μmol/L，引物体积在0.5μL-2μL之间调整，以确定最适宜的引物体积。在最佳引物量确定的基础上，进一步优化反应的退火温度，退火温度选择在48℃-60℃范围内进行优化，以确定最适宜的退火温度。
1.3特异性实验
利用建立的三重PCR体系，检测pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3的阳性质粒模板和猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪库布病毒(PKoV)、猪圆环病毒(PCV)和伪狂犬病毒(PRV)的cDNA/DNA样品，以检测所建立的三重PCR体系的特异性。
上述cDNA/DNA样品经PCR扩增后获得的PCR产物通过凝胶电泳进行结果检测。所述凝胶电泳检测指，采用含0.5μg/ml EB的1.5％的琼脂糖凝胶，于100V恒功率电泳分离，最后紫外灯下显影并拍照。
1.4敏感性实验
将1.2.2中稀释后等量混合的pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3阳性质粒模板(质粒标准品)10倍梯度稀释后，加入到本实验建立的三重PCR体系，利用最佳引物体积和最适宜反应温度进行扩增，以检测三重PCR体系的敏感性。
2结果
2.1三重PCR反应条件优化结果
由于PBoV3的引物中含有较多的简并碱基，而PBoV1和PBoV2的引物中含有的简并碱基较少或不含简并碱基。因此PBoV1和PBoV2的引物选择0.5μL和1μL(10μmol/L)2个浓度梯度，PBoV3的引物选择1.5μL和2μL(10μmol/L)2个浓度梯度相互组合，筛选最适宜引物浓度。最终PBoV1/PBoV2/PBoV2引物量(10μmol/L)选择如下8种组合：0.5μL/0.5μL/1.5μL、0.5μL/0.5μL/2μL、0.5μL/1μL/1.5μL、0.5μL/1μL/2μL、1μL/0.5μL/1.5μL、1μL/0.5μL/2μL、1μL/1μL/1.5μL和1μL/1μL/2μL。扩增结果如图1所示，当PCR体系中PBoV1/PBoV2型引物量均为0.5μL时，PBoV3型条带扩增较好；且PBoV3型引物量为2μL时，PBoV1/PBoV2/PBoV3型3个目的条带均能得到很好的扩增，条带大小分别为632bp,352bp和259bp，与预期相符。
在最适宜温度的优化实验中，使用设计的3对引物在48℃-60℃范围内均能扩增出预期的目的条带(图2)。随着温度的不断升高，PBoV1型目的条带(632bp)扩增较好，但PBoV2目的条带(352bp)和PBoV3型目的条带(259bp)条带变弱。从图2中看出当温度为57.8℃时，PBoV1/PBoV2/PBoV3型3个目的条带均能得到很好的扩增，且条带大小均与预期相符。
通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定三重PCR反应体系为：2×Es TaqMaster Mix 12.5μL，PBoV1F/PBoV1R(10μmol/L)各0.5μL，PBoV2F/PBoV2R(10μmol/L)各0.5μL，PBoV3F/PBoV3R(10μmol/L)各2μL,模板3μL，加双蒸水补足至25μL；最佳反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸35s，共35个循环，72℃延伸5min。
2.2特异性实验
用建立的三重PCR方法检测pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3阳性混合质粒和单个质粒，均能得到预期的条带；而对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪库布病毒(PKoV)、猪圆环病毒(PCV)和伪狂犬病毒(PRV)的cDNA/DNA样品检测则没有条带出现(图3)，说明该方法具有较好的特异性。
2.3敏感性试验结果
用双蒸水将pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3阳性混合质粒进行10倍梯度稀释，使用建立的三重PCR体系进行扩增。从图4中可以看出，利用该三重PCR扩增体系，阳性模板稀释106后，仍能扩增出相应的目的条带，其最低检测限为0.8×10-6ng/μL(0.8pg/ml)。
实施例4、本发明所述引物组/试剂盒的临床样品检测
1.临床样品检测方法
将来自京津冀地区的临床收集粪便样品，以1:5(w/v)的比例加入PBS稀释，在涡旋仪上震荡混合后，2000×g，2mim离心后取上清液，分装后存于-80℃备用。使用时按照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书提取DNA作为模板进行三重PCR检测。以部分检出过PBoV的临床样品作为模板，使用建立的三重PCR方法和单项PCR方法分别检测，以比较检测结果的符合情况。
2.临床样品检测结果
利用建立的三重PCR方法，对实验室2015年2月至8月间从京津冀地区猪场采集到的12份PBoV阳性粪便样品以及PBoV阴性粪便样品进行检测，同时与单项PCR检测结果比较。结果显示使用三重PCR体系的扩增结果与单项PCR扩增结果一致，阴性样品均未检出，符合率为100％(图5)。

Claims (10)

1.用于分型检测猪博卡病毒PBoV基因型的引物组，其特征在于，包括如下核苷酸序列的分别对应1型、2型、3型PBoV的上下游引物对：
PBoV1F：GYGCCAAAACCAAGGTGCAA；
PBoV1R：GAGCCTGTATCACCTATGTCA；
PBoV2F：CTACAAGGGYGCTACACAC；
PBoV2R：ATCCACGTTGTAGTAKGTGCT；
PBoV3F：GTGATCAAGACTTTATCGACTCT；
PBoV3R：GCYCCYTGTTCRTTATYWYCCA。
2.用于分型检测猪博卡病毒PBoV基因型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于PCR反应和/或电泳所需的试剂。
4.权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂盒在制备用于分型检测猪博卡病毒pBoV基因型试剂中的用途。
5.权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂盒的非诊断目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：
(1)采用所述引物组对提取自待测样品的DNA进行PCR扩增；
(2)对扩增产物进行凝胶电泳检测。
6.根据权利要求5所述的使用方法，其中所述PCR扩增的反应体系为：12.5μL的2×EsTaq Master Mix，终浓度分别为0.2μmol/L的PBoV1F/PBoV1R引物对，终浓度分别为0.2μmol/L的PBoV2F/PBoV2R引物对，终浓度分别为0.8μmol/L的PBoV3F/PBoV3R引物对，终浓度为0.8ng/μL的DNA模板，双蒸水补足至25μL。
7.根据权利要求5或6所述的使用方法，其中所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸35s，共35个循环；72℃延伸5min。
8.根据权利要求5所述的使用方法，其中所述凝胶电泳检测指，采用含0.5μg/mlEB的1.5％的琼脂糖凝胶，于100V恒功率电泳分离，最后紫外灯下显影并拍照。
9.权利要求2或3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，组装试剂盒的试剂中包括权利要求1所述的引物组。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂。
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