JP2022527740A - 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本開示は、標的DNA分子(例えばゲノム)のプライム編集を行うための組成物および方法を提供し、これは、ヌクレオチド変化の組み込みおよび/または標的化された変異導入を可能化する。ヌクレオチド変化は、1ヌクレオチド変化(例えば、いずれかのトランジションまたはいずれかのトランスバージョン)、1つ以上のヌクレオチドの挿入、または1つ以上のヌクレオチドの欠失を包含し得る。より具体的には、本開示は、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)とポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)とを含む融合タンパク質を提供し、これは、PEgRNAと名付けられた改変されたガイドRNAによって特定のDNA配列へとガイドされる。PEgRNAは、DNA合成鋳型配列を提供する(標準ガイドRNAに対して相対的に)伸長された部分を含むように変改されている。これは一本鎖DNAフラップをコードし、これは編集されるべき標的化された内生DNA配列の鎖に対して相同であるが、これは所望の1つ以上のヌクレオチド変化を含有し、かつこれはポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)による合成後に標的DNA分子上に組み込まれるようになる。プライム編集を活用する種々の方法もまた本願において開示され、トリヌクレオチド反復縮小疾患を処置すること、標的化されたペプチドタグを組み入れること、保護変異の組み入れによってプリオン病を処置すること、RNAの機能および発現をコントロールするためのRNAタグの組み入れのためにRNAをコードする遺伝子を操作すること、プライム編集を用いて高性能遺伝子ライブラリを構築すること、プライム編集を用いて免疫エピトープをタンパク質上に挿入すること、誘導可能な二量体化ドメインをタンパク質標的上に挿入するためのプライム編集の使用、ならびに送達方法を、とりわけ包含する。

Description

政府の支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金第U01AI142756号、第RM1HG009490号、第R01EB022376号、および第R35GM118062号の下、政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

関連出願および参照による組み込み
この米国仮出願は、以下の出願、つまり、2019年3月19日出願の米国仮出願第62/820,813号(代理人整理番号B1195.70074US00)、2019年6月7日出願の米国仮出願第62/858,958号(代理人整理番号B1195.70074US01)、2019年8月21日出願の米国仮出願第62/889,996号(代理人整理番号B1195.70074US02)、2019年8月21日出願の米国仮出願第62/922,654号(代理人整理番号B1195.70083US00)、2019年10月10日出願の米国仮出願第62/913,553号(代理人整理番号B1195.70074US03)、2019年10月10日出願の米国仮出願第62/973,558号(代理人整理番号B1195.70083US01)、2019年11月5日出願の米国仮出願第62/931,195号(代理人整理番号B1195.70074US04)、2019年12月5日出願の米国仮出願第62/944,231号(代理人整理番号B1195.70074US05)、2019年12月5日出願の米国仮出願第62/974,537号(代理人整理番号B1195.70083US02)、2020年3月17日出願の米国仮出願第62/991,069号(代理人整理番号B1195.70074US06)、および2020年3月17日出願の米国仮出願(これを出願する時点で連番は入手不可能)(代理人整理番号B1195.70083US03)を指し、参照により組み込む。

本発明の背景
病原性のある単一ヌクレオチド突然変異は、ある推計によれば遺伝的要素が存在するヒト疾患のおよそ50％に寄与する⁷。残念ながら、これら遺伝性障害をもつ患者にとっての処置の選択肢は、数十年に及ぶ遺伝子治療探索に関わらず、依然として極度に限定的である⁸。おそらく、この治療上の課題への最も簡素な解決策は患者ゲノム中の単一ヌクレオチド突然変異の直接的な修正であって、これは疾患の根本的原因に対処し、かつ永続する恩恵を提供するかもしれない。かかるストラテジーはこれまでに考えられないことであったが、CRISRP/Cas系⁹の到来によってもたらされたゲノム編集性能における近年の改善は今や、この治療的アプローチを射程圏内に入れる。標的DNA配列に相補的な～20ヌクレオチドを含有するガイドRNA(gRNA)配列の簡単なデザインによって、想定されるほぼ全てのゲノム部位は、CRISPR関連(Cas)ヌクレアーゼによって特異的にアクセスされ得る^1,2。今日まで、数種の単量体細菌性Casヌクレアーゼ系が同定されており、ゲノム編集用途に適応された¹⁰。このCasヌクレアーゼの天然の多様性は、増え続ける改変バリアントの一群と併せて^11～14、新しいゲノム編集技術を開発するための肥沃な土壌を用意する。

CRISPRでの遺伝子破壊は今や成熟した技法であるとはいえ、ヒトゲノム中の単一塩基対の高精度編集は依然として大きな課題である³。相同組み換え修復(Homology directed repair)(HDR)は長い間、ヒト細胞および他の生物において、所望の編集をコードするドナーDNA修復鋳型を使用しDNA配列を二本鎖切断(double strand break)(DSB)の部位にて挿入、修正、または交換(exchange)するために使用されてきた¹⁵。しかしながら、既存のHDRは、ほとんどのヒト細胞型において、具体的に非分裂細胞において、極めて低い効率を有し、両立しない非相同末端結合(non-homologous end joining)(NHEJ)は、主として挿入-欠失(インデル(indel))副産物に繋がる¹⁶。他の問題点はDSBの生成に関するが、これは標的遺伝子座にて大きな染色体再配置および欠失を生じさせ得るか¹⁷、または成長停止(growth arrest)およびアポトーシスに繋がるp53軸を活性化する^18,19。

数種のアプローチがHDRのこれら欠点に対処するために探索されてきた。例えば、単鎖DNA破壊(ニック)のオリゴヌクレオチドドナーでの修復は、インデル形成を低減することが示されたが、所望の修復産物の収率は依然として低い²⁰。他のストラテジーは、小分子および生物学的試薬を使用して修復をNHEJよりHDRへ向かうよう偏らせることを試みている^21～23。しかしながら、これらの方法の有効性は細胞型に依存し得、正常な細胞状態の撹乱は、望ましくなくかつ予測不可能な効果へ繋がり得る。

近年、Devid Liu教授らが率いる本発明者らは、DSBを創出することもHDRに頼ることもなく標的ヌクレオチドを編集する技術として塩基編集を開発した^{4～6,24～27}。Cas融合デアミナーゼによるDNA塩基の直接修飾は、極めて高効率の短い標的窓(short target window)(～5～7塩基)におけるC・G→T・AまたはA・T→G・C塩基対変換を可能にさせる。結果として、塩基編集因子(base editors)は科学界によって迅速に採用された。しかしながら、以下の因子は、高精度ゲノム編集のためのそれらの一般性を限定する:(1)標的窓上の非標的CまたはA塩基の「バイスタンダー(bystander)編集」が観察され;(2)標的ヌクレオチド産物混合物が観察され;(3)標的塩基はPAM配列の15±2ヌクレオチド上流に位置付けられなければならず;(5)小さい挿入および欠失変異の修復は可能ではない。

したがって、所望されるいずれの単一ヌクレオチドの変化も柔軟に導入することが可能であるか、および/または塩基対の挿入または欠失(例として、少なくとも1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、もしくはそれより多くの塩基対の挿入または欠失)を組み入れ得るか、および/または標的部位にてヌクレオチド配列を高い特異性および効率で変更もしくは修飾し得る、プログラム型編集因子の開発は、CRISPRに基づくゲノム編集技術の範囲(scope)および治療可能性を実質的に拡大するであろう。

本発明の概要
本発明は、「プライム編集」と呼ばれるゲノム編集のための全く新しいプラットホームを記載する。プライム編集は、ポリメラーゼ(すなわち、融合タンパク質の形態であるか、または別様にnapDNAbpとはtransで提供される)と共働する核酸プログラム型DNA結合タンパク質(「napDNAbp」)を使用して、新しい遺伝情報を特定DNA部位中へ直接書き込む多目的かつ正確なゲノム編集方法であるが、プライム編集系は、ガイドRNA上へ(例として、ガイドRNAの5'末もしくは3'末にて、または内部にて)改変される伸長(extension)(DNAまたはRNAのいずれか)を経由する置き換えDNA鎖の形態での所望の編集の合成のための標的部位と鋳型との両方を特定するプライム編集(PE)ガイドRNA(「PEgRNA」)でプログラムされる。所望の編集(例として、単一核酸塩基の置換)を含有する置き換え鎖は、編集されるべき標的部位(それが所望の編集を包含するのは例外として)の内生鎖と同じ配列を共有する。DNA修復および/または複製機構を通して、標的部位の内生鎖は、所望の編集を含有する新しく合成された置き換え鎖によって置き換えられる。いくつかのケースにおいて、本明細書に記載のとおりのプライム編集因子は、編集されるべき所望の標的部位を探査し位置付けるのみならず、同時に、内生DNA鎖の対応する標的部位の代わりに組み入れられる所望の編集を含有する置き換え鎖をコードするところ、プライム編集は「探査-と-置き換え(search-and-replace)」ゲノム編集技術であると考えられることもある。

本開示のプライム編集因子は、標的にプライムされた(target-primed)逆転写(TPRT)または「プライム編集」の機序が、効率および遺伝子の融通性(genetic flexibility)が高い高精度CRISPR/Casベースのゲノム編集を(例として、図1A～1Fの様々な態様において描かれているとおり)行うために活用または採用され得るという発見に、一部関する。TPRTは天然には、哺乳動物の非LTRレトロトランスポゾンおよび細菌のグループIIイントロンなどの可動DNA因子(mobile DNA elements)によって使用される^28,29。本発明者らは本明細書中、特定のDNA配列をガイドRNAで標的にし、標的部位にて単鎖ニックを生成し、およびニック入りDNAを、ガイドRNAで取り入れられた改変逆転写酵素鋳型の逆転写のためのプライマーとして使用する、Casタンパク質-逆転写酵素の融合体または関連する系を使用している。しかしながら、この概念は逆転写酵素をDNAポリメラーゼの構成要素として使用するプライム編集因子から始まったものの、本明細書に記載のプライム編集因子は逆転写酵素に限定されず、事実上はDNAポリメラーゼの使用を包含していてもよい。実際に本出願は全体を通し「逆転写酵素」をもつプライム編集因子に言及することもあるが、逆転写酵素は、プライム編集で働き得る唯一のタイプのDNAポリメラーゼであることが本明細書に説明されている。よって、本明細書のどこで「逆転写酵素」に言及しようとも、当業者は、いずれの好適なDNAポリメラーゼも逆転写酵素の代わりに使用されてもよいことを解するはずである。よって、一側面において、プライム編集因子は、標的DNA中の相補的なプロトスペーサーとアニールするスペーサー配列を含有する特化されたガイドRNA(すなわち、PEgRNA)とDNA配列を結び付けることによってDNA配列を標的にするようプログラムされているCas9(または等価なnapDNAbp)を含んでいてもよい。特化されたガイドRNAはまた、対応する内生DNA鎖を標的部位にて置き換えるために使用される所望の遺伝子変更を含有するDNAの置き換え鎖をコードする伸長という形態で、新しい遺伝情報も含有する。情報をPEgRNAから標的DNAへ伝達するため、プライム編集の機序は、3'ヒドロキシル基を晒すDNAの一方の鎖中の標的部位にニックを入れることを伴う。晒される3'ヒドロキシル基は次いで、PEgRNA上の、編集をコードする伸長の、標的部位中への直接的なDNA重合をプライムするのに使用され得る。様々な態様において、伸長－これは編集を含有する置き換え鎖の重合のための鋳型を提供する－は、RNAまたはDNAから形成され得る。RNA伸長のケースにおいて、プライム編集因子のポリメラーゼは、RNA依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素など)であり得る。DNA伸長のケースにおいて、プライム編集因子のポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼであってもよい。

本明細書に開示のプライム編集因子によって形成された、新しく合成された鎖(すなわち、所望の編集を含有する置き換えDNA鎖)は、所望のヌクレオチド変化(例として、単一ヌクレオチドの変化、欠失、もしくは挿入、またはそれらの組み合わせ)を包含することを除けば、ゲノムの標的配列と相同である(すなわち、これと同じ配列を有する)であろう。新しく合成された(または置き換え)DNAの鎖はまた、単鎖DNAフラップと称されることもあるが、これはハイブリダイゼーションを相補的な相同の内生DNA鎖と競合し、これによって対応する内生鎖に取って代わる。ある態様において、系は、エラーを起こしやすい(error-prone)逆転写酵素(例として、Cas9ドメインとの融合タンパク質として提供されるか、またはCas9ドメインとはtransで提供される)の使用と組み合わせられ得る。エラーを起こしやすい逆転写酵素は、単鎖DNAフラップ合成の最中に変更を導入し得る。よって、ある態様において、エラーを起こしやすい逆転写酵素は、ヌクレオチド変化を標的DNAへ導入するために利用され得る。系とともに使用される、エラーを起こしやすい逆転写酵素に応じて、変化はランダムまたは非ランダムであり得る。

ハイブリダイズされた中間体(内生DNA鎖とハイブリダイズされた逆転写酵素によって合成された単鎖DNAフラップを含む)の分解は、その結果得られる内生DNAの、取って代わられたフラップの(例として、5'末DNAフラップエンドヌクレアーゼ、FEN1での)除去、合成された単鎖DNAフラップの標的DNAへのライゲーション、ならびに細胞のDNA修復および/または複製プロセスの結果としての所望のヌクレオチド変化の同化を包含し得る。鋳型化(templated)DNA合成が、単一ヌクレオチドという高精度を、挿入および欠失を包含する、いずれのヌクレオチドの修飾にも付与することから、このアプローチの幅は極めて広く、基礎科学および治療法における無数の用途に使用され得ることが予見できる。

一側面において、本明細書は、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)と逆転写酵素とを含む融合タンパク質を提供する。種々の態様において、融合タンパク質は、伸長されたガイドRNAの存在下においてプライム標的にプライムされた逆転写によるゲノム編集を実行することができる。

ある態様において、napDNAbpはニッカーゼ活性を有する。napDNAbpは、Cas9タンパク質またはその機能的等価物、例えばヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)でもまたあり得る。

ある態様において、napDNAbpは:Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する。

他の態様において、融合タンパク質は、伸長されたガイドRNAと複合体化したときに標的DNA配列に結合することができる。

なお他の態様において、標的DNA配列は標的鎖および相補的な非標的鎖を含む。

他の態様において、伸長されたガイドRNAに対する複合体化した融合タンパク質の結合はRループを形成する。Rループは(i)伸長されたガイドRNAと標的鎖とを含むRNA-DNAハイブリッドおよび(ii)相補的な非標的鎖を含み得る。

なお他の態様において、相補的な非標的鎖はニッキングされて、遊離の3'端を有する逆転写酵素プライム配列を形成する。

種々の態様において、伸長されたガイドRNAは、(a)ガイドRNAと、(b)ガイドRNAの5'もしくは3'端またはガイドRNAの分子内の位置付けにおけるRNA伸長とを含む。RNA伸長は、(i)所望のヌクレオチド変化を含む逆転写鋳型配列と、(ii)逆転写プライマー結合部位と、(iii)任意にリンカー配列とを含み得る。種々の態様において、逆転写鋳型配列は、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし得、一本鎖DNAフラップは所望のヌクレオチド変化を含む。

様々な態様において、RNA伸長は、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。

なお他の態様において、一本鎖DNAフラップは、ニック部位に隣接する内生DNA配列にハイブリダイズし、それによって所望のヌクレオチド変化を組み入れ得る。なお他の態様において、一本鎖DNAフラップは、遊離の5'端を有しかつニック部位に隣接する内生DNA配列に取って代わる。ある態様において、5'端を有する取って代わられた内生DNAは細胞によって切除される。

種々の態様において、一本鎖DNAフラップの細胞性修復は所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。

種々の他の態様において、所望のヌクレオチド変化は、PAM配列の約-4～+10の間にある編集窓上に組み入れされる。

なお他の態様において、所望のヌクレオチド変化は、ニック部位の約-5～+5の間、またはニック部位の約-10～+10の間、またはニック部位の約-20～+20の間、またはニック部位の約-30～+30の間、またはニック部位の約-40～+40の間、またはニック部位の約-50～+50の間、またはニック部位の約-60～+60の間、またはニック部位の約-70～+70の間、またはニック部位の約-80～+80の間、またはニック部位の約-90～+90の間、またはニック部位の約-100～+100の間、またはニック部位の約-200～+200の間である編集窓上に組み入れされる。

種々の態様において、napDNAbpは配列番号18のアミノ酸配列を含む。種々の他の態様において、napDNAbpは、配列番号26～39、42～61、75～76、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487(Cas9);(SpCas9);配列番号77～86(CP-Cas9);配列番号18～25および87～88(SpCas9);および配列番号62～72(Cas12)のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含む。

他の態様において、開示される融合タンパク質および/または組成物の逆転写酵素は、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700～716、739～742、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含み得る。なお他の態様において、逆転写酵素は、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700～716、739～742、および766のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含み得る。これらの配列は例えばレトロウイルスもしくはレトロトランスポゾンからの天然に存在する逆転写酵素配列であり得るか、または配列は組み換えであり得る。

種々の他の態様において、本明細書に開示の融合タンパク質は種々の構造的構成を含み得る。例えば、融合タンパク質は構造NH₂-[napDNAbp]-[逆転写酵素]-COOH;またはNH₂-[逆転写酵素]-[napDNAbp]-COOHを含み得、「]-[」の夫々のものは任意のリンカー配列の存在を指示する。

種々の態様において、リンカー配列は、配列番号127、165～176、446、453、および767～769のアミノ酸配列、または配列番号127、165～176、446、453、および767～769のリンカーアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも80％、85％、もしくは90％、もしくは95％、もしくは99％同一であるアミノ酸配列を含む。

種々の態様において、標的DNA上に組み込まれる所望のヌクレオチド変化は、1ヌクレオチド変化(例えば、トランジションまたはトランスバージョン)、1つ以上のヌクレオチドの挿入、または1つ以上のヌクレオチドの欠失であり得る。

ある種のケースでは、挿入は、長さが少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、または少なくとも500ヌクレオチドである。

ある種の他のケースでは、欠失は、長さが少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、または少なくとも500ヌクレオチドである。

別の側面において、本開示はガイドRNAと少なくとも1つのRNA伸長とを含む伸長されたガイドRNAを提供する。RNA伸長はガイドRNAの3'端に位置取り得る。他の態様において、RNA伸長はガイドRNAの5'に位置取り得る。なお他の態様において、RNA伸長はガイドRNA上の分子内位置に位置取り得る。しかしながら、好ましくは、伸長された部分の分子内の位置取りはプロトスペーサーの機能を遮断しない。

様々な態様において、プライム編集因子ガイドRNA(PEgRNA)は、napDNAbpへ結合すること、およびnapDNAbpを標的DNA配列へ向かわせることが可能である。標的DNA配列は、標的鎖および相補的な非標的鎖を含み得るが、ここでガイドRNAは、標的鎖とハイブリダイズすることでRNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。

プライム編集因子ガイドRNAの様々な態様において、少なくとも1のRNA伸長は、DNA合成鋳型を含む。様々な他の態様において、RNA伸長は、逆転写プライマー結合部位をさらに含む。更なる他の態様において、RNA伸長は、RNA伸長をガイドRNAへ結び合わせるリンカーまたはスペーサーを含む。

様々な態様において、RNA伸長は、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドであり得る。

他の態様において、DNA合成鋳型(すなわち、図27につき、編集鋳型)は、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドである。

更なる他の態様において、逆転写プライマー結合部位配列(すなわち、図27につき、プライマー結合部位)は、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドである。

他の態様において、任意のリンカーまたはスペーサーは、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドである。

伸長されたガイドRNAの種々の態様では、逆転写鋳型配列は、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし得、一本鎖DNAフラップは所望のヌクレオチド変化を含む。一本鎖DNAフラップは内生一本鎖DNAをニック部位において取って代わられ得る。ニック部位における取って代わられた内生一本鎖DNAは5'端を有し得、内生フラップを形成し得、これは細胞によって切除され得る。種々の態様において、5'端の内生フラップの切除は産物形成を駆動し得る。なぜなら、5'端の内生フラップを除去することは、対応する相補的なDNA鎖に対する一本鎖3'DNAフラップのハイブリダイゼーションと、標的DNAへの一本鎖3'DNAフラップによって持たれる所望のヌクレオチド変化の組み込みまたは同化とを促すからである。

伸長されたガイドRNAの種々の態様では、一本鎖DNAフラップの細胞性修復は所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。

ある態様において、PEgRNAは、配列番号131、222、394、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、641、642、643、644、645、646、647、648、649、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、738、2997、2998、2999、3000、3001、3002、3003、3004、3005、3006、3007、3008、3009、3010、3011、3012、3013、3014、3015、3016、3017、3018、3019、3020、3021、3022、3023、3024、3025、3026、3027、3028、3029、3030、3031、3032、3033、3034、3035、3036、3037、3038、3039、3040、3041、3042、3043、3044、3045、3046、3047、3048、3049、3050、3051、3052、3053、3054、3055、3056、3057、3058、3059、3060、3061、3062、3063、3064、3065、3066、3067、3068、3069、3070、3071、3072、3073、3074、3075、3076、3077、3078、3079、3080、3081、3082、3083、3084、3085、3086、3087、3088、3089、3090、3091、3092、3093、3094、3095、3096、3097、3098、3099、3100、3101、3102、3103、3113、3114、3115、3116、3117、3118、3119、3120、3121、3305、3306、3307、3308、3309、3310、3311、3312、3313、3314、3315、3316、3317、3318、3319、3320、3321、3322、3323、3324、3325、3326、3327、3328、3329、3330、3331、3332、3333、3334、3335、3336、3337、3338、3339、3340、3341、3342、3343、3344、3345、3346、3347、3348、3349、3350、3351、3352、3353、3354、3355、3356、3357、3358、3359、3360、3361、3362、3363、3364、3365、3366、3367、3368、3369、3370、3371、3372、3373、3374、3375、3376、3377、3378、3379、3380、3381、3382、3383、3384、3385、3386、3387、3388、3389、3390、3391、3392、3393、3394、3395、3396、3397、3398、3399、3400、3401、3402、3403、3404、3405、3406、3407、3408、3409、3410、3411、3412、3413、3414、3415、3416、3417、3418、3419、3420、3421、3422、3423、3424、3425、3426、3427、3428、3429、3430、3431、3432、3433、3434、3435、3436、3437、3438、3439、3440、3441、3442、3443、3444、3445、3446、3447、3448、3449、3450、3451、3452、3453、3454、3455、3479、3480、3481、3482、3483、3484、3485、3486、3487、3488、3489、3490、3491、3492、3493、3522、3523、3524、3525、3526、3527、3528、3529、3530、3531、3532、3533、3534、3535、3536、3537、3538、3539、3540、3549、3550、3551、3552、3553、3554、3555、3556、3628、3629、3630、3631、3632、3633、3634、3635、3636、3637、3638、3639、3640、3641、3642、3643、3644、3645、3646、3647、3648、3649、3650、3651、3652、3653、3654、3655、3656、3657、3658、3659、3660、3661、3662、3663、3664、3665、3666、3667、3668、3669、3670、3671、3672、3673、3674、3675、3676、3677、3678、3679、3680、3681、3682、3683、3684、3685、3686、3687、3688、3689、3690、3691、3692、3693、3694、3695、3696、3697、3698、3755、3756、3757、3758、3759、3760、3761、3762、3763、3764、3765、3766、3767、3768、3769、3770、3771、3772、3773、3774、3775、3776、3777、3778、3779、3780、3781、3782、3783、3784、3785、3786、3787、3788、3789、3790、3791、3792、3793、3794、3795、3796、3797、3798、3799、3800、3801、3802、3803、3804、3805、3806、3807、3808、3809、および3810のヌクレオチド配列、または配列番号131、222、394、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、641、642、643、644、645、646、647、648、649、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、738、2997、2998、2999、3000、3001、3002、3003、3004、3005、3006、3007、3008、3009、3010、3011、3012、3013、3014、3015、3016、3017、3018、3019、3020、3021、3022、3023、3024、3025、3026、3027、3028、3029、3030、3031、3032、3033、3034、3035、3036、3037、3038、3039、3040、3041、3042、3043、3044、3045、3046、3047、3048、3049、3050、3051、3052、3053、3054、3055、3056、3057、3058、3059、3060、3061、3062、3063、3064、3065、3066、3067、3068、3069、3070、3071、3072、3073、3074、3075、3076、3077、3078、3079、3080、3081、3082、3083、3084、3085、3086、3087、3088、3089、3090、3091、3092、3093、3094、3095、3096、3097、3098、3099、3100、3101、3102、3103、3113、3114、3115、3116、3117、3118、3119、3120、3121、3305、3306、3307、3308、3309、3310、3311、3312、3313、3314、3315、3316、3317、3318、3319、3320、3321、3322、3323、3324、3325、3326、3327、3328、3329、3330、3331、3332、3333、3334、3335、3336、3337、3338、3339、3340、3341、3342、3343、3344、3345、3346、3347、3348、3349、3350、3351、3352、3353、3354、3355、3356、3357、3358、3359、3360、3361、3362、3363、3364、3365、3366、3367、3368、3369、3370、3371、3372、3373、3374、3375、3376、3377、3378、3379、3380、3381、3382、3383、3384、3385、3386、3387、3388、3389、3390、3391、3392、3393、3394、3395、3396、3397、3398、3399、3400、3401、3402、3403、3404、3405、3406、3407、3408、3409、3410、3411、3412、3413、3414、3415、3416、3417、3418、3419、3420、3421、3422、3423、3424、3425、3426、3427、3428、3429、3430、3431、3432、3433、3434、3435、3436、3437、3438、3439、3440、3441、3442、3443、3444、3445、3446、3447、3448、3449、3450、3451、3452、3453、3454、3455、3479、3480、3481、3482、3483、3484、3485、3486、3487、3488、3489、3490、3491、3492、3493、3522、3523、3524、3525、3526、3527、3528、3529、3530、3531、3532、3533、3534、3535、3536、3537、3538、3539、3540、3549、3550、3551、3552、3553、3554、3555、3556、3628、3629、3630、3631、3632、3633、3634、3635、3636、3637、3638、3639、3640、3641、3642、3643、3644、3645、3646、3647、3648、3649、3650、3651、3652、3653、3654、3655、3656、3657、3658、3659、3660、3661、3662、3663、3664、3665、3666、3667、3668、3669、3670、3671、3672、3673、3674、3675、3676、3677、3678、3679、3680、3681、3682、3683、3684、3685、3686、3687、3688、3689、3690、3691、3692、3693、3694、3695、3696、3697、3698、3755、3756、3757、3758、3759、3760、3761、3762、3763、3764、3765、3766、3767、3768、3769、3770、3771、3772、3773、3774、3775、3776、3777、3778、3779、3780、3781、3782、3783、3784、3785、3786、3787、3788、3789、3790、3791、3792、3793、3794、3795、3796、3797、3798、3799、3800、3801、3802、3803、3804、3805、3806、3807、3808、3809、および3810のいずれか1つと少なくとも85％、もしくは少なくとも90％、もしくは少なくとも95％、もしくは少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

本発明のもう1つの側面において、本明細書は、本明細書に記載の融合タンパク質および上に記載のいずれかの伸長されたガイドRNAを含む複合体を提供する。

本発明の更なる他の側面において、本明細書は、napDNAbpおよび伸長されたガイドRNAを含む複合体を提供する。napDNAbpは、Cas9ニッカーゼであり得るか、あるいは配列番号42～57(Cas9ニッカーゼ)および65(AsCas12aニッカーゼ)のアミノ酸配列、または配列番号42～57(Cas9ニッカーゼ)および65(AsCas12aニッカーゼ)のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％同一のアミノ酸配列であり得る。

複合体を伴う様々な態様において、伸長されたガイドRNAは、napDNAbpを標的DNA配列へ向かわせることが可能である。様々な態様において、逆転写酵素はtransで提供されてもよい、すなわち、複合体自体とは異なる供給源から提供されてもよい。例えば、逆転写酵素は、逆転写酵素を個別にコードする別々のベクターを導入することによって、複合体を有する同じ細胞へ提供され得る。

さらに別の側面において、本明細書はポリヌクレオチドを提供する。ある態様において、ポリヌクレオチドは本明細書に開示の融合タンパク質のいずれかをコードし得る。ある種の他の態様において、ポリヌクレオチドは本明細書に開示のnapDNAbpのいずれかをコードし得る。なおさらなる態様では、ポリヌクレオチドは本明細書に開示の逆転写酵素のいずれかをコードし得る。さらに他の態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示の伸長されたガイドRNAのいずれか、逆転写鋳型配列のいずれか、または逆転写プライマー部位のいずれか、または任意のリンカー配列のいずれかをコードし得る。

なお他の側面では、本明細書は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。それゆえに、ある態様において、ベクターは、napDNAbpと逆転写酵素とを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。他の態様において、ベクターは、napDNAbpと逆転写酵素とを別個にコードするポリヌクレオチドを含む。なお他の態様において、ベクターは、伸長されたガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを含み得る。種々の態様において、ベクターは、napDNAbpと逆転写酵素と伸長されたガイドRNAとをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを同じかまたは別個のベクター上に含み得る。

なお他の側面では、本明細書は、本明細書に記載の融合タンパク質と伸長されたガイドRNAとを含む細胞を提供する。細胞は融合タンパク質とnapDNAbpと逆転写酵素と伸長されたガイドRNAとを含むベクターによって形質転換され得る。これらの遺伝子要素は同じベクター上にまたは異なるベクター上に含まれ得る。

もう1つの側面において、本明細書は、医薬組成物を提供する。ある態様において、医薬組成物は、napDNAbp、融合タンパク質、逆転写酵素、および伸長されたガイドRNAのうち1以上を含む。ある態様において、本明細書に記載の融合タンパク質および薬学的に許容し得る賦形剤。他の態様において、医薬組成物は、本明細書に記載のいずれの伸長ガイドRNAおよび薬学的に許容し得る賦形剤を含む。更なる他の態様において、医薬組成物は、本明細書に記載のいずれの伸長ガイドRNAを、本明細書に記載のいずれの融合タンパク質および薬学的に許容し得る賦形剤と組み合わせて含む。もう1つの他の態様において、医薬組成物は、napDNAbp、融合タンパク質、逆転写酵素、および伸長されたガイドRNAのうち1以上をコードするいずれのポリヌクレオチド配列も含む。更なる他の態様において、本明細書に開示の様々な構成要素は、1以上の医薬組成物中へ分離されていてもよい。例えば、第1医薬組成物は、融合タンパク質またはnapDNAbpを含んでいてもよく、第2医薬組成物は、逆転写酵素を含んでいてもよく、および第3医薬組成物は、伸長されたガイドRNAを含んでいてもよい。

またさらなる側面において、本開示は、キットを提供する。一態様において、キットは、融合タンパク質、napDNAbp、逆転写酵素、および伸長されたガイドRNAを包含する1以上の構成要素をコードする1以上のポリヌクレオチドを含む。キットはまた、本明細書に開示のいずれの融合タンパク質、napDNAbp、または逆転写酵素を包含する、ベクター、細胞、およびポリペプチドの単離された調製物も含んでいてよい。

もう1つの側面において、本開示は、開示された組成物(compositions of matter)を使用する方法を提供する。

1つの態様では、方法は、所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列上に組み入れるための方法に関する。方法は、第1に、二本鎖DNA配列を融合タンパク質と伸長されたガイドRNAとを含む複合体と接触させることを含み、融合タンパク質はnapDNAbpおよび逆転写酵素を含み、伸長されたガイドRNAは、所望のヌクレオチド変化を含む逆転写鋳型配列を含む。次に、方法には、非標的鎖上で二本鎖DNA配列へニックを入れることが関わり、それによって3'端を有する遊離の一本鎖DNAを生成する。それから、方法には、遊離の一本鎖DNAの3'端を逆転写鋳型配列にハイブリダイズさせることが関わり、それによって逆転写酵素ドメインをプライムする。それから、方法には、DNAの鎖を3'端から重合することが関わり、それによって所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを生成する。それから、方法には、カットされた部位に隣接する内生DNA鎖を一本鎖DNAフラップによって置き換えることが関わり、それによって所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列上に組み入れる。

他の態様において、本開示は、標的遺伝子座にてDNA分子のヌクレオチド配列中に1以上の変化を導入するための方法を提供するが、DNA分子を、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)とnapDNAbpに標的遺伝子座を標的にさせるガイドRNAとに接触させることを含み、ここでガイドRNAは、少なくとも1の所望のヌクレオチド変化を含む逆転写酵素(RT)鋳型配列を含む。次に、方法は、標的遺伝子座にてDNA鎖中に、晒された3'末を形成すること、次いで、晒された3'末をRT鋳型配列とハイブリダイズさせることで逆転写をプライムすることを伴う。次に、RT鋳型配列に基づき少なくとも1の所望のヌクレオチド変化を含む単鎖DNAフラップは、逆転写酵素によって合成または重合される。最後に、少なくとも1の所望のヌクレオチド変化は、対応する内生DNA中へ組み込まれ、これによって標的遺伝子座にてDNA分子のヌクレオチド配列中に1以上の変化が導入される。

更なる他の態様において、本開示は、標的にプライムされた逆転写によって、標的遺伝子座にてDNA分子のヌクレオチド配列中に1以上の変化を導入するための方法を提供するが、方法は、以下:(a)標的遺伝子座にてDNA分子を、i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)と逆転写酵素とを含む融合タンパク質、および(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAに接触させること;(b)RT鋳型の標的にプライムされた逆転写に、所望のヌクレオチド変化を含む単鎖DNAを生成させること;(c)DNA修復および/または複製プロセスを通して標的遺伝子座にてDNA分子中への所望のヌクレオチド変化を組み込むこと、を含む。

ある態様において、内生DNA鎖を置き換えるステップは以下を含む:(i)単鎖DNAフラップを切断部位に隣接する内生DNA鎖とハイブリダイズさせることで、配列ミスマッチを創出すること;(ii)内生DNA鎖を切除すること;および(iii)ミスマッチを修復することで、DNAの両鎖中に所望のヌクレオチド変化を含む所望の産物を形成すること。

種々の態様において、所望のヌクレオチド変化は1ヌクレオチド置換(例えば、トランジションまたはトランスバージョン変化)、欠失、または挿入であり得る。例えば、所望のヌクレオチド変化は、(1)GからTの置換、(2)GからAの置換、(3)GからCの置換、(4)TからGの置換、(5)TからAの置換、(6)TからCの置換、(7)CからGの置換、(8)CからTの置換、(9)CからAの置換、(10)AからTの置換、(11)AからGの置換、または(12)AからCの置換であり得る。

他の態様において、所望のヌクレオチド変化は、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変換し得る。

なお他の態様において、方法は、挿入である所望のヌクレオチド変化を導入する。ある種のケースでは、挿入は長さが少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、または少なくとも500ヌクレオチドである。

他の態様において、方法は、欠失である所望のヌクレオチド変化を導入する。ある種の他のケースでは、欠失は長さが少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、または少なくとも500ヌクレオチドである。

種々の態様において、所望のヌクレオチド変化は疾患関連遺伝子を修正する。疾患関連遺伝子は:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連し得る。他の態様において、疾患関連遺伝子は:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連し得る。

本明細書に開示の方法は、ヌクレアーゼ不活性型(dead)Cas9(dCas9)、Cas9ニッカーゼ(nCas9)、またはヌクレアーゼ活性Cas9であるnapDNAbpを有する融合タンパク質を伴っていてもよい。他の態様において、napDNAbpおよび逆転写酵素は、単一の融合タンパク質としてはコードされていないが、むしろ別々の構築物中に提供され得る。よって、いくつかの態様において、逆転写酵素は(融合タンパク質としてよりむしろ)、napDNAbpに対しtransで提供され得る。

方法を伴う様々な態様において、napDNAbpは、配列番号26～61、75～76、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467および482～487(Cas9);(SpCas9);配列番号77～86(CP-Cas9);配列番号18～25および87～88(SpCas9);ならびに配列番号62～72(Cas12)のアミノ酸配列を含んでいてもよい。napDNAbpはまた、配列番号26～61、75～76、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467および482～487(Cas9);(SpCas9);配列番号77～86(CP-Cas9);配列番号18～25および87～88(SpCas9);ならびに配列番号62～72(Cas12)のいずれ1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一のアミノ酸配列も含んでいてもよい。

方法を伴う様々な態様において、逆転写酵素は、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700～716、739～742および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含んでいてもよい。逆転写酵素はまた、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700～716、739～742および766のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一のアミノ酸配列も含んでいてよい。

方法は、配列番号131、222、394、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、641、642、643、644、645、646、647、648、649、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、738、2997、2998、2999、3000、3001、3002、3003、3004、3005、3006、3007、3008、3009、3010、3011、3012、3013、3014、3015、3016、3017、3018、3019、3020、3021、3022、3023、3024、3025、3026、3027、3028、3029、3030、3031、3032、3033、3034、3035、3036、3037、3038、3039、3040、3041、3042、3043、3044、3045、3046、3047、3048、3049、3050、3051、3052、3053、3054、3055、3056、3057、3058、3059、3060、3061、3062、3063、3064、3065、3066、3067、3068、3069、3070、3071、3072、3073、3074、3075、3076、3077、3078、3079、3080、3081、3082、3083、3084、3085、3086、3087、3088、3089、3090、3091、3092、3093、3094、3095、3096、3097、3098、3099、3100、3101、3102、3103、3113、3114、3115、3116、3117、3118、3119、3120、3121、3305、3306、3307、3308、3309、3310、3311、3312、3313、3314、3315、3316、3317、3318、3319、3320、3321、3322、3323、3324、3325、3326、3327、3328、3329、3330、3331、3332、3333、3334、3335、3336、3337、3338、3339、3340、3341、3342、3343、3344、3345、3346、3347、3348、3349、3350、3351、3352、3353、3354、3355、3356、3357、3358、3359、3360、3361、3362、3363、3364、3365、3366、3367、3368、3369、3370、3371、3372、3373、3374、3375、3376、3377、3378、3379、3380、3381、3382、3383、3384、3385、3386、3387、3388、3389、3390、3391、3392、3393、3394、3395、3396、3397、3398、3399、3400、3401、3402、3403、3404、3405、3406、3407、3408、3409、3410、3411、3412、3413、3414、3415、3416、3417、3418、3419、3420、3421、3422、3423、3424、3425、3426、3427、3428、3429、3430、3431、3432、3433、3434、3435、3436、3437、3438、3439、3440、3441、3442、3443、3444、3445、3446、3447、3448、3449、3450、3451、3452、3453、3454、3455、3479、3480、3481、3482、3483、3484、3485、3486、3487、3488、3489、3490、3491、3492、3493、3522、3523、3524、3525、3526、3527、3528、3529、3530、3531、3532、3533、3534、3535、3536、3537、3538、3539、3540、3549、3550、3551、3552、3553、3554、3555、3556、3628、3629、3630、3631、3632、3633、3634、3635、3636、3637、3638、3639、3640、3641、3642、3643、3644、3645、3646、3647、3648、3649、3650、3651、3652、3653、3654、3655、3656、3657、3658、3659、3660、3661、3662、3663、3664、3665、3666、3667、3668、3669、3670、3671、3672、3673、3674、3675、3676、3677、3678、3679、3680、3681、3682、3683、3684、3685、3686、3687、3688、3689、3690、3691、3692、3693、3694、3695、3696、3697、3698、3755、3756、3757、3758、3759、3760、3761、3762、3763、3764、3765、3766、3767、3768、3769、3770、3771、3772、3773、3774、3775、3776、3777、3778、3779、3780、3781、3782、3783、3784、3785、3786、3787、3788、3789、3790、3791、3792、3793、3794、3795、3796、3797、3798、3799、3800、3801、3802、3803、3804、3805、3806、3807、3808、3809および3810のヌクレオチド配列、またはこれらと少なくとも80％、もしくは少なくとも85％、もしくは少なくとも90％、もしくは少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むPEgRNAの使用を伴っていてもよい。方法は、RNA伸長を3'末にて含む伸長されたガイドRNAの使用を含んでいてもよく、RNA伸長は逆転写酵素鋳型配列を含む。

方法は、5'端にRNA伸長を含む伸長されたガイドRNAの使用を含み得、RNA伸長は逆転写鋳型配列を含む。

方法は、ガイドRNAの分子内の位置付けにRNA伸長を含む伸長されたガイドRNAの使用を含み得、RNA伸長は逆転写鋳型配列を含む。

方法は、長さが少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、または少なくとも500ヌクレオチドである1以上のRNA伸長を有する伸長されたガイドRNAの使用を含んでもよい。

上記の概念、および下に考察される追加の概念は、いずれの好適な組み合わせでも並べられ得ることが解されるはずである(ただし、本開示はこの点において限定されない)。さらに、本開示の他の利点および新規特色は、添付の図と併せて考慮すれば、以下の様々な非限定的態様の詳細な記載から明らかであろう。

図面の簡単な記載
以下の図面は本明細書の一部を形成するものであって、これらの図面の1以上を、本明細書に提示される特定の態様の詳細な記載と組み合わせて参照することによってより良好に理解され得る、ある本開示の側面をさらに実証するために包含される。

図1Aは、伸長されたガイドRNA分子と複合したCas9タンパク質と融合した逆転写酵素を含む融合タンパク質を使用して、単一ヌクレオチドの変化、および/または挿入、および/または欠失をDNA分子(例として、ゲノム)中へ導入するための例示のプロセスの概略図を提供する。この態様において、ガイドRNAは、3'末にて伸長されていることで、逆転写酵素鋳型配列を包含する。概略図は、Cas9ニッカーゼと融合してガイドRNA(gRNA)と複合した逆転写酵素(RT)が、どのようにDNA標的部位に結合し、標的ヌクレオチドに隣接するPAM含有DNA鎖にニックを入れるのかを示す。RT酵素は、ニック入りDNAを、所望の編集をコードする新しいDNA鎖の合成のための鋳型として使用されるgRNAからのDNA合成のためのプライマーとして使用する。示される編集プロセスは、標的にプライムされた逆転写編集(TRT編集)、即ち「プライム編集」と称されてもよい。

図1Bは、プライム編集因子複合体がより一般的に[napDNAbp]-[P]:PEgRNAまたは[P]-[napDNAbp]:PEgRNAとして表されているということを例外として、図1Aと同じ図表を提供している。式中、「P」はいずれかのポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)を言い、「napDNAbp」は核酸プログラム型DNA結合タンパク質(例えばSpCas9)を言い、「PEgRNA」はプライム編集ガイドRNAを言い、「]-[」は任意のリンカーを言う。他所、例えば図3A-3Gに記載されているとおり、PEgRNAはプライマー結合部位とDNA合成鋳型とを含む5'伸長アームを含む。示されてはいないが、PEgRNAの伸長アーム(すなわち、これはプライマー結合部位およびDNA合成鋳型を含む)はDNAまたはRNAであり得るということが企図される。この構成で企図される具体的なポリメラーゼはDNA合成鋳型の性質に依存するであろう。例えば、DNA合成鋳型がRNAである場合には、ポリメラーゼはRNA依存性DNAポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)であり得る。DNA合成鋳型がDNAである場合には、ポリメラーゼはDNA依存性DNAポリメラーゼであり得る。

図1Cは、1ヌクレオチド変化および/または挿入および/または欠失をDNA分子(例えばゲノム)上に導入するための例示的プロセスの模式図を提供し、伸長されたガイドRNA分子との複合体としてCas9タンパク質に融合された逆転写酵素を含む融合タンパク質を用いる。この態様では、ガイドRNAは、逆転写酵素鋳型配列を包含するように5'端が伸長されている。模式図は、Cas9ニッカーゼに融合された逆転写酵素(RT)が、ガイドRNA(gRNA)との複合体として、どのようにしてDNA標的部位に結合し、標的ヌクレオチドに隣接するPAM含有DNA鎖へニックを入れるかを示している。RT酵素は、所望の編集をコードする新たなDNA鎖の合成のための鋳型として用いられるgRNAからのDNA合成のプライマーとして、ニッキングされたDNAを用いる。示されている編集プロセスは、プライム標的にプライムされた逆転写編集(TRT編集)または同等に「プライム編集」と言われ得る。

図1Dは、プライム編集因子複合体がより一般に、[napDNAbp]-[P]:PEgRNAまたは[P]-[napDNAbp]:PEgRNAPEgRNAとして表されることを除いて、図1Cと同じ描写を提供するが、ここで「P」は、いずれのポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)を指し、「napDNAbp」は、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(例として、SpCas9)を指し、および「PEgRNA」は、プライム編集ガイドRNAを指し、および「]-[」は、任意のリンカーを指す。他のどこか、例として図3A～3Gに記載のとおり、PEgRNAは、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型を含む3'伸長アームを含む。示されてはいないが、PEgRNAの伸長アーム(すなわち、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型を含む)はDNAまたはRNAであり得ることが企図される。この立体配置において企図される具体的なポリメラーゼは、DNA合成鋳型の性質に依存するであろう。実例として、DNA合成鋳型がRNAであると、ポリメラーゼはRNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)になり得る。DNA合成鋳型がDNAであると、ポリメラーゼはDNA依存性DNAポリメラーゼになり得る。様々な態様において、PEgRNAは、DNAベースのDNA合成鋳型を組み込むように改変または合成され得る。

図1Eは、合成された単DNAの鎖(所望のヌクレオチド変化を含む)が、所望のヌクレオチド変化がDNA中へ組み込まれるように、どのように分解されるのかという例示のプロセスを描く概略図である。示されるとおり、編集済鎖(または「変異誘発鎖」)の次の合成、内生鎖との平衡、内生鎖のフラップ切断、およびライゲーションは、内生DNA修復および/または複製プロセスの作用を通して、ミスマッチDNA二重鎖の分解後のDNA編集の組み込みに繋がる。

図1Fは、「反対鎖(opposite strand)へのニック入れ」が図1Eの分解方法の中へ組み込まれることで、所望の産物・対・復元産物の形成を推進するのに役立ち得ることを示す概略図である。反対鎖のニック入れにおいて、第2のCas9/gRNA複合体は、最初にニックが入った鎖の反対鎖上に第2ニックを導入するのに使用される。これは、未編集鎖(すなわち、第2ニック部位を含有する鎖)を優先的に置き換えるために、内生細胞のDNA修復および/または複製プロセスを誘導する。

図1Gは、伸長されたガイドRNAと複合体化された核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)を使用して、標的遺伝子座のDNA分子(例として、ゲノム)中へ単一ヌクレオチドの変化、および/または挿入、および/または欠失を導入するための例示のプロセスの別の概略図を提供する。このプロセスはプライム編集という態様として称されることもある。伸長されたガイドRNAは、ガイドRNAの3'末もしくは5'末にて、またはガイドRNA中の分子内のある場所にて伸長を含む。ステップ(a)において、napDNAbp/gRNA複合体はDNA分子に接触し、gRNAは標的遺伝子座へ結合するようにnapDNAbpをガイドする。ステップ(b)において、標的遺伝子座のDNA(Rループ鎖、またはPAM含有鎖、または非標的DNA鎖、またはプロトスペーサー鎖)の鎖の一方へニックが導入され(例として、ヌクレアーゼまたは化学剤によって)、これによって標的遺伝子座の鎖の一方に利用可能な3'末が創出される。ある態様において、ニックは、Rループ鎖に対応するDNAの鎖、すなわち、ガイドRNA配列とはハイブリダイズされない鎖に創出される。ステップ(c)において、3'末DNA鎖は、逆転写をプライムするためにガイドRNAの伸長された部分と相互作用する。いくつかの態様において、3'末DNA鎖は、ガイドRNAの伸長された部分上の特定のRTプライム配列とハイブリダイズする。ステップ(d)において、逆転写酵素が導入されて、プライムされた部位の3'末からガイドRNAの3'末へDNAの単鎖を合成する。これは、所望のヌクレオチド変化(例として、単一の塩基変化、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせ)を含む単鎖DNAフラップを形成する。ステップ(e)において、napDNAbpおよびガイドRNAは放出される。ステップ(f)および(g)は、所望のヌクレオチド変化が標的遺伝子座中へ組み込まれるように、単鎖DNAフラップの分解に関する。このプロセスは、一旦3'単鎖DNAフラップが侵入して他の鎖上の相補的な配列とハイブリダイズすると、形成された対応の5'内生DNAフラップを除去することによって、所望の産物形成が推進され得る。プロセスはまた、図1Fに例示されるとおり、第2鎖へニックが入れられた産物の形成へも推進され得る。このプロセスは、以下の遺伝子変化:トランスバージョン、トランジション、欠失、および挿入のうち少なくとも1またはそれ以上を導入してもよい。

図1Hは、本明細書に記載の、プライム編集プロセスに起こり得る遺伝子変化の型を描く概略図である。プライム編集によって達成され得るヌクレオチド変化の型は、欠失(短いおよび長い欠失を包含する)、単一のヌクレオチド変化(トランジションおよびトランスバージョンを包含する)、ならびに挿入(短いおよび長いものを包含する)を包含する。

図1Iは、PE3b(PE3b=PE2プライム編集因子融合タンパク質+PEgRNA+第2鎖へニックを入れるガイドRNA)によって例示される、一時的な(temporal)第2鎖へのニック入れを描く概略図である。一時的な第2鎖へのニック入れは、所望の編集済産物の形成を容易にするための、第2鎖へのニック入れのバリアントである。「一時的な」という用語は、未編集鎖への第2鎖ニックが、所望の編集が編集済鎖に組み入れられた後にしか生じないという事実を指す。これは、二本鎖DNA切断へ繋がる両鎖上の同時のニックを回避する。

図1Jは、napDNAbp(例として、SpCas9ニッカーゼ)を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)などのいずれのプログラム型ヌクレアーゼドメインにも置き換える、本明細書に企図されるプライム編集のバリエーションを描く。そのため、好適なヌクレアーゼは核酸標的分子(ガイドRNAなど)によって必ずしも「プログラムされる(programmed)」必要はないが、むしろ、とりわけヌクレアーゼなどのDNA結合ドメインの特異性を定義することによってプログラムされてもよいことが企図される。ちょうどnapDNAbp部分とのプライム編集と同じように、代替プログラム型ヌクレアーゼは、標的DNAの一方の鎖のみが切られるように修飾されることが好ましい。換言すれば、プログラム型ヌクレアーゼは、好ましくは、ニッカーゼとして機能するはずである。一旦プログラム型ヌクレアーゼが選択されると(例として、ZFNまたはTALEN)、追加の機能は改変されて、それがプライム編集様機序に従って作動することができる系になってもよい。例えば、プログラム型ヌクレアーゼは、これとRNAまたはDNAの伸長アームとを(例として、化学的リンカーを介して)カップリングすることによって修飾されてもよく、ここで伸長アームは、プライマー結合部位(PBS)およびDNA合成鋳型を含む。プログラム型ヌクレアーゼはまた、ポリメラーゼとも(例として、化学的リンカーまたはアミノ酸リンカーを介して)カップリングされてもよいが、前記ポリメラーゼの性質は、伸長アームがDNAまたはRNAであるかに依存するであろう。RNA伸長アームのケースにおいて、ポリメラーゼはRNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)であり得る。DNA伸長アームのケースにおいて、ポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、Pol I、Pol II、もしくはPol IIIを包含する原核生物のポリメラーゼ、またはPol a、Pol b、Pol g、Pol d、Pol e、もしくはPol zを包含する真核生物のポリメラーゼ)であり得る。系はまた、プログラム型ヌクレアーゼとの融合体として加えられるか、または反応全体を容易にするためにtransで加えられた他の機能も包含していてもよい(例として、(a)DNAを切断部位にて巻き戻すことで、プライマーとして利用可能な3'末をもつ切断鎖を作製する、ヘリカーゼ、(b)切断鎖上の内生鎖を除去することで、内生鎖の合成された鎖との置き換えへの反応を推進するのに役立つ、フラップエンドヌクレアーゼ(例として、FEN1)、または(c)反対鎖上に第2部位ニックを創出する、nCas9:gRNA複合体(これは非編集鎖の好ましい細胞修復を通した合成修復の取り入れを推進するのに役立つこともある))。napDNAbpで編集をプライムする類似したやり方において、別様なプログラム型ヌクレアーゼとのかかる複合体は、合成し、次いで、着目した編集を持つ新しく合成されたDNAの置き換え鎖をDNAの標的部位中へ永続的に組み入れるのに使用され得る。

図1Kは、一態様において、プライム編集によって編集されてもよい標的DNAの解剖学的な特色(anatomical features)を描く。標的DNAは「非標的鎖」および「標的鎖」を含む。標的鎖は、PAM部位(このケースにおいては、標準的なSpCas9ベースのプライム編集因子によって認識されるNGG)を認識するプライム編集因子複合体のPEgRNAのスペーサーとアニールされるようになる鎖である。標的鎖はまた、「非PAM鎖」または「非編集鎖」とも称されることがある。これに反して、非標的鎖(すなわち、プロトスペーサーおよびNGGのPAM配列を含有する鎖)は、「PAM鎖」または「編集鎖」と称されることもある。様々な態様において、PE複合体(例として、SpCas9ベースのPEでの)のニック部位は、PAM鎖上のプロトスペーサー中にあるであろう。ニックの場所は、PEを形成する具体的なCas9の特徴であろう。例えば、SpCas9ベースのPEであると、ニック部位は、塩基3(PAM配列の位置1と比べて「-3」位置)と4(PAM配列の位置1と比べて「-4」位置)との間のホスホジエステル結合中にある。プロトスペーサー中のニック部位は、以下の図に見られるとおりPEgRNAの伸長アームのプライマー結合部位と複合体化する遊離の3'ヒドロキシル基を形成し、PEgRNAの伸長アームのDNA合成鋳型をコードするDNAの単鎖の重合を始める基質を提供する。この重合反応は5'→3'方向に、PE融合タンパク質のポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によって触媒される。重合は、gRNAコアに達する前に(例として、PEの重合活性を終止するよう機能する重合終止シグナルまたは2次構造の包含によって)終止し、ニック入りのPAM鎖の元の3'ヒドロキシル基から伸長される単鎖DNAフラップを産生する。DNA合成鋳型は、PAM鎖上のニック部位のすぐ後に続く内生DNAの5'末の単鎖と相同な単鎖DNAをコードしており、所望のヌクレオチド変化(例として、単一塩基の置換、挿入、欠失、逆位)を組み入れる。所望の編集の位置は、PAM鎖上のニック部位の下流に続くいずれの位置にもあり得、位置+1、+2、+3、+4(PAM部位の開始)、+5(PAM部位の位置2)、+6(PAM部位の位置3)、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20、+21、+22、+23、+24、+25、+26、+27、+28、+29、+30、+31、+32、+33、+34、+35、+36、+37、+38、+39、+40、+41、+42、+43、+44、+45、+46、+47、+48、+49、+50、+51、+52、+53、+54、+55、+56、+57、+58、+59、+60、+61、+62、+63、+64、+65、+66、+67、+68、+69、+70、+71、+72、+73、+74、+75、+76、+77、+78、+79、+80、+81、+82、+83、+84、+85、+86、+87、+88、+89、+90、+91、+92、+93、+94、+95、+96、+97、+98、+99、+100、+101、+102、+103、+104、+105、+106、+107、+108、+109、+110、+111、+112、+113、+114、+115、+116、+117、+118、+119、+120、+ 121、+122、+123、+124、+125、+126、+127、+128、+129、+130、+131、+132、+133、+134、+135、+136、+137、+138、+139、+140、+141、+142、+143、+144、+145、+146、+147、+148、+149、もしくは+150、またはこれ以上(ニック部位の下流位置に対して)を包含し得る。一旦3'末単鎖DNA(着目する編集を含有する)が内生5'末単鎖DNAを置き換えると、DNA修復および複製プロセスは、PAM鎖上の編集部位の永続的な組み入れを、次いで編集部位に存在する非PAM鎖上のミスマッチの修正をもたらすであろう。このように、編集は、標的DNA部位上のDNAの両鎖へ広がるであろう。「編集済鎖」および「非編集済」鎖への言及が単に、PE機序に関与するDNAの鎖を正確に記述する(delineate)ことを意図するに過ぎないことは解されるであろう。「編集済鎖」は、ニック部位のすぐ下流での5'末の単鎖DNAの、所望の編集を含有する合成された3'末の単鎖DNAとの置き換えによって初めて編集されるようになる鎖である。「非編集済」鎖は編集済鎖との対の鎖であるが、これ自身もまた、修復および/または複製を通して、編集済鎖に相補的になるよう編集(とりわけ、着目する編集)がなされるようになる。

図1Lは、標的DNA、プライム編集因子複合体、およびPEgRNAと標的DNAとの間の相互作用の解剖学的な特色を示すプライム編集の機序を描く。第1に、ポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)およびnapDNAbp(例として、SpCas9ニッカーゼ、例として、HNHヌクレアーゼドメイン中の不活性化突然変異(例として、H840A)またはRuvCヌクレアーゼドメイン中の活性化突然変異(D10A)を有するSpCas9)を有する融合タンパク質を含むプライム編集因子は、PEgRNAおよび編集されるべき標的DNAを有するDNAと複合体化されている。PEgRNAは、スペーサー、gRNAコア(またgRNA骨格もしくはgRNA主鎖としても知られている)(これはnapDNAbpへ結合する)、および伸長アームを含む。伸長アームは、3'末、5'末に、またはPEgRNA分子内のどこかにあり得る。示されるとおり、伸長アームは、PEgRNAの3'末にある。伸長アームは、3'→5'方向において、PAM鎖上のニック部位のすぐ後に続く5'末の単鎖DNAと相同である、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型(着目する編集と相同領域(すなわち、相同アーム)との両方を含む)を含む。示されるとおり、一旦ニックが導入され、これによってニック部位のすぐ上流に遊離の3'ヒドロキシル基が産生されると、PAM鎖上のニック部位のすぐ上流の領域は、「プライマー結合部位」と称される伸長アームの3'末にて相補的な配列とアニールし、利用可能な3'ヒドロキシル末をもつ短い二本鎖の領域を創出するが、これによってプライム編集因子複合体のポリメラーゼのための基質が形成される。次いで、ポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)は、DNAの鎖として、3'ヒドロキシル末から伸長アームの末まで重合する。単鎖DNAの配列はDNA合成鋳型によってコードされており、これは、新しいDNAを合成するポリメラーゼによって「読まれる」伸長アームの一部(すなわち、プライマー結合部位を排除する)である。この重合は、最初のニック部位の元の3'ヒドロキシル末の配列まで有効に伸長する。DNA合成鋳型は、所望の編集のみならず、PAM鎖上のニック部位のすぐ下流の内生DNAの単鎖に相同の領域もまた含むDNAの単鎖をコードする。次に、コードされる3'末のDNAの単鎖(すなわち、3'単鎖DNAフラップ)は、PAM鎖上のニック部位のすぐ下流の、対応する相同の内生5'末のDNAの単鎖に取って代わり、5'末の単鎖DNAフラップを有するDNA中間体を形成するが、これは細胞によって(例として、フラップエンドヌクレアーゼによって)除去される。内生5'末の単鎖DNAフラップの相補体とアニールする3'末の単鎖DNAフラップは、5'DNAフラップが除去された後、内生鎖とライゲーションされる。3'末の単鎖DNAフラップ中の所望の編集は、たった今アニールされてライゲーションされたが、相補鎖とのミスマッチを形成し、DNA修復および/または一連の複製を経て、これによって両鎖上に所望の編集が永続的に組み入れられる。

図2は、本明細書に記載のプライム編集因子に用いられ得る3つのCas複合体(SpCas9、SaCas9、およびLbCas12a)と、それらのPAM、gRNA、およびDNA切断特色とを示している。図はSpCas9、SaCas9、およびLbCas12aが関わる複合体のデザインを示している。

図3A～3Fは、操作された5'プライム編集因子gRNA(図3A)、3'プライム編集因子gRNA(図3B)、および分子内の伸長(図3C)のデザインを示している。伸長されたガイドRNA(または伸長されたgRNA)は本願においてはPEgRNAまたは「プライム編集ガイドRNA」ともまた言われ得る。図3Dおよび図3Eは夫々3'および5'プライム編集因子gRNA(PEgRNA)の追加の態様を提供する。図3Fは標的DNA配列との3'端プライム編集因子ガイドRNAの間の相互作用を例解している。図3A～3Cの態様は、3'、5'、および分子内のバージョンの伸長された部分における逆転写鋳型配列(すなわち、または指示されているとおりより幅広くDNA合成鋳型と言われる。なぜなら、RTはプライム編集因子という文脈において用いられ得るポリメラーゼの唯一の型であるからである)、プライマー結合部位、および任意のリンカー配列の例示の配置、ならびにスペーサーおよびコア領域の一般的な配置を図示する。開示されるプライム編集プロセスは、伸長されたガイドRNAのこれらの構成に限定されない。図3Dの態様は、本願において企図される例示のPEgRNAの構造を提供する。PEgRNAは、5'から3'の方向で順序付けられた3つの主な構成要素構成要素、つまり:スペーサー、gRNAコア、および3'端の伸長アームを含む。伸長アームは、さらに、5'から3'方向に次の構造要素、つまり:プライマー結合部位(A)、編集鋳型(B)、および相同アーム(C)に分けられ得る。加えて、PEgRNAは任意の3'端修飾領域(e1)および任意の5'端修飾領域(e2)を含み得る。なお、さらに、PEgRNAは転写終結シグナルをPEgRNAの3'端に含み得る(図示されていない)。これらの構造要素はさらに本願において定められる。PEgRNAの構造の図示は限定することを意味されず、要素の配置のバリエーションを包摂する。例えば、任意の配列修飾(e1)および(e2)は、示されている他の領域のいずれかの内にまたは間に位置取り得る。3'および5'端に位置付けられることに限定されない。PEgRNAは、ある態様において、ヘアピン、ステムループ、トウループ、RNA結合タンパク質動員ドメイン(例えば、MS2cpタンパク質を動員および結合するMS2アプタマー)などだがこれらに限定されない二次RNA構造を含み得る。例えば、かかる二次構造は、スペーサー、gRNAコア、または伸長アーム内に、特にe1および/またはe2修飾領域内に位置し得る。二次RNA構造に加えて、PEgRNAは(例えばe1および/またはe2修飾領域内に)化学的リンカーまたはポリ(N)リンカーもしくはテールを含み得る。ここで、「N」はいずれかの核酸塩基であり得る。いくつかの態様では(例えば、図72(c)に示されているとおり)、化学的リンカーはsgRNA骨格またはコアの逆転写を防止するように機能し得る。加えて、ある種の態様では(例えば図72(c)を見よ)、伸長アーム(3)はRNAまたはDNAから構成され得、および/または1つ以上の核酸塩基アナログを包含し得る(例えば、これは温度レジリエンスなどの機能性を追加し得る)。なお、さらに、伸長アーム(3)の向きは、天然の5'から3'の方向であり得るか、または対向する向きで3'から5'の方向に(総体的なPEgRNA分子の向きに対して相対的に)合成され得る。当業者は、伸長アームの核酸材料の性質(すなわちDNAまたはRNA)に依存して、プライム編集への使用のための適当なDNAポリメラーゼを選択する能力があるであろうということもまた注意される。これは、所望の編集を包含する所望の鋳型によってコードされる3'一本鎖DNAフラップを合成するために、napDNAbpとの融合体として、または別個の部分としてトランスで提供されて、どちらかで実装され得る。例えば、伸長アームがRNAである場合には、DNAポリメラーゼは、逆転写酵素またはいずれかの他の好適なRNA依存性DNAポリメラーゼであり得る。しかしながら、伸長アームがDNAである場合には、DNAポリメラーゼはDNA依存性DNAポリメラーゼであり得る。種々の態様において、DNAポリメラーゼの提供はトランスであり得、例えばRNA－タンパク質動員ドメイン(例えば、PEgRNA上に組み入れされたMS2ヘアピン(例えば、e1もしくはe2領域にまたは他所に)およびDNAポリメラーゼに融合されたMS2cpタンパク質。それによってDNAポリメラーゼをPEgRNAに共局在させる)の使用による。プライマー結合部位は、一般的には、所望の編集を包含するもたらされる3'一本鎖DNAフラップをコードするためのDNAポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)によって用いられる鋳型の一部を形成しないということもまた注意される。それゆえに、「DNA合成鋳型」という指定は、編集とプライム編集DNA合成の3’一本鎖DNA鎖産物によって置き換えられる5’の内生一本鎖DNAフラップに対する相同領域とを含有する所望の3'一本鎖DNAフラップをコードするための、DNAポリメラーゼによって鋳型として用いられる伸長アーム(3)の領域または部分を言う。いくつかの態様では、DNA合成鋳型は「編集鋳型」および「相同アーム」または1つ以上の相同アームを例えば編集鋳型の前および後に包含する。編集鋳型は1ヌクレオチド置換ほども小さくあり得るか、またはそれはDNAの挿入もしくは逆位であり得る。加えて、編集鋳型は欠失をもまた包含し得、これは所望の欠失を含有する相同アームをコードすることによって操作され得る。他の態様において、DNA合成鋳型はe2領域またはその部分をもまた包含し得る。例えば、e2領域がDNAポリメラーゼ活性の終結を引き起こす二次構造を含む場合には、e2領域のいずれかの部分が実際にDNA上にコードされる前に、DNAポリメラーゼ機能が終結するであろうということが可能である。e2領域のいくつかまたはさらには全てがDNA上にコードされるであろうということもまた可能である。e2のどれくらい多くが実際に鋳型として用いられるのかは、その構成とその構成がDNAポリメラーゼ機能を分断するかどうかとに依存するであろう。

図3Eの態様は本願において企図される別のPEgRNAの構造を提供する。PEgRNAは、5'から3'の方向で順序付けられた3つの主な構成要素構成要素、つまり:スペーサー、gRNAコア、および3'端の伸長アームを含む。伸長アームは、さらに、5'から3'の方向で次の構造要素、つまり:プライマー結合部位(A)、編集鋳型(B)、および相同アーム(C)に分けられ得る。加えて、PEgRNAは任意の3'端修飾領域(e1)および任意の5'端修飾領域(e2)を含み得る。なお、さらに、PEgRNAはPEgRNAの3'端に転写終結シグナルを含み得る(図示されていない)。これらの構造要素はさらに本願において定められる。PEgRNAの構造の図示は限定することを意味されず、要素の配置のバリエーションを包摂する。例えば、任意の配列修飾(e1)および(e2)は示されている他の領域のいずれかの内にまたは間に位置取り得る。3'および5'端に位置付けられることに限定されない。PEgRNAは、ある態様において、ヘアピン、ステムループ、トウループ、RNA結合タンパク質動員ドメイン(例えば、MS2cpタンパク質を動員および結合するMS2アプタマー)などだがこれらに限定されない二次RNA構造を含み得る。これらの二次構造はPEgRNA分子上のどこかに位置取り得る。例えば、かかる二次構造は、スペーサー、gRNAコア、または伸長アーム内に、特にe1および/またはe2修飾領域内に位置し得る。二次RNA構造に加えて、PEgRNAは(例えば、e1および/またはe2修飾領域内に)化学的リンカーまたはポリ(N)リンカーもしくはテールを含み得る。ここで、「N」はいずれかの核酸塩基であり得る。いくつかの態様では(例えば、図72(c)に示されているとおり)、化学的リンカーはsgRNA骨格またはコアの逆転写を防止するように機能し得る。加えて、ある種の態様では(例えば、図72(c)を見よ)、伸長アーム(3)はRNAもしくはDNAからなり得、および/または1つ以上の核酸塩基アナログを包含し得る(例えば、これは温度レジリエンスなどの機能性を追加し得る)。なお、さらに、伸長アーム(3)の向きは天然の5'から3'の方向であり得るか、または対向する向きで3'から5'の方向に(総体的なPEgRNA分子の向きに対して相対的に)合成され得る。当業者は、伸長アームの核酸材料の性質(すなわちDNAまたはRNA)に依存して、プライム編集への使用のための適当なDNAポリメラーゼを選択する能力があるであろうということもまた注意される。これは、所望の編集を包含する所望の鋳型によってコードされる3'一本鎖DNAフラップを合成するために、napDNAbpとの融合体として、または別個の部分としてトランスで提供されて、どちらかで実装され得る。例えば、伸長アームがRNAである場合には、DNAポリメラーゼは、逆転写酵素またはいずれかの他の好適なRNA依存性DNAポリメラーゼであり得る。しかしながら、伸長アームがDNAである場合には、DNAポリメラーゼはDNA依存性DNAポリメラーゼであり得る。種々の態様において、DNAポリメラーゼの提供はトランスであり得、例えばRNA－タンパク質動員ドメイン(例えば、PEgRNA上に組み入れされたMS2ヘアピン(例えば、e1もしくはe2領域にまたは他所に)およびDNAポリメラーゼに融合されたMS2cpタンパク質。それによってDNAポリメラーゼをPEgRNAに共局在させる)の使用による。プライマー結合部位は、一般的には、所望の編集を包含するもたらされる3'一本鎖DNAフラップをコードするためのDNAポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)によって用いられる鋳型の一部を形成しないということもまた注意される。それゆえに、「DNA合成鋳型」という指定は、編集とプライム編集DNA合成の3’一本鎖DNA鎖産物によって置き換えられる5’の内生一本鎖DNAフラップに対する相同領域とを含有する所望の3'一本鎖DNAフラップをコードするための、DNAポリメラーゼによって鋳型として用いられる伸長アーム(3)の領域または部分を言う。いくつかの態様では、DNA合成鋳型は「編集鋳型」および「相同アーム」または1つ以上の相同アームを例えば編集鋳型の前および後に包含する。編集鋳型は1ヌクレオチド置換ほども小さくあり得るか、またはそれはDNAの挿入もしくは逆位であり得る。加えて、編集鋳型は欠失をもまた包含し得、これは所望の欠失を含有する相同アームをコードすることによって操作され得る。他の態様において、DNA合成鋳型はe2領域またはその部分をもまた包含し得る。例えば、e2領域がDNAポリメラーゼ活性の終結を引き起こす二次構造を含む場合には、e2領域のいずれかの部分が実際にDNA上にコードされる前に、DNAポリメラーゼ機能が終結するであろうということが可能である。e2領域のいくつかまたはさらには全てがDNA上にコードされるであろうということもまた可能である。e2のどれくらい多くが実際に鋳型として用いられるのかは、その構成とその構成がDNAポリメラーゼ機能を分断するかどうかとに依存するであろう。

図3Fの模式図は、二本鎖DNAの標的部位との典型的なPEgRNAの相互作用と、目当ての遺伝子変化を含有する3'一本鎖DNAフラップの付随的生成とを図示する。二本鎖DNAは3'から5'の向きの上側鎖(すなわち、標的鎖)と5'から3'方向の下方の鎖(すなわち、PAM鎖または非標的鎖)とによって示されている。上側の鎖は「プロトスペーサー」の相補体およびPAM配列の相補体を含み、「標的鎖」と言われる。なぜなら、それは、PEgRNAのスペーサーによる標的であるかつそれにアニールする鎖であるからである。それはPAM配列(例えばNGG)およびプロトスペーサーを含有するので、相補的な下方の鎖は、「非標的鎖」または「PAM鎖」または「プロトスペーサー鎖」と言われる。示されてはいないが、図示されているPEgRNAはプライム編集因子融合タンパク質のCas9または同等のドメインと複合体化するであろう。模式図に示されているとおり、PEgRNAのスペーサーは標的鎖上のプロトスペーサーの相補領域にアニールする。この相互作用はスペーサーRNAとプロトスペーサーDNAの相補体との間のDNA/RNAハイブリッドを形成し、プロトスペーサー上のRループの形成を誘導する。本願の他所において教示されるとおり、Cas9タンパク質(示されていない)は、それから、示されているとおり非標的鎖上にニックを誘導する。これは、それから、ニック部位の直ちに上流において3'ssDNAフラップ領域の形成に至り、これは、*z*に従ってプライマー結合部位においてPEgRNAの3'端と相互作用する。ssDNAフラップの3'端(すなわち、逆転写酵素プライマー配列)はPEgRNA上のプライマー結合部位(A)にアニーリングし、それによって逆転写酵素をプライムする。次に、逆転写酵素(例えば、トランスで提供されるか、またはCas9構築物に取り付けられた融合タンパク質としてシスで提供される)は、それから、DNA合成鋳型(編集鋳型(B)および相同アーム(C)を包含する)によってコードされるDNAの一本鎖を重合する。重合は伸長アームの5'端の方へ連続する。ssDNAの重合した鎖はssDNA 3'端フラップを形成し、これは他所に記載するとおり(例えば、図1Gに示されているとおり)内生DNAに侵入し、対応する内生鎖を押し除け(これは内生DNAの5'端のDNAフラップとして除去される)、所望のヌクレオチド編集(1ヌクレオチド塩基対変化、欠失、挿入(遺伝子丸ごとを包含する)を天然に存在するDNA修復/複製ラウンドによって組み入れる。

図3Gは、本願において企図されるプライム編集のさらに別の態様を図示する。特に、上側の模式図はプライム編集因子(PE)の1つの態様を図示する。これはnapDNAbp(例えば、SpCas9)およびポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)の融合タンパク質を含み、これらはリンカーによって連結されている。PEは、PEgRNAのgRNAコアに結合することによってPEgRNAとの複合体を形成する。示されている態様では、PEgRNAは3'伸長アームを備え、これは、3'端に始まって、プライマー結合部位(PBS)、次にDNA合成鋳型を含む。下側の模式図は、「トランスプライム編集因子(tPE)」と言われるプライム編集因子のバリアントを図示する。この態様では、DNA合成鋳型およびPBSはPEgRNAからデカップリングされ、トランスプライム編集因子RNA鋳型(「tPERT」)と言われる別個の分子によって提示される。これはRNA-タンパク質動員ドメイン(例えば、MS2ヘアピン)を含む。PEそれ自体は、rPERT動員タンパク質(「RP」)への融合体を含むようにさらに改変される。これはRNA-タンパク質動員ドメインを特異的に認識および結合するタンパク質である。RNA-タンパク質動員ドメインがMS2ヘアピンである例では、対応するrPERT動員タンパク質はMS2タグ付けシステムのMS2cpであり得る。MS2タグ付けシステムは、ファージのゲノム上に存在するステムループまたはヘアピン構造、すなわち「MS2ヘアピン」または「MS2アプタマー」とのMS2バクテリオファージコートタンパク質(「MCP」または「MS2cp」)の天然の相互作用に基づく。トランスプライム編集のケースでは、RP-PE:gRNA複合体は、PE:gRNA複合体と共局在するように適当なRNA-タンパク質動員ドメインを有するtPERTを「動員」し、それによって、図3Hに図示されている例に示されているとおりプライム編集への使用のためのPBSおよびDNA合成鋳型をトランスで提供する。

図3Hはトランスプライム編集のプロセスを図示する。この態様では、トランスプライム編集因子は、MS2cpタンパク質(すなわち、MS2アプタマーを認識および結合する型の動員タンパク質)に融合されているかつsgRNA(すなわち、PEgRNAと対比して標準ガイドRNA)と複合体化されている「PE2」プライム編集因子(すなわち、Cas9(H840A)およびバリアントMMLV RTの融合体)を含む。トランスプライム編集因子は標的DNAに結合し、非標的鎖へニックを入れる。MS2cpタンパク質はtPERT分子上のRNA-タンパク質動員ドメインとの特異的相互作用によってトランスでtPERTを動員する。tPERTはトランスプライム編集因子と共局在するようになり、それによって、逆転写酵素ポリメラーゼによる使用のためのPBSおよびDNA合成鋳型機能をトランスで提供して、3'端を有するかつDNA合成鋳型によってコードされる所望の遺伝子情報を含有する一本鎖DNAフラップを合成する。

図4A～4Eは、in vitroでのTPRTアッセイ(すなわち、プライム編集アッセイ)を実証する。図4Aは、蛍光標識DNA基質、RT酵素によるgRNA鋳型の伸長、PAGEの概略図である。 図4Bは、予めニックが入った(pre-nicked)基質、dCas9、および異なる合成鋳型長の5'伸長gRNAでのTPRT(すなわち、プライム編集)を示す。図4Cは、Cas9不在下の、予めニックが入ったDNA基質とのRT反応を示す。 図4Dは、Cas9(H840A)および5'伸長gRNAとの、全長dsDNA基質に対するTPRT(すなわち、プライム編集)を示す。図4Eは、予めニックが入った全長dsDNA基質との3'伸長gRNA鋳型を示す。すべての反応にはM-MLV RTが存在する。

図5は、合成鋳型長を変動させた5'伸長gRNAを使用する、in vitroでの検証結果(validations)を示す。蛍光標識(Cy5)DNA標的を基質として使用し、この実験一式において予めニックを入れた。これらの実験において使用されたCas9は触媒不活性型Cas9(dCas9)であり、使用されたRTは、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)に由来する商用RTであるSuperscript IIIである。dCas9:gRNA複合体を、精製された構成要素から形成した。次いで、蛍光標識DNA基質をdNTPsおよびRT酵素とともに加えた。37℃での1時間のインキュベーション後、反応産物を変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分析した。ゲル画像は、元のDNA鎖～逆転写鋳型長と一致する長さの伸長を示す。

図6は、合成鋳型長を変動させた5'伸長gRNAを使用する、in vitroでの検証結果を示すが、これは図5に示されるものと酷似している。しかしながら、DNA基質は、この実験一式においてニックは予め入っていない。これらの実験に使用されたCas9はCas9ニッカーゼ(SpyCas9 H840A突然変異体)であり、使用されたRTは、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)に由来する商用RTであるSuperscript IIIである。反応産物を変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分析した。ゲルに示されるとおり、ニッカーゼは、標準gRNAが使用されたとき、DNA鎖を効率的に切断する(gRNA_0、レーン3)。

図7は、3'伸長がDNA合成を裏付け有意にCas9ニッカーゼ活性を生じさせないことを実証する。予めニックが入った基質(黒色矢印)は、dCas9またはCas9ニッカーゼのいずれかが使用されたとき、ほぼ定量的にRT産物へ変換される(レーン4および5)。50％超のRT産物への変換(赤色矢印)が全長基質で観察される(レーン3)。Cas9ニッカーゼ(SpyCas9 H840A突然変異体)、触媒不活性型Cas9(dCas9)、およびSuperscript III(モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)に由来する商用RT)を使用する。

図8は、RT反応が優先してgRNAにcisで生じる(同じ複合体中で結合される)かを決定するために使用された二色(dual color)実験を実証する。2つ別々の実験を5'伸長gRNAおよび3'伸長gRNAについて行った。産物をPAGEによって分析した。産物比率は(Cy3cis/Cy3trans)/(Cy5trans/Cy5cis)として算出した。

図9A～9Dは、フラップモデル基質を実証する。図9Aは、フラップ特異的(-directed)変異誘発のための二重FPレポーターを示す。図9Bは、HEK細胞中の停止コドン修復を示す。 図9Cは、フラップ修復後に配列決定された(sequenced)酵母クローンを示す。図9Dは、ヒト細胞中の異なるフラップ特色の試験を示す。

図10は、プラスミド基質上のプライム編集を実証する。二重蛍光レポータープラスミドを酵母(S.cerevisiae)発現のために構築した。酵母中のこの構築物の発現は、GFPのみを産生する。in vitroでのプライム編集反応は点突然変異を誘導し、親プラスミド、またはin vitroでCas9(H840A)によってニックが入れられたプラスミドを酵母中へ形質転換する。コロニーは蛍光画像化によって可視化される。酵母二重FPプラスミド形質転換体が示されている。親プラスミドまたはin vitroでCas9(H840A)にニックが入ったプラスミドを形質展開することは、緑色GFP発現コロニーのみをもたらす。5'伸長gRNAまたは3'伸長gRNAでのプライム編集反応は、緑色および黄色の混合コロニーを産生する。後者はGFPとmCherryとの両方を発現する。より多くの黄色コロニーは3'伸長gRNAで観察される。停止コドンを含有しない陽性対照も示されていない。

図11は、図10の実験と同様のプラスミド基質上のプライム編集を示すが、停止コドン中に点突然変異を組み入れる代わりに、プライム編集は、フレームシフト突然変異を修復して下流のmCherryの合成を可能にさせる単一ヌクレオチドの挿入(左)または欠失(右)を組み入れる。両実験ともに3'伸長gRNAsを使用した。

図12は、サンガー(Sanger)配列決定によって特徴付けられる、プラスミド基質上のプライム編集の編集産物を示す。TRT形質転換からのコロニーを個々に選択し、サンガー配列決定によって分析した。正確な編集が選択コロニーを配列決定することによって観察された。緑色コロニーは元のDNA配列をもつプラスミドを含有していたのに対し、黄色コロニーはプライム編集gRNAによってデザインされた正確な突然変異を含有していた。他の点突然変異またはインデルは一切観察されなかった。

図13は、新しいプライム編集技術の潜在的な範囲を示し、デアミナーゼ媒介塩基編集技術との比較を示す。

図14は、ヒト細胞における編集の概略図を示す。

図15は、gRNA中のプライマー結合部位の伸長を実証する。

図16は、隣接標的化(adjacent targeting)のためにトランケートされたgRNAを示す。

図17A～17Cは、ヒト胚腎臓(HEK)細胞における構成要素のトランスフェクション後の標的ヌクレオチドでの％T→A変換を表示するグラフである。図17Aは、野生型MLV逆転写酵素のCas9(H840A)ニッカーゼ(32アミノ酸リンカー)へのN末融合を使用した結果を提示するデータを示す。図17Bは、RT酵素のC末融合を別にすれば図17Aと同様である。図17Cは、図17Aと同様であるが、MLV RTとCas9との間のリンカーが32アミノ酸の代わりに60アミノ酸長である。

図18は、ハイスループットアンプリコン配列決定によるHEK3部位での高純度T→A編集を示す。配列決定分析の出力は、編集済細胞の最も豊富な遺伝子型を表示する。

図19は、インデル比率(青色バー)と並んで標的ヌクレオチドでの編集効率(オレンジ色バー)を示す。WTは野生型MLV RT酵素を指す。突然変異酵素(M1～M4)は、右へ列挙された突然変異を含有する。編集比率をゲノムDNAアンプリコンのハイスループット配列決定によって定量化した。

図20は、単鎖ニックが標的ヌクレオチドに近接する相補的なDNA鎖中に導入されたときの標的ヌクレオチドの編集効率を示す。標的ヌクレオチドから様々な間隔にてニックを入れるのを試験した(三角形)。標的塩基対(青色バー)での編集効率が、インデル形成比率と並んで示される(オレンジ色バー)。「なし」の例は、相補鎖へニックを入れるガイドRNAを含有しない。編集比率をゲノムDNAアンプリコンのハイスループット配列決定によって定量化した。

図21は、所望のT→Aトランスバージョン突然変異および他の主なゲノム編集副産物の全般的な非存在を示す、処理されたハイスループット配列決定データを実証する。

図22は、伸長されたガイドRNAと複合体化された核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)を使用し、エラーを起こしやすい逆転写酵素で、標的変異誘発(targeted mutagenesis)を標的遺伝子座上に行う(すなわち、エラーを起こしやすいRTでプライム編集する)ための例示のプロセスの概略図を提供する。このプロセスは、標的変異誘発のためのプライム編集の態様と称されることもある。伸長されたガイドRNAは、ガイドRNAの3'末もしくは5'末での、またはガイドRNA中の分子内のある場所での伸長を含む。ステップ(a)において、napDNAbp/gRNA複合体はDNA分子に接触し、gRNAがnapDNAbpを、変異誘発されるべき標的遺伝子座へ結合するようにガイドする。ステップ(b)において、標的遺伝子座のDNAの鎖の一方にニックが導入され(例として、ヌクレアーゼまたは化学剤によって)、これによって標的遺伝子座の鎖の一方に利用可能な3'末が創出される。ある態様において、ニックは、Rループ鎖に対応するDNAの鎖、すなわち、ガイドRNA配列とはハイブリダイズされない鎖中に創出される。ステップ(c)において、3'末DNA鎖は、逆転写をプライムするために、ガイドRNAの伸長部分と相互作用する。ある態様において、3'末のDNA鎖は、ガイドRNAの伸長部分上の特定のRTプライム配列とハイブリダイズする。ステップ(d)において、エラーを起こしやすい逆転写酵素が導入されるが、これは変異誘発されたDNAの単鎖を、プライムされた部位の3'末からガイドRNAの3'末へ合成する。例示の突然変異は星印「*」で示される。これは、所望の変異誘発領域を含む単鎖DNAフラップを形成する。ステップ(e)において、napDNAbpおよびガイドRNAは放出される。ステップ(f)および(g)は、所望の変異誘発領域が標的遺伝子座中へ組み込まれるように、単鎖DNAフラップ(変異誘発領域を含む)の分解に関する。このプロセスは、一旦3'単鎖DNAフラップが侵入して他の鎖上の相補的な配列とハイブリダイズすると、形成された対応の5'内生DNAフラップを除去することによって、所望の産物形成へ推進され得る。プロセスはまた、図1Fに例示されるとおり、第2鎖にニックが入れられた産物の形成へも推進され得る。内生DNA修復および/または複製プロセスに続き、変異誘発領域は、DNA遺伝子座のDNAの両鎖中へ組み込まれるようになる。

図23は、トリヌクレオチド反復(repeat)配列を縮小するためのgRNAデザインおよびTPRTゲノム編集(すなわち、プライム編集)でのトリヌクレオチド反復の縮小の概略図である。トリヌクレオチド反復拡大は、ハンチントン病、脆弱X症候群、およびフリートライヒ運動失調症を包含する、数多のヒト疾患に関連する。最も一般的なトリヌクレオチド反復はCAGトリプレットを含有するが、GAAトリプレット(フリートライヒ運動失調症)およびCGGトリプレット(脆弱X症候群)もまた生じる。拡大する素因を遺伝するか、または既に拡大された親のアレルを獲得すること(acquiring)は、疾患に罹る(acquiring)可能性を増大させる。トリヌクレオチド反復の病原性の拡大は仮説上、プライム編集を使用して修正され得る。反復領域上流の領域は、RNAにガイドされる(-guided)ヌクレアーゼによってニックが入れられ、次いで、健常な数の反復(これは具体的な遺伝子および疾患に依存する)を含有する新しいDNA鎖の合成をプライムするのに使用され得る。反復配列の後に、反復の他端に隣接する配列の同一性にマッチする、一続きの短い相同(short stretch of homology)が加えられる(赤色鎖)。新しく合成された鎖の侵入、これに続く内生DNAの、新しく合成されたフラップとの置き換えが、縮小された反復アレルへ繋がる。

図24は、プライム編集での正確な10ヌクレオチド欠失を示す概略図である。HEK3遺伝子座が標的にするガイドRNAを、ニック部位の後に10ヌクレオチド欠失をコードする逆転写鋳型でデザインした。トランスフェクトされたHEK細胞における編集効率を、アンプリコン配列決定を使用して査定した。

図25は、内生ゲノム遺伝子座にて遺伝子をペプチドタグ付けする(peptide tagging)ためのgRNAデザインおよびTPRTゲノム編集(すなわち、プライム編集)でのペプチドタグ付けを示す概略図である。FlAsHおよびReAsHのタグ付け系は、2つの部分:(1)フルオロフォア-二ヒ素(biarsenical)プローブ、および(2)テトラシステインモチーフを含有する、遺伝子学的にコードされたペプチドを含み、配列FLNCCPGCCMEP(配列番号1)によって例示される。細胞内で発現されたとき、テトラシステインモチーフ含有タンパク質は、フルオロフォア-ヒ素プローブで蛍光標識され得る(参考文献:J.Am.Chem.Soc.,2002,124(21),pp6063-6076を参照。DOI:10.1021/ja017687n)。「ソルタグ付け(sortagging)」系は、標識ペプチドプローブを、好適なペプチド基質を含有するタンパク質へ共有結合的に抱合させる細菌ソルターゼ酵素を採用する(参考文献:Nat.Chem.Biol.2007 Nov;3(11):707-8を参照。DOI:10.1038/nchembio.2007.31)。FLAGタグ(DYKDDDDK(配列番号2))、V5タグ(GKPIPNPLLGLDST(配列番号3))、GCN4タグ(EELLSKNYHLENEVARLKK(配列番号4))、HAタグ(YPYDVPDYA(配列番号5))、およびMycタグ(EQKLISEEDL(配列番号6))は一般的に、免疫アッセイのためのエピトープタグとして採用される。パイクランプ(pi-clamp)は、ペンタフルオロ-芳香族基質で標識され得るペプチド配列(FCPF)をコードする(参考文献:Nat.Chem.2016 Feb;8(2):120-8。doi:10.1038/nchem.2413)。

図26Aは、ゲノムDNA中へのHis₆タグおよびFLAGタグの正確な組み入れを示す。HEK3遺伝子座を標的にするガイドRNAを、18nt Hisタグ挿入または24nt FLAGタグ挿入のいずれかをコードする逆転写鋳型でデザインした。トランスフェクトされたHEK細胞における編集効率を、アンプリコン配列決定を使用して査定した。FLAGタグの全長24nt配列はフレームから見切れている点に留意する(配列決定によって全長の正確な挿入が確認された)。 図26Bは、(a)タンパク質を可溶化または不溶化させること、(b)タンパク質の細胞内局在化を変化させるかまたはこれを追跡すること、(c)タンパク質の半減期を延長すること、(d)タンパク質精製を容易にさせること、および(e)タンパク質の検出を容易にさせることを包含する、タンパク質/ペプチドのタグ付けを伴う様々な用途をまとめる概略図を示す。

図27は、プリオン病を防止またはその進行を停止させる防護性変異をPRNPに組み入れることによるプライム編集の概観を示す。PEgRNA配列は左において配列番号351(すなわち、sgRNA骨格の5')、右において配列番号3864(すなわち、sgRNA骨格の3')に対応する。

図28Aは、RNAモチーフをコードする配列のPEに基づく挿入の模式図である。 図28Bは、潜在的に挿入され得るいくつかの例のモチーフの列挙(網羅的ではない)、およびそれらの機能である。

図29Aはプライム編集因子の図示である。図29BはPEによって導かれるゲノム、プラスミド、またはウイルスDNAへの可能な改変を示す。図29Cは、PEgRNAのライブラリによる規定されたタンパク質(このケースではGFP)上へのペプチドループのライブラリの挿入のための例のスキームを示す。図29Dは、異なるPEgRNAを用いるタンパク質のコドンの可能なプログラム可能な欠失またはNもしくはC末端短縮の例を示す。欠失はフレームシフト変異の最小限の生成でもって生起することが予測されるであろう。

図30は、PACEなどの連続的進化系におけるコドンの反復的挿入のための可能なスキームを示す。

図31は操作されたgRNAの説明である。gRNAコア、標的遺伝子の配列にマッチする～20ntスペーサー、免疫原性のエピトープヌクレオチド配列を有する逆転写鋳型、および標的遺伝子の配列にマッチするプライマー結合部位を示す。

図32は、公知の免疫原性エピトープを内生または外生のゲノムDNA上に挿入するための手段としてプライム編集を用いることの模式図であり、対応するタンパク質の改変をもたらす。

図33は、プライマー結合配列挿入のためのPEgRNAデザインと、オフターゲット編集を決定するためのプライム編集を用いるゲノムDNA上へのプライマー結合挿入とを示す模式図である。この態様では、プライム編集が生細胞、組織、または動物モデル内において行われる。第1のステップとして、適当なPEgRNAがデザインされる。上側の模式図は、この側面に用いられ得る例示のPEgRNAを示す。PEgRNA上のスペーサー(「プロトスペーサー」と標識されている)はゲノム標的の鎖の1つに対して相補的である。PE:PEgRNA複合体(すなわちPE複合体)は一本鎖3'端フラップをニック部位に組み入れし、これは、コードされるプライマー結合配列と、カットされた部位のちょうど下流の領域に対して相補的である相同領域(PEgRNAの相同アームによってコードされる)とを含有する(赤色による)。フラップ侵入およびDNA修復/複製プロセスによって、合成された鎖はDNA上に組み込まれるようになり、それによってプライマー結合部位を組み入れる。このプロセスは、所望のゲノム標的においてのみならず、オフターゲットの様式でPEgRNAと相互作用し得る他のゲノム部位においてもまた生起し得る(すなわち、意図されるゲノム部位ではない他のゲノム部位に対するスペーサー領域の相補性を原因として、PEgRNAはPE複合体を他のオフターゲット部位へとガイドする)。それゆえに、プライマー結合配列は、所望のゲノム標的においてのみならず、ゲノム上の他所のオフターゲットゲノム部位において組み入れられ得る。意図されるゲノム標的部位およびオフターゲットゲノム部位両方のこれらのプライマー結合部位の挿入を検出するためには、ゲノムDNA(PE後)が単離、フラグメント化、およびアダプターヌクレオチドにライゲーションされ得る(赤色で示されている)。次に、アダプターおよび挿入されたプライマー結合配列にアニールするPCRオリゴヌクレオチドによって、PCRが実行されて、プライマー結合部位がPEによって挿入されたオンターゲットおよびオフターゲットゲノムDNA領域を増幅し得る。それから、高スループット配列決定および配列アラインメントが行われて、オンターゲット部位またはオフターゲット部位どちらかにおけるPEによって挿入されたプライマー結合配列の挿入点を同定し得る。

図34は、PEによる遺伝子の精密な挿入を示す模式図である。

図35Aは、天然のインスリンシグナル経路を示す模式図である。図35Bは、FK1012によってコントロールされるFKBP12タグ付けされたインスリン受容体活性化を示す模式図である。

図36は、低分子モノマーを示す。参照:バンプFK506ミミック(2)¹⁰⁷。

図37は、低分子二量体を示す。参照:FK1012 4^95,96;FK1012 5¹⁰⁸;FK1012 6¹⁰⁷;AP1903 7¹⁰⁷;シクロスポリンA二量体8⁹⁸;FK506-シクロスポリンA二量体(FkCsA)9¹⁰⁰。

図38A～38Fは、プライム編集、ならびにin vitroおよび酵母細胞における実現可能性研究の概観を提供する。図38Aは、ClinVar(2019年7月アクセス)の75,122の公知の病原性のヒト遺伝子バリアントを示し、型によって分類されている。図38Bは、プライム編集複合体が、操作された逆転写酵素ドメインに融合されたRNAによってガイドされるDNAニッキングドメイン、例えばCas9ニッカーゼを含有するかつプライム編集ガイドRNA(PEgRNA)と複合体化したプライム編集因子(PE)タンパク質からなるということを示す。PE:PEgRNA複合体は標的DNA部位に結合し、標的部位のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の前および後の広い範囲のDNA位置における大きい種々の精密なDNA編集を可能化する。図38Cは、DNA標的結合によって、PE:PEgRNA複合体がPAM含有DNA鎖へニックを入れるということを示す。もたらされる遊離の3'端はPEgRNAのプライマー結合部位にハイブリダイズする。逆転写酵素ドメインはPEgRNAのRT鋳型を用いるプライマー伸長を触媒し、所望の編集を含有する新たに合成されたDNA鎖(3'フラップ)をもたらす。編集された3'フラップと元々のDNAを含有する編集されない5'フラップとの間の平衡化、次に細胞性の5'フラップ切断およびライゲーション、ならびにヘテロ二重鎖DNAを分解するためのDNA修復または複製が、安定に編集されたDNAをもたらす。図38Dは、5'Cy5標識されたPAM鎖を含有する予めニックが入ったdsDNA基質、dCas9、および市販のM-MLV RTバリアント(RT、Superscript III)による、in vitroの5'伸長されたPEgRNAプライマー伸長アッセイを示す。dCas9が様々な長さのRT鋳型を含有するPEgRNAと複合体化させられ、それから、指示されている構成要素と併せてDNA基質に追加された。反応は37℃で1時間に渡ってインキュベートされ、それから変性尿素PAGEによって分析され、Cy5蛍光について視覚化された。図38Eは、dCas9またはCas9 H840Aニッカーゼと予め複合体化した3'伸長されたPEgRNAおよび予めニックが入ったまたはニッキングされていない5'Cy5標識dsDNA基質を用いて、図38Dのとおり行われたプライマー伸長を示す。図38Fは、PEgRNA、Cas9ニッカーゼ、およびRTによってin vitroで編集されたGFP-mCherry融合レポータープラスミドによって形質転換された酵母コロニーを示す。GFPおよびmCherryの間にナンセンスまたはフレームシフト変異を含有するプラスミドが、トランスバージョン変異、1bp挿入、または1bp欠失によってmCherry翻訳を復元する5'伸長または3'伸長されたPEgRNAによって編集された。GFPおよびmCherry二重陽性の細胞は(黄色)首尾良い編集を反映する。

図39A～39DはPE1およびPE2によるヒト細胞のゲノムDNAのプライム編集を示す。図39Aは、PEgRNAが、スペーサー配列、sgRNA骨格、ならびにプライマー結合部位(緑色)および編集される塩基(単数または複数)(赤色)を含有する逆転写(RT)鋳型(紫色)を含有する3'伸長を含有するということを示す。プライマー結合部位はニッキングの部位の直ちに上流のPAM含有DNA鎖にハイブリダイズする。コードされる編集を例外として、RT鋳型はニックの下流のDNA配列に対して相同的である。図39Bは、野生型M-MLV逆転写酵素に融合されたCas9 H840Aニッカーゼ(PE1)と様々なプライマー結合部位長さのPEgRNAとを用いるHEK293T細胞のHEK3部位におけるT・AからA・Tのトランスバージョン編集の組み入れを示す。図39Cは、PE2への操作された五重変異体M-MLV逆転写酵素(D200N,L603W,T306K,W313F,T330P)の使用が、HEK293T細胞の5つのゲノム部位におけるプライム編集トランスバージョン効率とHEK3における小さい挿入および小さい欠失編集とを実質的に改善するということを示す。図39Dは、HEK293T細胞の5つのゲノム部位における様々なRT鋳型長さによるPE2編集効率の比較である。値およびエラーバーは3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映する。

図40A～40Cは、PE3およびPE3bシステムが非編集鎖へニックを入れてプライム編集効率を増大させるということを示す。図40AはPE3によるプライム編集の概観である。編集された鎖の当初の合成後に、DNA修復が、編集を含有する新たに合成された鎖(3'フラップ切除)または元々のゲノムDNA鎖(5'フラップ切除)どちらかを除去するであろう。5'フラップ切除は、1つの編集された鎖および1つの非編集鎖を含有するDNAヘテロ二重鎖を後に残す。ミスマッチ修復機構またはDNA複製がヘテロ二重鎖を分解して、編集されたまたは非編集の産物どちらかを与え得る。非編集鎖へニックを入れることは、その鎖の修復を好み、所望の編集を含有する安定な二重鎖DNAの選好的生成をもたらす。図40Bは、PE3によって媒介されるプライム編集効率およびインデル形成に対する相補鎖ニッキングの効果を示す。「なし」は相補鎖にニッキングしないPE2対照を言う。図40Cは、PE2(相補鎖ニックなし)、PE3(一般的な相補鎖ニック)、およびPE3b(編集特異的な相補鎖ニック)による編集効率の比較である。全ての編集収量は、ソーティングなしの全ての処置された細胞のうち、意図される編集を含有するかつインデルを含有しない配列決定総読取のパーセンテージを反映する。値およびエラーバーは3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映する。

図41A～41Kは、HEK293T細胞の7つの内生ヒトゲノム座位におけるPE3による標的化された挿入、欠失、および全ての12の型の点変異を示す。図41Aは、10nt RT鋳型を用いるHEK3部位の位置+1から+8(PEgRNAによって誘導されるニックの位置付けを位置+1および-1の間としてカウントする)の全ての12の型の1ヌクレオチドトランジションおよびトランスバージョン編集を示すグラフである。図41Bは、34nt RT鋳型を用いるHEK3部位におけるロングレンジPE3トランスバージョン編集を示すグラフである。図41C-41Hは、プライム編集窓上の種々の位置における全ての12の型のトランジションおよびトランスバージョン編集を、(図41C)RNF2、(図41D)FANCF、(図41E)EMX1、(図41F)RUNX1、(図41G)VEGFA、および(図41H)DNMT1について示すグラフである。図41Iは、7つの内生ゲノム座位におけるPE3による標的化された1および3bp挿入ならびに1および3bp欠失を示すグラフである。図41Jは、HEK3標的部位における5から80bpの標的化された精密な欠失を示すグラフである。図41Kは、挿入および欠失、挿入および点変異、欠失および点変異、ならびに二重点変異の組み合わせ編集を、3つの内生ゲノム座位において示すグラフである。全ての編集収量は、ソーティングなしの全ての処置された細胞のうち、意図される編集を含有するかつインデルを含有しない配列決定総読取のパーセンテージを反映する。値およびエラーバーは3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映する。

図42A～42Hは、公知のCas9オフターゲット部位におけるCas9ならびにPE3によるプライム編集および塩基編集ならびにオフターゲット編集の比較を示す。図42Aは、HEK293T細胞の内生HEK3、FANCF、およびEMX1部位において、PE2、PE3、BE2max、およびBE4maxについて、同じ標的ヌクレオチドにおけるトータルのC・GからT・Aの編集効率を示す。図42Bは図42Aの処置からのインデル度数を示す。図42Cは、精密なC・GからT・Aの編集(バイスタンダー編集またはインデルなし)の編集効率をPE2、PE3、BE2max、およびBE4maxについてHEK3、FANCF、およびEMX1において示す。EMX1では、3つの標的ヌクレオチドにおけるC・GからT・Aの変換の全ての可能な組み合わせの精密なPE組み合わせ編集もまた示されている。図42Dは、トータルのA・TからG・C編集効率をPE2、PE3、ABEdmax、およびABEmaxについてHEK3およびFANCFにおいて示す。図42Eは、バイスタンダー編集またはインデルなしの精密なA・TからG・C編集効率をHEK3およびFANCFについて示す。図42Fは図42Dの処置からのインデル度数を示す。図42Gは、HEK293T細胞における平均トリプリケート編集効率(インデルを有するパーセンテージ配列決定読取)を、Cas9ヌクレアーゼについて、4つのオンターゲットおよび16の公知のオフターゲット部位において示す。検分された16のオフターゲット部位は、4つのオンターゲット部位の夫々について上位4つの先に報告されたオフターゲット部位^118,159であった。各オンターゲット部位について、Cas9はsgRNAとまたは同じプロトスペーサーを認識する4つのPEgRNAの夫々とペアリングされた。図42Hは、平均トリプリケートオンターゲットおよびオフターゲット編集効率ならびにインデル効率(下の括弧内)を、HEK293T細胞において、(図42G)の各PEgRNAとペアリングされたPE2またはPE3について示す。オンターゲット編集収量は、ソーティングなしの全ての処置された細胞のうち、意図される編集を含有するかつインデルを含有しない配列決定総読取のパーセンテージを反映する。オフターゲット編集収量はプライム編集と整合するオフターゲット座位改変を反映する。値およびエラーバーは3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映する。

図43A～43Iは、種々のヒト細胞株および初代マウス皮質ニューロンにおけるプライム編集、病原性のトランスバージョン、挿入、または欠失変異の組み入れおよび修正、ならびにプライム編集およびHDRの比較を示す。図43Aは、HEK293T細胞のHBBにおける病原性のE6V変異の組み入れ(T・AからA・Tのトランスバージョンによる)および修正(A・TからT・Aのトランスバージョンによる)を示すグラフである。野生型HBBへのまたはPEgRNA PAMを遮断するサイレントな変異を含有するHBBどちらかへの修正が示されている。図43Bは、HEK293T細胞における病原性のHEXA 1278+TATCアレルの組み入れ(4bp挿入による)および修正(4bp欠失による)を示すグラフである。野生型HEXAまたはPEgRNA PAMを遮断するサイレントな変異を含有するHEXAどちらかへの修正が示されている。図43Cは、G・CからT・AのトランスバージョンによるHEK293T細胞におけるPRNPの防護性のG127Vバリアントの組み入れを示すグラフである。図43Dは、K562(白血病骨髄細胞)、U2OS(骨肉腫細胞)、およびHeLa(子宮頸がん細胞)を包含する他のヒト細胞株におけるプライム編集を示すグラフである。図43Eは、マウス初代皮質ニューロンのDNMT1におけるG・CからT・Aのトランスバージョン変異の組み入れを示すグラフであり、二元的な分裂インテインPE3レンチウイルスシステムを用いている。これにおいては、N末端の半分は、NインテインにかつP2A自己切断ペプチドを介してGFP-KASHに融合されたCas9(1-573)であり、C末端の半分は、PE2の残りに融合されたCインテインである。PE2の半分同士は、成熟ニューロンに高度に特異的であるヒトシナプシンプロモーターから発現される。ソーティングされた値はGFP陽性の核からの編集またはインデルを反映し、未ソーティングの値は全ての核からである。図43Fは、HEK293T細胞の内生ゲノム座位におけるPE3およびCas9によって媒介されるHDR編集効率の比較である。図43Gは、K562、U2OS、およびHeLa細胞の内生ゲノム座位におけるPE3およびCas9によって媒介されるHDR編集効率の比較である。図43Hは、HEK293T、K562、U2OS、およびHeLa細胞におけるPE3およびCas9によって媒介されるHDRインデル副産物生成の比較である。図43Iは、PE3によるHEK293T細胞におけるHis6タグ(18bp)、FLAGエピトープタグ(24bp)、または伸長されたLoxP部位(44bp)の標的化された挿入を示す。全ての編集収量は、全ての処置された細胞のうち、意図される編集を含有するかつインデルを含有しない配列決定総読取のパーセンテージを反映する。値およびエラーバーは3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映する。

図44A～44Gは、蛍光標識されたDNA基質によるin vitroのプライム編集検証研究を示す。図44Aは、dCas9、5'伸長されたPEgRNA、および5'-Cy5標識DNA基質による電気泳動移動度シフトアッセイを示す。PEgRNA 1から5は、スペーサーおよびPBSの間の15ntリンカー配列(PEgRNA 1ではリンカーA、PEgRNA 2から5ではリンカーB)、5nt PBS配列、ならびに7nt(PEgRNA 1および2)、8nt(PEgRNA 3)、15nt(PEgRNA 4)、および22nt(PEgRNA 5)のRT鋳型を含有する。PEgRNAは、図44Eおよび44Fに用いられるものである;完全な配列は表2A～2Cに列記される。図44Bは、5'伸長されたおよび3'伸長されたPEgRNAを用いるCas9 H840Aのin vitroニッキングアッセイを示す。図44Cは、5'伸長されたおよび3'伸長されたPEgRNAを用いるHEK3におけるHEK293T細胞のCas9によって媒介されるインデル形成を示す。図44Dはプライム編集in vitro生化学アッセイの概観を示す。5'-Cy5標識された予めニックが入ったおよびニッキングされていないdsDNA基質が試験された。sgRNA、5'伸長されたPEgRNA、または3'伸長されたPEgRNAがdCas9またはCas9 H840Aニッカーゼと予め複合体化され、それから、dsDNA基質、M-MLV RT、およびdNTPと組み合わせられた。変性尿素PAGEによる分離およびCy5蛍光による視覚化に先行して、反応が37℃で1時間に渡って進むことを許された。図44Eは、5'伸長されたPEgRNA、予めニックが入ったDNA基質、およびdCas9を用いるプライマー伸長反応が、RT産物への有意な変換に至るということを示す。図44Fは、ニッキングされていないDNA基質およびCas9 H840Aニッカーゼと図44Bのとおり5'伸長されたPEgRNAを用いるプライマー伸長反応を示す。産物収量は予めニックが入った基質と比較して多大に縮減される。図44Gは、3'-PEgRNAを用いるin vitroプライマー伸長反応が単一の明らかな産物を生成するということを変性尿素PAGEによって示す。RT産物バンドが切り出され、ゲルから溶出され、それから、dGTPまたはdATPどちらかを用いるターミナルトランスフェラーゼ(TdT)によるホモポリマーテーリングに付された。テーリングされた産物はポリTまたはポリCプライマーによって伸長され、もたらされたDNAが配列決定された。Sangerトレースは、gRNA骨格に由来する3ヌクレオチドが逆転写された(最後の3'ヌクレオチドとしてDNA産物に追加された)ということを指示する。哺乳類細胞プライム編集実験では、PEgRNA骨格挿入はin vitroよりもかなり稀であるということに注意せよ(図56A～56D)。可能性としては、テザリングされた逆転写酵素がCas9に結合したガイドRNA骨格にアクセスすることの不能、および/またはPEgRNA骨格配列を含有する3'フラップのミスマッチの3'端の細胞性の切除を原因とする。

図45A～45Gはin vitroプライム編集反応からの3'DNAフラップの酵母における細胞性修復を示す。図45Aは、二元的蛍光タンパク質レポータープラスミドが、インフレームの停止コドン、+1フレームシフト、または-1フレームシフトをコードする標的部位によって分離されたGFPおよびmCherryオープンリーディングフレームを含有するということを示す。プライム編集反応がCas9 H840Aニッカーゼ、PEgRNA、dNTP、およびM-MLV逆転写酵素によってin vitroで実行され、それから酵母に形質転換された。編集されないプラスミドを含有するコロニーはGFPを生ずるが、mCherryを生じない。編集されたプラスミドを含有する酵母コロニーはGFPおよびmCherry両方を融合タンパク質として生ずる。図45Bは、停止コドンをGFPおよびmCherryの間に含有する(編集されない負の対照。上側)または停止コドンもしくはフレームシフトをGFPおよびmCherryの間に含有しない(予め編集された正の対照。下側)レポータープラスミドによって形質転換された酵母コロニーのGFPおよびmCherry蛍光の重ね合わせを示す。図45C-45Fは、in vitroプライム編集反応産物によって形質転換された酵母コロニーからのmCherryおよびGFP蛍光の視覚化を示す。図45Cは、図45Dに示されているとおり、3'伸長されたPEgRNAまたは5'伸長されたPEgRNAを用いるT・AからA・Tのトランスバージョンによる停止コドン修正を示す。図45Eは、3'伸長されたPEgRNAを用いる1bp欠失の+1フレームシフト修正を示す。図45Fは、3'伸長されたPEgRNAを用いる1bp挿入による-1フレームシフト修正を示す。図45Gは、図45BのGFPのみコロニーならびに図45CのGFPおよびmCherry二重陽性コロニーから単離されたプラスミドからのSanger DNA配列決定トレースを示す。

図46A～46FはPE1による正しい編集対インデル生成を示す。図46AはHEK3の+1位置におけるPE1によるT・AからA・Tのトランスバージョン編集効率およびインデル生成を示し、10nt RT鋳型と8-17ntの範囲であるPBS配列とを含有するPEgRNAを用いる。図46Bは、EMX1の+5位置におけるPE1によるG・CからT・Aのトランスバージョン編集効率およびインデル生成を示し、13nt RT鋳型と9-17ntの範囲であるPBS配列とを含有するPEgRNAを用いる。図46Cは、FANCFの+5位置におけるPE1によるG・CからT・Aのトランスバージョン編集効率およびインデル生成を示し、17nt RT鋳型と8-17ntの範囲であるPBS配列とを含有するPEgRNAを用いる。図46Dは、RNF2の+1位置におけるPE1によるC・GからA・Tのトランスバージョン編集効率およびインデル生成を示し、11nt RT鋳型と9-17ntの範囲であるPBS配列とを含有するPEgRNAを用いる。図46EはHEK4の+2位置におけるPE1によるG・CからT・Aのトランスバージョン編集効率およびインデル生成を示し、13nt RT鋳型と7-15ntの範囲であるPBS配列とを含有するPEgRNAを用いる。図46FはHEK3部位におけるPE1によって媒介される+1T欠失、+1A挿入、および+1CTT挿入を示し、13nt PBSおよび10nt RT鋳型を用いる。PEgRNAの配列は図39Cに用いられるものである(表3A-3Rを見よ)。値およびエラーバーは3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映する。

図47A～47Sはプライム編集のためのM-MLV RTバリアントの評価を示す。図47Aは、この図に用いられるプライム編集因子バリアントの略語を示す。図47BはHEK3座位におけるPE1による標的化された挿入および欠失編集を示す。図47C～47Hは、図47Cに示されているとおりHEK3における+2G・CからC・Gのトランスバージョン編集、図47Dに示されているとおりHEK3における24bp FLAG挿入、図47Eに示されているとおりRNF2における+1C・GからA・Tのトランスバージョン編集、図47Fに示されているとおりEMX1における+1G・CからC・Gのトランスバージョン編集、図47Gに示されているとおりHBBにおける+2T・AからA・Tのトランスバージョン編集、および図47Hに示されているとおりFANCFにおける+1G・CからC・Gのトランスバージョン編集を組み入れるそれらの能力について、M-MLV RTバリアントを含有する18のプライム編集因子構築物の比較を示す。図47I～47Nは、独立した実験の第2ラウンドにおいて図47C-47Hに示されている編集を組み入れるそれらの能力について、M-MLVバリアントを含有する4つのプライム編集因子構築物の比較を示す。図47O～47Sは、様々なPBS長さによる5つのゲノム座位におけるPE2編集効率を示す。図47OはHEK3における+1T・AからA・Tのバリエーションを示す。図47PはEMX1における+5G・CからT・Aのバリエーションを示す。図47QはFANCFにおける+5G・CからT・Aのバリエーションを示す。図47RはRNF2における+1C・GからA・Tのバリエーションを示す。図47SはHEK4における+2G・CからT・Aバリエーションを示す。値およびエラーバーは3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映する。

図48A～48CはPEgRNA PBSおよびRT鋳型配列のデザイン特色を示す。図48Aは、RT鋳型長さの関数としてHEK293T細胞のVEGFAにおけるPE2によって媒介される+5G・CからT・Aのトランスバージョン編集効率(青色線)を示す。インデル(灰色線)が比較のためにプロットされている。グラフの下の配列は、PEgRNAによる合成のための鋳型とする編集のための最後のヌクレオチドを示す。Gヌクレオチド(PEgRNA上のCを鋳型とする)が強調されている;プライム編集効率を最大化するために、Cで終わるRT鋳型はPEgRNAのデザインの間に回避されるべきである。図48Bは、図48AのとおりDNMT1の+5G・CからT・Aのトランスバージョン編集およびインデルを示す。図48Cは、図48AのとおりRUNX1の+5G・CからT・Aのトランスバージョン編集およびインデルを示す。値およびエラーバーは3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映する。

図49A～49Bは、細胞生存性に対するPE2、PE2 R110S K103L、Cas9 H840Aニッカーゼ、およびdCas9の効果を示す。HEK293T細胞が、HEK3標的化PEgRNAプラスミドと一緒にPE2、PE2 R110S K103L、Cas9 H840Aニッカーゼ、またはdCas9をコードするプラスミドによってトランスフェクションされた。細胞生存性が、24時間毎に、トランスフェクション後に3日に渡ってCellTiter-Glo2.0アッセイ(Promega)を用いて測定された。図49Aは、トランスフェクション後の1、2、または3日にルミネセンスによって測定された生存性を示す。値およびエラーバーは、夫々が技術的トリプリケートで行われた3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.e.m.を反映する。図49Bは、+5GからAの編集をコードするHEK3標的化PEgRNAプラスミドと一緒に、PE2、PE2 R110S K103L、Cas9 H840Aニッカーゼ、またはdCas9について、パーセントの編集およびインデルを示す。編集効率が、トランスフェクション後の第3日に、図49Aの生存性をアッセイするために用いられたものと並べて、処置された細胞から測定された。値およびエラーバーは3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映する。

図50A～50Bは、種々のPEgRNAによるPE3によって媒介されるHBB E6V修正およびHEXA 1278+TATC修正を示す。図50Aは、PE3によるHEK293T細胞のHBB E6Vアレルの修正のための14のPEgRNAのスクリーンを示す。評価された全てのPEgRNAは、いずれかのサイレントなPAM変異の導入なしに、HBB E6Vアレルを再び野生型HBBに変換する。図50Bは、PE3またはPE3bによるHEK293T細胞のHEXA 1278+TATCアレルの修正のための41のPEgRNAのスクリーンを示す。HEXAと標識されたPEgRNAは、PAMを遮断しかつサイレントな変異を残すシフトした4bp欠失によって病原性のアレルを修正する。HEXAと標識されたPEgRNAは病原性のアレルを再び野生型へと修正する。「b」で終わるエントリーは編集特異的なニッキングsgRNAをPEgRNAとの組み合わせで用いる(PE3bシステム)。値およびエラーバーは3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映する。

図51A～51Fは、ヒト細胞株におけるPE3活性とPE3およびCas9によって開始されるHDRの比較とを示す。図51Aに示されているとおりHEK293T細胞、図51Bに示されているとおりK562細胞、図51Cに示されているとおりU2OS細胞、および図51Dに示されているとおりHeLa細胞において、PE3およびCas9によって開始されるHDRについて、正しい編集(インデルなし)およびインデル度数を生成する効率。各ひとくくりされた編集の比較は、PE3およびCas9によって開始されるHDRによって同一の編集を組み入れる。非標的化対照はPE3および非標的座位を標的化するPEgRNAである。図51Eは、野生型Cas9 HDR実験と比較した非標的化PEgRNA+PE3およびdCas9+sgRNAによる対照実験を示す。見かけ上のHDR効率を偽性的に上昇させる普通のコンタミナントのssDNAドナーHDR鋳型が図51A～51DのHDR測定に寄与しないということを確認している。図51Fは、PE3またはCas9によって開始されるHDRによる編集後にK562細胞から単離されたゲノムDNAサンプルからの例のHEK3部位アレル表を示す。アレルがIllumina MiSeqによって配列決定され、CRISPResso2によって分析された¹⁷⁸。この領域からの参照HEK3配列は上側にある。アレル表が、非標的化PEgRNAの負の対照、PE3を用いるHEK3における+1CTT挿入、およびCas9によって開始されるHDRを用いるHEK3における+1CTT挿入について示されている。アレル度数および対応するIllumina配列決定読取カウントが各アレルについて示されている。度数≧0.20％で観察された全てのアレルが示されている。値およびエラーバーは3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映する。

図52A～52Dは、ClinVarデータベース上の病原性の挿入、重複、欠失、およびインデルの長さの分布を示す。ClinVarバリアントサマリーが2019年7月15日にNCBIからダウンロードされた。報告された挿入、欠失、および重複の長さが、参照および代替対立遺伝子、バリアントスタートおよびストップ位置、またはバリアント名称の適当な識別情報を用いて計算された。上の情報のいずれかを報告しなかったバリアントは分析から排除された。報告されたインデル(参照ゲノムに対して相対的に挿入および欠失両方を包含する単一のバリアント)の長さは、参照および代替対立遺伝子の間の最も良好なペアワイズアラインメントにおけるミスマッチまたはギャップの数を決定することによって計算された。

図53A～53Bは、GFP陽性の細胞ソーティングについてFACSゲーティング例を示す。下は元々のバッチ分析ファイルの例であり、HEXA 1278+TATCおよびHBB E6V HEK293T細胞株を生成するために用いられたソーティング戦略を概説する。イメージデータはCell Sorterソフトウェアv.3.0.5を用いてSony LE-MA900サイトメーターによって生成された。グラフィック1は、GFPを発現しない細胞のゲーティングプロットを示す。グラフィック2は、HBB E6V HEK293T細胞株を単離するために用いられたP2A-GFP発現細胞の例のソーティングを示す。HEK293T細胞は、当初にはFSC-A/BSC-A(ゲートA)を用いて集団でゲーティングされ、それからFSC-A/FSC-H(ゲートB)を用いてシングレットについてソーティングされた。生細胞はDAPI陰性細胞(ゲートC)をゲーティングすることによってソーティングされた。負の対照の細胞のものよりも上であるGFP蛍光レベルを有する細胞は、フルオロクロームとしてEGFPを用いてソーティングされた(ゲートD)。図53AはHEK293T細胞(GFP陰性)を示す。図53Bは、PE2-P2A-GFPを発現する細胞についてのFACSゲーティングの代表的なプロットを示す。図53Cは、HEXA 1278+TATCホモ接合体HEK293T細胞の遺伝子型を示す。図53DはHBB E6Vホモ接合体HEK293T細胞株のアレル表を示す。

図54はPEgRNAクローニング手続きをまとめる模式図である。

図55A～55GはPEgRNAデザインの模式図である。図55Aは、ドメインが標識された(左)およびゲノム部位においてnCas9に結合された(右)PEgRNAの単純なダイアグラムを示す。図55Bは、活性を増大させることが予期されるPEgRNAの種々の型の修飾を示す。図55Cは、プロモーター選択肢ならびに5'、3'プロセシングおよび終結によってより長いRNAの転写を増大させるためのPEgRNAの修飾を示す。図55DはP1システムの長大化を示す。これは骨格修飾の例である。図55Eは、鋳型領域上におけるまたはPEgRNA上の他所における合成的修飾の組み込みが活性を増大させ得るということを示す。図55Fは、鋳型上の最小限の二次構造のデザインされた組み込みが、より長いより阻害性の二次構造の形成を防止し得るということを示す。図55Gは、PEgRNAの3'端においてRNAエレメントによってアンカー固定された第2の鋳型配列を有する分裂PEgRNAを示す(左)。PEgRNAの5'または3'端におけるエレメントの組み込みはRT結合を増強し得る。

図56A～56Dは標的座位へのPEgRNA骨格配列の組み込みを示す。HTSデータが図60A～60Bに記載されているとおりPEgRNA骨格配列挿入について分析された。図56AはEMX1座位の分析を示す。RT鋳型に隣接する挿入上に1つ以上のPEgRNA骨格配列ヌクレオチドを含有する配列決定総読取の％(左);規定された長さのPEgRNA骨格配列挿入を含有する配列決定総読取のパーセンテージ(中央);および最高でX軸上に規定された長さを包含するPEgRNA挿入の累積のトータルパーセンテージが示されている。図56Bは図56Aと同じことをFANCFについて示す。図56Cは図56Aと同じことをHEK3について示す。図56Dは図56Aと同じことをRNF2について示す。値およびエラーバーは3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映する。

図57A～57Iは、トランスクリプトームワイドなRNA存在量に対するPE2、PE2-dRT、およびCas9 H840Aニッカーゼの効果を示す。PE2、PE2-dRT、またはCas9 H840AニッカーゼとPRNP標的化またはHEXA標的化PEgRNAとを発現するHEK293T細胞から単離された、リボソームRNAを枯渇させられた細胞RNAの分析。14,410遺伝子および14,368遺伝子に対応するRNAが夫々PRNPおよびHEXAサンプルにおいて検出された。図57A～57Fは、-log10 FDR調整されたp値対log2転写物存在量の～倍の変化を各(Aeach)RNAについて呈示するボルケーノプロットを示す。(図57A)PRNP標的化PEgRNAによるPE2対PE2-dRT、(図57B)PRNP標的化PEgRNAによるPE2対Cas9 H840A、(図57C)PRNP標的化PEgRNAによるPE2-dRT対Cas9 H840A、(図57D)HEXA標的化PEgRNAによるPE2対PE2-dRT、(図57E)HEXA標的化PEgRNAによるPE2対Cas9 H840A、(図57F)HEXA標的化PEgRNAによるPE2-dRT対Cas9 H840Aを比較している。赤色のドットは、統計的に有意である相対存在量の≧2倍の変化を示す遺伝子を指示する(FDR調整されたp＜0.05)。図57G-57Iは、上方制御および下方制御される転写物(≧2倍変化)のベン図であり、PRNPおよびHEXAサンプルを(図57G)PE2対PE2-dRT、(図57H)PE2対Cas9 H840A、および(図57I)PE2-dRT対Cas9 H840Aについて比較している。

図58はニューロン核ソーティングのための代表的なFACSゲーティングを示す。核が、DyeCycle Rubyシグナル、FSC/SSC比、SSC幅/SSC高さ比、およびGFP/DyeCycle比に基づいて逐次的にゲーティングされた。

図59A～59Fは、3'伸長されたPEgRNAをゴールデンゲートアセンブリによって哺乳類U6発現ベクター上にクローニングするためのプロトコールを示す。図59Aはクローニングの概観を示す。図59Bは「ステップ1:pU6-PEgRNA-GG-ベクタープラスミドを消化(構成要素1)」を示す。図59Cは「ステップ2および3:オリゴヌクレオチドパーツを順序付けおよびアニーリング(構成要素2、3、および4)」を示す。図59Dは「ステップ2.b.ii.:sgRNA骨格リン酸化(オリゴヌクレオチドがリン酸化されて購入された場合には不必要)」を示す。図59Eは「ステップ4:PEgRNAアセンブリ」を示す。図59Fは「ステップ5および6:アセンブリされたプラスミドの形質転換」を示す。図59FはPEgRNAクローニングプロトコールをまとめるダイアグラムを示す。

図60A～60Bは、PEgRNA骨格取り入れを定量するためのPythonスクリプトを示す。標的ゲノム座位におけるPEgRNA挿入を特徴付けおよび定量するために、カスタムのpythonスクリプトが生成された。スクリプトは、参照配列(ガイドRNA骨格配列)から取られた増大していく長さのテキストストリングをfastqファイル内の配列決定読取と反復的にマッチさせ、検索クエリにマッチする配列決定読取の数をカウントする。各順次のテキストストリングは、ガイドRNA骨格配列の追加のヌクレオチドに対応する。厳密な長さ取り入れおよび最高で規定された長さの累積の取り入れが、この様式で計算された。sgRNAの短いスライスのアラインメントおよび正確なカウントを保証するために、参照配列のスタートにおいては、逆転写酵素によって合成される新たなDNA鎖の3'端の5から6塩基が包含される。

図61は、SaCas9(N580A)-MMLV RT HEK3 +6C＞Aについて、規定された編集を有する配列決定総読取のパーセントを示すグラフである。正しい編集およびインデルの値が示されている。

図62A～62Bは、プライム編集による精密な位置付けにおける所望の編集の効率的な組み入れにとってのプロトスペーサーの重要性を示す。図62Aは、種々のHEK3座位について、標的T・A塩基対がA・Tに変換された配列決定総読取のパーセントを示すグラフである。図62Bはそれを示す配列分析である。

図63はPAM編集のSpCas9 PAMバリアントを示すグラフである(N=3)。標的化されたPAM編集を有する配列決定総読取のパーセントが、NGA＞NTAであるSpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RTについて、およびNGCG＞NTCGであるSpCas9(H840A)-VRER-MMLV RTについて示されている。用いられたPEgRNAプライマー結合部位(PBS)長さ、RT鋳型(RT)長さ、およびPEシステムが列記される。

図64は、PEを用いるゲノム上への種々の部位特異的リコンビナーゼ(SSR)標的の導入を示す模式図である。(a)は、プライム編集因子によるリコンビナーゼ標的配列の挿入の一般的な模式図を提供する。(b)は、どのようにしてPEによって挿入される単一のSSR標的がDNAドナー鋳型のゲノム取り入れのための部位として用いられ得るかを示す。(c)は、どのようにしてSSR標的部位のタンデム挿入がゲノムの部分を欠失させるために用いられ得るかを示す。(d)は、どのようにしてSSR標的部位のタンデム挿入がゲノムの部分を逆位させるために用いられ得るかを示す。(e)は、どのようにして2つの遠位の染色体領域における2つのSSR標的部位の挿入が染色体転座をもたらし得るかを示す。(f)は、どのようにしてゲノム上の2つの異なるSSR標的部位の挿入がDNAドナー鋳型からのカセットを交換するために用いられ得るかを示す。さらなる詳細は例17を見よ。

図65は、1)ヒト細胞ゲノム上のSSR標的部位のPEによって媒介される合成および2)GFP発現マーカーを含むDNAドナー鋳型を取り入れするためのそのSSR標的部位の使用を示す。ひとたび首尾良く取り入れられると、GFPは細胞が蛍光発光することを引き起こす。さらなる詳細は例17を見よ。

図66は、2つのPEの半分のタンパク質として提供されているプライム編集因子の1つの態様を図示する。これらは、プライム編集因子の半分のタンパク質の夫々の終わりまたは始まりに位置付けられた分裂インテインの半分同士の自己スプライシング作用によって、丸ごとのプライム編集因子を再生する。

図67は、N末端およびC末端エクステイン配列の間におけるポリペプチド配列からのインテイン除去およびペプチド結合の再形成の機序を図示する。(a)は、夫々がインテイン配列の半分を含有する2つの半分のタンパク質の一般的な機序を図示する。これらは、細胞内で接触するときに、完全に機能的なインテインをもたらす。これは、それから、自己スプライシングおよび切除を経過する。切除のプロセスはN末端のタンパク質の半分(または「Nエクステイン」)およびC末端のタンパク質の半分(または「Cエクステイン」)の間におけるペプチド結合の形成をもたらして、NエクステインおよびCエクステイン部分を含む丸ごとの単一ポリペプチドを形成する。種々の態様において、Nエクステインは分裂されたプライム編集因子融合タンパク質のN末端の半分に対応し得、Cエクステインは分裂されたプライム編集因子のC末端の半分に対応し得る。(b)は、インテイン切除とNエクステインの半分(赤色をした半分)およびCエクステインの半分(青色をした半分)を連結するペプチド結合の再形成との化学的機序を示す。それにはトランスで提供される2つの別個の構成要素のスプライシング作用が関わるので、分裂インテイン(すなわち、分裂インテイン構成でのNインテインおよびCインテイン)の切除は「トランススプライシング」ともまた言われ得る。

図68Aは、HEK293T細胞にコトランスフェクションされるときに、リンカーにおけるSpPE(配列番号762)の分裂インテインの半分同士両方の送達が3つの試験座位において活性を維持するということを実証する。

図68Bは、HEK293T細胞にコトランスフェクションされるときに、SaPE2(例えば、配列番号443および配列番号450)の分裂インテインの半分同士両方の送達が全長SaPE2(配列番号134)の活性を再現するということを実証する。引用符で指示されている残基はSaCas

9のアミノ酸741-743(C末端エクステインの最初の残基)の配列であり、これらはインテイントランススプライシング反応にとって重要である。「SMP」はネイティブな残基である。我々はこれらを「CFN」コンセンサススプライシング配列へもまた変異させた。プライム編集パーセンテージによって測定されるとおり、コンセンサス配列は最も高い再構成を生むことが示されている。

図68Cは、種々の開示されるPEリボヌクレオタンパク質複合体(高濃度のPE2、高濃度のPE3、および低濃度のPE3)がこの様式で送達され得るということを示すデータを提供する。

図69は、PANCEにおけるPE有効性を決定するためのバクテリオファージプラークアッセイを示す。プラーク(暗色の円)は首尾良くE.coliに感染する能力があるファージを指示する。L-ラムノースの濃度を増大させることは、PEの増大した発現およびプラーク形成の増大をもたらす。プラークの配列決定は、PEによって組み入れされるゲノム編集の存在を明らかにした。

図70A～70Iは、プライム編集のためのPEgRNAおよびニッキングsgRNAをデザインするためのステップバイステップの説明書の例解として、編集された標的配列の例を提供する。図70A:ステップ1．標的配列および編集を定める。所望の編集(点変異、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせ)の位置付けを中心にした標的DNA領域(～200bp)の配列をリトリーブする。図70B:ステップ2．標的PAMを位置付ける。編集位置付けに対して近位のPAMを同定する。両鎖上のPAMを探すように気をつける。編集位置に近接するPAMが好ましいが、編集位置から≧30ntにニックを置くプロトスペーサーおよびPAMを用いて編集を組み入れることが可能である。図70C:ステップ3．ニック部位を位置付ける。考慮されようとする各PAMについて、対応するニック部位を同定する。Sp Cas9 H840Aニッカーゼでは、切断はPAM含有鎖上においてNGG PAMの5'の第3および第4の塩基の間で生起する。全ての編集されるヌクレオチドはニック部位の3'に存在しなければならない。そのため、適当なPAMがPAM含有鎖上の標的編集の5'にニックを置かなければならない。下で示されている例では、2つの可能なPAMがある。単純のために、残りのステップはPAM 1のみを用いるPEgRNAのデザインを実証する。図70D:ステップ4．スペーサー配列をデザインする。Sp Cas9のプロトスペーサーは、PAM含有鎖上のNGG PAMの5'の20ヌクレオチドに対応する。効率的なPol III転写開始はGが第1の転写されるヌクレオチドであることを要求する。プロトスペーサーの第1のヌクレオチドがGである場合には、PEgRNAのスペーサー配列は単純にプロトスペーサー配列である。プロトスペーサーの第1のヌクレオチドがGではない場合には、PEgRNAのスペーサー配列は、G、次にプロトスペーサー配列である。図70E:ステップ5．プライマー結合部位(PBS)をデザインする。出発アレル配列を用いて、PAM含有鎖上のDNAプライマーを同定する。DNAプライマーの3'端はニック部位のちょうど上流のヌクレオチドである(すなわち、Sp Cas9ではNGG PAMの5'の第4の塩基)。PE2およびPE3への使用のための一般的なデザイン原理としては、DNAプライマーに対する相補性の12から13ヌクレオチドを含有するPEgRNAプライマー結合部位(PBS)が、～40-60％のGC含量を含有する配列に用いられ得る。低いGC含量を有する配列では、より長い(14から15nt)PBSが試験されるべきである。より高いGC含量を有する配列では、より短い(8から11nt)PBSが試験されるべきである。GC含量にかかわらず、最適なPBS配列は経験的に決定されるはずである。長さpのPBS配列をデザインするためには、出発アレル配列を用いて、PAM含有鎖上のニック部位の5'の最初のpヌクレオチドの逆相補体を取る。図70F:ステップ6．RT鋳型をデザインする。RT鋳型は、デザインされた編集と編集に隣接する配列に対する相同性とをコードする。最適なRT鋳型長さは標的部位に基づいて変わる。ショートレンジ編集(位置+1から+6)では、短い(9から12nt)、中程度の(13から16nt)、および長い(17から20nt)RT鋳型を試験することが推奨される。ロングレンジ編集(位置+7以降)では、十分な3'DNAフラップ相同性を許すために、編集の位置を越えて少なくとも5nt(好ましくは10nt以上)伸長するRT鋳型を用いることが推奨される。ロングレンジ編集では、機能的なデザインを同定するためには、いくつかのRT鋳型がスクリーニングされるべきである。より大きい挿入および欠失(≧5nt)では、RT鋳型上へのより多大な3'相同性(～20nt以上)の組み込みが推奨される。RT鋳型が、逆転写されるDNA産物上の最後のヌクレオチドとしてG(PEgRNAのRT鋳型ではCに対応する)の合成をコードするときには、編集効率は典型的には損なわれる。多くのRT鋳型が効率的なプライム編集を支持するので、RT鋳型をデザインするときには、最後の合成されるヌクレオチドとしてのGの回避が推奨される。長さrのRT鋳型配列をデザインするためには、所望のアレル配列を用い、元々はPAMを含有した鎖上のニック部位の3'の最初のrヌクレオチドの逆相補体を取る。SNP編集と比較して、同じ長さのRT鋳型を用いる挿入または欠失編集は同一の相同性を含有しないであろうということに注意。図70G:ステップ7．完全なPEgRNA配列をアセンブリする。PEgRNA構成要素を次の順序でコンカテネーションする(5'から3'):スペーサー、骨格、RT鋳型、およびPBS。図70H:ステップ8．PE3のためのニッキングsgRNAをデザインする。編集の上流および下流の非編集鎖上のPAMを同定する。最適なニッキング位置は高度に座位依存性であり、経験的に決定されるはずである。一般的に、PEgRNAによって誘導されるニックの向かいの位置の40から90ヌクレオチド5'に置かれたニックは、より高い編集収量およびより少数のインデルに至る。ニッキングsgRNAは、出発アレル上の20ntプロトスペーサーにマッチするスペーサー配列を有する。プロトスペーサーがGで始まらない場合には5'Gの追加を有する。図70I:ステップ9．PE3bニッキングsgRNAをデザインする。PAMが相補鎖上に存在し、かつその対応するプロトスペーサーが編集のために標的化される配列とオーバーラップする場合には、この編集はPE3bシステムの候補であり得る。PE3bシステムでは、ニッキングsgRNAのスペーサー配列は出発アレルではなく所望の編集されるアレルの配列にマッチする。編集されるヌクレオチド(単数または複数)がニッキングsgRNAプロトスペーサーのシード領域(PAMに隣接する～10nt)内に収まるときには、PE3bシステムは効率的に作動する。これは、編集された鎖の組み入れ後まで相補鎖のニッキングを防止し、標的DNAに結合することについてのPEgRNAおよびsgRNAの間の競合を防止する。PE3bは、両方の鎖上の同時のニックの生成をもまた回避し、それゆえに、高い編集効率を維持しながらインデル形成を有意に縮減する。PE3b sgRNAは、所望のアレルの20ntプロトスペーサーにマッチするスペーサー配列を有するはずである。必要とされる場合には5'Gの追加を有する。

図71AはSpCas9 PEgRNA分子(上側)のヌクレオチド配列を示す。これは3'端において「UUU」で終結し、トウループエレメントを含有しない。図の下方の部分は同じSpCas9 PEgRNA分子を図示するが、「UUU」3'端の直ちに前に挿入された配列5'-「GAAANNNNN」-3'を有するトウループエレメントを含有するようにさらに改変される。「N」はいずれかの核酸塩基であり得る。

図71Bは例18の結果を示す。これは、HEK細胞またはEMX細胞におけるプライム編集の効率がトウループエレメントを含有するPEgRNAを用いて増大させられるが、インデル形成のパーセントは大きくは変化なしであるということを実証する。

図72はプライム編集に用いられ得る代替的なPEgRNA構成を図示する。(a)はプライム編集のPE2:PEgRNA態様を図示する。この態様には、PEgRNAと複合体化したPE2(Cas9および逆転写酵素を含む融合タンパク質)が関わる(図1A-1Iおよび/または図3A-3Eにもまた記載されているとおり)。この態様では、逆転写の鋳型がsgRNAの3’伸長アーム上に組み込まれてPEgRNAを作り、DNAポリメラーゼ酵素はCas9に直接的に融合された逆転写酵素(RT)である。(b)はMS2cp-PE2:sgRNA+tPERT態様を図示する。この態様は、PE2融合体(Cas9+逆転写酵素)を含み、これがさらにMS2バクテリオファージコートタンパク質(MS2cp)に融合されてMS2cp-PE2融合タンパク質を形成する。プライム編集を達成するためには、MS2cp-PE2融合タンパク質はsgRNAと複合体化させられ、これは複合体をDNA上の特異的な標的部位へと標的化する。それから、態様には、トランスプライム編集RNA鋳型(「tPERT」)の導入が関わり、これは、プライマー結合部位(PBS)およびDNA合成鋳型を別個の分子、すなわちtPERTによって提供することによって、PEgRNAの代わりに作動する。これはMS2アプタマー(ステムループ)をもまた備える。MS2cpタンパク質は分子のMS2アプタマーに結合することによってtPERTを動員する。(c)は、核酸分子の化学合成のための公知の方法によって達成され得るPEgRNAの代替的なデザインを図示する。例えば、プライム編集への使用のためのハイブリッドRNA/DNA PEgRNA分子を合成するために、化学合成が用いられ得、ハイブリッドPEgRNAの伸長アームはRNAの代わりにDNAである。かかる態様では、プライム編集によって形成される所望の遺伝子変化を含む3'DNAフラップを合成するために、DNA依存性DNAポリメラーゼが逆転写酵素の代わりに用いられ得る。別の態様では、伸長アームは、化学的リンカーを包含するように合成され得、これは、DNAポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)がsgRNA骨格またはバックボーンを鋳型として用いることを防止する。なお別の態様では、伸長アームは、PEgRNA分子の総体的な向きに対して相対的に逆の向きを有するDNA合成鋳型を含み得る。例えば、sgRNA骨格の3'端に取り付けられた伸長を有するかつ5'から3'の向きのPEgRNAについて示されるとおりでは、DNA合成鋳型は、対向する方向、すなわち3'から5'の方向を向く。この態様は、gRNAの3’端に位置取った伸長アームを有するPEgRNA態様にとって有利であり得る。伸長アームの向きを逆にすることによって、ひとたびそれが伸長アームの新たな向きの5’に達すると、ポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)によるDNA合成は終結し、それゆえに、鋳型としてgRNAコアを用いるリスクがないであろう。

図73はtPERTおよびMS2動員システム(MS2タグ付け技術としてもまた公知)によるプライム編集を実証する。プライム編集因子タンパク質(PE2)を標的座位へと標的化するsgRNAが、プライマー結合部位(13ntまたは17nt PBS)、His6タグ挿入および相同アームをコードするRT鋳型、ならびにMS2アプタマー(tPERT分子の5'または3'端に位置付けられる)を含有するtPERTとの組み合わせで発現される。プライム編集因子タンパク質(PE2)、またはPE2のN末端へのMS2cpの融合体どちらかが用いられた。先に開発されたPE3システムのとおり、相補鎖ニッキングsgRNAありまたはなしで、編集が実行された(夫々標識「PE2+ニック」または「PE2」としてx軸上に指定されている)。これは「第2鎖ニッキング」ともまた言われ、本願において定められる。

図74は、トランスでの逆転写酵素のMS2アプタマー発現とMS2アプタマーシステムによるその動員とを実証する。PEgRNAのPEgRNAは2つのsgRNA骨格ヘアピンのどちらか1つに挿入されたMS2 RNAアプタマーを含有する。野生型M-MLV逆転写酵素はMS2コートタンパク質(MCP)へのN末端またはC末端融合体として発現される。編集はHEK293T細胞のHEK3部位においてである。

図75は、PE2、PE2-trunc、PE3、およびPE3-truncの効率(すなわち「規定された編集またはインデルを有する配列決定総読取の％」)を種々の細胞株の異なる標的部位について比較する棒グラフを提供する。データは、短縮されたRTバリアントを含むプライム編集因子が短縮されていないRTタンパク質を含むプライム編集因子と約同じくらい効率的であったということを示す。

図76は例20のインテイン分裂プライム編集因子の編集効率を実証する。HEK239T細胞が、全長PE2またはインテイン分裂PE2、PEgRNA、およびニッキングガイドRNAをコードするプラスミドによってトランスフェクションされた。コンセンサス配列(C末端エクステインのほとんどのアミノ末端残基)が指示されている。2つの部位におけるパーセント編集が示されている:HEK3 +1CTT挿入およびPRNP +6GからT。レプリケートn=3つの独立したトランスフェクション。例20を見よ。

図77は例20のインテイン分裂プライム編集因子の編集効率を実証する。編集は、ICV注射によるP0マウスへのSpPE3半分当たり5E10vgおよび小量1E10の核局在GFP:KASHの送達によって、バルクの皮質およびGFP+亜集団の標的化されたディープ配列決定によって評価された。編集因子およびGFPがEFSプロモーターを有するAAV9にパッケージングされた。マウスが注射の3週間後に収穫され、GFP+核がフローサイトメトリーによって単離された。個々のデータポイントは、分析された条件当たり1-2マウスで示されている。例20を見よ。

図78は例20のインテイン分裂プライム編集因子の編集効率を実証する。具体的には、図は例20に用いるAV分裂SpPE3構築物を図示する。SpPE3-NおよびSpPE3-Cを別個に発現するAAV粒子による共形質導入はPE3活性を再現する。N末端ゲノムはニッキングsgRNAを発現するU6-sgRNAカセットを含有し、C末端ゲノムはPEgRNAを発現するU6-PEgRNAカセットを含有するということに注意せよ。例20を見よ。

図79は、例21で論じられるある種の最適化されたリンカーの編集効率を示す。特に、データは、リンカーが指示されている配列によって置き換えられた種々のバージョンと比較して、現行のリンカーを有するPE2構築物の編集効率(PE2と記される。白色のボックス)を、HEK3、EMX1、FANCF、RNF2座位において、トランジション、トランスバージョン、挿入、および欠失編集の代表的なPEgRNAについて示す。置き換えリンカーは「1×SGGS」、「2×SGGS」、「3×SGGS」、「1×XTEN」、「リンカーなし」、「1×Gly」、「1×Pro」、「1×EAAAK」、「2×EAAAK」、および「3×EAAAK」と言われる。編集効率はPE2の「対照」編集効率に対して相対的に棒グラフフォーマットで測定される。PE2のリンカーはSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS(配列番号127)である。全ての編集はPE3システムという文脈でされた。すなわち、これはPE2編集構築物プラス最適な二次sgRNAニッキングガイドの追加を言う。例21を見よ。

PE2に対して相対的に平均の～倍の効力を取ることは、示されているグラフを生み、1×XTENリンカー配列の使用が編集効率を平均で1.14倍改善するということを指示する(n=15)。例21を見よ。

図81は、例22に記載されているとおり、異なるプロモーターからのPEgRNAの転写レベルを図示する。

例22に図示されているとおり、未改変のPEgRNAに対して相対的な編集効率に対するPEgRNA構造上の異なる型の修飾のインパクト。

図83は、HEK3遺伝子の編集を標的化したPE実験を図示する。ニック部位に対して相対的に位置+1における10nt挿入の挿入を特異的に標的化し、PE3を用いた。例22を見よ。

図84Aは、スペーサー、gRNAコア、および伸長アーム(RT鋳型+プライマー結合部位)を有する例示のPEgRNAを図示する。これは、UCUリンカーを介してカップリングされたtRNA分子によってPEgRNAの3'端を修飾されている。tRNAは種々の転写後修飾を包含する。しかしながら、前記修飾は要求されない。

図84Bは、PEgRNA構造を改変するために用いられ得るtRNAの構造を図示する。例22を見よ。P1は長さが可変であり得る。P1は、PEgRNA-tRNA融合体のRNAsePプロセシングを防止することを助けるように伸長され得る。

図85はFANCF遺伝子の編集を標的化したPE実験を図示する。ニック部位に対して相対的に位置+5におけるGからTの変換を特異的に標的化し、PE3構築物を用いた。例22を見よ。

図86はHEK3遺伝子の編集を標的化したPE実験を図示する。ニック部位に対して相対的に位置+1における71nt FLAGタグ挿入の挿入を特異的に標的化し、PE3構築物を用いた。例22を見よ。

pegRNAが1412Adelを組み入れるN2A細胞のスクリーニングからの結果と、プライマー結合部位(PBS)長さおよび逆転写酵素(RT)鋳型長さの詳細(インデルありおよびなしで示されている)。例23を見よ。

pegRNAが1412Adelを組み入れるN2A細胞のスクリーニングからの結果と、プライマー結合部位(PBS)長さおよび逆転写酵素(RT)鋳型長さの詳細(インデルありおよびなしで示されている)。例23を見よ。

図89は、健康なHSCのβ-グロビン遺伝子の近位(proxy)座位におけるおよびHEK3における編集の結果を図示する。編集因子対pegRNAおよびニッキングgRNAの濃度を変えている。例23を見よ。

定義
別様に定められない限り、本願において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の業者によって普通に理解される意味を有する。次の参照は、本発明に用いられる用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する:Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988);The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991);およびHale & Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。別様に規定されない限り、本願において用いられる次の用語はそれらに帰せられる意味を有する。

アンチセンス鎖
遺伝学において、二本鎖のDNA内のセグメントの「アンチセンス」鎖は、鋳型鎖であって、3'→5'配向に伸びる(runs)と考えられる。これに反して、「センス」鎖は、5'から3'へ伸びる二本鎖のDNA内のセグメントであって、3'から5'へ伸びるDNAのアンチセンス鎖または鋳型鎖に相補的である。タンパク質をコードするDNAセグメントのケースにおいて、センス鎖は、転写の最中にその鋳型としてアンチセンス鎖を取り結局(典型的には、常にではない)翻訳を経てタンパク質になるmRNAと同じ配列を有するDNAの鎖である。よって、アンチセンス鎖は、後にタンパク質へ翻訳されるRNAを担い、一方センス鎖は、mRNAとほぼ同一の組成(makeup)を保有する。dsDNAの各セグメントについて、一方がどの方向から読まれるかに応じて、おそらく(センスおよびアンチセンスは視点に相対するから)センスおよびアンチセンスが2組存在するであろう点に留意する。遺伝子産物またはmRNAは結局、dsDNAの一方のセグメントのどちらかの鎖がセンスまたはアンチセンスと称されることを示す。

二重特異性リガンド
本願において用いられる用語「二重特異性リガンド」または「二重特異性部分」は、2つの異なるリガンド結合ドメインに結合するリガンドを言う。ある態様において、リガンドは低分子化合物またはペプチドまたはポリペプチドである。他の態様において、リガンド結合ドメインは「二量体化ドメイン」であり、これがペプチドタグとしてタンパク質上に組み入れられ得る。種々の態様では、同じかまたは異なる二量体化ドメインを夫々が含む2つのタンパク質が、二重特異性リガンドに対する各二量体化ドメインの結合によって二量体化するように誘導され得る。本願において用いられる「二重特異性リガンド」は同等に「二量体化の化学的誘導因子」または「CID」と言われ得る。

Cas9
用語「Cas9」または「Cas9ヌクレアーゼ」は、Cas9ドメインまたはそのフラグメントを含む、RNAにガイドされるヌクレアーゼ(例として、Cas9の活性もしくは不活性なDNA切断ドメインおよび/またはCas9のgRNA結合ドメインを含むタンパク質)を指す。「Cas9ドメイン」は、本明細書に使用されるとき、Cas9の活性もしくは不活性な切断ドメインおよび/またはCas9のgRNA結合ドメインを含むタンパク質フラグメントである。「Cas9タンパク質」は、全長Cas9タンパク質である。Cas9ヌクレアーゼはまた、ときにcasn1ヌクレアーゼまたはCRISPR(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat))関連ヌクレアーゼとしても言及される。CRISPRは、可動遺伝因子(ウイルス、転移因子、および接合性プラスミド)に対して保護を提供する適応免疫系である。CRISPRクラスターは、スペーサー、先行する可動因子に相補的な配列、および標的化侵入核酸を含有する。CRISPRクラスターは転写され、プロセスを受けて(processed)CRISPR RNA(crRNA)になる。II型CRISPR系において、pre-crRNAの修正プロセシングは、transでコードされた低分子(small)RNA(tracrRNA)、内生リボヌクレアーゼ3(rnc)、およびCas9ドメインを要する。tracrRNAは、pre-crRNAの、リボヌクレアーゼ3に補助された(-aided)プロセシングのためのガイドとして働く。続いて、Cas9/crRNA/tracrRNAは、スペーサーに相補的な線状または環状のdsDNA標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。crRNAに相補的ではない標的鎖は、最初にエンドヌクレアーゼ的に切られ、次いで3'-5'エキソヌクレアーゼ的に切り取られる。本来、DNAの結合および切断は、典型的には、タンパク質および両RNAを要する。しかしながら、単一ガイドRNA(「sgRNA」、または単に「gNRA」)は、crRNAとtracrRNAとの両方の側面を単一RNA種中へ組み込むために、改変され得る。例として、Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)を参照(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)。Cas9は、CRISPR反復配列(PAMまたはプロトスペーサー隣接モチーフ)中の短いモチーフを認識することで、自己・対・非自己を区別するのに役立つ。Cas9ヌクレアーゼ配列および構造は当業者に周知である(例として、“Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.”Ferretti et al.,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001);“CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.”Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);および“A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.”Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)を参照(これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))。Cas9オルソログは、これらに限定されないが、S.pyogenesおよびS.thermophilusを包含する様々な種において記載されている。追加の好適なCas9ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づき当業者に明らかであろう。またかかるCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier,“The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems”(2013)RNA Biology 10:5,726-737(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に開示された生物および遺伝子座からのCas9配列を包含する。いくつかの態様において、Cas9ヌクレアーゼは、DNA切断ドメインを部分的に損なうかまたは不活性化させる1以上の突然変異を含む。

ヌクレアーゼが不活性化されたCas9ドメインは、互換的に「dCas9」タンパク質(ヌクレアーゼが「不活性型」のCas9を表す)と称されてもよい。不活性なDNA切断ドメインを有するCas9ドメイン(またはそのフラグメント)を生成するための方法は知られている(例として、Jinek et al.,Science.337:816-821(2012);Qi et al.,“Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression”(2013)Cell.28;152(5):1173-83を参照(これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))。例えば、Cas9のDNA切断ドメインは、2つのサブドメイン、HNHヌクレアーゼサブドメインおよびRuvC1サブドメインを包含することが知られている。HNHサブドメインはgRNAに相補的な鎖を切断するのに対し、RuvC1サブドメインは非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の突然変異は、Cas9のヌクレアーゼ活性をサイレンシングさせ(silence)得る。例えば、突然変異D10AおよびH840Aは、S.pyogenes Cas9のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する(Jinek et al.,Science.337:816-821(2012);Qi et al.,Cell.28;152(5):1173-83(2013))。いくつかの態様において、Cas9のフラグメントを含むタンパク質が提供される。例えば、いくつかの態様において、タンパク質は、2つのCas9ドメイン:(1)Cas9のgRNA結合ドメイン;または(2)Cas9のDNA切断ドメインのうち一方を含む。いくつかの態様において、Cas9を含むタンパク質またはそのフラグメントは、「Cas9バリアント」と称される。Cas9バリアントは、Cas9またはそのフラグメントとの相同性を共有する。例えば、Cas9バリアントは、野生型Cas9(例として、配列番号18のSpCas9)と、少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、少なくとも約99.8％同一、または少なくとも約99.9％同一である。いくつかの態様において、Cas9バリアントは、野生型Cas9(例として、配列番号18のSpCas9)と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれ以上のアミノ酸変化を有していてもよい。いくつかの態様において、Cas9バリアントは、そのフラグメントが、野生型Cas9(例として、配列番号18のSpCas9)の対応するフラグメントと、少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、または少なくとも約99.9％同一となるように、配列番号X Cas9のフラグメント(例として、gRNA結合ドメインまたはDNA切断ドメイン)を含む。いくつかの態様において、フラグメントは、対応する野生型Cas9(例として、配列番号18のSpCas9)のアミノ酸の長さの、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一の、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％である。

cDNA
用語「cDNA」は、RNA鋳型からコピーされたDNAの鎖を指す。cDNAは、RNA鋳型に相補的である。

循環置換体
本明細書に使用されるとき、用語「循環置換体(circular permutant)」は、タンパク質のアミノ酸配列中に現れるアミノ酸の順序の変化を伴うタンパク質の構造上の立体配置における変化である循環置換(circular permutation)を含むタンパク質またはポリペプチド(例として、Cas9)を指す。換言すれば、循環置換体は、野生型対応物と比較してN末端およびC末端が変更されたタンパク質であり、例として、野生型タンパク質のC末端半分が新しいN末端半分になっている。循環置換(またはCP)は本質的に、そのN末端およびC末端が接続され、しばしばペプチドリンカーをもつ、タンパク質1次配列の形態上の再配置であるが、同時にその配列を異なる位置にて分裂させることで、隣接していた新しいN末端およびC末端が創出される。その結果は、接続が異なるが、しばしば同じか全体的には同様の3次元の(3D)形状を有し得るタンパク質構造であって、おそらく、改善または変更された特徴(タンパク分解への低減された感受性、改善された触媒活性、変更された基質結合もしくはリガンド結合、および/または改善された熱安定性を包含する)を包含する。循環置換タンパク質は天然に存在し得る(例として、コンカナバリンAおよびレクチン)。加えて、循環置換は、翻訳後修飾の結果として生じ得るか、または組換え技法を使用して改変されてもよい。

循環置換されたCas9
用語「循環置換されたCas9」は、循環置換体として生じたものであり、これによってそのN末端およびC末端が局所的に再配置された、いずれのCas9タンパク質またはそのバリアントも指す。循環置換されたかかるCas9タンパク質(「CP-Cas9」)、またはそれらのバリアントは、ガイドRNA(gRNA)と複合体化されたときのDNAへの結合能を保持している。Oakes et al.,“Protein Engineering of Cas9 for enhanced function,”Methods Enzymol,2014,546:491-511およびOakes et al.,“CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification,”Cell,January10,2019,176:254-267を参照(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)。本開示は、これまでに知られているいずれのCP-Cas9も企図するか、または新しいCP-Cas9を、その結果得られた循環置換タンパク質がガイドRNA(gRNA)と複合体化されたときのDNAへの結合能を保持している限り、使用する。例示のCP-Cas9タンパク質は、配列番号77～86である。

CRISPR
CRISPRは、原核生物に侵入したウイルスによる先行する感染のスニペットを表す細菌および古細菌におけるDNA配列(すなわちCRISPRクラスター)のファミリーである。DNAのスニペットは、類似のウイルスによる爾後の攻撃からのDNAを検出および破壊するために原核細胞によって用いられ、CRISPR関連タンパク質(Cas9およびそのホモログを包含する)およびCRISPR関連RNAのアレイと併せて、有効に原核生物免疫防御システムを成す。天然では、CRISPRクラスターはCRISPR RNA(crRNA)へと転写およびプロセシングされる。ある種の型のCRISPRシステム(例えば、II型CRISPRシステム)では、プレcrRNAの正しいプロセシングは、トランスにコードされる低分子RNA(tracrRNA)、内生リボヌクレアーゼ3(rnc)、およびCas9タンパク質を要求する。tracrRNAはプレcrRNAのリボヌクレアーゼ3によって支援されるプロセシングのためのガイドとしての用をなす。爾後に、Cas9/crRNA/tracrRNAはRNAに対して相補的な直線状または環状dsDNA標的をエンド的に切断する。具体的には、crRNAに対して相補的でない標的鎖が第1にエンド的にカットされ、それから3'-5'エキソ的にトリミングされる。天然では、DNA結合および切断は典型的にはタンパク質および両方のRNAを要求する。しかしながら、シングルガイドRNA(「sgRNA」または単純に「gNRA」)が、crRNAおよびtracrRNA両方の側面を単一のRNA種のガイドRNAに組み込むようにして操作され得る。例えば、Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を見よ。これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。Cas9はCRISPR反復配列上の短いモチーフ(PAMまたはプロトスペーサー隣接モチーフ)を認識して、自己対非自己を見分けることを助ける。CRISPR生物学ならびにCas9ヌクレアーゼ配列および構造は当業者には周知である(例えば、“Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.”Ferretti et al.,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001);“CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.”Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);および“A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.”Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)を見よ。これらの夫々の内容全体は参照によって本願に組み込まれる)。Cas9オーソログはS. pyogenesおよびS. thermophilusを包含するがこれらに限定されない種々の種において記載されている。追加の好適なCas9ヌクレアーゼおよび配列は本開示に基づいて当業者には明らかであろう。かかるCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski,Rhun,and Charpentier,“The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems”(2013)RNA Biology 10:5,726-737に開示されている生物および座位からのCas9配列を包含する;これの内容全体は参照によって本願に組み込まれる。

ある種の型のCRISPRシステム(例えば、II型CRISPRシステム)では、プレcrRNAの正しいプロセシングは、トランスにコードされる低分子RNA(tracrRNA)、内生リボヌクレアーゼ3(rnc)、およびCas9タンパク質を要求する。tracrRNAは、プレcrRNAのリボヌクレアーゼ3によって支援されるプロセシングのためのガイドとしての用をなす。爾後に、Cas9/crRNA/tracrRNAはRNAに対して相補的な直線状または環状核酸標的をエンド的に切断する。具体的には、crRNAに対して相補的でない標的鎖が第1にエンド的にカットされ、それから3'-5'エキソ的にトリミングされる。天然では、DNA結合および切断は典型的にはタンパク質および両方のRNAを要求する。しかしながら、シングルガイドRNA(「sgRNA」または単純に「gRNA」)が、crRNAおよびtracrRNA両方の態様を単一のRNA種のガイドRNAに組み込むようにして操作され得る。

一般的に、「CRISPRシステム」は、集合的に、CRISPR関連(「Cas」)遺伝子の発現に関わるかまたはそれの活性を導く転写物および他のエレメントを言い、Cas遺伝子、tracr(トランス活性化CRISPR)配列(例えばtracrRNAまたは活性な部分的なtracrRNA)、tracr mate配列(内生CRISPRシステムという文脈において、「ダイレクト反復」およびtracrRNAによってプロセシングされる部分的なダイレクト反復を包摂する)、ガイド配列(内生CRISPRシステムという文脈において「スペーサー」ともまた言われる)、またはCRISPR座位からの他の配列および転写物をコードする配列を包含する。システムのtracrRNAはガイドRNA上に存在するtracr mate配列に対して(完全にまたは部分的に)相補的である。

DNA合成鋳型
本明細書に使用されるとき、用語「DNA合成鋳型」は、プライム編集因子のポリメラーゼによって鋳型鎖(所望の編集を含有しており、次いでプライム編集の機序を通して、対応する内生DNAの鎖を標的部位にて置き換える、3'単鎖DNAフラップをコードする)として利用される、PEgRNAの伸長アームの領域または部分を指す。様々な態様において、DNA合成鋳型は、図3A(5'伸長アームを含むPEgRNAの文脈(context)において)、図3B(3'伸長アームを含むPEgRNAの文脈において)、図3C(内部伸長アームの文脈において)、図3D(3'伸長アームの文脈において)、および図3E(5'伸長アームの文脈において)に示される。伸長アームは、DNA合成鋳型を包含しており、DNAまたはRNAから構成されていてもよい。RNAのケースにおいて、プライム編集因子のポリメラーゼは、RNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)であり得る。DNAのケースにおいて、プライム編集因子のポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼであり得る。様々な(例として、図3D～3Eに描かれるとおりの)態様において、DNA合成鋳型(4)は、「編集鋳型」および「相同アーム」、ならびに任意の5'末修飾領域e2の全部または一部を含んでいてもよい。つまり、e2領域の性質に応じて(例として、これが、ヘアピン、トウループ、またはステム/ループの2次構造を包含するかどうかに関わらず)、ポリメラーゼは、e2領域を何もコードしていなくても、またはその一部もしくは全部をコードしていてもよい。別の言い方をすれば、3'伸長アームのケースにおいて、DNA合成鋳型(3)は、ポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によるDNAの単鎖の合成のための鋳型として動作してもよい、プライマー結合部位(PBS)の5'末からgRNAコアの3'末までに及ぶ伸長アーム(3)の部分を包含し得る。5'伸長アームのケースにおいて、DNA合成鋳型(3)は、PEgRNA分子の5'末から編集鋳型の3'末までに及ぶ伸長アーム(3)の部分を包含し得る。好ましくは、DNA合成鋳型は、3'伸長アームまたは5'伸長アームのいずれかを有するPEgRNAsのプライマー結合部位(PBS)を排除する。本明細書に記載のある態様(例として、図71A)は、編集鋳型および相同アーム、すなわち、DNA合成の最中に鋳型として実際に使用されるPEgRNA伸長アームの配列を包含する「RT鋳型」を指す。用語「RT鋳型」は、用語「DNA合成鋳型」と等価である。

トランスプライム編集のケースでは(例えば、図3Gおよび図3H)、プライマー結合部位(PBS)およびDNA合成鋳型は、トランスプライム編集因子RNA鋳型(tPERT)と言われる別個の分子へと操作され得る。

二量体化ドメイン
用語「二量体化ドメイン」は、二重特異性リガンドの結合ドメインに結合するリガンド結合ドメインを言う。「第1の」二量体化ドメインは二重特異性リガンドの第1の結合部分に結合し、「第2の」二量体化ドメインは同じ二重特異性リガンドの第2の結合部分に結合する。第1の二量体化ドメインが(例えば、本願において論じられるとおりPEを介して)第1のタンパク質に融合され、第2の二量体化ドメインが(例えば、本願において論じられるとおりPEを介して)第2のタンパク質に融合されるときには、第1および第2のタンパク質は二重特異性リガンドの存在下において二量体化し、二重特異性リガンドは、第1の二量体化ドメインに結合する少なくとも1つの部分と第2の二量体化ドメインに結合する少なくとも別の部分とを有する。

下流
本明細書に使用されるとき、用語「上流」および「下流」は、5'→3'方向に配向された核酸分子(単鎖または二本鎖であるかに関わらず)中に位置付けられた少なくとも2つの要素の線状の位置を定義する相対的な用語である。とりわけ、第1要素が第2要素に対して5'のどこかに位置付けられている場合、第1要素は、核酸分子中、第2要素の上流にある。例えば、SNPがニック部位の5'側にある場合、SNPは、Cas9に誘導されたニック部位の上流にある。逆に言うと、第1要素が第2要素に対して3'のどこかに位置付けられている場合、第1要素は、核酸分子中、第2要素の下流にある。例えば、SNPがニック部位の3'側にある場合、SNPは、Cas9に誘導されたニック部位の下流にある。核酸分子は、DNA(二本鎖もしくは単鎖)、RNA(二本鎖もしくは単鎖)、またはDNAとRNAとのハイブリッドであり得る。二本鎖分子のどちらの鎖を考慮するのか選択する必要がある場合を除き、上流および下流という用語が核酸分子の単鎖にのみ言及するところ、分析は単鎖核酸分子および二本鎖分子について同じである。しばしば、少なくとも2つの要素の相対的な位置を決定するのに使用され得る二本鎖のDNAの鎖は、「センス」鎖または「コード」鎖である。遺伝学において、「センス」鎖は、5'から3'へ伸びる二本鎖DNA内セグメントであって、3'から5'へ伸びるDNAのアンチセンス鎖または鋳型鎖に相補的である。よって、例として、SNP核酸塩基がセンス鎖またはコード鎖上のプロモーターの3'側にある場合、SNP核酸塩基はゲノムDNA(二本鎖である)中のプロモーター配列の「下流」にある。

編集鋳型
用語「編集鋳型」は、ポリメラーゼ、例えばDNA依存性DNAポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)によって合成される一本鎖3'DNAフラップ上に所望の編集をコードする伸長アームの部分を言う。本明細書に記載のある態様(例として、図71A)は、編集鋳型と相同アームとの両方一緒、すなわち、DNA合成の最中に鋳型として実際に使用されるPEgRNA伸長アームの配列を指す「RT鋳型」を指す。用語「RT編集鋳型」はまた、用語「DNA合成鋳型」とも等価であるが、ここでRT編集鋳型は、逆転写酵素であるポリメラーゼを有するプライム編集因子の使用を反映し、DNA合成鋳型は、いずれのポリメラーゼも有するプライム編集因子の使用をより広く反映する。

有効量
本願において用いられる用語「有効量」は、所望の生物学的応答を誘起するために十分である生物活性薬剤の量を言う。例えば、いくつかの態様では、プライム編集因子(PE)の有効量は、標的部位ヌクレオチド配列、例えばゲノムを編集するために十分である編集因子の量を言い得る。いくつかの態様では、本願において提供されるプライム編集因子(PE)の、例えばニッカーゼCas9ドメインおよび逆転写酵素を含む融合タンパク質の有効量は、融合タンパク質によって特異的に結合および編集される標的部位の編集を誘導するために十分である融合タンパク質の量を言い得る。当業者には了解されるであろうとおり、薬剤、例えば融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ハイブリッドタンパク質、タンパク質二量体、タンパク質(またはタンパク質二量体)およびポリヌクレオチドの複合体、またはポリヌクレオチドの有効量は、例えば、所望の生物学的反応、例えば編集されるべき特定のアレル、ゲノム、または標的部位、標的化されようとする細胞または組織、および用いられようとする薬剤のような種々の因子に依存して変わり得る。

エラーを起こしやすい逆転写酵素
本明細書に使用されるとき、用語「エラーを起こしやすい」逆転写酵素(またはより広くは、いずれのポリメラーゼ)は、天然に存在するか、または野生型M-MLV逆転写酵素の誤差率未満の誤差率を有する別の逆転写酵素(例として、野生型M-MLV逆転写酵素)に由来する逆転写酵素(またはより広くは、いずれのポリメラーゼ)を指す。野生型M-MLV逆転写酵素の誤差率は、1誤差の範囲が15,000(より高い)～27,000(より低い)にあると報告されている。15,000中の1の誤差率は6.7×10^-5の誤差率に相当する。27,000中の1の誤差率は3.7×10^-5の誤差率に相当する。Boutabout et al.(2001)“DNA synthesis fidelity by the reverse transcriptase of the yeast retrotransposon Ty1,”Nucleic Acids Res 29(11):2217-2222を参照(これは参照により本明細書に組み込まれる)。よって、本出願の目的において、用語「エラーを起こしやすい」は、15,000核酸塩基の組み込み中1より大きい誤差(6.7×10^-5またはこれより高い)、例として、14,000核酸塩基中1誤差(7.14×10^-5もしくはこれより高い)、13,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(7.7×10^-5もしくはこれより高い)、12,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(7.7×10^-5もしくはこれより高い)、11,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(9.1×10^-5もしくはこれより高い)、10,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(1×10^-4または0.0001もしくはこれより高い)、9,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00011もしくはこれより高い)、8,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00013もしくはこれより高い)、7,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00014もしくはこれより高い)、6,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00016もしくはこれより高い)、5,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.0002もしくはこれより高い)、4,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00025もしくはこれより高い)、3,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00033もしくはこれより高い)、2,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00050もしくはこれより高い)、あるいは1,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.001もしくはこれより高い)、あるいは500核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.002もしくはこれより高い)、あるいは250核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.004もしくはこれより高い)である誤差率を有する、それらRTを指す。

エクステイン
本願において用いられる用語「エクステイン」は、インテインによってフランキングされ、タンパク質スプライシングのプロセスの間に別のエクステインにライゲーションされて成熟したスプライシングされたタンパク質を形成するポリペプチド配列を言う。典型的には、インテインは2つのエクステイン配列によってフランキングされ、これらはインテインがそれ自体の切除を触媒するときに一緒にライゲーションされる。エクステインは、従って、mRNA上に見出されるエキソンに対するタンパク質アナログである。例えば、インテインを含むポリペプチドは構造エクステイン(N)-インテイン-エクステイン(C)であり得る。インテインの切除および2つのエクステインのスプライシング後に、もたらされる構造はエクステイン(N)-エクステイン(C)および遊離のインテインである。種々の構成では、エクステインは、夫々が分裂インテインに融合された別個のタンパク質(例えば、Cas9またはPE融合タンパク質の半分)であり得、分裂インテインの切除はエクステイン配列のスプライシングを一緒に引き起こす。

伸長アーム
用語「伸長アーム」は、数種の機能(逆転写酵素のためのプライマー結合部位および編集鋳型を包含する)を提供するPEgRNAのヌクレオチド配列構成要素を指す。いくつかの態様、例として、図3Dにおいて、伸長アームは、ガイドRNAの3'末にて位置付けられる。他の態様、例として、図3Eにおいて、伸長アームは、ガイドRNAの5’末にて位置付けられる。いくつかの態様において、伸長アームはまた、相同アームも包含する。様々な態様において、伸長アームは、5'→3'方向に以下の構成要素:相同アーム、編集鋳型、およびプライマー結合部位を含む。逆転写酵素の重合活性が5'→3'方向であるから、相同アーム、編集鋳型、およびプライマー結合部位の好ましい配置は、逆転写酵素が、アニールされたプライマー配列によって一旦プライムされると、編集鋳型を相補的な鋳型鎖として使用して単鎖DNAを重合する(polymerases)ように、5'→3'方向にある。伸長アームの長さなどのさらなる詳細は、本明細書に記載の他のどこかに記載されている。

伸長アームはまた、図3G(最上列)に実例として示されるとおり、一般に2つの領域:プライマー結合部位(PBS)およびDNA合成鋳型を含むものとしても記載されていてもよい。プライマー結合部位は、プライム編集因子複合体によってニックが入れられるようになり、これによってニックが入った内生鎖上に3'末が晒されたとき、標的部位の内生DNA鎖から形成されるプライマー配列へ結合する。本明細書に説明されるとおり、プライマー配列の、PEgRNAの伸長アーム上のプライマー結合部位への結合は、晒された3'末(すなわち、プライマー配列の3')をもつ二重鎖領域を創出し、これは次いで、晒された3'末からDNA合成鋳型の長さに沿ってDNAの単鎖を重合し始めるポリメラーゼのための基質を提供する。単鎖DNA産物の配列は、DNA合成鋳型の相補体である。重合は、重合が終止するまでDNA合成鋳型(または伸長アーム)の5'へ続く。よって、DNA合成鋳型は、プライム編集因子複合体のポリメラーゼによって単鎖DNA産物(すなわち、所望の遺伝子編集情報を含有する3'単鎖DNAフラップ)中へコードされる伸長アームの部分を表し、前記単鎖DNA産物は、PEに誘導されたニック部位のすぐ下流にある標的部位の対応する内生DNA鎖に置き換える。理論に拘泥されないが、DNA合成鋳型の重合は、終止という事象まで、伸長アームの5'末へ続く。重合は、これらに限定されないが、(a)PEgRNAの5'末端に達すること(例として、5'伸長アームのケースにおいて、DNAポリメラーゼが単に鋳型を使い果たす)、(b)とおり抜けられないRNA2次構造(例として、ヘアピンもしくはステム/ループ)に達すること、あるいは(c)複製終止シグナル、例として、ポリメラーゼを遮断もしくは阻害する特定のヌクレオチド配列、またはスーパーコイル状のDNAもしくはRNAなどの核酸形態上のシグナルに達すること、を包含する様々な形で終止することもある。

フラップエンドヌクレアーゼ(例として、FEN1)
本明細書に使用されるとき、用語「フラップエンドヌクレアーゼ」は、5'単鎖DNAフラップの除去を触媒する酵素を指す。これらは、細胞プロセス(DNA複製を包含する)の最中に形成された5'フラップの除去を処理する、天然に存在する酵素である。本明細書に記載のプライム編集方法は、内生で供給されるフラップエンドヌクレアーゼ、またはプライム編集の最中に標的部位にて形成される内生DNAの5'フラップを除去するのにtransで提供されるものを利用してもよい。フラップエンドヌクレアーゼは、当該技術分野において知られており、Patel et al.,“Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends,”Nucleic Acids Research,2012,40(10):4507-4519およびTsutakawa et al.,Human flap endonuclease structures,DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily,”Cell,2011,145(2):198-211、およびBalakrishnan et al.,“Flap Endonuclease 1,”Annu Rev Biochem,2013,Vol 82:119-138(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)の記載から見出され得る。例示のフラップエンドヌクレアーゼは、以下のアミノ酸配列によって表され得るFEN1である:

機能的等価物
用語「機能的等価物」は、機能は等価であるが構造は第1生体分子と必ずしも等価ではない第2生体分子を指す。例えば、「Cas9等価物」は、Cas9と同じかまたは実質的に同じ機能を有するが、必ずしも同じアミノ酸配列は有さないタンパク質を指す。本開示の文脈において、本明細書は通してずっと「タンパク質X、またはその機能的等価物」を指す。これに関連して、タンパク質Xの「機能的等価物」は、タンパク質Xの等価機能を担持する、いずれのホモログ、パラログ、フラグメント、天然に存在するバージョン、改変バージョン、突然変異バージョン、または合成バージョンを受け入れる。

融合タンパク質
用語「融合タンパク質」は、本明細書に使用されるとき、少なくとも2つの異なるタンパク質からタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを指す。あるタンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端(N末端)部分にて、またはカルボキシ末端(C末端)タンパク質にて位置付けられ、よって「アミノ末端の融合タンパク質」または「カルボキシ末端の融合タンパク質」の夫々を形成してもよい。タンパク質は、異なるドメイン、例えば、核酸結合ドメイン(例として、タンパク質を標的部位への結合へ向かわせる、Cas9のgRNA結合ドメイン)と、核酸編集タンパク質の核酸切断ドメインまたは触媒ドメインとを含んでいてもよい。別の例は、逆転写酵素と融合したCas9またはその等価物を包含する。本明細書に提供されるタンパク質のいずれも、当該技術分野において知られているいずれの方法によって産生されてもよい。例えば、本明細書に提供されるタンパク質は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質にとくに適した、組換えタンパク質の発現および精製を介して産生されてもよい。組換えタンパク質の発現および精製のための方法は周知であり、Green and Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)(これらの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))によって記載されるものを包含する。

着目した遺伝子(Gene of interest)(GOI)
用語「着目した遺伝子」または「GOI」は、着目した生体分子(例として、タンパク質またはRNA分子)をコードする遺伝子を指す。着目したタンパク質は、いずれの細胞内タンパク質、膜タンパク質、または細胞外タンパク質、例として、核内タンパク質、転写因子、核膜輸送体、細胞内オルガネラ関連タンパク質、膜受容体、触媒タンパク質、および酵素、治療用タンパク質、膜タンパク質、膜輸送タンパク質、シグナル伝達タンパク質、または免疫学的タンパク質(例として、IgGまたは他の抗体タンパク質)、等々を包含し得る。着目した遺伝子はまた、これらに限定されないが、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、低分子核内RNA(snRNA)、アンチセンスRNA、ガイドRNA、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、および無細胞RNA(cfRNA)を包含するRNA分子もコードしていてもよい。

ガイドRNA(「gRNA」)
本明細書に使用されるとき、用語「ガイドRNA」は、大部分が一般的にCRISPR-Cas9のCasタンパク質に関連する具体的な型のガイド核酸であって、Cas9に結び付いて、Cas9タンパク質をDNA分子中の特定の配列(ガイドRNAのプロトスペース配列との相補性を包含する)へ向かわせる。しかしながら、この用語はまた、天然に存在するかもしくは天然には存在しない(例として、改変または組換え)かに関わらず、Cas9等価物、ホモログ、オルソログ、またはパラログに結び付き、またCas9等価物を特定の標的ヌクレオチド配列へ局在化するよう別にプログラムする、等価なガイド核酸分子も受け入れる。Cas9等価物は、Cpf1(V型CRISPR-Cas系)、C2c1(V型CRISPR-Cas系)、C2c2(VI型CRISPR-Cas系)およびC2c3(V型CRISPR-Cas系)を包含する、いずれの型のCRISPR系(例として、II型、V型、VI型)からの他のnapDNAbpも包含していてもよい。さらなるCas等価物は、Makarova et al.,“C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector,”Science 2016;353(6299)(この内容は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。ガイドRNAの例示の配列および構造は本明細書に提供されている。加えて、適切なガイドRNA配列をデザインするための方法も、本明細書に提供されている。本明細書に使用されるとき、「ガイドRNA」はまた、本明細書に開示のプライム編集方法および組成物のために発明された「プライム編集ガイドRNA」(または「PEgRNA」)と呼ばれる修飾形態のガイドRNAと対比させるために「既存のガイドRNA」とも称されてもよい。

ガイドRNAまたはPEgRNAは、これらに限定されないが、以下を包含する様々な構造要素を含んでいてもよい:

スペーサー配列－標的DNA中のプロトスペーサーへ結合するガイドRNAまたはPEgRNA(長さが約20ntを有する)中の配列。

gRNAコア(またはgRNA骨格もしくは主鎖配列)－は、Cas9結合を担うgRNA内の配列を指し、これは、Cas9を標的DNAへガイドするのに使用されるスペーサー/標的化配列を包含していない。

伸長アーム－PEgRNAの3'端または5'端の一本鎖伸長。これは、プライマー結合部位とポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)によって目当ての遺伝子変化を含有する一本鎖DNAフラップをコードするDNA合成鋳型配列とを含む。これが、それから、対応する内生鎖を置き換えることによって内生DNA上に取り入れし、それによって所望の遺伝子変化を組み入れる。

転写ターミネーター－ガイドRNAまたはPEgRNAは分子の3'に転写終結配列を含み得る。

相同アーム
用語「相同アーム」は、結果として得られる、逆転写酵素にコードされた単鎖DNAフラップ(内生鎖を置き換えることによって標的DNA部位中へ取り入れられる)の部分をコードする伸長アームの部分(単数または複数)を指す。相同アームによってコードされる単鎖DNAフラップの部分は、標的DNA配列の非編集済鎖に相補的であって、内生鎖に取って代わることおよびその場所において単鎖DNAフラップとアニールすることを容易にし、これによって編集が組み入れられる。この構成要素は他のどこかでさらに定義される。定義上、それは本明細書に記載のプライム編集因子のポリメラーゼによってコードされるので、相同アームはDNA合成鋳型の一部である。

宿主細胞
用語「宿主細胞」は、本明細書に使用されるとき、本明細書に記載のベクター、例として、Cas9もしくはCas9等価物と逆転写酵素とを含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターの宿主となり(host)複製してこれを発現し得る細胞を指す。

インテイン
本願において用いられる用語「インテイン」は、生命の全てのドメインからの生物に見出される自己プロセシングポリペプチドドメインを言う。インテイン(介在タンパク質)は、タンパク質スプライシングとして公知の固有の自己プロセシングイベントを実行する。これにおいては、それは、2つのペプチド結合の切断によってより大きい前駆体ポリペプチドからそれ自体を切除、プロセスにおいて、新たなペプチド結合の形成によってフランキングするエクステイン(外部タンパク質)配列同士をライゲーションする。インテイン遺伝子は他のタンパク質コード遺伝子とインフレームで埋め込まれて見出されるので、この再構成は翻訳後に(または共翻訳的に)生起する。さらにその上、インテインによって媒介されるタンパク質スプライシングは自発的である;それは、外部の因子またはエネルギー源ではなくインテインドメインのフォールディングのみを要求する。このプロセスは、「分裂インテイン」によるトランスタンパク質スプライシングの天然のプロセスと対比して、シスタンパク質スプライシングとしてもまた公知である。インテインは自己スプライシングRNAイントロンのタンパク質等価物であり(Perler et al.,Nucleic Acids Res.22:1125-1127(1994)を見よ)、これらは前駆体タンパク質からのそれら自体の切除を触媒し、エクステインとして公知のフランキングするタンパク質配列の付随的融合を有する(Perler et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.1:292-299(1997);Perler,F.B.Cell 92(1):1-4(1998);Xu et al.,EMBO J.15(19):5146-5153(1996)において総説されている)。

本願において用いられる用語「タンパク質スプライシング」は、前駆体タンパク質の内側領域(インテイン)が切り出され、タンパク質のフランキング領域(エクステイン)同士がライゲーションされて、成熟したタンパク質を形成するプロセスを言う。この天然のプロセスは、原核生物および真核生物両方からの数々のタンパク質で観察されている(Perler,F.B.,Xu,M.Q.,Paulus,H.Current Opinion in Chemical Biology 1997,1,292-299;Perler,F.B.Nucleic Acids Research 1999,27,346-347)。インテイン単位は、タンパク質スプライシングを触媒するために必要とされる必要な構成要素を含有し、多くの場合には、インテイン可動性に関与するエンドヌクレアーゼドメインを含有する(Perler,F.B.,Davis,E.O.,Dean,G.E.,Gimble,F.S.,Jack,W.E.,Neff,N.,Noren,C.J.,Thomer,J.,Belfort,M.Nucleic Acids Research 1994,22,1127-1127)。しかしながら、もたらされるタンパク質は連結されており、別個のタンパク質としては発現されない。タンパク質スプライシングは、別個のポリペプチド上で発現される分裂インテインによって、トランスでもまた行われ得る。これらは自発的に組み合わさって単一のインテインを形成し、これがそれからタンパク質スプライシングプロセスを経過して別個のタンパク質に連結する。

タンパク質スプライシングの機序の解明は、インテインに基づく数多の用途へ繋がっている(Comb,et al.,米国特許第5,496,714号; Comb,et al.,米国特許第5,834,247号;Camarero and Muir,J.Amer.Chem.Soc.,121:5597-5598(1999);Chong,et al.,Gene,192:271-281(1997),Chong,et al.,Nucleic Acids Res.,26:5109-5115(1998);Chong,et al.,J.Biol.Chem.,273:10567-10577(1998);Cotton,et al.J.Am.Chem.Soc.,121:1100-1101(1999);Evans,et al.,J.Biol.Chem.,274:18359-18363(1999);Evans,et al.,J.Biol.Chem.,274:3923-3926(1999);Evans,et al.,Protein Sci.,7:2256-2264(1998);Evans,et al.,J.Biol.Chem.,275:9091-9094(2000);Iwai and Pluckthun,FEBS Lett.459:166-172(1999);Mathys,et al.,Gene,231:1-13(1999);Mills,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:3543-3548(1998);Muir,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:6705-6710(1998);Otomo,et al.,Biochemistry 38:16040-16044(1999);Otomo,et al.,J.Biolmol.NMR 14:105-114(1999);Scott,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:13638-13643(1999);Severinov and Muir,J.Biol.Chem.,273:16205-16209(1998);Shingledecker,et al.,Gene,207:187-195(1998);Southworth,et al.,EMBO J.17:918-926(1998);Southworth,et al.,Biotechniques,27:110-120(1999);Wood,et al.,Nat.Biotechnol.,17:889-892(1999);Wu,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:9226-9231(1998a);Wu,et al.,Biochim Biophys Acta 1387:422-432(1998b);Xu,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:388-393(1999);Yamazaki,et al.,J.Am.Chem.Soc.,120:5591-5592(1998))。各参照文献は参照により本明細書に組み込まれる。

リガンド依存性インテイン
本願において用いられる用語「リガンド依存性インテイン」は、リガンド結合ドメインを含むインテインを言う。典型的には、リガンド結合ドメインはインテインのアミノ酸配列上に挿入され、構造インテイン(N)-リガンド結合ドメイン-インテイン(C)をもたらす。典型的には、リガンド依存性インテインは、適当なリガンドの不在下においてはタンパク質スプライシング活性を発揮しないかまたは最小限のみ発揮し、リガンドの存在下においてはタンパク質スプライシング活性の顕著な増大を発揮する。いくつかの態様では、リガンド依存性インテインはリガンドの不在下においては観察可能なスプライシング活性を発揮しないが、リガンドの存在下においてはスプライシング活性を発揮する。いくつかの態様では、リガンド依存性インテインはリガンドの不在下においては観察可能なタンパク質スプライシング活性を、適当なリガンド存在下においては、リガンドの不在下において観察される活性よりも少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍、少なくとも250倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも1500倍、少なくとも2000倍、少なくとも2500倍、少なくとも5000倍、少なくとも10000倍、少なくとも20000倍、少なくとも25000倍、少なくとも50000倍、少なくとも100000倍、少なくとも500000倍、または少なくとも1000000倍多大であるタンパク質スプライシング活性を発揮する。いくつかの態様では、活性の増大は少なくとも1桁、少なくとも2桁、少なくとも3桁、少なくとも4桁、または少なくとも5桁に渡って用量依存的であり、リガンドの濃度を調整することによってインテイン活性の微調整を許す。好適なリガンド依存性インテインは当該技術分野において知られており、下で提供されるものおよび公開米国特許出願第U.S.2014/0065711A1号;Mootz et al.,“Protein splicng triggered by a small molecule.”J.Am.Chem.Soc.2002;124,9044-9045;Mootz et al.,“Conditional protein splicng: a new tool to control protein structure and function in vitro and in vivo.”J.Am.Chem.Soc.2003;125,10561-10569;Buskirk et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2004;101,10505-10510);Skretas & Wood,“Regulation of protein activity with small-molecule-controlled inteins.”Protein Sci.2005;14,523-532;Schwartz,et al.,“Post-translational enzyme activation in an animal via optimized conditional protein splicing.”Nat.Chem.Biol.2007;3,50-54;Peck et al.,Chem.Biol.2011;18(5),619-630に記載されているものを包含する;夫々の内容全体は参照によってここに組み込まれる。例示の配列は次のとおりである:

リンカー
本願において用いられる用語「リンカー」は、2つの他の分子または部分を連結するある分子を言う。リンカーは、2つの融合タンパク質を連結するリンカーのケースではアミノ酸配列であり得る。例えば、Cas9はアミノ酸リンカー配列によって逆転写酵素に融合され得る。リンカーは、2つのヌクレオチド配列を一緒に連結するケースではヌクレオチド配列でもまたあり得る。例えば、本ケースでは、従来のガイドRNAは、スペーサーまたはリンカーヌクレオチド配列を介して、RT鋳型配列とRTプライマー結合部位とを含み得るプライム編集ガイドRNAのRNA伸長に連結される。他の態様において、リンカーは有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。いくつかの態様では、リンカーは、長さが5-100アミノ酸、例えば長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30～35、35～40、40～45、45～50、50～60、60～70、70～80、80～90、90～100、100～150、または150～200アミノ酸である。より長いまたはより短いリンカーもまた企図される。

単離された
「単離された」は、自然状態から変更または除去されることを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核20酸またはペプチドは「単離され」ていないが、共存材料のその自然状態から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または非ネイティブ(non-native)的環境(例えば、宿主細胞など)で存在し得る。

いくつかの態様において、着目する遺伝子は、単離された核酸によってコードされる。本明細書に使用されるとき、用語「単離された」は、その元のまたはネイティブ(native)の環境(例として、天然に存在する場合は自然環境)から除去されている、本明細書に提供されるとおりの材料の特徴を指す。したがって、生きている動物中に存在する、天然に存在するポリヌクレオチドまたはタンパク質もしくはポリペプチドは単離されていないが、ヒトの介入によって自然系中の共存材料のいくつかまたはすべてから分離されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。人工材料または改変材料、例えば、本明細書に記載の発現コンストラクトおよびベクターなどの、天然には存在しない核酸構築物はまた、結果的に、単離されたとも称される。材料は、単離されるために精製される必要はない。結果的に、材料はベクターの一部および/または組成物の一部であってもよく、かかるベクターまたは組成物が、材料が自然界から見出される環境の一部にない点で、依然単離されている。

MS2タグ付け技術
種々の態様では(例えば、図72～73および例19の態様に図示されているとおり)、用語「MS2タグ付け技術」は、RNA-タンパク質相互作用ドメイン、例えば特定のヘアピン構造を特異的に認識および結合するRNA結合タンパク質とペアリングされた「RNA-タンパク質相互作用ドメイン」(「RNA-タンパク質動員ドメインまたはタンパク質」としてもまた公知)の組み合わせを言う。これらの型のシステムは、標的部位に結合されているプライム編集因子複合体に種々の機能性を動員するように活用され得る。MS2タグ付け技術は、ファージのゲノム上に存在するステムループまたはヘアピン構造、すなわち「MS2ヘアピン」とのMS2バクテリオファージコートタンパク質(「MCP」または「MS2cp」)の天然の相互作用に基づく。プライム編集のケースでは、MS2タグ付け技術は、プライム編集に関わる所望のRNA分子(例えば、PEgRNAまたはtPERT)上にMS2ヘアピンを導入することを含む。これは、それから、その構造を認識および結合するRNA結合タンパク質にとっての特異的な相互作用可能な結合標的を構成する。MS2ヘアピンのケースでは、それはMS2バクテリオファージコートタンパク質(MCP)によって認識および結合される。そして、MCPが別のタンパク質(例えば、逆転写酵素または他のDNAポリメラーゼ)に融合される場合には、MS2ヘアピンが、プライム編集複合体によって占有される標的部位にその他のタンパク質をトランスで「動員」するために用いられ得る。

本明細書に記載のプライム編集因子は、側面として、目当ての特定の機能をプライム編集因子複合体に動員または「共局在」させるためにいずれかの公知のRNA-タンパク質相互作用ドメインを組み込み得る。RNA-タンパク質相互作用の他のモジュールドメインの総説は、当該技術分野において、例えば、Johansson et al.,“RNA recognition by the MS2 phage coat protein,”Sem Virol.,1997,Vol.8(3):176-185;Delebecque et al.,“Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies,”Science,2011,Vol.333:470-474;Mali et al.,“Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering,”Nat. Biotechnol.,2013,Vol.31:833-838;およびZalatan et al.,“Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds,”Cell,2015,Vol.160:339-350(これら各々はその全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)において記載されている。他の系も、PCPタンパク質を特異的に動員するPP7ヘアピン、およびComタンパク質を特異的に動員する「com」ヘアピンを包含する。Zalatan et al.を参照。

MS2ヘアピン(即ち、「MS2アプタマー」と称される)のヌクレオチド配列は以下:GCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCC(配列番号763)である。

MCPまたはMS2cpのアミノ酸配列は以下:GSASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGEELPVAGWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY(配列番号764)である。

MS2ヘアピン(または「MS2アプタマー」)は、ある型の「RNAエフェクター動員ドメイン」(または同等に「RNA結合タンパク質動員ドメイン」もしくは単純に「動員ドメイン」)ともまた言われ得る。なぜなら、それは、PEgRNAまたはtPERT上に組み入れされる物理的構造(例えばヘアピン)であり、これはそのように改変されたPEgRNAまたはrPERTに他のエフェクター機能(例えば、種々の機能を有するRNA結合タンパク質、例えばDNAポリメラーゼ、または他のDNA修飾酵素)を有効に動員し、それゆえにプライム編集機構にエフェクター機能をトランスで共局在させるからである。この適用は、いずれかの具体的なRNAエフェクター動員ドメインに限定されることを決して意図されず、MS2ヘアピンを包含するいずれかの利用可能なかかるドメインを包含し得る。例19および図72(b)は、標的DNA部位に結合したプライム編集因子複合体(MS2cp-PE2:sgRNA複合体)とtPERT分子のDNA合成ドメインとの共局在が成就することを引き起こすための、DNA合成ドメイン(すなわちtPERT分子)に連結されたMS2アプタマーとPE2に融合されたMS2cpタンパク質を含むプライム編集因子との使用を図示する。

napDNAbp
本明細書に使用されるとき、用語「核酸プログラム型DNA結合タンパク質」または「napDNAbp」(そのCas9が一例である)は、DNA分子中の特定の配列を標的にし結合するためにRNA:DNAハイブリダイゼーションを使用するタンパク質を指す。各napDNAbpは、ガイド核酸またはこの一部(例として、ガイドRNAのプロトスペーサー)に相補的なDNA鎖(すなわち、標的鎖)を含むDNA配列へnapDNAbpを局在化する、少なくとも1のガイド核酸(例として、ガイドRNA)に結び付けられている。換言すれば、ガイド核酸は、相補的な配列へ局在化し結合するようnapDNAbp(例として、Cas9または等価物)を「プログラム」する。

理論に拘泥されないが、napDNAbp－ガイドRNA複合体の結合機序は、一般に、napDNAbpが二本鎖DNA標的の巻き戻しを誘導するRループを形成する(これによってnapDNAbpによって結合された領域中の鎖が分離される)ステップを包含する。ガイドRNAプロトスペーサーは次いで「標的鎖」とハイブリダイズする。これは、標的鎖に相補的な「非標的鎖」に取って代わり、このことによってRループの単鎖領域が形成される。いくつかの態様において、napDNAbpは1以上のヌクレアーゼ活性を包含しており、次いでDNAを切ることで、様々な型の病変がなくなる。例えば、napDNAbpは、非標的鎖を第1の場所にて切るか、および/または標的鎖を第2の場所にて切る、ヌクレアーゼ活性を含んでいてもよい。ヌクレアーゼ活性に応じて標的DNAが切られることで、両鎖とも切られた「二本鎖切断」が形成され得る。他の態様において、標的DNAは単一の部位でしか切られ得ない、すなわち、DNAは一方の鎖上に「ニックが入れられる(nicked)」。種々のヌクレアーゼ活性をもつ例示のnapDNAbpは、「Cas9ニッカーゼ」(「nCas9」)、およびヌクレアーゼ活性を一切有さない不活性化Cas9(「不活性型Cas9」または「dCas9」)を包含する。これらのおよび他のnapDNAbpへの例示の配列は、本明細書に提供されている。

ニッカーゼ
用語「ニッカーゼ」は、不活性化された2つのヌクレアーゼドメインのうち1つをもつCas9を指す。この酵素は、標的DNAの一方の鎖のみを切断することが可能である。

核局在化配列(NLS)
用語「核局在化配列」または「NLS」は、タンパク質の細胞核中への、例えば核輸送による、輸入(import)を促進するアミノ酸配列を指す。核局在化配列は当該技術分野において知られており、当業者に明らかであろう。例えば、NLS配列は、2000年11月23日に出願され、2001年5月31日にWO/2001/038547として公開された、Plankらの国際PCT出願PCT/EP2000/011690に記載されている(この内容は、例示の核局在化配列のその開示について参照により本明細書に組み込まれる)。いくつかの態様において、NLSは、アミノ酸配列PKKKRKV(配列番号16)またはMDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC(配列番号17)を含む。

核酸分子
用語「核酸」は、本明細書に使用されるとき、ヌクレオチドのポリマーを指す。ポリマーは、天然のヌクレオシド(すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン)、ヌクレオシド類似体(例として、2-アミノアデノシン、2-チオチミジン、イノシン、ピロロ-ピリミジン、3-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、C5ブロモウリジン、C5フルオロウリジン、C5ヨードウリジン、C5プロピニルウリジン、C5プロピニルシチジン、C5メチルシチジン、7デアザアデノシン、7デアザグアノシン、8オキソアデノシン、8オキソグアノシン、O(6)メチルグアニン、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、ジヒドロウリジン、メチルシュードウリジン、1-メチルアデノシン、1-メチルグアノシン、N6-メチルアデノシン、および2-チオシチジン)、化学修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基(例として、メチル化された塩基)、インターカレートされた(intercalated)塩基、修飾された糖(例として、2'-フルオロリボース、リボース、2'-デオキシリボース、2'-O-メチルシチジン、アラビノース、およびヘキソース)、または修飾されたホスファート基(例として、ホスホロチオアートおよび5'-Nホスホラミダイト連結)を包含していてもよい。

PEgRNA
本明細書に使用されるとき、用語「プライム編集ガイドRNA」または「PEgRNA」または「伸長されたガイドRNA」は、本明細書に記載のプライム編集方法および組成物を実践するための1以上の追加の配列を包含するよう修飾されたガイドRNAの特化された形態を指す。本明細書に記載のとおり、プライム編集ガイドRNAは、核酸配列の1以上の「伸長された領域」を含む。伸長された領域は、これらに限定されないが、単鎖のRNAまたはDNAを含んでいてもよい。さらに、伸長された領域は、既存のガイドRNAの3'末にて生じていてもよい。他の配置において、伸長された領域は、既存のガイドRNAの5’末にて生じていてもよい。また他の配置において、伸長された領域は、既存のガイドRNAの末端の分子内のある領域にて(例えば、napDNAbpへ結び付きおよび/または結合するgRNAコア領域中)生じていてもよい。伸長された領域は、単鎖DNAを(プライム編集因子のポリメラーゼによって)コードする「DNA合成鋳型」を含むが、前記分子は次に(a)編集されるべき内生標的DNAと相同であるようデザインされており、および(b)内生標的DNA中へ誘導または取り入れられるべき少なくとも1の所望のヌクレオチド変化(例として、トランジション、トランスバージョン、欠失、もしくは挿入)を含んでいる。伸長された領域はまた、他の機能的配列要素(これらに限定されないが、「プライマー結合部位」および「スペーサーもしくはリンカー」配列など)、または他の構造的要素(これらに限定されないが、アプタマー、ステムループ、ヘアピン、トウループ(例として、3'トウループ)、もしくはRNA-タンパク質動員ドメイン(例として、MS2ヘアピン))も含んでいてもよい。本明細書に使用されるとき「プライマー結合部位」は、Rループのニック入りDNAから生成された3'末を有する単鎖DNA配列とハイブリダイズする配列を含む。

ある態様において、PEgRNAは、5'伸長アーム、スペーサー、およびgRNAコアを有するPEgRNAを示す図3Aによって表されている。5'伸長は、5'→3'方向に逆転写酵素鋳型、プライマー結合部位、およびリンカーをさらに含む。示されているとおり、逆転写酵素鋳型はより幅広く「DNA合成鋳型」ともまた言われ得、ここで、本明細書に記載のプライム編集因子のポリメラーゼはRTではなく別の型のポリメラーゼである。

ある他の態様において、PEgRNAは、3'伸長アーム、スペーサー、およびgRNAコアを有するPEgRNAを示す図3Bによって表されている。3'伸長は、5'→3'方向に逆転写酵素鋳型、プライマー結合部位をさらに含む。示されているとおり、逆転写酵素鋳型はより幅広く「DNA合成鋳型」ともまた言われ得、ここで、本明細書に記載のプライム編集因子のポリメラーゼはRTではなく別の型のポリメラーゼである。

更なる他の態様において、PEgRNAは、5'→3'方向にスペーサー(1)、gRNAコア(2)、および伸長アーム(3)を有するPEgRNAを示す図3Dによって表されている。伸長アーム(3)は、PEgRNAの3'末にある。伸長アーム(3)は、5'→3'方向に「プライマー結合部位」(A)、「編集鋳型」(B)、および「相同アーム」(C)をさらに含む。伸長アーム(3)はまた、3'末および5'末にて、同じ配列であってもまたは異なる配列であってもよい任意の修飾領域も含んでいてもよい。加えて、PEgRNAの3'末は、転写ターミネータ配列を含んでいてもよい。PEgRNAのこれらの配列要素はさらに、本明細書に記載、定義される。

なお他の態様において、PEgRNAは図3Eによって表され、これは5'から3'方向に伸長アーム(3)、スペーサー(1)、およびgRNAコア(2)を有するPEgRNAを示す。伸長アーム(3)はPEgRNAの5'端にある。伸長アーム(3)はさらに3'から5'方向に「プライマー結合部位」(A)、「編集鋳型」(B)、および「相同アーム」(C)を含む。伸長アーム(3)は任意の修飾領域をもまた3'および5'端に含み得、これらは同じ配列または異なる配列であり得る。PEgRNAの3'末は、転写ターミネータ配列を含んでいてもよい。PEgRNAのこれらの配列要素はさらに、本明細書に記載、定義される。

PE1
本願において用いられる「PE1」は、次の構造を有するCas9(H840A)と野生型MMLV RTとを含む融合タンパク質を含むPE複合体を言う:[NLS]-[Cas9(H840A)]-[リンカー]-[MMLV_RT(wt)]+所望のPEgRNA。PE融合体は配列番号123のアミノ酸配列を有し、これは次のとおり示される;

PE2
本願において用いられる「PE2」は、次の構造を有するCas9(H840A)とバリアントMMLV RTとを含む融合タンパク質を含むPE複合体を言う:[NLS]-[Cas9(H840A)]-[リンカー]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)]+所望のPEgRNA。PE融合体は配列番号134のアミノ酸配列を有し、これは次のとおり示される:

PE3
本願において用いられる「PE3」は、PE2、プラスPE2と複合体化する第2鎖ニッキングガイドRNAを言い、編集される鎖の選好的置き換えを誘導するために非編集DNA鎖上にニックを導入する。
PE3b

本願において用いられる「PE3b」はPE3を言うが、第2鎖ニッキングガイドRNAは、所望の編集の組み入れ後までは第2鎖ニックが導入されないようにして時間的コントロールのためにデザインされる。これは、元々のアレルではなく編集された鎖のみにマッチするスペーサー配列を有するgRNAをデザインすることによって達成される。以降ではPE3bと言われるこの戦略を用いると、プロトスペーサーと編集されないアレルとの間のミスマッチは、PAM鎖上の編集イベントが生起する後までは、sgRNAによるニッキングを好まないはずである。

短いPE(PE-short)
本願において用いられる「短いPE」は、C末端短縮逆転写酵素に融合されているPE構築物を言い、次のアミノ酸配列を有する:

ペプチドタグ
用語「ペプチドタグ」は、遺伝子学的にタンパク質配列と融合してタンパク質上へ1以上の機能を付与するペプチドアミノ酸配列を指し、これによって可視化、精製、可溶化、分離等々などの様々な目的でのタンパク質の操作が容易になる。ペプチドタグは、目的または機能によって分類される様々な型のタグを包含し得、これは、「親和性タグ」(タンパク質精製を容易にするための)、「可溶化タグ」(タンパク質の正しい折り畳みを補助するための)、「クロマトグラフィータグ」(タンパク質のクロマトグラフ特性を変更するための)、「エピトープタグ」(高親和性抗体へ結合するための)、「蛍光タグ」(細胞中またはin vitroでのタンパク質の可視化を容易にするための)を包含していてもよい。

ポリメラーゼ
本願において用いられる用語「ポリメラーゼ」は、本明細書に記載のプライム編集因子システムに関して用いられ得るヌクレオチド鎖を合成する酵素を言う。ポリメラーゼは「鋳型依存性」ポリメラーゼであり得る(すなわち、鋳型鎖のヌクレオチド塩基の順序に基づいてヌクレオチド鎖を合成するポリメラーゼ)。ポリメラーゼは「鋳型非依存性」ポリメラーゼでもまたあり得る(すなわち、鋳型鎖の要件なしにヌクレオチド鎖を合成するポリメラーゼ)。ポリメラーゼはさらに「DNAポリメラーゼ」または「RNAポリメラーゼ」としてもまた類別され得る。種々の態様において、プライム編集因子システムはDNAポリメラーゼを含む。種々の態様において、DNAポリメラーゼは「DNA依存性DNAポリメラーゼ」であり得る(すなわち、それによると、鋳型分子はDNAの鎖である)。かかるケースでは、DNA鋳型分子はPEgRNAであり得、伸長アームはDNAの鎖を含む。かかるケースでは、PEgRNAはキメラまたはハイブリッドPEgRNAと言われ得、これはRNA部分(すなわち、スペーサーおよびgRNAコアを包含するガイドRNA構成要素)とDNA部分(すなわち伸長アーム)とを含む。種々の他の態様において、DNAポリメラーゼは「RNA依存性DNAポリメラーゼ」であり得る(すなわち、それによると、鋳型分子はRNAの鎖である)。かかるケースでは、PEgRNAはRNAであり、すなわちRNA伸長を包含する。用語「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素をもまた言い得る(すなわちポリメラーゼ活性)。一般的に、酵素は、ポリヌクレオチド鋳型配列にアニーリングしたプライマー(例えば、例えばPEgRNAのプライマー結合部位にアニーリングしたプライマー配列)の3'端において合成を開始し、鋳型鎖の5'端の方へ進むであろう。「DNAポリメラーゼ」はデオキシヌクレオチドの重合を触媒する。DNAポリメラーゼを参照して本願において用いられる用語DNAポリメラーゼは、「その機能的フラグメント」を包含する。「その機能的フラグメント」は、少なくとも1つのセットの条件下においてはポリヌクレオチドの重合を触媒する能力を保持する、ポリメラーゼのアミノ酸配列全体未満を包摂する野生型または変異体DNAポリメラーゼのいずれかの部分を言う。かかる機能的フラグメントは別個の実態として存在し得るか、またはそれは融合タンパク質などのより大きいポリペプチドの構成成分であり得る。

プライム編集
本願において用いられる用語「プライム編集」は、遺伝子編集のための新規のアプローチを言い、napDNAbp、ポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)、およびそれから標的DNA配列上に組み込まれる所望の新たな遺伝情報をコードする(または遺伝情報を欠失する)ためのDNA合成鋳型を包含する特殊化したガイドRNAを用いる。プライム編集のある種の態様は他の図の中でも図1A-1Hおよび図72(a)-72(c)の態様に記載される。

プライム編集は、規定されたDNA部位に新たな遺伝情報を直接的に書き込む汎用的なかつ精密なゲノム編集法であるゲノム編集のための全く新たなプラットフォームを表し、ポリメラーゼ(すなわち、融合タンパク質の形態で、またはさもなければnapDNAbpとトランスで提供されて)と共同で働く核酸プログラム型DNA結合タンパク質(「napDNAbp」)を用いる。プライム編集システムはプライム編集(PE)ガイドRNA(「PEgRNA」)によってプログラムされ、これは、標的部位を規定すると共に、ガイドRNA上に(例えば、ガイドRNAの5'もしくは3'端にまたは内部の部分に)操作された伸長(DNAまたはRNAどちらか)によって置き換えDNA鎖の形態での所望の編集の合成の鋳型となる。所望の編集(例えば、1核酸塩基置換)を含有する置き換え鎖は、編集されるべき標的部位の(ニック部位の直ちに下流の)内生鎖と同じ配列を共有する(またはそれに対して相同的である)(それが所望の編集を包含するということを例外とする)。DNA修復および/または複製機構によって、ニック部位の下流の内生鎖は、所望の編集を含有する新たに合成された置き換え鎖によって置き換えられる。いくつかのケースでは、プライム編集は「検索置換」ゲノム編集テクノロジーと考えられ得る。なぜなら、本明細書に記載のプライム編集因子は、編集されるべき所望の標的部位を検索し位置付けるのみならず、同時に、対応する標的部位の内生DNA鎖の代わりに組み入れされる所望の編集を含有する置き換え鎖をコードするからである。本開示のプライム編集因子は、部分的には、プライム標的にプライムされた逆転写(TPRT)または「プライム編集」の機序が、高い効率および遺伝子フレキシビリティーを有する精密なCRISPR/Casに基づくゲノム編集を行うために活用または適合され得るという発見に関する(例えば、図1A-1Fの種々の態様に図示されているとおり)。天然には、TPRTは、可動DNAエレメント、例えば哺乳類非LTRレトロトランスポゾンおよび細菌グループIIイントロンによって用いられる^28,29。本発明者は、本願において、Casタンパク質-逆転写酵素融合体または関係するシステムを用いて、ガイドRNAによって特定のDNA配列を標的化し、標的部位に一本鎖ニックを生成し、ガイドRNAに取り入れされた操作された逆転写酵素鋳型の逆転写のためのプライマーとして、ニッキングされたDNAを用いた。しかしながら、概念はDNAポリメラーゼ構成要素として逆転写酵素を用いるプライム編集因子から始まるが、本明細書に記載のプライム編集因子は逆転写酵素に限定されず、実質的にいずれかのDNAポリメラーゼの使用を包含し得る。実に、本願は、至る所で、「逆転写酵素」を有するプライム編集因子を言い得るが、逆転写酵素は、プライム編集で働き得るDNAポリメラーゼの1つの型であるのみであるということがここで明示される。それゆえに、本明細書が「逆転写酵素」に言及するところではいつも、当業者は、いずれかの好適なDNAポリメラーゼが逆転写酵素の代わりに用いられ得るということを了解するべきである。それゆえに、一側面において、プライム編集因子はCas9(または同等のnapDNAbp)を含み得、これは、標的DNA上の相補的なプロトスペーサーにアニールするスペーサー配列を含有する特殊化したガイドRNA(すなわちPEgRNA)とそれを会合させることによって、DNA配列を標的化するようにプログラムされる。特殊化したガイドRNAは、所望の遺伝子変改を含有するDNAの置き換え鎖をコードする伸長の形態の新たな遺伝情報をもまた含有し、これは、標的部位における対応する内生DNA鎖を置き換えるために用いられる。PEgRNAからの情報を標的DNAに移入するために、プライム編集の機序には、DNAの1つの鎖上の標的部位へニックを入れて3'ヒドロキシル基を暴露することが関わる。それから、暴露された3'ヒドロキシル基は、直接的に標的部位へのPEgRNA上の編集をコードする伸長のDNA重合をプライムするために用いられ得る。種々の態様において、編集を含有する置き換え鎖の重合のための鋳型を提供する伸長は、RNAまたはDNAから形成され得る。RNA伸長のケースでは、プライム編集因子のポリメラーゼはRNA依存性DNAポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)であり得る。DNA伸長のケースでは、プライム編集因子のポリメラーゼはDNA依存性DNAポリメラーゼであり得る。本明細書に開示のプライム編集因子によって形成される新たに合成された鎖(すなわち、所望の編集を含有する置き換えDNA鎖)は、所望のヌクレオチド変化(例えば、1ヌクレオチド変化、欠失、もしくは挿入、またはそれらの組み合わせ)の包含を例外として、ゲノム標的配列に対して相同的である(すなわち、それと同じ配列を有する)であろう。DNAの新たに合成された(または置き換え)鎖は一本鎖DNAフラップともまた言われ得る。これは相補的な相同的な内生DNA鎖とのハイブリダイゼーションについて競合し、それによって対応する内生鎖に取って代わるであろう。ある態様において、システムは、エラーを起こしやすい逆転写酵素酵素の使用と組み合わせられ得る(例えば、Cas9ドメインとの融合タンパク質として提供されるか、またはCas9ドメインに対してトランスで提供される)。エラーを起こしやすい逆転写酵素酵素は一本鎖DNAフラップの合成の間に変改を導入し得る。それゆえに、ある態様において、エラーを起こしやすい逆転写酵素は、標的DNAへのヌクレオチド変化を導入するために利用され得る。システムに用いられるエラーを起こしやすい逆転写酵素に依存して、変化はランダムまたは非ランダムであり得る。ハイブリダイズした中間体(内生DNA鎖にハイブリダイズした逆転写酵素によって合成される一本鎖DNAフラップを含む)の分解は、内生DNAのもたらされる取って代わられたフラップの除去(例えば、5'端DNAフラップエンドヌクレアーゼFEN1による)、標的DNAに対する合成された一本鎖DNAフラップのライゲーション、ならびに細胞性のDNA修復および/または複製プロセスの結果としての所望のヌクレオチド変化の同化を包含し得る。鋳型によるDNA合成は挿入および欠失を包含するいずれかのヌクレオチドの改変について1ヌクレオチド精度をオファーするので、このアプローチの範囲は非常に幅広く、予見可能には、基礎研究および治療学において無数の適用に用いられ得る。

種々の態様において、プライム編集は、プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)と複合体化した核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)と標的DNA分子(これについて、ヌクレオチド配列の変化が導入されることが望まれる)を接触させることによって作動する。図1Gを参照すると、プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)は、ガイドRNAの3'もしくは5'端にまたはガイドRNAの分子内の位置付けに伸長を含み、所望のヌクレオチド変化(例えば、1ヌクレオチド変化、挿入、または欠失)をコードする。ステップ(a)では、napDNAbp/伸長されたgRNA複合体がDNA分子に接触し、伸長されたgRNAが、標的座位に結合するようにnapDNAbpをガイドする。ステップ(b)では、標的座位のDNAの鎖の1つにニックが導入され(例えば、ヌクレアーゼまたは化学的薬剤による)、それによって利用可能な3'端を標的座位の鎖の1つに生出する。ある態様において、ニックは、Rループ鎖に対応するDNAの鎖、すなわちガイドRNA配列にハイブリダイズされない鎖、すなわち「非標的鎖」上に生出される。しかしながら、ニックは鎖のどちらかに導入され得る。つまり、ニックはRループ「標的鎖」(すなわち、伸長されたgRNAのプロトスペーサーにハイブリダイズされる鎖)または「非標的鎖」(すなわち、標的鎖に対して相補的であるRループの一本鎖部分を形成する鎖)に導入され得る。ステップ(c)では、DNA鎖の3'端(ニックによって形成される)は、逆転写をプライムするためにガイドRNAの伸長された部分と相互作用する(すなわち、「プライム標的にプライムされたRT」)。ある態様において、3'端DNA鎖は、ガイドRNAの伸長された部分の特異的なRTプライム配列、すなわちPEgRNA上の「逆転写酵素プライム配列」または「プライマー結合部位」にハイブリダイズする。ステップ(d)では、逆転写酵素(または他の好適なDNAポリメラーゼ)が導入される。これは、プライムされた部位の3'端からプライム編集ガイドRNAの5'端の方へDNAの一本鎖を合成する。DNAポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)はnapDNAbpに融合され得るか、または代替的にはnapDNAbpに対してトランスで提供され得る。これは、ニック部位のまたはそれに隣接する内生DNAに対してさもなければ相同的である所望のヌクレオチド変化(例えば、1塩基変化、挿入、もしくは欠失、またはそれらの組み合わせ)を含む一本鎖DNAフラップを形成する。ステップ(e)では、napDNAbpおよびガイドRNAがリリースされる。ステップ(f)および(g)は一本鎖DNAフラップの分解に関し、その結果、所望のヌクレオチド変化が標的座位に組み込まれるようになる。このプロセスは、ひとたび3'一本鎖DNAフラップが内生DNA配列に侵入およびハイブリダイズすると形成する対応する5'内生DNAフラップを除去することによって、所望の産物形成の方へ駆動され得る。理論によって拘束されることなしに、細胞の内生DNA修復および複製プロセスは、ミスマッチのDNAを分解して、ヌクレオチド変化(単数または複数)を組み込んで、所望の変改された産物を形成する。プロセスは、図1Fに例示されているとおり「第2鎖ニッキング」によってもまた産物形成の方へ駆動され得る。このプロセスは次の遺伝子変化の少なくとも1つ以上を導入し得る:トランスバージョン、トランジション、欠失、および挿入。

用語「プライム編集因子(PE)システム」または「プライム編集因子(PE)」または「PEシステム」または「PE編集システム」は、本明細書に記載の(describe)プライム標的にプライムされた逆転写(TPRT)を用いるゲノム編集の方法に関わる組成物を言い、napDNAbp、逆転写酵素、融合タンパク質(例えば、napDNAbpおよび逆転写酵素を含む)、プライム編集ガイドRNA、ならびに融合タンパク質およびプライム編集ガイドRNAを含む複合体、ならびに補助的な要素、例えば、プライム編集プロセスを編集された産物形成の方へ駆動することを助けるための第2鎖ニッキング構成要素(例えば、第2鎖sgRNA)および5'内生DNAフラップ除去エンドヌクレアーゼ(例えばFEN1)を包含するが、これらに限定されない。

ここまで記載された態様では、PEgRNAは、ガイドRNA(これは、それ自体が、スペーサー配列およびgRNAコアまたは骨格を含む)とプライマー結合部位およびDNA合成鋳型を含む5'または3'伸長アームとを含む単一分子を構成するが(例えば図3Dを見よ)、PEgRNAは2つの個々の分子の形態をもまた取り得、ガイドRNAと、トランスプライム編集因子RNA鋳型(tPERT)とからなる。これは、本質的に、伸長アーム(特に、プライマー結合部位およびDNA合成ドメインを包含する)およびRNA-タンパク質動員ドメイン(例えば、MS2アプタマーまたはヘアピン)を同じ分子上に収容する。これは、tPERT動員タンパク質(例えば、MS2アプタマーに結合するMS2cpタンパク質)を含む改変されたプライム編集因子複合体へと共局在または動員されるようになる。プライム編集に用いられ得るtPERTの例としては図3Gおよび図3Hを見よ。

プライム編集因子
用語「プライム編集因子」は、napDNAbp(例として、Cas9ニッカーゼ)および逆転写酵素を含む本明細書に記載の融合構築物を指し、PEgRNA(または「伸長されたガイドRNA」)の存在下で標的ヌクレオチド配列上にプライム編集を遂行することが可能である。用語「プライム編集因子」は、融合タンパク質、またはPEgRNAと複合体化された融合タンパク質、および/または第2鎖へニックを入れるsgRNAとさらに複合体化された融合タンパク質を指してもよい。いくつかの態様において、プライム編集因子はまた、本明細書に記載のとおりの非編集済鎖の第2部位へのニック入れステップへ向かうことが可能な、融合タンパク質(napDNAbpと融合した逆転写酵素)、PEgRNA、および定例の(regular)ガイドRNAを含む複合体も指してもよい。他の態様において、「プライマー編集因子」の逆転写酵素構成要素は、transで提供されてもよい。

プライマー結合部位
用語「プライマー結合部位」または「PBS」は、伸長アームの構成要素としてPEgRNA上に位置付けられ(典型的には伸長アームの3'末にある)ヌクレオチド配列であって、プライム編集因子による標的配列のCas9ニック入れ後に形成されるプライマー配列へ結合するのに役立つヌクレオチド配列を指す。他のどこかで詳述されるとおり、プライム編集因子のCas9ニッカーゼ構成要素が標的DNA配列の鎖の一方にニックを入れたとき、3'末のssDNAフラップが形成され、これはPEgRNA上のプライマー結合部位とアニールして逆転写をプライムするプライマー配列として働く。図27および28は、3'および5'伸長アーム上夫々に位置付けられるプライマー結合部位の態様を示す。

プロモーター
用語「プロモーター」は当該技術分野において認識されており、細胞性の転写機構によって認識され、下流遺伝子の転写を開始する能力がある配列を有する核酸分子を言う。プロモーターは、プロモーターが所与の細胞性という文脈において常に活性であるということを意味する恒常的に活性、またはプロモーターが特定の条件の存在下においてのみ活性であるということを意味する条件付きで活性であり得る。例えば、条件付きプロモーターは、プロモーター上の制御エレメントと会合したタンパク質を基本的な転写機構に接続する特定のタンパク質の存在下においてのみ、または阻害分子の不在下においてのみ活性であり得る。条件付きで活性なプロモーターのサブクラスは、活性のために低分子「誘導因子」の存在を要求する誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターの例は、アラビノース誘導性プロモーター、Tet-onプロモーター、およびタモキシフェン誘導性プロモーターを包含するが、これらに限定されない。種々の恒常的、条件付き、および誘導性プロモーターが当業者に周知であり、当業者は本発明を実行することに有用な種々のかかるプロモーターを確かめる能力があるであろう。これはこの点について限定されない。

プロトスペーサー
本願において用いられる用語「プロトスペーサー」はPAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)配列に隣接するDNA上の配列(～20bp)を言う。プロトスペーサーはガイドRNAのスペーサー配列と同じ配列を共有する。ガイドRNAは標的DNA上のプロトスペーサー配列の相補体(具体的には、それの1つの鎖、すなわち標的DNA配列の「非標的鎖」に対する「標的鎖」)にアニールする。Cas9が機能するためには、それは特定のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)をもまた要求し、これはCas9遺伝子の細菌種に依存して変わる。S.pyogenesに由来する最も普通に用いられるCas9ヌクレアーゼは、ゲノムDNA上の標的配列の直接的に下流に見出される非標的鎖上のNGGというPAM配列を認識する。当業者は、現況技術の文献が、場合によっては、それを「スペーサー」と言うよりもむしろ、ガイドRNAそれ自体の上の～20nt標的特異的ガイド配列として「プロトスペーサー」を言うということを了解するであろう。それゆえに、いくつかのケースでは、本願において用いられる用語「プロトスペーサー」は用語「スペーサー」と交換可能に用いられ得る。「プロトスペーサー」または「スペーサー」どちらかの出現の周囲の記載という文脈は、用語がgRNAまたはDNA標的を参照しているかどうかについて読み手に情報提供することを助けるであろう。

プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)
本願において用いられる用語「プロトスペーサー隣接配列」または「PAM」は、Cas9ヌクレアーゼの重要な標的化構成要素であるおよそ2-6塩基対のDNA配列を言う。典型的には、PAM配列はどちらかの鎖上にあり、Cas9によってカットされる部位の5'から3'方向においては下流である。標準的なPAM配列(すなわち、Streptococcus pyogenesのCas9ヌクレアーゼまたはSpCas9に関連するPAM配列)は5'-NGG-3'であり、「N」は2つのグアニン(「G」)核酸塩基によって後続されるいずれかの核酸塩基である。異なるPAM配列が異なる生物からの異なるCas9ヌクレアーゼまたは同等タンパク質と関連し得る。加えて、いずれかの所与のCas9ヌクレアーゼ、例えばSpCas9は、ヌクレアーゼが代替的なPAM配列を認識するようにしてヌクレアーゼのPAM特異性を変改するように改変され得る。

例えば、配列番号18の(is)標準的なSpCas9アミノ酸配列を参照して、PAM配列は1つ以上の変異を導入することによって改変され得る。(a)PAM特異性をNGANまたはNGNGへと変改するD1135V、R1335Q、およびT1337R「VQRバリアント」、(b)PAM特異性をNGAGへと変改するD1135E、R1335Q、およびT1337R「EQRバリアント」、ならびに(c)PAM特異性をNGCGへと変改するD1135V、G1218R、R1335E、およびT1337R「VRERバリアント」を包含する。加えて、標準的なSpCas9のD1135EバリアントはなおNGGを認識するが、それは野生型SpCas9タンパク質と比較して選択的である。

異なる細菌種からのCas9酵素(すなわち、Cas9オーソログ)は様々なPAM特異性を有し得るということもまた了解されるであろう。例えば、Staphylococcus aureusからのCas9(SaCas9)はNGRRTまたはNGRRNを認識する。加えて、Neisseria meningitisからのCas9(NmCas)はNNNNGATTを認識する。別の例では、Streptococcus thermophilisからのCas9(StCas9)はNNAGAAWを認識する。なお別の例では、Treponema denticolaからのCas9(TdCas)はNAAAACを認識する。これらは例であり、限定することを意味されない。さらに、非SpCas9が種々のPAM配列に結合するということは了解されるであろう。これは、好適なSpCas9 PAM配列が所望の標的のカットされる部位に存在しないときにそれらを有用にする。さらにその上、非SpCas9は、それらをSpCas9よりも有用にする他の特徴を有し得る。例えば、Staphylococcus aureusからのCas9(SaCas9)はSpCas9よりも約1キロベース小さい。そのため、それはアデノ随伴ウイルス(AAV)にパッケージングされ得る。Shah et al.,“Protospacer recognition motifs:mixed identities and functional diversity,”RNA Biology,10(5):891-899のさらなる参照がなされ得る(これは参照によって本願に組み込まれる)。
リコンビナーゼ

本願において用いられる用語「リコンビナーゼ」は、リコンビナーゼ認識配列間のDNAの組み換えを媒介する部位特異的な酵素を言い、これはリコンビナーゼ認識配列間のDNAフラグメントの切除、取り入れ、逆位、または交換(例えば転座)をもたらす。リコンビナーゼは2つの別物のファミリーに分類され得る:セリンリコンビナーゼ(例えばリゾルバーゼおよびインベルターゼ)およびチロシンリコンビナーゼ(例えばインテグラーゼ)である。セリンリコンビナーゼの例は、限定なしに、Hin、Gin、Tn3、β-six、CinH、ParA、γδ、Bxb1、φC31、TP901、TG1、φBT1、R4、φRV1、φFC1、MR11、A118、U153、およびgp29を包含する。チロシンリコンビナーゼの例は、限定なしに、Cre、FLP、R、Lambda、HK101、HK022、およびpSAM2を包含する。セリンおよびチロシンリコンビナーゼの名称は、リコンビナーゼがDNAを攻撃するために用い、鎖交換の間にDNAに共有結合的に連結されるようになる保存された求核性アミノ酸残基から派生する。リコンビナーゼは、遺伝子ノックアウト/ノックインの生出および遺伝子治療適用を包含する数々の適用を有する。例として、Brown et al.,“Serine recombinases as tools for genome engineering.”Methods.2011;53(4):372-9;Hirano et al.,“Site-specific recombinases as tools for heterologous gene integration.”Appl.Microbiol.Biotechnol.2011;92(2):227-39;Chavez and Calos,“Therapeutic applications of the ΦC31 integrase system.”Curr.Gene Ther.2011;11(5):375-81;Turan and Bode,“Site-specific recombinases:from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications.”FASEB J.2011;25(12):4088-107;Venken and Bellen,“Genome-wide manipulations of Drosophila melanogaster with transposons, Flp recombinase, and ΦC31 integrase.”Methods Mol.Biol.2012;859:203-28;Murphy,“Phage recombinases and their applications.”Adv.Virus Res.2012;83:367-414;Zhang et al.,“Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era.”J.Zhejiang Univ.Sci.B.2012;13(7):511-24;Karpenshif and Bernstein,“From yeast to mammals:recent advances in genetic control of homologous recombination.”DNA Repair(Amst).2012;1;11(10):781-8(各々の全内容は、それら全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)を参照。本願において提供されるリコンビナーゼは、本発明の態様に用いられ得るリコンビナーゼの専らの例であることを意味されない。本発明の方法および組成物は、新たな直交的なリコンビナーゼについてデータベースをマイニングすることまたは定められたDNA特異性を有する合成リコンビナーゼをデザインすることによって拡張され得る(例として、Groth et al.,“Phage integrases:biology and applications.”J.Mol.Biol.2004;335,667-678;Gordley et al.,“Synthesis of programmable integrases.”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.2009;106,5053-5058(各々の全内容は、それらの全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)を参照)。本明細書に記載の方法および組成物に有用であるリコンビナーゼの他の例は当業者には知られており、発見または生成されるいずれかの新たなリコンビナーゼは、本発明の異なる態様に用いられる能力があることが予想される。いくつかの態様では、リコンビナーゼの触媒ドメインは、ヌクレアーゼを不活性化されたRNAによってプログラム可能なヌクレアーゼ(例えば、dCas9またはそのフラグメント)に融合され、その結果、リコンビナーゼドメインは核酸結合ドメインを含まないかまたは標的核酸に結合する能力がない(例えば、リコンビナーゼドメインはそれが特異的なDNA結合活性を有さないようにして操作される)。DNA結合活性を欠くリコンビナーゼおよび改変するための方法は知られており、Klippel et al.,“Isolation and characterisation of unusual gin mutants.”EMBO J.1988;7:3983-3989:Burke et al.,“Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation.Mol Microbiol.2004;51:937-948;Olorunniji et al.,“Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants.”Nucleic Acids Res. 2008;36:7181-7191;Rowland et al.,“Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure-based model of the synaptosome.”Mol Microbiol.2009;74:282-298;Akopian et al.,“Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition.”Proc Natl Acad Sci USA.2003;100:8688-8691;Gordley et al.,“Evolution of programmable zinc finger-recombinases with activity in human cells.J Mol Biol.2007;367:802-813;Gordley et al.,“Synthesis of programmable integrases.”Proc Natl Acad Sci USA.2009;106:5053-5058;Arnold et al.,“Mutants of Tn3 resolvase which do not require accessory binding sites for recombination activity.”EMBO J.1999;18:1407-1414;Gaj et al.,“Structure-guided reprogramming of serine recombinase DNA sequence specificity.”Proc Natl Acad Sci USA.2011;108(2):498-503;およびProudfoot et al.,“Zinc finger recombinases with adaptable DNA sequence specificity.”PLoS One.2011;6(4):e19537(各々の全内容は、それらの全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)によって記載されるものを包含する。例えば、リゾルバーゼ-インベルターゼ群のセリンリコンビナーゼ、例えばTn3およびγδリゾルバーゼならびにHinおよびGinインベルターゼは、自律的な触媒およびDNA結合ドメインを有する分子構造を有する(例として、Grindley et al.,“Mechanism of site-specific recombination.”Ann Rev Biochem.2006;75:567-605(その全内容は参照により組み込まれる)を参照)。それゆえに、例えばいずれかの補助的な因子(例えばDNA結合活性)を要求しない「活性化された」リコンビナーゼ変異体の単離後に、これらのリコンビナーゼの触媒ドメインは、本明細書に記載のとおりヌクレアーゼを不活性化されたRNAによってプログラム可能なヌクレアーゼ(例えば、dCas9またはそのフラグメント)と組み換えられることに対して従順である(例として、Klippel et al.,“Isolation and characterisation of unusual gin mutants.”EMBO J.1988;7:3983-3989:Burke et al.,“Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation. Mol Microbiol.2004;51:937-948;Olorunniji et al.,“Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants.”Nucleic Acids Res.2008;36:7181-7191;Rowland et al.,“Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure-based model of the synaptosome.”Mol Microbiol.2009;74:282-298;Akopian et al.,“Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition.”Proc Natl Acad Sci USA.2003;100:8688-8691を参照)。加えて、N末端触媒ドメインおよびC末端DNA結合ドメインを有する多くの他の天然のセリンリコンビナーゼが知られており(例えば、ファイC31インテグラーゼ、TnpXトランスポゼース、IS607トランスポゼース)、それらの触媒ドメインは、本明細書に記載のとおりプログラム可能な部位特異的なリコンビナーゼを操作するために選出され得る(例として、Smith et al.,“Diversity in the serine recombinases.”Mol Microbiol.2002;44:299-307(その全内容は参照により組み込まれる)を参照)。類似に、チロシンリコンビナーゼ(例えば、Cre、λインテグラーゼ)のコア触媒ドメインは知られており、本明細書に記載のとおりプログラム可能な部位特異的リコンビナーゼを操作するために類似に選出され得る(例として、Guo et al.,“Structure of Cre recombinase complexed with DNA in a site-specific recombination synapse.”Nature.1997;389:40-46;Hartung et al.,“Cre mutants with altered DNA binding properties.”J Biol Chem 1998;273:22884-22891;Shaikh et al.,“Chimeras of the Flp and Cre recombinases:Tests of the mode of cleavage by Flp and Cre.J Mol Biol.2000;302:27-48;Rongrong et al.,“Effect of deletion mutation on the recombination activity of Cre recombinase.”Acta Biochim Pol.2005;52:541-544;Kilbride et al.,“Determinants of product topology in a hybrid Cre-Tn3 resolvase site-specific recombination system.”J Mol Biol.2006;355:185-195;Warren et al.,“A chimeric cre recombinase with regulated directionality.”Proc Natl Acad Sci USA.2008 105:18278-18283;Van Duyne,“Teaching Cre to follow directions.”Proc Natl Acad Sci USA.2009 Jan 6;106(1):4-5;Numrych et al.,“A comparison of the effects of single-base and triple-base changes in the integrase arm-type binding sites on the site-specific recombination of bacteriophage λ.”Nucleic Acids Res.1990;18:3953-3959;Tirumalai et al.,“The recognition of core-type DNA sites by λ integrase.”J Mol Biol.1998;279:513-527;Aihara et al.,“A conformational switch controls the DNA cleavage activity of λ integrase.”Mol Cell.2003;12:187-198;Biswas et al.,“A structural basis for allosteric control of DNA recombination by λ integrase.”Nature.2005;435:1059-1066;およびWarren et al.,“Mutations in the amino-terminal domain of λ-integrase have differential effects on integrative and excisive recombination.”Mol Microbiol.2005;55:1104-1112(各々の全内容は参照により組み込まれる)を参照)。

リコンビナーゼ認識配列
本願において用いられる用語「リコンビナーゼ認識配列」または同等に「RRS」または「リコンビナーゼ標的配列」は、リコンビナーゼによって認識され、RRSを有する別のDNA分子との鎖交換を経過するヌクレオチド配列標的を言う。これはリコンビナーゼ認識配列間のDNAフラグメントの切除、取り入れ、逆位、または交換をもたらす。

組み換えるまたは組み換え
用語「組み換える」または「組み換え」は、核酸改変(例えばゲノム改変)という文脈において、2つ以上の核酸分子または単一の核酸分子の2つ以上の領域がリコンビナーゼタンパク質(例えば、本願において提供される本発明のリコンビナーゼ融合タンパク質)の作用によって改変されるプロセスを言うために用いられる。組み換えは、例えば1つ以上の核酸分子上または間において、核酸のとりわけ挿入、逆位、切除、または転座をもたらし得る。リコンビナーゼ認識配列

逆転写酵素
用語「逆転写酵素」はRNA依存性DNAポリメラーゼとして特徴付けられるポリメラーゼのあるクラスを記述する。全ての公知の逆転写酵素はRNA鋳型からDNA転写物を合成するためにはプライマーを要求する。歴史的には、逆転写酵素は主としてmRNAをcDNAに転写するために用いられている。これはそれからさらなる操作のためにベクター上にクローニングされ得る。トリ骨髄芽球症(myoblastosis)ウイルス(AMV)逆転写酵素は最初の広く用いられるRNA依存性DNAポリメラーゼであった(Verma, Biochim. Biophys. Acta 473:1(1977))。酵素は、5'-3'RNA指令型DNAポリメラーゼ活性、5'-3'DNA指令型DNAポリメラーゼ活性、およびRNase H活性を有する。RNase HはRNA-DNAハイブリッドのRNA鎖に特異的なプロセッシブな5'および3'リボヌクレアーゼである(Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, New York: Wiley & Sons(1984))。公知のウイルス逆転写酵素はプルーフリーディングにとって必要な3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠くので、転写のエラーは逆転写酵素によって修正され得ない(Saunders and Saunders, Microbial Genetics Applied to Biotechnology, London: Croom Helm(1987))。AMV逆転写酵素の活性およびその関連するRNase H活性の詳細な研究は、Berger et al., Biochemistry 22:2365-2372(1983)によって提示されている。分子生物学に鋭意用いられる別の逆転写酵素はモロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)を起源とする逆転写酵素である。例えば、Gerard, G. R., DNA 5:271-279(1986)およびKotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-258(1985)を見よ。RNase H活性を実質的に欠くM-MLV逆転写酵素もまた記載されている。例えばU.S.Pat.No.5,244,797を見よ。本発明はいずれかのかかる逆転写酵素またはそれらのバリアントもしくは変異体の使用を企図する。

加えて、本発明は、エラーを起こしやすい、すなわちエラーを起こしやすい逆転写酵素と言われ得る逆転写酵素、または重合の間にヌクレオチドの高忠実性組み込みを支持しない逆転写酵素の使用を企図する。ガイドRNAと取り入れされたRT鋳型に基づく一本鎖DNAフラップの合成の間に、エラーを起こしやすい逆転写酵素は、RT鋳型配列とミスマッチである1つ以上のヌクレオチドを導入し得、それによって、一本鎖DNAフラップの誤りがちな重合によってヌクレオチド配列に変化を導入する。それから、一本鎖DNAフラップの合成の間に導入されるこれらのエラーは、対応する内生標的鎖に対するハイブリダイゼーション、取って代わられた内生鎖の除去、ライゲーション、ならびにそれから内生DNA修復および/または配列決定プロセスのもう1つのラウンドによって、二本鎖分子上に取り入れられるようになる。

逆転写
本願において用いられる用語「逆転写」は、酵素がRNAを鋳型として用いてDNA鎖(つまり、相補的なDNAまたはcDNA)を合成する能力を指示する。いくつかの態様では、逆転写は「エラーを起こしやすい逆転写」であり得る。これは、それらのDNA重合活性がエラーを起こしやすい、ある種の逆転写酵素の特性を言う。

PACE
本願において用いられる用語「ファージによって補助される連続的進化(PACE)」は、ウイルスベクターとしてファージを使用する連続的進化を言う。PACE技術の一般概念は、例えば、2009年9月8日出願の国際PCT出願PCT/US2009/056194、2010年3月11日にWO 2010/028347として公開;2011年12月22日出願の国際PCT出願PCT/US2011/066747、2012年6月28日にWO 2012/088381として公開;米国出願、2015年5月5日に発行された米国特許第9,023,594号;2015年1月20日出願の国際PCT出願PCT/US2015/012022、2015年9月11日にWO 2015/134121として公開;および2016年4月15日出願の国際PCT出願PCT/US2016/027795、2016年10月20日にWO 2016/168631として公開(これら全体の各内容は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。

ファージ
本願において用語「バクテリオファージ」と交換可能に用いられる用語「ファージ」は、細菌細胞に感染するウイルスを言う。典型的には、ファージは遺伝物質を内包する外側タンパク質カプシドからなる。遺伝物質は直線状または環状形態どちらかのssRNA、dsRNA、ssDNA、またはdsDNAであり得る。ファージおよびファージベクターは当業者には周知であり、本願において提供されるPACE法を実行するために有用であるファージの限定しない例は、λ(溶原体)、T2、T4、T7、T12、R17、M13、MS2、G4、P1、P2、P4、ファイX174、N4、Φ6、およびΦ29である。ある態様において、本発明に利用されるファージはM13である。追加の好適なファージおよびホスト細胞は当業者には明らかであろう。本発明はこの側面において限定されない。追加の好適なファージおよびホスト細胞の例示の記載は、Elizabeth Kutter and Alexander Sulakvelidze:Bacteriophages: Biology and Applications.CRC Press;1st edition(December 2004),ISBN:0849313368;Martha R.J.Clokie and Andrew M.Kropinski:Bacteriophages:Methods and Protocols,Volume 1:Isolation,Characterization,and Interactions(Methods in Molecular Biology)Humana Press;1st edition(December,2008),ISBN:1588296822;Martha R.J.Clokie and Andrew M.Kropinski:Bacteriophages:Methods and Protocols,Volume 2:Molecular and Applied Aspects(Methods in Molecular Biology)Humana Press;1st edition(December 2008),ISBN:1603275649を見よ;これらの全ては、好適なファージおよびホスト細胞、ならびにかかるファージの単離、培養、および操作のための方法およびプロトコールの開示について、それらの全体が参照によって本願に組み込まれる)。

タンパク質、ペプチド、およびポリペプチド
用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は本明細書中、互換的に使用され、ペプチド(アミド)結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基の重合体を指す。用語は、いずれのサイズ、構造、もしくは機能の、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも3アミノ酸長であろう。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質またはタンパク質の一群を指してもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中のアミノ酸の1以上は、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、ホスファート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、抱合のためのリンカー、官能基化、または他の修飾等々などの化学的実体(chemical entity)の付加によって修飾されていてもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドはまた、単一分子であってもよく、または多分子複合体であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドのただのフラグメントであってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するもの、組換え体、または合成物、またはいずれのそれらの組み合わせであってもよい。本明細書に提供されるタンパク質のいずれも、当該技術分野において知られているいずれの方法によって産生されてもよい。例えば、本明細書に提供されるタンパク質は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質にとくに適した、組換えタンパク質の発現および精製を介して産生されてもよい。組換えタンパク質の発現および精製のための方法は周知であり、Green and Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)(これらの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))によって記載されるものを包含する。

タンパク質スプライシング
本願において用いられる用語「タンパク質スプライシング」は、インテイン(または場合に応じて分裂インテイン)の配列がアミノ酸配列内から切り出され、アミノ酸配列の残りのフラグメントのエクステインがアミド結合によってライゲーションされて連続的なアミノ酸配列を形成するプロセスを言う。用語「トランス」タンパク質スプライシングは、インテインが分裂インテインであり、それらが異なるタンパク質上に位置付けられる特定のケースを言う。

第2鎖ニッキング
プライム編集の結果として形成されるヘテロ二重鎖DNA(すなわち、1つの編集されたおよび1つの非編集の鎖を含有する)の分解は、長期的な編集アウトカムを決定する。言葉にすると、プライム編集のゴールは、相補的な内生鎖上に編集された鎖を永久的に取り入れすることによって、PEの中間体として形成されるヘテロ二重鎖DNA(内生非編集鎖と対形成した編集された鎖)を分解することである。DNA分子上への編集された鎖の永久的な取り入れに有利にヘテロ二重鎖DNAの分解を駆動することを助けるために、「第2鎖ニッキング」のアプローチが本願において用いられ得る。本願において用いられる「第2鎖ニッキング」の概念は、第1のニック(すなわち、ガイドRNAの伸長された部分上の逆転写酵素のプライムへの使用のための遊離の3'端を提供する当初のニック部位)の下流の位置付けにおける、好ましくは編集されない鎖上の第2のニックの導入を言う。ある態様において、第1のニックおよび第2のニックは対向する鎖上にある。他の態様において、第1のニックおよび第2のニックは対向する鎖上にある。さらに別の態様では、第1のニックは非標的鎖(すなわち、Rループの一本鎖部分を形成する鎖)上にあり、第2のニックは標的鎖上にある。なお他の態様において、第1のニックは編集される鎖上にあり、第2のニックは編集されない鎖上にある。第2のニックは、第1のニックの少なくとも5ヌクレオチド下流に、あるいは第1のニックの少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、もしくは150ヌクレオチド、またはより多く下流に位置取り得る。第2のニックは、ある態様において、編集されない鎖上において、PEgRNAによって誘導されるニックの部位から約5-150ヌクレオチドの間、または約5-140の間、もしくは約5-130の間、もしくは約5-120の間、もしくは約5-110の間、もしくは約5-100の間、もしくは約5-90の間、もしくは約5-80の間、もしくは約5-70の間、もしくは約5-60の間、もしくは約5-50の間、もしくは約5-40の間、もしくは約5-30の間、もしくは約5-20の間、もしくは約5-10の間離れて導入され得る。1つの態様では、第2のニックは、PEgRNAによって誘導されるニックから14-116ヌクレオチドの間離れて導入される。理論によって拘束されることなしに、第2のニックは細胞の内生DNA修復および複製プロセスを編集されない鎖の置き換えまたは編集の方へ誘導し、それによって、両方の鎖上に編集された配列を永久的に組み入れし、PEの結果として形成されるヘテロ二重鎖を分解する。いくつかの態様では、編集される鎖は非標的鎖であり、編集されない鎖は標的鎖である。他の態様において、編集される鎖は標的鎖であり、編集されない鎖は非標的鎖である。

センス鎖
遺伝学において、「センス」鎖は、5'から3'へ伸びる二本鎖のDNA内のセグメントであって、3'から5'へ伸びるDNAのアンチセンス鎖または鋳型鎖に相補的である。タンパク質をコードするDNAセグメントのケースにおいて、センス鎖は、転写の最中にその鋳型としてアンチセンス鎖を取り結局(典型的には、常にではない)翻訳を経てタンパク質になるmRNAと同じ配列を有するDNAの鎖である。よって、アンチセンス鎖は、後にタンパク質へ翻訳されるRNAを担い、一方センス鎖は、mRNAとほぼ同一の組成(makeup)を保有する。dsDNAの各セグメントについて、一方がどの方向から読まれるかに応じて、おそらく(センスおよびアンチセンスは視点に相対するから)センスおよびアンチセンスが2組存在するであろう点に留意する。遺伝子産物またはmRNAは結局、dsDNAの一方のセグメントのどちらかの鎖がセンスまたはアンチセンスと称されることを示す。

PEgRNAの文脈において、第1ステップは、5'→3'方向に配向される単鎖相補DNA(すなわち、組み込まれることになる3'ssDNAフラップ)の合成であるが、前記合成鎖はPEgRNA伸長アームの鋳型から外れる。3'ssDNAフラップがセンス鎖と見なされるべきかまたはアンチセンス鎖と見なされるべきかについては、DNAの両鎖が転写のための鋳型として働き得る(が同時ではない)ことが十分に許容されているところ、転写の方向に依存する。よって、いくつかの態様において、3'ssDNAフラップ(全体的に5'→3'方向に伸びる)は、コード鎖であることから、センス鎖として働くであろう。他の態様において、3'ssDNAフラップ(全体的に5'→3'方向に伸びる)はアンチセンス鎖として働き、よって転写の鋳型であろう。

スペーサー配列
本明細書に使用されるとき、ガイドRNAまたはPEgRNAと関係のある用語「スペーサー配列」は、標的DNA配列中のプロトスペーサー配列に相補的なヌクレオチド配列を含有する、約20ヌクレオチドのガイドRNAまたはPEgRNAの部分を指す。スペーサー配列はプロトスペーサー配列とアニールすることで、標的部位にてssRNA/ssDNAハイブリッド構造が、およびプロトスペーサー配列に相補的な内生DNA鎖の対応するRループssDNA構造が形成される。

対象
用語「対象」は、本明細書に使用されるとき、個々の生物、例えば、個々の哺乳動物を指す。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は、霊長目の非ヒト動物である。いくつかの態様において、対象は、齧歯類の動物である。いくつかの態様において、対象は、ヒツジ、ヤギ、畜牛、ネコ、またはイヌである。いくつかの態様において、対象は、脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、飛ぶ昆虫(fly)、または線虫である。いくつかの態様において、対象は、研究動物である。いくつかの態様において、対象は、遺伝子学的に改変されており、例として、遺伝子学的に改変された非ヒト対象である。対象は、いずれの性であってもよく、いずれの発生段階にあってもよい。

分裂インテイン
インテインは最も頻繁には一続きのドメインとして見出されるが、いくつかは天然に分裂された形態で存在する。このケースでは、2つのフラグメントは別個のポリペプチドとして発現され、スプライシングが生起する、いわゆるタンパク質トランススプライシング前に会合しなければならない。

例示の分裂インテインはSsp DnaEインテインであり、これは2つのサブユニット、つまりDnaE-NおよびDnaE-Cを含む。2つの異なるサブユニットは別個の遺伝子、つまりdnaE-nおよびdnaE-cによってコードされ、これらは夫々DnaE-NおよびDnaE-Cサブユニットをコードする。DnaEはSynechocytis sp. PCC6803の天然に存在する分裂インテインであり、夫々がDnaE-NまたはDnaE-Cどちらかとの融合体を含む2つの別個のタンパク質のトランススプライシングを導くことができる。

追加の天然に存在するまたは操作された分裂インテイン配列は公知であるか、または本明細書に記載の丸ごとのインテイン配列もしくは当該技術分野で利用可能なものから作られ得る。分裂インテイン配列の例は、Stevens et al.,“A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications,”PNAS,2017,Vol.114:8538-8543;Iwai et al.,“Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme,FEBS Lett,580:1853-1858に見出され得る。これらの夫々は参照によって本願に組み込まれる。追加の分裂インテイン配列は例えばWO2013/045632、WO2014/055782、WO2016/069774、およびEP2877490に見出され得る。これらの夫々の内容は参照によって本願に組み込まれる。

加えて、トランスのタンパク質スプライシングがインビボおよびin vitroで記載されており(Shingledecker,et al.,[0076]Gene 207:187(1998)、Southworth,et al.,EMBO J.17:918(1998);Mills,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:3543-3548(1998);Lew,et al.,J.Biol.Chem.,273:15887-15890(1998);Wu,et al.,Biochim.Biophys.Acta 35732:1(1998b),Yamazaki,et al.,J.Am.Chem.Soc.120:5591(1998),Evans,et al.,J.Biol.Chem.275:9091(2000);Otomo,et al.,Biochemistry 38:16040-16044(1999);Otomo,et al.,J.Biolmol.NMR 14:105-114(1999);Scott,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:13638-13643(1999))、爾後にライゲーションを経過して機能的な産物を形成する2つの不活性なフラグメントとして、あるタンパク質を発現する機会を提供する。例えば、2つの別個に発現された半分からの完全なPE融合タンパク質の形成について、図66および67に示されているとおりである。

標的部位
用語「標的部位」は、本明細書に開示のプライム編集因子(PE)によって編集される核酸分子上の配列を言う。さらに、標的部位は、プライム編集因子(PE)およびgRNAの複合体が結合する核酸分子上の配列を言う。

tPERT
「transプライム編集因子「RNA型(tPERT)」に係る定義を参照。

一時的な第2鎖へのニック入れ
本明細書に使用されるとき、用語「一時的な第2鎖へのニック入れ」は、未編集鎖中の第2ニックの組み入れが、所望の編集が編集済鎖に組み入れられた後でしか生じない、第2鎖へのニック入れのバリアントを指す。これによって、二本鎖DNA切断へ繋がり得る両鎖上の同時ニックが回避される。第2鎖にニックを入れるガイドRNAは、第2鎖ニックが所望の編集の組み入れ後まで導入されないように、一時的制御のためにデザインされている。これは、編集済鎖のみにマッチするが元のアレルにはマッチしないスペーサー配列をもつgRNAをデザインすることによって達成される。このストラテジーを使用すると、プロトスペーサーと未編集アレルとの間のミスマッチによって、PAM鎖上の編集事象が起きた後まで、sgRNAによるニック入れが疎まれるはずである。

Transプライム編集
本明細書に使用されるとき、用語「transプライム編集」は、分裂PEgRNAを利用するプライム編集の修飾形態を指すが、すなわち、ここでPEgRNAは、2つ別々の分子:sgRNAおよびtransプライム編集RNA鋳型(tPERT)に分離される。sgRNAが、所望のゲノムの標的部位へ、プライム編集因子を標的化させる(またはより一般に、プライム編集因子のnapDNAbp構成要素を標的化させる)よう働く一方で、一旦tPERTが、プライム編集因子上およびtPERT上に位置付けられた結合ドメインの相互作用によって、プライム編集因子へtransに動員されると、tPERTはポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によって使用されて新しいDNA配列を標的遺伝子座中へ書き込む。一態様において、結合ドメインは、tPERT上に位置付けられたMS2アプタマーおよびプライム編集因子と融合したMS2cpタンパク質などの、RNA-タンパク質動員部分を包含し得る。transプライム編集の利点は、DNA合成鋳型をガイドRNAから分離させることによって、潜在的により長い長さの鋳型を使用できる点である。

transプライム編集の態様は図3Gおよび3Hに示される。図3Gは左に、transプライム編集因子複合体の組成物(「RP-PE:gRNA複合体」)を示すが、これは、ポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)およびrPERT動員タンパク質(例として、MS2sc)の各々と融合したnapDNAbpを含み、ガイドRNAと複合体化されている。図3Gはさらに、DNA合成鋳型およびプライマー結合配列を包含するPEgRNAの伸長アーム特色を含む、別々のtPERT分子を示す。tPERT分子はまた、RNA-タンパク質動員ドメイン(これは、このケースにおいて、ステムループ構造であり、例えば、MS2アプタマーであり得る)も包含する。図3Hに記載のプロセスに描かれるとおり、RP-PE:gRNA複合体は、標的DNA配列へ結合してニックを入れる。次いで、動員タンパク質(RP)は、tPERTを動員して、DNA標的部位へ結合したプライム編集因子複合体へ共局在化させ、それによってプライマー結合部位が、ニックが入った鎖上のプライマー配列へ結合できるようになり、続いて、ポリメラーゼ(例として、RT)が、DNA合成鋳型に対し、tPERTの5'に至るまでDNAの単鎖を合成できるようになる。

tPERTは、RNA-タンパク質動員ドメインの5'末上にPBSおよびDNA合成鋳型を含むように、図3Gおよび図3Hに示されているが、他の立体配置のtPERTも、RNA-タンパク質動員ドメインの3'末上に位置付けられるPBSおよびDNA合成鋳型をもつようデザインされてもよい。しかしながら、5'伸長をもつtPERTは、DNAの単鎖の合成がtPERTの5'末にて自然と終始するであろうという利点を有し、よって、プライム編集のDNA合成段階の最中に、RNA-タンパク質動員ドメインのいずれの部分も鋳型として使用するリスクがない。

Transプライム編集因子RNA鋳型(tPERT)
本明細書に使用されるとき、「transプライム編集因子RNA鋳型(tPERT)」は、transプライム編集に使用される構成要素を指す、プライム編集の修飾バージョンは、PEgRNAを2つの別個の分子:ガイドRNAおよびtPERT分子に分離することによって作動する。tPERT分子は、標的DNA部位にてプライム編集因子複合体と共局在化させて、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型をプライム編集因子へtransで連れていくようプログラムされている。例えば、(1)RP-PE:gRNA複合体および(2)プライマー結合部位とRNA-タンパク質動員ドメインへ結び合わされたDNA合成鋳型とを包含するtPERTを含む2構成要素系を示すtransプライム編集因子(tPE)の態様については、図3Gを参照。ここでRP-PE:gRNA複合体のRP(動員タンパク質)構成要素は、tPERTを、編集されるべき標的部位へ動員させ、それによってPBSおよびDNA合成鋳型がプライム編集因子にtransで結び付けられる。別の言い方をすれば、tPERTは、PEgRNAの伸長アーム(の全部または一部)を含有するよう改変されており、これは、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型を包含する。

トランジション
本明細書に使用されるとき、「トランジション」は、プリン核酸塩基(A⇔G)の相互変換(interchange)またはピリミジン核酸塩基(C⇔T)の相互変換を指す。このクラスの相互変換は、同様の形状の核酸塩基を伴う。本明細書に開示の組成物および方法は、標的DNA分子において1以上のトランジションを誘導することが可能である。本明細書に開示の組成物および方法はまた、同じ標的DNA分子においてトランジションとトランスバージョンとの両方を誘導することも可能である。これらの変化は、A⇔G、G⇔A、C⇔T、またはT⇔Cを伴う。ワトソン・クリック対の核酸塩基をもつ二本鎖DNAの文脈において、トランスバージョンは、以下の塩基対交換：A:T⇔G:C、G:G⇔A:T、C:G⇔T:A、またはT:A⇔C:Gを指す。本明細書に開示の組成物および方法は、標的DNA分子において1以上のトランジションを誘導することが可能である。本明細書に開示の組成物および方法はまた、同じ標的DNA分子においてトランジションとトランスバージョンとの両方、ならびに欠失および挿入を包含する他のヌクレオチド変化を誘導することも可能である。

トランスバージョン
本明細書に使用されるとき、「トランスバージョン」は、プリン核酸塩基のピリミジン核酸塩基への相互変換、またはその逆を指し、よって、形状が似ていない核酸塩基の相互変換を伴う。これらの変化は、T⇔A、T⇔G、C⇔G、C⇔A、A⇔T、A⇔C、G⇔C、およびG⇔Tを伴う。Watson-Crick対の核酸塩基をもつ二本鎖DNAの文脈において、トランスバージョンは、以下の塩基対交換：T:A⇔A:T、T:A⇔G:C、C:G⇔G:C、C:G⇔A:T、A:T⇔T:A、A:T⇔C:G、G:C⇔C:G、およびG:C⇔T:Aを指す。本明細書に開示の組成物および方法は、標的DNA分子において1以上のトランスバージョンを誘導することが可能である。本明細書に開示の組成物および方法はまた、同じ標的DNA分子においてトランジションとトランスバージョンとの両方、ならびに欠失および挿入を包含する他のヌクレオチド変化を誘導することも可能である。

処置
用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載のとおりの疾患もしくは障害、または1以上のその症状の発病を、食い止め、緩和し、遅延させるか、あるいはその進行を阻害することを目的とした臨床的介入を指す。本明細書に使用されるとき、用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載のとおりの疾患もしくは障害、または1以上のその症状の発病を、食い止め、緩和し、遅延させるか、あるいはその進行を阻害することを目的とした臨床的介入を指す。いくつかの態様において、処置は、1以上の症状が発症した後、および/または疾患と診断された後、施されてもよい。他の態様において、処置は、症状がない中、例として、症状の発病を予防もしくは遅延させるか、または疾患の発病もしくは進行を阻害するために、施されてもよい。例えば、処置は、症状の発現に先立ち(例として、症状の経歴に照らして、および/または遺伝因子もしくは他の感受性因子に照らして)、感受性のある個体へ施されてもよい。処置はまた、症状が消散した後も、例えば、それらの再発を予防または遅延するため、続けられてもよい。

トリヌクレオチド反復(repeat)障害
本明細書に使用されるとき、「トリヌクレオチド反復障害」(または代替的に、「拡大反復障害」もしくは「反復拡大障害」)は、ある種の突然変異(あるトリヌクレオチド反復が、ある遺伝子またはイントロンにある)である「トリヌクレオチド反復拡大」によって引き起こされる、一連の遺伝性障害を指す。トリヌクレオチド反復はかつて、ゲノム中のありふれた反復(iterations)であると考えられていたが、1990年代にこれらの障害に分類された。これらDNAの一見した「良性の」伸展(stretches)はときに、拡大して疾患を引き起こし得る。数種の決定的な特色が、トリヌクレオチド反復拡大によって引き起こされた障害に共通する。第1に、突然変異反復は、体細胞と生殖細胞系列との両方に不安定さを示し、より頻繁にはこれらは代々の遺伝(successive transmissions)で縮小するよりむしろ拡大する。第2に、低年齢の発病およびこれに続く世代における表現型の増大した重症度(予想)は一般に、より大きな反復の長さと相関する。最後に、疾患アレルの親の起源はしばしば、父系の遺伝がこれら障害の多くにとって拡大のより大きなリスクを抱えるという予想に影響を及ぼし得る。

トリプレット拡大は、DNA複製最中のずれ(slippage)によって引き起こされるものと考えられる。これらの領域におけるDNA配列の反復性に起因して、「ループアウト」構造は、合成されている親鎖と娘鎖との間の相補的な塩基対合を維持しながら、DNA複製最中に形成されることもある。ループアウト構造が娘鎖上の配列から形成された場合、これは反復数の増大をもたらすであろう。しかしながら、ループアウト構造が親鎖上に形成された場合、反復数の減少が生じる。これらの反復の拡大は低減より一般的であるようである。一般に拡大がより大きくなればなるほど、これらは、より疾患を引き起こしやすくなるか、またはより疾患の重症度を増大しやすくなる。この特性は、トリヌクレオチド反復障害に見られる予想の特徴をもたらす。予想は、これら反復の拡大に起因する罹患した家族の代々の世代を通して、発病の年齢が低くなる傾向、および症状の重症度が増す傾向を説明する。

ヌクレオチド反復障害は、トリプレット反復が非コード領域において生じる障害(すなわち、非コードトリヌクレオチド反復障害)またはコード領域において生じる障害を包含していてもよい。

本明細書に記載のプライム編集因子(PE)系は、数ある中でも、脆弱X症候群(FRAXA)、脆弱性XE MR(FRAXE)、フリードライヒ運動失調症(FRDA)、筋強直症ジストロフィー(DM)、8型脊髄小脳失調症(SCA8)、および12型脊髄小脳失調症(SCA12)を包含していてもよい、ヌクレオチド反復障害を処置するのに使用されてもよい。

上流
本明細書に使用されるとき、用語「上流」および「下流」は、5'→3'方向に配向された核酸分子(単鎖または二本鎖であるかに関わらず)中に位置付けられた少なくとも2つの要素の線状の位置を定義する相対的な用語である。とりわけ、第1要素が第2要素に対して5'のどこかに位置付けられている場合、第1要素は、核酸分子中、第2要素の上流にある。例えば、SNPがニック部位の5'側にある場合、SNPは、Cas9に誘導されたニック部位の上流にある。逆に言うと、第1要素が第2要素に対して3'のどこかに位置付けられている場合、第1要素は、核酸分子中、第2要素の下流にある。例えば、SNPがニック部位の3'側にある場合、SNPは、Cas9に誘導されたニック部位の下流にある。核酸分子は、DNA(二本鎖もしくは単鎖)、RNA(二本鎖もしくは単鎖)、またはDNAとRNAとのハイブリッドであり得る。二本鎖分子のどちらの鎖を考慮するのか選択する必要がある場合を除き、上流および下流という用語が核酸分子の単鎖にのみ言及するところ、分析は単鎖核酸分子および二本鎖分子について同じであるしばしば、少なくとも2つの要素の相対的な位置を決定するのに使用され得る二本鎖のDNAの鎖は、「センス」鎖または「コード」鎖である。遺伝学において、「センス」鎖は、5'から3'へ伸びる二本鎖DNA内セグメントであって、3'から5'へ伸びるDNAのアンチセンス鎖または鋳型鎖に相補的である。よって、例として、SNP核酸塩基がセンス鎖またはコード鎖上のプロモーターの3'側にある場合、SNP核酸塩基はゲノムDNA(二本鎖である)中のプロモーター配列の「下流」にある。

バリアント
本明細書に使用されるとき、用語「バリアント」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する属性(qualities)を呈するものを意味するとして解釈されるはずであり、例として、バリアントCas9は、野生型Cas9アミノ酸配列と比較してアミノ酸残基中に1以上の変化を含むCas9である。用語「バリアント」は、参照配列と少なくとも75％、または少なくとも80％、または少なくとも85％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも99％のパーセント同一性を有し、参照配列と同じかまたは実質的に同じ機能活性(単数もしくは複数)を有する、相同のタンパク質を包括する(encompasses)。用語はまた、参照配列の突然変異体、トランケーション体(truncations)、またはドメインであって、参照配列と同じかまたは実質的に同じ機能活性(単数もしくは複数)を呈示するものも包括する。

ベクター
用語「ベクター」は、本明細書に使用されるとき、着目する遺伝子をコードするよう修飾され得る核酸であって、宿主細胞中へ入って宿主細胞内で突然変異または複製する(次いでベクターの複製形態を別の宿主細胞中へ移す)ことができる核酸を指す。例示の好適なベクターは、レトロウイルスベクターまたはバクテリオファージおよび繊維状ファージ、および接合性プラスミドなどの、ウイルスベクターを包含する。追加の好適なベクターは、本開示に基づき当業者に明らかであろう。

野生型
本明細書に使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される専門用語であって、突然変異体もしくはバリアントの形態とは区別されるような、天然に存在するとおりの生物、株、遺伝子、または特徴の典型的な形態を意味する。

5'内生DNAフラップ
本願において用いられる用語「内生5'DNAフラップ」は、標的DNA上のPEによって誘導されるニック部位の直ちに下流に所在するDNAの鎖を言う。PEによる標的DNA鎖のニッキングは、ニック部位の上流側の3'ヒドロキシル基およびニック部位の下流側の5'ヒドロキシル基を暴露する。3'ヒドロキシル基で終わる内生鎖は、プライム編集因子のDNAポリメラーゼをプライムするために用いられる(例えば、DNAポリメラーゼは逆転写酵素である)。ニック部位の下流側のかつ暴露された5'ヒドロキシル基で始まる内生鎖は、「5'内生DNAフラップ」と言われ、究極的には除去され、PEgRNAの伸長によってコードされる新たに合成された置き換え鎖(すなわち、「3'置き換えDNAフラップ」)によって置き換えられる。

5'内生DNAフラップ除去
本明細書に使用されるとき、用語「5'内生DNAフラップ除去」または「5'フラップ除去」は、RTによって合成された単鎖DNAフラップが競合的に侵入して内生DNAとハイブリダイズしたときに形成される5'内生DNAフラップの除去を指し、そのプロセスにおいて内生鎖に取って代わる。取って代わられたこの内生鎖を除去することは、所望のヌクレオチド変化を含む所望の産物を形成する反応を推進し得る。細胞自身のDNA修復酵素は、5'内生フラップの除去または切除を触媒してもよい(例として、EXO1またはFEN1などの、フラップエンドヌクレアーゼ)。また、宿主細胞も、該5'内生フラップの除去を触媒する1以上の酵素を発現するよう形質転換されていてもよく、これによって産物を形成するプロセスが推進される(例として、フラップエンドヌクレアーゼ)。フラップエンドヌクレアーゼは当該技術分野において知られており、Patel et al.,“Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends,”Nucleic Acids Research,2012,40(10):4507-4519およびTsutakawa et al.,“Human flap endonuclease structures,DNA double-base flipping,and a unified understanding of the FEN1 superfamily,”Cell,2011,145(2):198-211(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)に記載のものから見出され得る。

3'置き換えDNAフラップ
本明細書に使用されるとき、用語「3'置き換えDNAフラップ」、または単に「置き換えDNAフラップ」は、プライム編集因子によって合成され、プライム編集因子PEgRNAの伸長アームによってコードされるDNAの鎖を指す。より具体的には、3'置き換えDNAフラップは、PEgRNAのポリメラーゼ鋳型によってコードされる。3'置き換えDNAフラップは、編集済配列(例として、単一ヌクレオチドの変化)も含有することを除くと、5'内生DNAフラップと同じ配列を含む。3'置き換えDNAフラップは標的DNAとアニールして、5'内生DNAフラップ(これは、例えば、FEN1もしくはEXO1などの5'フラップエンドヌクレアーゼによって、切除され得る)に取って代わるかまたはこれを置き換え、次いで、3'置き換えDNAフラップの3'末を、内生DNAの晒された(5'内生DNAフラップの切除後に晒される)5'ヒドロキシル末と結び合わせるようにライゲートされ、これによってホスホジエステル結合が再形成されて3'置き換えDNAフラップが組み入れられ、1編集済鎖と1未編集鎖とを含有するヘテロ二重鎖DNAが形成される。DNA修復プロセスはヘテロ二重鎖を分解し、編集済鎖の情報を相補鎖へコピーすることによってDNA中へ編集が永続的に組み入れられる。この分解プロセスは、完了まで(to completion)、未編集鎖へニックを入れることによって、すなわち、本明細書に記載のとおりの「第2鎖へのニック入れ」を経由して、さらに推進され得る。

ある態様の詳細な記載
ゲノム編集のための、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復(CRISPR)系の採用は、生命科学に革命をもたらした^1～3。CRISPRを使用する遺伝子の断絶は今やルーチンとなっているが、単一ヌクレオチドの編集の正確な組み入れは、疾患が原因の多数の突然変異を研究または修正するのに必要であるにも関わらず、大きな課題のままである。相同組み換え修復(HDR)は、かかる編集を達成させることは可能ではあるが、低い効率(しばしば＜5％)、ドナーDNA修復鋳型のための要件、および二本鎖DNA破壊(DSB)形成の有害効果に悩まされている。近年、David Liu教授らの実験室が塩基編集を開発したが、これによってDSBのない効率的な単一ヌクレオチドの編集が達成される。塩基編集因子(BE)は、CRISPR系を塩基修飾デアミナーゼ酵素と組み合わせて、標的C・GまたはA・T塩基対を夫々A・TまたはG・Cへ変換する^4～6。既に幅広く研究者らによって世界的に使用されているが、現BEは12塩基対の起こり得る変換のうちたった4つしかできず、小さい挿入または欠失を修正することはできない。その上、塩基編集の標的範囲は、標的塩基に隣接する非標的CまたはA塩基の編集(「バイスタンダー(bystander)編集」)によって、およびPAM配列が標的塩基から15±2bpに存在するという要件によって限定されている。したがって、これらの欠点を克服することは、ゲノム編集の基礎研究および治療用途を大幅に広げるであろう。

本開示は、塩基編集の利益の多く－つまり、二本鎖破壊の回避およびドナーDNA修復鋳型－を、その大きな欠点を克服しつつ与える、新しい高精度編集アプローチを提案する。本明細書に記載の提案アプローチは、標的にプライムされた逆転写(TPRT)を使用する標的ゲノムの部位での編集済DNA鎖の直接的な組み入れを達成する。本明細書に考察されるデザインにおいて、CRISPRガイドRNA(gRNA)は、所望のヌクレオチド変化を含む単鎖DNAをコードする逆転写酵素(RT)鋳型配列を持つよう改変されるであろう。CRISPRヌクレアーゼ(Cas9)によってニックが入れられた標的部位DNAは、修飾gRNA上の鋳型配列の逆転写のためのプライマーとして働き、いずれの所望のヌクレオチド編集の直接的な組み込みを可能にするであろう。

結果的に、本発明は、標的にプライムされた逆転写(TPRT)または「プライム編集」の機序が、効率および遺伝子の融通性(genetic flexibility)が高い高精度CRISPR/Casベースのゲノム編集を(例として、図1A～1Fの様々な態様において描かれているとおり)行うために活用または採用され得るという発見に、一部関する。本発明者らは本明細書中、特定のDNA配列を修飾ガイドRNA(「伸長されたガイドRNA」)で標的にし、標的部位にて単鎖ニックを生成し、および伸長されたgRNA中へ取り入れられた改変逆転写酵素鋳型のためのプライマーとして、ニック入りDNAを使用する、Cas9タンパク質-逆転写酵素融合体を使用することを提案している。新しく合成された鎖は、所望のヌクレオチド変化(例として、単一ヌクレオチドの変化、欠失、もしくは挿入、またはそれらの組み合わせ)を包含することを除けば、ゲノムの標的配列と相同であろう。新しく合成されたDNAの鎖はまた、単鎖DNAフラップと称されることもあるが、これはハイブリダイゼーションを相補的な相同の内生DNA鎖と競合し、これによって対応する内生鎖に取って代わる。ハイブリダイズされたこの中間体の分解は、その結果得られる内生DNAの、取って代わられたフラップの(例として、5'末DNAフラップエンドヌクレアーゼ、FEN1での)除去、合成された単鎖DNAフラップの標的DNAへのライゲーション、ならびに細胞のDNA修復および/または複製プロセスの結果としての所望のヌクレオチド変化の同化を包含し得る。鋳型化(templated)DNA合成が単一ヌクレオチドという高精度を付与することから、このアプローチの幅は極めて広く、基礎科学および治療法における無数の用途に使用され得ることが予見できる。

[1]napDNAbp
本明細書に記載のプライム編集因子およびトランスプライム編集因子は、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)を含み得る。

一側面において、napDNAbpは少なくとも1つのガイド核酸(例えば、ガイドRNAまたはPEgRNA)と会合または複合体化させられ得る。これが、ガイド核酸またはその部分(例えば、DNA標的のプロトスペーサーにアニールするガイドRNAのスペーサー)に対して相補的であるDNA鎖(すなわち標的鎖)を含むDNA配列に、napDNAbpを局在させる。換言すると、ガイド核酸は、DNA上のプロトスペーサーの相補配列に局在および結合するようにnapDNAbp(例えば、Cas9または等価物)を「プログラム」する。

いずれかの好適なnapDNAbpが本明細書に記載のプライム編集因子に用いられ得る。種々の態様において、napDNAbpはいずれかのクラス2 CRISPR-Casシステムであり得、いずれかのII型、V型、またはVI型CRISPR-Cas酵素を包含する。ゲノム編集のためのツールとしてのCRISPR-Casの急速な発達から、Cas9およびCas9オーソログなどのCRISPR-Cas酵素を記載および/または同定するために用いられる命名体系の一定した発達があった。本願は、古いおよび/または新たであり得る命名体系によってCRISPR-Cas酵素を参照する。当業者は、それが古い(すなわち「レガシー」)または新たな命名体系であるかどうかにかかわらず、用いられる命名体系に基づいて、本願において参照されている特定のCRISPR-Cas酵素を同定する能力があるであろう。CRISPR-Cas命名体系はMakarova et al., “Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?,” The CRISPR Journal, Vol. 1. No. 5, 2018に鋭意に記載されている。これの内容全体は参照によって本願に組み込まれる。本願のいずれかの所与の場合に用いられる具体的なCRISPR-Cas命名体系は決して限定せず、当業者はどのCRISPR-Cas酵素が参照されているのかを同定する能力があるであろう。

例えば、次のII型、V型、およびVI型クラス2 CRISPR-Cas酵素は、次の当該技術分野で認識される古い(すなわちレガシー)および新たな名称を有する。これらの酵素および/またはそれらのバリアントの夫々は、本明細書に記載のプライム編集因子に用いられ得る:

理論によって拘束されることなしに、本願において企図されるある種のnapDNAbpの作用機序は、Rループを形成するステップを包含する。これによって、napDNAbpは二本鎖DNA標的のほどけを誘導し、それによってnapDNAbpによって結合された領域の鎖を分離する。それから、ガイドRNAスペーサーがプロトスペーサー配列において「標的鎖」にハイブリダイズする。これは標的鎖に対して相補的である「非標的鎖」を押し除け、これはRループの一本鎖領域を形成する。いくつかの態様では、napDNAbpは1つ以上のヌクレアーゼ活性を包含し、これはそれからDNAをカットし、種々の型の傷跡を残す。例えば、napDNAbpは、第1の位置付けにおける非標的鎖をカットおよび/または第2の位置付けにおける標的鎖をカットするヌクレアーゼ活性を含み得る。ヌクレアーゼ活性に依存して、標的DNAは「二本鎖切断」を形成するようにカットされ得、これによって両方の鎖がカットされる。他の態様において、標的DNAは単一の部位でのみカットされ得る。すなわち、DNAは1つの鎖を「ニッキング」される。異なるヌクレアーゼ活性を有する例示のnapDNAbpは、「Cas9ニッカーゼ」(「nCas9」)およびヌクレアーゼ活性を有さない失活Cas9(「不活性型Cas9」または「dCas9」)を包含する。

本開示のプライム編集因子に関して用いられ得る種々のnapDNAbpの下の記載は、決して限定することを意味されない。プライム編集因子は、公知であるかまたは指向性進化もしくは別様の変異プロセスによって作られ得るかもしくは進化させられ得る標準的なSpCas9またはいずれかのオーソログCas9タンパク質またはいずれかのバリアントCas9タンパク質を含み得、Cas9のいずれかの天然に存在するバリアント、変異体、または別様に操作されたバージョンを包含する。種々の態様において、Cas9またはCas9バリアントはニッカーゼ活性を有し、すなわち標的DNA配列の1つの(of)鎖のみを切断する。他の態様において、Cas9またはCas9バリアントは不活性なヌクレアーゼを有し、すなわち「不活性型」Cas9タンパク質である。用いられ得る他のバリアントCas9タンパク質は、(例えば、より容易な送達のために)標準的なSpCas9よりも小さい分子量を有するかまたは改変もしくは再配置された一次アミノ酸構造(例えば循環置換体フォーマット)を有するものである。

本明細書に記載のプライム編集因子はCas9等価物をもまた含み得、収斂進化の結果であるCas12a(Cpf1)およびCas12b1タンパク質を包含する。本願において用いられるnapDNAbp(例えば、SpCas9、Cas9バリアント、またはCas9等価物)は、それらのPAM特異性を変改/増強する種々の改変をもまた含有し得る。最後に、本願は、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.9％配列同一性を参照Cas9配列、例えば参照SpCas9標準的な配列または参照Cas9等価物(例えばCas12a(Cpf1))に対して有するいずれかのCas9、Cas9バリアント、またはCas9等価物を企図する。

napDNAbpはCRISPR(クラスター化規則的間隔短回文反復)関連ヌクレアーゼであり得る。上で概説されているとおり、CRISPRは、可動遺伝因子(ウイルス、転移因子、および接合伝達性プラスミド)からの防護を提供する適応免疫系である。CRISPRクラスターは、スペーサー、祖先可動エレメントに対して相補的な配列、および標的侵入核酸を含有する。CRISPRクラスターはCRISPR RNA(crRNA)へと転写およびプロセシングされる。II型CRISPRシステムでは、プレcrRNAの正しいプロセシングは、トランスにコードされる低分子RNA(tracrRNA)、内生リボヌクレアーゼ3(rnc)、およびCas9タンパク質を要求する。tracrRNAは、プレcrRNAのリボヌクレアーゼ3によって支援されるプロセシングのためのガイドとしての用をなす。爾後に、Cas9/crRNA/tracrRNAは、スペーサーに対して相補的な直線状または環状dsDNA標的をエンド的に切断する。crRNAに対して相補的でない標的鎖は第1にエンド的にカットされ、それから3'-5'エキソ的にトリミングされる。天然では、DNA結合および切断は典型的にはタンパク質および両方のRNAを要求する。しかしながら、シングルガイドRNA(「sgRNA」または単純に「gRNA」)が、crRNAおよびtracrRNA両方の側面を単一のRNA種上に組み込むようにして操作され得る。例として、Jinek M. et al., Science 337:816-821(2012)を参照(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)。

いくつかの態様では、napDNAbpは、例えば標的配列上においておよび/または標的配列の相補体上において、標的配列の位置付けにおける1つまたは両方の鎖の切断を導く。いくつかの態様では、napDNAbpは、標的配列の最初のまたは最後のヌクレオチドから約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500、またはより多くの塩基対以内において、1つまたは両方の鎖の切断を導く。いくつかの態様では、ベクターは、変異したnapDNAbpが標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの1つまたは両方の鎖を切断する能力を欠くようにして対応する野生型酵素に対して変異しているnapDNAbpをコードする。例えば、S.pyogenesからのCas9のRuvC I触媒ドメイン上のアスパラギン酸からアラニンの置換(D10A)は、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ(一本鎖を切断する)へとCas9を変換する。Cas9をニッカーゼにする変異の他の例は、限定なしに、標準的なSpCas9配列をまたは他のCas9バリアントもしくはCas9等価物の同等のアミノ酸位置を参照して、H840A、N854A、およびN863Aを包含する。

本願において用いられる用語「Casタンパク質」は、天然から得られる全長Casタンパク質、天然に存在するCasタンパク質とは異なる配列を有する組み換えCasタンパク質、または本開示の方法に必要とされる全てもしくは有意な量の不可欠の基本機能、すなわち(i)標的DNAに対するCasタンパク質の核酸プログラム型結合の所有および(ii)1つの鎖上で標的DNA配列へニックを入れる能力をそれでもなお保持するCasタンパク質のいずれかのフラグメントを言う。本願において企図されるCasタンパク質は、CRISPR Cas9タンパク質、およびCas9等価物、バリアント(例えば、Cas9ニッカーゼ(nCas9)またはヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9))ホモログ、オーソログ、またはパラログを、天然に存在するかまたは天然に存在しないか(例えば、操作されたかまたは組み換えか)にかかわらず包摂し、いずれかのクラス2 CRISPRシステム(例えばII、V、VI型)からのCas9等価物を包含し得、Cas12a(Cpf1)、Cas12e(CasX)、Cas12b1(C2c1)、Cas12b2、Cas12c(C2c3)、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9 Cas13a(C2c2)、Cas13d、Cas13c(C2c7)、Cas13b(C2c6)、およびCas13bを包含する。さらなるCas等価物はMakarova et al.,“C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector,”Science 2016;353(6299)およびMakarova et al.,“Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems:Where from Here?,”The CRISPR Journal,Vol.1.No.5,2018に記載されている。これらの内容は参照によって本願に組み込まれる。

用語「Cas9」または「Cas9ヌクレアーゼ」または「Cas9部分」または「Cas9ドメイン」は、いずれかの生物からのいずれかの天然に存在するCas9、いずれかの天然に存在するCas9等価物またはその機能的フラグメント、いずれかの生物からのいずれかのCas9ホモログ、オーソログ、またはパラログ、および天然に存在するかまたは操作されたCas9のいずれかの変異体またはバリアントを包摂する。用語Cas9は特に限定することを意味されず、「Cas9または等価物」と言われ得る。例示のCas9タンパク質はさらに本願に記載および/または当該技術分野において記載されており、参照によって本願に組み込まれる。本開示は、本発明のプライム編集因子(PE)に使用される具体的なCas9について限定されない。

本願に記されるCas9ヌクレアーゼ配列および構造は当業者には周知である(例として、“Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.”Ferretti et al.,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001);“CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.”Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);および“A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.”Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)(これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)を参照)。

Cas9およびCas9等価物の例が次のとおり提供される;しかしながら、これらの特定の例は限定することを意味されない。本開示のプライマー編集因子は、いずれかの好適なCas9またはCas9等価物を包含するいずれかの好適なnapDNAbpを用い得る。

A．標準的な野生型SpCas9
1つの態様では、本明細書に記載のプライマー編集因子構築物は、S.pyogenesからの「標準的なSpCas9」ヌクレアーゼを含み得る。これはゲノム工学のツールとして広く用いられており、クラス2 CRISPR-Casシステムの酵素のII型サブグループとして類別される。このCas9タンパク質は、2つの別物のヌクレアーゼドメインを含有する大きいマルチドメインタンパク質である。1つのまたは両方のヌクレアーゼ活性を廃止するための点変異がCas9上に導入され得、夫々ニッカーゼCas9(nCas9)または不活性型Cas9(dCas9)をもたらす。これは、sgRNAによってプログラムされる様式でDNAに結合するその能力をなお保持する。原理的には、別のタンパク質またはドメインに融合されるときに、Cas9またはそのバリアント(例えばnCas9)は、単純に適当なsgRNAとの共発現によって、そのタンパク質を実質的にいずれかのDNA配列へと標的化し得る。本願において用いられる標準的なSpCas9タンパク質は、次のアミノ酸配列を有するStreptococcus pyogenesからの野生型タンパク質を言う:

本明細書に記載のプライム編集因子は、標準的なSpCas9、または上で提供されている野生型Cas9配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％配列同一性を有するそのいずれかのバリアントを包含し得る。これらのバリアントは、1つ以上の変異を含有するSpCas9バリアントを包含し得、SwissProtアクセッションNo.Q99ZW2(配列番号18)エントリーで報告されているいずれかの公知の変異を包含する。これらは:

を包含する。

本開示に用いられ得る他の野生型SpCas9配列は:

を包含する。

本明細書に記載のプライム編集因子は、上のSpCas9配列のいずれか、または少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％配列同一性をそれに対して有するそのいずれかのバリアントを包含し得る。

B．野生型Cas9オーソログ
他の態様において、Cas9タンパク質は、S.pyogenesからの標準的なCas9とは異なる別の細菌種からの野生型Cas9オーソログであり得る。例えば、次のCas9オーソログが本明細書に記載されるプライム編集因子構築物に関して用いられ得る。加えて、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％配列同一性を下のオーソログのいずれかに対して有するいずれかのバリアントCas9オーソログもまた本プライム編集因子に用いられ得る。

本明細書に記載のプライム編集因子は、上のCas9オーソログ配列のいずれか、または少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％配列同一性をそれに対して有するそのいずれかのバリアントを包含し得る。

napDNAbpは、Cas9などの天然に存在する酵素の(or)いずれかの好適なホモログおよび/またはオーソログを包含し得る。Cas9ホモログおよび/またはオーソログはS.pyogenesおよびS.thermophilusを包含するがこれらに限定されない種々の種において記載されている。好ましくは、Cas部分はニッカーゼとして構成される(例えば、変異導入されるか、組み換え操作されるか、または別様に天然から得られる)。すなわち、標的の一本鎖のみを切断することができる。追加の(doubpdditional)好適なCas9ヌクレアーゼおよび配列は本開示に基づいて当業者には明らかであろう。かかるCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski,Rhun,and Charpentier,“The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems”(2013)RNA Biology 10:5,726-737に開示されている生物および座位からのCas9配列を包含する;これの内容全体は参照によって本願に組み込まれる。いくつかの態様では、Cas9ヌクレアーゼは不活性な(例えば不活性化された)DNA切断ドメインを有する。つまり、Cas9はニッカーゼである。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表3のバリアントのいずれか1つによって提供されるCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、上の表のCas9オーソログのいずれか1つによって提供されるCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一であるアミノ酸配列を含む。

C．不活性型Cas9バリアント
ある態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は、不活性型Cas9、例えば不活性型SpCas9を包含し得る。これは、Cas9の両方のヌクレアーゼドメイン、つまりRuvCドメイン(これは、非プロトスペーサーDNA鎖を切断する)およびHNHドメイン(これはプロトスペーサーDNA鎖を切断する)を不活性化する1つ以上の変異を原因として、ヌクレアーゼ活性を有さない。ヌクレアーゼ不活性化は、コードされるタンパク質、または少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％配列同一性をそれに対して有するそのいずれかのバリアントのアミノ酸配列に1つ以上の置換および/または欠失をもたらす1つ以上の変異を原因とし得る。

本願において用いられる用語「dCas9」は、ヌクレアーゼ不活性(inactive)Cas9もしくはヌクレアーゼ不活性型(dead)Cas9またはその機能的フラグメントを言い、いずれかの生物からのいずれかの天然に存在するdCas9、いずれかの天然に存在するdCas9等価物またはその機能的フラグメント、いずれかの生物からのいずれかのdCas9ホモログ、オーソログ、またはパラログ、および天然に存在するかまたは操作されたdCas9のいずれかの変異体またはバリアントを包摂する。用語dCas9は特に限定することを意味されず、「dCas9または等価物」と言われ得る。例示のdCas9タンパク質とdCas9タンパク質を作るための方法とは、さらに本願に記載および/または当該技術分野において記載されており、参照によって本願に組み込まれる。

他の態様において、dCas9は、部分的にまたは丸ごとで、Cas9ヌクレアーゼ活性を不活性化する1つ以上の変異を有するCas9アミノ酸配列に対応するかまたはそれを含む。他の態様において、D10AおよびH840A以外の変異を有するCas9バリアントが提供され、これらは内生Cas9ヌクレアーゼ活性の完全なまたは部分的な不活性化物をもたらし得る(例えば、夫々nCas9またはdCas9)。かかる変異は、例として、D10およびH820における他のアミノ酸置換、またはCas9のヌクレアーゼドメイン上の他の置換(例えば、HNHヌクレアーゼサブドメインおよび/またはRuvC1サブドメイン上の置換)を、Streptococcus pyogenesからのCas9(NCBI参照配列:NC_017053.1)などの野生型配列を参照して包含する。いくつかの態様では、Cas9のバリアントまたはホモログ(例えば、Streptococcus pyogenesからのCas9(NCBI参照配列:NC_017053.1(配列番号20))のバリアント)が提供され、これらは、NCBI参照配列:NC_017053.1と少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、または少なくとも約99.9％同一である。いくつかの態様では、dCas9のバリアント(例えば、NCBI参照配列:NC_017053.1(配列番号20)のバリアント)が提供され、NC_017053.1(配列番号20)よりも約5アミノ酸、約10アミノ酸、約15アミノ酸、約20アミノ酸、約25アミノ酸、約30アミノ酸、約40アミノ酸、約50アミノ酸、約75アミノ酸、約100アミノ酸、またはより多くだけ短いかまたは長いアミノ酸配列を有する。

1つの態様では、不活性型Cas9はQ99ZW2の標準的なSpCas9配列に基づき得、D10XおよびH810X置換(下線付きかつ太字)を含む次の配列を有し得、Xはいずれかのアミノ酸であり得、またはバリアントは少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％配列同一性をそれに対して有する配列番号40のバリアントであり得る。

1つの態様では、不活性型Cas9はQ99ZW2の標準的なSpCas9配列に基づき得、D10AおよびH810A置換(下線付きかつ太字)を含む次の配列を有し得、または少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％配列同一性をそれに対して有する配列番号41のバリアントであり得る。

D．Cas9ニッカーゼバリアント
1つの態様において、本明細書に記載のプライム編集因子はCas9ニッカーゼを含む。用語「Cas9ニッカーゼ」または「nCas9」は、二本鎖DNA分子標的上に一本鎖切断を導入することができるCas9のバリアントを言う。いくつかの態様では、Cas9ニッカーゼは単一の機能するヌクレアーゼドメインのみを含む。野生型Cas9(例えば標準的なSpCas9)は、2つの別個のヌクレアーゼドメイン、つまりRuvCドメイン(これは非プロトスペーサーDNA鎖を切断する)およびHNHドメイン(これはプロトスペーサーDNA鎖を切断する)を含む。1つの態様では、Cas9ニッカーゼはRuvCヌクレアーゼ活性を不活性化するRuvCドメインの変異を含む。例えば、アスパラギン酸(D)10、ヒスチジン(H)983、アスパラギン酸(D)986、またはグルタミン酸(E)762の変異は、RuvCヌクレアーゼドメインの機能喪失変異および機能的なCas9ニッカーゼの生出として報告されている(例えば、Nishimasu et al., “Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA,”Cell 156(5),935-949。これは参照によって本願に組み込まれる)。それゆえに、RuvCドメインのニッカーゼ変異はD10X、H983X、D986X、またはE762Xを包含し得、Xは野生型アミノ酸以外のいずれかのアミノ酸である。ある態様において、ニッカーゼはD10A、もしくは(of)H983A、もしくはD986A、もしくはE762A、またはそれらの組み合わせであり得る。

種々の態様において、Cas9ニッカーゼはRuvCヌクレアーゼドメインに変異を有し得(can having)、次のアミノ酸配列の1つ、または少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％配列同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を有するそのバリアントを有し得る。

別の態様では、Cas9ニッカーゼはHNHヌクレアーゼ活性を不活性化するHNHドメインの変異を含む。例えば、ヒスチジン(H)840またはアスパラギン(R)863の変異は、HNHヌクレアーゼドメインの機能喪失変異および機能的なCas9ニッカーゼの生出として報告されている(例えば、Nishimasu et al.,“Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA,”Cell 156(5),935-949。これは参照によって本願に組み込まれる)。それゆえに、HNHドメインのニッカーゼ変異はH840XおよびR863Xを包含し得、Xは野生型アミノ酸以外のいずれかのアミノ酸である。ある態様において、ニッカーゼはH840AもしくはR863Aまたはそれらの組み合わせであり得る。

種々の態様において、Cas9ニッカーゼはHNHヌクレアーゼドメインの変異を有し得、次のアミノ酸配列の1つ、または少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％配列同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を有するそのバリアントを有し得る。

いくつかの態様では、N末端メチオニンが、Cas9ニッカーゼから、または本願において開示もしくは企図されるいずれかのCas9バリアント、オーソログ、もしくは等価物から除去される。例えば、メチオニンマイナスCas9ニッカーゼは、次の配列、または少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％配列同一性をそれらに対して有するアミノ酸配列を有するそれらのバリアントを包含する。

E．他のCas9バリアント
不活性型Cas9およびCas9ニッカーゼバリアントの他に、本願において用いられるCas9タンパク質は、本明細書に開示のかまたは当該技術分野において公知のいずれかの野生型Cas9または変異体Cas9(例えば、不活性型Cas9またはCas9ニッカーゼ)、またはフラグメントCas9、または循環置換体Cas9、またはCas9の他のバリアントを包含するいずれかの参照Cas9タンパク質と少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、または少なくとも約99.9％同一である他の「Cas9バリアント」をもまた包含し得る。いくつかの態様では、Cas9バリアントは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはより多くのアミノ酸変化を、参照Cas9と比較して有し得る。いくつかの態様では、Cas9バリアントは参照Cas9のフラグメント(例えば、gRNA結合ドメインまたはDNA切断ドメイン)を含み、その結果、フラグメントは、野生型Cas9の対応するフラグメントと少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、または少なくとも約99.9％同一である。いくつかの態様では、フラグメントは(is is)、対応する野生型Cas9(例えば配列番号18)のアミノ酸長さの少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％である。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示のいずれかのCas9タンパク質のフラグメントであるそれらの機能性を保持するCas9フラグメントをもまた利用し得る。いくつかの態様では、Cas9フラグメントは長さが少なくとも100アミノ酸である。いくつかの態様では、フラグメントは長さが少なくとも100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、または少なくとも1300アミノ酸である。

種々の態様において、本明細書に開示のプライム編集因子は、次のとおり記載されるCas9バリアントの1つ、またはいずれかの参照Cas9バリアントと少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、もしくは少なくとも約99.9％同一であるそのCas9バリアントを含み得る。

F．小さいサイズのCas9バリアント
いくつかの態様では、本願において企図されるプライム編集因子は、標準的なSpCas9配列よりも小さい分子量であるCas9タンパク質を包含する。いくつかの態様では、より小さいサイズのCas9バリアントは、例えば発現ベクター、ナノ粒子、または送達の他の手段による細胞への送達を容易化し得る。ある態様において、より小さいサイズのCas9バリアントは、クラス2 CRISPR-CasシステムのII型酵素として類別される酵素を包含し得る。いくつかの態様では、より小さいサイズのCas9バリアントは、クラス2 CRISPR-CasシステムのV型酵素として類別される酵素を包含し得る。他の態様において、より小さいサイズのCas9バリアントは、クラス2 CRISPR-CasシステムのVI型酵素として類別される酵素を包含し得る。

標準的なSpCas9タンパク質は長さが1368アミノ酸であり、158キロダルトンの予測される分子量を有する。本願において用いられる用語「小さいサイズのCas9バリアント」は、少なくとも1300アミノ酸未満、または少なくとも1290アミノ酸未満、または1280アミノ酸未満、または1270アミノ酸未満、または1260アミノ酸未満、または1250アミノ酸未満、または1240アミノ酸未満、または1230アミノ酸未満、または1220アミノ酸未満、または1210アミノ酸未満、または1200アミノ酸未満、または1190アミノ酸未満、または1180アミノ酸未満、または1170アミノ酸未満、または1160アミノ酸未満、または1150アミノ酸未満、または1140アミノ酸未満、または1130アミノ酸未満、または1120アミノ酸未満、または1110アミノ酸未満、または1100アミノ酸未満、または1050アミノ酸未満、または1000アミノ酸未満、または950アミノ酸未満、または900アミノ酸未満、または850アミノ酸未満、または800アミノ酸未満、または750アミノ酸未満、または700アミノ酸未満、または650アミノ酸未満、または600アミノ酸未満、または550アミノ酸未満、または500アミノ酸未満だが、少なくとも約400アミノ酸よりも大きく、かつCas9タンパク質の要求される機能を保持している天然に存在する、操作された、または別様のいずれかのCas9バリアントを言う。Cas9バリアントは、クラス2 CRISPR-CasシステムのII型、V型、またはVI型酵素として類別されるものを包含し得る。

種々の態様において、本明細書に開示のプライム編集因子は、次のとおり記載される小さいサイズのCas9バリアントの1つ、またはいずれかの参照の小さいサイズのCas9タンパク質と少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、もしくは少なくとも約99.9％同一である(having)そのCas9バリアントを含み得る。

G．Cas9等価物
いくつかの態様では、本明細書に記載のプライム編集因子はいずれかのCas9等価物を包含し得る。本願において用いられる用語「Cas9等価物」は、幅広い用語であり、これは、そのアミノ酸一次配列および/またはその三次元構造が異なり得るおよび/または進化的立場からは無関係であり得るにもかかわらず、本プライム編集因子においてCas9と同じ機能を供するいずれかのnapDNAbpタンパク質を包摂する。それゆえに、Cas9等価物は進化的に関係する本願に記載または包摂されるいずれかのCas9オーソログ、ホモログ、変異体、またはバリアントを包含するが、Cas9等価物は、Cas9と同じかまたは類似の機能を有するように収斂進化プロセスによって進化してあり得るが、アミノ酸配列および/または三次元構造についていずれかの類似性を必ずしも有さないタンパク質をもまた包摂する。Cas9等価物が収斂進化によって発生したタンパク質に基づき得るにもかかわらず、ここで記載されるプライム編集因子は、Cas9と同じかまたは類似の機能を提供するであろういずれかのCas9等価物を包摂する。例えば、Cas9がCRISPR-CasシステムのII型酵素を言う場合には、Cas9等価物はCRISPR-CasシステムのV型またはVI型酵素を言い得る。

例えば、Cas12e(CasX)は、報告によるとCas9と同じ機能を有するが、収斂進化によって進化したCas9等価物である。それゆえに、Liu et al.,“CasX enzymes comprises a distinct family of RNA-guided genome editors,”Nature,2019,Vol.566:218-223に記載されているCas12e(CasX)タンパク質は、本明細書に記載のプライム編集因子に用いられることを企図される。加えて、Cas12e(CasX)のいずれかのバリアントまたは改変が想像され、本開示の範囲内である。

Cas9は広い種々の種において進化した細菌酵素である。しかしながら、本願において企図されるCas9等価物は古細菌からもまた得られ得る。これらは細菌とは異なる単細胞原核微生物のドメインおよび界を構成する。

いくつかの態様では、Cas9等価物はCas12e(CasX)またはCas12d(CasY)を言い得る。これらは例えばBurstein et al.,“New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes.”Cell Res.2017 Feb 21.doi:10.1038/cr.2017.21に記載されている。これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。ゲノム分解能メタゲノミクスを用いて、生命の古細菌ドメインにおける最初に報告されたCas9を包含するいくつものCRISPR-Casシステムが同定された。この分岐したCas9タンパク質は、わずかにしか研究されていないナノ古細菌から活性なCRISPR-Casシステムの一部として見出された。細菌では、2つの先には未知のシステムCRISPR-Cas12eおよびCRISPR-Cas12dが発見された。これらはこれまでに発見された最もコンパクトなシステムのうちである。いくつかの態様では、Cas9はCas12eまたはCas12eのバリアントを言う。いくつかの態様では、Cas9はCas12dまたはCas12dのバリアントを言う。他のRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質が核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)として用いられ得、本開示の範囲内であるということは了解されるはずである。Liu et al.,“CasX enzymes comprises a distinct family of RNA-guided genome editors,”Nature,2019,Vol.566:218-223をもまた見よ。これらのCas9等価物のいずれかが企図される。

いくつかの態様では、Cas9等価物は、天然に存在するCas12e(CasX)またはCas12d(CasY)タンパク質と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、napDNAbpは天然に存在するCas12e(CasX)またはCas12d(CasY)タンパク質である。いくつかの態様では、napDNAbpは、本願において提供される野生型Cas部分またはいずれかのCas部分と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一であるアミノ酸配列を含む。

種々の態様において、核酸プログラム型DNA結合タンパク質は、限定なしに、Cas9(例えば、dCas9およびnCas9)、Cas12e(CasX)、Cas12d(CasY)、Cas12a(Cpf1)、Cas12b1(C2c1)、Cas13a(C2c2)、Cas12c(C2c3)、アルゴノート、およびCas12b1を包含する。Cas9とは異なるPAM特異性を有する核酸プログラム型DNA結合タンパク質の1つの例は、PrevotellaおよびFrancisellaからのクラスター化規則的間隔短回文反復1である(すなわちCas12a(Cpf1))。Cas9と類似に、Cas12a(Cpf1)もまたクラス2 CRISPRエフェクターであるが、それはII型サブグループよりもむしろ酵素のV型サブグループである。Cas12a(Cpf1)はCas9とは別物の特色を有するロバストなDNA干渉を媒介するということが示されている。Cas12a(Cpf1)は、tracrRNAを欠く単一のRNAによってガイドされるエンドヌクレアーゼであり、それは、Tリッチなプロトスペーサー隣接モチーフ(TTN、TTTN、またはYTN)を利用する。その上、Cpf1は互い違いのDNA二本鎖切断によってDNAを切断する。16のCpf1ファミリータンパク質のうち、AcidaminococcusおよびLachnospiraceaeからの2つの酵素はヒト細胞における効率的なゲノム編集活性を有することが示される。Cpf1タンパク質は当該技術分野で知られており、先に記載されている。例えばYamano et al.,“Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA.”Cell(165)2016,p.949-962;これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。

なお他の態様において、Casタンパク質はいずれかのCRISPR関連タンパク質を包含し得、Cas12a、Cas12b1、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1およびCsx12としてもまた公知)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、それらのホモログ、またはそれらの改変されたバージョンを包含するが、これらに限定されず、好ましくはニッカーゼ変異を含む(例えば、配列番号18の野生型Cas9ポリペプチドのD10A変異に対応する変異)。

種々の他の態様において、napDNAbpは次のタンパク質のいずれかであり得る:Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12e(CasX)、Cas12d(CasY)、Cas12b1(C2c1)、Cas13a(C2c2)、Cas12c(C2c3)、GeoCas9、CjCas9、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cas14、Csn2、xCas9、SpCas9-NG、循環置換Cas9、もしくはアルゴノート(Ago)ドメイン、またはそのバリアント。

例示のCas9等価物タンパク質配列は次を包含し得る:

本明細書に記載のプライム編集因子は、ガイドヌクレオチド配列によってプログラム可能なDNA結合タンパク質ドメインとして用いられ得るCas12a(Cpf1)(dCpf1)バリアントをもまた含み得る。Cas12a(Cpf1)タンパク質は、Cas9のRuvCドメインに類似であるRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを有するが、HNHエンドヌクレアーゼドメインは有さず、Cas12a(Cpf1)のN末端はCas9のアルファヘリックス系の認識ローブを有さない。Zetsche et al.,Cell,163,759-771,2015(これは参照によって本願に組み込まれる)においては、Cas12a(Cpf1)のRuvC様ドメインは両方のDNA鎖を切断することを担い、RuvC様ドメインの不活性化がCas12a(Cpf1)ヌクレアーゼ活性を不活性化するということが示された。

いくつかの態様では、napDNAbpは微生物CRISPR-Casシステムの単一のエフェクターである。微生物CRISPR-Casシステムの単一のエフェクターは、限定なしに、Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b1(C2c1)、Cas13a(C2c2)、およびCas12c(C2c3)を包含する。典型的には、微生物CRISPR-Casシステムはクラス1およびクラス2システムに分けられる。クラス1システムはマルチサブユニットエフェクター複合体を有するが、クラス2システムは単一のタンパク質エフェクターを有する。例えば、Cas9およびCas12a(Cpf1)はクラス2エフェクターである。Cas9およびCas12a(Cpf1)に加えて、3つの別物のクラス2 CRISPR-Casシステム(Cas12b1、Cas13a、およびCas12c)がShmakov et al.,“Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems”,Mol.Cell,2015 Nov 5;60(3):385-397によって記載されている。これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。

システムの2つCas12b1およびCas12cのエフェクターは、Cas12aに関係するRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを含有する。第3のシステムのCas13aは、2つの予測される(predicated)HEPN RNaseドメインを有するエフェクターを含有する。Cas12b1によるCRISPR RNAの生産とは違って、成熟CRISPR RNAの生産はtracrRNA非依存的である。Cas12b1はDNA切断についてはCRISPR RNAおよびtracrRNA両方に依存する。細菌Cas13aは、そのRNAによって活性化される一本鎖RNA分解活性とは別物のCRISPR RNA成熟のための固有のRNase活性を所有することが示されている。これらのRNase機能は、互いとは、およびCas12aのCRISPR RNAプロセシング挙動とは異なる。例えば、East-Seletsky,et al.,“Two distinct RNase activities of CRISPR-Cas13a enable guide-RNA processing and RNA detection”,Nature,2016 Oct 13;538(7624):270-273を見よ。これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。Leptotrichia shahiiのCas13aのin vitroの生化学分析は、Cas13aが単一のCRISPR RNAによってガイドされ、相補的なプロトスペーサーを持つssRNA標的を切断するようにプログラムされ得るということを示している。2つの保存されたHEPNドメイン上の触媒残基が切断を媒介する。触媒残基の変異は触媒的に不活性なRNA結合タンパク質を生成する。例えば、Abudayyeh et al.,“C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector”,Science,2016 Aug 5;353(6299)を見よ。これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。

Alicyclobaccillus acidoterrastris Cas12b1(AacC2c1)の結晶構造がキメラ単分子ガイドRNA(sgRNA)との複合体として報告されている。例えば、Liu et al.,“C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism”,Mol.Cell,2017 Jan 19;65(2):310-322を見よ。これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。結晶構造は三者複合体として標的DNAに結合したAlicyclobacillus acidoterrestris C2c1としてもまた報告されている。例えば、Yang et al.,“PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease”,Cell,2016 Dec 15;167(7):1814-1828を見よ。これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。AacC2c1の触媒的に有能な立体配座は、独立して単一のRuvC触媒ポケット内に位置取った標的および非標的DNA鎖両方によって、キャプチャされている。C2c1によって媒介される切断は、標的DNAの互い違いの7ヌクレオチド切断をもたらす。C2c1三者複合体と先に同定されたCas9およびCpf1カウンターパートとの間の構造比較は、CRISPR-Cas9システムによって用いられる機序の多様性を実証する。

いくつかの態様では、napDNAbpはC2c1、C2c2、またはC2c3タンパク質であり得る。いくつかの態様では、napDNAbpはC2c1タンパク質である。いくつかの態様では、napDNAbpはCas13aタンパク質である。いくつかの態様では、napDNAbpはCas12cタンパク質である。いくつかの態様では、napDNAbpは、天然に存在するCas12b1(C2c1)、Cas13a(C2c2)、またはCas12c(C2c3)タンパク質と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、napDNAbpは天然に存在するCas12b1(C2c1)、Cas13a(C2c2)、またはCas12c(C2c3)タンパク質である。

H．Cas9循環置換体
種々の態様において、本明細書に開示のプライム編集因子はCas9の循環置換体を含み得る。

用語「循環置換Cas9」またはCas9の「循環置換体」または「CP-Cas9」は、循環置換体バリアントとして生起するかまたは操作されるように改変されているいずれかのCas9タンパク質またはそのバリアントを言う。これは、Cas9タンパク質(例えば、野生型Cas9タンパク質)のN末端およびC末端が局所的に再配置されているということを意味する。かかる循環置換Cas9タンパク質またはそれらのバリアントは、ガイドRNA(gRNA)と複合体化したときにDNAに結合する能力を保持する。Oakes et al.,“Protein Engineering of Cas9 for enhanced function,”Methods Enzymol,2014,546:491-511およびOakes et al.,“CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification,”Cell,January 10,2019,176:254-267を見よ。夫々は参照によって本願に組み込まれる。もたらされる循環置換タンパク質がガイドRNA(gRNA)と複合体化したときにDNAに結合する能力を保持する限り、本開示は、いずれかの先に公知のCP-Cas9を企図するか、または新たなCP-Cas9を用いる。

いずれかのバリアント、オーソログ、もしくは天然に存在するCas9を包含する本明細書に記載のCas9タンパク質のいずれか、またはその等価物が、循環置換体バリアントとして再構成され得る。

種々の態様において、Cas9の循環置換体は次の構造を有し得る:N末端-[元々のC末端]-[任意のリンカー]-[元々のN末端]-C末端。

例として、本開示は標準的なS.pyogenes Cas9の次の循環置換体を企図する(UniProtKB-Q99ZW2(CAS9_STRP1)の1368アミノ酸(付番は配列番号18のアミノ酸位置に基づく)):
N末端-[1268～1368]-[任意のリンカー]-[1～1267]-C末端;
N末端-[1168～1368]-[任意のリンカー]-[1～1167]-C末端;
N末端-[1068～1368]-[任意のリンカー]-[1～1067]-C末端;
N末端-[968～1368]-[任意のリンカー]-[1～967]-C末端;
N末端-[868～1368]-[任意のリンカー]-[1～867]-C末端;
N末端-[768～1368]-[任意のリンカー]-[1～767]-C末端;
N末端-[668～1368]-[任意のリンカー]-[1～667]-C末端;
N末端-[568～1368]-[任意のリンカー]-[1～567]-C末端;
N末端-[468～1368]-[任意のリンカー]-[1～467]-C末端;
N末端-[368～1368]-[任意のリンカー]-[1～367]-C末端;
N末端-[268～1368]-[任意のリンカー]-[1～267]-C末端;
N末端-[168～1368]-[任意のリンカー]-[1～167]-C末端;
N末端-[68～1368]-[任意のリンカー]-[1～67]-C末端;もしくは
N末端-[10～1368]-[任意のリンカー]-[1～9]-C末端、または
他のCas9タンパク質(他のCas9オーソログ、バリアントなどを包含する)の対応する循環置換体。

具体的な態様では、循環置換体(circular permuant)Cas9は次の構造を有する(S.pyogenes Cas9(UniProtKB-Q99ZW2(CAS9_STRP1)の1368アミノ酸(付番は配列番号18のアミノ酸位置に基づく)に基づく:
N末端-[102～1368]-[任意のリンカー]-[1～101]-C末端;
N末端-[1028～1368]-[任意のリンカー]-[1～1027]-C末端;
N末端-[1041～1368]-[任意のリンカー]-[1～1043]-C末端;
N末端-[1249～1368]-[任意のリンカー]-[1～1248]-C末端;もしくは
N末端-[1300～1368]-[任意のリンカー]-[1～1299]-C末端、または
他のCas9タンパク質(他のCas9オーソログ、バリアントなどを包含する)の対応する循環置換体。

なお他の態様において、循環置換体(circular permuant)Cas9は次の構造を有する(S.pyogenes Cas9(UniProtKB-Q99ZW2(CAS9_STRP1)の1368アミノ酸(付番は配列番号18のアミノ酸位置に基づく)に基づく:
N末端-[103～1368]-[任意のリンカー]-[1～102]-C末端;
N末端-[1029～1368]-[任意のリンカー]-[1～1028]-C末端;
N末端-[1042～1368]-[任意のリンカー]-[1～1041]-C末端;
N末端-[1250～1368]-[任意のリンカー]-[1～1249]-C末端;もしくは
N末端-[1301～1368]-[任意のリンカー]-[1～1300]-C末端、または
他のCas9タンパク質(他のCas9オーソログ、バリアントなどを包含する)の対応する循環置換体。

いくつかの態様では、循環置換体は、直接的にまたはアミノ酸リンカーなどのリンカーを用いることによってどちらかで、Cas9のC末端フラグメントをCas9のN末端フラグメントに連結することによって形成され得る。いくつかの態様では、C末端フラグメントは、Cas9のアミノ酸(例えば、アミノ酸約1300-1368)のC末端95％以上、あるいはCas9(例えば、配列番号77-86のいずれか1つ)のC末端90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％、またはより多くに対応し得る。N末端部分は、Cas9のアミノ酸(例えば、アミノ酸約1-1300)のN末端95％以上、あるいはCas9の(例えば配列番号18の)N末端90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％、またはより多くに対応し得る。

いくつかの態様では、循環置換体は、直接的にまたはアミノ酸リンカーなどのリンカーを用いることによってどちらかで、Cas9のC末端フラグメントをCas9のN末端フラグメントに連結することによって形成され得る。いくつかの態様では、N末端へと再配置されるC末端フラグメントは、Cas9のアミノ酸のC末端30％以下(例えば、配列番号18のアミノ酸1012～1368)を包含するかまたはそれらに対応する。いくつかの態様では、N末端へと再配置されるC末端フラグメントは、Cas9のアミノ酸(例えば、配列番号18のCas9)のC末端30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、または1％を包含するかまたはそれらに対応する。いくつかの態様では、N末端へと再配置されるC末端フラグメントは、Cas9(例えば、配列番号18のCas9)のC末端410残基以下を包含するかまたはそれらに対応する。いくつかの態様では、N末端へと再配置されるC末端部分は、Cas9(例えば、配列番号18のCas9)のC末端410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、または10残基を包含するかまたはそれらに対応する。いくつかの態様では、N末端へと再配置されるC末端フラグメントは、Cas9(例えば、配列番号18のCas9)のC末端357、341、328、120、または69残基を包含するかまたはそれらに対応する。

他の態様において、循環置換体Cas9バリアントは、次の方法に基づくCas9一次構造のトポロジー的再配置として定められ得、これは配列番号18のS.pyogenes Cas9に基づく:(a)Cas9一次構造の内部のアミノ酸残基に対応する循環置換体(CP)部位を選択し、これが元々のタンパク質を2つの半分:N末端領域およびC末端領域へと切り分けること;(b)元々のN末端領域に先立つ(preceed)ように元々のC末端領域(CP部位アミノ酸を含む)を動かすことによって、Cas9タンパク質配列を改変し(例えば、遺伝子工学技術による)、それによって、今やCP部位アミノ酸残基で始まるCas9タンパク質の新たなN末端を形成すること。CP部位は、例えばヘリカルIIドメイン、RuvCIIIドメイン、またはCTDドメインを包含するCas9タンパク質のいずれかのドメイン上に位置付られ得る。例えば、CP部位は、(配列番号18のS.pyogenes Cas9に対して相対的に)元々のアミノ酸残基181、199、230、270、310、1010、1016、1023、1029、1041、1247、1249、または1282に位置付けられ得る。それゆえに、ひとたびN末端に位置替えされると、元々のアミノ酸181、199、230、270、310、1010、1016、1023、1029、1041、1247、1249、または1282は新たなN末端アミノ酸になるであろう。これらのCP-Cas9タンパク質の命名体系は、夫々Cas9-CP¹⁸¹、Cas9-CP¹⁹⁹、Cas9-CP²³⁰、Cas9-CP²⁷⁰、Cas9-CP³¹⁰、Cas9-CP¹⁰¹⁰、Cas9-CP¹⁰¹⁶、Cas9-CP¹⁰²³、Cas9-CP¹⁰²⁹、Cas9-CP¹⁰⁴¹、Cas9-CP¹²⁴⁷、Cas9-CP¹²⁴⁹、およびCas9-CP¹²⁸²と言われ得る。この記載は配列番号18からのCPバリアントを作ることに限定されることを意味されず、いずれかのCas9配列において、これらの位置に対応するCP部位においてまたは全く(entireley)他のCP部位においてどちらかでCPバリアントを作るために実装され得る。この記載は決して特定のCP部位を限定することを意味されない。実質的にいずれかのCP部位がCP-Cas9バリアントを形成するために用いられ得る。

配列番号18のCas9に基づく例示のCP-Cas9アミノ酸配列が下で提供される。これにおいては、リンカー配列は下線付きによって指示され、任意のメチオニン(M)残基は太字で指示されている。本開示はリンカー配列を包含しないかまたは異なるリンカー配列を包含するCP-Cas9配列を提供するということは了解されるはずである。CP-Cas9配列が配列番号18以外のCas9配列に基づき得るということは了解されるはずであり、本願において提供されるいずれかの例は限定することを意味されない。例示のCP-Cas9配列は次のとおりである:

本明細書に記載のプライム編集構築物に有用であり得るCas9循環置換体。Cas9のN末端へと再配置され得る配列番号18のCas9に基づくCas9の例示のC末端フラグメントが、下で提供される。Cas9のかかるC末端フラグメントは例示的であり、限定することを意味されないということは了解されるはずである。これらの例示のCP-Cas9フラグメントは次の配列を有する:

I．改変されたPAM特異性を有するCas9バリアント
本開示のプライム編集因子は、改変されたPAM特異性を有するCas9バリアントをもまた含み得る。本開示のいくつかの側面は、標準的なPAM(5'-NGG-3'。ここで、NはA、C、G、またはTである)をその3'端に含まない標的配列に対して活性を発揮するCas9タンパク質を提供する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NGG-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NNG-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NNA-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NNC-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NNT-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NGT-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NGA-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NGC-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NAA-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NAC-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NAT-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。なお他の態様において、Cas9タンパク質は、5'-NAG-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。

第1のアミノ酸残基(例えばA)から第2のアミノ酸残基(例えばT)への本明細書に記載のアミノ酸変異のいずれか(例えば、A262T)は、第1のアミノ酸残基から(例えば、保存された)第2のアミノ酸残基に類似であるアミノ酸残基への変異をもまた包含し得るということは了解されるはずである。例えば、疎水性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン)の変異は、異なる疎水性側鎖を有する第2のアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン)への変異であり得る。例えば、アラニンからトレオニンへの変異(例えばA262T変異)は、アラニンからサイズおよび化学的特性がトレオニンに類似であるアミノ酸、例えばセリンへの変異でもまたあり得る。別の例として、正荷電側鎖を有するアミノ酸(例えば、アルギニン、ヒスチジン、またはリジン)の変異は、異なる正荷電側鎖を有する第2のアミノ酸(例えば、アルギニン、ヒスチジン、またはリジン)への変異であり得る。別の例として、極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミン)の変異は、異なる極性側鎖を有する第2のアミノ酸(例えば、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミン)への変異であり得る。追加の類似のアミノ酸ペアは次を包含するが、これらに限定されない:フェニルアラニンおよびチロシン;アスパラギンおよびグルタミン;メチオニンおよびシステイン;アスパラギン酸およびグルタミン酸;ならびにアルギニンおよびリジン。当業者は、かかる保存的アミノ酸置換が蓋然的にはタンパク質構造に対して軽度の効果を有し、機能を毀損することなしに良く忍容されることが蓋然的であるということを認識するであろう。いくつかの態様では、1つのアミノ酸からトレオニンへの本願において提供されるアミノ酸変異のいずれかのアミノは、セリンへのアミノ酸変異であり得る。いくつかの態様では、1つのアミノ酸からアルギニンへの本願において提供されるアミノ酸変異のいずれかのアミノは、リジンへのアミノ酸変異であり得る。いくつかの態様では、1つのアミノ酸からイソロイシンへの本願において提供されるアミノ酸変異のいずれかのアミノはアラニン、バリン、メチオニン、またはロイシンへのアミノ酸変異であり得る。いくつかの態様では、1つのアミノ酸からリジンへの本願において提供されるアミノ酸変異のいずれかのアミノはアルギニンへのアミノ酸変異であり得る。いくつかの態様では、1つのアミノ酸からアスパラギン酸への本願において提供されるアミノ酸変異のいずれかのアミノはグルタミン酸またはアスパラギンへのアミノ酸変異であり得る。いくつかの態様では、1つのアミノ酸からバリンへの本願において提供されるアミノ酸変異のいずれかのアミノはアラニン、イソロイシン、メチオニン、またはロイシンへのアミノ酸変異であり得る。いくつかの態様では、1つのアミノ酸からグリシンへの本願において提供されるアミノ酸変異のいずれかのアミノはアラニンへのアミノ酸変異であり得る。しかしながら、追加の保存されたアミノ酸残基は当業者によって認識されるであろうということは了解されるはずであり、他の保存されたアミノ酸残基へのアミノ酸変異のいずれかもまた本開示の範囲内である。

いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NAA-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する変異の組み合わせを含む。いくつかの態様では、変異の組み合わせは、表1の列記されているクローンのいずれか1つに存在する。いくつかの態様では、変異の組み合わせは、表1の列記されているクローンの保存的変異である。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表1に列記されるCas9クローンのいずれか1つの変異の組み合わせを含む。

表1:NAA PAMクローン

いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表1のバリアントのいずれか1つによって提供されるCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表1のバリアントのいずれか1つによって提供されるCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、配列番号18によって提供されるStreptococcus pyogenes Cas9と比較して、標準的なPAM(5'-NGG-3')をその3'端に含まない標的配列に対して増大した活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、標準的なPAM配列(5'-NGG-3')に直接的に隣接しない3'端を有する標的配列に対して、同じ標的配列に対する配列番号18によって提供されるStreptococcus pyogenes Cas9の活性と比較して、少なくとも5倍増大した活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、標準的なPAM配列(5'-NGG-3')に直接的に隣接しない標的配列に対して、同じ標的配列に対する配列番号2によって提供されるStreptococcus pyogenesの活性と比較して、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1,000倍、少なくとも5,000倍、少なくとも10,000倍、少なくとも50,000倍、少なくとも100,000倍、少なくとも500,000倍、または少なくとも1,000,000倍増大した活性を発揮する。いくつかの態様では、標的配列の3'端はAAA、GAA、CAA、またはTAA配列に直接的に隣接する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NAC-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する変異の組み合わせを含む。いくつかの態様では、変異の組み合わせは、表2の列記されているクローンのいずれか1つに存在する。いくつかの態様では、変異の組み合わせは、表2の列記されているクローンの保存的変異である。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表2の列記されているCas9クローンのいずれか1つの変異の組み合わせを含む。

表2:NAC PAMクローン

いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表2のバリアントのいずれか1つによって提供されるCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表2のバリアントのいずれか1つによって提供されるCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、配列番号18によって提供されるStreptococcus pyogenes Cas9と比較して、標準的なPAM(5'-NGG-3')をその3'端に含まない標的配列に対して増大した活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、標準的なPAM配列(5'-NGG-3')に直接的に隣接しない3'端を有する標的配列に対して、同じ標的配列に対する配列番号18によって提供されるStreptococcus pyogenes Cas9の活性と比較して少なくとも5倍増大した活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、標準的なPAM配列(5'-NGG-3')に直接的に隣接しない標的配列に対して、同じ標的配列に対する配列番号18によって提供されるStreptococcus pyogenesの活性と比較して少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1,000倍、少なくとも5,000倍、少なくとも10,000倍、少なくとも50,000倍、少なくとも100,000倍、少なくとも500,000倍、または少なくとも1,000,000倍増大した活性を発揮する。いくつかの態様では、標的配列の3'端はAAC、GAC、CAC、またはTAC配列に直接的に隣接する。

いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NAT-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する変異の組み合わせを含む。いくつかの態様では、変異の組み合わせは表3の列記されているクローンのいずれか1つに存在する。いくつかの態様では、変異の組み合わせは、表3の列記されているクローンの保存的変異である。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表3に列記されるCas9クローンのいずれか1つの変異の組み合わせを含む。

表3:NAT PAMクローン

本開示のプライム編集因子に関して用いられ得る種々のnapDNAbpの上の記載は、決して限定することを意味されない。プライム編集因子は、公知であるか、または指向性進化的なもしくは別様の変異プロセスによって作られ得るかもしくは進化させられ得る標準的なSpCas9、またはいずれかのオーソログCas9タンパク質、またはいずれかのバリアントCas9タンパク質を含み得、Cas9のいずれかの天然に存在するバリアント、変異体、または別様に操作されたバージョンを包含する。種々の態様において、Cas9またはCas9バリアント(varant)はニッカーゼ活性を有し、すなわち標的DNA配列の1つの(of)鎖のみを切断する。他の態様において、Cas9またはCas9バリアントは不活性なヌクレアーゼを有し、すなわち「不活性型」Cas9タンパク質である。用いられ得る他のバリアントCas9タンパク質は、標準的なSpCas9よりも小さい分子量を有するか(例えば、より容易な送達のため)または改変もしくは再配置された一次アミノ酸構造(例えば、循環置換体フォーマット)を有するものである。本明細書に記載のプライム編集因子は、収斂進化の結果であるCas12a/Cpf1およびCas12bタンパク質を包含するCas9等価物をもまた含み得る。本願において用いられるnapDNAbp(例えば、SpCas9、Cas9バリアント、またはCas9等価物)は、それらのPAM特異性(specifity)を変改/増強する種々の改変をもまた含有し得る。最後に、本願は、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.9％配列同一性を参照Cas9配列、例えば参照SpCas9標準的な配列または参照Cas9等価物(例えば、Cas12a/Cpf1)に対して有するいずれかのCas9、Cas9バリアント、またはCas9等価物を企図する。

具体的な態様では、拡張されたPAM能力を有するCas9バリアントはSpCas9(H840A)VRQR(配列番号87)であり、これは次のアミノ酸配列を有する(配列番号51のSpCas9(H840A)に対して相対的なV、R、Q、R置換が太字の下線で示されている(show)。加えて、SpCas9(H840)のメチオニン残基はSpCas9(H840A)VRQRでは除去された):

別の具体的な態様では、拡張されたPAM能力を有するCas9バリアントはSpCas9(H840A) VRERであり、これは次のアミノ酸配列を有する(配列番号51のSpCas9(H840A)に対して相対的なV、R、E、R置換が太字の下線で示されている。加えて、SpCas9(H840)のメチオニン残基はSpCas9(H840A)VRERでは除去された):

いくつかの態様では、非標準的なPAM配列について機能するnapDNAbpはアルゴノートタンパク質である。かかる核酸プログラム型DNA結合タンパク質の1つの例は、Natronobacterium gregoryiからのアルゴノートタンパク質(NgAgo)である。NgAgoはssDNAによってガイドされるエンドヌクレアーゼである。NgAgoは～24ヌクレオチドの5'リン酸化されたssDNA(gDNA)に結合してそれをその標的部位へとガイドし、gDNA部位においてDNA二本鎖切断を作るであろう。Cas9とは対照的に、NgAgo-gDNAシステムはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を要求しない。ヌクレアーゼ不活性なNgAgo(dNgAgo)を用いることは、標的化され得る塩基を多大に拡張し得る。NgAgoの特徴付けおよび使用はGao et al.,Nat Biotechnol.,2016 Jul;34(7):768-73.PubMed PMID: 27136078;Swarts et al.,Nature.507(7491)(2014):258-61;およびSwarts et al.,Nucleic Acids Res.43(10)(2015):5120-9に記載されている。これらの夫々は参照によって本願に組み込まれる。

いくつかの態様では、napDNAbpはアルゴノートタンパク質の原核生物ホモログである。アルゴノートタンパク質の原核生物ホモログは知られており、例えばMakarova K.,et al.,“Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements”,Biol Direct.2009 Aug 25;4:29.doi:10.1186/1745-6150-4-29に記載されている。これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。いくつかの態様では、napDNAbpはMarinitoga piezophila Argunaute(MpAgo)タンパク質である。CRISPR関連Marinitoga piezophila Argunaute(MpAgo)タンパク質は、5'-リン酸化されたガイドを用いて一本鎖標的配列を切断する。5'ガイドは全ての公知のアルゴノートによって用いられる。MpAgo-RNA複合体の結晶構造は、5'リン酸相互作用をブロックする残基を含むガイド鎖結合部位を示す。このデータは、5'ヒドロキシル化されたガイドに対する非標準的な特異性を有するアルゴノートサブクラスの進化を示唆する。例えば、Kaya et al.,“A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity”,Proc Natl Acad Sci U S A.2016 Apr 12;113(15):4057-62を見よ。これの内容全体は参照によってここに組み込まれる)。他のargonauteタンパク質が用いられ得、本開示の範囲内であるということは了解されるはずである。

本開示のいくつかの側面は、異なるPAM特異性を有するCas9ドメインを提供する。典型的には、S.pyogenesからのCas9(spCas9)などのCas9タンパク質は、具体的な核酸領域に結合するためには標準的なNGG PAM配列を要求する。これはゲノム上の所望の塩基を編集する能力を限定し得る。いくつかの態様では、本願において提供される塩基編集融合タンパク質は、精密な位置付けに置かれることを必要とし得る。例えば、ここでは、標的塩基が4塩基領域(例えば、「編集窓」)上に置かれ、これがPAMのおよそ15塩基上流にある。Komor,A.C.,et al.,“Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”Nature 533,420-424(2016)を見よ。これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。従って、いくつかの態様では、本願において提供される融合タンパク質のいずれかは、標準的な(例えば、NGG)PAM配列を含有しないヌクレオチド配列に結合することができるCas9ドメインを含有し得る。非標準的なPAM配列に結合するCas9ドメインは当該技術分野において記載されており、当業者には明らかであろう。例えば、非標準的なPAM配列に結合するCas9ドメインは、Kleinstiver,B.P.,et al.,“Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities”Nature 523,481-485(2015);およびKleinstiver,B.P.,et al.,“Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition” Nature Biotechnology 33,1293-1298(2015)に記載されている;夫々の内容全体は参照によってここに組み込まれる。

例えば、変改されたPAM特異性を有するnapDNAbpドメイン、例えば、次のアミノ酸配列を有する野生型Francisella novicida Cpf1(D917、E1006、およびD1255)(配列番号74)と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％配列同一性を有するドメイン:

変改されたPAM特異性を有する追加のnapDNAbpドメイン、例えば、次のアミノ酸配列を有する野生型Geobacillus thermodenitrificans Cas9(配列番号75)と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％配列同一性を有するドメイン:

いくつかの態様では、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)は、標準的な(NGG)PAM配列を要求しない核酸プログラム型DNA結合タンパク質である。いくつかの態様では、napDNAbpはargonauteタンパク質である。かかる核酸プログラム型DNA結合タンパク質の1つの例はNatronobacterium gregoryiからのアルゴノートタンパク質(NgAgo)である。NgAgoはssDNAによってガイドされるエンドヌクレアーゼである。NgAgoは～24ヌクレオチドの5'リン酸化されたssDNA(gDNA)に結合してそれをその標的部位へとガイドし、gDNA部位においてDNA二本鎖切断を作るであろう。Cas9とは対照的に、NgAgo-gDNAシステムはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を要求しない。ヌクレアーゼ不活性なNgAgo(dNgAgo)を用いることは、標的化され得る塩基を多大に拡張し得る。NgAgoの特徴付けおよび使用はGao et al.,Nat Biotechnol.,34(7):768-73(2016),PubMed PMID:27136078;Swarts et al.,Nature,507(7491):258-61(2014);およびSwarts et al.,Nucleic Acids Res.43(10)(2015):5120-9に記載されている。これらの夫々は参照によって本願に組み込まれる。Natronobacterium gregoryi Argonauteの配列は配列番号76によって提供される。

開示される融合タンパク質は、次のアミノ酸配列を有する野生型Natronobacterium gregoryi Argonaute(配列番号76)と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％配列同一性を有するnapDNAbpドメインを含み得る:

加えて、いずれかの利用可能な方法が、バリアントまたは変異体Cas9タンパク質を得るかまたは構築するために利用され得る。本願において用いられる用語「変異」は、別の残基によるある配列、例えば核酸もしくはアミノ酸配列上の残基の置換、またはある配列上の1つ以上の残基の欠失もしくは挿入を言う。変異は、典型的には、元々の残基、次に配列上の残基の位置および新たに置換された残基のアイデンティティーを同定することによって本明細書に記載の。本願において提供されるアミノ酸置換(変異)を作るための種々の方法が当該技術分野において周知であり、例えばGreen and Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012))によって提供される。変異は、種々のカテゴリー、例えば1塩基多型、微小重複領域、インデル、および逆位を包含し得、決して限定することを意味されない。変異は、タンパク質活性を縮減または廃止する変異の正常の結果である「機能喪失」変異を包含し得る。ほとんどの機能喪失変異は劣性である。なぜなら、ヘテロ接合体では、第2の染色体コピーが完全に機能的なタンパク質をコードする遺伝子の未変異のバージョンを持ち、この存在が変異の効果を補償するからである。変異は、「機能獲得」変異をもまた包摂する。これは、正常な条件下ではさもなければ存在しない異常な活性をタンパク質または細胞に付与するものである。多くの機能獲得変異はコード領域よりもむしろ制御配列にあり、よって、いくつもの帰結を有し得る。例えば、変異は、1つ以上の遺伝子が間違った組織において発現されることに至り得、これらの組織は、それらが正常では欠く機能を獲得する。それらの性質ゆえに、機能獲得変異は通常は優性である。

変異は部位特異的変異導入を用いて参照Cas9タンパク質上に導入され得る。当該技術分野で公知の部位特異的変異導入のより古い方法は、一本鎖DNA鋳型の単離を許すM13バクテリオファージベクターなどのベクター上への変異させられるべき配列のサブクローニングに依拠する。これらの方法では、変異誘発プライマー(すなわち、変異させられるべき部位にアニールすることができるが、変異させられるべき部位に1つ以上のミスマッチのヌクレオチドを持つプライマー)を一本鎖鋳型にアニーリングさせ、それから、変異誘発プライマーの3'端からスタートして鋳型の相補体を重合する。それから、もたらされた二重鎖はホスト細菌に形質転換され、プラークが所望の変異についてスクリーニングされる。より最近では、部位特異的変異導入はPCR方法論を使用している。これらは一本鎖鋳型を要求しないという利点を有する。加えて、サブクローニングを要求しない方法が開発されている。PCRに基づく部位特異的変異導入が行われるときには、いくつかのイシューが考慮されなければならない。第1に、これらの方法では、ポリメラーゼによって導入される望まれない変異の拡張を防止するために、PCRサイクル数を縮減することが望ましい。第2に、反応中に残存する変異していない親の分子の数を縮減するために、セレクションが使用されなければならない。第3に、単一のPCRプライマーセットの使用を許すために、伸長された長さのPCR法が好ましい。そして第4に、いくつかの熱安定性ポリメラーゼの非鋳型依存性末端伸長活性ゆえに、多くの場合には、PCRによって生成された変異体産物の平滑末端ライゲーションに先行して、端を磨くステップを手続きに組み込むことが必要である。

変異は、指向性進化プロセス、例えばファージによって補助される連続的進化(PACE)またはファージによって補助される非連続的進化(PANCE)によってもまた導入され得る。本願において用いられる用語「ファージによって補助される連続的進化(PACE)」は、ファージをウイルスベクターとして使用する連続的進化を言う。PACEテクノロジーの一般概念は、例えば、2010年3月11日にWO2010/028347として公開された2009年9月8日出願の国際PCT出願PCT/US2009/056194;2012年6月28日にWO2012/088381として公開された2011年12月22日出願の国際PCT出願PCT/US2011/066747;2015年5月5日登録のU.S.出願U.S.特許No.9,023,594、2015年9月11日にWO2015/134121として公開された2015年1月20日出願の国際PCT出願PCT/US2015/012022、および2016年10月20日にWO2016/168631として公開された2016年4月15日出願の国際PCT出願PCT/US2016/027795に記載されている。これらの夫々の内容全体は参照によって本願に組み込まれる。バリアントCas9はファージによって補助される非連続的進化(PANCE)によってもまた得られ得る。本願において用いられるこれは、ファージをウイルスベクターとして使用する非連続的進化を言う。PANCEは急速なインビボの指向性進化のための単純化された技術であり、新しいE.coliホスト細胞による進化させられるべき目当ての遺伝子を含有する進化する「セレクションファージ」(SP)の連続フラスコ植え継ぎを用い、それによって、ホストE.coli内の遺伝子が一定に保たれることを許しながら、SPに含有される遺伝子は連続的に進化する。連続フラスコ植え継ぎは微生物の実験室進化のための広くアクセス可能なアプローチとして長く用をなしており、より最近では、バクテリオファージ進化のための類縁のアプローチが開発されている。PANCEシステムはPACEシステムよりも低いストリンジェンシーを特色とする。

Cas9またはCas9等価物に関する上に記されている参照のいずれかは、すでにそのように申し立てられていない場合には、それらの全体が参照によってここに組み込まれる。

J．分裂されたPE送達のための割られたnapDNAbpドメイン
種々の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は2つ以上のフラグメントとして細胞に送達され得、これらは、細胞内において、再構成されたプライム編集因子へとアセンブリされるようになる(受動的アセンブリによるか、または分裂インテイン配列を用いることなどの能動的アセンブリによる)。いくつかのケースでは、自己アセンブリは受動的であり得、これによって、2つ以上のプライム編集因子フラグメントは細胞内で共有結合的にまたは非共有結合的に会合してプライム編集因子を再構成する。他のケースでは、自己アセンブリはフラグメントの夫々に組み入れされた二量体化ドメインによって触媒され得る。二量体化ドメインの例は本明細書に記載の。なお他のケースでは、自己アセンブリは、プライム編集因子フラグメントの夫々に組み入れされた分裂インテイン配列によって触媒され得る。

分裂されたPE送達は、異なる送達アプローチの種々のサイズ制約に対処するために有利であり得る。例えば、送達アプローチは、ウイルスに基づく送達方法、メッセンジャーRNAに基づく送達方法、またはRNPに基づく送達(リボヌクレオタンパク質に基づく送達)を包含し得る。そして、送達のこれらの方法の夫々は、プライム編集因子をより小さいピースへと割ることによって、より効率的および/または有効であり得る。ひとたび細胞内においては、より小さいピースは機能的なプライム編集因子へとアセンブリし得る。分裂の手段に依存して、割られたプライム編集因子フラグメントは非共有結合的様式または共有結合的様式で再アセンブリされてプライム編集因子を再形成し得る。1つの態様では、プライム編集因子は1つ以上の分裂部位において2つ以上のフラグメントへと分裂され得る。フラグメントは(分裂される以外は)未改変であり得る。ひとたびフラグメントが細胞に送達されると(例えば、リボヌクレオタンパク質複合体の直接的送達によるか、または核酸送達、例えばmRNA送達もしくはウイルスベクターに基づく送達による)、フラグメントは共有結合的にまたは非共有結合的に再会合してプライム編集因子を再構成し得る。別の態様では、プライム編集因子は1つ以上の分裂部位において2つ以上のフラグメントへと分裂され得る。フラグメントの夫々は二量体化ドメインを含むように改変され得、これによって、形成された各フラグメントは二量体化ドメインにカップリングされる。ひとたび細胞内に送達または発現されると、異なるフラグメントの二量体化ドメイン同士は会合し、互いに結合し、異なるプライム編集因子フラグメントを一緒に持って来て、機能的なプライム編集因子を再形成する。さらに別の態様では、プライム編集因子フラグメントは分裂インテインを含むように改変され得る。ひとたび細胞内に送達または発現されると、異なるフラグメントの分裂インテインドメイン同士は会合し、互いに結合し、それからトランススプライシングを経過する。これが、フラグメントの夫々からの分裂インテインドメインの切除と、フラグメント間のペプチド結合の付随的形成とをもたらし、それによってプライム編集因子を復元する。

1つの態様では、プライム編集因子は分裂インテインアプローチを用いて送達され得る。

分裂部位の位置付けは、プライム編集因子上の残基のいずれか1つ以上のペアの間に、ならびにnapDNAbpドメイン、ポリメラーゼドメイン(例えば、RTドメイン)、napDNAbpドメインおよびポリメラーゼドメインを連結するリンカードメイン内を包含するその中のいずれかのドメイン上に、位置取り得る。

図66に図示される1つの態様では、プライム編集因子(PE)はnapDNAbp上の分裂部位において割られる。

ある態様において、napDNAbpは次のとおり配列番号18の標準的なSpCas9ポリペプチドである:

ある態様において、SpCas9は、配列番号18の標準的なSpCas9の残基1および2、もしくは2および3、もしくは3および4、もしくは4および5、もしくは5および6、もしくは6および7、もしくは7および8、もしくは8および9、もしくは9および10の間に位置付けられた分裂部位において、または残基1～10、10～20、20～30、30～40、40～50、50～60、60～70、70～80、80～90、90～100、100～200、200～300、300～400、400～500、500～600、600～700、700～800、800～900、1000～1100、1100～1200、1200～1300、もしくは1300～1368の間のどこかに位置付けられた残基のいずれかの2つのペアの間において、2つのフラグメントへと分裂される。

ある態様において、napDNAbpは、配列番号18の標準的なSpCas9の位置1～10、10～20、20～30、30～40、40～50、50～60、60～70、70～80、80～90、90～100、100～200、200～300、300～400、400～500、500～600、600～700、700～800、800～900、1000～1100、1100～1200、1200～1300、または1300～1368の間のどこかに位置付けられた残基のいずれか2つのペアに対応する残基のペアに位置付けられる分裂部位において、2つのフラグメントへと分裂される。

ある態様において、SpCas9は、配列番号18の標準的なSpCas9の残基1および2、もしくは2および3、もしくは3および4、もしくは4および5、もしくは5および6、もしくは6および7、もしくは7および8、もしくは8および9、もしくは9および10の間に位置付けられた分裂部位において、または残基1～10、10～20、20～30、30～40、40～50、50～60、60～70、70～80、80～90、90～100、100～200、200～300、300～400、400～500、500～600、600～700、700～800、800～900、1000～1100、1100～1200、1200～1300、もしくは1300～1368の間のどこかに位置付けられた残基のいずれか2つのペアの間において、2つのフラグメントへと分裂される。ある態様において、分裂部位は、1つ以上のポリペプチド結合部位(すなわち、「分裂部位または分裂インテイン分裂部位」)に位置付けられ、分裂インテインに融合され、それから、別個にコードされる融合タンパク質として細胞に送達される。ひとたび分裂インテイン融合タンパク質同士(すなわち、タンパク質の半分同士)が細胞内で発現されると、タンパク質はトランススプライシングを経過して、連結された分裂インテイン配列の付随的除去によって完全なまたは丸ごとのPEを形成する。

例えば、図66に示されているとおり、N末端エクステインは第1の分裂インテイン(例えば、Nインテイン)に融合され得、C末端エクステインは第2の分裂インテイン(例えば、Cインテイン)に融合され得る。細胞内におけるNインテインおよびCインテインの自己会合、次にそれらの自己切除と丸ごとのプライム編集因子(PE)のN末端エクステインおよびC末端エクステイン部分の間のペプチド結合の付随的形成とによって、N末端エクステインはC末端エクステインに融合されるようになって、napDNAbpドメインおよびポリメラーゼドメイン(例えば、RTドメイン)を含む丸ごとのプライム編集因子融合タンパク質を再形成する。

分裂インテインを用いる分裂されたPE送達戦略を利するためには、プライム編集因子は、1つ以上の分裂部位において割られて、プライム編集因子の少なくとも2つの別個の半分を生出することを必要とする。これらの夫々は、各半分が分裂インテイン配列に融合される場合には、細胞内で再連結され得る。

ある態様において、プライム編集因子は単一の分裂部位において分裂される。ある種の他の態様において、プライム編集因子は2つの分裂部位、もしくは3つの分裂部位、もしくは4つの分裂部位、またはより多くにおいて分裂される。

好ましい態様では、プライム編集因子は単一の分裂部位において分裂されて、プライム編集因子の2つの別個の半分を生出する。これらの夫々は分裂インテイン配列に融合され得る。

例示の分裂インテインはSsp DnaEインテインであり、これは2つのサブユニットつまりDnaE-NおよびDnaE-Cを含む。2つの異なるサブユニットは別個の遺伝子つまりdnaE-nおよびdnaE-cによってコードされ、これらは夫々DnaE-NおよびDnaE-Cサブユニットをコードする。DnaEはSynechocytis sp. PCC6803の天然に存在する分裂インテインであり、夫々がDnaE-NまたはDnaE-Cどちらかとの融合体を含む2つの別個のタンパク質のトランススプライシングを導くことができる。

追加の天然に存在するかまたは操作された分裂インテイン配列は当該技術分野で公知であるか、または本明細書に記載の丸ごとのインテイン配列もしくは当該技術分野で利用可能なものから作られ得る。分裂インテイン配列の例はStevens et al.,“A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications,”PNAS,2017,Vol.114:8538-8543;Iwai et al.,“Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme,FEBS Lett,580:1853-1858に見出され得る。これらの夫々は参照によって本願に組み込まれる。追加の分裂インテイン配列は例えばWO2013/045632、WO2014/055782、WO2016/069774、およびEP2877490に見出され得る。これらの夫々の内容は参照によって本願に組み込まれる。

加えて、トランスのタンパク質スプライシングがインビボおよびin vitroで記載されており(Shingledecker,et al.,[0076]Gene 207:187(1998),Southworth,et al.,EMBO J.17:918(1998);Mills, et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:3543-3548(1998);Lew,et al.,J.Biol.Chem.,273:15887-15890(1998);Wu,et al.,Biochim.Biophys.Acta 35732:1(1998b),Yamazaki,et al.,J.Am.Chem.Soc.120:5591(1998),Evans,et al.,J.Biol.Chem.275:9091(2000);Otomo,et al.,Biochemistry 38:16040-16044(1999);Otomo,et al.,J.Biolmol.NMR 14:105-114(1999);Scott,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:13638-13643(1999))、2つの不活性なフラグメントとして(as to)タンパク質を発現するための機会を提供し、これらは爾後にライゲーションを経過して機能的な産物を形成する。例えば、2つの別個に発現された半分からの完全なPE融合タンパク質の形成について、図66および67に示されているとおりである。

本明細書に記載の種々の態様では、連続的進化法(例えばPACE)が塩基編集因子の第1の部分を進化させるために用いられ得る。第1の部分は、単一の構成要素またはドメイン、例えばCas9ドメイン、デアミナーゼドメイン、またはUGIドメインを包含し得る。それから、進化した部分および残りの未進化の部分両方を分裂インテインポリペプチドドメインと共に別個に発現することによって、別個に進化した構成要素またはドメインは、細胞内において塩基編集因子の残りの部分に融合され得る。第1の部分は、より幅広く、本明細書に記載の連続的進化方法を用いて進化させられることを望まれる塩基編集因子のいずれかの第1のアミノ酸部分を包含し得る。第2の部分は、この態様では、本願の方法を用いて進化させられない塩基編集因子の残りのアミノ酸部分を言うであろう。塩基編集因子の進化した第1の部分および第2の部分は、夫々が分裂インテインポリペプチドドメインと共に細胞によって発現され得る。細胞の天然のタンパク質スプライシング機序は、進化した第1の部分および未進化の第2の部分を再アセンブリして、単一の融合タンパク質の進化した塩基編集因子を形成するであろう。進化した第1の部分は、単一の融合タンパク質のNまたはC末端パーツどちらかを含み得る。類縁の様式で、第2の直交的なトランススプライシングインテインペアの使用は、進化した第1の部分が単一の融合タンパク質の内部のパーツを含むことを許し得る。

それゆえに、細胞内における進化したおよび未進化の構成要素を含む完全な塩基編集因子の形成を容易化するために、本明細書に記載の塩基編集因子の進化したおよび未進化の構成要素のいずれかは、分裂インテインタグと共に発現され得る。

タンパク質スプライシングプロセスの機序は多大に詳細に研究されており(Chong,et al.,J.Biol.Chem.1996,271,22159-22168;Xu,M-Q & Perler,F.B.EMBO Journal,1996,15,5146-5153)、保存されたアミノ酸がインテインおよびエクステインスプライシング点に見出されている(Xu,et al.,EMBO Journal,1994,13 5517-522)。本明細書に記載の構築物は、第1の遺伝子(例えば、塩基編集因子の進化した部分)の5'末端に融合されたインテイン配列を含有する。好適なインテイン配列は、タンパク質スプライシングエレメントを含有することが公知のタンパク質のいずれかから選択され得る。全ての公知のインテインを含有するデータベースはワールドワイドウェブ上に見出され得る(Perler,F.B.Nucleic Acids Research,1999,27,346-347)。インテイン配列は3'端において第2の遺伝子の5'端に融合される。ある種のオルガネラへのこの遺伝子の標的化のためには、ペプチドシグナルが遺伝子のコード配列に融合され得る。第2の遺伝子の後に、インテイン遺伝子配列は、同じ細胞における複数のタンパク質の発現のために所望の回数だけ繰り返され得る。マルチインテイン含有構築物では、異なるソースからのインテイン要素を用いることが有用であり得る。発現されるべき最後の遺伝子の配列の後には、転写終結配列が挿入されなければならない。1つの態様では、それがインテインからのエクステインの切除を触媒すると共にエクステインのライゲーションを防止し得るようにして、改変されたインテインスプライシング単位がデザインされる。Pyrococcus種GB-D DNAポリメラーゼ上のC末端エクステインジャンクションの変異導入は、変改されたスプライシングエレメントを生ずることが見出された。これは、エクステインおよびインテインの切断を誘導するが、エクステインの爾後のライゲーションを防止する(Xu,M-Q & Perler,F.B.EMBO Journal,1996,15,5146-5153)。セリン538からアラニンまたはグリシンどちらかへの変異は、切断を誘導したが、ライゲーションを防止した。インテインへのC末端エクステインジャンクションにおけるアミノ酸の保存を原因として、他のインテインスプライシング単位における同等残基の変異もまたエクステインライゲーションを防止するはずである。エンドヌクレアーゼドメインを含有しない好ましいインテインは、Mycobacterium xenopi GyrAタンパク質である(Telenti,et al.J.Bacteriol.1997,179,6378-6382)。他は天然に見出されているか、またはインテインを含有するエンドヌクレアーゼからエンドヌクレアーゼドメインを除去することによって人工的に生出されている(Chong,et al.J.Biol.Chem.1997,272,15587-15590)。好ましい態様では、インテインは、それがスプライシング機能を果たすために必要とされる最小限の数のアミノ酸からなるようにして選択され、例えばMycobacterium xenopi GyrAタンパク質からのインテインである(Telenti,A.,et al.,J.Bacteriol.1997,179,6378-6382)。代替的な態様では、エンドヌクレアーゼ活性なしのインテインが選択され、例えばMycobacterium xenopi GyrAタンパク質からのインテイン、またはエンドヌクレアーゼドメインを除去するように改変されたSaccharaomyces cerevisiae VMAインテインである(Chong,1997)。インテインスプライシング単位のさらなる改変は、切断反応の反応速度が変改されることを許し得、スプライシング単位の遺伝子配列を単純に改変することによって、タンパク質用量がコントロールされることを許す。

インテインは2つの別個に転写および翻訳される遺伝子によってコードされる2つのフラグメントとしてもまた存在し得る。これらのいわゆる分裂インテインは自己会合し、タンパク質スプライシング活性をトランスで触媒する。分裂インテインは多様なシアノバクテリアおよび古細菌において同定されているが(Caspi et al,Mol Microbiol.50:1569-1577(2003);Choi J.et al,J Mol Biol.556:1093-1106(2006.);Dassa B.et al,Biochemistry.46:322-330(2007.);Liu X. and Yang J.,J Biol Chem.275:26315-26318(2003);Wu H.et al.

Proc Natl Acad Sci USA.￡5:9226-9231(1998.);およびZettler J.et al,FEBS Letters.553:909-914(2009))、真核生物ではここまで見出されていない。最近、環境メタゲノムデータのバイオインフォマティクス分析は、新規のゲノム配置を有する26の異なる座位を明らかにした。各座位においては、保存された酵素コード領域が分裂インテインによって分断され、自立したエンドヌクレアーゼ遺伝子が、インテインサブドメインをコードするセクション間に挿入されている。それらのうち、5つの座位が完全にアセンブリされた:DNAヘリカーゼ(gp41-1、gp41-8);イノシン-5'-一リン酸デヒドロゲナーゼ(IMPDH-1);およびリボヌクレオチドレダクターゼ触媒サブユニット(NrdA-2およびNrdJ-1)である。このばらばらになった遺伝子編成は主にファージに存在するように見える(Dassa et al,Nucleic Acids Research.57:2560-2573(2009))。

分裂インテインNpu DnaEは、タンパク質トランススプライシング反応について報告された最も高い速度を有するとして特徴付けられた。加えて、Npu DnaEタンパク質スプライシング反応は、異なるエクステイン配列、6から37℃の温度、および最高で6Mの尿素の存在についてロバストかつ高収量と考慮される(Zettler J.et al,FEBS Letters.553:909-914(2009);Iwai I.et al,FEBS Letters 550:1853-1858(2006))。予想されたとおり、これらのインテインのNドメインにおけるCysl Ala変異が導入されたときには、当初のNからSのアシルシフト、よってタンパク質スプライシングがブロックされた。残念ながら、C末端切断反応もまたほとんど完全に阻害された。N末端の切れやすいペプチド結合におけるアシルシフトに対するC末端スプライスジャンクションにおけるアスパラギン環化の依存性は、天然に分裂されたDnaEインテインアレルに普通の固有の特性であるように見える(Zettler J.et al.FEBS Letters.555:909-914(2009))。

タンパク質スプライシングの機序は、典型的には4つのステップを有する[29-30]:1)インテインN末端におけるN-SまたはN-Oアシルシフト。これは上流のペプチド結合を切断し、Nエクステインとインテインの第1のアミノ酸(CysまたはSer)の側鎖との間にエステル結合を形成する;2)NエクステインをインテインC末端へと位置替えするトランスエステル化。新たなエステル結合を形成し、NエクステインをCエクステインの第1のアミノ酸(Cys、Ser、またはThr)の側鎖に連結する;3)インテインおよびCエクステインの間のペプチド結合を切断するAsn環化;ならびに4)NエクステインおよびCエクステインの間においてペプチド結合によってエステル結合を置き換えるS-NまたはO-Nアシルシフト。

分裂インテインによって触媒されるタンパク質トランススプライシングは、タンパク質ライゲーションのための全く酵素的な方法を提供する[31]。分裂インテインは本質的には一続きのインテイン(例えばミニインテイン)であり、夫々NインテインおよびCインテインという名称の2つのピースへと分裂されている。分裂インテインのNインテインおよびCインテインは、非共有結合的に会合して活性なインテインを形成し、一続きのインテインがするのと本質的に同じやり方でスプライシング反応を触媒し得る。分裂インテインは天然に見出され、実験室でもまた操作されている[31-35]。本願において用いられる用語「分裂インテイン」は、1つ以上のペプチド結合切断がN末端およびC末端アミノ酸配列の間に存在するいずれかのインテインを言い、その結果、N末端およびC末端配列が別個の分子になり、これらは、トランススプライシング反応について機能的であるインテインへと非共有結合的に再会合または再構成し得る。いずれかの触媒的に活性なインテインまたはそのフラグメントが、本発明の方法への使用のための分裂インテインを導出するために用いられ得る。例えば、一側面において、分裂インテインは真核生物インテインに由来し得る。別の側面において、分裂インテインは細菌インテインに由来し得る。別の側面において、分裂インテインは古細菌インテインに由来し得る。好ましくは、そのように導出された分裂インテインは、トランススプライシング反応を触媒することにとって必須のアミノ酸配列のみを所有するであろう。

本願において用いられる「N末端分裂インテイン(In)」は、トランススプライシング反応について機能的であるN末端アミノ酸配列を含むいずれかのインテイン配列を言う。Inは、それゆえに、トランススプライシングが生起するときにスプライスアウトされる配列をもまた含む。Inは、天然に存在するインテイン配列のN末端部分の改変である配列を含み得る。例えば、かかる追加のおよび/または変異した残基の包含がInをトランススプライシングにおいて非機能的にしない限り、Inは追加のアミノ酸残基および/または変異した残基を含み得る。好ましくは、追加のおよび/または変異した残基の包含は、Inのトランススプライシング活性を改善または増強する。

本願において用いられる「C末端分裂インテイン(Ic)」は、トランススプライシング反応について機能的であるC末端アミノ酸配列を含むいずれかのインテイン配列を言う。一側面において、Icは一続きの4から7アミノ酸残基を含み、これらの少なくとも4アミノ酸はそれが由来したインテイン最後のβ鎖からである。Icは、それゆえに、トランススプライシングが生起するときにスプライスアウトされる配列をもまた含む。Icは、天然に存在するインテイン配列のC末端部分の改変である配列を含み得る。例えば、かかる追加のおよび/または変異した残基の包含がInをトランススプライシングにおいて非機能的にしない限り、Icは追加のアミノ酸残基および/または変異した残基を含み得る。好ましくは、追加のおよび/または変異した残基の包含は、Icのトランススプライシング活性を改善または増強する。

本発明のいくつかの態様では、IcまたはInに連結されたペプチドは、とりわけ蛍光基、ビオチン、ポリエチレングリコール(PEG)、アミノ酸アナログ、非天然のアミノ酸、リン酸基、グリコシル基、放射性同位体標識、および医薬分子を包含する追加の化学的部分を含み得る。他の態様において、Icに連結されたペプチドは、とりわけケトン、アルデヒド、Cys残基、およびLys残基を包含する1つ以上の化学反応性基を含み得る。「インテインスプライシングポリペプチド(ISP)」が存在するときには、分裂インテインのNインテインおよびCインテインは非共有結合的に会合して活性なインテインを形成し、スプライシング反応を触媒し得る。本願において用いられる「インテインスプライシングポリペプチド(ISP)」は、Ic、In、または両方が分裂インテインから除去されるときに留まる分裂インテインのアミノ酸配列の部分を言う。ある態様において、InはISPを含む。別の態様では、IcはISPを含む。さらに別の態様では、ISPはInにもIcにも共有結合的に連結されていない別個のペプチドである。

分裂インテインは、ミニインテインの構造上に見出される-12の保存されたベータ鎖間の構造化されていないループまたは介在アミノ酸配列中に1つ以上の分裂部位を操作することによって、一続きのインテインから生出され得る[25-28]。分裂の生出が、タンパク質スプライシング活性が失われる十分な度合まではインテインの構造、特に構造化されたベータ鎖を遮断しないであろうという条件で、ベータ鎖間の領域内の分裂部位の位置のいくらかのフレキシビリティーが存在し得る。

タンパク質トランススプライシングでは、1つの前駆体タンパク質はNインテインによって後続されるNエクステインパーツからなり、別の前駆体タンパク質はCエクステインパーツによって後続されるCインテインからなり、トランススプライシング反応(一緒にNおよびCインテインによって触媒される)が2つのインテイン配列を切除、2つのエクステイン配列をペプチド結合によって連結する。酵素反応であるタンパク質トランススプライシングは、非常に低い(例えばマイクロモル)濃度のタンパク質で働き得、生理条件下において実行され得る。

[2]他のプログラム可能なヌクレアーゼ
本明細書に記載の種々の態様において、プライム編集因子はCas9タンパク質などのnapDNAbpを含む。これらのタンパク質は、それらがガイドRNA(または場合に応じてPEgRNA)と複合体化するようになることによって「プログラム可能」である。これは、gRNA(またはPEgRNA)のスペーサー部分に対して相補的である配列を所有し、かつ要求されるPAM配列をもまた所有するDNA上の標的部位へとCas9タンパク質をガイドする。しかしながら、ここで想定されるある態様において、napDNAbpは、異なる型のプログラム可能なタンパク質、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼまたは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)によって置換され得る。

図1Jは、napDNAbp(例えばSpCas9ニッカーゼ)をいずれかのプログラム可能なヌクレアーゼドメイン、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)によって置き換える本願において企図されるプライム編集のかかるバリエーションを図示する。そのため、好適なヌクレアーゼは必ずしも核酸標的化分子(例えばガイドRNA)によって「プログラム」されることを必要とせず、むしろ、DNA結合ドメイン、例えば特にヌクレアーゼの特異性を定めることによってプログラムされ得るということが企図される。ちょうどnapDNAbp部分によるプライム編集のように、かかる代替的なプログラム可能なヌクレアーゼは、標的DNAの1つの鎖のみがカットされるようにして改変されるということが好ましい。換言すると、プログラム可能なヌクレアーゼは好ましくはニッカーゼとして機能するべきである。ひとたびプログラム可能なヌクレアーゼが選択されると(例えば、ZFNまたはTALEN)、それから、それがプライム編集様機序に従って作動することを許すように、追加の機能性がシステム上に操作され得る。例えば、プログラム可能なヌクレアーゼは(例えば、化学的リンカーを介して)RNAまたはDNA伸長アームをそれにカップリングすることによって改変され得、伸長アームはプライマー結合部位(PBS)およびDNA合成鋳型を含む。プログラム可能なヌクレアーゼは(例えば、化学的またはアミノ酸リンカーを介して)ポリメラーゼにもまたカップリングされ得る。これの性質は、伸長アームがDNAまたはRNAであるかどうかに依存するであろう。RNA伸長アームのケースでは、ポリメラーゼはRNA依存性DNAポリメラーゼであり得る(例えば逆転写酵素)。DNA伸長アームのケースでは、ポリメラーゼはDNA依存性DNAポリメラーゼであり得る(例えば、Pol I、Pol II、もしくはPol IIIを包含する原核生物ポリメラーゼ、またはPol a、Pol b、Pol g、Pol d、Pol e、もしくはPol zを包含する真核生物ポリメラーゼ)。システムは、丸ごととしての反応を容易化するために、プログラム可能なヌクレアーゼへの融合体として追加またはトランスで追加される他の機能性をもまた包含し得る(例えば、(a)カットされた部位においてDNAをほどいて、プライマーとして利用可能な3’端を有するカットされた鎖を作るためのヘリカーゼ、(b)カットされた鎖上の内生鎖を除去することを助けて、合成された鎖による内生鎖の置き換えの方に反応を駆動するためのFEN1、または(c)非編集鎖の有利な細胞性修復によって合成修復の取り入れを駆動することを助け得る、対向する鎖上の第2部位ニックを生出するためのnCas9:gRNA複合体)。napDNAbpによるプライム編集と類縁の様式で、別様にプログラム可能なヌクレアーゼによるかかる複合体は、目当ての編集を持つDNAの新たに合成された置き換え鎖を合成し、それから永久的にDNAの標的部位上に組み入れるために用いられ得る。

好適な代替的なプログラム可能なヌクレアーゼは当該技術分野で周知であり、これらは、DNAの標的部位に選択的に結合するようにプログラムされ得る代替的なプライム編集因子システムを構築するために、napDNAbp:gRNA複合体の代わりに用いられ得る。かつ、これらは、ポリメラーゼとプライマー結合部位およびDNA合成鋳型を含むRNAまたはDNA伸長アームとを特定のニック部位へと共局在させるために、上に記載されている様式でさらに改変され得る。例えば、図1Jによって表されるとおり、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)が、プログラム可能なヌクレアーゼとして、本明細書に記載のプライム編集法および組成物に用いられ得る。TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合することによって生成される人工の制限酵素である。これらの試薬は効率的な、プログラム可能な、かつ特異的なDNA切断を可能化し、in situのゲノム編集のための強力なツールを表す。転写活性化因子様エフェクター(TALE)は、事実上いずれかのDNA配列に結合するように迅速に操作され得る。本願において用いられる用語TALENは幅広く、別のTALENからの補助なしに二本鎖DNAを切断し得るモノマーTALENを包含する。用語TALENは、同じ部位においてDNAを切断するために一緒に働くように操作されているTALENのペアの1つまたは両方のメンバーを言うためにもまた用いられる。一緒に働くTALENは左TALENおよび右TALENと言われ得る。これはDNAの掌性を参照している。U.S.Ser.No.12/965,590;U.S.Ser.No.13/426,991(U.S.Pat.No.8,450,471);U.S.Ser.No.13/427,040(U.S.Pat.No.8,440,431);U.S.Ser.No.13/427,137(U.S.Pat.No.8,440,432);およびU.S.Ser.No.13/738,381を見よ。これらの全てはそれらの全体が参照によって本願に組み込まれる。加えて、TALENはWO2015/027134、US 9,181,535、Boch et al.,“Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors”,Science,vol.326,pp.1509-1512(2009),Bogdanove et al.,TAL Effectors:Customizable Proteins for DNA Targeting,Science,vol.333,pp.1843-1846(2011),Cade et al.,“Highly efficient generation of heritable zebrafish gene mutations using homo- and heterodimeric TALENs”,Nucleic Acids Research,vol.40,pp.8001-8010(2012),およびCermak et al.,“Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting”,Nucleic Acids Research,vol.39,No.17,e82(2011)に記載されている。これらの夫々は参照によって本願に組み込まれる。

図1Jに表されているとおり、ジンクフィンガーヌクレアーゼもまた、プライム編集への使用のための代替的なプログラム可能なヌクレアーゼとして、Cas9ニッカーゼなどのnapDNAbpの代わりに用いられ得る。TALENのように、ZFNタンパク質は、それらがニッカーゼとして機能するようにして改変され得る。すなわち、本明細書に記載のプライム編集因子に用いられるnapDNAbpと類似の様式で、それが標的DNAの1つの鎖のみを切断するようにして、ZFNを操作する。ZFNタンパク質は、当該技術分野において、例えば、Carroll et al.,“Genome Engineering with Zinc-Finger Nucleases,”Genetics,Aug 2011,Vol.188:773-782;Durai et al.,“Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells,”Nucleic Acids Res,2005,Vol.33:5978-90;およびGaj et al.,“ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering,”Trends Biotechnol.2013,Vol.31:397-405(これらの各々はその全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に広範囲に記載されている。

[3]ポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)
種々の態様において、本明細書に開示のプライム編集因子(PE)システムはポリメラーゼ(例えば、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼ、例えば逆転写酵素)またはそのバリアントを包含し、これは、napDNAbpもしくは他のプログラム可能なヌクレアーゼとの融合タンパク質として提供またはトランスで提供され得る。

いずれかのポリメラーゼが、本明細書に開示のプライム編集因子に用いられ得る。ポリメラーゼは野生型ポリメラーゼ、機能的フラグメント、変異体、バリアント、または短縮されたバリアント、および同類であり得る。ポリメラーゼは、真核、原核、古細菌、もしくはウイルス生物からの野生型ポリメラーゼを包含し得、および/またはポリメラーゼは遺伝子工学、変異導入、指向性進化に基づくプロセスによって改変され得る。ポリメラーゼはT7 DNAポリメラーゼ、T5 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、KlenowフラグメントDNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIII、および同類を包含し得る。ポリメラーゼは熱安定性でもまたあり得、Taq、Tne、Tma、Pfu、Tfl、Tth、Stoffelフラグメント、VENT(登録商標)およびDEEPVENT(登録商標)DNAポリメラーゼ、KOD、Tgo、JDF3、ならびにそれらの変異体、バリアント、および誘導体を包含し得る(米国特許第5,436,149号;米国特許第4,889,818号;米国特許第4,965,185号;米国特許第5,079,352号;米国特許第5,614,365号;米国特許第5,374,553号;米国特許第5,270,179号;米国特許第5,047,342号;米国特許第5,512,462号;WO 92/06188;WO 92/06200;WO 96/10640;Barnes,W.M.,Gene 112:29-35(1992);Lawyer,F.C.,et al.,PCR Meth. Appl.2:275-287(1993);Flaman,J.-M,et al.,Nuc.Acids Res.22(15):3259-3260(1994)(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)を参照)。より長い核酸分子(例えば、長さが約3-5Kbよりも長い核酸分子)の合成には、少なくとも2つのDNAポリメラーゼが使用され得る。ある態様において、ポリメラーゼの1つは3'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠き得、他は3'エキソヌクレアーゼ活性を有し得る。かかるペアリングは同じかまたは異なるポリメラーゼを包含し得る。3'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くDNAポリメラーゼの例は、Taq、Tne(exo-)、Tma(exo-)、Pfu(exo-)、Pwo(exo-)、exo-KOD、およびTth DNAポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、バリアント、および誘導体を包含するが、これらに限定されない。

好ましくは、本明細書に開示のプライム編集因子に使用可能なポリメラーゼは「鋳型依存性」ポリメラーゼである(なぜなら、ポリメラーゼは、プライム編集の間に合成中のDNA鎖の配列を規定するためにはDNA合成鋳型に依拠することを意図されるからである。本願において用いられる用語「鋳型DNA分子」は、相補的な核酸鎖がDNAポリメラーゼによって例えばPEgRNAのDNA合成鋳型のプライマー伸長反応によってそれから合成される核酸の鎖を言う。

本願において用いられる用語「鋳型依存的様式」は、プライマー分子の鋳型依存的伸長(例えば、DNAポリメラーゼによるDNA合成)が関わるプロセスを言うことを意図される。用語「鋳型依存的様式」は、ポリヌクレオチドの新たに合成される鎖の配列が相補的な塩基対形成の周知のルールによって記述されるRNAまたはDNAのポリヌクレオチド合成を言う(例えば、Watson,J.D.et al.,In:Molecular Biology of the Gene,4th Ed.,W.A.Benjamin,Inc.,Menlo Park,Calif.(1987)を見よ)。用語「相補的」は、塩基対形成による2つのポリヌクレオチド鎖の領域間のまたは2つのヌクレオチド間の配列相補性の幅広い概念を言う。アデニンヌクレオチドは、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特異的な水素結合を形成する(「塩基対形成する」)ことができるということが公知である。類似に、シトシンヌクレオチドは、グアニンヌクレオチドと塩基対形成することができるということが公知である。そのため、プライム編集のケースでは、DNA合成鋳型に対してプライム編集因子のポリメラーゼによって合成されるDNAの一本鎖は、DNA合成鋳型の配列に対して「相補的」であると言われるということが言われ得る。

A．例示のポリメラーゼ
種々の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子はポリメラーゼを含む。本開示は、いずれかの天然に存在する生物もしくはウイルスから得られるか、または市販のもしくは非市販のソースから得られるいずれかの野生型ポリメラーゼを企図する。加えて、本開示のプライム編集因子に使用可能なポリメラーゼは、いずれかの天然に存在する変異体ポリメラーゼ、操作された変異体ポリメラーゼ、または他のバリアントポリメラーゼを包含し得、機能を保持する短縮されたバリアントを包含する。本願において使用可能なポリメラーゼは、特定のアミノ酸置換、例えば具体的に本明細書に開示のものを含有するようにもまた操作され得る。ある種の好ましい態様では、本開示のプライム編集因子に使用可能なポリメラーゼは、鋳型に基づくポリメラーゼである。すなわち、それらは鋳型依存的な様式でヌクレオチド配列を合成する。

ポリメラーゼは、本明細書に記載のプライム編集因子システムに関して用いられ得る、ヌクレオチド鎖を合成する酵素である。ポリメラーゼは好ましくは「鋳型依存性」ポリメラーゼである(すなわち、鋳型鎖のヌクレオチド塩基の順序に基づいてヌクレオチド鎖を合成するポリメラーゼ)。ある種の構成では、ポリメラーゼは「鋳型非依存性」でもまたあり得る(すなわち、鋳型鎖の要件なしにヌクレオチド鎖を合成するポリメラーゼ)。ポリメラーゼはさらに「DNAポリメラーゼ」または「RNAポリメラーゼ」としてもまた類別され得る。種々の態様において、プライム編集因子システムはDNAポリメラーゼを含む。種々の態様において、DNAポリメラーゼは「DNA依存性DNAポリメラーゼ」であり得る(すなわち、これによると、鋳型分子はDNAの鎖である)。かかるケースでは、DNA鋳型分子はPEgRNAであり得、伸長アームはDNAの鎖を含む。かかるケースでは、PEgRNAはキメラまたはハイブリッドPEgRNAともまた言われ得、これがRNA部分(すなわち、スペーサーおよびgRNAコアを包含するガイドRNA構成要素)およびDNA部分(すなわち、伸長アーム)を含む。種々の他の態様において、DNAポリメラーゼは「RNA依存性DNAポリメラーゼ」であり得る(すなわち、これによると、鋳型分子はRNAの鎖である)。かかるケースでは、PEgRNAはRNAであり、すなわちRNA伸長を包含する。用語「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素をもまた言い得る(すなわち、ポリメラーゼ活性)。一般的に、酵素は、ポリヌクレオチド鋳型配列にアニーリングしたプライマー(例えば、例えば、PEgRNAのプライマー結合部位にアニーリングしたプライマー配列)の3'端において合成を開始し、鋳型鎖の5'端の方へ進むであろう。「DNAポリメラーゼ」はデオキシヌクレオチドの重合を触媒する。DNAポリメラーゼを参照して本願において用いられる用語DNAポリメラーゼは、「その機能的フラグメント」を包含する。「その機能的フラグメント」は、少なくとも1つのセットの条件下においてポリヌクレオチドの重合を触媒する能力を保持する、ポリメラーゼのアミノ酸配列全体未満を包摂する野生型または変異体DNAポリメラーゼのいずれかの部分を言う。かかる機能的フラグメントは別個の実体として存在し得るか、またはそれは融合タンパク質などのより大きいポリペプチドの構成成分であり得る。

いくつかの態様では、ポリメラーゼはバクテリオファージからであり得る。バクテリオファージDNAポリメラーゼは5'から3'のエキソヌクレアーゼ活性を一般的に欠いている。なぜなら、この活性は別個のポリペプチドによってコードされるからである。好適なDNAポリメラーゼの例はT4、T7、およびファイ29 DNAポリメラーゼである。市販で利用可能な酵素は:T4(多くのソース、例えばEpicentreから利用可能)およびT7(多くのソース、例えば未改変についてはEpicentreおよび3'から5'のエキソT7「Sequenase」DNAポリメラーゼについてはUSBから利用可能)である。

他の態様、ポリメラーゼは古細菌ポリメラーゼである。古細菌において同定されているDNAポリメラーゼの2つの異なるクラスがある:1．ファミリーB/pol I型(Pyrococcus furiosusからのPfuのホモログ)および2．pol II型(P.furiosus DP1/DP2 2サブユニットポリメラーゼのホモログ)である。両方のクラスからのDNAポリメラーゼは、関連する5'から3'のエキソヌクレアーゼ活性を天然に欠くことと、3'から5'のエキソヌクレアーゼ(プルーフリーディング)活性を所有することとが示されている。好適なDNAポリメラーゼ(pol Iまたはpol II)は、所望のアッセイ温度に類似である最適な成長温度を有する古細菌に由来し得る。

熱安定性古細菌DNAポリメラーゼはPyrococcus種(furiosus、sp. GB-D、woesii、abysii、horikoshii)、Thermococcus種(kodakaraensis KOD1、litoralis、sp.9 degrees North-7、sp. JDF-3、gorgonarius)、Pyrodictium occultum、およびArchaeoglobus fulgidusから単離される。

ポリメラーゼはユーバクテリウム種からでもまたあり得る。ユーバクテリウムDNAポリメラーゼの3つのクラス、pol I、II、およびIIIがある。Pol I DNAポリメラーゼファミリーの酵素は5'から3'のエキソヌクレアーゼ活性を所有し、ある種のメンバーは3'から5'のエキソヌクレアーゼ活性をもまた発揮する。Pol II DNAポリメラーゼは5'から3'のエキソヌクレアーゼ活性を天然に欠くが、3'から5'のエキソヌクレアーゼ活性は発揮する。Pol III DNAポリメラーゼは細胞の主要な複製DNAポリメラーゼを表し、複数のサブユニットから成る。pol III触媒サブユニットは5'から3'のエキソヌクレアーゼ活性を欠くが、いくつかのケースでは、3'から5'のエキソヌクレアーゼ活性が同じポリペプチド上に位置付けられる。

種々の市販で利用可能なPol I DNAポリメラーゼがあり、これらのいくつかは5'から3'のエキソヌクレアーゼ活性を縮減または廃止するように改変されている。

好適な熱安定性pol I DNAポリメラーゼは、Thermus種およびThermotoga maritima、例えばThermus aquaticus(Taq)、Thermus thermophilus(Tth)、およびThermotoga maritima(Tma UlTma)を包含する種々の好熱ユーバクテリウムから単離され得る。

上に列記されているものに関係する追加のユーバクテリウムはThermophilic Bacteria(Kristjansson, J. K., ed.) CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1992に記載されている。

本発明は、さらに、米国特許第5,677,152号、第6,479,264号、および第6,183,998号に開示されている方法に従って化学的に改変されているキメラまたは非キメラDNAポリメラーゼを可能にする。これらの内容はそれらの全体が参照によってここに組み込まれる。

上に列記されているものに関係する追加の古細菌DNAポリメラーゼは次の参照に記載されている:Archaea:A Laboratory Manual(Robb,F.T. and Place,A.R.,eds.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1995およびThermophilic Bacteria(Kristjansson,J.K.,ed.)CRC Press,Inc.,Boca Raton,Fla.,1992。

B．例示の逆転写酵素
種々の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子はポリメラーゼとして逆転写酵素を含む。本開示は、いずれかの天然に存在する生物もしくはウイルスから得られるかまたは市販のもしくは非市販のソースから得られるいずれかの野生型逆転写酵素を企図する。加えて、本開示のプライム編集因子に使用可能な逆転写酵素は、いずれかの天然に存在する変異体RT、操作された変異体RT、または他のバリアントRTを包含し得、機能を保持する短縮されたバリアントを包含する。RTは、特定のアミノ酸置換、例えば具体的に本明細書に開示のものを含有するようにもまた操作され得る。

逆転写酵素は多機能酵素であり、典型的には、RNAおよびDNA依存性DNA重合活性、ならびにRNA-DNAハイブリッド中のRNAの切断を触媒するRNaseH活性を包含する3つの酵素活性を有する。逆転写酵素のいくつかの変異体は、mRNAの意図されない損傷を防止するためにRNaseH部分を不能化している。mRNAを鋳型として用いて相補的なDNA(cDNA)を合成するこれらの酵素は、RNAウイルスにおいて最初に同定された。爾後に、逆転写酵素は直接的にウイルス粒子、細胞、または組織から単離および精製された(例として、Kacian et al.,1971,Biochim. Biophys.Acta 46:365-83;Yang et al.,1972,Biochem.Biophys.Res.Comm.47:505-11;Gerard et al.,1975,J.Virol.15:785-97;Liu et al.,1977,Arch.Virol.55 187-200;Kato et al.,1984,J.Virol.Methods 9:325-39;Luke et al.,1990,Biochem.29:1764-69およびLe Grice et al.,1991,J.Virol.65:7004-07(これらの各々は参照により組み込まれる)を参照)。より最近では、改善された特性、例えば熱安定性、忠実性、および活性を求めて、変異体および融合タンパク質が生出されている。当該技術分野で公知であるかまたは当該技術分野で公知の方法を用いて作られ得る逆転写酵素の野生型、バリアント、および/または変異体形態のいずれかは、本願において企図される。

逆転写酵素(RT)遺伝子(またはそれに含有される遺伝情報)はいくつもの異なるソースから得られ得る。例えば、遺伝子は、レトロウイルスに感染している真核細胞から、またはレトロウイルスゲノム全体もしくはそれの部分どちらかを含有するいくつものプラスミドから得られ得る。加えて、RT遺伝子を含有するメッセンジャーRNA様のRNAがレトロウイルスから得られ得る。RTのソースの例は、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLVまたはMLVRT);ヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV-1);ウシ白血病ウイルス(BLV);ラウス肉腫ウイルス(RSV);ヒト免疫不全ウイルス(HIV);Saccharomycesを包含する酵母、Neurospora、Drosophila;霊長類;および齧歯類を包含するが、これらに限定されない。例えば、Weiss,et al.,米国特許第4,663,290号(1987);Gerard,G.R.,DNA:271-79(1986);Kotewicz,M.L.,et al.,Gene 35:249-58(1985);Tanese,N.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA):4944-48(1985);Roth,M.J.,at al.,J.Biol.Chem.260:9326-35(1985);Michel,F.,et al.,Nature 316:641-43(1985);Akins,R.A.,et al.,Cell 47:505-16(1986),EMBO J.4:1267-75(1985);およびFawcett,D.F.,Cell 47:1007-15(1986)(これらの各々はその全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)を参照。

野生型RT
本明細書に開示のプライム編集因子による使用のための例示の酵素は、M-MLV逆転写酵素およびRSV逆転写酵素を包含し得るが、これらに限定されない。逆転写酵素活性を有する酵素は市販で利用可能である。ある態様において、逆転写酵素は、プライム編集因子(PE)システムの他の構成要素に対してトランスで提供される。つまり、逆転写酵素は、個々の構成要素として、すなわちnapDNAbpとの融合タンパク質としてではなく、発現または別様に提供される。

当業者は、野生型逆転写酵素が(モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV);ヒト免疫不全ウイルス(HIV)逆転写酵素、およびトリ白血病・肉腫ウイルス(ASLV)逆転写酵素を包含するが、これらに限定されず、これはラウス肉腫ウイルス(RSV)逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)逆転写酵素、トリ赤芽球症ウイルス(AEV)ヘルパーウイルスMCAV逆転写酵素、トリ骨髄球腫症ウイルスMC29ヘルパーウイルスMCAV逆転写酵素、トリ細網内皮症ウイルス(REV-T)ヘルパーウイルスREV-A逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスUR2ヘルパーウイルスUR2AV逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスY73ヘルパーウイルスYAV逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス(RAV)逆転写酵素、および骨髄芽球症ウイルス随伴ウイルス(MAV)逆転写酵素を包含するが、これらに限定されない)、本明細書に記載の対象の方法および組成物に好適に用いられ得るということを認識するであろう。

例示の野生型RT酵素は次のとおりである:

バリアントおよびエラーを起こしやすいRT
逆転写酵素は、相補的なDNA(cDNA)鎖をRNA鋳型から合成することにとって必須である。逆転写酵素は、異なる生化学的活性を発揮する別物のドメインから成る酵素である。酵素は次のとおりRNA鋳型からのDNAの合成を触媒する:アニーリングしたプライマーの存在下において、逆転写酵素はRNA鋳型に結合し、重合反応を開始する。RNA依存性DNAポリメラーゼ活性が相補的なDNA(cDNA)鎖を合成し、dNTPを組み込む。RNase H活性がDNA:RNA複合体のRNA鋳型を分解する。それゆえに、逆転写酵素は、(a)RNA/DNAハイブリッドを認識および結合する結合活性、(b)RNA依存性DNAポリメラーゼ活性、および(c)RNase H活性を含む。加えて、逆転写酵素は、一般的に、それらの熱安定性、処理能力(dNTP組み込みの速度)、および忠実性(またはエラー率)を包含する種々の属性を有すると見なされる。本願において企図される逆転写酵素バリアントは、これらの酵素活性(例えば、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性、RNase H活性、またはDNA/RNAハイブリッド結合活性)または酵素特性(例えば、熱安定性、処理能力、または忠実性)のいずれか1つ以上にインパクトを及ぼすかまたは変化させる、逆転写酵素のいずれかの変異を包含し得る。かかるバリアントは、当該技術分野においてパブリックドメインにおいて利用可能、市販で利用可能であり得るか、または指向性進化プロセス(例えば、PACEまたはPANCE)を包含する変異導入の公知の方法を用いて作られ得る。

種々の態様において、逆転写酵素はバリアント逆転写酵素であり得る。本願において用いられる「バリアント逆転写酵素」は、参照配列(例えば、参照野生型配列)に対して相対的に1つ以上の変異(単数の変異、逆位、欠失、挿入、および再構成を包含する)を含む、いずれかの天然に存在するかまたは遺伝子操作されたバリアントを包含する。RTは、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性、リボヌクレアーゼH活性、およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を包含するいくつかの活性を天然に有する。集合的に、これらの活性は酵素が一本鎖RNAを二本鎖cDNAへと変換することを可能化する。レトロウイルスおよびレトロトランスポゾンでは、このcDNAはそれからホストゲノム上に取り入れし得、これから新たなRNAのコピーがホスト細胞転写によって作られ得る。バリアントRTは、これらの活性の1つ以上にインパクトを及ぼす変異を含み得る(これはこれらの活性を縮減もしくは増大させるか、またはこれはこれらの活性をすっかり消去するかどちらかである)。加えて、バリアントRTは、RTを多かれ少なかれ安定に、凝集をよりしにくくし、精製および/もしくは検出を容易化する1つ以上の変異、ならびに/または特性もしくは特徴の他の(other the)改変を含み得る。

当業者は、他の逆転写酵素(モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV);ヒト免疫不全ウイルス(HIV)逆転写酵素、およびトリ白血病・肉腫ウイルス(ASLV)逆転写酵素を包含するが、これらに限定されず、これはラウス肉腫ウイルス(RSV)逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)逆転写酵素、トリ赤芽球症ウイルス(AEV)ヘルパーウイルスMCAV逆転写酵素、トリ骨髄球腫症ウイルスMC29ヘルパーウイルスMCAV逆転写酵素、トリ細網内皮症ウイルス(REV-T)ヘルパーウイルスREV-A逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスUR2ヘルパーウイルスUR2AV逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスY73ヘルパーウイルスYAV逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス(RAV)逆転写酵素、および骨髄芽球症関連ウイルス(MAV)逆転写酵素を包含するが、これらに限定されない)に由来するバリアント逆転写酵素が、本明細書に記載の対象の方法および組成物に好適に用いられ得るということを認識するであろう。

バリアントRTを調製する1つの方法は、遺伝子改変によって(例えば、野生型逆転写酵素のDNA配列を改変することによって)である。DNA配列のランダムなおよび標的化された変異を許すいくつもの方法が当該技術分野において公知である(例えば、Ausubel et.al.Short Protocols in Molecular Biology(1995)3.sup.rd Ed.John Wiley & Sons,Inc.を見よ)。加えて、従来のおよびPCRに基づく方法両方を包含する部位特異的変異導入のためのいくつもの市販で利用可能なキットがある。例は、QuikChange部位特異的変異導入キット(AGILENT(登録商標))、Q5(登録商標)部位特異的変異導入キット(NEW ENGLAND BIOLABS(登録商標))、およびGeneArt(商標)部位特異的変異導入システム(THERMOFISHER SCIENTIFIC(登録商標))を包含する。

加えて、変異体逆転写酵素が、挿入変異または短縮(N末端の、内部の、またはC末端の挿入または短縮)によって当業者に公知の方法論に従って生成され得る。本願において用いられる用語「変異」は、別の残基によるある配列、例えば核酸もしくはアミノ酸配列上の残基の置換、またはある配列上の1つ以上の残基の欠失もしくは挿入を言う。変異は、典型的には、元々の残基、次に配列上の残基の位置および新たに置換された残基のアイデンティティーを同定することによって本明細書に記載の。本願において提供されるアミノ酸置換(変異)を作るための種々の方法が当該技術分野において周知であり、例えばGreen and Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012))によって提供される。変異は種々のカテゴリー、例えば1塩基多型、微小重複領域、インデル、および逆位を包含し得、決して限定することを意味されない。変異は、タンパク質活性を縮減または廃止する変異の正常の結果である「機能喪失」変異を包含し得る。ほとんどの機能喪失変異は劣性である。なぜなら、ヘテロ接合体では、第2の染色体コピーが完全に機能的なタンパク質をコードする遺伝子の未変異のバージョンを持ち、この存在が変異の効果を補償するからである。変異は、「機能獲得」変異をもまた包摂する。これは、正常な条件下ではさもなければ存在しない異常な活性をタンパク質または細胞に付与するものである。多くの機能獲得変異はコード領域よりもむしろ制御配列にあり、よって、いくつもの帰結を有し得る。例えば、変異は、1つ以上の遺伝子が間違った組織において発現されることに至り得、これらの組織は、それらが正常では欠く機能を獲得する。それらの性質ゆえに、機能獲得変異は通常は優性である。

当該技術分野で公知の部位特異的変異導入のより古い方法は、一本鎖DNA鋳型の単離を許すM13バクテリオファージベクターなどのベクター上への変異させられるべき配列のサブクローニングに依拠する。これらの方法では、変異誘発プライマー(すなわち、変異させられるべき部位にアニールすることができるが、変異させられるべき部位に1つ以上のミスマッチのヌクレオチドを持つプライマー)を一本鎖鋳型にアニーリングさせ、それから、変異誘発プライマーの3'端からスタートして鋳型の相補体を重合する。それから、もたらされた二重鎖はホスト細菌に形質転換され、プラークが所望の変異についてスクリーニングされる。

より最近では、部位特異的変異導入がPCR方法論を使用している。これらは一本鎖鋳型を要求しないという利点を有する。加えて、サブクローニングを要求しない方法が開発されている。PCRに基づく部位特異的変異導入が行われるときには、いくつかのイシューが考慮されなければならない。第1に、これらの方法では、ポリメラーゼによって導入される望まれない変異の拡張を防止するために、PCRサイクル数を縮減することが望ましい。第2に、反応中に残存する変異していない親の分子の数を縮減するために、セレクションが使用されなければならない。第3に、単一のPCRプライマーセットの使用を許すために、伸長された長さのPCR法が好ましい。そして第4に、いくつかの熱安定性ポリメラーゼの非鋳型依存的な末端伸長活性ゆえに、多くの場合には、PCRによって生成された変異体産物の平滑末端ライゲーションに先行して、端を磨くステップを手続きに組み込むことが必要である。

ランダム変異導入の方法が当該技術分野に存在し、これらは1つ以上のランダムに所在する変異を持つ変異体のパネルをもたらすであろう。それから、変異体のかかるパネルは、所望の特性、例えば野生型逆転写酵素に対して相対的に増大した安定性を発揮するものについてスクリーニングされ得る。

ランダムな変異導入のための方法の例はいわゆる「エラーを起こしやすいPCR法」である。名称が含意するとおり、方法は、DNAポリメラーゼが高忠実性組み込みを支持しない条件下において所与の配列を増幅する。エラーを起こしやすい組み込みを促す条件は異なるDNAポリメラーゼについて変わるが、当業者は所与の酵素についてかかる条件を決定し得る。増幅の忠実性においての多くのDNAポリメラーゼの鍵の変数は、例えば緩衝液中の二価金属イオンの型および濃度である。よって、マンガンイオンの使用および/またはマグネシウムもしくはマンガンイオン濃度のバリエーションが、ポリメラーゼのエラー率に影響するように適用され得る。

種々の側面では、プライム編集因子のRTは「エラーを起こしやすい」逆転写酵素バリアントであり得る。当該技術分野において公知および/または利用可能であるエラーを起こしやすい逆転写酵素が用いられ得る。逆転写酵素は天然にはいずれかのプルーフリーディング機能を有さず;それゆえに、逆転写酵素のエラー率はプルーフリーディング活性を含むDNAポリメラーゼよりも一般的に高いということは了解されるであろう。いずれかの具体的な逆転写酵素のエラー率は酵素の「忠実性」の特性であり、これはそのRNA鋳型に対してDNAの鋳型によって導かれる重合の正確度を表す。高忠実性を有するRTは低いエラー率を有する。反対に、低い忠実性を有するRTは高いエラー率を有する。M-MLVに基づく逆転写酵素の忠実性は、合成される15,000から27,000ヌクレオチドに1エラーの範囲のエラー率を有することが報告される。Boutabout et al.,“DNA synthesis fidelity by the reverse transcriptase of the yeast retrotransposon Ty1,”Nucleic Acids Res,2001,29:2217-2222を見よ。これは参照によって組み込まれる。それゆえに、この適用の目的には、「エラーを起こしやすい」であると考慮されるかまたは「エラーを起こしやすい忠実性」を有すると考慮される逆転写酵素は、合成される15,000ヌクレオチドに1つのエラー未満であるエラー率を有するものである。

エラーを起こしやすい逆転写酵素は、出発RT酵素(例えば、野生型M-MLV RT)の変異導入によってもまた生出され得る。変異導入の方法は限定されず、指向性進化プロセス、例えばファージによって補助される連続的進化(PACE)またはファージによって補助される非連続的進化(PANCE)を包含し得る。本願において用いられる用語「ファージによって補助される連続的進化(PACE)」は、ファージをウイルスベクターとして使用する連続的進化を言う。PACEテクノロジーの一般概念は、例えば、2010年3月11日にWO2010/028347として公開された2009年9月8日出願の国際PCT出願PCT/US2009/056194;2012年6月28日にWO2012/088381として公開された2011年12月22日出願の国際PCT出願PCT/US2011/066747;2015年5月5日登録のU.S.出願U.S.特許No.9,023,594、2015年9月11日にWO2015/134121として公開された2015年1月20日出願の国際PCT出願PCT/US2015/012022、および2016年10月20日にWO2016/168631として公開された2016年4月15日出願の国際PCT出願PCT/US2016/027795に記載されている。これらの夫々の内容全体は参照によって本願に組み込まれる。

エラーを起こしやすい逆転写酵素は、「ファージによって補助される非連続的進化(PANCE)」によってもまた得られ得る。本願において用いられるこれは、ファージをウイルスベクターとして使用する非連続的進化を言う。PANCEは急速なインビボの指向性進化のための単純化された技術であり、新しいE.coliホスト細胞による進化させられるべき目当ての遺伝子を含有する進化する「セレクションファージ」(SP)の連続フラスコ植え継ぎを用い、それによって、ホストE.coli内の遺伝子が一定に保たれることを許しながら、SPに含有される遺伝子は連続的に進化する。連続フラスコ植え継ぎは微生物の実験室進化のための広くアクセス可能なアプローチとして長く用をなしており、より最近では、バクテリオファージ進化のための類縁のアプローチが開発されている。PANCEシステムはPACEシステムよりも低いストリンジェンシーを特色とする。

他のエラーを起こしやすい逆転写酵素が文献に記載されている。これらの夫々は本願の方法および組成物への使用を企図される。例えば、エラーを起こしやすい逆転写酵素は、Bebenek et al.,“Error-prone Polymerization by HIV-1 Reverse Transcriptase,”J Biol Chem,1993,Vol.268:10324-10334およびSebastian-Martin et al.,“Transcriptional inaccuracy threshold attenuates differences in RNA-dependent DNA synthesis fidelity between retroviral reverse transcriptases,”Scientific Reports,2018,Vol.8:627に記載されている。これらの夫々は参照によって組み込まれる。なお、さらに、エラーを起こしやすい逆転写酵素を包含する逆転写酵素は市販のサプライヤーから得られ得、全てNEW ENGLAND BIOLABS(登録商標)からのProtoScript(登録商標)(II)逆転写酵素、AMV逆転写酵素、WarmStart(登録商標)逆転写酵素、およびM-MuLV逆転写酵素、または全てTAKARA BIO USA,INC.(以前はCLONTECH)からのAMV逆転写酵素XL、SMARTScribe逆転写酵素、GPRウルトラピュアMMLV逆転写酵素を包含する。

本願の開示はRNaseHドメインに変異を有する逆転写酵素をもまた企図する。上で言及されているとおり、逆転写酵素の本来的な特性の1つはRNase H活性であり、これはRNA:cDNAハイブリッドのRNA鋳型を重合と同時的に切断する。RNA鋳型が全長の逆転写の完了前に分解され得るので、RNase H活性は長いcDNAの合成にとっては望ましくなくあり得る。おそらくは酵素のポリメラーゼ活性とのその競合を原因として、RNase H活性は逆転写効率をもまた低下させ得る。それゆえに、本開示は改変されたRNaseH活性を含むいずれかの逆転写酵素バリアントを企図する。

本願の開示は、RNA依存性DNAポリメラーゼドメインに変異を有する逆転写酵素をもまた企図する。上で言及されているとおり、逆転写酵素の本来的な特性の1つはRNA依存性DNAポリメラーゼ活性である。これは、RNA:cDNAハイブリッドの鋳型RNA鎖によってコードされる新生cDNA鎖に核酸塩基を組み込む。RNA依存性DNAポリメラーゼ活性は、酵素の処理能力を増大させるかまたは減少させるかどちらかのために(すなわち、その組み込み速度の観点から)増大または減少させられ得る。それゆえに、本開示は、酵素の処理能力が(of)未改変のバージョンに対して相対的に増大させられるかまたは減少させられるかどちらかのようにして、改変されたRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むいずれかの逆転写酵素バリアントを企図する。

変改された熱安定性特徴を有する逆転写酵素バリアントもまた本願において企図される。逆転写酵素が高い温度に耐える能力はcDNA合成の重要な側面である。上昇した反応温度は、強い二次構造および/または高いGC含量を有するRNAを変性することを助け、逆転写酵素が配列を読み通すことを許す。結果として、より高い温度における逆転写は全長cDNA合成およびより高い収量を可能化し、これはプライム編集プロセスの結果としての3'フラップssDNAの改善された生成に至り得る。野生型M-MLV逆転写酵素は典型的には37-48℃の範囲に至適温度を有する;しかしながら、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、およびより高くを包含する48℃超のより高い温度において逆転写活性を許す変異が導入され得る。

エラーを起こしやすいRT、熱安定性RT、処理能力増大RTを包含する本願において企図されるバリアント逆転写酵素は、変異導入または進化プロセスを包含する種々のルーチン戦略によって操作され得る。いくつかのケースでは、バリアントは単一の変異を導入することによって生じ得る。他のケースでは、バリアントは1つよりも多くの変異を要求し得る。1つよりも多くの変異を含む変異体では、所与の変異の効果は、具体的な変異体によって持たれる他の変異からは単離して、部位特異的変異導入による野生型遺伝子への同定された変異の導入によって評価され得る。それから、それゆえに生じた一重変異体のスクリーニングアッセイは、その変異単独の効果の決定を許すであろう。

本願において用いられるバリアントRT酵素は、本願において開示もしくは企図されるかまたは当該技術分野で公知のいずれかの野生型RTまたは変異体RTまたはフラグメントRTまたはRTの他のバリアントを包含するいずれかの参照RTタンパク質と少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、または少なくとも約99.9％同一である他の「RTバリアント」をもまた包含し得る。

いくつかの態様では、RTバリアントは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、または最高で100、または最高で200、または最高で300、または最高で400、または最高で500、またはより多くのアミノ酸変化を、参照RTと比較して有し得る。いくつかの態様では、フラグメントが参照RTの対応するフラグメントと少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、または少なくとも約99.9％同一であるようにして、RTバリアントは参照RTのフラグメントを含む。いくつかの態様では、フラグメントは、対応する野生型RT(M-MLV逆転写酵素)(例えば、配列番号89)または配列番号90-100の逆転写酵素のいずれかのアミノ酸長さの少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％である。

いくつかの態様では、本開示は、それらの機能性を保持し、かついずれかの本明細書に開示のRTタンパク質のフラグメントであるRTフラグメントをもまた利用し得る。いくつかの態様では、RTフラグメントは長さが少なくとも100アミノ酸である。いくつかの態様では、フラグメントは長さが少なくとも100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、もしくは最高で600、またはより多くのアミノ酸である。

なお他の態様において、本開示は、N末端もしくはC末端または両方がある種のアミノ酸数だけ短縮されているRTバリアントをもまた利用し得、これは、なお十分なポリメラーゼ機能を保持する短縮バリアントをもたらす。いくつかの態様では、RT短縮バリアントは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、または250アミノ酸の短縮を、タンパク質のN末端の端に有する。他の態様において、RT短縮バリアントは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、または250アミノ酸の短縮を、タンパク質のC末端の端に有する。なお他の態様において、RT短縮バリアントは同じかまたは異なる長さである短縮をN末端およびC末端の端に有する。

例えば、本明細書に開示のプライム編集因子は、M-MLV逆転写酵素の短縮されたバージョンを包含し得る。この態様では、逆転写酵素は4つの変異を含有する(D200N、T306K、W313F、T330P;PE2に存在するL603W変異は短縮を原因としてもはや存在しないということに注意)。この短縮された編集因子をコードするDNA配列は、PE2よりも522bp小さく、よって、DNA配列の送達がそのサイズを原因として難しい適用(すなわち、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルス送達)にとってそれを可能性として有用にする。この態様はMMLV-RT(trunc)と言われ、次のアミノ酸配列を有する:

種々の態様において、本明細書に開示のプライム編集因子は、本明細書に記載のRTバリアントの1つ、またはいずれかの参照Cas9バリアントと少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、または少なくとも約99.9％同一であるそのRTバリアントを含み得る。

なお他の態様において、本方法および組成物は、Effefson et al.,“Synthetic evolutionary origin of a proofreading reverse transcriptase,”Science,June 24,2016,Vol.352:1590-1593に記載されているとおり、逆転写酵素へと進化させられたDNAポリメラーゼを利用し得る。これの内容は参照によって本願に組み込まれる。

ある種の他の態様において、逆転写酵素は、napDNAbpをもまた含む融合タンパク質の構成要素として提供される。換言すると、いくつかの態様では、逆転写酵素は融合タンパク質としてnapDNAbpに融合される。

種々の態様において、バリアント逆転写酵素は配列番号89によって表される野生型M-MLV逆転写酵素から操作され得る。

種々の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、次の変異の1つ以上を含むバリアントRTを包含し得る:配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるP51L、S67K、E69K、L139P、T197A、D200N、H204R、F209N、E302K、E302R、T306K、F309N、W313F、T330P、L345G、L435G、N454K、D524G、E562Q、D583N、H594Q、L603W、E607K、またはD653N。

本開示の種々の態様に従ってnapDNAbpタンパク質に融合または個々のタンパク質として提供され得るいくつかの例示の逆転写酵素が、下で提供される。例示の逆転写酵素は、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％配列同一性を次の野生型酵素または部分的な酵素に対して有するバリアントを包含する:

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、次の変異の1つ以上を含むバリアントRTを包含し得る:配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるP51X、S67X、E69X、L139X、T197X、D200X、H204X、F209X、E302X、T306X、F309X、W313X、T330X、L345X、L435X、N454X、D524X、E562X、D583X、H594X、L603X、E607X、またはD653Xであって、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるP51X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはLである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるS67X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはKである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるE69X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはKである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるL139X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはPである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるT197X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはAである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるD200X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはNである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるH204X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはRである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるF209X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはNである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるE302X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはKである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるE302X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはRである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるT306X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはKである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるF309X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはNである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるW313X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはFである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるT330X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはPである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるL345X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはGである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるL435X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはGである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるN454X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはKである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるD524X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはGである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるE562X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはQである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるD583X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはNである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるH594X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはQである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるL603X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはWである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるE607X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはKである。

種々の他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子(RTが融合パートナーとしてまたはトランスでどちらかで提供される)は、配列番号89の野生型M-MLV RTにおけるまたは別の野生型RTポリペプチド配列上の対応するアミノ酸位置におけるD653X変異を含むバリアントRTを包含し得、「X」はいずれかのアミノ酸であり得る。ある態様において、XはNである。

本開示の種々の態様に従ってnapDNAbpタンパク質に融合または個々のタンパク質として提供され得るいくつかの例示の逆転写酵素が、下で提供される。例示の逆転写酵素は、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％配列同一性を次の野生型酵素または部分的な酵素に対して有するバリアントを包含する:

ここに記載されるプライム編集因子(PE)システムは、次の米国特許(これらの夫々はそれらの全体が参照によって組み込まれる):米国特許第10,202,658号;第10,189,831号;第10,150,955号;第9,932,567号;第9,783,791号;第9,580,698号;第9,534,201号;および第9,458,484号のいずれかに記載または開示されているいずれかの公に利用可能な逆転写酵素と、変異を組み入れるための公知の方法またはタンパク質を進化させるための公知の方法を用いて作られ得るそのいずれかのバリアントとを企図する。次の参照は当該技術分野の逆転写酵素を記載する。それらの開示の夫々はそれらの全体が参照によって本願に組み込まれる。

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逆転写酵素に関する上に記されている参照のいずれかは、すでにそのように申し立てられていない場合には、それらの全体が参照によってここに組み込まれる。

[4]PE融合タンパク質
本明細書に記載のプライム編集因子(PE)システムは、任意にリンカーによって連結されるnapDNAbpおよびポリメラーゼ(例えば、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼ、例えば逆転写酵素)を含む融合タンパク質を企図する。本願は、いずれかの好適なnapDNAbpおよびポリメラーゼ(例えば、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼ、例えば逆転写酵素)が単一の融合タンパク質として組み合わせられることを企図する。napDNAbpおよびポリメラーゼ(例えば、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼ、例えば逆転写酵素)の例は、夫々が本願において定められる。ポリメラーゼは当該技術分野において周知であり、アミノ酸配列は難なく利用可能であるので、本開示は本願において同定される特定のポリメラーゼに限定されることを決して意味されない。

種々の態様において、融合タンパク質はいずれかの好適な構造的な構成を含み得る。例えば、融合タンパク質は、N末端からC末端方向に、napDNAbpをポリメラーゼ(例えば、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼ、例えば逆転写酵素)に融合されて含み得る。他の態様において、融合タンパク質は、N末端からC末端方向に、ポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)をnapDNAbpに融合されて含み得る。融合したドメインは、任意に、リンカー、例えばアミノ酸配列によって連結され得る。他の態様において、融合タンパク質は構造NH₂-[napDNAbp]-[ポリメラーゼ]-COOH;またはNH₂-[ポリメラーゼ]-[napDNAbp]-COOHを含み得、「]-[」の夫々のものは任意のリンカー配列の存在を指示する。ポリメラーゼが逆転写酵素である態様では、融合タンパク質は構造NH₂-[napDNAbp]-[RT]-COOH;またはNH₂-[RT]-[napDNAbp]-COOHを含み得、「]-[」の夫々のものは任意のリンカー配列の存在を指示する。

例示の融合タンパク質が図14に図示されている。これはリンカー配列を介してニッカーゼCas9(「Cas9(H840A)」)に融合されたMLV逆転写酵素(「MLV-RT」)を含む融合タンパク質を示す。この例は、本明細書に記載のプライム編集因子(PE)システムに利用され得る融合タンパク質の範囲を限定することを意図されない。

種々の態様において、プライム編集因子融合タンパク質は次のアミノ酸配列(本願においては「PE1」と言われる)を有し得、これは、H840A変異を含むCas9バリアント(すなわち、Cas9ニッカーゼ)およびM-MLV RT野生型と、N末端NLS配列(19アミノ酸)およびCas9ニッカーゼドメインのC末端をRTドメインのN末端に連結するアミノ酸リンカー(32アミノ酸)とを包含する。PE1融合タンパク質は次の構造を有する:[NLS]-[Cas9(H840A)]-[リンカー]-[MMLV_RT(wt)]。PE1およびその個々の構成要素のアミノ酸配列は次のとおりである:

別の態様では、プライム編集因子融合タンパク質は次のアミノ酸配列(本願においては「PE2」と言われる)を有し得、これは、H840A変異を含むCas9バリアント(すなわち、Cas9ニッカーゼ)ならびに変異D200N、T330P、L603W、T306K、およびW313Fを含むM-MLV RTと、N末端NLS配列(19アミノ酸)ならびにCas9ニッカーゼドメインのC末端をRTドメインのN末端に連結するアミノ酸リンカー(33アミノ酸)とを包含する。PE2融合タンパク質は次の構造を有する:[NLS]-[Cas9(H840A)]-[リンカー]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)]。PE2のアミノ酸配列は次のとおりである:

更なる他の態様において、プライム編集因子融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有していてもよい:

他の態様において、プライム編集因子融合タンパク質は、次の例示の配列などのSaCas9にまたは変改されたPAM特異性を有するSpCas9ニッカーゼに基づき得る:

さらに他の態様において、本願において企図されるプライム編集因子融合タンパク質は、M-MLV逆転写酵素の短縮されたバージョンに融合されたCas9ニッカーゼ(例えば、Cas9(H840A))を包含し得る。この態様では、逆転写酵素は4つの変異をもまた含有する(D200N、T306K、W313F、T330P;PE2に存在するL603W変異は短縮を原因としてもはや存在しないということに注意)。この短縮された編集因子をコードするDNA配列はPE2よりも522bp小さく、よって、DNA配列の送達がそのサイズを原因として難しい適用(すなわち、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルス送達)にとってそれを可能性として有用にする。この態様はCas9(H840A)-MMLV-RT(trunc)または「短いPE2(PE2-short)」または「PE2-trunc」と言われ、次のアミノ酸配列を有する:

図75を見よ。これは、PE2、PE2-trunc、PE3、およびPE3-truncの効率(すなわち、「規定された編集またはインデルを有する配列決定総読取の％」)を種々の細胞株において異なる標的部位について比較する棒グラフを提供する。データは、短縮されたRTバリアントを含むプライム編集因子が、短縮されていないRTタンパク質を含むプライム編集因子と約同じくらい効率的であったということを示す。

種々の態様において、本願において企図されるプライム編集因子融合タンパク質は、PE1、PE2、または上で指示されているプライム編集因子融合体配列のいずれかと少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、または少なくとも約99.9％同一であるアミノ酸配列を有する上で開示されている配列のいずれかのバリアントをもまた包含し得る。

ある態様において、リンカーが、本発明のペプチドまたはペプチドドメインもしくは部分のいずれかを連結するために用いられ得る(例えば、逆転写酵素に連結または融合されたnapDNAbp)。

[5]リンカーおよび他のドメイン
PE融合タンパク質は、napDNAbp(例えば、Cas9ドメイン)およびポリメラーゼドメイン(例えば、RTドメイン)以外に種々の他のドメインを含み得る。例えば、napDNAbpがCas9でありかつポリメラーゼがRTであるケースでは、PE融合タンパク質は、Cas9ドメインをRTドメインと連結する1つ以上のリンカーを含み得る。リンカーは、他の機能ドメイン、例えば核局在配列(NLS)またはFEN1(または他のフラップエンドヌクレアーゼ)をもまたPE融合タンパク質またはそのドメインに連結し得る。

加えて、トランスプライム編集が関わる態様では、リンカーが、tPERT動員タンパク質をプライム編集因子に例えばtPERt動員タンパク質およびnapDNAbpの間において連結するために用いられ得る。例えば、ポリメラーゼドメインおよび動員タンパク質ドメインをnapDNAbpに別個に融合するためのリンカーを包含するトランスプライム編集因子(tPE)の例示の模式図については、図3Gを見よ。

A．リンカー
上で定められているとおり、本願において用いられる用語「リンカー」は、2つの分子または部分、例えばヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメインを連結する化学基または分子を言う。いくつかの態様では、リンカーはRNAによってプログラム可能なヌクレアーゼのgRNA結合ドメインおよびポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)の触媒ドメインを連結する。いくつかの態様では、リンカーはdCas9および逆転写酵素を連結する。典型的には、リンカーは2つの基、分子、または他の部分の間に位置取るかまたはそれらによってフランキングされ、共有結合を介して夫々の1つに接続され、それゆえに2つを接続する。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸または複数のアミノ酸(例えば、ペプチドまたはタンパク質)である。いくつかの態様では、リンカーは有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。いくつかの態様では、リンカーは長さが5-100アミノ酸、例えば、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、または150-200アミノ酸である。より長いかまたはより短いリンカーもまた企図される。

リンカーは共有結合ほども単純であり得るか、またはそれは長さが多くの原子であるポリマー性リンカーであり得る。ある態様において、リンカーはポリ(pol)ペプチドであるかまたはアミノ酸に基づく。他の態様において、リンカーはペプチド様ではない。ある態様において、リンカーは共有結合である(例えば、炭素-炭素結合、ジスルフィド結合、炭素-ヘテロ原子結合など)。ある態様において、リンカーはアミド連結部の炭素-窒素結合である。ある態様において、リンカーは、環状または非環状の、置換または無置換の、分枝または非分枝の脂肪族またはヘテロ脂肪族リンカーである。ある態様において、リンカーはポリマー性である(例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど)。ある態様において、リンカーはアミノアルカン酸のモノマー、二量体、またはポリマーを含む。ある態様において、リンカーはアミノアルカン酸を含む(例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータアラニン、3-アミノプロパン酸、4-アミノ酪酸、5-ペンタン酸など)。ある態様において、リンカーはアミノヘキサン酸(Ahx)のモノマー、二量体、またはポリマーを含む。ある態様において、リンカーは炭素環部分(例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン)に基づく。他の態様において、リンカーはポリエチレングリコール部分(PEG)を含む。他の態様において、リンカーはアミノ酸を含む。ある態様において、リンカーはペプチドを含む。ある態様において、リンカーはアリールまたはヘテロアリール部分を含む。ある態様において、リンカーはフェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤の取り付けを容易化するための官能化された部分を包含し得る(例えば、チオール、アミノ)。いずれかの求電子剤がリンカーの一部として用いられ得る。例示の求電子剤は、活性化エステル、活性化アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアネートを包含するが、これらに限定されない。

いくつかの他の態様において、リンカーはアミノ酸配列(GGGGS)_n(配列番号165)、(G)_n(配列番号166)、(EAAAK)_n(配列番号167)、(GGS)_n(配列番号168)、(SGGS)_n(配列番号169)、(XP)_n(配列番号170)、またはそれらのいずれかの組み合わせを含み、nは独立して1および30の間の整数であり、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列(GGS)N(配列番号176)を含み、nは1、3、または7である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGSETPGTSESATPES(配列番号171)を含む。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(配列番号172)を含む。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSGGSGGS(配列番号173)を含む。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGS(配列番号174)を含む。他の態様において、リンカーはアミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESAGSYPYDVPDYAGSAAPAAKKKKLDGSGSGGSSGGS(配列番号175、60AA)を含む。

ある態様において、リンカーは本発明のペプチドまたはペプチドドメインもしくは部分のいずれかを連結するために用いられ得る(例えば、逆転写酵素に連結または融合されるnapDNAbp)。

上で定められているとおり、本願において用いられる用語「リンカー」は、2つの分子または部分、例えばヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメインを連結する化学基または分子を言う。いくつかの態様では、リンカーはRNAによってプログラム可能なヌクレアーゼのgRNA結合ドメインおよびリコンビナーゼの触媒ドメインを連結する。いくつかの態様では、リンカーはdCas9および逆転写酵素を連結する。典型的には、リンカーは2つの基、分子、または他の部分の間に位置取るかまたはそれらによってフランキングされ、共有結合を介して夫々の1つに接続され、それゆえに2つを接続する。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸または複数のアミノ酸(例えば、ペプチドまたはタンパク質)である。いくつかの態様では、リンカーは有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。いくつかの態様では、リンカーは長さが5～100アミノ酸、例えば、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30～35、35～40、40～45、45～50、50～60、60～70、70～80、80～90、90～100、100～150、または150～200アミノ酸である。より長いかまたはより短いリンカーもまた企図される。

リンカーは共有結合ほども単純であり得るか、またはそれは長さが多くの原子であるポリマー性リンカーであり得る。ある態様において、リンカーはポリペプチドであるかまたはアミノ酸に基づく。他の態様において、リンカーはペプチド様ではない。ある態様において、リンカーは共有結合である(例えば、炭素-炭素結合、ジスルフィド結合、炭素-ヘテロ原子結合など)。ある態様において、リンカーはアミド連結部の炭素-窒素結合である。ある態様において、リンカーは、環状または非環状の、置換または無置換の、分枝または非分枝の脂肪族またはヘテロ脂肪族リンカーである。ある態様において、リンカーはポリマー性である(例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど)。ある態様において、リンカーはアミノアルカン酸のモノマー、二量体、またはポリマーを含む。ある態様において、リンカーはアミノアルカン酸を含む(例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータアラニン、3-アミノプロパン酸、4-アミノ酪酸、5-ペンタン酸など)。ある態様において、リンカーはアミノヘキサン酸(Ahx)のモノマー、二量体、またはポリマーを含む。ある態様において、リンカーは炭素環部分(例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン)に基づく。他の態様において、リンカーはポリエチレングリコール部分(PEG)を含む。他の態様において、リンカーはアミノ酸を含む。ある態様において、リンカーはペプチドを含む。ある態様において、リンカーはアリールまたはヘテロアリール部分を含む。ある態様において、リンカーはフェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤の取り付けを容易化するための官能化された部分を包含し得る(例えば、チオール、アミノ)。いずれかの求電子剤がリンカーの一部として用いられ得る。例示の求電子剤は、活性化エステル、活性化アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアネートを包含するが、これらに限定されない。

いくつかの他の態様において、リンカーはアミノ酸配列(GGGGS)n(配列番号165)、(G)n(配列番号166)、(EAAAK)_n(配列番号167)、(GGS)_n(配列番号168)、(SGGS)n(配列番号169)、(XP)n(配列番号170)、またはそれらのいずれかの組み合わせを含み、nは独立して1および30の間の整数であり、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列(GGS)N(配列番号176)を含み、nは1、3、または7である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGSETPGTSESATPES(配列番号171)を含む。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(配列番号172)を含む。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSGGSGGS(配列番号173)を含む。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGS(配列番号174)を含む。

特に、次のリンカーが、プライム編集因子ドメインを互いと連結するために種々の態様に用いられ得る:
GGS(配列番号767);
GGSGGS(配列番号768);
GGSGGSGGS(配列番号769);
SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS(配列番号127);
SGSETPGTSESATPES(配列番号171);
SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESAGSYPYDVPDYAGSAAPAAKKKKLDGSGSGGSSGGS(配列番号175)。

B．核局在配列(NLS)
種々の態様において、PE融合タンパク質は1つ以上の核局在配列(NLS)を含み得、これらは細胞核内へのタンパク質の移行を促進することを助ける。かかる配列は当該技術分野で周知であり、次の例を包含し得る:

上のNLS例は限定しない。PE融合タンパク質はいずれかの公知のNLS配列を含み得、Cokol et al.,“Finding nuclear localization signals,”EMBO Rep.,2000,1(5):411-415およびFreitas et al.,“Mechanisms and Signals for the Nuclear Import of Proteins,”Current Genomics,2009,10(8):550-7に記載されているもののいずれかを包含する。これらの夫々は参照によって本願に組み込まれる。

種々の態様において、本明細書に開示のプライム編集因子およびプライム編集因子をコードする構築物は、さらに、1つ以上の、好ましくは少なくとも2つの核局在シグナルを含む。ある態様において、プライム編集因子は少なくとも2つのNLSを含む。少なくとも2つのNLSによる態様では、NLSは同じNLSであり得るか、またはそれらは異なるNLSであり得る。加えて、NLSはプライム編集因子の残りの部分との融合タンパク質の一部として発現され得る。いくつかの態様では、NLSの1つ以上は双節型NLS(「bpNLS」)である。ある態様において、本開示の融合タンパク質は2つの双節型NLSを含む。いくつかの態様では、本開示の融合タンパク質は2つよりも多くの双節型NLSを含む。

NLS融合の位置付けはプライム編集因子のN末端、C末端、または配列内であり得る(例えば、コードされるnapDNAbp構成要素(例えばCas9)およびポリメラーゼドメイン(例えば逆転写酵素ドメイン)の間に挿入される。

NLSは当該技術分野のいずれかの公知のNLS配列であり得る。NLSは核局在のためのいずれかの将来に発見されるNLSでもまたあり得る。NLSは、いずれかの天然に存在するNLSまたはいずれかの天然に存在しないNLS(例えば、1つ以上の所望の変異を有するNLS)でもまたあり得る。

用語「核局在配列」または「NLS」は、例えば核輸送による細胞核へのタンパク質の搬入を促進するアミノ酸配列を言う。核局在配列は当該技術分野で知られており、当業者には明らかであろう。例えば、NLS配列は、2001年5月31日にWO/2001/038547として公開された2000年11月23日出願のPlank et al.の国際PCT出願PCT/EP2000/011690に記載されている。これの内容は参照によって本願に組み込まれる。いくつかの態様では、NLSはアミノ酸配列PKKKRKV(配列番号16)、MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC(配列番号17)、KRTADGSEFESPKKKRKV(配列番号3864)、またはKRTADGSEFEPKKKRKV(配列番号13)を含む。他の態様において、NLSはアミノ酸配列NLSKRPAAIKKAGQAKKKK(配列番号3865)、PAAKRVKLD(配列番号192)、RQRRNELKRSF(配列番号3866)、NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(配列番号3867)を含む。

本開示の一側面において、プライム編集因子は、1つ以上の核局在シグナル(NLS)、好ましくは少なくとも2つのNLSによって修飾され得る。ある態様において、プライム編集因子は2つ以上のNLSによって修飾される。本開示は、本開示の時に当該技術分野で公知のいずれかの核局在シグナルまたは本出願時の後の現況技術によって同定されるかもしくはさもなければ利用可能にされるいずれかの核局在シグナルの使用を企図する。代表的な核局在シグナルは、配列が発現される細胞の核にタンパク質を導くペプチド配列である。核局在シグナルは支配的には塩基性であり、タンパク質のアミノ酸配列のほとんどどこにでも位置取り得、一般的には、4アミノ酸(Autieri & Agrawal,(1998)J.Biol.Chem.273:14731-37。参照によって本願に組み込まれる)から8アミノ酸の短い配列を含み、典型的にはリジンおよびアルギニン残基がリッチである(Magin et al.,(2000)Virology 274:11-16。参照によって本願に組み込まれる)。核局在シグナルは多くの場合にはプロリン残基を含む。種々の核局在シグナルが同定されており、細胞質から細胞の核への生物学的分子の輸送を成し遂げるために用いられている。例えば、Tinland et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:7442-46;Moede et al.,(1999) FEBS Lett.461:229-34を見よ。これは参照によって組み込まれる。移行は現行では核膜孔タンパク質が関わると考えられる。

ほとんどのNLSは3つの一般的な群に分類され得る:(i)SV40ラージT抗原NLS(PKKKRKV(配列番号16))によって例示される単節型NLS;(ii)XenopusヌクレオプラスミンNLS(KRXXXXXXXXXXKKKL(配列番号3868))によって例示される、可変の数のスペーサーアミノ酸によって分離された2つの塩基性ドメインからなる双節型モチーフ;ならびに(iii)非標準的な配列、例えばhnRNP A1タンパク質のM9、インフルエンザウイルス核タンパク質NLS、および酵母Gal4タンパク質NLS(Dingwall and Laskey 1991)。

核局在シグナルはタンパク質のアミノ酸配列上の種々の点に出現する。NLSはタンパク質のN末端、C末端、および中心領域から同定されている。それゆえに、本開示は、プライム編集因子のC末端、N末端、および内部の領域において1つ以上のNLSによって修飾され得るプライム編集因子を提供する。核局在シグナルそれ自体と例えば強直的にまたは立体的に干渉しないようにして、構成要素NLS残基として機能しないより長い配列の残基が選択されるべきである。よって、NLSを含む配列の組成に厳格な限定はないが、事実上、かかる配列は長さおよび組成が機能的に限定され得る。

本開示は、1つ以上のNLSを包含するようにプライム編集因子を改変するためのいずれかの好適な手段を企図する。一側面において、プライム編集因子は、そのN末端またはそのC末端(または両方)において1つ以上のNLSに翻訳的に融合されているプライム編集因子タンパク質を発現するように、すなわちプライム編集因子-NLS融合体構築物を形成するように、操作され得る。他の態様において、プライム編集因子をコードするヌクレオチド配列は、コードされるプライム編集因子の内部の領域に1つ以上のNLSをコードする読み枠を組み込むように遺伝子改変され得る。加えて、NLSは、プライム編集因子とN末端に、C末端に、または内部に、例えばそしてタンパク質の中心領域に取り付けられたNLSアミノ酸配列との間にコードされる種々のアミノ酸リンカーまたはスペーサー領域を包含し得る。それゆえに、本開示は、プライム編集因子および1つ以上のNLSを含む融合タンパク質を発現するためのヌクレオチド構築物、ベクター、およびホスト細胞をもまた可能にする。

本明細書に記載のプライム編集因子は核局在シグナルをもまた含み得、これらは、1つ以上のリンカー、例えばそしてポリマー性、アミノ酸、核酸、多糖、化学的、または核酸リンカー要素を介してプライム編集因子に連結される。本開示の企図される範囲内のリンカーはいずれかの限定を有することを意図されず、いずれかの好適な型の分子(例えば、ポリマー、アミノ酸、多糖、核酸、脂質、またはいずれかの合成化学的リンカードメイン)であり得、プライム編集因子および1つ以上のNLSの間に結合(例えば、共有結合的連結、水素結合)を形成することを成就するいずれかの好適な戦略によって、プライム編集因子に連結され得る。

C．フラップエンドヌクレアーゼ(例えばFEN1)
種々の態様において、PE融合タンパク質は1つ以上のフラップエンドヌクレアーゼ(例えばFEN1)を含み得、これは5'一本鎖DNAフラップの除去を触媒する酵素を言う。これらは天然に存在する酵素であり、これらはDNA複製を包含する細胞性のプロセスの間に形成される5'フラップの除去をプロセシングする。本明細書に記載のプライム編集法は、プライム編集の間に標的部位において形成される内生(endogenouse)DNAの5'フラップを除去するために、内生で供給されるフラップエンドヌクレアーゼまたはトランスで提供されるものを利用し得る。フラップエンドヌクレアーゼは当該技術分野において知られており、Patel et al.,“Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends,”Nucleic Acids Research,2012,40(10):4507-4519およびTsutakawa et al.,“Human flap endonuclease structures,DNA double-base flipping,and a unified understanding of the FEN1 superfamily,”Cell,2011,145(2):198-211(これら各々は参照により本明細書に組み込まれる)の記載から見出され得る。例示のフラップエンドヌクレアーゼは、以下のアミノ酸配列によって表され得るFEN1である:

フラップエンドヌクレアーゼは、いずれかのFEN1バリアント、変異体、または他のフラップエンドヌクレアーゼオーソログ、ホモログ、もしくはバリアントをもまた包含し得る。限定しないFEN1バリアントの例は次のとおりである:

種々の態様において、本願において企図されるプライム編集因子融合タンパク質は、上の配列のいずれかと少なくとも約70％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約96％同一、少なくとも約97％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、少なくとも約99.5％同一、または少なくとも約99.9％同一であるアミノ酸配列を有する上に開示されている配列のいずれかのフラップエンドヌクレアーゼバリアントを包含し得る。

5'端一本鎖DNAフラップの除去を容易化するために本方法によって利用され得る他のエンドヌクレアーゼは、(1)trex2、(2)exo1エンドヌクレアーゼを包含するが、これらに限定されない(例えば、Keijzers et al.,Biosci Rep.2015,35(3):e00206)。
Trex2

3' 3プライム修復エキソヌクレアーゼ2(TREX2)－ヒト

受託番号NM_080701
MSEAPRAETFVFLDLEATGLPSVEPEIAELSLFAVHRSSLENPEHDESGALVLPRVLDKLTLCMCPERPFTAKASEITGLSSEGLARCRKAGFDGAVVRTLQAFLSRQAGPICLVAHNGFDYDFPLLCAELRRLGARLPRDTVCLDTLPALRGLDRAHSHGTRARGRQGYSLGSLFHRYFRAEPSAAHSAEGDVHTLLLIFLHRAAELLAWADEQARGWAHIEPMYLPPDDPSLEA(配列番号3865)。

3' 3プライム修復エキソヌクレアーゼ2(TREX2)－マウス

受託番号NM_011907

MSEPPRAETFVFLDLEATGLPNMDPEIAEISLFAVHRSSLENPERDDSGSLVLPRVLDKLTLCMCPERPFTAKASEITGLSSESLMHCGKAGFNGAVVRTLQGFLSRQEGPICLVAHNGFDYDFPLLCTELQRLGAHLPQDTVCLDTLPALRGLDRAHSHGTRAQGRKSYSLASLFHRYFQAEPSAAHSAEGDVHTLLLIFLHRAPELLAWADEQARSWAHIEPMYVPPDGPSLEA(配列番号3866)。

3' 3プライム修復エキソヌクレアーゼ2(TREX2)－ラット

受託番号NM_001107580

MSEPLRAETFVFLDLEATGLPNMDPEIAEISLFAVHRSSLENPERDDSGSLVLPRVLDKLTLCMCPERPFTAKASEITGLSSEGLMNCRKAAFNDAVVRTLQGFLSRQEGPICLVAHNGFDYDFPLLCTELQRLGAHLPRDTVCLDTLPALRGLDRVHSHGTRAQGRKSYSLASLFHRYFQAEPSAAHSAEGDVNTLLLIFLHRAPELLAWADEQARSWAHIEPMYVPPDGPSLEA(配列番号3867)。

ExoI
ヒトエキソヌクレアーゼ1(EXO1)は、DNAミスマッチ修復(MMR)、マイクロ媒介末端結合(micro-mediated end-joining、相同組換え(HR)、および複製を包含する、多くの種々のDNA代謝プロセスに関係する。ヒトEXO1は、真核生物ヌクレアーゼRad2/XPGのファミリーに属し、これはまたFEN1およびGEN1も包含する。Rad2/XPGファミリーは、ファージからヒトまでの種を通してヌクレアーゼドメインが保存されている。EXO1遺伝子産物は、5'エキソヌクレアーゼと5'フラップ活性との両方を呈する。加えて、EXO1は、固有の5'RNase H活性も含有する。ヒトEXO1は、二本鎖DNA(dsDNA)、ニック、ギャップ、シュードY構造のプロセシングに対し高親和性を有し、遺伝で受け継いだそのフラップ活性を使用してホリデイ接点を分解し得る。ヒトEXO1はMMRに関係し、MLH1およびMSH2と直接相互作用する保存された結合ドメインを含有する。EXO1核酸分解活性は、PCNA、MutSα(MSH2/MSH6複合体)、14-3-3、MRN、および9-1-1複合体によって正に刺激される。

エキソヌクレアーゼ1(EXO1)受託番号NM_003686(Homo sapiensエキソヌクレアーゼ1(EXO1)、転写産物バリアント3)－アイソフォームA
MGIQGLLQFIKEASEPIHVRKYKGQVVAVDTYCWLHKGAIACAEKLAKGEPTDRYVGFCMKFVNMLLSHGIKPILVFDGCTLPSKKEVERSRRERRQANLLKGKQLLREGKVSEARECFTRSINITHAMAHKVIKAARSQGVDCLVAPYEADAQLAYLNKAGIVQAIITEDSDLLAFGCKKVILKMDQFGNGLEIDQARLGMCRQLGDVFTEEKFRYMCILSGCDYLSSLRGIGLAKACKVLRLANNPDIVKVIKKIGHYLKMNITVPEDYINGFIRANNTFLYQLVFDPIKRKLIPLNAYEDDVDPETLSYAGQYVDDSIALQIALGNKDINTFEQIDDYNPDTAMPAHSRSHSWDDKTCQKSANVSSIWHRNYSPRPESGTVSDAPQLKENPSTVGVERVISTKGLNLPRKSSIVKRPRSAELSEDDLLSQYSLSFTKKTKKNSSEGNKSLSFSEVFVPDLVNGPTNKKSVSTPPRTRNKFATFLQRKNEESGAVVVPGTRSRFFCSSDSTDCVSNKVSIQPLDETAVTDKENNLHESEYGDQEGKRLVDTDVARNSSDDIPNNHIPGDHIPDKATVFTDEESYSFESSKFTRTISPPTLGTLRSCFSWSGGLGDFSRTPSPSPSTALQQFRRKSDSPTSLPENNMSDVSQLKSEESSDDESHPLREEACSSQSQESGEFSLQSSNASKLSQCSSKDSDSEESDCNIKLLDSQSDQTSKLRLSHFSKKDTPLRNKVPGLYKSSSADSLSTTKIKPLGPARASGLSKKPASIQKRKHHNAENKPGLQIKLNELWKNFGFKKF(配列番号3868)。

エキソヌクレアーゼ1(EXO1)受託番号NM_006027(Homo sapiensエキソヌクレアーゼ1(EXO1)、転写産物バリアント3)－アイソフォームB

MGIQGLLQFIKEASEPIHVRKYKGQVVAVDTYCWLHKGAIACAEKLAKGEPTDRYVGFCMKFVNMLLSHGIKPILVFDGCTLPSKKEVERSRRERRQANLLKGKQLLREGKVSEARECFTRSINITHAMAHKVIKAARSQGVDCLVAPYEADAQLAYLNKAGIVQAIITEDSDLLAFGCKKVILKMDQFGNGLEIDQARLGMCRQLGDVFTEEKFRYMCILSGCDYLSSLRGIGLAKACKVLRLANNPDIVKVIKKIGHYLKMNITVPEDYINGFIRANNTFLYQLVFDPIKRKLIPLNAYEDDVDPETLSYAGQYVDDSIALQIALGNKDINTFEQIDDYNPDTAMPAHSRSHSWDDKTCQKSANVSSIWHRNYSPRPESGTVSDAPQLKENPSTVGVERVISTKGLNLPRKSSIVKRPRSAELSEDDLLSQYSLSFTKKTKKNSSEGNKSLSFSEVFVPDLVNGPTNKKSVSTPPRTRNKFATFLQRKNEESGAVVVPGTRSRFFCSSDSTDCVSNKVSIQPLDETAVTDKENNLHESEYGDQEGKRLVDTDVARNSSDDIPNNHIPGDHIPDKATVFTDEESYSFESSKFTRTISPPTLGTLRSCFSWSGGLGDFSRTPSPSPSTALQQFRRKSDSPTSLPENNMSDVSQLKSEESSDDESHPLREEACSSQSQESGEFSLQSSNASKLSQCSSKDSDSEESDCNIKLLDSQSDQTSKLRLSHFSKKDTPLRNKVPGLYKSSSADSLSTTKIKPLGPARASGLSKKPASIQKRKHHNAENKPGLQIKLNELWKNFGFKKDSEKLPPCKKPLSPVRDNIQLTPEAEEDIFNKPECGRVQRAIFQ(配列番号3869)。

エキソヌクレアーゼ1(EXO1)受託番号NM_001319224(Homo sapiensエキソヌクレアーゼ1(EXO1)、転写産物バリアント4)－アイソフォームC

MGIQGLLQFIKEASEPIHVRKYKGQVVAVDTYCWLHKGAIACAEKLAKGEPTDRYVGFCMKFVNMLLSHGIKPILVFDGCTLPSKKEVERSRRERRQANLLKGKQLLREGKVSEARECFTRSINITHAMAHKVIKAARSQGVDCLVAPYEADAQLAYLNKAGIVQAIITEDSDLLAFGCKKVILKMDQFGNGLEIDQARLGMCRQLGDVFTEEKFRYMCILSGCDYLSSLRGIGLAKACKVLRLANNPDIVKVIKKIGHYLKMNITVPEDYINGFIRANNTFLYQLVFDPIKRKLIPLNAYEDDVDPETLSYAGQYVDDSIALQIALGNKDINTFEQIDDYNPDTAMPAHSRSHSWDDKTCQKSANVSSIWHRNYSPRPESGTVSDAPQLKENPSTVGVERVISTKGLNLPRKSSIVKRPRSELSEDDLLSQYSLSFTKKTKKNSSEGNKSLSFSEVFVPDLVNGPTNKKSVSTPPRTRNKFATFLQRKNEESGAVVVPGTRSRFFCSSDSTDCVSNKVSIQPLDETAVTDKENNLHESEYGDQEGKRLVDTDVARNSSDDIPNNHIPGDHIPDKATVFTDEESYSFESSKFTRTISPPTLGTLRSCFSWSGGLGDFSRTPSPSPSTALQQFRRKSDSPTSLPENNMSDVSQLKSEESSDDESHPLREEACSSQSQESGEFSLQSSNASKLSQCSSKDSDSEESDCNIKLLDSQSDQTSKLRLSHFSKKDTPLRNKVPGLYKSSSADSLSTTKIKPLGPARASGLSKKPASIQKRKHHNAENKPGLQIKLNELWKNFGFKKDSEKLPPCKKPLSPVRDNIQLTPEAEEDIFNKPECGRVQRAIFQ(配列番号3870)。

D．インテインおよび分裂インテイン
いくつかの態様では(例えば、AAV粒子を用いるインビボのプライム編集因子の送達)、ポリペプチド(例えば、デアミナーゼまたはnapDNAbp)または融合タンパク質(例えばプライム編集因子)をN末端の半分およびC末端の半分へと分裂し、それらを別個に送達し、それからそれらの共局在が完全なタンパク質(または場合に応じて融合タンパク質)を細胞内で再形成することを許すことが有利であり得るということは理解されるであろう。タンパク質または融合タンパク質の別個の半分同士は、夫々が、タンパク質トランススプライシングの機序による完全なタンパク質または融合タンパク質の再形成を容易化するための分裂インテインタグを含み得る。

分裂インテインによって触媒されるタンパク質トランススプライシングは、タンパク質ライゲーションのための全く酵素的な方法を提供する。分裂インテインは、夫々NインテインおよびCインテインという名称の2つのピースへと分裂された本質的に一続きのインテイン(例えばミニインテイン)である。分裂インテインのNインテインおよびCインテインは、非共有結合的に会合して活性なインテインを形成し、一続きのインテインがするのと本質的に同じやり方でスプライシング反応を触媒し得る。分裂インテインは天然に見出され、実験室でもまた操作されている。本願において用いられる用語「分裂インテイン」は、1つ以上のペプチド結合切断がN末端およびC末端アミノ酸配列の間に存在するいずれかのインテインを言い、その結果、N末端およびC末端配列が別個の分子になり、これらは、トランススプライシング反応について機能的であるインテインへと非共有結合的に再会合または再構成し得る。いずれかの触媒的に活性なインテインまたはそのフラグメントが、本発明の方法への使用のための分裂インテインを導出するために用いられ得る。例えば、一側面において、分裂インテインは真核生物インテインに由来し得る。別の側面において、分裂インテインは細菌インテインに由来し得る。別の側面において、分裂インテインは古細菌インテインに由来し得る。好ましくは、そのように導出された分裂インテインは、トランススプライシング反応を触媒することにとって必須のアミノ酸配列のみを所有するであろう。

本願において用いられる「N末端分裂インテイン(In)」は、トランススプライシング反応について機能的であるN末端アミノ酸配列を含むいずれかのインテイン配列を言う。Inは、それゆえに、トランススプライシングが生起するときにスプライスアウトされる配列をもまた含む。Inは、天然に存在するインテイン配列のN末端部分の改変である配列を含み得る。例えば、かかる追加のおよび/または変異した残基の包含がInをトランススプライシングにおいて非機能的にしない限り、Inは追加のアミノ酸残基および/または変異した残基を含み得る。好ましくは、追加のおよび/または変異した残基の包含は、Inのトランススプライシング活性を改善または増強する。

本願において用いられる「C末端分裂インテイン(Ic)」は、トランススプライシング反応について機能的であるC末端アミノ酸配列を含むいずれかのインテイン配列を言う。一側面において、Icは、それが由来したインテインの最後のβ鎖からである一続きの4から7アミノ酸残基、少なくとも4アミノ酸を含む。Icは、それゆえに、トランススプライシングが生起するときにスプライスアウトされる配列をもまた含む。Icは、天然に存在するインテイン配列のC末端部分の改変である配列を含み得る。例えば、かかる追加のおよび/または変異した残基の包含がInをトランススプライシングにおいて非機能的にしない限り、Icは追加のアミノ酸残基および/または変異した残基を含み得る。好ましくは、追加のおよび/または変異した残基の包含は、Icのトランススプライシング活性を改善または増強する。

本発明のいくつかの態様では、IcまたはInに連結されたペプチドは、とりわけ蛍光基、ビオチン、ポリエチレングリコール(PEG)、アミノ酸アナログ、非天然のアミノ酸、リン酸基、グリコシル基、放射性同位体標識、および医薬分子を包含する追加の化学的部分を含み得る。他の態様において、Icに連結されたペプチドは、とりわけケトン、アルデヒド、Cys残基、およびLys残基を包含する1つ以上の化学反応性基を含み得る。「インテインスプライシングポリペプチド(ISP)」が存在するときには、分裂インテインのNインテインおよびCインテインは非共有結合的に会合して活性なインテインを形成し、スプライシング反応を触媒し得る。本願において用いられる「インテインスプライシングポリペプチド(ISP)」は、Ic、In、または両方が分裂インテインから除去されるときに留まる分裂インテインのアミノ酸配列の部分を言う。ある態様において、InはISPを含む。別の態様では、IcはISPを含む。さらに別の態様では、ISPはInにもIcにも共有結合的に連結されていない別個のペプチドである。

分裂インテインは、ミニインテインの構造上に見出される-12の保存されたベータ鎖間の構造化されていないループまたは介在アミノ酸配列中に1つ以上の分裂部位を操作することによって、一続きのインテインから生出され得る。分裂の生出が、タンパク質スプライシング活性が失われる十分な度合まではインテインの構造、特に構造化されたベータ鎖を遮断しないであろうという条件で、ベータ鎖間の領域内の分裂部位の位置のいくらかのフレキシビリティーが存在し得る。

タンパク質トランススプライシングでは、1つの前駆体タンパク質はNインテインによって後続されるNエクステインパーツからなり、別の前駆体タンパク質はCエクステインパーツによって後続されるCインテインからなり、トランススプライシング反応(一緒にNおよびCインテインによって触媒される)が2つのインテイン配列を切除、2つのエクステイン配列をペプチド結合によって連結する。酵素反応であるタンパク質トランススプライシングは、非常に低い(例えばマイクロモル)濃度のタンパク質で働き得、生理条件下において実行され得る。

例示の配列は次のとおりである:

インテインは最も頻繁には一続きのドメインとして見出されるが、いくつかは天然に分裂された形態で存在する。このケースでは、2つのフラグメントは別個のポリペプチドとして発現され、スプライシング、いわゆるタンパク質トランススプライシングが生起する前に会合しなければならない。

例示の分裂インテインはSsp DnaEインテインであり、これは2つのサブユニットつまりDnaE-NおよびDnaE-Cを含む。2つの異なるサブユニットは別個の遺伝子つまりdnaE-nおよびdnaE-cによってコードされ、これらは夫々DnaE-NおよびDnaE-Cサブユニットをコードする。DnaEはSynechocytis sp. PCC6803の天然に存在する分裂インテインであり、夫々がDnaE-NまたはDnaE-Cどちらかとの融合体を含む2つの別個のタンパク質のトランススプライシングを導くことができる。

追加の天然に存在するまたは操作された分裂インテイン配列は当該技術分野(the)において公知であるか、または本明細書に記載の丸ごとのインテイン配列もしくは当該技術分野で利用可能なものから作られ得る。分裂インテイン配列の例は、Stevens et al.,“A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications,”PNAS,2017,Vol.114:8538-8543;Iwai et al.,“Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme,FEBS Lett,580:1853-1858に見出され得る。これらの夫々は参照によって本願に組み込まれる。追加の分裂インテイン配列は例えばWO2013/045632、WO2014/055782、WO2016/069774、およびEP2877490に見出され得る。これらの夫々の内容は参照によって本願に組み込まれる。

加えて、トランスのタンパク質スプライシングがインビボおよびin vitroで記載されており(Shingledecker,et al.,[0076]Gene 207:187(1998),Southworth,et al.,EMBO J.17:918(1998);Mills,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:3543-3548(1998);Lew,et al.,J.Biol.Chem.,273:15887-15890(1998);Wu,et al.,Biochim.Biophys.Acta 35732:1(1998b),Yamazaki,et al.,J.Am.Chem.Soc.120:5591(1998),Evans,et al.,J.Biol.Chem.275:9091(2000);Otomo,et al.,Biochemistry 38:16040-16044(1999);Otomo,et al.,J.Biolmol.NMR 14:105-114(1999);Scott,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:13638-13643(1999))、爾後にライゲーションを経過して機能的な産物を形成する2つの不活性なフラグメントとして、あるタンパク質を発現するための機会を提供する。例えば、2つの別個に発現される半分からの完全なPE融合タンパク質の形成について、図66および67に示されているとおりである。

E．RNA-タンパク質相互作用ドメイン
種々の態様において、2つの別個のタンパク質ドメイン(例えば、Cas9ドメインおよびポリメラーゼドメイン)は、「RNA-タンパク質動員システム」、例えば「MS2タグ付け技術」を用いることによって、機能的な複合体(2つの別個のタンパク質ドメインを含む融合タンパク質の機能と同様)を形成するように互いに共局在させられ得る。かかるシステムは、一般的には、1つのタンパク質ドメインを「RNA-タンパク質相互作用ドメイン」(「RNA-タンパク質動員ドメイン」としてもまた公知)によって、他をRNA-タンパク質相互作用ドメイン、例えば特定のヘアピン構造を特異的に認識および結合する「RNA結合タンパク質」によってタグ付けする。これらの型のシステムは、プライム編集因子のドメイン同士を共局在させるためにおよびUGIドメインなどの追加の機能性をプライム編集因子に動員するために活用され得る。1つの例では、MS2タグ付け技術は、ファージのゲノム上に存在するステムループまたはヘアピン構造、すなわち「MS2ヘアピン」とのMS2バクテリオファージコートタンパク質(「MCP」または「MS2cp」)の天然の相互作用に基づく。MS2ヘアピンのケースでは、それはMS2バクテリオファージコートタンパク質(MCP)によって認識および結合される。それゆえに、1つの例示的シナリオでは、デアミナーゼ-MS2融合体はCas9-MCP融合体を動員し得る。

他のモジュラーなRNA-タンパク質相互作用ドメインの総説は当該技術分野において例えばJohansson et al.,“RNA recognition by the MS2 phage coat protein,”Sem Virol.,1997,Vol.8(3):176-185;Delebecque et al.,“Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies,”Science,2011,Vol.333:470-474;Mali et al.,“Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering,”Nat.Biotechnol.,2013,Vol.31:833-838;およびZalatan et al.,“Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds,”Cell,2015,Vol.160:339-350に記載されている。これらの夫々はそれらの全体が参照によって本願に組み込まれる。他のシステムは、特異的にPCPタンパク質を動員するPP7ヘアピン、および特異的にComタンパク質を動員する「com」ヘアピンを包含する。Zalatan et al.を見よ。

MS2ヘアピン(または「MS2アプタマー」とも等価に称される)のヌクレオチド配列は:GCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCC(配列番号3871)である。

MCPまたはMS2cpのアミノ酸配列は:
GSASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGEELPVAGWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY(配列番号3872)である。

F．UGIドメイン
他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は1つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤ドメインを含み得る。本願において用いられる用語「ウラシルグリコシラーゼ阻害剤(UGI)」または「UGIドメイン」は、ウラシルDNAグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することができるタンパク質を言う。いくつかの態様では、UGIドメインは、野生型UGIまたは配列番号3873で明示されるUGIを含む。いくつかの態様では、本願において提供されるUGIタンパク質は、UGIのフラグメント、およびUGIまたはUGIフラグメントに対して相同的なタンパク質を包含する。例えば、いくつかの態様では、UGIドメインは、配列番号3873で明示されるアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの態様では、UGIフラグメントは、配列番号3873で明示されるアミノ酸配列の少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、UGIは、配列番号3873で明示されるアミノ酸配列に対して相同的なアミノ酸配列、または配列番号3873で明示されるアミノ酸配列のフラグメントに対して相同的なアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、UGIもしくはUGIのフラグメントまたはUGIもしくはUGIフラグメントのホモログを含むタンパク質は、「UGIバリアント」と言われる。UGIバリアントはUGIまたはそのフラグメントに対する相同性を共有する。例えば、UGIバリアントは、野生型UGIまたは配列番号3873で明示されるUGIと少なくとも70％同一、少なくとも75％同一、少なくとも80％同一、少なくとも85％同一、少なくとも90％同一、少なくとも95％同一、少なくとも96％同一、少なくとも97％同一、少なくとも98％同一、少なくとも99％同一、少なくとも99.5％同一、または少なくとも99.9％同一である。いくつかの態様では、UGIバリアントは、フラグメントが野生型UGIまたは配列番号3873で明示されるUGIの対応するフラグメントと少なくとも70％同一、少なくとも80％同一、少なくとも90％同一、少なくとも95％同一、少なくとも96％同一、少なくとも97％同一、少なくとも98％同一、少なくとも99％同一、少なくとも99.5％同一、または少なくとも99.9％であるようにして、UGIのフラグメントを含む。いくつかの態様では、UGIは次のアミノ酸配列を含む:

ウラシル-DNAグリコシラーゼインヒビター:

＞sp|P14739|UNGI_BPPB2
MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML(配列番号3873)。

本明細書に記載のプライム編集因子は1つよりも多くのUGIドメインを含み得、これらは本明細書に記載の1つ以上のリンカーによって分離され得る。

G．追加のPEエレメント
ある態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は塩基修復の阻害剤を含み得る。用語「塩基修復の阻害剤」または「IBR」は、核酸修復酵素、例えば塩基除去修復酵素の活性を阻害することができるタンパク質を言う。いくつかの態様では、IBRはOGG塩基除去修復の阻害剤である。いくつかの態様では、IBRは塩基除去修復の阻害剤(「iBER」)である。塩基除去修復の例示の阻害剤は、APE1、Endo III、Endo IV、Endo V、Endo VIII、Fpg、hOGG1、hNEIL1、T7 EndoI、T4PDG、UDG、hSMUG1、およびhAAGの阻害剤を包含する。いくつかの態様では、IBRはEndo VまたはhAAGの阻害剤である。いくつかの態様では、IBRは、触媒的に不活性なグリコシラーゼまたは触媒的に不活性なジオキシゲナーゼ、またはオキシダーゼの低分子もしくはペプチド阻害剤、あるいはそれらのバリアントであり得るiBERである。いくつかの態様では、IBRは、TDG阻害剤、MBD4阻害剤、またはAlkBH酵素の阻害剤であり得るiBERである。いくつかの態様では、IBRは、触媒的に不活性なTDGまたは触媒的に不活性なMBD4を含むiBERである。例示の触媒的に不活性なTDGは配列番号3872(ヒトTDG)のN140A変異体である。

いくつかの例示のグリコシラーゼは下で提供される。これらのグリコシラーゼドメインのいずれかの触媒的に不活性化されたバリアントは、本開示で提供されるプライム編集因子のnapDNAbpまたはポリメラーゼドメインに融合され得るiBERである。

OGG(ヒト)

MPARALLPRRMGHRTLASTPALWASIPCPRSELRLDLVLPSGQSFRWREQSPAHWSGVLADQVWTLTQTEEQLHCTVYRGDKSQASRPTPDELEAVRKYFQLDVTLAQLYHHWGSVDSHFQEVAQKFQGVRLLRQDPIECLFSFICSSNNNIARITGMVERLCQAFGPRLIQLDDVTYHGFPSLQALAGPEVEAHLRKLGLGYRARYVSASARAILEEQGGLAWLQQLRESSYEEAHKALCILPGVGTKVADCICLMALDKPQAVPVDVHMWHIAQRDYSWHPTTSQAKGPSPQTNKELGNFFRSLWGPYAGWAQAVLFSADLRQSRHAQEPPAKRRKGSKGPEG(配列番号3869)

MPG(ヒト)

MVTPALQMKKPKQFCRRMGQKKQRPARAGQPHSSSDAAQAPAEQPHSSSDAAQAPCPRERCLGPPTTPGPYRSIYFSSPKGHLTRLGLEFFDQPAVPLARAFLGQVLVRRLPNGTELRGRIVETEAYLGPEDEAAHSRGGRQTPRNRGMFMKPGTLYVYIIYGMYFCMNISSQGDGACVLLRALEPLEGLETMRQLRSTLRKGTASRVLKDRELCSGPSKLCQALAINKSFDQRDLAQDEAVWLERGPLEPSEPAVVAAARVGVGHAGEWARKPLRFYVRGSPWVSVVDRVAEQDTQA(配列番号3870)

MBD4(ヒト)

MGTTGLESLSLGDRGAAPTVTSSERLVPDPPNDLRKEDVAMELERVGEDEEQMMIKRSSECNPLLQEPIASAQFGATAGTECRKSVPCGWERVVKQRLFGKTAGRFDVYFISPQGLKFRSKSSLANYLHKNGETSLKPEDFDFTVLSKRGIKSRYKDCSMAALTSHLQNQSNNSNWNLRTRSKCKKDVFMPPSSSSELQESRGLSNFTSTHLLLKEDEGVDDVNFRKVRKPKGKVTILKGIPIKKTKKGCRKSCSGFVQSDSKRESVCNKADAESEPVAQKSQLDRTVCISDAGACGETLSVTSEENSLVKKKERSLSSGSNFCSEQKTSGIINKFCSAKDSEHNEKYEDTFLESEEIGTKVEVVERKEHLHTDILKRGSEMDNNCSPTRKDFTGEKIFQEDTIPRTQIERRKTSLYFSSKYNKEALSPPRRKAFKKWTPPRSPFNLVQETLFHDPWKLLIATIFLNRTSGKMAIPVLWKFLEKYPSAEVARTADWRDVSELLKPLGLYDLRAKTIVKFSDEYLTKQWKYPIELHGIGKYGNDSYRIFCVNEWKQVHPEDHKLNKYHDWLWENHEKLSLS(配列番号3871)

TDG(ヒト)

MEAENAGSYSLQQAQAFYTFPFQQLMAEAPNMAVVNEQQMPEEVPAPAPAQEPVQEAPKGRKRKPRTTEPKQPVEPKKPVESKKSGKSAKSKEKQEKITDTFKVKRKVDRFNGVSEAELLTKTLPDILTFNLDIVIIGINPGLMAAYKGHHYPGPGNHFWKCLFMSGLSEVQLNHMDDHTLPGKYGIGFTNMVERTTPGSKDLSSKEFREGGRILVQKLQKYQPRIAVFNGKCIYEIFSKEVFGVKVKNLEFGLQPHKIPDTETLCYVMPSSSARCAQFPRAQDKVHYYIKLKDLRDQLKGIERNMDVQEVQYTFDLQLAQEDAKKMAVKEEKYDPGYEAAYGGAYGENPCSSEPCGFSSNGLIESVELRGESAFSGIPNGQWMTQSFTDQIPSFSNHCGTQEQEEESHA(配列番号3872)

いくつかの態様では、本明細書に記載の融合タンパク質は1つ以上の異種タンパク質ドメインを含み得る(例えば、プライム編集因子構成要素に加えて、約または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上のまたはそれよりも多くのドメイン)。融合タンパク質は、いずれかの追加のタンパク質配列と、任意にいずれかの2つのドメイン間のリンカー配列とを含み得る。存在し得る他の例示の特色は、局在配列、例えば細胞質局在配列、搬出配列、例えば核搬出配列、または他の局在配列、および融合タンパク質の可溶化、精製、または検出に有用である配列タグである。

プライム編集因子またはその構成要素(例えば、napDNAbpドメイン、ポリメラーゼドメイン、またはNLSドメイン)を融合するために用いられ得るタンパク質ドメインの例は、限定なしに、エピトープタグ、およびレポーター遺伝子配列を包含する。エピトープタグの限定しない例はヒスチジン(His)タグ、V5タグ、FLAGタグ、インフルエンザヘマグルチニン(HA)タグ、Mycタグ、VSV-Gタグ、およびチオレドキシン(Trx)タグを包含する。レポーター遺伝子の例は、グルタチオン-5-トランスフェラーゼ(GST)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ベータガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、および青色蛍光タンパク質(BFP)を包含する自家蛍光タンパク質を包含するが、これらに限定されない。プライム編集因子は、DNA分子に結合または他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子配列に融合され得、マルトース結合タンパク質(MBP)、Sタグ、Lex A DNA結合ドメイン(DBD)融合体、GAL4 DNA結合ドメイン融合体、および単純ヘルペスウイルス(HSV)BP16タンパク質融合体を包含するがこれらに限定されない。プライム編集因子の一部を形成し得る追加のドメインは2011年3月11日公開のUS特許公開No.2011/0059502に記載され、その全体が参照によって本願に組み込まれる。

本開示のある側面では、グルタチオン-5-トランスフェラーゼ(GST)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)ベータガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、および青色蛍光タンパク質(BFP)を包含する自家蛍光タンパク質を包含するがこれらに限定されないレポーター遺伝子が、遺伝子産物の発現の変改または改変を測定するためのマーカーとしての用をなす遺伝子産物をコードするように、細胞に導入され得る。本開示のある態様において、遺伝子産物はルシフェラーゼである。本開示のさらなる態様では、遺伝子産物の発現は減少させられる。

本願において提供される好適なタンパク質タグは、ビオチンカルボキシラーゼキャリアタンパク質(BCCP)タグ、mycタグ、カルモジュリンタグ、FLAGタグ、ヘマグルチニン(HA)タグ、ヒスチジンタグまたはHisタグともまた言われるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質(MBP)タグ、nusタグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)タグ、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ、チオレドキシンタグ、Sタグ、Softag(例えば、Softag 1、Softag 3)、strepタグ、ビオチンリガーゼタグ、FlAsHタグ、V5タグ、およびSBPタグを包含するが、これらに限定されない。追加の好適な配列は当業者には明らかであろう。いくつかの態様では、融合タンパク質は1つ以上のHisタグを含む。

本開示のいくつかの態様では、PEシステムの発現される構成要素の滞留時間、量、および/または活性を調整することによって、プライム編集システムの活性は時間的に制御され得る。例えば、本明細書に記載のPEは、PEの細胞内半減期を改変することができるタンパク質ドメインと融合され得る。2つ以上のベクターが関わるある種の態様(例えば、本明細書に記載の構成要素が2つ以上の別個のベクター上にコードされるベクターシステム)では、PEシステムの活性は、ベクターが送達されるタイミングをコントロールすることによって時間的に制御され得る。例えば、いくつかの態様では、鋳型をコードするベクターに先行して、ヌクレアーゼシステムをコードするベクターがPEを送達し得る。他の態様において、PEシステムをコードするベクターに先行して、PEgRNAをコードするベクターはガイドを送達し得る。いくつかの態様では、PEシステムおよびPEgRNAをコードするベクターが同時に送達される。ある態様において、同時に送達されるベクターは、例えばPE、PEgRNA、および/または第2の鎖ガイドRNA構成要素を時間的に送達する。さらなる態様では、ベクター上のコード配列から転写されるRNA(例えば、例えばヌクレアーゼ転写物)は、さらに、RNAの細胞内半減期を改変および/または翻訳コントロールを調節することができる少なくとも1つのエレメントを含み得る。いくつかの態様では、RNAの半減期は増大させられ得る。いくつかの態様では、RNAの半減期は減少させられ得る。いくつかの態様では、エレメントはRNAの安定性を増大させることができ得る。いくつかの態様では、エレメントはRNAの安定性を減少させることができ得る。いくつかの態様では、エレメントはRNAの3'UTR内にあり得る。いくつかの態様では、エレメントはポリアデニル化シグナル(PA)を包含し得る。いくつかの態様では、エレメントは、キャップ、例えば上流のmRNAまたはPEgRNA端を包含し得る。いくつかの態様では、RNAはPAを含まずにあり得、その結果、それは転写後に細胞内でより迅速な分解を受ける。いくつかの態様では、エレメントは少なくとも1つのAUリッチエレメント(ARE)を包含し得る。組織型、細胞型、タイミング、細胞局在、および環境に依存的である様式で、AREはARE結合タンパク質(ARE-BP)によって結合され得る。いくつかの態様では、不安定化エレメントがRNA崩壊を促進、RNA安定性に影響、または翻訳を活性化し得る。いくつかの態様では、AREは長さが50から150ヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様では、AREは少なくとも1コピーの配列AUUUAを含み得る。いくつかの態様では、少なくとも1つのAREがRNAの3'UTRに追加され得る。いくつかの態様では、エレメントはウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)であり得る。

転写物からの発現を増強するための三次構造を生出する転写後制御エレメント(WPRE)。さらなる態様では、エレメントは、転写物からの発現を増強することができる改変および/または短縮されたWPRE配列であり、例えばZufferey et al., J Virol, 73(4): 2886-92(1999)およびFlajolet et al., J Virol, 72(7): 6175-80(1998)に記載されているとおりである。いくつかの態様では、WPREまたは等価物はRNAの3'UTRに追加され得る。いくつかの態様では、エレメントは、高速でまたは低速で崩壊する転写物どちらかに濃縮された他のRNA配列モチーフから選択され得る。

いくつかの態様では、PEまたはPEgRNAをコードするベクターは、PEシステムによるベクター上に存在する標的配列の切断によって自己破壊され得る。切断はベクターからのPEまたはPEgRNAの連続した転写を防止し得る。転写は直線化されたベクター上において何らかの時間量に渡って生起し得るが、細胞内分解を受ける発現された転写物またはタンパク質は、コードするベクターの発現からの連続した供給なしには、オフターゲット効果を生ずるためのより少ない時間を有するであろう。

[6]PEgRNA
本明細書に記載のプライム編集システムはいずれかの好適なPEgRNAの使用を企図する。本発明者は、所望のヌクレオチド変化をコードする逆転写(RT)鋳型配列を含む特殊に構成されたガイドRNAの使用によって、プライム標的にプライムされた逆転写(TPRT)の機序が、精密かつ汎用的なCRISPR/Casに基づくゲノム編集を行うことに活用または適合され得るということを発見した。RT鋳型配列は標準のまたは従来のガイドRNA分子の伸長として提供され得るので、本願はこの特殊に構成されたガイドRNAを「伸長されたガイドRNA」または「PEgRNA」と言う。本願は伸長されたガイドRNAについていずれかの好適な構成または配置を企図する。

PEgRNAアーキテクチャ
図3Aは、本明細書に開示のプライム編集因子系に使用可能な伸長されたガイドRNAの一態様を示すが、既存のガイドRNA(緑色部分)は、～20ntプロトスペーサー配列とgRNAコア領域とを包含し、napDNAbpとともに結合する。この態様において、ガイドRNAは、5'末にて伸長されたRNAセグメント、すなわち、5'伸長を包含する。この態様において、5'伸長は、逆転写鋳型配列、逆転写プライマー結合部位、および任意の5～20ヌクレオチドリンカー配列を包含する。図1A～1Bに示されるとおり、RTプライマー結合部位の、ニックの後に形成される遊離3'末とのハイブリッドは、Rループの非標的鎖に形成され、これによって5'-3'方向におけるDNA重合のために逆転写酵素がプライムされる。

図3Bは、本明細書に開示のプライム編集系に使用可能な伸長されたガイドRNAの別の態様を示すが、既存のガイドRNA(緑色部分)は、～20ntプロトスペーサー配列とgRNAコアとを包含し、napDNAbpとともに結合する。この態様において、ガイドRNAは、3'末にて伸長されたRNAセグメント、すなわち、3'伸長を包含する。この態様において、3'伸長は、逆転写鋳型配列および逆転写プライマー結合部位を包含する。図1C～1Dに示されるとおり、RTプライマー結合部位の、ニックの後に形成される遊離3'末とのハイブリッドは、Rループの非標的鎖に形成され、これによって5'-3'方向におけるDNA重合のために逆転写酵素がプライムされる。

図3Cは、本明細書に開示のプライム編集系に使用可能な、伸長されたガイドRNAの別の態様を示すが、既存のガイドRNA(緑色部分)は、～20ntプロトスペーサー配列とgRNAコアとを包含し、napDNAbpとともに結合する。この態様において、ガイドRNAは、gRNAコア内の分子間のある位置にて伸長されたRNAセグメント、すなわち、分子内伸長を包含する。この態様において、分子内伸長は、逆転写鋳型配列および逆転写プライマー結合部位を包含する。RTプライマー結合部位はニックの後に形成される遊離3'末とハイブリダイズし、Rループの非標的鎖に形成され、これによって5'-3'方向におけるDNA重合のために逆転写酵素がプライムされる。

一態様において、分子内RNA伸長の位置は、ガイドRNAのプロトスペーサー配列中にはない。別の態様において、分子内RNA伸長の位置は、gRNAコア中にある。また別の態様において、分子内RNA伸長の位置は、プロトスペーサー配列内を除きガイドRNA分子内のどこにでも、またはプロトスペーサー配列を妨害しない位置にある。

一態様において、分子内RNA伸長は、プロトスペーサー配列の3'末から下流に挿入される。別の態様において、分子内RNA伸長は、プロトスペーサー配列の3'末の、少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド下流に挿入される。

他の態様において、分子内RNA伸長はgRNA中へ挿入され、これは、tracrRNAに対応するかまたはtracrRNAを含むガイドRNAの部分を指し、これはCas9タンパク質またはその等価物(すなわち、異なるnapDNAbp)に結合するかおよび/またはこれと相互作用する。好ましくは、分子内RNA伸長の挿入は、tracrRNA部分とnapDNAbpとの相互作用を妨害しないか、または妨害しても最小限である。

RNA伸長の長さは、いずれの有用な長さでもあり得る。様々な態様において、RNA伸長は、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドである。

RT鋳型配列はまた、いずれの好適な長さでもあり得る。例えば、RT鋳型配列は、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドであり得る。

更なる他の態様において、逆転写プライマー結合部位配列は、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチドヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチドヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチドヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチドヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドヌクレオチドである。

他の態様において、任意のリンカーまたはスペーサー配列は、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、または少なくとも500ヌクレオチドである。

RT鋳型配列は、ある態様において、単鎖DNA分子をコードするが、これは、非標的鎖と相同である(よって、標的鎖の対応する部位に相補的である)が1以上のヌクレオチド変化を包含する。少なくとも1ヌクレオチド変化は、1以上の単一塩基ヌクレオチド変化、1以上の欠失、および1以上の挿入を包含していてもよい。

図1Gに描かれるとおり、RT鋳型配列の合成された単鎖DNA産物は、非標的鎖と相同であって、1以上のヌクレオチド変化を含有する。RT鋳型配列の単鎖DNA産物は、平衡状態で、相補的な標的鎖配列とハイブリダイズし、これによって相同の内生標的鎖配列に取って代わる。取って代わられた内生鎖は、いくつかの態様において、5'内生DNAフラップ種として言及されてもよい(例として、図1Eを参照)。この5'内生DNAフラップ種は、5'フラップエンドヌクレアーゼ(例として、FEN1)によって除去され得、単鎖DNA産物は、今や内生標的鎖とハイブリダイズされており、ライゲートされて内生配列と新しく合成された鎖との間にミスマッチが創出される。ミスマッチは、細胞固有のDNA修復および/または複製プロセスによって分解されてもよい。

様々な態様において、RT鋳型配列のヌクレオチド配列は、5'フラップ種と取って代わられ、かつ編集されるべき部位と重複する、非標的鎖のヌクレオチド配列に対応する。

伸長されたガイドRNAの様々な態様において、逆転写鋳型配列は、ニック部位に隣接する内生DNA配列に相補的な単鎖DNAフラップをコードしていてもよく、ここで単鎖DNAフラップは、所望のヌクレオチド変化を含む。単鎖DNAフラップは、ニック部位にて内生単鎖DNAに取って代わってもよい。ニック部位にて取って代わられた内生単鎖DNAは、5'末を有し、内生フラップを形成し得るが、これは細胞によって切除され得る。様々な態様において、5'末内生フラップを除去することが、単鎖3'DNAフラップの、対応する相補的なDNA鎖とのハイブリダイゼーション、および単鎖3'DNAフラップが持つ所望のヌクレオチド変化の標的DNA中への組み込みまたは同化を促すところ、5'末内生フラップの切除は、産物形成を推進するのに役立ち得る。

伸長されたガイドRNAの様々な態様において、単鎖DNAフラップの細胞修復は、所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、これによって所望の産物が形成される。

なお他の態様において、所望のヌクレオチド変化は、ニック部位の約-5～+5の間、またはニック部位の約-10～+10の間、またはニック部位の約-20～+20の間、またはニック部位の約-30～+30の間、またはニック部位の約-40～+40の間、またはニック部位の約-50～+50の間、またはニック部位の約-60～+60の間、またはニック部位の約-70～+70の間、またはニック部位の約-80～+80の間、またはニック部位の約-90～+90の間、またはニック部位の約-100～+100の間、またはニック部位の約-200～+200の間である編集窓上に組み入れされる。
他の態様において、所望のヌクレオチド変化は、ニック部位から約+1から+2、またはニック部位から約+1～+3、+1～+4、+1～+5、+1～+6、+1～+7、+1～+8、+1～+9、+1～+10、+1～+11、+1～+12、+1～+13、+1～+14、+1～+15、+1～+16、+1～+17、+1～+18、+1～+19、+1～+20、+1～+21、+1～+22、+1～+23、+1～+24、+1～+25、+1～+26、+1～+27、+1～+28、+1～+29、+1～+30、+1～+31、+1～+32、+1～+33、+1～+34、+1～+35、+1～+36、+1～+37、+1～+38、+1～+39、+1～+40、+1～+41、+1～+42、+1～+43、+1～+44、+1～+45、+1～+46、+1～+47、+1～+48、+1～+49、+1～+50、+1～+51、+1～+52、+1～+53、+1～+54、+1～+55、+1～+56、+1～+57、+1～+58、+1～+59、+1～+60、+1～+61、+1～+62、+1～+63、+1～+64、+1～+65、+1～+66、+1～+67、+1～+68、+1～+69、+1～+70、+1～+71、+1～+72、+1～+73、+1～+74、+1～+75、+1～+76、+1～+77、+1～+78、+1～+79、+1～+80、+1～+81、+1～+82、+1～+83、+1～+84、+1～+85、+1～+86、+1～+87、+1～+88、+1～+89、+1～+90、+1～+90、+1～+91、+1～+92、+1～+93、+1～+94、+1～+95、+1～+96、+1～+97、+1～+98、+1～+99、+1～+100、+1～+101、+1～+102、+1～+103、+1～+104、+1～+105、+1～+106、+1～+107、+1～+108、+1～+109、+1～+110、+1～+111、+1～+112、+1～+113、+1～+114、+1～+115、+1～+116、+1～+117、+1～+118、+1～+119、+1～+120、+1～+121、+1～+122、+1～+123、+1～+124、もしくは+1～+125の間である編集窓上に組み入れされる。

なお他の態様において、所望のヌクレオチド変化は、ニック部位から約+1から+2の間、またはニック部位から約+1～+5、+1～+10、+1～+15、+1～+20、+1～+25、+1～+30、+1～+35、+1～+40、+1～+45、+1～+50、+1～+55、+1～+100、+1～+105、+1～+110、+1～+115、+1～+120、+1～+125、+1～+130、+1～+135、+1～+140、+1～+145、+1～+150、+1～+155、+1～+160、+1～+165、+1～+170、+1～+175、+1～+180、+1～+185、+1～+190、+1～+195、もしくは+1～+200である編集窓上に組み入れされる。

様々な側面において、伸長されたガイドRNAは、ガイドRNAの修飾バージョンである。ガイドRNAは、天然に存在するものであっても、コードする核酸から発現されても、または化学的に合成されてもよい。着目するゲノムの標的部位の標的鎖と相互作用してハイブリダイズするプロトスペーサー配列を包含する、ガイドRNAを入手またはそうでなければ合成するための方法、およびガイドRNAの適切な配列を決定するための方法は、当該技術分野において周知である。

様々な態様において、ガイドRNA配列の具体的なデザイン側面は、PAM配列の場所、標的配列中のパーセントG/C含量、マイクロ相同領域の程度、2次構造等々などの他の因子の中でも、着目するゲノム標的部位のヌクレオチド配列(すなわち、編集されるべき所望の部位)と、本明細書に記載のプライム編集系に存在するnapDNAbpの型(例として、Cas9タンパク質)とに依存するであろう。

一般に、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列との充分な相補性を有するいずれのポリヌクレオチド配列であって、標的配列とハイブリダイズし、かつnapDNAbp(例として、Cas9、Cas9ホモログ、またはCas9バリアント)の標的配列への配列特異的結合に向けるものである。いくつかの態様において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適な整列(alignment)アルゴリズムを使用して最適に整列されたとき、約50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％以上、またはこれらより高い。最適な整列は、配列を整列させるためのいずれか好適なアルゴリズムの使用で決定されてもよく、前記アルゴリズムの非限定例は、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler Transform(例として、Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies)、ELAND(Illumina,San Diego,Calif.)、SOAP(soap.genomics.org.cnにて利用可能)、およびMaq(maq.sourceforge.netにて利用可能)に基づくアルゴリズムを包含する。いくつかの態様において、ガイド配列は、長さが約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75ヌクレオチド以上であるか、またはこれらより長い。

いくつかの態様において、ガイド配列は、長さが約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12ヌクレオチド未満であるか、またはこれらより短い。ガイド配列の、プライム編集因子(PE)の標的配列への配列特異的結合に向ける能力は、いずれの好適なアッセイによっても査定されてもよい。例えば、プライム編集因子(PE)の構成要素(試験されるべきガイド配列を包含する)は、本明細書に開示のプライム編集因子(PE)の構成要素をコードするベクターでのトランスフェクション、これに続く、本明細書に記載のとおりのSurveyorアッセイなどによる標的配列内の優先的な切断の査定などによって、対応する標的配列を有する宿主細胞へ提供されてもよい。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は試験管中、標的配列、プライム編集因子(PE)の構成要素(試験されるべきガイド配列を包含する)、および試験ガイド配列とは異なる制御ガイド配列を提供すること、ならびに試験ガイド配列とおよび制御ガイド配列との間の反応の、標的配列での結合または切断率を比較することによって、評価されてもよい。他のアッセイもなし得、当業者に思い当たるものであろう。

ガイド配列は、いずれの標的配列をも標的にするのに選択されてもよい。いくつかの態様において、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示の標的配列は、標的ゲノム中にユニークな配列を包含する。例えば、S.pyogenes Cas9について、ゲノム中のユニークな標的配列は、形態MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG(配列番号204)のCas9標的部位を包含していてもよく、ここでNNNNNNNNNNNNXGG(配列番号205)(Nは、A、G、T、またはCである;およびXは、何であってもよい)。ゲノム中のユニークな標的配列は、形態MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG(配列番号206)のS.pyogenes Cas9標的部位を包含していてもよく、ここでNNNNNNNNNNNXGG(配列番号207)(Nは、A、G、T、またはCである;およびXは、何であってもよい)。S.thermophilus CRISPR1Cas9について、ゲノム中のユニークな標的配列は、形態MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW(配列番号208)のCas9標的部位を包含していてもよく、ここでNNNNNNNNNNNNXXAGAAW(配列番号209)(Nは、A、G、T、またはCである;Xは、何であってもよい;およびWは、AまたはTである)。ゲノム中のユニークな標的配列は、形態MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW(配列番号210)のS.thermophilus CRISPR1 Cas9標的部位を包含していてもよく、ここでNNNNNNNNNNNXXAGAAW(配列番号211)(Nは、A、G、T、またはCである;Xは、何であってもよい;およびWは、AまたはTである)。S.pyogenes Cas9について、ゲノム中のユニークな標的配列は、形態MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG(配列番号212)のCas9標的部位を包含していてもよく、ここでNNNNNNNNNNNNXGGXG(配列番号213)(Nは、A、G、T、またはCである;およびXは、何であってもよい)。ゲノム中のユニークな標的配列は、形態MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG(配列番号214)のS.pyogenes Cas9標的部位を包含していてもよく、ここでNNNNNNNNNNNXGGXG(配列番号215)(Nは、A、G、T、またはC;およびXは、何であってもよい)。これらの配列の各々において、「M」は、A、G、T、またはCであってもよく、配列をユニークなものとして同定する際に考慮される必要はない。

いくつかの態様において、ガイド配列は、ガイド配列内の2次構造の程度を低減するよう選択される。2次構造は、いずれの好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによっても決定されてもよい。いくつかのプログラムは、最小限のギブス(Gibbs)自由エネルギーを算出することに基づく。かかるアルゴリズムの1つの例は、ZukerおよびStiegler(Nucleic Acids Res.9(1981),133-148)によって記載されるとおりの、mFoldである。別の例の折り畳みアルゴリズムは、重心構造予測アルゴリズムを使用する、ウィーン大学(University of Vienna)の理論化学研究所(Institute for Theoretical Chemistry)にて開発された、オンラインウェブサーバRNA foldである(例として、A.R.Gruber et al.,2008,Cell 106(1):23-24;およびPA Carr and GM Church,2009,Nature Biotechnology 27(12):1151-62を参照)。さらなるアルゴリズムは、米国出願第61/836,080号;Broad参照BI-2013/004A)に見出されるものであってもよい(参照により本明細書に組み込まれる)。

一般的に、tracrメイト配列は:(1)対応するtracr配列を含有する細胞におけるtracrメイト配列によってフランキングされるガイド配列の切除;および(2)標的配列における複合体の形成の1つ以上を促進するために、tracr配列との十分な相補性を有するいずれかの配列を包含し、複合体は、tracr配列にハイブリダイズしたtracrメイト配列を含む。一般的に、相補性の度合は、2つの配列の短い方の長さに沿って、tracrメイト配列およびtracr配列の最適な整列の参照によってである。最適な整列は、いずれの好適な整列アルゴリズムによっても決定されてもよく、さらにtracr配列またはtracrメイト配列のいずれかの配列内に自己相補性などの2次構造を構成していてもよい。いくつかの態様において、tracr配列とtracrメイト配列との間の相補性の程度は、その2つのより短い長さに沿って最適に整列されたとき、約25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％以上、またはこれらより高い。いくつかの態様において、tracr配列は、長さが約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50ヌクレオチド以上、またはこれらより長い。いくつかの態様において、tracr配列およびtracrメイト配列は、その2つの間のハイブリダイゼーションがヘアピンなどの2次構造を有する転写産物を産生するように、単一転写産物内に含有される。ヘアピン構造における使用のための好ましいループ形成配列は、長さが4ヌクレオチドであり、最も好ましくは配列GAAAを有する。しかしながら、より長いまたはより短いループ配列も、代替の配列になり得るよう(as may alternative sequences)使用されてもよい。配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット(例えば、AAA)、および追加のヌクレオチド(例えばCまたはG)を包含する。ループ形成配列の例は、CAAAおよびAAAGを包含する。本発明の態様において、転写産物または転写されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも2つの、またはそれより多くのヘアピンを有する。好ましい一態様において、転写産物は、2、3、4または5つのヘアピンを有する。本発明のさらなる態様において、転写産物は、最大でも5つのヘアピンを有する。いくつかの態様において、単一の転写産物はさらに、転写終止配列を包含する;好ましくは、これは、ポリT配列、例えば6つのTヌクレオチドを包含する。ガイド配列、tracrメイト配列、およびtracr配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定例は、以下のとおりであるが(5'→3'に列挙)、ここで「N」は、ガイド配列の塩基を表し、第1ブロックの小文字は、tracrブロック配列を表し、および第2ブロックの小文字は、tracr配列を表し、および最後のポリT配列は、転写ターミネータを表す:(1)NNNNNNNNGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAGAAATAAATCTTGCAGAAGCTACAAAGATAAGGCTTCATGCCGAAATCAACACCCTGTCATTTTATGGCAGGGTGTTTTCGTTATTTAATTTTTT(配列番号216);

(2)NNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT(配列番号217);

(3)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTT(配列番号218);

(4)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT(配列番号219);

(5)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtgTTTTTTT(配列番号220);および

(6)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTTTTT(配列番号221)。

いくつかの態様において、配列(1)～(3)は、S.thermophilus CRISPR1からのCas9と組み合わせて使用される。いくつかの態様において、配列(4)～(6)は、S.pyogenesからのCas9と組み合わせて使用される。いくつかの態様において、tracr配列は、tracrメイト配列を含む転写産物とは別々の転写産物である。

Cas9ドメインと単鎖DNA結合タンパク質とを含む本明細書に開示のとおりの融合タンパク質のいずれも、標的部位(例として、編集されるべき点突然変異を含む部位)に対して、標的にさせるために、典型的には、融合タンパク質をガイドRNA(例として、sgRNA)と一緒に共発現させることが必要であることは、当業者には明らかであろう。本明細書中、他のどこかでより詳細に説明されるとおり、ガイドRNAは、典型的には、Cas9結合を可能にさせるtracrRNAフレームワークと、配列特異性をCas9:核酸編集酵素/ドメイン融合タンパク質へ付与するガイド配列とを含む。

いくつかの態様において、ガイドRNAは、構造5'-[ガイド配列]-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUU-3'(配列番号222)を含み、ここでガイド配列は、標的配列に相補的な配列を含む。ガイド配列は、典型的には20ヌクレオチド長である。Cas9:核酸編集酵素/ドメイン融合タンパク質を特定のゲノム標的部位に対して標的にさせるための好適なガイドRNAの配列は、本開示に基づき当業者に明らかであろう。かかる好適なガイドRNA配列は、典型的には、編集されるべき標的ヌクレオチドから50ヌクレオチド以内上流または下流の核酸配列に相補的なガイド配列を含む。提供される融合タンパク質に、特定の標的配列を標的にさせるのに好適ないくつかの例示のガイドRNA配列は、本明細書に提供される。追加のガイド配列は、当該技術分野において周知であり、本明細書に記載のプライム編集因子(PE)とともに使用され得る。

他の態様において、PEgRNAは、図3Dに描かれるものを包含する。

更なる他の態様において、PEgRNAは、図3Eに描かれるものを包含していてもよい。

図3Dは、本明細書に企図され、例2に定義される方法論に従ってデザインされてもよい、ある態様のPEgRNAの構造を提供する。PEgRNAは、5'→3'方向に順序付けられた3大構成要素、つまり:スペーサー、gRNAコア、および3'末にて伸長アームを含む。伸長アームはさらに、5'→3'方向に以下の構造要素、つまり:プライマー結合部位(A)、編集鋳型(B)、および相同アーム(C)に分けられてもよい。加えて、PEgRNAは、任意の3'末修飾領域(e1)および任意の5'末修飾領域(e2)を含んでいてもよい。またさらに、PEgRNAは、PEgRNAの3'末にて転写終止シグナルを含んでいてもよい(描かれず)。これらの構造要素はさらに本明細書に定義される。PEgRNA構造の描画は、限定することを意図しておらず、要素の配置におけるバリエーションを網羅するものである。例えば、任意の配列修飾因子(e1)および(e2)は、示されるいずれの他の領域内またはそれらの間に位置付けられ得るものであって、3'末および5'末にて位置付けられることに限定され得ない。

図3Eは、本明細書に企図され、例2に定義される方法論に従ってデザインされてもよい、別の態様のPEgRNAの構造を提供する。PEgRNAは、5'→3'方向に順序付けられた3大構成要素、つまり:スペーサー、gRNAコア、および3'末にて伸長アームを含む。伸長アームはさらに、5'→3'方向に以下の構造要素、つまり:プライマー結合部位(A)、編集鋳型(B)、ならびに相同アーム(C)に分けられてもよい。加えて、PEgRNAは、任意の3'末修飾領域(e1)および任意の5'末修飾領域(e2)を含んでいてもよい。またさらに、PEgRNAは、PEgRNAの3'末にて転写終止シグナルを含んでいてもよい(描かれず)。これらの構造要素はさらに本明細書に定義される。PEgRNA構造の描画は、限定することを意図しておらず、要素の配置におけるバリエーションを網羅するものである。例えば、任意の配列修飾因子(e1)および(e2)は、示されるいずれの他の領域内またはそれらの間に位置付けられ得るものであって、3'末および5'末にて位置付けられることに限定され得ない。

PEgRNAはまた、PEgRNAの特性および/または特徴を修飾してもよい追加のデザイン改善点も包含していてもよく、これによってプライム編集の有効性が改善される。様々な態様において、これらの改善点は、数多の種々のカテゴリーの1以上に属するものであってもよく、これらに限定されないが、以下を包含する:(1)非ポリメラーゼIII(pol III)プロモーターからの機能的PEgRNAの効率的な発現を可能にさせるデザイン(これによって厄介な配列要件もなく、より長いPEgRNAの発現が可能になるであろう);(2)コア、Cas9結合PEgRNA骨格への改善点(これによって有効性が改善され得る);(3)RT処理能力(processivity)を改善する、PEgRNAへの修飾(標的にされたゲノム遺伝子座にてより長い配列の挿入が可能になる);および(4)RNAモチーフの、PEgRNAの5'末端または3'末端への付加(これによって、PEgRNA安定性が改善されるか、RT処理能力が増強されるか、PEgRNAの誤った折り畳みが防止されるか、またはゲノム編集に重要な追加の因子が動員される)。

一態様において、PEgRNAは、より大きな伸長アームをもつより長い長さのPEgRNAの発現を改善するよう、pol IIIプロモーターでデザインされ得る。sgRNAは、典型的には、U6 snRNAプロモーターから発現される。このプロモーターは、pol IIIを動員して関連RNAを発現するものであって、核内に保持される短いRNAの発現に有用である。しかしながら、pol IIIは、処理能力がそれほど高くなく、効率的なゲノム編集に要されるレベルにて長さが数百ヌクレオチドより長いRNAを発現することができない。加えて、pol IIIは、伸展したU(streches of U's)にて失速または終止し、PEgRNAを使用して挿入され得る配列多様性を潜在的に限定し得る。ポリメラーゼII(pCMVなど)またはポリメラーゼI(U1 snRNAプロモーターなど)を動員する他のプロモーターも、それらのより長いsgRNAの発現能について調べられている。しかしながら、これらのプロモーターは、典型的には、部分的に転写され、これによって、発現されたPEgRNA中スペーサーの5'に余分な配列がもたらされ、このことは部位依存的なやり方で著しく低減されたCas9:sgRNA活性をもたらすことが示されている。加えて、pol III転写のPEgRNAは、6～7つ伸びたUにおいて簡単に終止し得るのに対し、pol IIまたはpol Iから転写されたPEgRNAは、異なる終止シグナルを要するであろう。しばしば、かかるシグナルはまた、ポリアデニル化ももたらし、これによってPEgRNAの核からの望ましくない輸送がもたらされるであろう。同様に、pol IIプロモーター(pCMVなど)から発現されるRNAは、典型的には、5'にキャップされており、それらの核外輸送もまたもたらされる。

これまでに、Rinnおよび共同研究者らは、長鎖非コーディングRNA(lncRNA)でタグ付けされたsgRNAの産生のための様々な発現プラットホームをスクリーニングした¹⁸³。これらのプラットホームは、pCMVから発現され、ヒトのMALAT1 ncRNAからのENE要素¹⁸⁴、KSHVからのPAN ENE要素¹⁸⁵、またはU1 snRNAからの3'ボックス¹⁸⁶において終止するRNAを包含する。注目すべきことに、MALAT1 ncRNAおよびPAN ENEは、ポリAテールを保護する三重ヘリックスを形成する^184,187。これらの構築物はまた、RNA安定性をも増強し得る。これらの発現系はまた、より長いPEgRNAの発現も可能にさせるであろうことが企図される。

加えて、一連の方法は、PEgRNAの一部として転写されるであろうpol IIプロモーターの部分の切断のためにデザインされており、自己切断型リボザイム(ハンマーヘッド¹⁸⁸、ピストル¹⁸⁹、ハチェット¹⁸⁹、ヘアピン¹⁹⁰、VS¹⁹¹、ツイスター¹⁹²、もしくはツイスターシスター¹⁹²リボザイムなど)、または転写されたガイドを処理する他の自己切断型要素、またはCsy4によって認識されまたガイドのプロセシングへも繋がるヘアピン¹⁹³のいずれかが付加されている。また、複数のENEモチーフの組み込みは、これまでKSHV PAN RNAおよび要素について実証されたとおり¹⁸⁵、改善されたPEgRNA発現および安定性へ繋がり得ることも仮定される。PEgRNAを環状イントロンRNA(ciRNA)の形態に環化することはまた、増強されたRNAの発現および安定性、ならびに核局在化へも繋がり得ることもまた、予想される¹⁹⁴。

様々な態様において、PEgRNAは、以下の配列によって例示されるとおり、上の様々な要素を包含していてもよい。

非限定例1－pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、およびMALAT1 ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTAGGGTCATGAAGGTTTTTCTTTTCCTGAGAAAACAACACGTATTGTTTTCTCAGGTTTTGCTTTTTGGCCTTTTTCTAGCTTAAAAAAAAAAAAAGCAAAAGATGCTGGTGGTTGGCACTCCTGGTTTCCAGGACGGGGTTCAAATCCCTGCGGCGTCTTTGCTTTGACT(配列番号223)

非限定例2－pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、およびPAN ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号224)

非限定例3－pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3×PAN ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACACACTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTCTCTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号225)

非限定例4－pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3'ボックスからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号226)

非限定例5－pU1、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3'ボックスからなるPEgRNA発現プラットホーム
CTAAGGACCAGCTTCTTTGGGAGAGAACAGACGCAGGGGCGGGAGGGAAAAAGGGAGAGGCAGACGTCACTTCCCCTTGGCGGCTCTGGCAGCAGATTGGTCGGTTGAGTGGCAGAAAGGCAGACGGGGACTGGGCAAGGCACTGTCGGTGACATCACGGACAGGGCGACTTCTATGTAGATGAGGCAGCGCAGAGGCTGCTGCTTCGCCACTTGCTGCTTCACCACGAAGGAGTTCCCGTGCCCTGGGAGCGGGTTCAGGACCGCTGATCGGAAGTGAGAATCCCAGCTGTGTGTCAGGGCTGGAAAGGGCTCGGGAGTGCGCGGGGCAAGTGACCGTGTGTGTAAAGAGTGAGGCGTATGAGGCTGTGTCGGGGCAGAGGCCCAAGATCTCAGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTCAGCAAGTTCAGAGAAATCTGAACTTGCTGGATTTTTGGAGCAGGGAGATGGAATAGGAGCTTGCTCCGTCCACTCCACGCATCGACCTGGTATTGCAGTACCTCCAGGAACGGTGCACCCACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号227).

様々な他の態様において、PEgRNAは、改善点を骨格またはコア配列へ導入することによって改善されてもよい。これは、知られているものを導入することによってなされ得る。

コア、Cas9結合PEgRNA骨格はおそらく、PE活性を増強するのにも改善され得る。数種のかかるアプローチは既に実証されている。実例として、骨格の第1の対形成要素(P1)は、GTTTT-AAAAC対形成要素を含有する。かかるT(複数)の伸びは、RNA転写産物のpol III休止(pausing)および未成熟終止をもたらすことが示されている。このP1の部分におけるT-A対の1つの、G-C対への合理的な突然変異は、sgRNA活性を増強するのが示されたが、このアプローチもまたPEgRNAに対して実現可能であろうことを示唆する¹⁹⁵。加えて、P1の長さを増大することはまた、sgRNAの折り畳みを増強して改善された活性へ繋がることも示されたが¹⁹⁵、これはPEgRNA活性の改善のための別の道として示唆される。コアへの改善点の例は以下を包含し得る:

P1まで6nt伸長を含有するPEgRNA
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGCTCATGAAAATGAGCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号228)

P1内にT-A→G-C突然変異を含有するPEgRNA
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTGAGAGCTAGAAATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号229)

様々な他の態様において、PEgRNAは、修飾を編集鋳型領域へ導入することによって改善されてもよい。PEgRNAによって鋳型にされた(templated)挿入のサイズが増大するにつれて、エンドヌクレアーゼによって分解されるか、自発的加水分解を経るか、または折り畳まれることで2次構造(RTによって逆転写され得ないか、もしくはPEgRNA骨格の折り畳みおよびこれに続くCas9-RT結合を妨害する)になるか、になる可能性が高い。結果的に、PEgRNAの鋳型への修飾が、遺伝子全体の挿入などの大きな挿入に影響を及ぼす必要もあり得る。そうするためのいくつかのストラテジーは、合成または半合成PEgRNA内の修飾ヌクレオチドの組み込み(RNAを、分解もしくは加水分解に対してより耐性があるようにさせるか、または阻害性の2次構造を採用する可能性を低くさせる)を包含する¹⁹⁶。かかる修飾は、Gリッチ配列中のRNA2次構造を低減するであろう、8-アザ-7-デアザグアノシン;分解を低減してある種のRNA2次構造を増強する、ロックド核酸(LNA);RNA安定性を増強する、2'-O-メチル修飾、2'-フルオロ修飾、または2'-O-メトキシエトキシ修飾を包含し得る。かかる修飾はまた、安定性および活性を増強するために、PEgRNA中の他のどこかにも包含され得る。代わりに、または加えて、PEgRNAの鋳型は、所望のタンパク質産物をコードするのとともに、RTによって折り畳まれ得ない単純な2次構造を採用する可能性もまた高くなるように、デザインされ得る。かかる単純な構造は、熱力学的な流し台(sink)として作用するであろうが、これによって逆転写を防止するであろうより複雑な構造が生じる可能性が低くなる。最終的に、鋳型を分裂させて2つ別々のPEgRNAにすることもまたあり得ることである。かかるデザインにおいて、PEは、Cas9と融合したRNA結合タンパク質またはPEgRNA自身上のRNA認識要素(MS2アプタマーなど)を介して、転写を開始すること、また別々の鋳型RNAを標的にされた部位へ動員することにも使用されるであろう。RTは、この別々の鋳型RNAへ直接結合するか、または第2鋳型と入れ替える(swapping to)前に元のPEgRNA上で逆転写を開始するか、のいずれかであり得る。かかるアプローチは、長い鋳型を付加した際にPEgRNAの誤った折り畳みを予防することのみならず、長い挿入を生じさせるのにゲノムからのCas9の解離(おそらくPEベースの長い挿入を阻害している可能性がある)を要さないことによってもまた、長い挿入を可能にさせ得る。

更なる他の態様において、PEgRNAは、PEgRNAの5'およびは3'末端にて、それらの間の位置(例として、gRNAコア領域中もしくはスペーサー中)にてさえも、追加のRNAモチーフを導入することによって改善されることもある。数種のかかるモチーフ－KSHVからのPAN ENEおよびMALAT1からのENEなどを、非pol IIIプロモーターからのより長いPEgRNAの発現を終止させ得る手段として、上に考察した。これらの要素は、ポリAテールを飲み込むRNA三重ヘリックスを形成し、それらの核内への保持をもたらす^184,187。しかしながら、末端ヌクレオチドを塞ぐ複合体構造をPEgRNAの3'末端にて形成することによって、これらの構造はまた、PEgRNAのエキソヌクレアーゼ媒介分解を予防するのにも役立つ可能性があろう。

3'末端にて挿入された他の構造要素もまた、非pol IIIプロモーターからの終止を可能にさせることはせずとも、RNA安定性を増強し得る。かかるモチーフは、3'末端を塞ぐであろうヘアピンもしくはRNA四重鎖¹⁹⁷、または3'末端にて2'-3'-環状ホスファートの形成をもたらし、また潜在的にPEgRNAをエキソヌクレアーゼによって分解される可能性を低くもさせるHDVなどの自己切断型リボザイム¹⁹⁸を包含し得る。不完全なスプライシングを介してPEgRNAを環化するのに誘導する－ciRNAを形成する－ことはまた、PEgRNA安定性を増大させてPEgRNAが核内に保持されることももたらし得る¹⁹⁴。

追加のRNAモチーフはまた、RT処理能力をも改善し得るか、またはDNA-RNA二重鎖へのRTの結合を増強することによってPEgRNA活性をも増強し得る。RTによって結合されるネイティブ配列の、その同族のレトロウイルスゲノム中での付加は、RT活性を増強し得る¹⁹⁹。これは、レトロウイルスゲノム二量体化および転写開始に関与する、ネイティブプライマー結合部位(PBS)、ポリプリントラクト(PPT)、またはキッシングループを包含し得る¹⁹⁹。

二量体化チーフ－キッシングループまたはGNRAテトラループ/テトラループ受容体対²⁰⁰など－の、PEgRNAの5'末端および3'末端での付加はまた、PEgRNAの有効な環状化をももたらし得、安定性が改善される。加えて、これらモチーフの付加は、PEgRNAスペーサーとプライマーとの物理的な分離、PE活性の妨げになるであろうスペーサー閉塞への予防を可能にさせ得ることが想像される。スペーサー領域中もしくはプライマー結合部位に沿って小さいトウホールド(toehold)ヘアピンを形成する、PEgRNAへの短い5'伸長もしくは3'伸長はまた、好ましくは、PEgRNAの長さに沿って分子内相補領域のアニーリング(例として、スペーサーとプライマー結合部位との間に生じ得る相互作用)に対しても競合し得る。最終的に、キッシングループはまた、他の鋳型RNAをゲノム部位へ動員するのにも、あるRNAから他のRNAへのRT活性の入れ替えを可能にさせるのにも、使用され得る。様々な2次構造の例示の態様として、図3Dおよび図3Eに描かれるPEgRNAは、示されるとおり伸長アームの末端部分(すなわち、e1およびe2)にあるものを包含する、数多の2次RNA構造(改変されることで、PEgRNAのいずれの領域にもなり得る)を列挙する。

改善例は、これらに限定されないが、以下を包含する:

PEgRNA-HDV融合体
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号230)

PEgRNA-MMLVキッシングループ
GGTGGGAGACGTCCCACCGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCTTTTTTT(配列番号231)

PEgRNA-VSリボザイムキッシングループ
GAGCAGCATGGCGTCGCTGCTCACGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTCCATCAGTTGACACCCTGAGGTTTTTTT(配列番号232)

PEgRNA-GNRAテトラループ/テトラループ受容体
GCAGACCTAAGTGGUGACATATGGTCTGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAUACGTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTUACGAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGCATGCGATTAGAAATAATCGCATGTTTTTTT(配列番号233)

2次RNA-HDV融合体を切り替える(switching)PEgRNA鋳型
TCTGCCATCAAAGCTGCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号234)

PEgRNA骨格は、SpCas9およびプライム編集因子(PE)の改善のされ方に類似した様式で、指向進化を介してさらに改善され得る。指向進化は、Cas9または進化したCas9バリアントによるPEgRNA認識を増強し得る。加えて、種々のPEgRNA骨格配列はおそらく、種々のゲノム遺伝子座にて最適であって、問題になっている部位にてPE活性を増強するか、オフターゲット活性を低減するか、またはその両方のいずれかであろう。最終的に、他のRNAモチーフが付加されたPEgRNA骨格の進化は、未進化の融合RNAと比べて、融合されたPEgRNAの活性をほぼ必ず改善するであろう。実例として、c-ジ-GMP-Iアプタマーおよびハンマーヘッド型リボザイムから構成されるアロステリックリボザイムの進化は、劇的に改善された活性へ繋がったが²⁰²、これは進化がハンマーヘッド-PEgRNA融合体の活性も改善するであろうことを示唆する。加えて、Cas9は現行では一般的にsgRNAの5'伸長を忍容しないが、指向性進化は、蓋然的には、この非忍容性を和らげる有能な変異を生成し、追加のRNAモチーフが利用されることを許すであろう。

本開示は、ここで開示されるプライム編集システムの効力をさらに改善するためのいずれかのかかるやり方を企図する。

連続した一連のTはPEgRNAが転写される容量を限定し得るので、種々の態様においては、伸長アームからのTの連続した配列の出現を限定することが有利であり得る。例えば、少なくとも3つの連続したT、少なくとも4つの連続したT、少なくとも5つの連続したT、少なくとも6つの連続したT、少なくとも7つの連続したT、少なくとも8つの連続したT、少なくとも9つの連続したT、少なくとも10の連続したT、少なくとも11の連続したT、少なくとも12の連続したT、少なくとも13の連続したT、少なくとも14の連続したT、または少なくとも15の連続したTのストリングは、PEgRNAをデザインするときに回避されるべきであるか、または少なくとも最終的なデザインされた配列からは除去されるべきである。1つの態様では、連続したA:T核酸塩基対がリッチである標的部位を回避する以外に、PEgRNA伸長アーム上の連続したTの欲されないストリングの包含を回避し得る。

トランスプライム編集のための分裂PEgRNAデザイン
本開示はトランスプライム編集をもまた企図する。これは、PEgRNAを2つの別物の分子:ガイドRNAおよびtPERT分子へと分離することによって作動するプライム編集の改変されたバージョンを言う。tPERT分子は、標的DNA部位においてプライム編集因子複合体と共局在するようにプログラムされ、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型をプライム編集因子にトランスで持って来る。例えば、トランスプライム編集因子(tPE)の態様については図3Gを見よ。これは、(1)動員タンパク質(RP)-PE:gRNA複合体と(2)RNA-タンパク質動員ドメイン(例えば、ステムループまたはヘアピン)に連結されたプライマー結合部位およびDNA合成鋳型を包含するtPERTとを含む2構成要素システムを示す。RP-PE:gRNA複合体の動員タンパク質構成要素は編集されるべき標的部位へとtPERTを動員し、それによって、PBSおよびDNA合成鋳型をプライム編集因子とトランスで会合させる。別の言い方をすると、tPERTは、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型を包含するPEgRNAの伸長アーム(の全てまたは一部)を含有するように操作される。このアプローチの1つの利点はPEgRNAの伸長アームをガイドRNAから分離することであり、それによって、伸長アームのPBSとガイドRNAのスペーサー配列との間に生起する傾向があるアニーリング相互作用を最小化する。

トランスプライム編集の鍵の特色は、トランスプライム編集因子がtPERTをDNA編集の部位へと動員する能力であり、それによってプライム編集の部位においてPEgRNAの機能の全てを有効に共局在させる。動員は、MS2アプタマーなどのRNA-タンパク質動員ドメインをtPERTに組み入れることと、対応する動員タンパク質をRNA-タンパク質動員ドメインに特異的に結合することができるプライム編集因子に(例えば、リンカーを介してnapDNAbpに、またはリンカーリンカーを介してポリメラーゼに)融合することとによって達成され得、それによってtPERT分子をプライム編集因子複合体へと動員する。図3Hに記載されているプロセスに図示されているとおり、RP-PE:gRNA複合体は標的DNA配列に結合およびニッキングする。それから、動員タンパク質(RP)は、DNA標的部位に結合したプライム編集因子複合体に共局在するようにtPERTを動員し、それによって、tPERT上に位置付けられたプライマー結合部位がニッキングされた鎖上のプライマー配列に結合することを許し、爾後に、ポリメラーゼ(例えばRT)がtPERTの5'端からtPERT上に位置付けられたDNA合成鋳型に対してDNAの一本鎖を合成することを許す。

tPERTは図3Gおよび図3HにおいてはPBSおよびDNA合成鋳型をRNA-タンパク質動員ドメインの5'端に含むとして示されているが、他の構成のtPERTは、RNA-タンパク質動員ドメインの3'端に位置付けられたPBSおよびDNA合成鋳型を有してデザインされ得る。しかしながら、5’伸長を有するtPERTは、DNAの一本鎖の合成が天然にはtPERTの5'端において終結するであろうという利点を有し、それゆえに、プライム編集のDNA合成ステージの間の鋳型としてRNA-タンパク質動員ドメインのいずれかの部分を用いるリスクがない。

PEgRNAデザイン方法
本開示はPEgRNAをデザインするための方法にもまた関する。

デザインの一側面において、デザインアプローチは、プライム編集が用いられようとする具体的な適用を考慮に入れ得る。例えば、本願において例示され論じられるとおり、プライム編集は、限定なしに、(a)変異を修正する変化をヌクレオチド配列に組み入れ、(b)タンパク質およびRNAタグを組み入れ、(c)免疫エピトープを目当てのタンパク質に組み入れ、(d)誘導可能な二量体化ドメインをタンパク質に組み入れ、(e)バイオ分子のその活性を変改するために配列を組み入れまたは除去、(f)特定の遺伝子変化を導くためにリコンビナーゼ標的部位を組み入れ、および(g)エラーを起こしやすいRTを用いることによる標的配列の変異導入をするために用いられ得る。目当ての標的部位におけるヌクレオチド配列を一般的に挿入、変化、または欠失させるこれらの方法に加えて、プライム編集因子は、高度にプログラム可能なライブラリを構築するために、ならびに細胞データ記録および系統トレース研究を行うためにもまた用いられ得る。これらの種々の使用では、本明細書に記載のとおり、これらの適用のいずれかの所与のものにとって特に有用であるPEgRNAの調製に当てはまる具体的なデザイン側面があり得る。

プライム編集のいずれかの具体的な適用または使用のためのPEgRNAをデザインするときには、いくつもの考慮事項が考慮に入れられ得る。これらは:
(a)1つ以上の核酸塩基改変がプライム編集因子によって組み入れされることを望まれる標的配列、すなわちヌクレオチド配列;
(b)標的配列上のカットされる部位の位置付け、すなわち、プライム編集因子が一本鎖ニックを誘導して、ニックの1つの側に3'端RTプライマー配列およびニックの他の側に5'端の内生フラップ(これは究極的にはFEN1またはその等価物によって除去され、3'ssDNAフラップによって置き換えられる)を生出するであろう特定の核酸塩基位置。カットされる部位は「編集の位置付け」に類縁である。なぜなら、これは3'端RTプライマー配列を生出し、これはRNA依存的なDNA重合の間にRTによって伸長されるようになって、所望の編集を含有する3'ssDNAフラップを生出し、これがそれから標的配列上の5'内生DNAフラップを置き換えるからである;
(c)利用可能なPAM配列(標準的なSpCas9 PAM部位、および拡張されたまたは異なるPAM特異性を有するCas9バリアントおよび等価物によって認識される非標準的なPAM部位を包含する);
(d)標的配列上の利用可能なPAM配列とカットされる部位の位置付けとの間の間隔;
(e)用いられようとするプライム編集因子の具体的なCas9、Cas9バリアント、またはCas9等価物;
(f)プライマー結合部位の配列および長さ;
(g)編集鋳型の配列および長さ;
(h)相同アームの配列および長さ;
(i)スペーサー配列および長さ;ならびに
(j)コア配列、
を包含するが、これらに限定されない。

本開示は上のこれらの側面を論ずる。

1つの態様では、好適なPEgRNAと任意に第2部位ニッキングのためのニッキングsgRNAデザインガイドとをデザインするアプローチが、ここに提供される。この態様は、プライム編集のためのPEgRNAおよびニッキングsgRNAをデザインするための説明書のステップバイステップのセットを提供し、これは上の考慮事項の1つ以上を考慮に入れる。ステップは図70A-70Iに示されている例を参照する。
1．標的配列および編集を定める。所望の編集(点変異、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせ)の位置付けを中心とした標的DNA領域(～200bp)の配列をリトリーブする。図70Aを見よ。
2．標的PAMを位置付ける。所望の編集位置付けに対して近位のPAMを同定する。PAMは所望の編集位置付けに対して近位のDNAのどちらかの鎖上に同定され得る。編集位置に近接するPAMが好ましいが(すなわち、ニック部位は編集位置から30nt未満である。または編集位置からニック部位まで29nt、28nt、27nt、26nt、25nt、24nt、23nt、22nt、21nt、20nt、19nt、18nt、17nt、16nt、15nt、14nt、13nt、12nt、11nt、10nt、9nt、8nt、7nt、6nt、5nt、4nt、3nt、もしくは2nt未満)、編集位置から≧30ntのニックを置くプロトスペーサーおよびPAMを用いて編集を組み入れることが可能である。図70Bを見よ。
3．ニック部位を位置付ける。考慮されている各PAMについて、対応するニック部位とどの鎖上かとを同定する。Sp Cas9 H840Aニッカーゼでは、切断はNGG PAMの5'の第3および第4の塩基の間においてPAM含有鎖に生起する。全ての編集されるヌクレオチドはニック部位の3'に存在しなければならない。そのため、適当なPAMはPAM含有鎖上の標的の編集の5'にニックを置かなければならない。下で示される例では、2つの可能なPAMがある。単純のために、残りのステップはPAM 1のみを用いるPEgRNAのデザインを実証する。図70Cを見よ。
4．スペーサー配列をデザインする。Sp Cas9のプロトスペーサーはPAM含有鎖上のNGG PAMの5'の20ヌクレオチドに対応する。効率的なPol III転写開始はGが最初に転写されるヌクレオチドであることを要求する。プロトスペーサーの最初のヌクレオチドがGである場合には、PEgRNAのスペーサー配列は単純にプロトスペーサー配列である。プロトスペーサーの最初のヌクレオチドがGではない場合には、PEgRNAのスペーサー配列は、G、次にプロトスペーサー配列である。図70Dを見よ。
5．プライマー結合部位(PBS)をデザインする。出発アレル配列を用いて、PAM含有鎖上のDNAプライマーを同定する。DNAプライマーの3'端はニック部位のちょうど上流のヌクレオチドである(すなわち、Sp Cas9ではNGG PAMの5'の第4の塩基)。PE2およびPE3への使用のための一般的なデザイン原理として、DNAプライマーに対する12から13ヌクレオチドの相補性を含有するPEgRNAプライマー結合部位(PBS)が、～40-60％GC含量を含有する配列に用いられ得る。低いGC含量を有する配列では、より長い(14から15nt)PBSが試験されるべきである。より高いGC含量を有する配列では、より短い(8から11nt)PBSが試験されるべきである。GC含量にかかわらず、最適なPBS配列は経験的に決定されるはずである。長さpのPBS配列をデザインするためには、出発アレル配列を用いて、PAM含有鎖上のニック部位の5'の最初のpヌクレオチドの逆相補体を取る。図70Eを見よ。
6．RT鋳型(またはDNA合成鋳型)をデザインする。RT鋳型(または、ポリメラーゼが逆転写酵素ではないところでは、DNA合成鋳型)は、デザインされた編集と編集に隣接する配列に対する相同性とをコードする。1つの態様では、これらの領域は図3Dおよび図3EのDNA合成鋳型に対応し、DNA合成鋳型は「編集鋳型」および「相同アーム」を含む。最適なRT鋳型長さは標的部位に基づいて変わる。ショートレンジ編集(位置+1から+6)では、短い(9から12nt)、中程度の(13から16nt)、および長い(17から20nt)RT鋳型を試験することが推奨される。ロングレンジ編集(位置+7以降)では、十分な3'DNAフラップ相同性を許すように、編集の位置から少なくとも5nt(好ましくは10nt以上)伸長するRT鋳型を用いることが推奨される。ロングレンジ編集では、機能的なデザインを同定するために、いくつかのRT鋳型がスクリーニングされるべきである。より大きい挿入および欠失(≧5nt)では、RT鋳型上へのより多大な3'相同性(～20nt以上)の組み込みが推奨される。RT鋳型が、逆転写されるDNA産物上の最後のヌクレオチドとしてのG(PEgRNAのRT鋳型上のCに対応する)の合成をコードするときには、編集効率は典型的には損なわれる。多くのRT鋳型が効率的なプライム編集を支持するので、RT鋳型をデザインするときには、最後の合成されるヌクレオチドとしてのGの回避が推奨される。長さrのRT鋳型配列をデザインするためには、所望のアレル配列を用い、PAMを元々含有した鎖上のニック部位の3'の最初のrヌクレオチドの逆相補体を取る。SNP編集と比較して、同じ長さのRT鋳型を用いる挿入または欠失編集は同一の相同性を含有しないであろうということに注意せよ。図70Fを見よ。
7．完全なPEgRNA配列をアセンブリする。PEgRNA構成要素を次の順序(5'から3')でコンカテネーションする:スペーサー、骨格、RT鋳型、およびPBS。図70Gを見よ。
8．PE3のためのニッキングsgRNAをデザインする。編集の上流および下流の非編集鎖上のPAMを同定する。最適なニッキング位置は高度に座位依存的であり、経験的に決定されるはずである。一般的に、PEgRNAによって誘導されるニックの向かいの位置の40から90ヌクレオチド5'に置かれたニックは、より高い編集収量およびより少数のインデルに至る。ニッキングsgRNAは、出発アレル上の20ntプロトスペーサーにマッチするスペーサー配列を有する。プロトスペーサーがGで始まらない場合には5'Gの追加を有する。図70Hを見よ。
9．PE3bニッキングsgRNAをデザインする。PAMが相補鎖に存在し、その対応するプロトスペーサーが編集のために標的化される配列とオーバーラップする場合には、この編集はPE3bシステムの候補であり得る。PE3bシステムでは、ニッキングsgRNAのスペーサー配列は出発アレルではなく所望の編集されたアレルの配列にマッチする。編集されるヌクレオチド(単数または複数)がニッキングsgRNAプロトスペーサーのシード領域(PAMに隣接する～10nt)内に収まるときには、PE3bシステムは効率的に作動する。これは、編集された鎖の組み入れ後まで相補鎖のニッキングを防止し、標的DNAに結合することについてのPEgRNAおよびsgRNAの間の競合を防止する。PE3bは、両方の鎖上の同時のニックの生成をもまた回避し、それゆえに、高い編集効率を維持しながらインデル形成を有意に縮減する。PE3b sgRNAは、所望のアレルの20ntプロトスペーサーにマッチするスペーサー配列を有するはずである。必要とされる場合には5'Gの追加を有する。図70Iを見よ。

好適なPEgRNAおよび第2部位ニッキングsgRNAをデザインするための上のステップバイステップのプロセスは、決して限定することを意味されない。本開示は上に記載されているステップバイステップのプロセスのバリエーションを企図し、これらは当業者によってそれから導出可能であろう。

[7]プライム編集を利用する適用
標的化された挿入、欠失、および全ての12の可能な塩基から塩基の変換をヒト細胞の標的座位において二本鎖DNA切断またはドナーDNA鋳型を要求することなしに媒介する新たな「検索置換」ゲノム編集テクノロジーとしての本明細書に記載のプライム編集システムの開発に加えて、本発明者は、特定の適用の広いアレイへのプライム編集因子の使用をもまた企図した。例えば、本願において例示され論じられるとおり、プライム編集は、(a)変異を修正する変化をヌクレオチド配列に組み入れ、(b)タンパク質およびRNAタグを組み入れ、(c)免疫エピトープを目当てのタンパク質に組み入れ、(d)誘導可能な二量体化ドメインをタンパク質に組み入れ、(e)バイオ分子のその活性を変改するために配列を組み入れまたは除去、(f)特定の遺伝子変化を導くためにリコンビナーゼ標的部位を組み入れ、および(g)エラーを起こしやすいRTを用いることによる標的配列の変異導入をするために用いられ得る。目当ての標的部位におけるヌクレオチド配列を一般的に挿入、変化、または欠失させるこれらの方法に加えて、プライム編集因子は、高度にプログラム可能なライブラリを構築するために、ならびに細胞データ記録および系統トレース研究を行うためにもまた用いられ得る。本発明者は、プライム編集の効力を改善することを狙うPEgRNAの追加のデザイン特色をもまた企図した。なお、さらに、本発明者は、インテインドメインを用いてnapDNAbpを分裂することが関わる、ベクター送達システムを用いてプライム編集因子を首尾良く送達するための方法の着想を得た。

プライム編集のこれらの特定の例示の使用は決して限定することを意図されない。本願は、ヌクレオチド配列、例えばゲノムDNA上の標的部位における1つ以上の核酸塩基の組み入れ、除去、および/または改変の何らかの形態が一般的に関わるプライム編集のいずれかの使用を企図する。

プライム編集の例示されている使用のいずれかについて、PE1、PE2、PE3、およびPE3b、またはPE-shortを包含する本明細書に開示のいずれかのプライム編集因子を用い得る。

A．プライム編集機序
種々の態様において、プライム編集(または「プライム編集」)は、標的DNA分子(これに、ヌクレオチド配列の変化が導入されることが望まれる)を、伸長されたガイドRNAと複合体化した核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)と接触させることによって作動する。図1Gを参照すると、伸長されたガイドRNAは、ガイドRNAの3'もしくは5'端にまたはガイドRNAの分子内の位置付けに伸長を含み、所望のヌクレオチド変化(例えば、1ヌクレオチド変化、挿入、または欠失)をコードする。ステップ(a)では、napDNAbp/伸長されたgRNA複合体がDNA分子に接触し、伸長されたgRNAがnapDNAbpをガイドして標的座位に結合させる。ステップ(b)では、ニックが標的座位のDNAの鎖の1つに導入され(例えば、ヌクレアーゼまたは化学的薬剤による)、それによって利用可能な3'端を標的座位の鎖の1つに生出する。ある態様において、ニックは、Rループ鎖に対応するDNAの鎖、すなわちガイドRNA配列にハイブリダイズされない鎖、すなわち「非標的鎖」上に生出される。しかしながら、ニックは鎖のどちらかに導入され得る。つまり、ニックは、Rループ「標的鎖」(すなわち、伸長されたgRNAのプロトスペーサー配列にハイブリダイズされる鎖)または「非標的鎖」(すなわち、Rループの一本鎖部分を形成し、標的鎖に対して相補的である鎖)上に導入され得る。ステップ(c)では、DNA鎖の3'端(ニックによって形成される)は、逆転写をプライムするためにガイドRNAの伸長された部分と相互作用する(すなわち「プライム標的にプライムされたRT」)。ある態様において、3'端DNA鎖は、ガイドRNAの伸長された部分の特定のRTプライム配列、すなわち「逆転写酵素プライム配列」にハイブリダイズする。ステップ(d)では、逆転写酵素が導入され(napDNAbpとの融合タンパク質としてまたはトランスで)、これが、プライムされた部位の3'端から伸長されたガイドRNAの5'端の方へDNAの一本鎖を合成する。これは、ニック部位におけるまたはそれに隣接する内生DNAに対してさもなければ相同的である、所望のヌクレオチド変化(例えば、1塩基変化、挿入、もしくは欠失、またはそれらの組み合わせ)を含む一本鎖DNAフラップを形成する。ステップ(e)では、napDNAbpおよびガイドRNAがリリースされる。ステップ(f)および(g)は一本鎖DNAフラップの分解に関し、その結果、所望のヌクレオチド変化が標的座位に組み込まれるようになる。このプロセスは、ひとたび3'一本鎖DNAフラップが内生DNA配列に侵入およびハイブリダイズすると形成する対応する5'内生DNAフラップを除去することによって、所望の産物形成の方へ駆動され得る(例えば、トランスで、プライム編集因子との融合体として提供、または内生で提供されるFEN1または類似の酵素による)。理論によって拘束されることなしに、細胞の内生DNA修復および複製プロセスは、ミスマッチのDNAを分解してヌクレオチド変化(単数または複数)を組み込んで、所望の変改された産物を形成する。プロセスは、図1Gにおいて例示されるとおり「第2鎖ニッキング」または図1Iにおいて例示され本願において論じられるとおり「時間的(termporal)第2鎖ニッキング」によってもまた、産物形成の方へ駆動され得る。

プライム編集のプロセスは次の遺伝子変化の少なくとも1つ以上を導入し得る:トランスバージョン、トランジション、欠失、および挿入。加えて、プライム編集は特定の適用のために実装され得る。例えば、本願において例示され論じられるとおり、プライム編集は、(a)変異を修正する変化をヌクレオチド配列に組み入れ、(b)タンパク質およびRNAタグを組み入れ、(c)免疫エピトープを目当てのタンパク質に組み入れ、(d)誘導可能な二量体化ドメインをタンパク質に組み入れ、(e)バイオ分子のその活性を変改するために配列を組み入れまたは除去、(f)特定の遺伝子変化を導くためにリコンビナーゼ標的部位を組み入れ、および(g)エラーを起こしやすいRTを用いることによる標的配列の変異導入をするために用いられ得る。目当ての標的部位におけるヌクレオチド配列を一般的に挿入、変化、または欠失させるこれらの方法に加えて、プライム編集因子は、高度にプログラム可能なライブラリを構築するために、ならびに細胞データ記録および系統トレース研究を行うためにもまた用いられ得る。本発明者は、プライム編集の効力を改善することを狙うPEgRNAの追加のデザイン特色をもまた企図した。なお、さらに、本発明者は、インテインドメインを用いてnapDNAbpを分裂することが関わる、ベクター送達システムを用いてプライム編集因子を首尾良く送達するための方法の着想を得た。

用語「プライム編集システム」または「プライム編集因子(PE)」は、本明細書に記載のプライム標的にプライムされた逆転写(TPRT)を用いるゲノム編集の方法に関わる組成物を言い、napDNAbp、逆転写酵素、融合タンパク質(例えば、DNAbpおよび逆転写酵素を含む)、伸長されたガイドRNA、および融合タンパク質と伸長されたガイドRNAとを含む複合体、ならびに補助的な要素、例えば、プライム編集プロセスを編集された産物形成の方へ駆動することを助けるための第2鎖ニッキング構成要素および5'内生DNAフラップ除去エンドヌクレアーゼ(例えばFEN1)を包含するが、これらに限定されない。

別の態様では、図3Fの模式図は、二本鎖DNAの標的部位との典型的なPEgRNAの相互作用と、目当ての遺伝子変化を含有する3'一本鎖DNAフラップの付随的生産とを図示する。二本鎖DNAは、上側鎖が3'から5'の向きで、下方の鎖が5'から3'の方向で示されている。上側の鎖は「プロトスペーサー」およびPAM配列を含み、「標的鎖」と言われる。相補的な下方の鎖は「非標的鎖」と言われる。示されていないが、図示されているPEgRNAはCas9または等価物と複合体化するであろう。模式図に示されているとおり、PEgRNAのスペーサーは、プロトスペーサーと言われる標的鎖上の相補的な領域にアニーリングし、これはPAM配列のちょうど下流に位置付けられ、長さがおよそ20ヌクレオチドである。この相互作用は、スペーサーRNAおよびプロトスペーサーDNAの間にDNA/RNAハイブリッドを形成し、プロトスペーサーに対向する領域におけるRループの形成を誘導する。本願の他所において教示されるとおり、Cas9タンパク質(示されていない)が、それから、示されているとおり非標的鎖上にニックを誘導する。それから、これは3'ssDNAフラップ領域の形成に至り、これは、*z*に従って、プライマー結合部位においてPEgRNAの3'端と相互作用する。ssDNAフラップの3'端(すなわち、逆転写酵素プライマー配列)はPEgRNA上のプライマー結合部位(A)にアニーリングし、それによって逆転写酵素をプライムする。次に、逆転写酵素(例えば、トランスで提供されるか、またはCas9構築物に取り付けられた融合タンパク質としてシスで提供される)が、それから、編集鋳型(B)および相同アーム(C)によってコードされるDNAの一本鎖を重合する。重合は伸長アームの5'端の方へ連続する。ssDNAの重合した鎖はssDNA 3'端フラップを形成する。これは、他所に記載されるとおり(例えば図1Gに示されるとおり)、内生DNAに侵入し、対応する内生鎖を押し除け(これは内生DNAの5'DNAフラップとして除去される)、所望のヌクレオチド編集(1ヌクレオチド塩基対変化、欠失、挿入(遺伝子丸ごとを包含する)を天然に存在するDNA修復/複製ラウンドによって組み入れる。

プライム編集のこの適用は例1においてさらに記載され得る。

B．エラーを起こしやすいRTによるプライム編集を用いる変異導入
種々の態様において、プライム編集システム(すなわちプライム編集システム)は、標的化された変異導入を行うための、すなわちゲノムまたは細胞の他のDNAエレメント上の良く定めされたDNAのストレッチのみを変異させるための、エラーを起こしやすい逆転写酵素の使用を包含し得る。図22は、標的座位上のエラーを起こしやすい逆転写酵素による標的化された変異導入を行うことを導入するための例示的プロセスの模式図を提供し、伸長されたガイドRNAと複合体化した核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)を用いる。このプロセスは、標的化された変異導入のためのプライム編集のある態様と言われ得る。伸長されたガイドRNAは、ガイドRNAの3'もしくは5'端にまたはガイドRNAの分子内の位置付けに伸長を含む。ステップ(a)では、napDNAbp/gRNA複合体がDNA分子に接触し、gRNAがnapDNAbpをガイドして、変異導入されるべき標的座位に結合させる。ステップ(b)では、ニックが標的座位のDNAの鎖の1つに導入され(例えば、ヌクレアーゼまたは化学的薬剤による)、それによって利用可能な3'端を標的座位の鎖の1つに生出する。ある態様において、ニックは、Rループ鎖に対応するDNAの鎖、すなわちガイドRNA配列にハイブリダイズされない鎖上に生出される。ステップ(c)では、DNA鎖の3'端は、逆転写をプライムするためにガイドRNAの伸長された部分と相互作用する。ある態様において、3'端DNA鎖は、ガイドRNAの伸長された部分の特定のRTプライム配列にハイブリダイズする。ステップ(d)では、エラーを起こしやすい逆転写酵素が導入され、これが、プライムされた部位の3'端からガイドRNAの3'端の方へDNAの変異導入された一本鎖を合成する。例示の変異がアステリスク「*」によって指示されている。これは所望の変異導入された領域を含む一本鎖DNAフラップを形成する。ステップ(e)では、napDNAbpおよびガイドRNAがリリースされる。ステップ(f)および(g)は一本鎖DNAフラップ(変異導入された領域を含む)の分解に関し、その結果、所望の変異導入された領域が標的座位に組み込まれるようになる。このプロセスは、ひとたび3'一本鎖DNAフラップが他の鎖上の相補的な配列に侵入およびハイブリダイズすると形成する対応する5'内生DNAフラップを除去することによって、所望の産物形成の方へ駆動され得る。プロセスは、図1Fにおいて例示されるとおり第2鎖ニッキングによってもまた産物形成の方へ駆動され得る。内生DNA修復および/または複製プロセス後に、変異導入された領域はDNA座位のDNAの両方の鎖上に組み込まれるようになる。

プライム編集のこの適用は例2においてさらに記載され得る。

エラーを起こしやすいまたは変異誘発RT酵素は当該技術分野において公知である。本願において用いられる用語「エラーを起こしやすい」逆転写酵素は、野生型M-MLV逆転写酵素のエラー率未満であるエラー率を有する、天然に存在するかまたは別の逆転写酵素(例えば、野生型M-MLV逆転写酵素)から導出された逆転写酵素酵素を言う。野生型M-MLV逆転写酵素のエラー率は15,000から27,000の核酸塩基組み込みにつき1つのエラーの範囲であることが報告されている。Boutabout et al.(2001) “DNA synthesis fidelity by the reverse transcriptase of the yeast retrotransposon Ty1,” Nucleic Acids Res 29(11):2217-2222を見よ。これは参照によって本願に組み込まれる。それゆえに、この適用の目的では、用語「エラーを起こしやすい」は、15,000核酸塩基組み込みにつき1つのエラー(6.7×10^-5またはより高く)、例えば、14,000核酸塩基につき1エラー(7.14×10^-5またはより高く)、13,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(7.7×10^-5またはより高く)、12,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(7.7×10^-5またはより高く)、11,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(9.1×10^-5またはより高く)、10,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(1×10^-4もしくは0.0001またはより高く)、9,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.00011またはより高く)、8,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.00013またはより高く)、7,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.00014またはより高く)、6,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.00016またはより高く)、5,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.0002またはより高く)、4,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.00025またはより高く)、3,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.00033またはより高く)、2,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.00050またはより高く)、または1,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.001またはより高く)、または500核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.002またはより高く)、または250核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.004またはより高く)よりも多大であるエラー率を有するRTを言う。

プライム編集を用いる変異導入された配列の生成のためには、種々の変異誘発RTが想定され得る。2つのかかる例はBordetellaファージ(Handa,S.,et al.Nucl Acids Res 9711-25(2018)を見よ。これは参照によって本願に組み込まれる)およびLegionella pneumophila(Arambula,D.,et al.Proc Natl Acad Sci USA 8212-7(2013)を見よ。これは参照によって組み込まれる)からの変異誘発逆転写酵素である。BordetellaファージからのRT(brt)のケースでは、標的部位に対する変異誘発RTの結合を改善するために、補助的なタンパク質(bavd)がCas9に、および追加のRNA配列がPEgRNAに、追加またはトランスで送達されることをもまた必要とし得る(Handa,S.,et al.Nucl Acids Res 9711-25(2018)を見よ)。変異誘発RTを用いるときには、PEgRNAの鋳型領域は、多様性を増強するためのアデノシンまたはAAYコドンが濃縮され得る。

Bordetellaファージからの変異誘発RTのアミノ酸配列は次のとおり提供される。本明細書に開示の他のRTのように、Brtタンパク質は、機能的なPEを形成するように融合タンパク質としてnapDNAbpに融合され得る。

BodetellaからのBrtのケースでは、PE融合体は追加の補助的なタンパク質(Bavd)をもまた包含し得る。補助的なタンパク質はPE融合タンパク質に融合またはトランスで提供され得る。Bavd補助的タンパク質のアミノ酸配列は次のとおり提供される:

BodetellaからのBrtのケースでは、PEgRNAは、PEgRNA、例えば5'または3'端に追加された追加のヌクレオチド配列を含み得る。例示の配列は次のとおりであり、これは元々はBordetellaファージゲノムからである:

長さを短くするために、このPEgRNA追加配列は種々のやり方で縮減され得る。例えば、PEgRNA追加1配列は次の例示の代替的な追加配列へと縮減され得る:

他の態様において、PEgRNA追加配列もまた変異させられ得る。例えば、PEgRNA追加1配列は次の例示の代替的な追加配列へと変異させられ得る:

変異を導入するためのPEの使用に関する種々の態様では、特殊なPEgRNAの考慮事項が適用され得る。例えば、理論によって拘束されることなしに、上に記載されている追加のPEgRNA配列は、変異誘発RTによる効率的な変異導入を可能化するために必要とされ得る。

いずれかの変異誘発RTが本明細書に開示のプライム編集因子に用いられ得る。例えば、次の参照に記載されるエラーを起こしやすいRTが用いられ得、参照によって本願に組み込まれる:

Bebenek et al.,“Error-prone polymerization by HIV-1 reverse transcriptase.Contribution of template-primer misalignment,miscoding,and termination probability to mutational hot spots.,”J.BiolChem,1993,268:10324-34;および

Menendez-Arias,“Mutation rates and instrinsic fidelity of retroviral reverse transcriptases,”2009,Viruses,1(3):1137-1165。

種々のエラーを起こしやすいRTは、次のとおり、Menendez-Arias et al.の表1に開示されている次の酵素を包含し得るが、これらに限定されない(これの参照の内容全体は参照によって組み込まれる):

C．トリプレット拡大障害を処置するためのプライム編集の使用
本明細書に記載のプライム編集システムまたはプライム編集(PE)システムは、ハンチントン病および他のトリヌクレオチド反復障害などの疾病を処置するために、トリヌクレオチド反復変異(または「トリプレット拡大疾患」)を縮小するために用いられ得る。トリヌクレオチド反復拡大障害は発達神経生物学が関わる複雑な進行性の障害であり、多くの場合には、認知および感覚運動機能に影響する。障害は遺伝学的な表現促進現象(すなわち、各世代での増大した重症度)を示す。DNA伸長または短縮は、通常は減数分裂的に(すなわち、配偶子形成の時の間に、または胚発生中に早期に)起こり、多くの場合には性バイアスを有し、いくつかの遺伝子は女性から受け継がれるときにのみ、他は男性からのみ伸長するということを意味する。ヒトでは、トリヌクレオチド反復拡大障害は転写または翻訳レベルどちらかで遺伝子サイレンシングを引き起こし得、これは本質的に遺伝子機能をノックアウトする。代替的には、トリヌクレオチド反復拡大障害は、大きい繰り返しアミノ酸配列を有して生成された変改されたタンパク質を引き起こし得る。これは、多くの場合にはドミナントネガティブな様式で(例えばポリグルタミン疾患)、タンパク質機能を無効化するかまたは変化させるかどちらかである。

理論によって拘束されることなしに、トリプレット拡大はDNA複製またはDNA修復合成の間のスリップによって引き起こされる。タンデム反復は互いに同一の配列を有するので、2つのDNA鎖間の塩基対形成は配列上の複数の点において生起し得る。これはDNA複製またはDNA修復合成の間の「ループアウト」構造の形成に至り得る。これは繰り返し配列の繰り返しのコピーに至り得、反復数を伸長させる。ハイブリッドRNA:DNA中間体が関わる追加の機序が提案されている。プライム編集は、害をなす繰り返しのコドントリプレットの1つ以上を欠失させることによって、これらのトリプレット拡大領域を縮減または消去するために用いられ得る。この使用のある態様では、図23が、プライム編集によってトリヌクレオチド反復配列を短縮または縮減するためのPEgRNAデザインの模式図を提供する。

プライム編集は、カットされる部位へと標的化される充当されたPEgRNAを含むプライム編集因子によって、トリプレット反復領域の上流の領域へニックを入れることによって、トリプレット拡大領域を短縮するように実装され得る。それから、プライム編集因子は、健康な数のトリプレット反復(これは具体的な遺伝子および疾患に依存する)をコードする鋳型(すなわち、その編集鋳型)としてのPEgRNAに基づく新たなDNA鎖(ssDNAフラップ)を合成する。健康なトリプレット反復配列を含む新たに合成されたssDNA鎖は、また、反復の他端に隣接する配列にマッチする相同性の短いストレッチ(すなわち相同アーム)を包含するように合成される(赤色の鎖)。新たに合成された鎖の侵入、および新たに合成されたssDNAフラップによる内生DNAの爾後の置き換えは、短縮された反復アレルに至る。

具体的なトリヌクレオチド伸長障害に依存して、欠陥を誘導するトリプレット拡大は「トリヌクレオチド反復拡大タンパク質」において生起し得る。トリヌクレオチド反復拡大タンパク質は、トリヌクレオチド反復拡大障害を発生する感受性、トリヌクレオチド反復拡大障害の存在、トリヌクレオチド反復拡大障害の重症度、またはそれらのいずれかの組み合わせに関連するタンパク質の多様なセットである。トリヌクレオチド反復拡大障害は反復の型によって決定される2つのカテゴリーに分けられる。最も普通の反復はトリプレットCAGであり、これは遺伝子のコード領域に存在するときにはアミノ酸のグルタミン(Q)をコードする。よって、これらの障害はポリグルタミン(ポリQ)障害と言われ、次の疾患を含む:ハンチントン病(HD);球脊髄性筋萎縮症(SBMA);脊髄小脳失調症(SCA1、2、3、6、7、および17型);および歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)。残りのトリヌクレオチド反復拡大障害にはCAGトリプレットが関わらないか、またはCAGトリプレットが遺伝子のコード領域にはないかどちらかであり、よって、非ポリグルタミン障害と言われる。非ポリグルタミン障害は、脆弱X症候群(FRAXA);脆弱XE精神遅滞(FRAXE);フリードライヒ運動失調症(FRDA);筋強直性ジストロフィー(DM);および脊髄小脳失調症(SCA 8および12型)を含む。

トリヌクレオチド反復拡大障害に関連するタンパク質は、トリヌクレオチド反復拡大障害に対するトリヌクレオチド反復拡大障害に関連するタンパク質の実験的関連に基づいて選択され得る。例えば、トリヌクレオチド反復拡大障害に関連するタンパク質の生産速度または循環濃度は、トリヌクレオチド反復拡大障害を欠く集団に対して相対的に、トリヌクレオチド反復拡大障害を有する集団において上昇または降下し得る。タンパク質レベルの違いは、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、および質量分析を包含するがこれらに限定されないプロテオミクス技術を用いて評価され得る。代替的には、トリヌクレオチド反復拡大障害に関連するタンパク質はタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることによって同定され得、DNAマイクロアレイ分析、遺伝子発現の連続分析(SAGE)、および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR)を包含するがこれらに限定されないゲノム技術を用いる。

プライム編集によって修正され得るトリヌクレオチド反復拡大障害に関連するタンパク質の限定しない例は、AR(アンドロゲン受容体)、FMR1(脆弱X精神遅滞1)、HTT(ハンチンチン)、DMPK(筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ)、FXN(フラタキシン)、ATXN2(アタキシン2)、ATN1(アトロフィン1)、FEN1(フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ1)、TNRC6A(トリヌクレオチド反復含有6A)、PABPN1(核ポリA結合タンパク質1)、JPH3(ジャンクトフィリン3)、MED15(メディエーター複合体サブユニット15)、ATXN1(アタキシン1)、ATXN3(アタキシン3)、TBP(TATAボックス結合タンパク質)、CACNA1A(電位依存性カルシウムチャネルP/Q型アルファ1Aサブユニット)、ATXN80S(ATXN8対向鎖(非タンパク質コード))、PPP2R2B(タンパク質ホスファターゼ2制御サブユニットBベータ)、ATXN7(アタキシン7)、TNRC6B(トリヌクレオチド反復含有6B)、TNRC6C(トリヌクレオチド反復含有6C)、CELF3(CUGBP Elav様ファミリーメンバー3)、MAB21L1(mab-21様1(C.elegans))、MSH2(mutSホモログ2結腸がん非ポリポーシス1型(E.coli))、TMEM185A(膜貫通タンパク質185A)、SIX5(SIXホメオボックス5)、CNPY3(canopy 3ホモログ(ゼブラフィッシュ))、FRAXE(脆弱部位、葉酸型、稀、fra(X)(q28)E)、GNB2(グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)ベータポリペプチド2)、RPL14(リボソームタンパク質L14)、ATXN8(アタキシン8)、INSR(インスリン受容体)、TTR(トランスサイレチン)、EP400(E1A結合タンパク質p400)、GIGYF2(GRB10相互作用GYFタンパク質2)、OGG1(8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼ)、STC1(スタニオカルシン1)、CNDP1(カルノシンジペプチダーゼ1(メタロペプチダーゼM20ファミリー))、C10orf2(染色体10オープンリーディングフレーム2)、MAML3 mastermind様3(Drosophila)、DKC1(先天性角化不全症1、ジスケリン)、PAXIP1(PAX相互作用(転写活性化ドメイン)タンパク質1)、CASK(カルシウム/カルモジュリン依存性セリンタンパク質キナーゼ(MAGUKファミリー))、MAPT(微小管関連タンパク質tau)、SP1(Sp1転写因子)、POLG(ポリメラーゼ(DNA依存性)ガンマ)、AFF2(AF4/FMR2ファミリーメンバー2)、THBS1(トロンボスポンジン1)、TP53(腫瘍タンパク質p53)、ESR1(エストロゲン受容体1)、CGGBP1(CGGリプレット反復結合タンパク質1)、ABT1(基本転写活性化因子1)、KLK3(カリクレイン関連ペプチダーゼ3)、PRNP(プリオンタンパク質)、JUN(jun癌遺伝子)、KCNN3(カリウム中/小コンダクタンスカルシウム活性化チャネルサブファミリーNメンバー3)、BAX(BCL2関連Xタンパク質)、FRAXA(脆弱部位、葉酸型、稀、fra(X)(q27.3)A(巨睾丸、精神遅滞))、KBTBD10(kelch反復およびBTB(POZ)ドメイン含有10)、MBNL1(muscleblind様(Drosophila))、RAD51(RAD51ホモログ(RecAホモログ、E.coli)(S. cerevisiae))、NCOA3(核受容体コアクチベーター3)、ERDA1(伸長した反復ドメインCAG/CTG1)、TSC1(結節性硬化症1)、COMP(軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質)、GCLC(グルタミン酸-システインリガーゼ触媒サブユニット)、RRAD(糖尿病に関連するRas関連)、MSH3(mutSホモログ3(E.coli))、DRD2(ドーパミン受容体D2)、CD44(CD44分子(インド人血液型))、CTCF(CCCTC結合因子(ジンクフィンガータンパク質))、CCND1(サイクリンD1)、CLSPN(クラスピンホモログ(Xenopus laevis))、MEF2A(筋細胞エンハンサー因子2A)、PTPRU(タンパク質チロシンホスファターゼ受容体型U)、GAPDH(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ)、TRIM22(三節型モチーフ含有22)、WT1(ウィルムス腫瘍1)、AHR(アリール炭化水素受容体)、GPX1(グルタチオンペルオキシダーゼ1)、TPMT(チオプリンS-メチルトランスフェラーゼ)、NDP(ノリエ病(偽神経膠腫))、ARX(aristaless関連ホメオボックス)、MUS81(MUS81エンドヌクレアーゼホモログ(S.cerevisiae))、TYR(チロシナーゼ(眼皮膚白皮症IA))、EGR1(初期増殖応答1)、UNG(ウラシル-DNAグリコシラーゼ)、NUMBL(numbホモログ(Drosophila)様)、FABP2(腸脂肪酸結合タンパク質2)、EN2(engrailedホメオボックス2)、CRYGC(クリスタリンガンマC)、SRP14(シグナル認識粒子14kDa(相同的Alu RNA結合タンパク質))、CRYGBクリスタリンガンマB)、PDCD1(プログラム細胞死1)、HOXA1(ホメオボックスA1)、ATXN2L(アタキシン2様)、PMS2(PMS2減数分裂後分離増大2(S.cerevisiae))、GLA(ガラクトシダーゼアルファ)、CBL(Cas-Br-M(ネズミ)同種指向性レトロウイルス形質転換配列)、FTH1(フェリチン重鎖ポリペプチド1)、IL12RB2(インターロイキン12受容体ベータ2)、OTX2(orthodenticleホメオボックス2)、HOXA5(ホメオボックスA5)、POLG2(ポリメラーゼ(DNA依存性)ガンマ2補助的サブユニット)、DLX2(distal-lessホメオボックス2)、SIRPA(シグナル制御タンパク質アルファ)、OTX1(orthodenticleホメオボックス1)、AHRR(アリール炭化水素受容体リプレッサー)、MANF(中脳アストロサイト由来神経栄養因子)、TMEM158(膜貫通タンパク質158(遺伝子/偽遺伝子))、およびENSG00000078687を包含する。

本明細書に開示のプライム編集因子は、次のポリグルタミントリプレット拡大疾患遺伝子を包含する、上で指示されている疾患タンパク質のいずれかのトリプレット反復拡大領域を縮小するために用いられ得る(これらは、プライム編集によって丸ごとまたは部分的に除去され得る病原性反復の具体的位置付けを示す):

本明細書に開示のプライム編集因子は、次の非ポリグルタミントリプレット拡大疾患遺伝子に典型的に見出されるトリプレット反復拡大領域を縮小するためにもまた用いられ得る:

プライム編集は、トリプレット拡大領域の少なくとも1つのコドンを欠失するようにデザインされている編集鋳型を有するPEgRNAを用いて、トリプレット拡大領域を縮小するために実装され得る。他の態様において、健康な(すなわち、疾患を生ずることに関連しない)数のトリプレット反復に到達するために、これのためにプライム編集に用いるためのPEgRNAは、少なくとも1、または2、または3、または4、または5、または6、または7、または8、または9、または10、または11、または12、または13、または14、または15、または16、または17、または18、または19、または20、または21、または22、または23、または24、または25、または26、または27、または28、または29、または30、または31、または32、または33、または34、または35、または36、または37、または38、または39、または40、または41、または42、または43、または44、または45、または46、または47、または48、または49、または50、または51、または52、または53、または54、または55、または56、または57、または58、または59、または60、または61、または62、または63、または64、または65、または66、または67、または68、または69、または70、または71、または72、または73、または74、または75、または76、または77、または78、または79、または80、または81、または82、または83、または84、または85、または86、または87、または88、または89、または90、または91、または92、または93、または94、または95、または96、または97、または98、または99、または100、またはより多くのコドンをトリプレット拡大領域から欠失させるために用いられる。

他の態様において、健康な(すなわち、疾患を生ずることに関連しない)数のトリプレット反復に到達するために、これのためにプライム編集に用いるためのPEgRNAは、少なくとも1、または2、または3、または4、または5、または6、または7、または8、または9、または10、または11、または12、または13、または14、または15、または16、または17、または18、または19、または20、またはより多くのコドンをトリプレット拡大領域から欠失させるために用いられる。

他の態様において、健康な(すなわち、疾患を生ずることに関連しない)数のトリプレット反復に到達するために、これのためにプライム編集に用いるためのPEgRNAは、少なくとも1、または2、または3、または4、または5、または6、または7、または8、または9、または10、または11、または12、または13、または14、または15、またはより多くのコドンをトリプレット拡大領域から欠失させるために用いられる。

他の態様において、健康な(すなわち、疾患を生ずることに関連しない)数のトリプレット反復に到達するために、これのためにプライム編集に用いるためのPEgRNAは、少なくとも1、または2、または3、または4、または5、または6、または7、または8、または9、または10、またはより多くのコドンをトリプレット拡大領域から欠失させるために用いられる。

プライム編集は、いずれかのトリプレット拡大領域、例えばBudworth et al.,“A Brief History of Triplet Repeat Diseases,”Methods Mol Biol,2013,1010:3-17、US20011/00165540A1(動物のトリヌクレオチド反復拡大障害に関連する遺伝子のゲノム編集)、US2016/0355796A1(crispr-casシステムの組成物およびヌクレオチド反復障害への使用の方法)に記載されているものを修正するように構成され得る。

種々の態様において、本開示は、欠陥遺伝子にトリヌクレオチド反復拡大領域を有する細胞への使用にとって好適なプライム編集構築物を提供し、(a)napDNAbpと逆転写酵素とを含むプライム編集因子融合体、(b)トリヌクレオチド反復拡大領域を標的化するスペーサー配列とトリヌクレオチド反復拡大領域の除去をコードする編集鋳型を含む伸長アームとを含むPEgRNAを含む。

種々の他の態様において、本開示は、プライム編集を用いて細胞の欠陥遺伝子のトリヌクレオチド反復拡大領域の全てまたは部分を欠失させるための方法を提供し、napDNAbpと逆転写酵素とを含むプライム編集因子融合体、およびトリヌクレオチド反復拡大領域を標的化するスペーサー配列とトリヌクレオチド反復拡大領域の除去をコードする編集鋳型を含む伸長アームとを含むPEgRNAに、細胞を接触させることを含む。

種々の態様において、トリヌクレオチド反復は、繰り返すCTG、CAG、CGG、CCG、GAA、またはTTCトリヌクレオチドを含む。

種々の他の態様において、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復、またはヘキサヌクレオチド反復である。

D．ペプチドタグ付けのためのプライム編集の使用
別の側面において、本開示は、プライム編集を用いてタンパク質上に1つ以上のペプチドタグを遺伝子的にグラフトするために本明細書に記載のプライム編集因子を用いるための方法を提供する。より具体的には、本開示は、1つ以上のペプチドタグをタンパク質上に遺伝子的に組み入れるための方法を提供し:タンパク質をコードする標的ヌクレオチド配列を、1つ以上のペプチドタグをコードする第2のヌクレオチド配列をその中に挿入するように構成されたプライム編集因子と接触させて、タンパク質タグに融合されたタンパク質を含む融合タンパク質をコードする組み換えヌクレオチド配列をもたらすことを含む。

他の態様において、本開示は、目当てのペプチドと1つ以上のペプチドタグとを含む融合タンパク質を作るための方法を提供し、方法は:タンパク質をコードする標的ヌクレオチド配列を、1つ以上のペプチドタグをコードする第2のヌクレオチド配列をその中に挿入するように構成されたプライム編集因子と接触させて、タンパク質タグに融合されたタンパク質を含む融合タンパク質をコードする組み換えヌクレオチド配列をもたらすことを含む。

種々の態様において、標的ヌクレオチド配列はゲノムDNA上の目当ての特定の遺伝子である。目当ての遺伝子は目当てのタンパク質をコードし得る(例えば、受容体、酵素、治療学的タンパク質、膜タンパク質、輸送タンパク質、シグナル伝達タンパク質、または免疫学的タンパク質など)。目当ての遺伝子はRNA分子をもまたコードし得、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、アンチセンスRNA、ガイドRNA、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、およびセルフリーRNA(cfRNA)を包含するが、これらに限定されない。

ペプチドタグは、分離、精製、視覚化、可溶化、または検出などの目的で、1つ以上の機能をタンパク質に授けるいずれかのペプチドタグまたはそのバリアントであり得る。ペプチドタグは、「アフィニティータグ」(タンパク質精製を容易化するため)、「可溶化タグ」(タンパク質の適切なフォールディングを補助するため)、「クロマトグラフィータグ」(タンパク質のクロマトグラフィー特性を変改するため)、「エピトープタグ」(高親和性抗体に結合するため)、および「蛍光タグ」(細胞のまたはin vitroのタンパク質の視覚化を容易化するため)を包含し得る。ペプチドタグの例は次のタグを包含するが、これらに限定されない:

ペプチドタグは次のアフィニティータグ(タンパク質の分離および/または精製のため)でもまたあり得る(Kimple et al.,“Overview of Affinity Tags for Protein Purification,”Curr Protoc Protein Sci,2013,73:Unit-9.9の表9.9.1に記載されているとおり。これは参照によって本願に組み込まれる)。

具体的な態様では、ペプチドタグはHis⁶タグ、FLAGタグ、V5タグ、GCN4タグ、HAタグ、Mycタグ、FIAsH/ReAsHタグ、ソルターゼ基質、パイクランプを包含し得る。

種々の態様において、ペプチドタグは、タンパク質蛍光標識、免疫沈降、イムノブロッティング、免疫組織化学、タンパク質動員、誘導可能なタンパク質デグロン、およびゲノムワイドスクリーニングを包含する適用に用いられ得る。

種々の他の態様において、ペプチドタグは、タンパク質自己スプライシング機能を組み入れるためにインテイン配列を包含し得る。本願において用いられる用語「インテイン」は、生命の全てのドメインからの生物に見出される自己プロセシングポリペプチドドメインを言う。インテイン(介在タンパク質)は、タンパク質スプライシングとして公知の固有の自己プロセシングイベントを実行する。これにおいては、それは2つのペプチド結合の切断によってそれ自体をより大きい前駆体ポリペプチドから切除、プロセスにおいて、新たなペプチド結合の形成によってフランキングするエクステイン(外部タンパク質)配列をライゲーションする。インテイン遺伝子は他のタンパク質コード遺伝子内にインフレームで埋め込まれて見出されるので、この再構成は翻訳後に(またはことによると共翻訳的に)生起する。さらにその上、インテインによって媒介されるタンパク質スプライシングは自発的である;それは外部の因子またはエネルギー源ではなくインテインドメインのフォールディングのみを要求する。このプロセスは、「分裂インテイン」によるトランスタンパク質スプライシングの天然のプロセスと対比してシスタンパク質スプライシングとしてもまた公知である。インテインは自己スプライシングRNAイントロンのタンパク質等価物であり(Perler et al.,Nucleic Acids Res.22:1125-1127(1994)を見よ)、これらは前駆体タンパク質からのそれら自体の切除を触媒し、エクステインとして公知のフランキングタンパク質配列の付随的融合を有する(Perler et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.1:292-299(1997);Perler,F.B.Cell 92(1):1-4(1998);Xu et al.,EMBO J. 15(19):5146-5153(1996)において総説されている)。

タンパク質スプライシングプロセスの機序は多大に詳細に研究されており(Chong,et al.,J.Biol.Chem.1996,271,22159-22168;Xu,M-Q & Perler,F.B.EMBO Journal,1996,15,5146-5153)、保存されたアミノ酸がインテインおよびエクステインスプライシング点に見出されている(Xu,et al.,EMBO Journal,1994,13 5517-522)。

インテインは2つの別個に転写および翻訳される遺伝子によってコードされる2つのフラグメントとしてもまた存在し得る。これらの所謂分裂インテインは自己会合し(self-associate)、タンパク質-スプライシング活性をtransで触媒する。分裂インテインは、多様なシアノ細菌および古細菌において同定されている(Caspi et al,Mol Microbiol.50:1569-1577(2003);Choi J.et al,J Mol Biol.556:1093-1106(2006.);Dassa B.et al,Biochemistry.46:322-330(2007.);Liu X. and Yang J.,J Biol Chem.275:26315-26318(2003);Wu H.et al.Proc Natl Acad Sci USA.￡5:9226-9231(1998.);およびZettler J.et al,FEBS Letters.553:909-914(2009))が、これまでbut have not been found in 真核生物からは見出されていない。近年、環境メタゲノムデータの生物情報学的(bioinformatic)分析から、新規ゲノム配置をもつ26の種々の遺伝子座が明らかにされた。各遺伝子座にて、保存された酵素コード領域は分裂インテインによって遮られており、独立型の(freestanding)エンドヌクレアーゼ遺伝子が、インテインサブドメインをコードする節(sections)間に挿入されている。それらのうち、5つの座位が完全にアセンブリされた:DNAヘリカーゼ(gp41-l、gp41-8);イノシン-5'-一リン酸デヒドロゲナーゼ(IMPDH-1);およびリボヌクレオチドレダクターゼ触媒サブユニット(NrdA-2およびNrdJ-1)である。このばらばらになった遺伝子編成は主にファージに存在するように見える(Dassa et al,Nucleic Acids Research.57:2560-2573(2009))。

ある態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は、分裂インテインタグを2つの異なるタンパク質上に挿入するために用いられ得、共発現されるときにそれらの細胞内ライゲーションを引き起こして融合タンパク質を形成する。タンパク質トランススプライシングでは、1つの前駆体タンパク質はNインテインによって後続されるNエクステインパーツからなり、別の前駆体タンパク質はCエクステインパーツによって後続されるCインテインからなり、トランススプライシング反応(一緒にNおよびCインテインによって触媒される)が2つのインテイン配列を切除、2つのエクステイン配列をペプチド結合によって連結する。酵素反応であるタンパク質トランススプライシングは、非常に低い(例えばマイクロモル)濃度のタンパク質で働き得、生理条件下において実行され得る。

分裂インテインNpu DnaEは、タンパク質トランススプライシング反応について報告された最も高い速度を有するとして特徴付けられた。加えて、Npu DnaEタンパク質スプライシング反応は、異なるエクステイン配列、6から37℃の温度、および最高で6Mの尿素の存在についてロバストかつ高収量と考慮される(Zettler J.et al,FEBS Letters.553:909-914(2009);Iwai I.et al,FEBS Letters 550:1853-1858(2006))。予想されたとおり、これらのインテインのNドメインにおけるCysl Ala変異が導入されたときには、当初のNからSのアシルシフト、よってタンパク質スプライシングがブロックされた。残念ながら、C末端切断反応もまたほとんど完全に阻害された。N末端の切れやすいペプチド結合におけるアシルシフトに対するC末端スプライスジャンクションにおけるアスパラギン環化の依存性は、天然に分裂されたDnaEインテインアレルに普通の固有の特性であるように見える(Zettler J.et al.FEBS Letters.555:909-914(2009))。

分裂インテインによって触媒されるタンパク質トランススプライシングは、タンパク質ライゲーションのための全く酵素的な方法を提供する。分裂インテインは、夫々NインテインおよびCインテインという名称の2つのピースへと分裂された本質的に一続きのインテイン(例えばミニインテイン)である。分裂インテインのNインテインおよびCインテインは、非共有結合的に会合して活性なインテインを形成し、一続きのインテインがするのと本質的に同じやり方でスプライシング反応を触媒し得る。分裂インテインは天然に見出され、実験室でもまた操作されている。本願において用いられる用語「分裂インテイン」は、1つ以上のペプチド結合切断がN末端およびC末端アミノ酸配列の間に存在するいずれかのインテインを言い、その結果、N末端およびC末端配列が別個の分子になり、これらは、トランススプライシング反応について機能的であるインテインへと非共有結合的に再会合または再構成し得る。いずれかの触媒的に活性なインテインまたはそのフラグメントが、本発明の方法への使用のための分裂インテインを導出するために用いられ得る。例えば、一側面において、分裂インテインは真核生物インテインに由来し得る。別の側面において、分裂インテインは細菌インテインに由来し得る。別の側面において、分裂インテインは古細菌インテインに由来し得る。好ましくは、そのように導出された分裂インテインは、トランススプライシング反応を触媒することにとって必須のアミノ酸配列のみを所有するであろう。

分裂インテインは、ミニインテインの構造上に見出される-12の保存されたベータ鎖間の構造化されていないループまたは介在アミノ酸配列中に1つ以上の分裂部位を操作することによって、一続きのインテインから生出され得る。分裂の生出が、タンパク質スプライシング活性が失われる十分な度合まではインテインの構造、特に構造化されたベータ鎖を遮断しないであろうという条件で、ベータ鎖間の領域内の分裂部位の位置のいくらかのフレキシビリティーが存在し得る。

本明細書に記載のプライム編集因子は、ペプチドタグ(インテインを包含する)を目当てのタンパク質のC末端の端に組み込み得る。他の態様において、ペプチドタグ(インテインを包含する)は目当てのタンパク質のN末端の端に組み込まれ得る。ペプチドタグは目当てのタンパク質の内側にもまた組み込まれ得る。本明細書に記載のプライム編集因子によって生出されるもたらされる融合タンパク質は、次の構造を有し得る:

[目当てのタンパク質]-[ペプチドタグ];

[ペプチドタグ]-[目当てのタンパク質];または

[目当てのタンパク質-N末端領域]-[ペプチドタグ]-[目当てのタンパク質-C末端領域]。

ペプチドタグ付けへの使用のためのガイドRNAデザインの原理は、至る所でペプチドタグ付けに適用され得る。例えば、1つの態様では、ペプチドタグ付けのためのPEgRNA構造は次の構造を有し得る:5'-[スペーサー配列]-[gRNAコアまたは骨格]-[伸長アーム]-3'。伸長アームは、5'から3'方向に、相同アーム、編集鋳型(ペプチドタグをコードする配列を含む)、およびプライマー結合部位を含む。この構成は図3Dおよび図24に図示されている。

別の態様では、ペプチドタグ付けのためのPEgRNA構造は、次の構造を有し得る:5'-[伸長アーム]-[スペーサー配列]-[gRNAコアまたは骨格]-3'。伸長アームは、5'から3'方向に、相同アーム、編集鋳型(ペプチドタグをコードする配列を含む)、およびプライマー結合部位を含む。この構成は図3Eに図示されている。

プライム編集を用いるペプチドタグ付けの態様は図25および26に図示され、例4に記載されている。

E．プリオン病を防止または処置するためのプライム編集の使用
プライム編集は、疾患の過程においてミスフォールディングされるようになるプリオンタンパク質(PRNP)上への1つ以上の防護性変異の組み入れによって、プリオン病を防止またはその進行を停止させるためにもまた用いられ得る。プリオン病または伝達性海綿状脳症(TSE)は、ヒトおよび動物両方を冒す稀な進行性の神経変性障害のファミリーである。それらは、長い潜伏期間、ニューロン喪失に関連する特徴的な海綿状変化、および炎症性応答を誘導することの失敗によって見分けられる。

ヒトでは、プリオン病は、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、およびクールー病を包含する。動物では、プリオン病は牛海綿状脳症(BSEまたは「狂牛病」)、慢性消耗病(CWD)、スクレイピー、伝達性ミンク脳症、ネコ海綿状脳症、および有蹄類海綿状脳症を包含する。これらのプリオン病のいずれか1つを防止またはその進行を停止させるために、プライム編集は防護性の点変異をプリオンタンパク質上に組み入れるために用いられ得る。

古典的CJDはヒトプリオン病である。それは、特徴的な臨床および診断特色を有する神経変性障害である。この疾患は急速に進行性であり、常に致死的である。この疾患による感染は通常は病気の発症から１年以内に死に至る。CJDは急速に進行性の変わることなく致死的な神経変性障害であり、プリオンタンパク質として公知の細胞性の糖タンパク質の異常なアイソフォームによって引き起こされると信じられている。CJDは世界的に生起し、米国を包含する多くの国の見積もられる年間発生率は100万人の集団あたり約1ケースであることが報告されている。CJD患者の大多数は通常は病気の発症から１年以内に死ぬ。CJDは、ヒトおよび動物において生起する他のプリオン病と併せて、伝達性海綿状脳症(TSE)として分類される。患者の約85％では、CJDは伝達の認識可能なパターンなしに特発性疾患として生起する。患者のより小さい割合(5から15％)は、プリオンタンパク質遺伝子の受け継がれた変異ゆえにCJDを発生する。これらの受け継がれる形態は、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群および致死性家族性不眠症を包含する。CJDについて、処置は現行では公知ではない。

変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)は英国で1996年に最初に記載されたプリオン病である。今や、牛のプリオン病の牛海綿状脳症(BSEまたは「狂牛」病)のアウトブレイクを担う物質が、ヒトのvCJDのアウトブレイクを担う同じ物質であるという強い科学的証拠がある。バリアントCJD(vCJD)は古典的CJD(多くの場合には単純にCJDと呼ばれる)と同じ疾患ではない。それは古典的CJDとは異なる臨床的および病理学的特徴を有する。各疾患はプリオンタンパク質遺伝子の具体的な遺伝子プロファイルをもまた有する。両方の障害は、年で測定される普通でなく長い潜伏期間を有する変わることなく致死的な脳疾患であり、プリオンと呼ばれる非従来的な伝達性物質によって引き起こされる。vCJDについて、処置は現行では公知ではない。

BSE(牛海綿状脳症または「狂牛病」)は、プリオンと呼ばれる普通でない伝達性物質による感染からもたらされる畜牛の進行性の神経学的障害である。伝達性物質の性質は良く理解されてはいない。現行では、最も受け入れられた理論は、物質が、プリオンタンパク質として公知の正常タンパク質の改変された形態であるということである。まだ理解されていない理由から、正常なプリオンタンパク質は病原性の(有害な)形態へと変化し、これはそれから畜牛の中枢神経系を損傷する。BSEの異なる株があるという増大して行く証拠がある:英国におけるアウトブレイクを担った典型的または古典的BSE株および2つの非典型的な株(HおよびL株)である。BSEについて、処置は現行では公知ではない。

慢性消耗病(CWD)は、鹿、ヘラジカ、トナカイ、ニホンジカ、およびムースを冒すプリオン病である。それはカナダおよび米国を包含する北米、ノルウェー、ならびに韓国のいくつかのエリアにおいて見出されている。感染動物が症状を発生する前には1年超がかかり得、これらは激しい体重減少(消耗)、よろめき、無気力、および他の神経症状を包含し得る。CWDは全ての年齢の動物を冒し得、いくつかの感染動物はいつか疾患を発生することなしに死に得る。CWDは動物にとって致死的であり、処置またはワクチンはない。

TSEの原因物質はプリオンであると信じられている。用語「プリオン」は、伝達性であり、脳に最も豊富に見出されるプリオンタンパク質と呼ばれる特定の正常な細胞性タンパク質の異常なフォールディングを誘導する能力がある異常な病原性物質を言う。これらの正常なプリオンタンパク質の機能はなお完全には理解されていない。プリオンタンパク質の異常なフォールディングは脳損傷と疾患の特徴的な徴候および症状とに至る。プリオン病は通常は急速に進行性であり、常に致死的である。

本願において用いられる用語「プリオン」は、ヒトおよび動物の疾患(海綿状脳症)を引き起こすことが公知の感染性粒子を意味する。用語「プリオン」は単語「タンパク質」および「感染」の短縮であり、粒子は、専らではないにしても、大きくは、立体配座を変化させてPRNP^ScになるPRNP^Cを発現するPRNP遺伝子によってコードされるPRNP^Sc分子からなる。プリオンは細菌、ウイルス、およびウイロイドとは別物である。公知のプリオンは、動物に感染して、羊および山羊の神経系の伝達性の変性疾患スクレイピー、および牛海綿状脳症(BSE)または狂牛病および猫のネコ海綿状脳症を引き起こすものを包含する。ヒトを冒すことが公知の上で論じられている4つのプリオン病は(1)クールー病、(2)クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、(3)ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病(GSS)、および(4)致死性家族性不眠症(FFI)である。本願において用いられるプリオンは、用いられるいずれかの動物、具体的にはヒトおよび飼育畜産動物においてこれらの疾患または他の全てまたはいずれかを引き起こすプリオンの全ての形態を包含する。

一般的に、理論によって拘束されることなしに、プリオン病はプリオンタンパク質のミスフォールディングによって引き起こされる。多くの場合に沈着性疾患と呼ばれるかかる疾患、プリオンタンパク質のミスフォールディングは次のとおり説明され得る。Aが、意図される生理的役割をモノマーまたはオリゴマー状態で実行する正常に合成された遺伝子産物であり、かつA*が、劇的な立体配座変化を経過するために有能であるAの立体配座的に活性化された形態である場合には、Bは多量体アセンブリを好む立体配座的に変改された状態であり(すなわち、沈着を形成するミスフォールディングされた形態)、かつB_nは、病原性であり、リサイクルすることが相対的に困難である多量体材料である。プリオン病では、PRNP^CおよびPRNP^Scは状態AおよびB_nに対応し、ここで、Aは大きくはヘリカルかつモノマー性であり、B_nはβリッチかつ多量体性である。

プリオンタンパク質のある種の変異はプリオン(prior)病の増大したリスクに関連し得るということが公知である。反対に、プリオンタンパク質のある種の変異は天然に防護性であり得る。Bagynszky et al.,“Characterization of mutations in PRNP(prion)gene and their possible roles in neurodegenerative diseases,”Neuropsychiatr Dis Treat.,2018;14:2067-2085を見よ。これの内容は参照によって本願に組み込まれる。

PRNP(NCBI RefSeq No.NP_000302.1(配列番号291))ヒトプリオンタンパク質は、染色体20(4686151-4701588)上に位置付けられた16kb長の遺伝子によってコードされる。それは2つのエキソンを含有し、エキソン2はオープンリーディングフレームを持ち、これは253アミノ酸(AA)長のPrPタンパク質をコードする。エキソン1は非コードエキソンであり、これは転写開始部位としての用をなし得る。翻訳後修飾は最初の22AA N末端フラグメント(NTF)および最後の23AA C末端フラグメント(CTF)の除去をもたらす。NTFは小胞体(ER)へのPrP輸送後に切断され、CTF(グリコシルホスファチジルイノシトール[GPI]シグナルペプチド[GPI-SP])はGPIアンカーによって切断される。GPIアンカーはPrPタンパク質輸送に関わり得る。それは細胞膜の外側表面へのプリオンタンパク質の取り付けの役割をもまた演じ得る。正常なPrPは、長いN末端ループ(これはオクタペプチド反復領域を含有する)、2つの短いβシート、3つのαヘリックス、およびC末端領域(これはGPIアンカーを含有する)から成る。PrPの切断は、細胞膜にアンカー固定される208AA長の糖タンパク質をもたらす。

PRNP(NP_000302.1)のアミノ酸配列は以下のとおりである:
MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG(配列番号291)。

PRNP(NP_000302.1)のアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列(NCBI Ref.Seq No.NM_000311.5,“homo sapiens prion protein(PRNP),transcript variant 1,mRNA)によってコードされ、以下のとおりである:
GCGAACCTTGGCTGCTGGATGCTGGTTCTCTTTGTGGCCACATGGAGTGACCTGGGCCTCTGCAAGAAGCGCCCGAAGCCTGGAGGATGGAACACTGGGGGCAGCCGATACCCGGGGCAGGGCAGCCCTGGAGGCAACCGCTACCCACCTCAGGGCGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCCCATGGTGGTGGCTGGGGACAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGTCAAGGAGGTGGCACCCACAGTCAGTGGAACAAGCCGAGTAAGCCAAAAACCAACATGAAGCACATGGCTGGTGCTGCAGCAGCTGGGGCAGTGGTGGGGGGCCTTGGCGGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGAGCAGGCCCATCATACATTTCGGCAGTGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGATGAGGAAGGTCTTCCTGTTTTCACCATCTTTCTAATCTTTTTCCAGCTTGAGGGAGGCGGTATCCACCTGCAGCCCTTTTAGTGGTGGTGTCTCACTCTTTCTTCTCTCTTTGTCCCGGATAGGCTAATCAATACCCTTGGCACTGATGGGCACTGGAAAACATAGAGTAGACCTGAGATGCTGGTCAAGCCCCCTTTGATTGAGTTCATCATGAGCCGTTGCTAATGCCAGGCCAGTAAAAGTATAACAGCAAATAACCATTGGTTAATCTGGACTTATTTTTGGACTTAGTGCAACAGGTTGAGGCTAAAACAAATCTCAGAACAGTCTGAAATACCTTTGCCTGGATACCTCTGGCTCCTTCAGCAGCTAGAGCTCAGTATACTAATGCCCTATCTTAGTAGAGATTTCATAGCTATTTAGAGATATTTTCCATTTTAAGAAAACCCGACAACATTTCTGCCAGGTTTGTTAGGAGGCCACATGATACTTATTCAAAAAAATCCTAGAGATTCTTAGCTCTTGGGATGCAGGCTCAGCCCGCTGGAGCATGAGCTCTGTGTGTACCGAGAACTGGGGTGATGTTTTACTTTTCACAGTATGGGCTACACAGCAGCTGTTCAACAAGAGTAAATATTGTCACAACACTGAACCTCTGGCTAGAGGACATATTCACAGTGAACATAACTGTAACATATATGAAAGGCTTCTGGGACTTGAAATCAAATGTTTGGGAATGGTGCCCTTGGAGGCAACCTCCCATTTTAGATGTTTAAAGGACCCTATATGTGGCATTCCTTTCTTTAAACTATAGGTAATTAAGGCAGCTGAAAAGTAAATTGCCTTCTAGACACTGAAGGCAAATCTCCTTTGTCCATTTACCTGGAAACCAGAATGATTTTGACATACAGGAGAGCTGCAGTTGTGAAAGCACCATCATCATAGAGGATGATGTAATTAAAAAATGGTCAGTGTGCAAAGAAAAGAACTGCTTGCATTTCTTTATTTCTGTCTCATAATTGTCAAAAACCAGAATTAGGTCAAGTTCATAGTTTCTGTAATTGGCTTTTGAATCAAAGAATAGGGAGACAATCTAAAAAATATCTTAGGTTGGAGATGACAGAAATATGATTGATTTGAAGTGGAAAAAGAAATTCTGTTAATGTTAATTAAAGTAAAATTATTCCCTGAATTGTTTGATATTGTCACCTAGCAGATATGTATTACTTTTCTGCAATGTTATTATTGGCTTGCACTTTGTGAGTATTCTATGTAAAAATATATATGTATATAAAATATATATTGCATAGGACAGACTTAGGAGTTTTGTTTAGAGCAGTTAACATCTGAAGTGTCTAATGCATTAACTTTTGTAAGGTACTGAATACTTAATATGTGGGAAACCCTTTTGCGTGGTCCTTAGGCTTACAATGTGCACTGAATCGTTTCATGTAAGAATCCAAAGTGGACACCATTAACAGGTCTTTGAAATATGCATGTACTTTATATTTTCTATATTTGTAACTTTGCATGTTCTTGTTTTGTTATATAAAAAAATTGTAAATGTTTAATATCTGACTGAAATTAAACGAGCGAAGATGAGCACCA(配列番号292)

CJDおよびFFIにリンクしているPRNP(NP_000302.1)に対して相対的な変異部位が次のとおり報告されている。これらの変異は、本明細書に開示のプライム編集因子を用いて除去または組み入れられ得る。

GSSへ繋がる、PRNP(NP_000302.1)(配列番号291)と比べた突然変異部位は、以下のとおり報告されている:

プリオン病に対して起こり得る防護特質(protective nature)へ繋がるPRNP(NP_000302.1)(配列番号291)と比べた突然変異部位は以下のとおりである:

それゆえに、種々の態様において、プライム編集は、プリオン病にリンクしているPRNPの変異を除去するかまたはプリオン病に対して防護性であると考慮されるPRNPの変異を組み入れるために用いられ得る。例えば、プライム編集は、PRNPタンパク質のD178N、V180I、T188K、E196K、E196A、E200K、E200G、V203I、R208H、V210I、E211Q、I215V、またはM232R変異を除去または復元するために用いられ得る(NP_000302.1のPRNPに対して相対的)(配列番号291)。他の態様において、プライム編集は、PRNPタンパク質のP102L、P105L、A117V、G131V、V176G、H187R、F198S、D202N、Q212P、Q217R、またはM232T変異を除去または復元するために用いられ得る(NP_000302.1のPRNPに対して相対的)(配列番号291)。プライム編集を用いてPRNPのかかる変異の存在を除去または修正することによって、プリオン病のリスクが縮減または消去され得る。

他の態様において、プライム編集は、1つ以上のプリオン病に対する防護性の効果にリンクしているPRNPの防護性変異を組み入れるために用いられ得る。例えば、プライム編集は、PRNPのG127S、G127V、M129V、D167G、D167N、N171S、E219K、またはP238S防護性変異を組み入れるために用いられ得る(NP_000302.1のPRNPに対して相対的)(配列番号291)。なお他の態様において、防護性変異は、PRNPのG127、G127、M129、D167、D167、N171、E219、またはP238に組み入れされるいずれかの代替アミノ酸であり得る(NP_000302.1のPRNPに対して相対的)(配列番号291)。

具体的な態様では、図27において例解され例5において論じられるとおり、プライム編集はG127V防護性変異をPRNPに組み入れるために用いられ得る。

別の態様では、プライム編集はE219K防護性変異をPRNPに組み入れるために用いられ得る。

PRNPタンパク質および防護性変異部位は哺乳動物において保存されている。そのため、ヒト疾患を処置することに加えて、それは、プリオン病に対して免疫がある牛および羊を生成するか、またはさらにはプリオン病を患っている動物の野生集団を治癒させることを助けるためにもまた用いられ得る。プライム編集はヒト細胞における天然に存在する防護性アレルの～25％組み入れを達成するためにすでに用いられており、先のマウス実験は組み入れのこのレベルがほとんどのプリオン病に対する免疫を引き起こすために十分であるということを指示している。この方法は、ほとんどの細胞型においてかかる高い効率でこのアレルを組み入れるための最初のかつ可能性としては唯一の現行のやり方である。処置のための別の可能な戦略は、プライム編集を用いて、早期停止コドンを遺伝子に組み入れることによってPRNPの発現を縮減または消去することである。

PEgRNAデザインのための本明細書に記載の原理を用いて、所望の防護性変異を組み入れるためのまたはプリオン病関連変異をPRNPから除去するための適当なPEgRNAがデザインされ得る。例えば、PEgRNAの下のリストは、G127V防護性アレルおよびE219K防護性アレルをヒトPRNPに、ならびにG127V防護性アレルを種々の動物のPRNPに組み入れるために用いられ得る。

F．RNAタグ付けのためのプライム編集の使用
プライム編集は、RNAタグ付けによってRNA機能をコードするDNAの配列を操作、変改、および別様に改変するためにもまた用いられ得、このやり方で、RNAの構造および機能を間接的に改変するための手段を提供する。例えば、PEは、非コードRNAまたはmRNAをタグ付けまたは別様に操作するためのRNAレベルで機能的であるモチーフ(これ以降ではRNAモチーフ)を挿入するために用いられ得る。これらのモチーフは、遺伝子発現を増大させるか、遺伝子発現を減少させるか、スプライシングを変改するか、転写後修飾を変化させるか、RNAの細胞下レベル位置付けに影響するか、RNAの単離または細胞内もしくは外の位置付けの決定を可能化するか(例えば、蛍光RNAアプタマー、例えばSpinach、Spinach2、Baby Spinach、またはBroccoliを用いる)、内生もしくは外因的なタンパク質もしくはRNA結合因子を動員するか、sgRNAを導入するか、あるいは自己切断またはRNAseどちらかによるRNAのプロセシングを誘導するための用をなし得る(さらなる詳細については図28Bおよび例6を見よ)。

次のRNAタグまたはモチーフが、RNA輸送、発現レベル、スプライシング、および検出を包含するRNAの種々の特性に影響するための適当なPEgRNA(本願において提供されるガイダンスを用いてデザインされる)によるプライム編集を用いて目当ての遺伝子上に挿入され得る。

上の表のPEgRNAは、上のモチーフの例をHEXA遺伝子(テイ・サックス病において欠陥がある)に部位特異的に挿入するためにデザインされている(例えば、GenBank No.KR710351.1(配列番号369)。しかしながら、これは例解の目的のためのみである。RNAタグ付けへのプライム編集の使用はHEXA遺伝子に限定されず、実にいずれかの遺伝子であり得る。
HEXA mRNAは以下のヌクレオチド配列を有する:
GTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGTTGGCATGACAAGTTCCAGGCTTTGGTTTTCGCTGCTGCTGGCGGCAGCGTTCGCAGGACGGGCGACGGCCCTCTGGCCCTGGCCTCAGAACTTCCAAACCTCCGACCAGCGCTACGTCCTTTACCCGAACAACTTTCAATTCCAGTACGATGTCAGCTCGGCCGCGCAGCCCGGCTGCTCAGTCCTCGACGAGGCCTTCCAGCGCTATCGTGACCTGCTTTTCGGTTCCGGGTCTTGGCCCCGTCCTTACCTCACAGGGAAACGGCATACACTGGAGAAGAATGTGTTGGTTGTCTCTGTAGTCACACCTGGATGTAACCAGCTTCCTACTTTGGAGTCAGTGGAGAATTATACCCTGACCATAAATGATGACCAGTGTTTACTCCTCTCTGAGACTGTCTGGGGAGCTCTCCGAGGTCTGGAGACTTTTAGCCAGCTTGTTTGGAAATCTGCTGAGGGCACATTCTTTATCAACAAGACTGAGATTGAGGACTTTCCCCGCTTTCCTCACCGGGGCTTGCTGTTGGATACATCTCGCCATTACCTGCCACTCTCTAGCATCCTGGACACTCTGGATGTCATGGCGTACAATAAATTGAACGTGTTCCACTGGCATCTGGTAGATGATCCTTCCTTCCCATATGAGAGCTTCACTTTTCCAGAGCTCATGAGAAAGGGGTCCTACAACCCTGTCACCCACATCTACACAGCACAGGATGTGAAGGAGGTCATTGAATACGCACGGCTCCGGGGTATCCGTGTGCTTGCAGAGTTTGACACTCCTGGCCACACTTTGTCCTGGGGACCAGGTATCCCTGGATTACTGACTCCTTGCTACCCTGGGTCTGAGCCCTCTGGCACCTTTGGACCAGTGAATCCCAGTCTCAATAATACCTATGAGTTCATGAGCACATTCTTCTTAGAAGTCAGCTCTGTCTTCCCAGATTTTTATCTTCATCTTGGAGGAGATGAGGTTGATTTCACCTGCTGGAAGTCCAACCCAGAGATCCAGGACTTTATGAGGAAGAAAGGCTTCGGTGAGGACTTCAAGCAGCTGGAGTCCTTCTACATCCAGACGCTGCTGGACATCGTCTCTTCTTATGGCAAGGGCTATGTGGTGTGGCAGGAGGTGTTTGATAATAAAGTAAAGATTCAGCCAGACACAATCATACAGGTGTGGCGAGAGGATATTCCAGTGAACTATATGAAGGAGCTGGAACTGGTCACCAAGGCCGGCTTCCGGGCCCTTCTCTCTGCCCCCTGGTACCTGAACCGTATATCCTATGGCCCTGACTGGAAGGATTTCTACGTAGTGGAACCCCTGGCATTTGAAGGTACCCCTGAGCAGAAGGCTCTGGTGATTGGTGGAGAGGCTTGTATGTGGGGAGAATATGTGGACAACACAAACCTGGTCCCCAGGCTCTGGCCCAGAGCAGGGGCTGTTGCCGAAAGGCTGTGGAGCAACAAGTTGACATCTGACCTGACATTTGCCTATGAACGTTTGTCACACTTCCGCTGTGAGTTGCTGAGGCGAGGTGTCCAGGCCCAACCCCTCAATGTAGGCTTCTGTGAGCAGGAG TTTGAACAGACCTGCCCAACTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAAC(配列番号369)。

対応するHEXAタンパク質は以下のアミノ酸配列を有する:
MTSSRLWFSLLLAAAFAGRATALWPWPQNFQTSDQRYVLYPNNFQFQYDVSSAAQPGCSVLDEAFQRYRDLLFGSGSWPRPYLTGKRHTLEKNVLVVSVVTPGCNQLPTLESVENYTLTINDDQCLLLSETVWGALRGLETFSQLVWKSAEGTFFINKTEIEDFPRFPHRGLLLDTSRHYLPLSSILDTLDVMAYNKLNVFHWHLVDDPSFPYESFTFPELMRKGSYNPVTHIYTAQDVKEVIEYARLRGIRVLAEFDTPGHTLSWGPGIPGLLTPCYPGSEPSGTFGPVNPSLNNTYEFMSTFFLEVSSVFPDFYLHLGGDEVDFTCWKSNPEIQDFMRKKGFGEDFKQLESFYIQTLLDIVSSYGKGYVVWQEVFDNKVKIQPDTIIQVWREDIPVNYMKELELVTKAGFRALLSAPWYLNRISYGPDWKDFYVVEPLAFEGTPEQKALVIGGEACMWGEYVDNTNLVPRLWPRAGAVAERLWSNKLTSDLTFAYERLSHFRCELLRRGVQAQPLNVGFCEQEFEQT(配列番号370)。

注意すべきことに、もたらされるRNAモチーフはHEXA遺伝子の翻訳領域内に包含され、タンパク質コード遺伝子の機能を遮断するであろう。挿入されるポリアデニル化モチーフは未成熟転写物終結をもたらすであろう。この部位は、転写される、それゆえにRNA産物を生ずるであろうゲノム部位内における上の表の列記されるRNAモチーフの挿入をもたらし得る可能性あるPEgRNAを単に例解している。

RNAタグ付けのためのPEへの使用のためのPEgRNAは、U6プロモーター(このケースでは、Gで始まらないプロトスペーサーを包含するガイドでは、単一のグアノシンがPEgRNAの5'端に追加され、6～7つのチミンが3'端に追加されるであろう)またはpolIIプロモーター、例えばpCMV(このケースでは、自己切断エレメントまたはCsy4モチーフによってRNAの5'端からこのプロモーターの本来的に転写される配列を除去することが必要であり得、終結モチーフが、核からのRNAの搬出をもたらさないRNAの3'端に追加されることを必要とするであろう。例えば上に列記されている3'ボックスモチーフである。それはアニーリング領域の3'であろうから、このモチーフはPEの結果としてゲノム上に挿入されないであろうということに注意せよ)から発現され得る。コアPEgRNA骨格は下線付きであり、相同性およびアニーリング領域はイタリックであり、挿入配列は太字である。下で記載されるとおり、挿入される配列は上の例の逆相補体であり、よって、これらのPEgRNAはコード鎖へと標的化されることを必要とするであろうということに注意せよ。

また、HDV以外の自己切断リボザイムは、いくつかの態様では、所与の標的部位に合わせて仕立てられることを必要とするということに注意せよ;つまり、HDVはコードされる転写物をそれ自体の直ちに5'において切断するが、全ての他の自己切断リボザイムのカットされる部位はリボザイムそれ自体の内にある。よって、最初および最後の大体5～10ヌクレオチド(そしていくつかの場合には、可能性としては10よりも多く)は実際にはコードされる配列の一部であろう。例として、ハンマーヘッド自己切断リボザイムを用いて、Nがいずれかのヌクレオチドである配列5'NNNNNTCATCCTGATAAACTGCAAA3'(配列番号371)を5つのNの後で切断するためには、次の配列が挿入されるであろう。ここで、下線付き配列は完璧ではないRNA対形成エレメントを形成する。

5'NNNNNCAGTTTGTACGGATGACTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAACGCGCTTCGGTGCGTCTCATCCTGATAAACTGCAAA-3'(配列番号372)。

この対形成エレメントの長さおよび性質の観点からは有意なフレキシビリティーがあり、これは元々の提出物に列記される非HDV自己切断リボザイムのいずれかについて真であろう。上に列記されている構築物と同じプロトスペーサーを有するPEgRNAを用いてhexA mRNAを切断するハンマーヘッドリボザイムを組み入れるためには、次のPEgRNA配列が用いられ得る(標識は上と同じ):

(ここで、コアPEgRNA骨格に下線を付し、相同領域およびアニーリング領域は斜字体に、挿入配列は太字にしている)(配列番号373)。

RNAモチーフの挿入のために他のPEgRNAをデザインすることは、本明細書に記載の一般的な原理を踏襲する。しかしながら、RNAモチーフの多くは可能性として高度に構造化されているということが注意される。これはそれらが逆転写およびゲノム上に挿入されることを困難にし得る。いくつかのRNA配列、例えば単純なヘアピンでは、RNA配列それ自体およびその相補体両方が構造化されているが、しかしながら、それは上に記されている配列について真であることは非蓋然的である。よって、これらのモチーフを挿入するときには、最も蓋然的には、PEgRNAがこれらの配列の逆相補体をコードし、ゲノム上への実際にモチーフをコードするDNA配列の挿入をもたらすことが最善であろう。類似に、PEgRNA鋳型領域への自己切断リボザイムの包含はプロセシングおよび非効率的な活性をもたらすであろうが、その逆相補体の包含はもたらさないであろう。それゆえに、これらのPEgRNAは蓋然的にはコード鎖を標的化しなければならないであろうが、他の型の挿入(例えば治療学的な修正)をコードするPEgRNAは理論的にはどちらの鎖も標的化する能力があるであろう。

また、挿入されるモチーフの多くでは、もたらされるPEgRNAはU6プロモーターから転写される能力がなくあり得、他のプロモーター、例えばpCMVの使用を要するということに注意せよ。類似に、より長いPEgRNAもまたより安定ではなくあり得る。m⁶Aマーカーなどのより短いモチーフはこの課題を有さないであろう。

G．高性能遺伝子ライブラリの生成のためのプライム編集の使用
プライム編集は、定められたまたは可変の挿入、欠失、または定められたアミノ酸/ヌクレオチド変換を有するタンパク質またはRNAをコードする遺伝子の高性能ライブラリを生成するためにもまた用いられ得、高スループットスクリーニングおよび指向性進化へのそれらの使用が本明細書に記載の。プライム編集のこの適用は例7においてさらに記載され得る。

可変の遺伝子ライブラリの生成は最も普通には変異誘発PCRによって達成されている(Cadwell RC and Joyce GF.PCR Methods Appl.1992を見よ)。この方法は、DNAポリメラーゼの忠実性を縮減する反応条件を用いることまたはより高い変異率を有する改変されたDNAポリメラーゼを用いることどちらかに依拠する。そのため、これらのポリメラーゼのバイアスはライブラリ産物に反映される(例えば、トランスバージョンに対してトランジション変異の選好性)。ライブラリ構築のこのアプローチの内在する限定は、変えられようとする遺伝子のサイズに影響することの相対的不能である。ほとんどのDNAポリメラーゼはインデル変異(挿入または欠失)の極めて低い率を有し、これらのほとんどはタンパク質コード領域におけるフレームシフト変異をもたらし、ライブラリのメンバーがいずれかの下流のセレクションを通過することを非蓋然的にするであろう(McInerney P,Adams P,and Hadi MZ.Mol Biol Int.2014を見よ)。

加えて、PCRおよびクローニングのバイアスは、異なるサイズの遺伝子からなる単一のライブラリを生成することを困難にし得る。これらの限定は、存在するタンパク質機能を増強および新規のタンパク質機能を操作するための指向性進化の効力を厳しく限定し得る。天然の進化では、タンパク質機能または効力の大きい変化は、典型的には、変異導入のための標準的なライブラリ生成の間には生起することが非蓋然的である挿入および欠失変異に関連する。さらにその上、これらの変異は、最も普通には、疎水性コアと対比してループを形成することが予測される当のタンパク質の領域に生起する。それゆえに、従来のバイアスがないアプローチを用いて生成されるほとんどのインデルは、害があるかまたは無効かどちらかであることが蓋然的である。

全てのライブラリは可能な変異空間のある画分のみにアクセスするということから、それらが有益であることが最も蓋然的であろうタンパク質上の部位、例えばループ領域にかかる変異を偏らせ得るライブラリは、従来のライブラリと比べて有意な利点を有するであろう。最後に、NNKプライマーを用いるマルチステップPCRおよびクローンアセンブリによってまたはDNAシャッフリングによって、部位特異的なインデル変異を有する遺伝子ライブラリを生成することは可能であるが、これらのライブラリは連続的進化では「インデルジェネシス」の追加のラウンドを経過し得ない。連続的進化は、最小限のユーザー介入によるある型の指向性進化である。1つのかかる例はPACEである(Esvelt KM,Carlson JC,and Liu DR.Nature.2011を見よ)。連続的進化は最小限のユーザー介入によって生起するので、進化の間のライブラリ多様性のいずれかの増大はネイティブな複製機構を用いて生起するはずである。そのため、PACEでは、特定の座位として挿入または除去されたコドンを有する遺伝子のライブラリが生成およびスクリーニングされ得るが、「インデルジェネシス」の追加のラウンドは可能ではない。

プライム編集(PE)のプログラム可能性は、高スループットスクリーニングおよび指向性進化への使用のための高度に高性能なプログラムされた遺伝子ライブラリを生成するために活用され得るということが想定される(図29Aを見よ)。PEは、プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)上にコードされた情報を用いて、規定された遺伝子座位から定められた数のヌクレオチドを挿入、変化、または除去し得る(図29Bを見よ)。これは、非機能的なフレームシフト変異のバックグラウンド導入なしに、変異が機能の変化を生じさせることが最も蓋然的であるループ領域から挿入または除去された1つ以上のアミノ酸を有する標的化されたライブラリの生成を可能化する(図29Cを見よ)。PEは、DNAポリメラーゼまたは変異させられようとする配列どちらかに内在するバイアスにかかわらず、特定のセットの変異を組み入れるために用いられ得る。

例えば、それは2つのトランスバージョンを包含する3つの連続した変異を要求するであろうから、CCCコドンを停止コドンに変換することは標準的なライブラリ生成によっては非蓋然的な生起であろうが、PEは、いずれかの所与の標的コドンをTGA停止コドンへと1ステップで変換するために用いられ得る。それらは、例えば、いずれかの疎水性アミノ酸をコードしながらいずれかの他をコードしないコドンを所与の部位に組み込むことによって、プログラムされた多様性を所与の位置に組み入れるためにもまた用いられ得る。さらにその上、PEのプログラム可能性ゆえに、複数のPEgRNAが複数の異なる編集を複数の部位に同時に生成するために利用され得、高度にプログラムされたライブラリの生成を可能化する(図29Dを見よ)。加えて、より低い忠実性を有する逆転写酵素を用いて、さもなければ不変のライブラリにおいて変異導入の領域を生成することが可能である(例えば、HIV-I逆転写酵素またはBordetellaファージ逆転写酵素)(Naorem SS,Hin J,Wang S,Lee WR,Heng X,Miller JF,Guo H.Proc Natl Acad Sci 2017およびMartinez MA,Vartanian JP,Wain-Hobson S.Proc Natl Acad Sci USA 1994を見よ)。

同じ部位に対するPEの反復的なラウンドの可能性もまた想定され、例えば、例えばループ領域において、単一の部位におけるコドンの繰り返しの挿入を許す。また、上に記載されているアプローチの全てが連続的進化に組み込まれ得るということが想定され、新規のin situ進化ライブラリの生成を可能化する(図30を見よ)。それらは、大きいライブラリをアセンブリすることがさもなければ困難であろう他の細胞型内において、例えば哺乳類細胞内において、これらのライブラリを構築するためにもまた用いられ得る。指向性進化のための最適化されたPEをコードする細菌株の生成は、改善されたまたは新規の機能性を有するタンパク質およびRNAの同定のための有用な追加のツールであろう。PEのこれらの使用の全てはPEの新規の性質を原因として非自明である。結論として、PEによるライブラリ生成は、合成生物学および指向性進化において、ならびにタンパク質およびRNAのコンビナトリアル変異体の高スループットスクリーニングにとって、高度に有用なツールであろう。
競合するアプローチ

多様なライブラリが現行で生成される主だった方法は、上に記載されている変異誘発PCRによってである(Cadwell RC and Joyce GF.PCR Methods Appl.1992を見よ)。挿入または欠失はPCRの間に定められた部位において縮重したNNKプライマーによって導入され得るが、かかる変異を複数の部位において導入することは、より多様なライブラリを変異誘発PCRによって構築する前に複数のラウンドの反復的なPCRおよびクローニングを要求し、方法を低速にする。代替的な相補的な方法はDNAシャッフリングであり、ここでは、DNase処置によって生成された遺伝子のライブラリのフラグメントがプライマーなしのPCR反応に導入され、互いに対する異なるフラグメントのアニーリングと、変異誘発PCR単独よりも多様なライブラリの急速な生成とをもたらす(Meyer AJ,Ellefson JW,Ellington AD.Curr Protoc Mol Biol.2014を見よ)。このアプローチは理論的にはインデル変異を生成し得るが、それはより多くの場合には遺伝子機能を破壊するフレームシフト変異をもたらす。さらにその上、DNAシャッフリングは遺伝子フラグメント間に高い度合の相同性を要求する。

これらの方法の両方はin vitroでされなければならず、もたらされるライブラリは細胞に形質転換されるが、PEによって生成されるライブラリはin situで構築され得、連続的進化へのそれらの使用を可能化する。ライブラリはインビボの変異導入によってin situで構築され得、これらのライブラリはホスト細胞機構に依拠し、インデルに対してのバイアスを発揮する。類似に、従来のクローニング方法は部位特異的な変異プロファイルを生成するために用いられ得るが、それらはin situでは用いられ得ず、一般的には、細胞に形質転換される前にin vitroで1度に1つずつアセンブリされる。原核および真核細胞型両方におけるPEの効率および幅広い機能性は、さらに、E.coliなどのモデル生物にクローニングされることおよびそれから目当ての細胞または生物に移入されることと対比して、これらのライブラリが目当ての細胞型内において直接的に構築され得るということを示唆する。標的化された多様化の別の競合するアプローチは自動多重ゲノム工学またはMAGEであり、複数の一本鎖DNAオリゴヌクレオチドが複製フォークに組み込まれ得、プログラム可能な変異をもたらし得る⁷。しかしながら、MAGEはホスト株の有意な改変を要求し、オフターゲットまたはバックグラウンド変異の100倍の増大に至り得るが(Nyerges A et al.Proc Natl Acad Sci USA.2016を見よ)、PEはより高度にプログラムされており、より少数のオフターゲット効果をもたらすことが予期される。加えて、MAGEは哺乳類細胞を包含する広い種々の細胞型においては実証されていない。

対照的に、プライム編集はライブラリ生成のための新規のかつ非自明の補完的技術である。
遺伝子ライブラリを構築するためのPEの使用

PEはプログラム可能な様式で遺伝子ライブラリを構築するために用いられ得る。

1つの例では、PEは、PACEを用いる連続的進化実験の間に遺伝子ライブラリにタンパク質バリアントを導入するために指向性進化実験に用いられ得、従来のアプローチでは可能ではない様式で点変異およびインデル両方の反復的蓄積を許す。

PEは部位特異的にかつプログラム可能にヌクレオチドをE.coliの遺伝子配列上に挿入し得るということがすでに示されている。指向性進化は、改変されたツーハイブリッドタンパク質:タンパク質結合PACEセレクションによって、特異的なエピトープに対する改善された結合を有するモノボディを同定するために用いられ得る。これらのモノボディ上の特異的なかつ高度に可変のループは、有意に親和性および特異性に寄与する。改善されたモノボディ結合は、PACEにおいてはこれらのループの長さおよび組成を標的化された様式で変えることによって急速に得られ得る。しかしながら、配列長さを変えることはPACEの確立された機能性ではない。様々なループサイズのライブラリがPACEの出発点として用いられ得るが、長さの爾後の改善はPACEセレクションの間には発生せず、点変異およびインデル変異の有益な相乗的組み合わせへのアクセスを妨害するであろう。

種々の態様において、PEは、様々なループ長さを有するモノボディのin situ生成および進化を可能化することによって、PACEセレクションを改善するために用いられ得る。そうするためには、PACE E.coli株は追加のPEプラスミドに導入され得、これはPE酵素および1つ以上のPEgRNAをコードする。E.coliにおけるPE酵素およびPEgRNAの発現は、実験者によって選択される速度でPACEラグーンに送達される低分子のコントロール下にあるであろう。

種々の態様において、PEgRNA構成要素は、セレクションファージ上の目当ての部位へとPEを導くスペーサーを含有し、複数の3ヌクレオチドが標的部位に挿入され得るようにしてデザインされるであろう。その結果、新たなPEgRNA結合部位が導入され、標的部位における1つ以上のコドンの反復的挿入を可能化するであろう。

並行して、別のホストE.coli株は、1つ以上のコドンの除去の鋳型となるであろうPEgRNAを包含し得、ループサイズが進化の間に縮むことを可能化する。PACE実験は両方の株の混合物を利用し得るか、または2つを交互にしてループ配列の低速のかつコントロールされた追加または除去を許し得る。

モノボディライブラリを生出するためのPEおよびPACEの使用に加えて、この技術はPEおよびPACEを用いる抗体の進化にもまた適用され得る。抗体を支配する結合原理は、モノボディを支配するものに非常に類似である:抗体相補性決定領域ループの長さはそれらの結合機能にとって重大である。さらに、より長いループ長さは、HIV-1および他のウイルス感染に対する幅広く防護性の活性を有する稀な抗体の開発に重大であることが見出されている(Mascola JR,Haynes BF.Immunol Rev.2013を見よ)。抗体または抗体由来分子への上に記載されているPEの適用は、多様なループ長さおよび様々なループ配列を有する抗体の生成を許すであろう。PACEとの組み合わせで、かかるアプローチは、標準のPACEにとってはアクセス可能でないループジオメトリによる増強された結合を許し、それゆえに高度に機能的な抗体の進化を許すであろう。

限定しない例として、次のPEgRNAが、連続的進化実験に用いられるバクテリオファージのゲノムをプログラム可能に改変するために用いられ得る:

種々の態様において、遺伝子ライブラリを構築するためのPEの使用は、エラーを起こしやすい逆転写酵素の変異誘発活性の使用をなし得る。かかる変異誘発逆転写酵素の使用は、エラーを起こしやすいRTのより低い忠実性を原因として、変異導入されたプログラム可能なライブラリの生成を容易化し得る。本願において用いられる用語「エラーを起こしやすい」逆転写酵素は、野生型M-MLV逆転写酵素のエラー率未満であるエラー率を有する、天然に存在するまたは別の逆転写酵素(例えば、野生型M-MLV逆転写酵素)から導出された逆転写酵素酵素を言う。野生型M-MLV逆転写酵素のエラー率は15,000から27,000核酸塩基組み込みにつき1エラーの範囲であることが報告されている。Boutabout et al.(2001)“DNA synthesis fidelity by the reverse transcriptase of the yeast retrotransposon Ty1,”Nucleic Acids Res 29(11):2217-2222を見よ。これは参照によって本願に組み込まれる。

それゆえに、この適用の目的には、用語「エラーを起こしやすい」は、15,000核酸塩基組み込みにつき1つのエラー(6.7×10^-5またはより高く)、例えば、14,000核酸塩基につき1エラー(7.14×10^-5またはより高く)、13,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(7.7×10^-5またはより高く)、12,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(7.7×10^-5またはより高く)、11,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(9.1×10^-5またはより高く)、10,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(1×10^-4もしくは0.0001またはより高く)、9,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.00011またはより高く)、8,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.00013またはより高く)、7,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.00014またはより高く)、6,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.00016またはより高く)、5,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.0002またはより高く)、4,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.00025またはより高く)、3,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.00033またはより高く)、2,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.00050またはより高く)、または1,000核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.001またはより高く)、または500核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.002またはより高く)、または250核酸塩基もしくはより少数につき1エラー(0.004またはより高く)よりも多大であるエラー率を有するRTを言う。

高度に変異導入されたプログラム可能なライブラリの生成のためには、種々の変異誘発RTが想定され得る。2つのかかる例はBordetellaファージ(Handa,S.,et al.Nucl Acids Res 9711-25(2018)を見よ。これは参照によって本願に組み込まれる)およびLegionella pneumophila(Arambula,D.,et al.Proc Natl Acad Sci USA 8212-7(2013)を見よ。これは参照によって組み込まれる)からの変異誘発逆転写酵素である。BordetellaファージからのRT(brt)のケースでは、標的部位に対する変異誘発RTの結合を改善するために、補助的なタンパク質(bavd)がCas9に、および追加のRNA配列がPEgRNAに、追加またはトランスで送達されることをもまた必要とし得る(Handa,S.,et al.Nucl Acids Res 9711-25(2018)を見よ)。変異誘発RTを用いるときには、PEgRNAの鋳型領域は、多様性を増強するためのアデノシンまたはAAYコドンが濃縮され得る。

Bordetellaファージからの変異誘発RTのアミノ酸配列は次のとおり提供される。本明細書に開示の他のRTのように、Brtタンパク質は、機能的なPEを形成するように融合タンパク質としてnapDNAbpに融合され得る。

BodetellaからのBrtのケースでは、PE融合体は追加の補助的なタンパク質(Bavd)をもまた包含し得る。補助的なタンパク質はPE融合タンパク質に融合またはトランスで提供され得る。Bavd補助的タンパク質のアミノ酸配列は次のとおり提供される:

BodetellaからのBrtのケースでは、PEgRNAは、PEgRNA、例えば5'または3'端に追加された追加のヌクレオチド配列を含み得る。例示の配列は次のとおりであり、これは元々はBordetellaファージゲノムからである:

長さを短くするために、このPEgRNA追加配列は種々のやり方で縮減され得る。例えば、PEgRNA追加1配列は次の例示の代替的な追加配列へと縮減され得る:

他の態様において、PEgRNA追加配列もまた変異させられ得る。例えば、PEgRNA追加1配列は次の例示の代替的な追加配列へと変異させられ得る:

遺伝子ライブラリをデザインするためのPEの使用に関する種々の態様では、特殊なPEgRNAの考慮事項が適用され得る。例えば、理論によって拘束されることなしに、上に記載されている追加のPEgRNA配列は、変異誘発RTによる効率的な変異導入を可能化するために必要とされ得る。別の態様では、PEを用いる反復的なコドン挿入は特定のPEgRNAデザインを要求し得る。例えば、GGG(グリシン)コドンを反復的に挿入するためには、上に示されているとおり、PEgRNAの相同性領域全体がGから成ることを必要とし得る。これはある種の部位のみが反復的な挿入をし得るということを意味するであろう。加えて、PAM配列はPEによって遮断される能力はないであろう。

H．免疫エピトープの挿入のためのプライム編集の使用
プライム編集因子は、公知の免疫原性エピトープを内生または外生のゲノムDNA上に挿入するための手段としてもまた用いられ得、治療学的またはバイオテクノロジー的適用のための対応するタンパク質の改変をもたらす(図31および32を見よ)。プライム編集の本発明に先行しては、かかる挿入は、非効率的にかつDSBからの高いインデル形成率によってのみ達成され得た。プライム編集は挿入編集からの高いインデル形成の問題を解決しながら、一般的にHDRよりも高い効率をオファーする。このより低いインデル形成率は、特に免疫原性エピトープを挿入するという記載されている適用において、標的化されたDNA挿入のための方法としてのHDRと比べたプライム編集の主要な利点を提示する。エピトープの長さは少数塩基から数百塩基の範囲である。プライム編集因子はかかる標的化された挿入を哺乳類細胞において達成するための効率的なアプローチである。

本発明の鍵の概念は、それらのタンパク質産物および/または発現細胞型の下方制御および/または破壊のために、内生または外生のゲノムDNA上に、先に記載された免疫原性エピトープを含有するヌクレオチド配列を挿入するためのプライム編集因子の使用である。標的遺伝子のコードされるタンパク質と挿入される免疫原性のエピトープの対応するタンパク質翻訳との融合タンパク質を生ずる様式で、免疫原性のエピトープ挿入のためのヌクレオチド配列が、遺伝子へと標的化されるであろう。患者の免疫系は、例えば破傷風またジフテリアまたは麻疹に対するルーチンの予防接種からの先行する標準免疫化の結果として、これらのエピトープを認識するように先に訓練されているであろう。融合されるエピトープの免疫原性の性質の結果として、患者の免疫系は、プライム編集されたタンパク質(ただの挿入されるエピトープではない)と可能性としてはそれが発現された細胞とを認識および不能化することが予想されるであろう。

CRISPR/Casシステムを用いる精密なゲノム標的化テクノロジーが、最近では、標的ゲノム座位上への操作されたDNA配列の挿入を包含する広い範囲の適用において調査されている。先には、相同組み換え修復(HDR)がこの適用について用いられ、ssDNAドナー鋳型と二本鎖DNA切断(DSB)の手段による修復開始とを要求した。この戦略は、細胞になされるべき可能な変化の最も幅広い範囲をオファーし、大きいDNA配列を哺乳類細胞に挿入するために利用可能な唯一の方法である。しかしながら、HDRは、そのDSBを開始することから派生する望まれない細胞副作用、例えば高いレベルのインデル形成、DNA転座、大きい欠失、およびP53活性化によって邪魔される。これらの欠点に加えて、HDRは多くの細胞型における低い効率によって限定される(T細胞はこの観察の注意すべき例外である)。これらの欠点を克服するための最近の作業は、ヒトRad51変異体をCas9 D10Aニッカーゼに融合することを包含し(RDN)、DSBフリーHDRシステムをもたらす。これは、改善されたHDR産物:インデル比およびより低いオフターゲット編集を特色とするが、細胞型依存性および控えめなのみのHDR編集効率によってなお邪魔される。

PEgRNAとカップリングされた逆転写酵素へのCas9の最近開発された融合体(「プライム編集因子」)は、存在するゲノム編集法と比べていくつもの利点をオファーする新規のゲノム編集テクノロジーを表し、部位特異的な様式で、いずれかの1ヌクレオチド置換を組み入れおよびヌクレオチドのいずれかの短いストレッチ(最高で少なくとも何ダースもの塩基)を挿入または欠失する能力を包含する。注意すべきことに、PE編集は一般的には低い意図されないインデル率によって達成される。そのため、PEは、先には不可能または非実用的であった標的化された挿入に基づく編集適用を可能化する。

この具体的な側面は、公知の免疫原性エピトープを内生または外生のゲノムDNA上に挿入するための手段としてプライム編集を用いるための方法を記載し、治療学的またはバイオテクノロジー的適用のための対応するタンパク質の改変をもたらす(図31および32を見よ)。プライム編集の本発明に先行しては、かかる挿入は、非効率的にかつDSBからの高いインデル形成率によってのみ達成され得た。プライム編集は挿入編集からの高いインデル形成の問題を解決しながら、一般的にHDRよりも高い効率をオファーする。このより低いインデル形成率は、特に免疫原性エピトープを挿入するという記載されている適用において、標的化されたDNA挿入のための方法としてのHDRと比べたプライム編集の主要な利点を提示する。エピトープの長さは少数塩基から数百塩基の範囲である。プライム編集因子はかかる標的化された挿入を哺乳類細胞において達成するための効率的なかつ最もクリーンなアプローチである。

この側面の鍵の概念は、それらのタンパク質産物および/または発現細胞型の下方制御および/または破壊のために、先に記載された免疫原性エピトープを含有するヌクレオチド配列を内生または外生のゲノムDNA上に挿入するためのプライム編集因子の使用である。標的遺伝子のコードされるタンパク質と挿入される免疫原性のエピトープの対応するタンパク質翻訳との融合タンパク質を生ずる様式で、免疫原性のエピトープ挿入のためのヌクレオチド配列は、遺伝子へと標的化されるであろう。患者の免疫系は、例えば破傷風またジフテリアまたは麻疹に対するルーチンの予防接種からの先行する標準免疫化の結果として、これらのエピトープを認識するように先に訓練されているであろう。融合されるエピトープの免疫原性の性質の結果として、患者の免疫系は、プライム編集されたタンパク質(ただの挿入されるエピトープではない)と可能性としてはそれが発現された細胞とを認識および不能化することが予想されるであろう。

標的遺伝子への融合体は、挿入されたエピトープタンパク質翻訳が免疫系認識のために暴露されるということを保証するために必要とされるとおり操作されるであろう。これは、免疫原性エピトープがタンパク質構造の表面に暴露された領域にコードされるようにして、標的遺伝子への免疫原性エピトープのC末端融合体、標的遺伝子への免疫原性エピトープのN末端融合体、または遺伝子上へのヌクレオチドの挿入を生むタンパク質翻訳をもたらす標的化されたヌクレオチド挿入を包含し得る。

標的遺伝子の免疫系認識、細胞輸送、タンパク質機能、またはタンパク質フォールディングを容易化するために、標的遺伝子配列と挿入される免疫原性エピトープヌクレオチド配列との間に挿入されるヌクレオチドとしてコードされるタンパク質リンカーが、本発明の一部として操作されることを必要とし得る。これらの挿入されるヌクレオチドによってコードされるタンパク質リンカーは、可変の長さおよび配列のXTENリンカーまたは可変の長さおよび配列のグリシン-セリンリンカーを包含し得る(が、これらに限定されない)。これらの操作されたリンカーは、タンパク質融合を首尾良く容易化するために先に用いられている。例示のリンカーは、本明細書に記載のもののいずれかを包含し得、アミノ酸配列(GGGGS)n(配列番号165)、(G)n(配列番号166)、(EAAAK)n(配列番号167)、(GGS)n(配列番号168)、(SGGS)n(配列番号169)、(XP)n(配列番号170)、またはそれらのいずれかの組み合わせを包含し、nは独立して1および30の間の整数であり、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列(GGS)n(配列番号176)を含み、nは1、3、または7である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGSETPGTSESATPES(配列番号171)を含む。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(配列番号172)を含む。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSGGSGGS(配列番号173)を含む。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGS(配列番号174)を含む。

この側面の際立った特色は、さもなければ非免疫原性のタンパク質に対する免疫応答を誘導するための手段として、特定のアミノ酸配列に対する先に獲得された免疫応答を用いる能力を包含する。別の際立った特色は、副産物編集としての欲されないインデルの高いレベルを誘導せずかつその挿入が効率的である標的様式で、これらの免疫原性のエピトープのヌクレオチド配列を挿入する能力である。PEのこの特定の適用は、細胞型特異的な送達方法(例えばAAV血清型)を組み合わせて、それに対する免疫応答を誘発することが目当てである細胞型にエピトープを挿入する能力を有する。

免疫原性のエピトープを病原性の遺伝子上に挿入する手段としてのプライム編集は、広い種々の疾患(免疫腫瘍学戦略のがんに限定されない)と戦うように患者の免疫系をプログラムするために用いられ得る。このテクノロジーの直ちに該当する使用は、がんの治療学としてであろう。なぜなら、それは、HER2のような該当するがん遺伝子またはEGFRのような増殖因子に対する免疫応答を引き起こすことによって、腫瘍の免疫エスケープ機序を阻み得るからである。かかるアプローチはT細胞操作に類似に見え得るが、このアプローチの1つの新規の進歩は、操作されたT細胞を生成し患者に導入することを必要とすることなしに、それが多くの細胞型におよびがん以外の疾患に利用され得るということである。

PEを用いて、ほとんどの者がすでに予防接種されている免疫原性エピトープ(破傷風、百日咳、ジフテリア、麻疹、ムンプス、風疹など)を疾患を駆動する外生のまたは内生遺伝子上に挿入し、そのため、患者の免疫系はそのタンパク質を不能化することを学習する。

前述の戦略からの可能性ある治療学的な利益を有しそうな疾患は、毒性のタンパク質の凝集によって引き起こされるもの、例えば致死性家族性不眠症を包含する。利し得る他の疾患は、さもなければ非毒性の内生タンパク質の病原性の過剰発現によって引き起こされるもの、および外生の病原体によって引き起こされるものを包含する。

一次的な治療学的適応は、上で言及されているもの、例えばがん、プリオン、および他の神経変性疾患の治療学、感染性疾患、ならびに予防的な医療を包含する。二次的な治療学的適応は、遅発性の遺伝子疾患を有する患者の予防的ケアを包含し得る。特に侵襲性のがんのようないくつかの疾患では、または薬物治療が疾患が完全に治癒するまで疾患症状を緩和することを助けるケースでは、現行の標準治療の医療がプライム編集と併せて用いられ得るということが予想される。下は、本明細書に開示のプライム編集因子によって遺伝子上に挿入され得る免疫エピトープの例である:

当該技術分野で公知の追加の免疫エピトープもまた組み入れられ得る。Immune Epitope Database and Analysis Resource(iedb.org/epitopedetails_v3.php)(これの内容は参照によって本願に組み込まれる)から利用可能な免疫エピトープのいずれかは、本明細書に開示のプライム編集因子によって組み入れられ得る。

いくつかの態様では、本明細書に開示のプライム編集因子によって組み入れられ得る免疫エピトープは次のエピトープのいずれかを包含し得る:

I．プライム編集因子の送達
別の側面において、本開示は、種々の戦略を用いてin vitroおよびインビボのプライム編集因子の送達を可能にし、分裂インテインを用いる別個のベクター、ならびにエレクトロポレーションなどの技術を用いるリボヌクレオタンパク質複合体(すなわち、PEgRNAおよび/または第2部位gRNAと複合体化したプライム編集因子)、カチオン性脂質によって媒介される製剤の使用、およびリボヌクレオタンパク質複合体に融合された受容体リガンドを用いる誘導性エンドサイトーシス法という直接的送達戦略を包含する。いずれかのかかる方法が本願において企図される。

送達オプションの概観
いくつかの側面では、本発明は、1つ以上のプライム編集因子をコードするポリヌクレオチド、例えば本明細書に記載のプライム編集システムの1つ以上の構成要素をコードする本明細書に記載の1つ以上のベクター、その1つ以上の転写物、および/またはそれから転写される1つ以上のタンパク質を、ホスト細胞に送達することを含む方法を提供する。いくつかの側面では、本発明は、さらに、かかる方法によって生ずる細胞、およびかかる細胞を含むかまたはそれから生ずる生物(例えば動物、植物、または真菌)を提供する。いくつかの態様では、本明細書に記載のプライム編集因子は、ガイド配列との組み合わせで(任意に、それと複合体化されて)、細胞に送達される。従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法が、哺乳類細胞または標的組織において核酸を導入するために用いられ得る。かかる方法は、プライム編集因子の構成要素をコードする核酸を培養中のまたはホスト生物中の細胞に投与するために用いられ得る。非ウイルスベクター送達システムは、DNAプラスミド、RNA(例えば、本明細書に記載のベクターの転写物)、裸の核酸、およびリポソームなどの送達基剤と複合体化した核酸を包含する。ウイルスベクター送達システムはDNAおよびRNAウイルスを包含し、これらは細胞への送達後にエピソーム性のまたは取り入れされたゲノムどちらかを有する。遺伝子療法の総説については、Anderson,Science 256:808-813(1992);Nabel & Felgner,TIBTECH 11:211-217(1993);Mitani & Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993);Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993);Miller,Nature 357:455-460(1992);Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988);Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995);Kremer & Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995);Haddada et al.,in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bihm(eds)(1995);およびYu et al.,Gene Therapy 1:13-26(1994)を参照。

核酸の非ウイルス的送達の方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、裸のDNA、人工ビリオン、およびDNAの薬剤によって増強された取り込みを包含する。リポフェクションは例えば米国特許第5,049,386号、第4,946,787号;および第4,897,355号に記載され、リポフェクション試薬は市販で販売されている(例えば、Transfectam(商標)およびLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションにとって好適であるカチオン性および中性脂質は、FeignerのWO91/17424;WO91/16024のものを包含する。送達は細胞(例えば、in vitroのまたはエクスビボの投与)または標的組織(例えばインビボの投与)にであり得る。

イムノ脂質複合体などの標的化リポソームを包含する脂質:核酸複合体の調製は当業者に周知である(例として、Crystal,Science 270:404-410(1995);Blaese et al.,Cancer Gene Ther.2:291-297(1995);Behr et al.,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994);Remy et al.,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994);Gao et al.,Gene Therapy 2:710-722(1995);Ahmad et al.,Cancer Res.52:4817-4820(1992);米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、および第4,946,787を参照)。

核酸の送達のためのRNAまたはDNAウイルスに基づくシステムの使用は、体の特定の細胞へとウイルスを標的化およびウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利する。ウイルスベクターは、直接的に患者に投与され得るか(インビボ)、またはそれらはin vitroの細胞を処置するために用いられ得、改変された細胞が任意に患者に投与され得る(エクスビボ)。従来のウイルスに基づくシステムは、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、および単純ヘルペスウイルスベクターを包含し得る。ホストゲノムへの取り入れはレトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入法で可能であり、多くの場合には、挿入されたトランスジーンの長期的発現をもたらす。加えて、高い形質導入効率が多くの異なる細胞型および標的組織で観察されている。

ウイルスのトロピズムは外生のエンベロープタンパク質を組み込むことによって変改され得、標的細胞の可能性ある標的集団を拡張する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染する能力があるレトロウイルスベクターであり、典型的には高いウイルス力価を生ずる。よって、レトロウイルス遺伝子移入システムの選択は標的組織に依存するであろう。レトロウイルスベクターはシスに作用する長い末端反復からなり、最高で6-10kbの外生の配列のパッケージング容量を有する。最小のシスに作用するLTRはベクターの複製およびパッケージングにとって十分であり、これらはそれから治療学的な遺伝子を標的細胞に取り入れするために用いられて、永久的なトランスジーン発現を提供する。広く用いられるレトロウイルスベクターは、ネズミ白血病ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、およびそれらの組み合わせに基づくものを包含する(例えば、Buchscher et al.,J.Virol.66:2731-2739(1992);Johann et al.,J.Virol.66:1635-1640(1992);Sommnerfelt et al.,Virol.176:58-59(1990);Wilson et al.,J.Virol.63:2374-2378(1989);Miller et al.,J.Virol.65:2220-2224(1991);PCT/US94/05700を見よ)。一過性の発現が好ましい適用では、アデノウイルスに基づくシステムが用いられ得る。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率ができ、細胞分裂を要求しない。かかるベクターによって、高い力価および発現レベルが得られている。このベクターは相対的に単純なシステムによって大きい数量で生じ得る。アデノ随伴ウイルス(「AAV」)ベクターもまた細胞に標的核酸を形質導入するために、例えば、核酸およびペプチドのin vitro生産にならびにインビボおよびエクスビボの遺伝子治療手続きに用いられ得る(例として、West et al.,Virology 160:38-47(1987);米国特許第4,797,368号;WO93/24641;Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994);Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)を参照)。組換えAAVベクターの構築は、米国特許第5,173,414号;Tratschin et al.,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985);Tratschin,et al.,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984);Hermonat & Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984);およびSamulski et al.,J.Virol.63:03822-3828(1989)を包含する数多の刊行物に記載されている。

パッケージング細胞は、ホスト細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために典型的に用いられる。かかる細胞は、アデノウイルスをパッケージングする293細胞およびレトロウイルスをパッケージングするψ2細胞またはPA317細胞を包含する。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする細胞株を生ずることによって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびホストへの爾後の取り入れに要求される最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は発現されるべきポリヌクレオチド(単数または複数)の発現カセットによって置き換えられる。欠けているウイルス機能は典型的にはパッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に用いられるAAVベクターは、典型的には、パッケージングおよびホストゲノムへの取り入れに要求されるAAVゲノムからのITR配列のみを所有する。ウイルスDNAは細胞株によってパッケージングされ、これは、他のAAV遺伝子つまりrepおよびcapをコードするがITR配列を欠くヘルパープラスミドを含有する。細胞株はヘルパーとしてのアデノウイルスにもまた感染し得る。ヘルパーウイルスはAAVベクターの複製およびヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドはITR配列の欠如を原因として有意な量ではパッケージングされない。アデノウイルスによるコンタミネーションは、例えば、アデノウイルスがAAVよりも敏感である熱処置によって縮減され得る。細胞への核酸の送達のための追加の方法は当業者に公知である。例えば、参照によって本願に組み込まれるUS20030087817を見よ。

種々の態様において、PE構築物(分裂構築物を包含する)は1つ以上のrAAVベクターによる送達のために操作され得る。本願において提供される方法および組成物のいずれかに関するrAAVは、いずれかの誘導体またはシュードタイプを包含するいずれかの血清型であり得る(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、2/1、2/5、2/8、2/9、3/1、3/5、3/8、または3/9)。rAAVは細胞に送達されるべきである遺伝子積荷(すなわち、rAAVによって細胞内に持ち込まれる丸ごとのまたは分裂のPE融合タンパク質などの目当ての遺伝子を発現する組み換え核酸ベクター)を含み得る。rAAVはキメラであり得る。

rAAVの本願において用いられる血清型は、組み換えウイルスのカプシドタンパク質の血清型を言う。誘導体およびシュードタイプの限定しない例は、rAAV2/1、rAAV2/5、rAAV2/8、rAAV2/9、AAV2-AAV3ハイブリッド、AAVrh.10、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAV-HSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV6(Y445F/Y731F)、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAVクローン32/83、AAVShH10、AAV2(Y-＞F)、AAV8(Y733F)、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41、およびAAVr3.45を包含する。キメラVP1タンパク質を有する誘導体およびシュードタイプの限定しない例はrAAV2/5-1VP1uであり、これはAAV2のゲノム、AAV5のカプシドバックボーン、およびAAV1のVP1uを有する。キメラVP1タンパク質を有する誘導体およびシュードタイプの他の限定しない例はrAAV2/5-8VP1u、rAAV2/9-1VP1u、およびrAAV2/9-8VP1uである。

AAV誘導体/シュードタイプ、およびかかる誘導体/シュードタイプを生ずるための方法は、当該技術分野で公知である(例えば、Mol Ther.2012 Apr;20(4):699-708.doi:10.1038/mt.2011.287.Epub 2012 Jan 24.The AAV vector toolkit:poised at the clinical crossroads.Asokan A1,Schaffer DV,Samulski RJ.を見よ)。シュードタイプのrAAVベクターを生ずるおよび用いるための方法は当該技術分野で公知である(例えば、Duan et al.,J.Virol.,75:7662-7671,2001;Halbert et al.,J.Virol.,74:1524-1532,2000;Zolotukhin et al.,Methods,28:158-167,2002;およびAuricchio et al.,Hum.Molec.Genet.,10:3075-3081,2001を見よ)。

rAAV粒子を作るまたはパッケージングする方法は当該技術分野で知られており、試薬が市販で利用可能である(例えば、Zolotukhin et al.Production and purification of serotype 1,2,and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.Methods 28(2002)158-167;および米国特許公開番号US20070015238およびUS20120322861を見よ。これらは参照によって本願に組み込まれる;プラスミドおよびキットはATCCおよびCell Biolabs,Inc.から利用可能)。例えば、目当ての遺伝子を含むプラスミドが、例えばrep遺伝子(例えば、Rep78、Rep68、Rep52、およびRep40をコードする)およびcap遺伝子(本明細書に記載の改変されたVP2領域を包含するVP1、VP2、およびVP3をコードする)を含有する1つ以上のヘルパープラスミドと組み合わせられ、組み換え細胞にトランスフェクションされ得る。その結果、rAAV粒子がパッケージングおよび爾後に精製され得る。

組み換えAAVは核酸ベクターを含み得、これは、最小で:(a)目当てのタンパク質もしくはポリペプチドまたは目当てのRNA(例えば、siRNAもしくはmicroRNA)をコードする配列を含む1つ以上の異種核酸領域と、(b)1つ以上の核酸領域(例えば、異種核酸領域)をフランキングする逆位末端反復(ITR)配列(例えば、野生型ITR配列または操作されたITR配列)を含む1つ以上の領域とを含み得る。本願において、目当てのタンパク質または目当てのRNAをコードする配列を含む異種核酸領域は目当ての遺伝子と言われる。

本願において提供されるrAAV粒子のいずれか1つは、VP1u領域の外に異なる血清型のアミノ酸を有するカプシドタンパク質を有し得る。いくつかの態様では、VP1タンパク質のバックボーンの血清型はITRおよび/またはRep遺伝子の血清型とは異なる。いくつかの態様では、粒子のVP1カプシドタンパク質のバックボーンの血清型はITRの血清型と同じである。いくつかの態様では、粒子のVP1カプシドタンパク質のバックボーンの血清型はRep遺伝子の血清型と同じである。いくつかの態様では、rAAV粒子のカプシドタンパク質は改善された形質導入効率をもたらすアミノ酸変異を含む。

いくつかの態様では、核酸ベクターは、核酸(例えば、異種核酸)の発現を容易化する配列、例えば核酸に作動可能に連結された発現コントロール配列を含む1つ以上の領域を含む。数々のかかる配列が当該技術分野で公知である。発現コントロール配列の限定しない例は、プロモーター、インシュレーター、サイレンサー、応答エレメント、イントロン、エンハンサー、開始部位、終結シグナル、およびポリAテールを包含する。かかるコントロール配列のいずれかの組み合わせは本願において企図される(例えば、プロモーターおよびエンハンサー)。

最終的なAAV構築物はPEgRNAをコードする配列を組み込み得る。他の態様において、AAV構築物は、第2部位ニッキングガイドRNAをコードする配列を組み込み得る。なお他の態様において、AAV構築物は、第2部位ニッキングガイドRNAをコードする配列とPEgRNAをコードする配列とを組み込み得る。

種々の態様において、PEgRNAおよび第2部位ニッキングガイドRNAは、適当なプロモーター、例えばヒトU6(hU6)プロモーター、マウスU6(mU6)プロモーター、または他の適当なプロモーターから発現され得る。PEgRNAおよび第2部位ニッキングガイドRNAは同じプロモーターまたは異なるプロモーターから駆動され得る。

いくつかの態様では、rAAV構築物または本願の組成物は対象に経腸的に投与される。いくつかの態様では、rAAV構築物または本願の組成物は対象に非経口的に投与される。いくつかの態様では、rAAV粒子または本願の組成物は、対象に皮下で、眼内で、硝子体内で、網膜下で、静脈内で(IV)、脳室内で、筋肉内で、髄腔内で(IT)、脳槽内で、腹腔内で、吸入によって、局所的に、または1つ以上の細胞、組織、もしくは臓器への直接的注射によって投与される。いくつかの態様では、rAAV粒子または本願の組成物は、対象に肝動脈または門脈への注射によって投与される。
分裂PEベクターに基づく戦略

この側面では、プライム編集因子は分裂部位において割られ得、丸ごとの/完全なプライム編集因子の2つの半分として提供され得る。2つの半分は細胞に送達され得(例えば、発現されたタンパク質として、または別個の発現ベクター上において)、ひとたび細胞内で接触をすると、2つの半分は各プライム編集因子半分のインテインの自己スプライシング作用によって完全なプライム編集因子を形成する。細胞内におけるそれらのトランススプライシングと完全な機能するPEの付随的復元とを容易化するために、分裂インテイン配列が、コードされるプライム編集因子の半分の夫々に操作され得る。

これらの分裂インテインに基づく方法はインビボ送達のいくつかの関門を克服する。例えば、プライム編集因子をコードするDNAはrAAVパッケージング限界よりも大きく、そのため、特殊な解決を要求する。1つのかかる解決は、分裂インテインペアに融合された編集因子を製剤することであり、これらが2つの別個のrAAV粒子にパッケージングされ、これらは細胞に同時送達されるときに機能的な編集因子タンパク質を再構成する。プライム編集の固有の特色を説明するいくつかの他の特殊な考慮事項が記載され、第2部位ニッキング標的の最適化と、レンチウイルスおよびrAAVを包含するウイルスベクターにプライム編集因子を適切にパッケージングすることとを包含する。

この側面では、プライム編集因子は分裂部位において割られ得、丸ごとの/完全なプライム編集因子の2つの半分として提供され得る。2つの半分は細胞に送達され得(例えば、発現されたタンパク質として、または別個の発現ベクター上において)、ひとたび細胞内で接触をすると、2つの半分は各プライム編集因子半分のインテインの自己スプライシング作用によって完全なプライム編集因子を形成する。細胞内におけるそれらのトランススプライシングと完全な機能するPEの付随的復元とを容易化するために、分裂インテイン配列が、コードされるプライム編集因子の半分の夫々に操作され得る。

図66は、2つのPEの半分のタンパク質として提供されているプライム編集因子の1つの態様を図示する。これらは、プライム編集因子の半分のタンパク質の夫々の終わりまたは始まりに位置付けられた分裂インテインの半分同士の自己スプライシング作用によって、丸ごとのプライム編集因子を再生する。本願において用いられる用語「PE N末端半分」は、完全なプライム編集因子のPE N末端半分のC末端の端に「Nインテイン」を含む、完全なプライム編集因子のN末端半分を言う(すなわち、N末端エクステイン)。「Nインテイン」は、完全な十分に形成された分裂インテイン部分のN末端半分を言う。本願において用いられる用語「PE C末端半分」は、完全なプライム編集因子のC末端半分のN末端の端に「Cインテイン」を含む完全なプライム編集因子のC末端半分を言う(すなわち、C末端エクステイン)。2つの半分タンパク質、すなわちPE N末端半分およびPE C末端半分が例えば細胞内において互いと接触をするときには、NインテインおよびCインテインは、自己切除とPE N末端半分のC末端の端およびPE C末端半分のN末端の端の間のペプチド結合の形成との同時プロセスを経過して、完全なnapDNAbpドメイン(例えばCas9ニッカーゼ)およびRTドメインを含む完全なプライム編集因子タンパク質を再形成する。図面には示されていないが、プライム編集因子は、N末端および/またはC末端のNLSと各ドメインを連結するアミノ酸リンカー配列とを包含する追加の配列をもまた含み得る。

種々の態様において、プライム編集因子は、丸ごとのプライム編集因子を「分裂部位」において(as)「分裂」することによって、2つの半分タンパク質(すなわち、PE N末端半分およびPE C末端半分)として操作され得る。「分裂部位」は、プライム編集因子上の2つの隣接するアミノ酸残基の間における分裂インテイン配列(すなわち、NインテインおよびCインテイン)の挿入の位置付けを言う。より具体的には、「分裂部位」は丸ごとのプライム編集因子を2つの別個の半分へと割る位置付けを言い、各半分は分裂部位においてNインテインまたはCインテインモチーフどちらかに融合される。分裂部位はプライム編集因子融合タンパク質上のいずれかの好適な位置付けであり得るが、好ましくは、分裂部位は送達(例えば発現ベクターによる)にとって適当なサイズである2つの半分タンパク質の形成を許す位置に位置付けられ、分裂部位末端において各半分タンパク質に融合されているインテインは、1つの半分タンパク質が細胞内において他の半分タンパク質に接触するときに互いと十分に相互作用するように利用可能である。

いくつかの態様では、分裂部位はnapDNAbpドメイン上に位置付けられる。他の態様において、分裂部位はRTドメイン上に位置付けられる。他の態様において、分裂部位はnapDNAbpドメインおよびRTドメインを連結するリンカー上に位置付けられる。

種々の態様において、分裂部位デザインは、2つの半分のプライム編集因子ドメインを2つの異なるAAVゲノムにパッケージングする目的を両方が構造的に許容するNおよびC末端インテインを分裂および挿入するための部位を見出すことを要求する。加えて、トランススプライシングに必要なインテイン残基は、C末端エクステインのN末端の残基を変異させることまたはインテインの「傷跡」を残すであろう残基を挿入することによって組み込まれ得る。

SpCas9ニッカーゼまたはSaCas9ニッカーゼどちらかを含む分裂されたプライム編集因子の例示の分裂構成は次のとおりである。

種々の態様では、例としてSpCas9ニッカーゼ(配列番号18、1368アミノ酸)を用いて、分裂は、1および1368の間のいずれかの2つのアミノ酸の間においてであり得る。しかしながら、好ましい分裂は、タンパク質の中心領域の間に、例えば、配列番号18のアミノ酸50～1250、または100～1200、または150～1150、または200～1100、または250～1050、または300～1000、または350～950、または400～900、または450～850、または500～800、または550～750、または600～700に位置付けられるであろう。特定の例示の態様では、分裂部位は740/741、または801/802、または1010/1011、または1041/1042の間であり得る。他の態様において、分裂部位は、配列番号18のSpCas9に対して相対的に、1/2、2/3、3/4、4/5、5/6、6/7、7/8、8/9、9/10、10/11、12/13、14/15、15/16、17/18、19/20、20/21、21/22、22/23、23/24、24/25、25/26、26/27、27/28、28/29、29/30、30/31、31/32、32/33、33/34、34/35、35/36、36/37、38/39、39/40、41/42、42/43、43/44、44/45、45/46、46/47、47/48、48/49、49/50、51/52、52/53、53/54、54/55、55/56、56/57、57/58、58/59、59/60、61/62、62/63、63/64、64/65、65/66、66/67、67/68、68/69、69/70、71/72、72/73、73/74、74/75、75/76、76/77、77/78、78/79、79/80、81/82、82/83、83/84、84/85、85/86、86/87、87/88、88/89、89/90の間、または90～100、100～150、150～200、200～250、250～300、300～350、350～400、450～500、500～550、550～600、600～650、650～700、700～750、750～800、800～850、850～900、900～950、950～1000、1000～1050、1050～1100、1100～1150、1150～1200、1200～1250、1250～1300、1300～1350、および1350～1368の間の隣接する残基のいずれか2つのペアの間、配列番号18と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列上のいずれか2つの対応する残基の間、あるいは配列番号19～88のアミノ酸配列のいずれかのSpCas9のバリアントもしくは等価物、または配列番号19～88のいずれかと少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、もしくは99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列のいずれか2つの対応する残基の間であり得る。

種々の態様において、分裂インテイン配列は次のインテイン配列からによって操作され得る。

種々の他の態様において、分裂インテイン配列は次のとおり用いられ得る:

種々の態様において、分裂インテインは完全なPE融合タンパク質の別個の部分を細胞に別個に送達するために用いられ得、これらは、細胞内での発現によって、トランススプライシングによって完全なPE融合タンパク質として再構成されるようになる。

いくつかの態様では、本開示は、PE融合タンパク質を細胞に送達する方法を提供し:
(a)第1の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のN末端フラグメントをコードする第1の発現ベクターを構築すること;
(b)第2の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のC末端フラグメントをコードする第2の発現ベクターを構築すること;
(c)第1および第2の発現ベクターを細胞に送達すること、
を含み、
第1および第2の分裂インテイン配列の自己切除を引き起こすトランススプライシング活性の結果として、N末端およびC末端フラグメントは、細胞内においてPE融合タンパク質として再構成される。

分裂部位は、いくつかの態様では、napDNAbpドメイン、リンカー、または逆転写酵素ドメインを包含するプライム編集因子融合体のどこかであり得る。

他の態様において、分裂部位はnapDNAbpドメイン上である。

なお他の態様において、分裂部位は逆転写酵素またはポリメラーゼドメイン上である。

さらに他の態様において、分裂部位はリンカー上である。

種々の態様において、本開示は、napDNAbp(例えばCas9ドメイン)と逆転写酵素とを含むプライム編集因子を提供し、napDNAbpおよび/または逆転写酵素の1つまたは両方は、インテイン、例えばリガンド依存性インテインを含む。典型的には、インテインはリガンド依存性インテインであり、これはリガンド(例えば、4-ヒドロキシタモキシフェンなどの低分子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、アミノ酸、およびヌクレオチド)の不在下ではタンパク質スプライシング活性を発揮しないか、または最小限発揮する。リガンド依存性インテインは知られており、U.S.2014/0065711A1として公開された米国特許出願U.S.S.N.14/004,280に記載されているものを包含する。これの内容全体は参照によって本願に組み込まれる。加えて、分裂Cas9アーキテクチャの使用、いくつかの態様では、インテインは配列番号8-15、447、452、462、および472-479からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

種々の態様において、napDNAbpドメインは配列番号18の標準的なSpCas9ドメインと比較して小さいサイズのnapDNAbpドメインである。

標準的なSpCas9タンパク質は長さが1368アミノ酸であり、158キロダルトンという予測される分子量を有する。本願において用いられる用語「小さいサイズのCas9バリアント」は、少なくとも1300アミノ酸未満、または少なくとも1290アミノ酸未満、または1280アミノ酸未満(than less than)、または1270アミノ酸未満、または1260アミノ酸未満、または1250アミノ酸未満、または1240アミノ酸未満、または1230アミノ酸未満、または1220アミノ酸未満、または1210アミノ酸未満、または1200アミノ酸未満、または1190アミノ酸未満、または1180アミノ酸未満、または1170アミノ酸未満、または1160アミノ酸未満、または1150アミノ酸未満、または1140アミノ酸未満、または1130アミノ酸未満、または1120アミノ酸未満、または1110アミノ酸未満、または1100アミノ酸未満、または1050アミノ酸未満、または1000アミノ酸未満、または950アミノ酸未満、または900アミノ酸未満、または850アミノ酸未満、または800アミノ酸未満、または750アミノ酸未満、または700アミノ酸未満、または650アミノ酸未満、または600アミノ酸未満、または550アミノ酸未満、または500アミノ酸未満だが、少なくとも約400アミノ酸よりも大きく、かつCas9タンパク質の要求される機能を保持する、天然に存在するか、操作されたか、または別様のいずれかのCas9バリアントを言う。

1つの態様では、例20に図示されるとおり、本明細書は次の分裂インテインPE構築物を包摂する。これらは標準的なSpCas9(配列番号18)の残基1024および1025の間で分裂される(または、これらはMetマイナスの配列番号18に対して相対的に夫々残基1023および1024と言われ得る)。

第1に、配列番号18のアミノ酸配列は次のとおり示される。1024(「K」)および1025(「S」)残基の間の分裂部位の位置付けを指示している:

この構成において、N末端半分のアミノ酸配列(アミノ酸1～1024)は以下のとおりである:

この構成において、N末端半分のアミノ酸配列(アミノ酸1～1023)(ここでタンパク質は位置1にてMetマイナスである)は以下のとおりである:

この構成において、C末端半分のアミノ酸配列(アミノ酸1024～1368)(またはMetマイナスCas9中アミノ酸1023～1367として数えた)は以下のとおりである:

例20に示されているとおり、PE2(これは配列番号18のSpCas9に基づく)構築物を、次のとおり、(Metマイナス配列番号18に対して相対的に)位置1023/1024で2つの別個の構築物へと分裂した:

1023/1024のN末端半分でのSpPE2分裂

1023/1024のC末端半分でのSpPE2分裂

本開示は、分裂インテインプライム編集因子を細胞に送達および/または分裂インテインプライム編集因子によって細胞を処置する方法をもまた企図する。

いくつかの態様では、本開示はPE融合タンパク質を細胞に送達する方法を提供し:
(a)第1の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のN末端フラグメントをコードする第1の発現ベクターを構築すること;
(b)第2の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のC末端フラグメントをコードする第2の発現ベクターを構築すること;
(c)第1および第2の発現ベクターを細胞に送達すること、
を含み、
第1および第2の分裂インテイン配列の自己切除を引き起こすトランススプライシング活性の結果として、N末端およびC末端フラグメントは細胞内においてPE融合タンパク質として再構成される。

ある態様において、第1の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のN末端フラグメントは、配列番号3875、または配列番号3875との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列である。

他の態様において、第1の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のC末端フラグメントは、配列番号3876、または配列番号3876との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列である。

他の態様において、本開示は、細胞内の標的DNA配列を編集する方法を提供し:
(a)第1の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のN末端フラグメントをコードする第1の発現ベクターを構築すること;
(b)第2の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のC末端フラグメントをコードする第2の発現ベクターを構築すること;
(c)第1および第2の発現ベクターを細胞に送達すること、
を含み、
第1および第2の分裂インテイン配列の自己切除を引き起こすトランススプライシング活性の結果として、N末端およびC末端フラグメントは細胞内においてPE融合タンパク質として再構成される。

ある態様において、第1の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のN末端フラグメントは、配列番号3875、または配列番号3875との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列である。

他の態様において、第1の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のC末端フラグメントは、配列番号3876、または配列番号3876との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列である。
PEリボヌクレオタンパク質複合体の送達

この側面では、プライム編集因子は、エレクトロポレーションおよび脂質ナノ粒子を包含する種々の方法によって、PEgRNAと複合体化したプライム編集因子(すなわち、PEリボヌクレオタンパク質複合体)の送達が関わる非ウイルス的送達戦略によって送達され得る。核酸の非ウイルス的送達の方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、裸のDNA、人工ビリオン、およびDNAの薬剤によって増強された取り込みを包含する。リポフェクションは例えば米国特許第5,049,386号、第4,946,787号;および第4,897,355号に記載され、リポフェクション試薬は市販で販売されている(例えば、Transfectam(商標)およびLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションにとって好適であるカチオン性および中性脂質は、FeignerのWO91/17424;WO91/16024のものを包含する。送達は細胞(例えば、in vitroのまたはエクスビボの投与)または標的組織(例えばインビボの投与)にであり得る。

イムノ脂質複合体などの標的化リポソームを包含する脂質:核酸複合体の調製は当業者に周知である(例として、Crystal,Science 270:404-410(1995);Blaese et al.,Cancer Gene Ther.2:291-297(1995);Behr et al.,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994);Remy et al.,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994);Gao et al.,Gene Therapy 2:710-722(1995);Ahmad et al.,Cancer Res.52:4817-4820(1992);米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、および第4,946,787号を参照)。

リボヌクレオタンパク質複合体の非ウイルス的送達のためのアプローチを論ずる次の参照の追加の参照がなされ得る。これらの夫々は参照によって本願に組み込まれる。

Chen,Sean,et al.“Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.”Journal of Biological Chemistry(2016):jbc-M116.PubMed

Zuris,John A.,et al.“Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.”Nature biotechnology 33.1(2015):73.PubMed

Rouet,Romain,et al.“Receptor-Mediated Delivery of CRISPR-Cas9 Endonuclease for Cell-Type-Specific Gene Editing.”Journal of the American Chemical Society 140.21(2018):6596-6603.PubMed.

図68Cは、種々の開示されるPEリボヌクレオタンパク質複合体(高濃度のPE2、高濃度のPE3、および低濃度のPE3)がこの様式で送達され得るということを示すデータを提供する。
mRNAによるPEの送達

プライム編集に基づくゲノム編集が望まれる細胞に、プライム編集因子および/またはPEgRNAを送達するために使用され得る別の方法は、メッセンジャーRNA(mRNA)送達方法およびテクノロジーの使用を使用することによってである。本開示に利用され得るmRNA送達方法および組成物の例は、例えばPCT/US2014/028330、US8822663B2、NZ700688A、ES2740248T3、EP2755693A4、EP2755986A4、WO2014152940A1、EP3450553B1、BR112016030852A2、およびEP3362461A1を包含する。これらの夫々はそれらの全体が参照によって本願に組み込まれる。参照によってここに組み込まれる追加の開示はKowalski et al.,“Delivering the Messenger:Advances in Technologies for Therapeutic mRNA Delivery,”Mol Therap.,2019; 27(4):710-728に見出され得る。

プライム編集因子をコードするDNAベクターとは対照的に、プライム編集因子の送達物質としてのRNAの使用は、遺伝物質がその機能を果たすために核に入らなくてもよいという利点を有する。送達されたmRNAは細胞質において直接的に所望のタンパク質(例えば、プライム編集因子融合タンパク質)および核酸産物(例えばPEgRNA)へと翻訳され得る。しかしながら、より安定である(例えば、細胞質のRNA分解酵素に抵抗する)ためには、いくつかの態様では、送達効率を改善するためにmRNAを安定化することが必要である。ある種の送達担体、例えばカチオン性脂質またはポリマー性の送達担体は、トランスフェクションされたmRNAを内生RNase酵素から防護することをもまた助け得る。これらは、さもなければ、所望のプライム編集因子融合タンパク質をコードする治療学的なmRNAを分解し得る。加えて、修飾されたmRNAの増大した安定性にもかかわらず、治療学的レベルのタンパク質生産を許す様式でのインビボの細胞へのmRNA、特に全長タンパク質をコードするmRNAの送達は、課題のままに留まっている。

いくつかの例外はあるが、mRNAの細胞内送達は小さいオリゴヌクレオチドのものよりも一般的に難しく、それは送達ナノ粒子へのカプセル化を要求する。部分的には、他の型のRNA(低分子干渉RNA[siRNA]、～14kDa;アンチセンスオリゴヌクレオチド[ASO]、4～10kDa)と比較して、mRNA分子の有意に大きいサイズ(300～5,000kDa、～1～15kb)を原因とする。

mRNAは細胞質に達するためには細胞膜を横断しなければならない。細胞膜は細胞内送達への動的なかつ手強い関門である。それは主として双性イオン性のおよび負荷電のリン脂質の脂質二重層から作り上げられており、ここで、リン脂質の極性頭部は水性環境の方を向き、疎水性テールは疎水性コアを形成する。

いくつかの態様では、本開示のmRNA組成物は、mRNA(プライム編集因子および/またはPEgRNAをコードする)、輸送基剤、および任意に標的細胞との接触と爾後のトランスフェクションとを容易化する薬剤を含む。

いくつかの態様では、mRNAは、(例えば、mRNAの野生型のまたはネイティブなバージョンと比較して)mRNAに安定性を付与し、タンパク質の関連する異常な発現に関わる1つ以上の改変を包含し得る。欠陥を修正する野生型の1つ以上の改変もまた包含され得る。例えば、本発明の核酸は5'非翻訳領域または3'非翻訳領域の1つまたは両方の改変を包含し得る。かかる改変は、サイトメガロウイルス(CMV)最初期1(IE1)遺伝子、ポリAテール、キャップ1構造、またはヒト成長ホルモン(hGH)の部分配列をコードする配列の包含を包含し得る。いくつかの態様では、mRNAはmRNA免疫原性を縮減するように修飾される。

1つの態様では、本発明の組成物中の「プライム編集因子」mRNAは、標的細胞への送達を容易化するためにリポソーム移入基剤によって製剤され得る。企図される移入基剤は、1つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および/またはPEG修飾脂質を包含し得る。例えば、移入基剤は次のカチオン性脂質の少なくとも1つを包含し得る:C12-200、DLin-KC2-DMA、DODAP、HGT4003、ICE、HGT5000、またはHGT5001。態様では、移入基剤はコレステロール(chol)および/またはPEG修飾脂質を含む。いくつかの態様では、移入基剤はDMG-PEG2Kを含む。ある態様において、移入基剤は次の脂質製剤を有する:C12-200、DOPE、chol、DMG-PEG2K;DODAP、DOPE、コレステロール、DMG-PEG2K;HGT5000、DOPE、chol、DMG-PEG2K、HGT5001、DOPE、chol、DMG-PEG2Kの1つ。

本開示は、1つ以上のPEをコードするmRNA分子による標的細胞のトランスフェクションを容易化することにとって有用な組成物および方法をもまた提供する。例えば、本発明の組成物および方法は、1つ以上の標的細胞に対する組成物の親和性を増大させ得る標的化リガンドの使用を企図する。1つの態様では、標的化リガンドはアポリポタンパク質Bまたはアポリポタンパク質Eであり、対応する標的細胞は低密度リポタンパク質受容体を発現し、それゆえに標的化リガンドの認識を促進する。膨大な数の標的細胞が本開示の方法および組成物を用いて選好的に標的化され得る。例えば、企図される標的細胞は、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉系細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋包含(Includes)細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜表層細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、B細胞、T細胞、網赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞を包含する。しかしながら、それはこれらに限定されない。

いくつかの態様では、PEをコードするmRNAは、任意に、例えばかかるmRNAの安定性および/もしくは半減期を改善するかまたはタンパク質生産を改善もしくは別様に容易化する化学的または生物学的修飾を有し得る。トランスフェクションによって、本発明の組成物中の天然のmRNAは30分および何日かの間の半減期で崩壊し得る。本開示の組成物中のmRNAは翻訳される少なくともいくらかの能力を保持し得、それによって機能的なタンパク質または酵素を生ずる。従って、本発明は、安定化されたmRNAを含む組成物およびそれを投与する方法を提供する。いくつかの態様では、mRNAの活性は伸長された期間に渡って遷延する。例えば、本開示の組成物が半週毎もしくは隔週毎の基準で、またはより好ましくは毎月、隔月毎、四半期毎、もしくは毎年の基準で対象に投与されるようにして、mRNAの活性は遷延し得る。本発明のmRNAの伸長または遷延した活性は、かかるmRNAから生ずるタンパク質または酵素の数量に直接的に関係する。類似に、本開示の組成物の活性は、mRNAの翻訳を改善または増強するためになされる改変によってさらに伸長または遷延し得る。さらにその上、標的細胞によって生ずる機能的なタンパク質または酵素の数量は、標的細胞に送達されるmRNAの数量およびかかるmRNAの安定性の関数である。本発明のmRNAの安定性が改善または増強され得る程度に合わせて、半減期、生ずるタンパク質または酵素の活性、および組成物の投薬頻度はさらに伸長され得る。

従って、いくつかの態様では、本開示の組成物中のmRNAは、例えばインビボのヌクレアーゼ消化に対する改善された耐性を包含する増大または増強された安定性を核酸に付与する少なくとも1つの改変を含む。本願において用いられる用語「改変」および「改変される」は、かかる用語が本願において提供される核酸に関すると、好ましくは安定性を増強し、mRNAの野生型または天然に存在するバージョンよりもmRNAを安定に(例えば、ヌクレアーゼ消化に対して耐性に)する少なくとも1つの変改を包含する。本願において用いられる用語「安定」および「安定性」は、かかる用語が特にmRNAについて本発明の核酸に関すると、例えば正常ではかかるmRNAを分解することができるヌクレアーゼ(すなわち、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ)による分解に対する増大または増強した耐性を言う。増大した安定性は、例えば、標的細胞または組織内の内生酵素(例えば、エンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ)または条件による加水分解または他の破壊に対するより少ない感度を包含し得、それによって、標的細胞、組織、対象、および/または細胞質におけるかかるmRNAの滞留を増大または増強する。本願において提供される安定化されたmRNA分子は、それらの天然に存在する未改変のカウンターパート(例えば、mRNAの野生型バージョン)に対して相対的に、長い半減期を実証する。また、かかる用語が本発明のmRNAに関係すると、用語「改変」および「改変される」によって、mRNA核酸の翻訳を改善または増強する変改が企図される。例えば、タンパク質翻訳の開始に機能する配列(例えば、Kozakコンセンサス配列)の包含を包含する。(Kozak,M.,Nucleic Acids Res 15(20):8125-48(1987))。

いくつかの態様では、本開示の組成物に用いられるmRNAは、それらをより安定にするための化学的または生物学的修飾を経過している。mRNAの例示の修飾は、塩基の枯渇(例えば、1つのヌクレオチドの欠失もしくは別のものへの置換による)または塩基の修飾、例えば塩基の化学修飾を包含する。本願において用いられる言い回し「化学修飾」は、天然に存在するmRNAに見られるものとは異なるケミストリーを導入する修飾、例えば共有結合的修飾、例えば修飾ヌクレオチドの導入(例えば、ヌクレオチドアナログ、またはかかるmRNA分子に天然には見出されないペンダント基の包含)を包含する。

本開示の組成物に用いられるPEをコードするmRNAに組み込まれ得る他の好適なポリヌクレオチド修飾は、4'-チオ修飾塩基:4'-チオアデノシン、4'-チオグアノシン、4'-チオシチジン、4'-チオウリジン、4'-チオ-5-メチル-シチジン、4'-チオシュードウリジン、および4'-チオ2-チオウリジン、ピリジン-4-オンリボヌクレオシド、5-アザ-ウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオウリジン、4-チオシュードウリジン、2-チオシュードウリジン、5-ヒドロキシウリジン、3-メチルウリジン、5-カルボキシメチル-ウリジン、1-カルボキシメチル-シュードウリジン、5-プロピニルウリジン、1-プロピニルシュードウリジン、5-タウリノメチルウリジン、1-タウリノメチル-シュードウリジン、5-タウリノメチル-2-チオウリジン、1-タウリノメチル-4-チオウリジン、5-メチル-ウリジン、1-メチル-シュードウリジン、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、2-チオジヒドロウリジン、2-チオジヒドロシュードウリジン、2-メトキシウリジン、2-メトキシ-4-チオウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオシュードウリジン、5-アザ-シチジン、シュードイソシチジン、3-メチル-シチジン、N4-アセチルシチジン、5-ホルミルシチジン、N4-メチルシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、1-メチル-シュードイソシチジン、ピロロ-シチジン、ピロロ-シュードイソシチジン、2-チオシチジン、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-チオシュードイソシチジン、4-チオ-1-メチル-シュードイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン、1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン、ゼブラリン、5-アザ-ゼブラリン、5-メチルゼブラリン、5-アザ-2-チオゼブラリン、2-チオゼブラリン、2-メトキシ-シチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、4-メトキシ-シュードイソシチジン、4-メトキシ-1-メチル-シュードイソシチジン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-アデニン、7-デアザ-8-アザ-アデニン、7-デアザ-2-アミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノプリン、7-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、1-メチルアデノシン、N6-メチルアデノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6-グリシニルカルバモイルアデノシン、N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、2-メチルチオ-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6-ジメチルアデノシン、7-メチルアデニン、2-メチルチオアデニン、および2-メトキシ-アデニン、イノシン、1-メチル-イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7-デアザ-グアノシン、7-デアザ-8-アザ-グアノシン、6-チオグアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-グアノシン、6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-メチルイノシン、6-メトキシ-グアノシン、1-メチルグアノシン、sN2-メチルグアノシン、N2,N2-ジメチルグアノシン、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、1-メチル-6-チオグアノシン、N2-メチル-6-チオグアノシン、およびN2,N2-ジメチル-6-チオグアノシン、ならびにそれらの組み合わせを包含するが、これらに限定されない。用語修飾は、例えば、本発明のmRNA配列上への非ヌクレオチド連結部または修飾ヌクレオチドの組み込みをもまた包含する(例えば、機能的なタンパク質または酵素をコードするmRNA分子の3'および5'端の1つまたは両方の修飾)。かかる修飾は、mRNA配列への塩基の追加(例えば、ポリAテールまたはより長いポリAテールの包含)、3'UTRまたは5'UTRの変改、mRNAを薬剤(例えば、タンパク質または相補的な核酸分子)と複合体化すること、mRNA分子の構造を変化させるエレメント(例えば、これは二次構造を形成する)の包含を包含する。

いくつかの態様では、PEをコードするmRNAは5'キャップ構造を包含する。5'キャップは典型的には次のとおり追加される:第1に、RNA末端ホスファターゼが末端リン酸基の1つを5'ヌクレオチドから除去し、2つの末端リン酸を残す;それから、グアノシン三リン酸(GTP)がグアニリルトランスフェラーゼによって末端リン酸に追加され、5'5'5三リン酸連結部を生ずる;それから、グアニンの7-窒素がメチルトランスフェラーゼによってメチル化される。キャップ構造の例は、m7G(5')ppp(5'(A、G(5')ppp(5')A、およびG(5')ppp(5')Gを包含するが、これらに限定されない。天然に存在するキャップ構造は、三リン酸ブリッジを介して最初に転写されるヌクレオチドの5'端に連結されている7-メチルグアノシンを含み、m7G(5')ppp(5')Nのジヌクレオチドキャップをもたらし、Nはいずれかのヌクレオシドである。インビボでは、キャップは酵素的に追加される。キャップは核内で追加され、酵素グアニリルトランスフェラーゼによって触媒される。RNAの5'末端の端へのキャップの追加は転写の開始後に直ちに生起する。末端ヌクレオシドは典型的にはグアノシンであり、全ての他のヌクレオチドとは逆向き、すなわちG(5')ppp(5')GpNpNpである。

追加のキャップアナログは、m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC;非メチル化キャップアナログ(例えばGpppG);ジメチル化キャップアナログ(例えばm2,7GpppG)、トリメチル化キャップアナログ(例えば、m2,2,7GpppG)、ジメチル化対称キャップアナログ(例えば、m7Gpppm7G)、またはアンチリバースキャップアナログ(例えば、ARCA;m7,2'OmeGpppG、m72'dGpppG、m7,3'OmeGpppG、m7,3'dGpppG、およびそれらの四リン酸誘導体)からなる群から選択される化学構造を包含するが、これらに限定されない(例えば、Jemielity,J.et al.,“Novel 'anti-reverse'cap analogs with superior translational properties”,RNA,9:1108-1122(2003)を見よ)。

典型的には、「テール」の存在はエキソヌクレアーゼ分解からmRNAを防護するための用をなす。ポリAまたはポリUテールは天然のメッセンジャーおよび合成センスRNAを安定化すると考えられる。よって、ある態様において、長いポリAまたはポリUテールがmRNA分子に追加され得、それゆえにRNAをより安定にする。ポリAまたはポリUテールは種々の当該技術分野で認識される技術を用いて追加され得る。例えば、長いポリAテールは、ポリAポリメラーゼを用いて合成のまたはin vitro転写されたRNAに追加され得る(Yokoe,et al.Nature Biotechnology.1996;14:1252-1256)。転写ベクターもまた長いポリAテールをコードし得る。加えて、ポリAテールは直接的にPCR産物からの転写によって追加され得る。ポリAはRNAリガーゼによってもまたセンスRNAの3’端にライゲーションされ得る(例えば、Sambrook、FritschおよびManiatisによるMolecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.,ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1991 edition)を見よ)。

典型的には、ポリAまたはポリUテールの長さは少なくとも約10、50、100、200、300、400、少なくとも500ヌクレオチドであり得る。いくつかの態様では、mRNAの3'末端のポリAテールは典型的には約10から300アデノシンヌクレオチドを包含する(例えば、約10から200アデノシンヌクレオチド、約10から150アデノシンヌクレオチド、約10から100アデノシンヌクレオチド、約20から70アデノシンヌクレオチド、または約20から60アデノシンヌクレオチド)。いくつかの態様では、mRNAは3'ポリCテール構造を包含する。mRNAの3'末端の好適なポリCテールは典型的には約10から200シトシンヌクレオチドを包含する(例えば、約10から150シトシンヌクレオチド、約10から100シトシンヌクレオチド、約20から70シトシンヌクレオチド、約20から60シトシンヌクレオチド、または約10から40シトシンヌクレオチド)。ポリCテールはポリAまたはポリUテールに追加され得るか、あるいはポリAまたはポリUテールを置換し得る。

本開示に従うPEをコードするmRNAは種々の公知の方法のいずれかに従って合成され得る。例えば、本発明に従うmRNAはin vitro転写(IVT)によって合成され得る。手短かには、IVTは、典型的には、プロモーターを含有する直線状または環状DNA鋳型、リボヌクレオチド三リン酸のプール、DTTおよびマグネシウムイオンを包含し得る緩衝液系、ならびに適当なRNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7、またはSP6 RNAポリメラーゼ)、DNAse I、ピロホスファターゼ、および/またはRNAse阻害剤によって行われる。厳密な条件は特定の適用に従って変わるであろう。

mRNA送達が関わる態様では、PE融合タンパク質をコードするmRNA対PEgRNAの比は効率的な編集にとって重要であり得る。ある態様において、mRNA(PE融合タンパク質をコードする)対PEgRNAの重量比は1:1である。ある種の他の態様において、mRNA(PE融合タンパク質をコードする)対PEgRNAの重量比は2:1である。なお他の態様において、mRNA(PE融合タンパク質をコードする)対PEgRNAの重量比は1:2である。なおさらなる態様では、mRNA(PE融合タンパク質をコードする)対PEgRNAの重量比は、約1:1000、1:900;1:800;1:700;1:600;1:500;1:400;1:300;1:200;1:100;1:90;1:80;1:70;1:60;1:50;1:40;1:30;1:20;1:10;および1:1からなる群から選択される。他の態様において、mRNA(PE融合タンパク質をコードする)対PEgRNAの重量比は、約1:1000、1:900;800:1;700:1;600:1;500:1;400:1;300:1;200:1;100:1;90:1;80:1;70:1;60:1;50:1;40:1;30:1;20:1;10:1;および1:1からなる群から選択される。

J．バイアスがない様式でオフターゲット編集を同定するためのプライム編集の使用
他のゲノム編集因子のように、PEはそのプログラムされた遺伝子変改をゲノム上の意図されない部位、すなわち「オフターゲット」部位において導入し得るといういくらかのリスクが存在する。しかしながら、現行では、プライム編集因子によるオフターゲット編集を検出するための記載されている方法はない。かかる方法は、プライム編集因子を用いるオフターゲット編集の可能性ある部位の同定を許すであろう。

この側面の鍵の概念は、プライム編集を用いて、同じPEgRNAを鋳型として、オンターゲットおよびオフターゲット部位において同じアダプター配列および/またはプライマー結合部位を挿入して、napDNAbpヌクレアーゼまたはプライム編集因子のゲノムオフターゲット改変部位の急速な同定を可能化するという発想である。アダプターおよび/またはプライマー結合配列がnapDNAbpによるDNA結合およびニッキングと同じイベントにおいて挿入され、下流プロセシングを単純化するので、この方法はヌクレアーゼオフターゲット部位を同定する他の技術から見分けられる。

図33はオフターゲット同定の基本的原理を例解する。図は、プライマー結合配列挿入のためのPEgRNAデザインと、オフターゲット編集を決定するためのプライム編集を用いるゲノムDNA上へのプライマー結合挿入とを示す模式図である。この態様では、プライム編集が生細胞、組織、または動物モデル内において行われる。第1のステップとして、適当なPEgRNAがデザインされる。上側の模式図は、この側面に用いられ得る例示のPEgRNAを示す。PEgRNA上のスペーサー(「プロトスペーサー」と標識されている)はゲノム標的の鎖の1つに対して相補的である。PE:PEgRNA複合体(すなわちPE複合体)は一本鎖3'端フラップをニック部位に組み入れし、これは、コードされるプライマー結合配列と、カットされる部位のちょうど下流の領域に対して相補的である相同領域(PEgRNAの相同アームによってコードされる)とを含有する(赤色による)。フラップ侵入およびDNA修復/複製プロセスによって、合成された鎖はDNA上に組み込まれるようになり、それによってプライマー結合部位を組み入れる。このプロセスは、所望のゲノム標的において生起し得るが、オフターゲットの様式でPEgRNAと相互作用し得る他のゲノム部位においてもまた生起し得る(すなわち、意図されるゲノム部位ではない他のゲノム部位に対するスペーサー領域の相補性を原因として、PEgRNAはPE複合体を他のオフターゲット部位へとガイドする)。それゆえに、プライマー結合配列は、所望のゲノム標的においてのみならず、ゲノム上の他所のオフターゲットゲノム部位において組み入れられ得る。意図されるゲノム標的部位およびオフターゲットゲノム部位両方におけるこれらのプライマー結合部位の挿入を検出するためには、ゲノムDNA(PE後)が単離、フラグメント化、およびアダプターヌクレオチドにライゲーションされ得る(赤色で示されている)。次に、アダプターおよび挿入されたプライマー結合配列にアニールするPCRオリゴヌクレオチドによって、PCRが実行されて、プライマー結合部位がPEによって挿入されたオンターゲットおよびオフターゲットゲノムDNA領域を増幅し得る。それから、高スループット配列決定および配列アラインメントが行われて、オンターゲット部位またはオフターゲット部位どちらかにおけるPEによって挿入されたプライマー結合配列の挿入点を同定し得る。

それゆえに、図33は、生細胞内、組織培養、または動物モデルにおいて編集するときのオフターゲット編集部位の同定についての1つの側面を例解する。この方法を行うためには、最終的な所望のプライム編集因子と同一のスペーサー(そして、プライム編集オフターゲットを検査する場合には、最終的な所望の編集因子と同一のプライマー結合部位配列)を有するが、プライム編集による逆転写後にアダプターまたはプライマー結合部位を組み入れるための必要な配列を包含するPEgRNAが生成される。プライム編集因子またはRTに融合したヌクレアーゼを用いるインビボ編集が行われ、ゲノムDNAを単離する。ゲノムDNAは酵素的なまたは機械的な手段によってフラグメント化され、DNAフラグメント化の部位に異なるアダプターを付加する。1つのアダプターからPEgRNAによって組み入れされたアダプターまでを増幅するためのPCRが用いられる。もたらされた産物はディープ配列決定されて、全ての改変された部位を同定する。

別の側面において、PEによるオフターゲット編集の評価がin vitroで行われ得る。この側面では、ゲノムDNAのin vitro改変を用いるオフターゲット編集部位のゲノムDNA同定のin vitro改変の間に、PEが用いられる。この方法を行うためには、精製されたプライム編集因子融合タンパク質およびPEgRNAのリボヌクレオタンパク質(RNP)(すなわちPE複合体)がアセンブリされる。これは、アダプターまたはプライマー結合配列を標的部位において組み入れるように構成されるが、さもなければ目当てのPEgRNAと同じである。このRNP(すなわち、PE複合体)がDNAのフラグメント化前または後に抽出されたゲノムDNAとインキュベーションされる。フラグメント化後に、異なるアダプター配列がフラグメントDNAの端にライゲーションされる。挿入されたアダプター配列(すなわち、EPによって挿入された)とフラグメントの端にライゲーションされたアダプターとにまたがるゲノム部位を増幅するためのPCRが用いられる。アダプター配列間の高スループット配列決定は、オンターゲットおよびオフターゲットである改変のゲノム部位を同定し得る。細胞性のDNA修復は、プライム編集因子によって追加された逆転写されたDNAアダプターを消去しないであろうので、このin vitro編集法は、検出の感度を増強するはずである。

これらの方法は、いずれかのプライム編集因子、または標的のカットされる部位を認識するためにガイドRNAを用いるいずれかのゲノム編集因子(ほとんどのCasヌクレアーゼ)について、オフターゲット編集を同定するために用いられ得る。

これらの方法は、ゲノム編集因子が処置への使用を考慮される全ての遺伝子疾患に適用され得る。

PEによって組み入れられ得る例示のアダプターおよび/またはプライマー結合配列は:

を包含するが、これらに限定されない。

これらのアダプターおよび/またはプライマー結合配列もまた、上で概説されているとおりゲノムDNAフラグメント化後のライゲーションステップに用いられ得る。

オフターゲット編集を評価するための本明細書に記載の方法の使用を例解する例示のPEgRNAデザインと、それらの編集標的座位とは、次のとおりである:

K．誘導可能な二量体化ドメインの挿入のためのプライム編集の使用
本明細書に記載のプライム編集因子は、二量体化ドメインを1つ以上のタンパク質標的に組み入れるためにもまた用いられ得る。二量体化ドメインは、二重特異的な様式で結合する連結部分(例えば、低分子、ペプチド、またはタンパク質)を介する1つ以上のタンパク質標的の二量体化に関連する活性の誘導可能な制御を容易化し得る。種々の側面では、二量体化ドメインは、異なるタンパク質(例えば、同じ型または異なるタンパク質)上に組み入れされるときに、夫々が同じ二重特異性部分(例えば、別個に二量体化ドメインに結合する少なくとも(a least)2つの領域を有する二重特異性低分子、ペプチド、またはポリペプチド)に結合し、それによって、二重特異性リガンドに対するそれらの共通の相互作用によってタンパク質の二量体化を引き起こす。この様式で、二重特異性リガンドは2つのタンパク質の二量体化の「誘導因子」として機能する。いくつかのケースでは、二重特異性リガンドまたは化合物は、同じである2つの標的化部分を有するであろう。他の態様において、二重特異性リガンドまたは化合物は夫々が他とは異なる標的化部分を有するであろう。同じ2つの標的化部分を有する二重特異性リガンドまたは化合物は、異なるタンパク質標的上に組み入れされた同じ二量体化ドメインを標的化する能力があるであろう。異なる標的化部分を有する二重特異性リガンドまたは化合物は、異なるタンパク質標的上に組み入れされた異なる二量体化ドメインを標的化する能力があるであろう。

本願において用いられる用語「二量体化ドメイン」は、二重特異性リガンドの結合部分に結合するリガンド結合ドメインを言う。「第1の」二量体化ドメインは二重特異性リガンドの第1の結合部分に結合し、「第2の」二量体化ドメインは同じ二重特異性リガンドの第2の結合部分に結合する。第1の二量体化ドメインが第1のタンパク質に融合され(例えば、本願において論じられるとおりPEによる)、かつ第2の二量体化ドメイン(例えば、本願において論じられるとおりPEによる)が第2のタンパク質に融合されるときには、第1および第2のタンパク質は二重特異性リガンドの存在下において二量体化し、二重特異性リガンドは、第1の二量体化ドメインに結合する少なくとも1つの部分と第2の二量体化ドメインに結合する少なくとも別の部分とを有する。

本願において用いられる用語「二重特異性リガンド」または「二重特異性部分」は、2つの異なるリガンド結合ドメインに結合するリガンドを言う。種々の態様においては、二重特異性部分はそれ自体が2つの同じまたは2つの異なる化学的部分の二量体であり、各部分は二量体化ドメインに特異的にかつきつく結合する。ある態様において、リガンドは低分子化合物またはペプチドまたはポリペプチドである。他の態様において、リガンド結合ドメインはペプチドタグとしてタンパク質上に組み入れられ得る「二量体化ドメイン」である。種々の態様においては、同じかまたは異なる二量体化ドメインを夫々が含む2つのタンパク質が、二重特異性リガンドに対する各二量体化ドメインの結合によって二量体化するように誘導され得る。それらの分子は「二量体化の化学的誘導因子」またはCIDともまた言われ得る。加えて、二重特異性リガンドは、(例えば、標準化された化学的連結部によって)2つの同じ部分を一緒にまたは2つの異なる部分を一緒にカップリングすることによって調製され得、各部分は二量体化ドメインにきつくかつ特異的に結合する。

種々の側面では、PEによって組み入れされる二量体化ドメイン同士は同じかまたは異なり得る。

例えば、二量体化ドメインはFKBP12であり得る。これは次のアミノ酸配列を有する:

別の例では、二量体化ドメインは、FKBP12-F36Vと言われるFKBP12の変異体、合成バンプFK506ミミックに結合する操作された穴を有するFKBP12の変異体であり得る(2、図3)¹⁰⁷:

別の例では、二量体化ドメインは次のとおりシクロフィリンであり得る:

種々の態様において、これらの二量体化ドメインのアミノ酸配列は、ネイティブな標的に対する結合を最適化するかまたは結合直交性を改善するために変改され得る。低分子結合タンパク質をコードする遺伝子の核酸配列は、例えばPEgRNA二次構造を縮減することによってPEプロセスの効率を最適化するために変改され得る。

好適な二量体化ドメインおよびそれに結合する対応する低分子化合物の他の例は次のとおり提供される。2つの二量体化ドメインに結合し得る二重特異性リガンドを形成するためには、対応する低分子化合物は第2の低分子化合物(同じ化合物または異なる化合物どちらか)に(例えば、化学的リンカーによって)カップリングされ得るということに注意せよ。FK506およびシクロスポリンAなどのいくつかのケースでは、夫々の二量体化(例えば、FK506-FK506またはシクロスポリンA-シクロスポリンA)はモノマー化合物の免疫抑制活性を縮減または消去する。

天然に存在する二機能性分子およびそれらの二元的な標的受容体の他の例は次のとおりである。プライム編集は、二元的な標的受容体を異なるタンパク質に組み入れるために用いられ得る。ひとたび異なるタンパク質が二機能性分子受容体を含有するようにPEによって改変されると、二機能性分子は導入され得、それによって、異なる二量体化ドメインを含むように改変されたタンパク質の二量体化を引き起こす。(1)二機能性(biofunctional)分子および(2)それらの二元的な標的受容体のペアリングの例は次のとおりである:

プライム編集のこの側面で使用され得る他の二機能性分子の例は以下のとおりである:

Synstab A:

パクリタキセル:

ディスコデルモリド:

GNE-0011

ARV-825、および

dBET1

。

Synstab A、パクリテキセル、およびディスコデルモライドは微小管安定化剤である。それゆえに、これらの化合物は、微小管タンパク質を含むようにPEによって改変されたタンパク質同士を二量体化するために用いられ得る。GNE-0011、ARV-825、およびdBET1はBRD4結合モチーフおよびCRBN結合モチーフを含む。それゆえに、これらの化合物は、これらの標的化ドメインを含むようにPEによって改変されたタンパク質同士を二量体化するために用いられ得る。

二量体化ドメインを組み入れるためのPEgRNAは次の構造を含み得る(図3Dの参照による):
5'-[スペーサー]-[gRNAコア]-[伸長アーム]-3'であって、伸長アームは5'-[相同アーム]-[編集鋳型]-[プライマー結合部位]-3'を含む;または
5'-[伸長アーム]-[スペーサー]-[gRNAコア]-3'であって、伸長アームは5'-[相同アーム]-[編集鋳型]-[プライマー結合部位]-3'を含み、どちらの構成でも「編集鋳型」は二量体化ドメインのヌクレオチド配列を含む。

1つの例では、ヒトインスリン受容体のC末端の端におけるFKBP12二量体化ドメインの挿入のためのPEgRNA(スペーサーは下線付き、gRNAコアはプレーン、フラップ相同性は太字、FKBP12挿入はイタリック、アニーリング領域は太字イタリック):

別の例では、(最適化のための)HEK3座位におけるFKBP12二量体化ドメインの挿入のためのPEgRNA:

二量体化ドメインを組み入れるための標的タンパク質は特に限定されない;しかしながら、二重特異性リガンドの存在下におけるそれらの二量体化は(ひとたびPEによって改変されると)、何らかの有利な生物学的効果、例えばシグナル経路、減少した免疫応答性などを生ずるということが有利である。種々の側面では、二量体化ドメインのPE依存的組み入れによって二量体化させられるべきである標的タンパク質同士は、同じタンパク質または異なるタンパク質であり得る。好ましくは、タンパク質は、二量体化したときには、1つ以上の下流の生物学的カスケード、例えばシグナル伝達カスケード、リン酸化などを誘発する。PEが二量体化ドメインを組み入れるために用いられ得る例示の標的タンパク質は:

を包含するが、これらに限定されない。

一側面において、本明細書に記載のプライム編集因子は、生細胞または患者の目当ての標的タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子上に、二量体化ドメインをコードする配列を組み入れるために用いられ得る。これは「プライム編集-CIDシステム」と言われ得、CIDは二重特異性リガンドであり、これは、PEによって組み入れされる二量体化ドメインに夫々が融合された標的タンパク質の二量体化を誘導した。この編集は単独では生理学的効果を有さないはずである。典型的には夫々が標的タンパク質のコピーに融合されている2つの二量体化ドメインに同時に結合し得る二量体低分子である二重特異性リガンドの投与によって、二重特異性リガンドは標的タンパク質の二量体化を引き起こす。それから、この標的タンパク質二量体化イベントは、生物学的シグナルイベント、例えば赤血球形成またはインスリンシグナルを誘導する。プライム編集による低分子結合タンパク質(すなわち、二量体化ドメイン)をコードする遺伝子のゲノム取り入れによって、二量体化によって誘導される生物学的プロセス、例えば受容体シグナルを便利な低分子薬物(すなわち、二重特異性リガンド)のコントロール下に置くための新たな方法が、本明細書に記載の。

タンパク質二量体化はユビキタスな生物学的プロセスである。注意すべきことに、多くの膜結合受容体のホモ二量体化はシグナルカスケードを開始することが知られており、多くの場合に深大な生物学的帰結を有する。薬物としての使用を認可されたいくつもの天然低分子産物は、それらの作用機序の一部としてタンパク質二量体化の化学的誘導因子として作用する⁹²。例えば、FK506はFKBP12にきつく結合し、もたらされる低分子-タンパク質複合体はそれからホスファターゼカルシニューリンに結合し、それによってT細胞受容体シグナルのあるステップを阻害する⁹³。同様に、シクロスポリンAはシクロフィリンおよびカルシニューリンの二量体化を誘導し、ラパマイシンはFKBPおよびmTORの二量体化を誘導する^93,94。

1つの態様では、FK506:FKBP12およびシクロスポリンA:シクロフィリン低分子:タンパク質結合相互作用の選択的な高親和性の結合を活用して、二量体化の合成の化学的誘導因子もまた開発されている。ある例では、シグナル受容体の細胞質ドメインがFKBP12によってタグ付けされたときに、FK1012と呼称されるFK506の2つの単位からなる低分子がシグナル伝達を成し遂げることが示された⁹⁵。以来、二量体化の化学的誘導因子(CID)がいくつものシグナル経路をコントロールするために用いられている^96～103。

生物学的プロセスを研究するための有用なツールではあるが、治療学的適用について合成CIDに当面する1つの課題は、患者へのFKBP12またはシクロフィリン-標的タンパク質キメラの導入が難しいということである。

本開示は2つの概念を一緒に持って来て、先にはアクセス不可能な治療学的プロセスを生出する。第1の概念は、本明細書に記載のプライム編集であり、これは生細胞における標的化された挿入を包含する精密なゲノム編集を許す。第2の概念は化学物質によって誘導される二量体化であり、細胞培養物におけるシグナルおよびオリゴマー化プロセスの低分子コントロールを可能化した強力なツールである。

タンパク質二量体化の化学的コントロールが有益な治療学的効果を有し得た特定のケースが同定されている。

インスリン受容体は、細胞質キナーゼドメインのリン酸化によって細胞外ドメインへのインスリン結合に応答するヘテロ四量体膜貫通タンパク質である¹⁰⁴。膜局在構成要素、インスリン受容体のC末端キナーゼドメイン、および3コピーのFKBP12から成る操作されたキメラタンパク質は、細胞培養物においてFK1012に応答し、インスリン応答を開始する99。類似に、患者細胞のネイティブなインスリン受容体のキナーゼドメインのC末端の端へのFKBP12の融合は、FK1012依存的なリン酸化とインスリンシグナルカスケードの開始とを許すはずであるということが予想される。このシステムは、インスリンを作り得ない(例えば1型糖尿病)または弱くインスリンに応答する(例えば2型糖尿病)患者において、インスリン使用を置き換えるかまたは補完し得る。

加えて、エリスロポエチンは、エリスロポエチン受容体(EpoR)に結合することによって赤血球増殖を刺激し、二量体化または予め形成された受容体二量体の立体配座変化どちらかを誘導し、これはJak/STATシグナルカスケードの活性化をもたらす¹⁰⁵。FKBP12によってタグ付けされたEpoRの膜にアンカー固定される細胞質ドメインのFK1012によって誘導されるオリゴマー化は、Jak/STATシグナルカスケードシグナルを開始および細胞増殖を促進するために十分であるということが実証されている¹⁰⁶。患者細胞においてプライム編集によってFKBP12をネイティブなEpoRに融合することは、赤血球増殖(赤血球形成)のFK1012によって誘導されるコントロールを許すであろうということが予期される。このシステムは貧血患者において赤血球成長を誘発するために用いられ得る。FK1012誘導性のEpoRは、エクスビボ操作を経過した血液細胞のインビボの選択マーカーとしてもまた使用され得る。

原理的には、いずれかの受容体チロシンキナーゼはプライム編集-CID治療学の見込みある標的である。下の表は、ヒトゲノム上の全ての受容体チロシンキナーゼのリストを包含する¹¹⁰。

プライム編集-CIDシステムには数々の利点がある。1つのかかる利点は、それが、典型的には製造、コスト、送達、生産、または貯蔵において複雑化を呈するタンパク質である内生リガンドを薬物様低分子によって置き換え得るということである。これらはIVまたは注射によって投与される代わりに経口投与され得、FDA認可された薬物から難なく調製され(またはそれら自体がすでに薬物である)、タンパク質薬物に典型的に関連する特殊な生産または貯蔵コストを招かない。別の利点は、編集が単独では生理学的効果を有さないはずであるということである。標的タンパク質二量体化の量は低分子CIDを投薬することによってコントロールされ得る。さらに、標的タンパク質二量体化は、CIDのモノマー形態を追加することによって難なくかつ急速に可逆的である。さらに別の利点は、単一のリガンドが複数の受容体を標的化する場合に、1つの受容体のみをプライム編集することによって選択性が達成され得るということである。最後に、プライム編集に用いられる送達方法に依存して、局在した組織または臓器に編集を制限することもまた可能であり得、特定のエリアのみにおいて誘導可能な受容体活性化を許す。

プライム編集による編集効率が十分高く、2つの別個の編集イベントが高いレベルで生起し得る場合には、目当ての2つのタンパク質を異なる低分子結合ドメイン(例えばFKBPおよびシクロフィリン)によってタグ付けし、低分子ヘテロ二量体(例えばFK506-シクロスポリンA二量体)によるヘテロ二量体化を誘導することもまた可能であろう。

ネイティブなタンパク質へのFKBP12または他の低分子結合タンパク質の融合体は、一般的には、組織培養によるプラスミドからの過剰発現によって達成されている。爾後の化学物質によって誘導される二量体化は、融合タンパク質を生ずる細胞に表現型変化を誘導することが実証されている。

以下の参考文献がセクションGにおいて上で引用され、参照により本明細書に組み込まれる。

L．細胞データ記録のためのプライム編集の使用
プライム編集因子およびもたらされるゲノム改変は、細胞性のプロセスおよび発生を研究および記録するためにもまた用いられ得る。例えば、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を有する融合タンパク質をコードする第1の核酸配列を細胞に提供することと、PEgRNAをコードする少なくとも第2の核酸配列を細胞に提供することとによって、本明細書に記載のプライム編集因子は、細胞への刺激の存在および持続時間を記録するために用いられ得る。第1の、第2の、または両方の核酸配列どちらかは、細胞刺激に応答性である誘導性プロモーターに作動可能に連結され、その結果、それは融合タンパク質および/またはPEgRNAの発現を誘導し、それによって細胞内の標的配列の改変を引き起こす。

本明細書に記載のプライム編集因子は細胞バーコード化および系統トレースにもまた用いられ得る。例えば、固有のゲノムバーコードによって各細胞をバーコード化することによって、プライム編集因子は、1つ以上の標的配列になされる改変に基づく系統樹の構築を許すことによって、細胞系統マップを明らかにすることを助け得る。前駆細胞から出発して、プライム編集因子システムは、丸ごとの生物中の単一細胞について細胞運命マップを築くことを可能化し得る。これは、1つ以上の標的配列になされた改変を分析することによって読み解かれ得る。細胞の系統(linage)をトレースするための方法は、napDNAbpおよび逆転写酵素による融合タンパク質をコードする核酸を提供することと、PEgRNAをコードする少なくとも1つの第2の核酸を提供することとを包含し得る。1つ以上の標的配列に1つ以上の改変を生出するために融合タンパク質およびPEgRNAを用いて固有の細胞バーコードが生成され得、それによって、最初の細胞から発生するいずれかの細胞の系統(linage)が固有の細胞バーコードを用いてトレースされることを許す。細胞データ記録および系統(linage)トレース両方のためのプライム編集因子の使用は例13においてさらに記載される。

プライム編集因子は、ゲノム標的配列または取り入れされた予めデザインされた配列を改変することによって、系統トレースおよび細胞シグナル記録両方を行い得る。プライム編集因子は、Cas9ニッカーゼフラグメント(SpCas9 H840Aバリアントを包含するが、これに限定されない)および逆転写酵素ドメインを含む合成融合タンパク質を、操作されたプライム編集ガイドRNA(PEgRNA)と併せて用いる。一緒になって、これらの構成要素は特異的なゲノム配列または取り入れされた予めデザインされた配列を標的化し、予め決定された編集を組み入れる。PEgRNAは標的ゲノム配列および編集アウトカム両方を規定するので、高度に特異的なかつコントロールされたゲノム改変が複数のPEgRNAを用いて同じ細胞内において同時に達成され得る。アクセス可能なゲノム改変は、全ての1ヌクレオチド置換、小から中程度のサイズの配列挿入、および小から中程度のサイズの欠失を包含する。このゲノム編集テクノロジーの汎用性は細胞内における時間的にカップリングされたシグナル特異的な記録を可能化し得る。

細胞データ記録のためのプライム編集因子の使用は、細胞の一生の過程に渡って内生または外因的な刺激の強さおよび/または持続時間を記録するための、組成物(例えば核酸)、細胞、システム、キット、および方法を包含し得る。細胞データ記録システムは、細胞の刺激または変化に応答して、標的化されかつ配列が規定されたゲノム挿入、欠失、または変異を生出することによって変化を誘導するための融合タンパク質の発現を誘導するプロモーターに作動可能に連結された、napDNAbp(例えば、Cas9ドメイン)および逆転写酵素からなる融合タンパク質を包含し得る。情報(例えば、刺激の存在または不在)を2つの別物の状態の1つ(すなわち、「オン」または「オフ」)として貯蔵するデジタルメモリーデバイスとは対照的に、これらの細胞データレコーダは、1つ以上の刺激の強さ(すなわち振幅)および持続時間両方を反映する様式で細胞DNA上に永久的なマークを誘導し得る。それゆえに、いくつかの側面では、細胞データ記録システムは、複数の細胞状態を同時に記録する能力を有する。例えば、低分子、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、代謝物質、無機分子、有機金属分子、有機分子、薬物もしくは薬物候補、糖、脂質、金属、核酸、内生もしくは外因的なシグナルカスケードの活性化の間に生ずる分子、光、熱、音、圧力、機械的ストレス、剪断ストレス、またはウイルスもしくは他の微生物に対する暴露を包含する。これらの細胞データレコーダは読み出し(例えば、細胞DNAの変化)を測定するためには配列決定テクノロジー(例えば、高スループット配列決定)を使用し得、刺激の記録または刺激によって誘導される細胞DNAの変化(単数または複数)の読み出し両方について、大きい細胞集団に依存しない。

一般的に、細胞への使用のための本願において提供される細胞データレコーダシステムは、napDNAbpおよび逆転写酵素からなる融合タンパク質を含み、融合体プラスミドをコードする核酸配列はプロモーター(例えば、誘導性プロモーターまたは恒常的プロモーター)に作動可能に連結されている。刺激が存在するかまたは細胞状態の変化が生起するときには、刺激は融合タンパク質の発現を誘導する。napDNAbpと会合し、napDNAbpまたは融合タンパク質を標的配列へと導く少なくとも1つのPEgRNAをコードする1つ以上の核酸もまた細胞内に存在する(すなわち、PEgRNAは標的配列に対して相補的である)。PEgRNAをコードする核酸もまた、または代替的に、プロモーター(例えば、誘導性プロモーターまたは恒常的プロモーター)に作動可能に連結され得る。正しい刺激または正しいセットの刺激下においては、融合タンパク質およびPEgRNA両方が細胞によって発現され、PEgRNAは融合タンパク質と会合してそれを標的配列へと導く。この標的配列はプライム編集因子の活性を記録し、それによって、刺激もしくは刺激のセットの存在または細胞状態の変化を記録する。1つよりも多くのPEgRNA配列もまた細胞内に存在し得、融合タンパク質を別物の標的配列へと導き得るこれらの追加のPEgRNA配列は夫々が、異なる刺激の存在を感知するプロモーターに作動可能に連結され得、刺激またはセットの刺激の存在および持続時間の順序付けられた記録のための複雑な細胞データレコーダシステムが構築されることを許す。いくつかのケースでは、細胞データレコーダシステムの構成要素(例えば、融合タンパク質およびPEgRNA)の1つ以上は、細胞によって恒常的に発現され得る。組成物への使用のための細胞データレコーダシステムの例示の構成要素が本明細書に記載の。本願において提供される構成要素の追加の好適な組み合わせは、本開示および当該技術分野の知識に基づいて当業者には明らかであろう。それゆえに本開示の範囲に包摂される。

標的アンプリコン配列決定および/またはRNA配列決定(これは単一細胞記録実験にとって特に価値がある)によって配列決定され得るDNA標的の繰り返しの改変が、シグナルカスケードの活性化、代謝状態、および細胞分化プログラムを包含する幾多の重要な生物学的プロセスを記録するために用いられ得る。内部のおよび外部の細胞性シグナルをゲノム上の配列改変に接続することは、シグナル応答性プロモーターが存在するいずれかのシグナルについて可能である。いくつかの態様では、プロモーターは原核生物システムへの使用にとって好適なプロモーターである(すなわち、細菌プロモーター)。いくつかの態様では、プロモーターは真核生物システムへの使用にとって好適なプロモーターである(すなわち、真核生物プロモーター)。いくつかの態様では、プロモーターは哺乳類(例えば、ヒト)システムへの使用にとって好適なプロモーターである(すなわち、哺乳類プロモーター)。いくつかの態様では、プロモーターは刺激によって誘導される(すなわち、誘導性プロモーター)。いくつかの態様では、刺激は、低分子、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、代謝物質、無機分子、有機金属分子、有機分子、薬物もしくは薬物候補、糖、脂質、金属、核酸、内生もしくは外因的なシグナルカスケードの活性化の間に生ずる分子、光、熱、音、圧力、機械的ストレス、剪断ストレス、またはウイルスもしくは他の微生物、pHの変化、または酸化還元状態の変化である。いくつかの態様では、刺激は光である。いくつかの態様では、刺激はウイルスである。いくつかの態様では、刺激は低分子である。いくつかの態様では、刺激は抗生物質である。いくつかの態様では、刺激はアンヒドロテトラサイクリンまたはドキシサイクリンである。いくつかの態様では、刺激は糖である。いくつかの態様では、刺激はアラビノース、ラムノース、またはIPTGである。いくつかの態様では、刺激は活性化したシグナルカスケードの間に生ずるシグナル分子である(例えば、活性化したWntシグナルカスケードの間に生ずるベータカテニン)。シグナル分子を検出する追加のプロモーターが、プロモーターに作動可能に連結された核酸配列の発現を誘導するために生成され得る。例えば、免疫応答(IL-2プロモーター)、cAMP応答エレメント(CREB)、NFκBシグナル、インターフェロン応答、P53(DNA損傷)、Sox2、TGF-βシグナル(SMAD)、Erk(例えば、活性化したRas/Raf/Mek/Erkカスケードから)、PI3K/AKT(例えば、活性化したRas/PI3K/Aktカスケードから)、熱ショック、Notchシグナル、Oct4、アリール炭化水素受容体、またはAP-1転写因子を包含する内在的経路を記録するプロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは恒常的プロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは表3に列記されるプロモーターである。原核生物および真核生物システム両方への使用のための追加の好適なプロモーターは、本開示および当該技術分野の知識に基づいて当業者には明らかであろう。本開示の範囲内である。

プライム編集因子は細胞系統をトレースするためにもまた用いられ得る。個々の細胞を追跡するために、固有の細胞バーコードを生成するための繰り返しの配列改変が用いられ得る。バーコードのアレイ、それらの順序、およびサイズは全て、細胞系統を推論するために用いられ得る。例えば、相同性配列(すなわち、Cas9ニックの位置付けの3'の配列)、具体的には関連するバーコードを有する相同性配列の挿入は、特に有用な系統プライム編集因子戦略であるように見える。これらのシステムは、編集の順次のラウンドが、同じ細胞の他のPEgRNA編集イベントによっては改変され得ないPEgRNAカセットからのバーコードの挿入をもたらすようにしてデザインされ得る。バーコード化システムは複数のバーコードを利用し得、これらは所与の刺激に関連し得る。このシステムは標的プロトスペーサーの多数を保全し得るが、シード配列、PAM、および下流の隣接ヌクレオチドを変改し得る。これは、用いられようとするPEgRNAの有意な再デザインなしに、複数のシグナルが1つの編集座位に接続されることを可能化する。戦略は、多数の細胞性の刺激(内部または外部どちらかの)に応答して単一の座位において多重化されたバーコード挿入を可能化し得る。それは、固有のバーコードが存在するだけ多くのシグナルの強度、持続時間、および順序の記録を可能化し得る(これらは4^Nの可能なバーコードを生成するように複数のNヌクレオチドによってデザインされ得る。例えば、5ntバーコードは4^5または1024の固有のシグナルの一度での記録を可能化するであろう)。このシステムはin vitroおよびインビボ両方で用いられ得る。

M．バイオ分子活性を調節するためのプライム編集の使用
本明細書に記載のプライム編集因子の使用は、DNA、RNA、およびタンパク質などのバイオ分子の細胞下レベル局在および修飾状態を制御するためにもまた用いられ得る。転写コントロール、細胞代謝、およびシグナル伝達カスケードのような特定の生物学的機能は、細胞内の具体的な位置付けにおいて丁寧にオーケストレーションされている。タンパク質をこれらのおよび他の固有の細胞区画に輸送する能力は、いくつもの生物学的プロセスを変改するための機会を提供し得る。

従って、プライム編集は、遺伝子にコードされたシグナルによるバイオ分子(例えばタンパク質、脂質、糖、および核酸)の変改された修飾状態および細胞下レベルの輸送を許すであろう遺伝子にコードされたハンドルを組み入れるために用いられ得る。種々の態様において、プライム編集因子によって媒介される薬物治療の標的バイオ分子はDNAである。例えば、DNAは、標的座位のアクセス可能性を変化させるいくつものDNA配列を組み入れることによって改変され得る。これは所望の配列の増大または減少したどちらかの転写に至り得る。他の態様において、プライム編集因子によって媒介される薬物治療の標的バイオ分子はRNAである。例えば、RNAの活性は、その細胞局在、相互作用パートナー、構造ダイナミクス、またはフォールディングの熱力学を変化させることによって改変され得る。さらに他の態様において、プライム編集因子によって媒介される薬物治療の標的バイオ分子はタンパク質である。タンパク質は翻訳後修飾にインパクトを及ぼすように改変され得るか、タンパク質モチーフがタンパク質の細胞下レベル局在を変化させるように組み入れられ得るか、またはタンパク質はタンパク質-タンパク質複合体化イベントに存在するそれらの能力を生出するかもしくは破壊するかどちらかのために改変され得る。

プライム編集のこの適用は例14においてさらに記載され得る。

DNA改変
PEによって媒介される改変の1つの標的バイオ分子はDNAである。標的座位のアクセス可能性を変化させるいくつものDNA配列を組み入れるためのDNAの改変がなされ得る。クロマチンアクセス可能性は遺伝子転写アウトプットをコントロールする。クロマチンコンパクト化酵素を動員するためのマークの組み入れは、隣り合う遺伝子の転写アウトプットを減少させるはずであるが、クロマチン開放に関連する配列の組み入れは、領域をよりアクセス可能にし、翻って転写を増大させるはずである。ネイティブな制御配列を真似たより複雑な配列モチーフの組み入れは、現行で利用可能なdCas9融合体よりも微妙なかつ生物学的に敏感なコントロールを異なるエピジェネティックなリーダー、ライター、またはイレーサー酵素に提供するはずである。典型的には、具体的な生物学的祖先を有さずにあり得る多数の単一型のマークを組み入れるツールである。3Dゲノムアーキテクチャの急成長分野において実証されているとおり、2つの座位を近接する近位に持って来るかまたは座位を核膜との接触に持って来るであろう配列の組み入れもまた、それらの座位の転写アウトプットを変改するはずである。

RNA改変
それらの細胞局在、相互作用パートナー、構造ダイナミクス、またはフォールディングの熱力学を変化させることによってそれらの活性を変改するためのRNAの改変もまたなされ得る。翻訳中断またはフレームシフトを引き起こすであろうモチーフの組み入れは、種々のmRNAプロセシング機序によってmRNA種の存在量を変化させ得る。コンセンサススプライス配列を改変することもまた、異なるRNA種の存在量および保有率を変改するであろう。異なるスプライスアイソフォームの相対比を変化させることは、予測可能に、タンパク質翻訳産物の比の変化に至るであろう。これは多くの生物学的経路を変改するために用いられ得る。例えば、ミトコンドリア対核のDNA修復タンパク質のバランスをシフトさせることは、化学療法試薬に対する異なるがんのレジリエンスを変改するであろう。さらにその上、RNAは、新規のタンパク質標的への結合を可能化する配列によって修飾され得る。高い親和性で細胞タンパク質に結合するいくつものRNAアプタマーが開発されている。これらのアプタマーの1つの組み入れは、それらの翻訳、生物活性を防止するであろうタンパク質標的への結合によって異なるRNA種を隔離するために、またはRNA種を特定の細胞下レベル区画に持って来るためにどちらかで用いられ得る。バイオ分子分解は局在改変の別のクラスである。

例えば、細胞内のRNAを制御するためのRNAメチル化が用いられる。メチル化のコンセンサスモチーフがPEによって標的RNAコード配列上に導入され得る。RNAは、ナンセンスによって媒介される崩壊機構または標的RNA種を分解するための他の核酸代謝経路を導く配列を包含するようにもまた改変され得、細胞内のRNAのプールを変化させるであろう。加えて、RNA種はそれらの凝集状態を変改するように改変され得る。RNAの絡まりを生成するための配列が目当ての単一のRNAまたは複数のRNA上に組み入れされ得、これはそれらを翻訳またはシグナルにとって無効な基質にするであろう。

タンパク質修飾
翻訳後修飾(PTM)によるタンパク質の修飾もまたPEによって実行され得るバイオ分子操作の重要なクラスを表す。RNA種のように、細胞内のタンパク質の存在量を変化させることは、PEの重要な能力である。オープンリーディングフレームに停止コドンを組み入れるための編集がされ得る。これは編集されたDNA配列から生ずる全長産物を消去するであろう。代替的には、タンパク質分解の速度が標的タンパク質について変改されることを引き起こすペプチドモチーフが組み入れられ得る。遺伝子本体上への分解タグの組み入れが、細胞内のタンパク質の存在量を変改するために用いられ得る。その上、低分子によって誘導されるデグロンの導入はタンパク質分解の時間的コントロールを可能化し得る。これは研究および治療学両方にとって重要な関連性を有し得る。なぜなら、研究者は所与の標的の低分子によって媒介される治療学的タンパク質分解が見込みある治療学的戦略であるかどうかを難なく評価し得るからである。タンパク質の細胞下レベル局在を変化させるためのタンパク質モチーフもまた組み入れられ得る。核、ミトコンドリア、細胞膜、ペルオキシソーム、リソソーム、プロテアソーム、エキソソーム、および他を包含するいくつもの細胞下レベル区画にタンパク質を選好的に輸送するためのアミノ酸モチーフが組み入れられ得る。

PTM機構によって修飾されるモチーフを組み入れまたは破壊することはタンパク質翻訳後修飾を変改し得る。リン酸化、ユビキチン化、グリコシル化、脂質修飾(例えばファルネシル化、ミリストイル化、パルミトイル化、プレニル化、GPIアンカー)、ヒドロキシル化、メチル化、アセチル化、クロトニル化、SUMO化、ジスルフィド結合形成、側鎖結合切断イベント、ポリペプチドバックボーン切断イベント(タンパク質分解)、およびいくつもの他のタンパク質PTMが同定されている。これらのPTMは、多くの場合には細胞下レベル局在を変化させることによってタンパク質機能を変化させる。実に、キナーゼは多くの場合にはリン酸化イベントによって下流のシグナルカスケードを活性化する。標的ホスホ部位の除去はシグナル伝達を防止するであろう。全長タンパク質発現を保持しながらいずれかのPTMモチーフを部位特異的に切除または組み入れる能力は、基礎研究および治療学両方にとって重要な進歩であろう。PEの配列組み入れ範囲および標的窓は、それを幅広いPTM改変空間に良く適するようにしている。

脂質修飾部位の除去は細胞膜へのタンパク質の輸送を防止するはずである。翻訳後修飾プロセスを標的化する現行の治療学における主要な限定はそれらの特異性である。ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤は細胞膜へのKRAS局在を消去するそれらの能力について鋭意に試験されている。残念ながら、ファルネシル化の全面的な阻害は数々のオフターゲット効果を伴い、これらはこれらの低分子の幅広い使用を防止している。類似に、低分子によるタンパク質キナーゼの特異的阻害は、ヒトゲノムの大きいサイズおよび種々のキナーゼ間の類似性を原因として非常に難しくあり得る。PEはこの特異性問題に可能性ある解決をオファーする。なぜなら、それは全面的な酵素阻害の代わりに修飾部位の切除による標的タンパク質の修飾の阻害を可能化するからである。例えば、KRAS上の脂質修飾ペプチドモチーフの除去は、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害の代わりに用いられ得る標的化されたアプローチであろう。このアプローチは、膜結合するようにデザインされていないタンパク質上に脂質標的化モチーフを組み入れることによって標的タンパク質活性を阻害することの機能的な反対物である。

PEはタンパク質-タンパク質複合体化イベントを取り調べる(instigate)ためにもまた用いられ得る。タンパク質は多くの場合には複合体内で機能してそれらの生物活性を遂行する。PEは、タンパク質がこれらの複合体内に存在する能力を生出するかまたは破壊するかどちらかのために用いられ得る。複合体形成イベントを消去するためには、タンパク質:タンパク質インターフェース上のアミノ酸置換または挿入が、複合体化を好まないように組み入れられ得る。SSX18は重要なヒストンリモデリング複合体のBAF複合体のタンパク質構成要素である。SSX18の変異は滑膜肉腫を駆動する。PEは、SSX18が複合体のそのタンパク質パートナーに結合することを防止する側鎖を組み入れしてその発がん活性を防止するために用いられ得る。PEは病原性の変異を除去してこのタンパク質のWT活性を復元するためにもまた用いられ得る。代替的には、PEは、タンパク質をそれらのネイティブな複合体中に保つために、またはそれらのネイティブな活性とは無関係である相互作用に関与するようにそれらを引っ張ってそれらの活性を阻害するためにどちらかで用いられ得る。別のものと比べて1つの相互作用状態を維持する複合体を形成することは、重要な治療学的モダリティーを表し得る。タンパク質:タンパク質インターフェースを変改して相互作用のKdを減少させることは、それらのタンパク質がより長く互いにくっついていることを保つであろう。疾患においては神経芽腫シグナルカスケードを駆動するが、さもなければ他の細胞では健康な転写コントロールに関与するn-mycのように、タンパク質複合体は複数のシグナル複合体を有し得る。PEは、健康な相互作用パートナーとのn-myc会合を駆動しかつ発がん相互作用パートナーに対するその親和性を減少させる変異を組み入れるために用いられ得る。
セクションIに引用された参考文献
以下の参考文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる。

N．プライム編集のためのPEgRNAの改善されたデザイン側面
他の態様において、プライム編集システムはプライム編集効率を改善し得るPEgRNAデザインおよび戦略の使用を包含し得る。これらの戦略は、プライム編集に要求されるマルチステッププロセスゆえに存在するいくつかのイシューを克服することを探究する。例えば、PEgRNA上に形成し得る好ましくないRNA構造は、DNA編集がPEgRNAからゲノム座位にコピーされることの阻害をもたらし得る。これらの限定はPEgRNA構成要素の再デザインおよび操作によって克服され得る。これらの再デザインはプライム編集因子効率を改善し得、ゲノム上へのより長い挿入配列の組み入れを許し得る。

従って、種々の態様において、PEgRNAデザインは、非ポリメラーゼIII(pol III)プロモーターからの機能的なPEgRNAの効率的な発現を可能化することによって、より長いPEgRNAをもたらし得る。これは難儀な配列要件の必要を回避するであろう。他の態様において、コアのCas9結合PEgRNA骨格はシステムの効力を改善するように改善され得る。さらに他の態様において、逆転写酵素(RT)処理能力を改善するための改変がPEgRNAになされ得る。これは標的ゲノム座位におけるより長い配列の挿入を可能化するであろう。他の態様において、安定性を改善、RT処理能力を増強、PEgRNAのミスフォールディングを防止、および/またはゲノム編集にとって重要な追加の因子を動員するために、RNAモチーフがPEgRNAの5'および/または3'末端に追加され得る。さらに別の態様では、PEgRNA骨格を改善およびプライム編集因子効率を増強し得る所与の配列標的についてのPEgRNAの進化のためのプラットフォームが提供される。これらのデザインは、いずれかのCas9またはその進化したバリアントによって認識されるいずれかのPEgRNAを改善するために用いられ得る。

プライム編集のこの適用は例15にさらに記載され得る。

PEgRNAは、PEgRNAの特性および/または特徴を改変し得る追加のデザイン改善を包含し得、それによってプライム編集の効力を改善する。種々の態様において、これらの改善は、いくつもの異なるカテゴリーの1つ以上に属し得る:(1)難儀な配列要件なしにより長いPEgRNAの発現を可能化するであろう非ポリメラーゼIII(pol III)プロモーターからの機能的なPEgRNAの効率的な発現を可能化するためのデザイン;(2)効力を改善し得るコアのCas9結合PEgRNA骨格の改善;(3)RT処理能力を改善し、標的ゲノム座位におけるより長い配列の挿入を可能化するPEgRNAの改変;および(4)PEgRNA安定性を改善、RT処理能力を増強、PEgRNAのミスフォールディングを防止、またはゲノム編集にとって重要な追加の因子を動員するPEgRNAの5'または3'末端へのRNAモチーフの追加を包含するが、これらに限定されない。

1つの態様では、より大きい伸長アームを有するより長い長さのPEgRNAの発現を改善するためのpol IIIプロモーターによるPEgRNAがデザインされ得る。sgRNAは典型的にはU6 snRNAプロモーターから発現される。このプロモーターはpol IIIを動員して関連するRNAを発現し、核内に保持される短いRNAの発現にとって有用である。しかしながら、pol IIIは高度にプロセッシブではなく、長さが数百ヌクレオチドよりも長いRNAを効率的なゲノム編集に要求されるレベルで発現する能力はない。加えて、pol IIIはUのストレッチにおいてストールまたは終結し得、可能性として、PEgRNAを用いて挿入され得る配列多様性を限定する。ポリメラーゼII(例えばpCMV)またはポリメラーゼI(例えばU1 snRNAプロモーター)を動員する他のプロモーターが、より長いsgRNAを発現するそれらの能力について検分されている。しかしながら、これらのプロモーターは典型的には部分的に転写され、これは発現されるPEgRNA上のスペーサーの5'に余分な配列をもたらすであろう。これは顕著に縮減されたCas9:sgRNA活性を部位依存的な様式でもたらすことが示されている。加えて、pol IIIによって転写されるPEgRNAは単純に一続きの6-7つのUで終結し得るが、pol IIまたはpol Iから転写されるPEgRNAは異なる終結シグナルを要求するであろう。多くの場合に、かかるシグナルはポリアデニル化をもまたもたらし、これは核からのPEgRNAの望まれない輸送をもたらすであろう。類似に、pCMVなどのpol IIプロモーターから発現されたRNAは典型的には5'キャッピングされ、それらの核搬出をもまたもたらすであろう。

先に、Rinnおよび同僚は、長鎖非コードRNA(lncRNA)タグ付きsgRNAの生産について、種々の発現プラットフォームをスクリーニングした¹⁸³。これらのプラットフォームは、ヒトのMALAT1 ncRNAからのENEエレメント¹⁸⁴、KSHVからのPAN ENEエレメント¹⁸⁵、またはU1 snRNAからの3'ボックス¹⁸⁶で終結する、pCMVから発現されるRNAを包含する。注意すべきことに、MALAT1 ncRNAおよびPAN ENEは三重らせんを形成し、ポリAテールを防護する^184,187。これらの構築物もまたRNA安定性を増強し得る。これらの発現システムもまたより長いPEgRNAの発現を可能化するであろうということが企図される。

加えて、PEgRNAの一部として転写されるであろうpol IIプロモーターの部分の切断のための一連の方法がデザインされており、転写されたガイドをプロセシングするための自己切断リボザイム、例えばハンマーヘッド¹⁸⁸、ピストル¹⁸⁹、ハチェット¹⁸⁹、ヘアピン¹⁹⁰、VS¹⁹¹、ツイスター¹⁹²、もしくはツイスターシスター¹⁹²リボザイム、または他の自己切断エレメント、あるいはCsy4によって認識され¹⁹³、またガイドのプロセシングに至るヘアピンどちらかを追加している。また、KSHV PAN RNAおよびエレメントについて先に実証されているとおり、複数のENEモチーフの組み込みが、改善されたPEgRNA発現および安定性に至り得るという仮説が立てられている¹⁸⁵。環状イントロン性RNA(ciRNA)の形態でPEgRNAを環状化することもまた増強されたRNA発現および安定性ならびに核局在に至り得るということもまた予期される¹⁹⁴。

様々な態様において、PEgRNAは、以下の配列によって例示されるとおり、上の様々な要素を包含していてもよい。

非限定例1－pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、およびMALAT1 ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTAGGGTCATGAAGGTTTTTCTTTTCCTGAGAAAACAACACGTATTGTTTTCTCAGGTTTTGCTTTTTGGCCTTTTTCTAGCTTAAAAAAAAAAAAAGCAAAAGATGCTGGTGGTTGGCACTCCTGGTTTCCAGGACGGGGTTCAAATCCCTGCGGCGTCTTTGCTTTGACT(配列番号501)

非限定例2－pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、およびPAN ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号502)

非限定例3－pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3×PAN ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACACACTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTCTCTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号503)

非限定例4－pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3'ボックスからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号504)

非限定例5－pU1、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3'ボックスからなるPEgRNA発現プラットホーム
CTAAGGACCAGCTTCTTTGGGAGAGAACAGACGCAGGGGCGGGAGGGAAAAAGGGAGAGGCAGACGTCACTTCCCCTTGGCGGCTCTGGCAGCAGATTGGTCGGTTGAGTGGCAGAAAGGCAGACGGGGACTGGGCAAGGCACTGTCGGTGACATCACGGACAGGGCGACTTCTATGTAGATGAGGCAGCGCAGAGGCTGCTGCTTCGCCACTTGCTGCTTCACCACGAAGGAGTTCCCGTGCCCTGGGAGCGGGTTCAGGACCGCTGATCGGAAGTGAGAATCCCAGCTGTGTGTCAGGGCTGGAAAGGGCTCGGGAGTGCGCGGGGCAAGTGACCGTGTGTGTAAAGAGTGAGGCGTATGAGGCTGTGTCGGGGCAGAGGCCCAAGATCTCAGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTCAGCAAGTTCAGAGAAATCTGAACTTGCTGGATTTTTGGAGCAGGGAGATGGAATAGGAGCTTGCTCCGTCCACTCCACGCATCGACCTGGTATTGCAGTACCTCCAGGAACGGTGCACCCACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号505)

種々の他の態様において、PEgRNAは、骨格またはコア配列への改善を導入することによって改善され得る。これは公知を導入することによってされ得る。

コアのCas9結合PEgRNA骨格は、蓋然的には、PE活性を増強するように改善され得る。いくつかのかかるアプローチはすでに実証されている。例えば、骨格の第1の対形成エレメント(P1)はGTTTT-AAAAC対形成エレメントを含有する。かかる一続きのTはpol III中断とRNA転写物の未成熟な終結とをもたらすことが示されている。P1のこの部分におけるT-Aペアの1つからG-Cペアへの合理的な変異はsgRNA活性を増強することが示されており、このアプローチがPEgRNAについてもまた実現可能であろうということを示唆している¹⁹⁵。加えて、P1の長さを増大させることは、sgRNAフォールディングを増強し、改善された活性に至るということもまた示されており¹⁹⁵、それをPEgRNA活性の改善のための別の道として示唆している。コアの例の改善は:

P1まで6nt伸長を含有するPEgRNA
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGCTCATGAAAATGAGCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号228)

P1内にT-A→G-C突然変異を含有するPEgRNA
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTGAGAGCTAGAAATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号229)
を包含し得る。

種々の他の態様において、PEgRNAは編集鋳型領域の改変を導入することによって改善され得る。PEgRNAを鋳型とする挿入のサイズが増大すると、それは、エンドヌクレアーゼによって分解されるか、自発的加水分解を経過するか、またはRTによって逆転写される能力がないもしくはPEgRNA骨格のフォールディングおよび爾後のCas9-RT結合を遮断する二次構造へとフォールディングすることがより蓋然的である。従って、PEgRNAの鋳型の改変が、大きい挿入、例えば遺伝子丸ごとの挿入を成し遂げる(affect)ために必要であり得るということが蓋然的である。そうするためのいくつかの戦略は、合成または半合成PEgRNA上の修飾ヌクレオチドの組み込みを包含し、これらがRNAを分解もしくは加水分解に対してより耐性にするか、または阻害性の二次構造を採用することをより蓋然的でなくする¹⁹⁶。かかる修飾は、Gリッチ配列のRNA二次構造を縮減するであろう8-アザ-7-デアザグアノシン;分解を縮減し、ある種の種類のRNA二次構造を増強するロック核酸(LNA);RNA安定性を増強する2'-O-メチル、2'-フルオロ、または2'-O-メトキシエトキシ修飾を包含し得る。かかる修飾は、安定性および活性を増強するためにPEgRNA上の他所にもまた包含され得る。代替的にはまたは加えて、それが所望のタンパク質産物をコードすることと、RTによってアンフォールディングされる能力がある単純な二次構造を採用することがより蓋然的でもまたあることと両方であるようにして、PEgRNAの鋳型がデザインされ得る。かかる単純な構造は熱力学的シンクとして作用し、逆転写を防止するであろうより複雑化した構造が生起することをより蓋然的でなくするであろう。最後に、鋳型を2つの別個のPEgRNAに分裂し得る。かかるデザインでは、転写を開始し、Cas9に融合されたRNA結合タンパク質またはMS2アプタマーなどのPEgRNAそれ自体の上のRNA認識エレメントによって別個の鋳型RNAを標的部位に動員するためにもまた、PEは用いられるであろう。RTは、直接的にこの別個の鋳型RNAに結合し得るか、または第2の鋳型へのスワッピング前に元々のPEgRNAから逆転写を開始し得るかどちらかである。かかるアプローチは、長い鋳型の追加によるPEgRNAのミスフォールディングを防止することによって、また、長い挿入が生起するために、ことによるとPEに基づく長い挿入を阻害し得るゲノムからのCas9の解離を要求しないことによって両方で、長い挿入を可能化し得る。

なお他の態様において、PEgRNAは、追加のRNAモチーフをPEgRNAの5'および3'末端に導入することによって改善され得る。いくつかのかかるモチーフ、例えばKSHVからのPAN ENEおよびMALAT1からのENEは、非pol IIIプロモーターからのより長いPEgRNAの発現を終結させるための可能な手段として上で論じられた。これらのエレメントはRNA三重らせんを形成し、これらはポリAテールを取り囲み、それらが核内に保持されることをもたらす^184,187。しかしながら、末端ヌクレオチドを閉じ込めるPEgRNAの3'末端の複雑な構造を形成することによって、これらの構造は、蓋然的には、PEgRNAのエキソヌクレアーゼによって媒介される分解を防止することをもまた助けるであろう。

非pol IIIプロモーターからの終結を可能化することなしにであっても、3'末端に挿入される他の構造要素もまたRNA安定性を増強し得る。かかるモチーフは、3'末端を閉じ込めるであろうヘアピンもしくはRNA四重鎖¹⁹⁷、または3'末端における2’-3'-環状リン酸の形成をもたらし、また、可能性としてはPEgRNAがエキソヌクレアーゼによって分解されることをより蓋然的でなくするであろうHDVなどの自己切断リボザイム¹⁹⁸を包含し得る。不完全なスプライシングによってPEgRNAが環化することを誘導して、ciRNAを形成することもまた、PEgRNA安定性を増大させ得、PEgRNAが核内に保持されることをもたらし得る¹⁹⁴。

追加のRNAモチーフもまた、DNA-RNA二重鎖に対するRT結合を増強することによって、RT処理能力を改善またはPEgRNA活性を増強し得る。その対応するレトロウイルスゲノム上のRTによって結合されるネイティブな配列の追加は、RT活性を増強し得る¹⁹⁹。これは、ネイティブなプライマー結合部位(PBS)、ポリプリントラクト(PPT)、またはレトロウイルスゲノム二量体化および転写の開始に関わるキッシングループを包含し得る¹⁹⁹。

PEgRNAの5'および3'末端におけるキッシングループまたはGNRAテトラループ/テトラループレセプターペア²⁰⁰などの二量体化モチーフの追加もまた、PEgRNAの有効な環状化をもたらし得、安定性を改善する。加えて、これらのモチーフの追加はPEgRNAスペーサーおよびプライマーの物理的分離を可能化し得、PE活性を妨げるであろうスペーサーの閉じ込めを防止する(prevention)ということが想定される。スペーサー領域における小さいトーホールドヘアピンを形成するPEgRNAの短い5'または3'伸長もまた、スペーサーに結合するPEgRNAのアニーリング領域に対して好ましく競合し得る。最後に、キッシングループもまた他の鋳型RNAをゲノム部位に動員するために用いられ得、1つのRNAから他へのRT活性のスワッピングを可能化し得る。例の改善は:

PEgRNA-HDV融合体
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号230)

PEgRNA-MMLVキッシングループ
GGTGGGAGACGTCCCACCGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCTTTTTTT(配列番号231)

PEgRNA-VSリボザイムキッシングループ
GAGCAGCATGGCGTCGCTGCTCACGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTCCATCAGTTGACACCCTGAGGTTTTTTT(配列番号232)

PEgRNA-GNRAテトラループ/テトラループ受容体
GCAGACCTAAGTGGUGACATATGGTCTGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAUACGTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTUACGAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGCATGCGATTAGAAATAATCGCATGTTTTTTT(配列番号233)

2次RNA-HDV融合体を切り替えるPEgRNA鋳型
TCTGCCATCAAAGCTGCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号234)
を包含するが、これらに限定されない。

PEgRNA骨格は、どのようにしてSpCas9およびプライム編集因子(PE)が改善されたかに類縁の様式で、指向性進化によってさらに改善され得る。指向性進化はCas9または進化したCas9バリアントによるPEgRNA認識を増強し得る。加えて、異なるPEgRNA骨格配列が異なるゲノム座位においては最適であろうということが蓋然的であり、当の部位におけるPE活性を増強するか、オフターゲット活性を縮減するか、または両方かどちらかである。最後に、他のRNAモチーフが追加されたPEgRNA骨格の進化は、ほとんど確実に、未進化の融合RNAに対して相対的に融合PEgRNAの活性を改善するであろう。例えば、c-ジ-GMP-Iアプタマーおよびハンマーヘッドリボザイムから成るアロステリックリボザイムの進化は劇的に改善された活性に至り²⁰²、進化がハンマーヘッド-PEgRNA融合体の活性も改善するであろうということを示唆した。加えて、Cas9は現行では一般的にsgRNAの5'伸長を忍容しないが、指向性進化は、蓋然的には、この非忍容性を和らげる有能な変異を生成し、追加のRNAモチーフが利用されることを許すであろう。

本開示は、ここで開示されるプライム編集システムの効力をさらに改善するためのいずれかのかかるやり方を企図する。

O．拡張された標的化範囲を有するプライム編集の使用
Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)を用いるプライム編集(PE)は、SpCas9が効率的に結合し得る好適に置かれたNGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)があるゲノム座位において、全ての1塩基置換、挿入、欠失、およびそれらの組み合わせを効率的に組み入れ組み入れ得る。しかしながら、別の側面において、本明細書に記載の方法は、アクセス可能なPAM、よって効率的なPEのためのアクセス可能な標的化可能なゲノム座位を拡張することによって、PEの標的化能力を幅広くする。SpCas9以外のRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質を用いるプライム編集因子は、異なるPAMへのアクセスを許すことによってゲノム座位の拡張された標的化可能な範囲を可能化する。加えて、SpCas9よりも小さいRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質の使用は、より効率的なウイルス送達をもまた許す。SpCas9以外のCasタンパク質または他のRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質によるPEは、SpCas9に基づくPEを用いてはアクセス不可能または非効率的どちらかであった高効率の治療学的編集を許すであろう。

これは、NGG PAMに対して相対的な編集の非理想的な間隔を原因として、SpCas9に基づくPEが非効率的であるか、またはSpCas9に基づく構築物の総体的なサイズが細胞発現および/もしくは送達にとって法外であるかどちらかの状況に用いられることが予想される。SpCas9の少数のかつ不良に位置付けられたNGG PAMを標的領域の近くに有するハンチンチン遺伝子などの特定の疾患に該当する(relevent)座位は、NGA PAMを認識するSpCas9-VRQRなどのPEシステムの異なるCasタンパク質を用いて容易に標的化され得る。より効率的にAAVベクターにパッケージングされ得るより小さいPE構築物を生成するために、より小さいCasタンパク質が用いられ、標的組織へのより良好な送達を可能化するであろう。図61は、RNAによってガイドされるDNA結合タンパク質としてStaphylococcus aureus CRISPR-Casを用いるプライム編集の実施化を示す。NTは無処置の対照である。

図62A～62Bは、プライム編集による精密な位置付けにおける所望の編集の効率的な組み入れのためのプロトスペーサーの重要性の実証を提供する。これは、このテクノロジーの新規の特色としての代替的なPAMおよびプロトスペーサーの重要性を強調する。図62Aの「n.d.」は「検出されない」である。

図63は、プライム編集因子システムのRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質としてSpCas9(H840A)-VRQRおよびSpCas9(H840A)-VRERを用いるPEの実施化を示す。SpCas9(H840A)-VRQR napDNAbpは配列番号87として本明細書に開示の。SpCas9(H840A)-VRER napDNAbpは配列番号88として本明細書に開示の。SpCas9(H840A)-VRER-MMLV RT融合タンパク質は配列番号516として本願において開示され、MMLV RTはD200N、L603W、T330P、T306K、およびW313F置換を野生型MMLV RTに対して相対的に含む。SpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RT融合タンパク質は配列番号515として本願において開示され、MMLV RTはD200N、L603W、T330P、T306K、およびW313F置換を野生型MMLV RTに対して相対的に含む。ヒトゲノム上の7つの異なる座位が標的化される:4つはSpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RTプライム編集因子システムにより、3つはSpCas9(H840A)-VRER-MMLV RTシステムによる。試験された構築物のアミノ酸配列は次のとおりである:

図63に示されているとおり、SpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RTは「AGAG」および「GGAG」を包含するPAM部位において作動性であり、いくらかの編集活性を「GGAT」および「AGAT」PAM配列において有した。SpCas9(H840A)-VRER-MMLV RTは「AGCG」および「GGCG」を包含するPAM部位において作動性であり、いくらかの編集活性を「TGCG」において有した。

データは、プライム編集が、異なるPAM特異性を持つnapDNAbp、例えば本明細書に記載のCas9バリアントを用いて行われ得るということを実証している。

種々の態様において、変改されたPAM特異性を有するnapDNAbp(例えばCas9)は、その3'端に5'-NAA-3'PAM配列を含む標的配列に対して活性を発揮する変異の組み合わせを含む。いくつかの態様では、変異の組み合わせは、表1の列記されているクローンのいずれか1つに存在する。いくつかの態様では、変異の組み合わせは、表1の列記されているクローンの保存的変異である。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表1に列記されるCas9クローンのいずれか1つの変異の組み合わせを含む。

表1:NAA PAMクローン

いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表1のバリアントのいずれか1つによって提供されるCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表1のバリアントのいずれか1つによって提供されるCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、配列番号18によって提供されるStreptococcus pyogenes Cas9と比較して、その3'端に標準的なPAM(5'-NGG-3')を含まない標的配列に対する増大した活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、同じ標的配列に対する配列番号18によって提供されるStreptococcus pyogenes Cas9の活性と比較して、少なくとも5倍増大した標準的なPAM配列(5'-NGG-3')に直接的に隣接しない3'端を有する標的配列に対する活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、同じ標的配列に対する配列番号2によって提供されるStreptococcus pyogenesの活性と比較して、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1,000倍、少なくとも5,000倍、少なくとも10,000倍、少なくとも50,000倍、少なくとも100,000倍、少なくとも500,000倍、または少なくとも1,000,000倍増大した標準的なPAM配列(5'-NGG-3')に直接的に隣接しない標的配列に対する活性を発揮する。いくつかの態様では、標的配列の3'端はAAA、GAA、CAA、またはTAA配列に直接的に隣接する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、その3'端に5'-NAC-3'PAM配列を含む標的配列に対する活性を発揮する変異の組み合わせを含む。いくつかの態様では、変異の組み合わせは、表2の列記されているクローンのいずれか1つに存在する。いくつかの態様では、変異の組み合わせは表2の列記されているクローンの保存的変異である。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表2に列記されるCas9クローンのいずれか1つの変異の組み合わせを含む。

表2:NAC PAMクローン

いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表2のバリアントのいずれか1つによって提供されるCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表2のバリアントのいずれか1つによって提供されるCas9タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、配列番号18によって提供されるStreptococcus pyogenes Cas9と比較して、その3'端に標準的なPAM(5'-NGG-3')を含まない標的配列に対する増大した活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、同じ標的配列に対する配列番号18によって提供されるStreptococcus pyogenes Cas9の活性と比較して、少なくとも5倍増大した標準的なPAM配列(5'-NGG-3')に直接的に隣接しない3'端を有する標的配列に対する活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、同じ標的配列に対する配列番号18によって提供されるStreptococcus pyogenesの活性と比較して、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1,000倍、少なくとも5,000倍、少なくとも10,000倍、少なくとも50,000倍、少なくとも100,000倍、少なくとも500,000倍、または少なくとも1,000,000倍増大した、標準的なPAM配列(5'-NGG-3')に直接的に隣接しない標的配列に対する活性を発揮する。いくつかの態様では、標的配列の3'端はAAC、GAC、CAC、またはTAC配列に直接的に隣接する。

いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、その3'端に5'-NAT-3'PAM配列を含む標的配列に対する活性を発揮する変異の組み合わせを含む。いくつかの態様では、変異の組み合わせは表3の列記されているクローンのいずれか1つに存在する。いくつかの態様では、変異の組み合わせは表3の列記されているクローンの保存的変異である。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、表3に列記されるCas9クローンのいずれか1つの変異の組み合わせを含む。

表3:NAT PAMクローン

標準的なSpCas9と比較して差次的なPAM特異性を呈示する上のCas9バリアントのいずれかは、本明細書に開示のプライム編集因子に用いられ得る。

P．リコンビナーゼ標的部位を挿入するためのプライム編集の使用
別の側面において、プライム編集は、リコンビナーゼ部位(または「リコンビナーゼ認識配列」)を所望のゲノム部位に挿入するために用いられ得る。リコンビナーゼ部位の挿入は、部位特異的な遺伝子変化をゲノムに成し遂げるためのプログラムされた位置付けを提供する。かかる遺伝子変化は、他の遺伝子変化の中でも、例えばプラスミドのゲノム取り入れ、ゲノム欠失または挿入、染色体転座、およびカセット交換を包含し得る。遺伝子変化のこれらの例示の型は図64(b)～(f)において例解されている。それから、組み入れされたリコンビナーゼ認識配列は、その部位における部位特異的な組み換えを行うために用いられて、種々の組み換えアウトカム、例えば切除、取り入れ、逆位、またはDNAフラグメントの交換を成就し得る。例えば、図65はリコンビナーゼ部位の組み入れを例解し、これはそれからGFP発現マーカーを含むDNAドナー鋳型を取り入れするために用いられ得る。リコンビナーゼ部位に取り入れされたGFP発現システムを含有する細胞は、蛍光発光するであろう。

リコンビナーゼ部位をゲノムに組み入れる機序は、ペプチド/タンパク質およびRNAタグなどの他の配列をゲノムに組み入れることに類縁である。リコンビナーゼ標的配列の組み入れを例示する模式図が図64(a)に示されている。プロセスは、リコンビナーゼ標的配列が導入されるであろう所望の標的座位を選択することによって始まる。次に、プライム編集因子融合体が提供される(「RT-Cas9:gRNA」)。ここで、「gRNA」はPEgRNAを言い、これは本明細書に記載の原理を用いてデザインされ得る。PEgRNAは種々の態様において図3Dに対応するアーキテクチャを含むであろう(5'-[～20ntスペーサー]-[gRNAコア]-[伸長アーム]-3'であって、伸長アームは3'から5'の方向にプライマー結合部位(「A」)、編集鋳型(「B」)、および相同アーム(「C」)を含む。編集鋳型(「B」)は、リコンビナーゼ部位に対応する配列、すなわち、リコンビナーゼ部位のセンスまたはアンチセンス鎖どちらかでありかつプライム編集プロセスによってゲノムDNA標的座位に組み込まれる相補的な一本鎖DNAをコードするPEgRNAの一本鎖RNAを含むであろう。

種々の側面では、本開示は、ヒトまたは他のゲノム上の高価値の座位にリコンビナーゼ認識配列を導入するためのPEの使用を可能にする。これらは、部位特異的なリコンビナーゼ(単数または複数)に対する暴露後に、精密なかつ効率的なゲノム改変を導くであろう(図64)。図64に示されている(show)種々の態様では、PEは、(b)DNAドナー鋳型のゲノム取り入れの部位としての使用のための単一のSSR標的を挿入するために用いられ得る。(c)は、どのようにしてSSR標的部位のタンデム挿入がゲノムのある部分を欠失させるために用いられ得るかを示す。(d)は、どのようにしてSSR標的部位のタンデム挿入がゲノムのある部分を逆位させるために用いられ得るかを示す。(e)は、どのようにして2つの遠位の染色体領域における2つのSSR標的部位の挿入が染色体転座をもたらし得るかを示す。(f)は、どのようにしてゲノム上の2つの異なるSSR標的部位の挿入がDNAドナー鋳型からのカセットを交換するために用いられ得るかを示す。ゲノム改変の型の夫々は、SSR標的を挿入するためにPEを用いることによって想定されるが、このリストもまた限定することを意味されない。

リコンビナーゼ認識配列のPEによって媒介される導入は、大スケールのゲノム欠陥、例えば遺伝子喪失、逆位、もしくは重複、または染色体転座によって引き起こされる遺伝子疾患の処置にとって特に有用であり得る^1～7(表6)。例えば、ウィリアムズ・ボイレン症候群は染色体7上の24の欠失によって引き起こされる発達障害である21。現行では、生細胞における複数の遺伝子全体の効率的なかつ標的化された挿入のためのテクノロジーは存在しない(かかる全長遺伝子挿入をするPEのポテンシャルは現行では調査されているが、まだ確立されていない);しかしながら、PEによって挿入される標的におけるリコンビナーゼによって媒介される取り入れは、このおよび他の疾患の永久的な治癒への1つのアプローチをオファーする。加えて、リコンビナーゼ認識配列の標的化された導入は、トランスジェニック植物、動物研究モデル、バイオプロダクション細胞株、または他のカスタム真核細胞株の生成を包含する適用にとって高度に有能であり得る。例えば、PE特異的な標的におけるトランスジェニック植物のリコンビナーゼによって媒介されるゲノム再構成は、改善された特性を有する農作物を生成することのボトルネックの1つを克服し得る^8,9。

表6.リコンビナーゼ認識配列のPEに基づく組み入れによって修復され得る大スケールゲノム改変にリンクした遺伝子疾患の例。

いくつものSSRファミリーメンバーが特徴付けられ、それらのリコンビナーゼ認識配列が記載されており、天然のおよび操作されたチロシンリコンビナーゼ(表7)、ラージセリンインテグラーゼ(表8)、セリンリゾルバーゼ(表9)、およびチロシンインテグラーゼ(表10)を包含する。増強されたゲノム取り入れ率を実証する改変された標的配列もまたいくつかのSSRについて記載されている^22-30。天然のリコンビナーゼに加えて、別物の特異性を有するプログラム可能なリコンビナーゼが開発されている^31～40。所望の適用に依存して、PEを用いて、これらの認識配列の1つ以上が、規定された位置付け、例えばセーフハーバー座位においてゲノム上に導入され得る^41～43。

例えば、プライム編集によるゲノム上の単一のリコンビナーゼ認識配列の導入は、DNAドナー鋳型との取り入れ的な組み換えをもたらすであろう(図64b)。ヒト細胞においてロバストに作動するセリンインテグラーゼは、遺伝子取り入れに特に良く適し得る^44,45。

加えて、標的のアイデンティティーおよび向きに依存して、2つのリコンビナーゼ認識配列の導入は介在配列の欠失、介在配列の逆位、染色体転座、またはカセット交換をもたらし得る(図64c～f)。すでにリコンビナーゼ標的に密に似ている内生配列を選ぶことによって、完全なリコンビナーゼ標的を導入するために要求される編集の範囲は縮減されるであろう。

最後に、いくつかのリコンビナーゼは、ネイティブに生起する偽部位(pseudosite)においてヒトまたは真核ゲノムに取り入れすることが実証されている^46～64。PE編集は、これらの天然の偽部位における取り入れ率を増強するために、または代替的には欲されないオフターゲット配列としての用をなし得る偽部位を消去するために、これらの座位を改変するために用いられ得る。

本開示は、PEを用いて真核ゲノム上にリコンビナーゼ標的配列を導入するための一般的な方法論を記載する。これの適用は無限に近い。ゲノム編集反応はCRISPR/Cas9タンパク質と逆転写酵素ドメインとのキメラ融合体の「プライム編集因子」による使用を意図され、これはカスタムのプライム編集ガイドRNA(PEgRNA)を利用する。さらに伸長して、Cas9ツールおよび相同組み換え修復(HDR)経路は、いくつかの技術を用いてインデル率を低下させることによって、DNA鋳型からリコンビナーゼ認識配列を導入するためにもまた有効利用され得る^65～67。ヒト細胞培養における概念実証実験が図65に示されている。

次のいくつかの表は、リコンビナーゼ認識配列のPEによって導かれる組み入れに関して上の記載に引用され、用いられ得る例示のリコンビナーゼとPEによって組み入れられ得るそれらの対応するリコンビナーゼ認識配列とのリストを提供する。
表7.チロシンリコンビナーゼおよびSSR標的配列。

表8.ラージセリンインテグラーゼおよびSSR標的配列。

表9.セリンリゾルバーゼおよびSSR標的配列。

表10.チロシンインテグラーゼおよび標的配列。

種々の他の側面では、本開示は、1つ以上のリコンビナーゼ認識配列を組み入れるためにPEを用いる方法と、部位特異的な組み換えへのそれらの使用とに関する。

いくつかの態様では、部位特異的な組み換えは、種々の組み換えアウトカム、例えば切除、取り入れ、逆位、またはDNAフラグメントの交換を成就させ得る。

いくつかの態様では、方法は、2つ以上の核酸(例えばDNA)分子の2つ以上の領域のまたはそれらの間の組み換えを誘導することにとって有用である。他の態様において、方法は、単一の核酸分子(例えばDNA)の2つ以上の領域のまたはそれらの間の組み換えを誘導することにとって有用である。

いくつかの態様では、本開示は、部位特異的な組み換えによってドナーDNA鋳型を取り入れするための方法を提供し:(a)プライム編集によってゲノム座位にリコンビナーゼ認識配列を組み入れること;(b)リコンビナーゼの存在下において、リコンビナーゼ認識配列をもまた含むDNAドナー鋳型とゲノム座位を接触させることを含む。

他の態様において、本開示は、部位特異的な組み換えによってゲノム領域を欠失させるための方法を提供し:(a)プライム編集によってゲノム座位にリコンビナーゼ認識配列のペアを組み入れること;(b)ゲノム座位をリコンビナーゼと接触させることを含み、それによって、リコンビナーゼ認識配列のペア間のゲノム領域の欠失を触媒する。

さらに他の態様において、本開示は、部位特異的な組み換えによってゲノム領域を逆位させるための方法を提供し:(a)プライム編集によってゲノム座位にリコンビナーゼ認識配列のペアを組み入れること;(b)ゲノム座位をリコンビナーゼと接触させることを含み、それによって、リコンビナーゼ認識配列のペア間のゲノム領域の逆位を触媒する。

なお他の態様において、本開示は、第1のゲノム部位と第2のゲノム部位との間の染色体転座を誘導するための方法を提供し:(a)プライム編集によって第1のゲノム座位に第1のリコンビナーゼ認識配列を組み入れること;(b)プライム編集によって第2のゲノム座位に第2のリコンビナーゼ認識配列を組み入れること;(c)第1および第2のゲノム座位をリコンビナーゼと接触させることを含み、それによって、第1および第2のゲノム座位の染色体転座を触媒する。

他の態様において、本開示は、ゲノム座位とカセットを含むドナーDNAとの間のカセット交換を誘導するための方法を提供し:(a)プライム編集によって第1のゲノム座位に第1のリコンビナーゼ認識配列を組み入れること;(b)プライム編集によって第2のゲノム座位に第2のリコンビナーゼ認識配列を組み入れること;(c)第1および第2のリコンビナーゼ認識配列によってフランキングされているカセットを含むドナーDNAおよびリコンビナーゼと第1および第2のゲノム座位を接触させることを含み、それによって、フランキングされたゲノム座位とDNAドナー上のカセットとの交換を触媒する。

ゲノム上の1つよりも多くのリコンビナーゼ認識配列の挿入が関わる種々の態様では、リコンビナーゼ認識配列は同じかまたは異なり得る。いくつかの態様では、リコンビナーゼ認識配列は同じである。他の態様において、リコンビナーゼ認識配列は異なる。

種々の態様において、リコンビナーゼはチロシンリコンビナーゼ、例えばCre、Dre、Vcre、Scre、Flp、B2、B3、Kw、R、TD1-40、Vika、Nigri、Panto、Kd、Fre、Cre(ALSHG)、Tre、Brec1、またはCre-R3M3であり得、表7に示されているとおりである。かかる態様では、リコンビナーゼ認識配列は使用中のリコンビナーゼに対応する表7のRRSであり得る。

種々の他の態様において、リコンビナーゼはラージセリンリコンビナーゼ、例えばBxb1、PhiC31、R4、phiBT1、MJ1、MR11、TP901-1、A118、V153、phiRV1、phi370.1、TG1、WB、BL3、SprA、phiJoe、phiK38、Int2、Int3、Int4、Int7、Int8、Int9、Int10、Int11、Int12、Int13、L1、peaches、Bxz2、またはSV1であり得、表8に示されているとおりである。かかる態様では、リコンビナーゼ認識配列は使用中のリコンビナーゼに対応する表8のRRSであり得る。

なお他の態様において、リコンビナーゼはセリンリコンビナーゼ、例えばBxb1、PhiC31、R4、phiBT1、MJ1、MR11、TP901-1、A118、V153、phiRV1、phi370.1、TG1、WB、BL3、SprA、phiJoe、phiK38、Int2、Int3、Int4、Int7、Int8、Int9、Int10、Int11、Int12、Int13、L1、peaches、Bxz2、またはSV1であり得、表8に示されているとおりである。かかる態様では、リコンビナーゼ認識配列は使用中のリコンビナーゼに対応する表8のRRSであり得る。

他の態様において、リコンビナーゼは表9に示されているとおりGin、Cin、Hin、Min、またはSinなどのセリンリゾルバーゼであり得る。かかる態様では、リコンビナーゼ認識配列は、使用中のリコンビナーゼに対応する表9のRRSであり得る。

種々の他の態様において、リコンビナーゼは表10に示されているとおりHK022、P22、またはL5などのチロシンインテグラーゼであり得る。かかる態様では、リコンビナーゼ認識配列は、使用中のリコンビナーゼに対応する表10のRRSであり得る。

いくつかの態様では、PEによる部位特異的な組み換えのための方法のいずれかがインビボでまたはin vitroで行われ得る。いくつかの態様では、部位特異的な組み換えための方法のいずれかが細胞に行われる(例えば、細胞のゲノムDNAを組み換える)。細胞は原核または真核であり得る。真核細胞などの細胞は本明細書に記載の対象などの個体(例えば、ヒト対象)中にあり得る。本明細書に記載の方法は、in vitroおよびインビボの細胞の遺伝子改変にとって、例えば、トランスジェニック細胞、細胞株、もしくは動物の生成という文脈において、または対象の細胞のゲノム配列の変改、例えば遺伝子欠陥の修正において、有用である。

セクションLに引用された参考文献
以下の参考文献の各々は例17に引用され、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

[8]処置の方法
本開示は、例示されるとおりであるがプリオン病(例えば本願の例5)、トリヌクレオチド反復拡大疾患(例えば本願の例3)、またはCDKL5欠損症障害(CDD)(例えば本願の例23)に限定されない、本願において提供されるプライム編集システムによって修正され得る点変異または他の変異(例えば、欠失、挿入、逆位、重複など)に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患と診断された対象の処置のための方法を提供する。

実質的にいずれかの疾患を引き起こす遺伝子欠陥は、プライム編集を用いることによって修復され得る。これは、napDNAbpおよびポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)を包含する適当なプライム編集因子融合タンパク質の選択と、(a)編集部位を含有する適当な標的DNAを標的化し、(b)ニック部位の直ちに下流の内生鎖を押し除け、置き換える所望の編集を包含するニック部位の3’端からのDNAの一本鎖の合成のための鋳型を提供するようにデザインされる適当なPEgRNAのデザインとを包含する。プライム編集は、限定なしに、(a)変異を修正する変化をヌクレオチド配列に組み入れ、(b)タンパク質およびRNAタグを組み入れ、(c)免疫エピトープを目当てのタンパク質上に組み入れ、(d)誘導可能な二量体化ドメインをタンパク質に組み入れ、(e)バイオ分子のその活性を変改するための配列を組み入れまたは除去、(f)特定の遺伝子変化を導くためのリコンビナーゼ標的部位を組み入れ、および(g)エラーを起こしやすいRTを用いることによって標的配列の変異導入をするために用いられ得る。

障害を処置する方法には、早期のステップとして、本明細書に記載の方法に従う適当なPEgRNAおよびプライム編集因子融合タンパク質のデザインが関わり、これらは、考慮に入れられ得るいくつもの考慮事項を包含する。例えば:
(a)1つ以上の核酸塩基改変がプライム編集因子によって組み入れされることを望まれる標的配列、すなわちヌクレオチド配列;
(b)標的配列上のカットされる部位の位置付け、すなわち、プライム編集因子が一本鎖ニックを誘導して、ニックの1つの側に3'端RTプライマー配列およびニックの他の側に5'端の内生フラップ(これは究極的にはFEN1またはその等価物によって除去され、3'ssDNAフラップによって置き換えられる)を生出するであろう特定の核酸塩基位置。カットされた部位は3'端プライマー配列を生出し、これはRNA依存的なDNA重合の間にPE融合タンパク質(例えばRT酵素)のポリメラーゼによって伸長されるようになって、所望の編集を含有する3'ssDNAフラップを生出し、これがそれから標的配列上の5'内生DNAフラップを置き換える;
(c)利用可能なPAM配列(標準的なSpCas9 PAM部位、および拡張されたまたは異なるPAM特異性を有するCas9バリアントおよび等価物によって認識される非標準的なPAM部位を包含する);
(d)PAM鎖上の利用可能なPAM配列とカットされる部位の位置付けとの間の間隔;
(e)用いられるべき利用可能なプライム編集因子の具体的なCas9、Cas9バリアント、またはCas9等価物(これは部分的には利用可能なPAMによって記述される);
(f)プライマー結合部位の配列および長さ;
(g)編集鋳型の配列および長さ;
(h)相同アームの配列および長さ;
(i)スペーサー配列および長さ;ならびに
(j)gRNAコア配列。

好適なPEgRNAと任意に第2部位ニッキングのためのニッキングsgRNAデザインガイドとが、説明書の次の例示の(exemplarly)ステップバイステップのセットによってデザインされ得る。これは上の考慮事項の1つ以上を考慮に入れる。ステップは図70A-70Iに示されている例を参照する。
1．標的配列および編集を定める。所望の編集(点変異、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせ)の位置付けを中心とした標的DNA領域(～200bp)の配列をリトリーブする。図70Aを見よ。
2．標的PAMを位置付ける。所望の編集位置付けに対して近位のPAMを同定する。PAMは所望の編集位置付けに対して近位のDNAのどちらかの鎖上に同定され得る。編集位置に近接するPAMが好ましいが(すなわち、ニック部位は編集位置から30nt未満である。または編集位置からニック部位まで29nt、28nt、27nt、26nt、25nt、24nt、23nt、22nt、21nt、20nt、19nt、18nt、17nt、16nt、15nt、14nt、13nt、12nt、11nt、10nt、9nt、8nt、7nt、6nt、5nt、4nt、3nt、もしくは2nt未満)、編集位置から≧30ntのニックを置くプロトスペーサーおよびPAMを用いて編集を組み入れることが可能である。図70Bを見よ。
3．ニック部位を位置付ける。考慮されている各PAMについて、対応するニック部位とどの鎖上かとを同定する。Sp Cas9 H840Aニッカーゼでは、切断はNGG PAMの5'の第3および第4の塩基の間においてPAM含有鎖に生起する。全ての編集されるヌクレオチドはニック部位の3'に存在しなければならない。そのため、適当なPAMはPAM含有鎖上の標的の編集の5'にニックを置かなければならない。下で示される例では、2つの可能なPAMがある。単純のために、残りのステップはPAM 1のみを用いるPEgRNAのデザインを実証する。図70Cを見よ。
4．スペーサー配列をデザインする。Sp Cas9のプロトスペーサーはPAM含有鎖上のNGG PAMの5'の20ヌクレオチドに対応する。効率的なPol III転写開始はGが最初に転写されるヌクレオチドであることを要求する。プロトスペーサーの最初のヌクレオチドがGである場合には、PEgRNAのスペーサー配列は単純にプロトスペーサー配列である。プロトスペーサーの最初のヌクレオチドがGではない場合には、PEgRNAのスペーサー配列は、G、次にプロトスペーサー配列である。図70Dを見よ。
5．プライマー結合部位(PBS)をデザインする。出発アレル配列を用いて、PAM含有鎖上のDNAプライマーを同定する。DNAプライマーの3'端はニック部位のちょうど上流のヌクレオチドである(すなわち、Sp Cas9ではNGG PAMの5'の第4の塩基)。PE2およびPE3への使用のための一般的なデザイン原理として、DNAプライマーに対する12から13ヌクレオチドの相補性を含有するPEgRNAプライマー結合部位(PBS)が、～40-60％GC含量を含有する配列に用いられ得る。低いGC含量を有する配列では、より長い(14から15nt)PBSが試験されるべきである。より高いGC含量を有する配列では、より短い(8から11nt)PBSが試験されるべきである。GC含量にかかわらず、最適なPBS配列は経験的に決定されるはずである。長さpのPBS配列をデザインするためには、出発アレル配列を用いて、PAM含有鎖上のニック部位の5'の最初のpヌクレオチドの逆相補体を取る。図70Eを見よ。
6．RT鋳型(またはDNA合成鋳型)をデザインする。RT鋳型(または、ポリメラーゼが逆転写酵素ではないところでは、DNA合成鋳型)は、デザインされた編集と編集に隣接する配列に対する相同性とをコードする。1つの態様では、これらの領域は図3Dおよび図3EのDNA合成鋳型に対応し、DNA合成鋳型は「編集鋳型」および「相同アーム」を含む。最適なRT鋳型長さは標的部位に基づいて変わる。ショートレンジ編集(位置+1から+6)では、短い(9から12nt)、中程度の(13から16nt)、および長い(17から20nt)RT鋳型を試験することが推奨される。ロングレンジ編集(位置+7以降)では、十分な3'DNAフラップ相同性を許すように、編集の位置から少なくとも5nt(好ましくは10nt以上)伸長するRT鋳型を用いることが推奨される。ロングレンジ編集では、機能的なデザインを同定するために、いくつかのRT鋳型がスクリーニングされるべきである。より大きい挿入および欠失(≧5nt)では、RT鋳型上へのより多大な3'相同性(～20nt以上)の組み込みが推奨される。RT鋳型が、逆転写されるDNA産物上の最後のヌクレオチドとしてのG(PEgRNAのRT鋳型上のCに対応する)の合成をコードするときには、編集効率は典型的には損なわれる。多くのRT鋳型が効率的なプライム編集を支持するので、RT鋳型をデザインするときには、最後の合成されるヌクレオチドとしてのGの回避が推奨される。長さrのRT鋳型配列をデザインするためには、所望のアレル配列を用い、PAMを元々含有した鎖上のニック部位の3'の最初のrヌクレオチドの逆相補体を取る。SNP編集と比較して、同じ長さのRT鋳型を用いる挿入または欠失編集は同一の相同性を含有しないであろうということに注意せよ。図70Fを見よ。
7．完全なPEgRNA配列をアセンブリする。PEgRNA構成要素を次の順序(5'から3')でコンカテネーションする:スペーサー、骨格、RT鋳型、およびPBS。図70Gを見よ。
8．PE3のためのニッキングsgRNAをデザインする。編集の上流および下流の非編集鎖上のPAMを同定する。最適なニッキング位置は高度に座位依存的であり、経験的に決定されるはずである。一般的に、PEgRNAによって誘導されるニックの向かいの位置の40から90ヌクレオチド5'に置かれたニックは、より高い編集収量およびより少数のインデルに至る。ニッキングsgRNAは、出発アレル上の20ntプロトスペーサーにマッチするスペーサー配列を有する。プロトスペーサーがGで始まらない場合には5'Gの追加を有する。図70Hを見よ。
9．PE3bニッキングsgRNAをデザインする。PAMが相補鎖に存在し、その対応するプロトスペーサーが編集のために標的化される配列とオーバーラップする場合には、この編集はPE3bシステムの候補であり得る。PE3bシステムでは、ニッキングsgRNAのスペーサー配列は出発アレルではなく所望の編集されたアレルの配列にマッチする。編集されるヌクレオチド(単数または複数)がニッキングsgRNAプロトスペーサーのシード領域(PAMに隣接する～10nt)内に収まるときには、PE3bシステムは効率的に作動する。これは、編集された鎖の組み入れ後まで相補鎖のニッキングを防止し、標的DNAに結合することについてのPEgRNAおよびsgRNAの間の競合を防止する。PE3bは、両方の鎖上の同時のニックの生成をもまた回避し、それゆえに、高い編集効率を維持しながらインデル形成を有意に縮減する。PE3b sgRNAは所望のアレルの20ntプロトスペーサーにマッチするスペーサー配列を有するべきである。必要とされる場合には5'Gの追加を有する。図70Iを見よ。

好適なPEgRNAおよび第2部位ニッキングsgRNAをデザインするための上のステップバイステップのプロセスは、決して限定することを意味されない。本開示は上に記載されているステップバイステップのプロセスのバリエーションを企図し、これらは当業者によってそれから導出可能であろう。

ひとたび好適なPEgRNAおよびPE融合タンパク質が選択/デザインされると、それらは、好適な方法論によって、例えば、ベクターに基づくトランスフェクション(これにおいては、ベクターによるトランスフェクションによって細胞内で発現される、PEgRNAおよびPE融合タンパク質をコードするDNAを含む1つ以上のベクター)、送達フォーマット(例えば、脂質粒子、ナノ粒子)でPEgRNAと複合体化したPE融合タンパク質の直接的送達(例えばRNP送達)によって、またはmRNAに基づく送達システムによって、投与され得る。かかる方法は本願において本開示によって記載され、いずれかの公知の方法が利用され得る。

目当ての標的DNAに接触することによって、所望の編集がそれに組み入れされるようになるようにして、PEgRNAおよびPE融合タンパク質(または一緒にPE複合体と言われる)は治療学的有効量で細胞に送達され得る。

適当な細胞への送達が実現可能である限りは、いずれかの疾患は、着想上はかかる方法によって処置可能である。当業者は、意図される目的および意図される標的細胞に適するようにPE送達方法論を選ぶおよび/またはセレクションする能力があるであろう。

例えば、いくつかの態様において、かかる疾患(例として、上に記載のとおりの点突然変異に関連するがん)を有する対象へ、有効量の、本明細書に記載のプライム編集系(所望の遺伝子変化を含むドナーDNA分子の存在下での相同特異的(homology-directed)修復によって媒介されるとおりに、点突然変異を修正するかまたは疾患関連遺伝子中へ不活性化突然変異を導入する)を投与することを含む方法が提供される。いくつかの態様において、かかる疾患(例として、上に記載のとおりの点突然変異に関連するがん)を有する対象へ、有効量の、本明細書に記載のプライム編集系(点突然変異を修正するかまたは疾患関連遺伝子中へ不活性化突然変異を導入する)を投与することを含む方法が提供される。いくつかの態様において、疾患は、増殖性疾患である。いくつかの態様において、疾患は、遺伝的疾患である。いくつかの態様において、疾患は、新生物疾患である。いくつかの態様において、疾患は、代謝疾患である。いくつかの態様において、疾患は、リソソーム蓄積症である。点突然変異を修正するかまたは疾患関連遺伝子中へ不活性化突然変異を導入することによって処置され得る他の疾患は当業者に知られており、本開示はこの点において限定されない。

本開示は、追加の疾患または障害(例として、TPRT媒介の遺伝子編集によって修正され得る点突然変異に関連するかもしくはこれによって引き起こされる疾患または障害)の処置のための方法を提供する。いくつかのかかる疾患は本明細書に記載されており、本明細書に提供されるストラテジーおよび融合タンパク質で処置され得る追加の好適な疾患は本開示に基づき当業者に明らかであろう。例示の好適な疾患および障害は下に列挙される。夫々の配列における特定の位置または残基のナンバリングが、使用される具体的なタンパク質およびナンバリングスキームに依存することは、理解されるであろう。ナンバリングは、例として、成熟したタンパク質の前駆体および成熟したタンパク質それ自体において異なることもあり、種ごと(from species to species)の配列の差異はナンバリングに影響を及ぼすこともある。当業者は、当該技術分野において周知である方法によって(例として、配列の整列および相同の残基の決定によって)、いずれの相同のタンパク質および夫々のコード核酸における夫々の残基を同定することができるであろう。例示の好適な疾患および障害は、限定せずに以下を包含する:2-メチル-3-ヒドロキシ酪酸尿症;3ベータ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ欠損症;3-メチルグルタコン酸尿症;3-オキソ-5アルファ-ステロイドデルタ4-デヒドロゲナーゼ欠損症;46,XY性転換、1型,3型および5型;5-オキソプロリナーゼ欠損症;6-ピルボイル-テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症;アースコグ症候群;アーセ症候群;2型軟骨無発生症;色覚異常2および7;後天性QT延長症候群;シンゲル(Schinzel)型先端脳梁症候群;先端大腿骨頭異形成症;ホルモン耐性の有無に関わらない先端骨形成不全症2;先端紅斑角皮症(Acroerythrokeratoderma);先端短肢異形成症;Acth-非依存性の副腎皮質大結節性過形成2;活性化PI3K-delta症候群;急性間欠性ポルフィリン症;アシル-CoAデヒドロゲナーゼファミリー、メンバー9の欠損症;アダムス-オリバー症候群5および6;アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症;アデニル酸キナーゼ欠損症;アデニロコハク酸リアーゼ欠損症に起因する溶血性貧血;青年期のネフロン癆;腎・肝・膵異形成症;7型メッケル症候群;副腎白質ジストロフィー;成人接合部型表皮水疱症;表皮水疱症、接合部型、限局性バリアント;成人神経セロイドリポフスチン症;成人神経セロイドリポフスチン症;成人発症の、眼球運動失効を伴う運動失調症;ADULT症候群;無フィブリノーゲン血症および先天性無フィブリノーゲン血症;常染色体潜性無ガンマグロブリン血症2;加齢性黄斑変性症3,6,11および12;アイカルディ・グティエール症候群1,4および5;凍傷状狼瘡1;アラジール症候群1および2;アレキサンダー病;アルカプトン尿症;アラン・ハーンドン・ダドリー症候群;先天性の汎発性脱毛症;アルパース脳症;アルファ-1-抗トリプシン欠損症;常染色体優性の、常染色体劣性の、およびX連鎖劣性のアルポート症候群;アルツハイマー病、家族性、3、痙性対麻痺および運動失行あり;アルツハイマー病、1型,3型および4型;低石灰化型および低成熟型、IIA1遺伝性エナメル質形成不全症;アミノアシラーゼ1欠損症;アーミッシュ小児てんかん症候群;アミロイド形成性トランスサイレチンアミロイドーシス;トランスサイレチンに関する、アミロイド心筋症;心筋症;筋萎縮性側索硬化症1型,6型,15型(前頭側頭型認知症の有無に関わらない),22型(前頭側頭型認知症の有無に関わらない),および10型;TARDBPに関する、TDP43封入体を伴う前頭側頭型認知症;アンダーマン(Andermann)症候群;アンダーセン・タウィル症候群;先天性QT延長症候群;G6PD欠損症に起因する非球形溶血性の貧血症;アンジェルマン(Angelman)症候群;小頭症を伴う、新生児発症の重症脳症;自閉症、X連鎖性3に対する感受性;腎症、動脈瘤、および筋痙攣を伴う遺伝性の血管症;アンジオテンシンi変換酵素、穏やかな血清増加;無虹彩症、小脳性運動失調症、および精神遅滞;無爪症;アンチトロンビンIII欠損症;性器奇形およびステロイド産生異常を伴うアントレー・ビクスラー症候群;家族性胸部大動脈瘤4,6および9;胸部大動脈瘤および大動脈解離;多臓器平滑筋機能障害症候群(multisystemic smooth muscle dysfunction syndrome);もやもや病5;再生不良性貧血;見かけの鉱質コルチコイド過剰;アルギナーゼ欠損症;アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症;アロマターゼ欠損症;5型,8型および10型不整脈原性右室心筋症;原発性家族性肥大型心筋症;先天性多発性関節拘縮症、末梢の、X連鎖性;関節拘縮-腎機能障害-胆汁うっ滞症候群;関節拘縮、腎機能障害、および胆汁うっ滞2;アスパラギン合成酵素欠損症;神経細胞移動の異常性;ビタミンE欠損症を伴う運動失調症;感覚性の、常染色体優性の、運動失調症;運動失調症-毛細血管拡張症候群;遺伝性がん素因症候群(hereditary cancer-predisposing syndrome);無トランスフェリン血症;家族性の心房細動11,12,13および16;心房中隔欠損症2,4および7(心室伝導欠陥の有無に関わらない);心房停止2;房室中隔欠損症4;遺伝性眼球萎縮;ATR-X症候群;耳介下顎骨症候群2;自己免疫疾患、多臓器、小児発症;1a型自己免疫リンパ増殖性症候群;常染色体優性の無汗性外胚葉形成不全症;ミトコンドリアDNA欠失1および3を伴う、常染色体優性の進行性外眼筋麻痺;常染色体優性の捻転ジストニア4;常染色体劣性の中心核ミオパチー;常染色体劣性の先天性魚鱗癬1,2,3,4Aおよび4B;常染色体劣性のIA型および1B型皮膚弛緩症;常染色体劣性の無汗性外胚葉形成不全症候群;外胚葉異形成症11b;発汗低下/毛髪/歯型、常染色体劣性;常染色体劣性低リン酸血症性の骨疾患;3型アクセンフェルト・リーガー症候群;ベインブリッジ・ロパーズ症候群;バナヤン・ライリー・ルバルカ症候群;PTEN過誤腫症候群;バライスター(Baraitser)・ウインター症候群1および2;バラカート症候群;バルデ・ビードル症候群1,11,16および19;2型裸リンパ球症候群、相補群E;出生前2型バーター症候群;バーター症候群の3型,低カルシウム尿を伴う3型,および4型;特発性基底核石灰化症4;連珠毛;良性家族性血尿;良性家族性新生児発作1および2;発作、良性家族性新生児1、および/またはミオキミア;発作、早期小児てんかん性脳症7;良性家族性新生児-小児発作;良性遺伝性舞踏病;心筋症を伴う良性肩甲骨骨膜筋ジストロフィー;A1型およびA2型(常染色体優性)ベルナール・スーリエ症候群;ベストロフィノパチー(常染色体劣性);ベータ サラセミア;ベスレムミオパチーおよびベスレムミオパチー2;ビエッティ結晶性角膜網膜ジストロフィー;胆汁酸合成欠損症、先天性2;ビオチニダーゼ欠損症;バーク・バレル(Birk Barel)精神遅滞異形症候群;眼裂縮小、眼瞼下垂症、および眼瞼内反症;ブルーム症候群;ベルエソン・フォルスマン・レーマン症候群;バウチャー・ノイハウザー(Boucher Neuhauser)症候群;A1型およびA2型乳頭症;高血圧症を伴う乳頭症;出血を伴う脳小血管疾患;分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ欠損症;分岐鎖症候群2および3;乳がん、早期発症;乳房卵巣がん、家族性1,2および4;角膜脆性症候群2;ブロディミオパチー;汗の塩化物上昇の有無に関わらない気管支拡張症3;ブラウン・ビアレット・ヴァン レアレ症候群およびブラウン・ビアレット・ヴァン レアレ症候群2;ブルガダ症候群;ブルガダ症候群1;心室細動;発作性家族性心室細動;ブルガダ症候群およびブルガダ症候群4;QT延長症候群;心臓性突然死;標的(Bull eye)黄斑ジストロフィー;スターガート病4;錐体桿体ジストロフィー12;水疱性魚鱗癬様紅皮症;バーン・マッキューン(Burn-Mckeown)症候群;家族性カンジダ症2,5,6および8;I型およびII型糖タンパク質糖鎖不全症候群;高アンモニア血症に起因する炭酸脱水酵素VA欠損症;結腸癌;心筋不整脈;QT延長症候群、LQT1亜型;チトクロームcオキシダーゼ欠損症に起因する致死性乳児心臓脳筋症;心筋症;ダノン病;肥大型心筋症;左心室非圧縮心筋症;カルネヴァーレ症候群;1型カーニー複合体;カルニチンアシルカルニチントランスロカーゼ欠損症;カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI,II,II(遅発性)およびII(小児性)欠損症;白内障1,4、常染色体優性、常染色体優性の多型、微小角膜を伴う、コポック様、若年性、微小角膜と糖尿を伴う、および核びまん性非進行性;カテコラミン作動性多形心室頻拍;尾状回帰症候群;家族性Cd8欠損症;中心核疾患;1,9および16番染色体の中心核不安定性ならびに免疫不全;進行性外眼筋を伴う小児小脳性運動失調症および小脳性運動失調症、精神遅滞、ならびに平衡障害症候群2;APPに関する脳アミロイド血管症;大脳皮質下梗塞および白質脳症を伴う、脳の常染色体優性および劣性の動脈症;脳海綿状奇形2;脳・眼・顔・骨格症候群2;脳-眼-顔-骨格症候群;石灰化および嚢胞を伴う脳網膜微小血管症;セロイドリポフスチン症神経細胞2,6,7および10;Ch＼xc3＼xa9diak・東症候群;成人型チェディアック・東症候群;シャルコー・マリー・トゥース病の1B型,2B2型,2C型,2F型,2I型,2U型(軸索性),1C型(脱髄性),優性中間C型,劣性中間A型,2A2型,4C型,4D型,4H型,IF型,IVF型およびX型;肩甲骨腹側脊髄筋萎縮症;遠位型脊髄性筋萎縮症、先天性非進行性;脊髄筋萎縮症、遠位型、常染色体劣性、5;CHARGE関連;小児低リン酸塩症;成人低リン酸塩症;胆嚢炎;進行性家族性肝内胆汁うっ滞3;妊娠性肝内胆汁うっ滞3;コレスタノール蓄積症;コレステロールモノオキシゲナーゼ(側鎖切断)欠損症;ブロムストランド型軟骨異形成症;穿刺性軟骨異形成症1、X連鎖劣性および2 X連鎖優性;CHOPS症候群;慢性肉芽腫性疾患、常染色体劣性チトクロームb陽性、1型および2型;チュドリー・マッカラー症候群; 原発性毛様体ジスキネジア、7,11,15,20および22;I型シトルリン血症;I型およびII型シトルリン血症;頭蓋骨裂傷症;C様症候群;A型コケイン症候群;原発性補酵素Q10欠乏症、1,4および7;コフィン・シリス/知的障害;コフィン・ローリー症候群;コーエン症候群;寒冷時発汗症候群1;コール・カーペンター症候群2;肉芽腫を伴う、細胞性および体液性免疫複合欠損症;d-2-およびl-2-ヒドロキシグルタル酸複合尿症;マロン酸およびメチルマロン酸複合尿症;酸化的リン酸化複合欠損症1,3,4,12,15および25;一部および全部の17-アルファ-ヒドロキシラーゼ/17,20-リアーゼ複合欠損症;共通可変性免疫不全症9;c1インヒビターの機能不全に起因する補体成分4の部分欠損;補体因子B欠損症;錐体単色症;錐体桿体ジストロフィー2および6;錐体桿体ジストロフィー遺伝性エナメル質形成不全症;先天性副腎過形成および先天性副腎低形成、X連鎖性;先天性無巨核球性血小板減少症;先天性無虹彩症;先天性中枢性低換気;ヒルシュスプルング病3;先天性収縮性腕十二指腸症;四肢および顔面の先天性拘縮、低緊張、および発育遅延;グリコシル化の先天性障害1B型,1D型,1G型,1H型,1J型,1K型,1N型,1P型,2C型,2J型,2K型,IIm型;I型およびII型先天性赤血球異形成貧血;顔面の先天性外胚葉異形成症;先天性赤血球生成性ポルフィリン症;2型先天性全身性リポジストロフィー;先天性心疾患、多発型2;先天性心疾患;大動脈弓離断症;先天性脂肪腫性過成長、血管奇形、および表皮母斑;非小細胞肺がん;卵巣の新生物;心伝導系障害、非特異性;先天性微絨毛萎縮症;先天性筋ジストロフィー;LAMA2の部分的欠損に起因する先天性筋ジストロフィー;先天性筋ジストロフィー－脳および眼の異常を伴うジストログリカノパチー、A2型,A7型,A8型,A11型およびA14型;先天性筋ジストロフィー－精神遅滞を伴うジストログリカノパチー、B2型,B3型,B5型およびB15型;先天性筋ジストロフィー－精神遅滞を伴わないジストログリカノパチー、B5型;先天性筋肥大－大脳症候群;先天性筋無力症候群、アセタゾールアミド反応性;繊維型不均衡を伴う先天性ミオパチー;先天性眼球コロボマ;先天性静止型夜盲症、1A型,1B型,1C型,1E型,1F型および2A型;コプロポルフィリン症;角膜平板症2;角膜ジストロフィー、フックス内皮性4;2型角膜内皮性ジストロフィー;角膜脆弱性ケラトグロブ、青色強膜、および関節過度可動性;コーネリア ド ランゲ症候群1および5;常染色体優性の冠動脈疾患2;冠状動脈疾患;高αリポタンパク質血症2; 皮質異形成症(他の脳奇形との複合)5および6;後頭部の皮質奇形;コルチコステロイド結合グロブリン欠損症;2型コルチコステロンメチルオキシダーゼ欠損症;コステロ症候群;カウデン症候群1;扁平股;常染色体優性の頭蓋骨異形成症;頭蓋縫合早期癒合症1お
よび4;頭蓋縫合早期癒合症および歯異常;クレアチン欠損症、X連鎖;クルーゾン症候群;潜在眼球症候群;停留精巣、片側または両側;クッシング指節癒合症;皮膚悪性黒色腫1;骨異栄養症と、肺、胃腸、および泌尿器の重度の異常とを伴う皮膚弛緩症;チアノーゼ、一過的な新生児のおよび非定型の腎症;嚢胞性線維症;シスチン尿症;シトクロムcオキシダーゼi欠損症;シトクロムcオキシダーゼ欠損症;D-2-ヒドロキシグルタル酸尿症2;分節性ダリエー病;内耳形成不全、小耳症、および小歯症(LAMM)を伴う難聴;難聴、常染色体優性3a,4,12,13,15、常染色体優性の非症候性感音性17,20および65;難聴、常染色体劣性1A,2,3,6,8,9,12,15,16,18b,22,28,31,44,49,63,77,86および89;難聴、蝸牛の、近視および知的障害あり、前庭障害なし、常染色体優性、X連鎖2;2-メチルブチリル-CoA脱水素酵素の欠損症;3-ヒドロキシアシル-CoA脱水素酵素の欠損症;アルファ-マンノシダーゼの欠損症;芳香族-L-アミノ酸脱炭酸酵素の欠損症;ビスホスホグリセリン酸ムターゼの欠損症;ブチリル-CoA脱水素酵素の欠損症;フェロキシダーゼの欠損症;ガラクトキナーゼの欠損症;グアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼの欠損症;ヒアルロノグルコサミニダーゼの欠損症;リボース-5-リン酸イソメラーゼの欠損症;ステロイド11-ベータ-モノオキシゲナーゼの欠損症;UDPグルコース-ヘキソース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの欠損症;キサンチンオキシダーゼの欠損症;デジェリン・ソッタス病;シャルコー・マリー・トゥース病、ID型およびIVF型;デジェリン・ソッタス症候群、常染色体優性;樹状細胞、単球、Bリンパ球、およびナチュラルキラーリンパ球の欠損症;デビュクワ(Desbuquois)異形成症2; デビュクワ症候群;DFNA 2非症候性の聴力低下;視神経萎縮および難聴を伴う糖尿病および尿崩症;2型糖尿病、およびインスリン依存性20;ダイアモンド・ブラックファン貧血1,5,8および10;下痢3(分泌性ナトリウム、先天性、症候性)、および5(タフティング腸症(tufting enteropathy)を伴う、先天性);ジカルボキシルアミノ酸尿症;びまん性掌蹠角化症、ボスニア型;デジトレノ脳症候群;ジヒドロプテリジン還元酵素欠損症;拡張型心筋症1A,1AA,1C,1G,1BB,1DD,1FF,1HH,1I,1KK,1N,1S,1Yおよび3B;左心室非圧縮3;シトクロムp450酸化還元酵素欠損症に起因するステロイド産生異常;遠位型関節拘縮2B型;遠位型遺伝性運動ニューロン症2B型;遠位型ミオパチーMarkesbery-Griggs型;遠位型脊髄性筋萎縮症、X連鎖3;二重睫毛・リンパ浮腫症候群;皮膚の欠如を伴う、優性栄養傷害性表皮水疱症;優性遺伝性視神経萎縮症;ドンナイ・バロウ症候群;ドーパミン ベータ水酸化酵素欠損症;ドーパミン受容体d2、脳内密度低下;ダウリング・デゴス病4;ドイン蜂巣状網膜ジストロフィー;マラティア・レベンチーヌ(Malattia leventinese);2型デュアン症候群;デュビン・ジョンソン症候群;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ベッカー型筋ジストロフィー;異常フィブリノーゲン血症;常染色体優性の先天性角化異常症および常染色体優性、3;常染色体劣性の先天性角化異常症1,3,4および5;X連鎖性の先天性角化異常症;顔面ミオキミアを伴う、家族性ジスキネジア;プラスミノーゲン分子異常症;ジストニア2(捻転、常染色体劣性),3(捻転、X連鎖),5(ドーパ反応型),10,12,16,25,26(ミオクロニー);良性家族性乳児の発作2;早期乳児てんかん性脳症2,4,7,9,10,11,13および14;非定型レット症候群;初期T細胞前駆体急性リンパ性白血病;外胚葉性異形成表皮水疱症候群;外胚葉性異形成-合指症候群1;偏位水晶体、単独で(isolated)常染色体劣性および優性;裂手裂足(Ectrodactyly)、外胚葉性異形成、および口唇口蓋裂症候群3;エーラス・ダンロス症候群7型(常染色体劣性)、古典型、2型(早老性)、ヒドロキシリジン欠損型、4型、4型バリアント、およびテナシンX欠損に起因するもの;アイヒスフェルト型先天性筋ジストロフィー;内分泌-大脳骨異形成症(cerebroosteodysplasia);S錐体増強症候群;拡大前庭水管症候群;エンテロキナーゼ欠損症;疣贅状表皮発育異常症;単純型表皮水疱症および肢帯筋ジストロフィー、斑状色素沈着(mottled pigmentation)を伴う単純型、幽門閉鎖を伴う単純型、単純型、常染色体劣性、および幽門閉鎖を伴う;表皮剥離性掌蹠角化症;家族性熱性痙攣8;てんかん、小児欠神2,12(特発性全身、感受性),5(夜間前頭葉型)、夜間前頭葉型1、部分性、可変の病巣があるもの(with variable foci)、進行性ミオクロニー3、およびX連鎖性、可変の学習障害および行動障害があるもの;てんかん性脳症、小児期発症、乳児期早期、1,19,23,25,30および32;骨端異形成症、多発性、近視および伝音難聴を伴う;一過性運動失調症2型;一過性疼痛症候群、家族性、3;エプスタイン症候群;フェクトナー症候群;赤芽球増殖性プロトポルフィリン症;エストロゲン抵抗性;滲出性硝子体網膜症6;ファブリー病、およびファブリー病、心臓変異型;第H因子、第VII因子、第X因子、第v因子、および第viii因子の、2つの複合欠損症、第xiii因子、サブユニット、欠損症;家族性腺腫性ポリポーシス1および3;蕁麻疹および難聴を伴う家族性アミロイド腎症;家族性寒冷蕁麻疹;家族性の小脳虫部無発生;家族性良性天疱瘡;家族性乳がん;乳がん感受性(Breast cancer, susceptibility to);骨肉腫;膵臓がん3;家族性心筋症;家族性寒冷自己炎症性症候群2;家族性大腸がん;家族性滲出性硝子体網膜症、X連鎖性;家族性片麻痺性片頭痛1型および2型;家族性高コレステロール血症;家族性肥大型心筋症1,2,3,4,7,10,23および24;家族性低カリウム血症-低マグネシウム血症;家族性低形成の、糸球体嚢胞腎;家族性乳児筋無力症;家族性若年性痛風;家族性地中海熱、および家族性地中海熱、常染色体優性;家族性多弁症;家族性晩発性皮膚ポルフィリン症;家族性肺毛細血管腫症;家族性腎性糖尿;家族性腎性低尿酸血症;家族性拘束性心筋症1;家族性1型および3型高リポ蛋白血症;ファンコニー貧血，補欠群E,I,NおよびO;ファンコニー・ビッケル症候群;ファビズム感受性(Favism, susceptibility to);熱性痙攣、家族性、11;フェインゴールド症候群1;胎児ヘモグロビン量的形質遺伝子座1;FG症候群およびFG症候群4;眼球外筋の線維症、先天性、1,2,3a(眼球外病変の有無に関わらない),3b;魚眼病;フレック角膜ジストロフィー;フローティング・ハーバー症候群;精神遅滞の有無に関わらない、言語障害を伴う焦点てんかん;巣状分節性糸球体硬化症5;前脳欠損症;フランク・テル・ハール症候群;Borrone Di Rocco Crovato症候群;フレイジャー症候群;ウィルムス腫瘍1;フリーマン・シェルドン症候群;前頭骨幹端異形成症1および3;前頭側頭型認知症;前頭側頭型認知症および/または筋萎縮性側索硬化症3および4;前頭側頭型認知症第3染色体連鎖性および前頭側頭型認知症ユビキチン陽性;フルクトース-ビホスファターゼ欠損症;フールマン(Fuhrmann)症候群;ガンマ-アミノ酪酸トランスアミナーゼ欠損症;ガムストープ・ウォールファールト(Gamstorp-Wohlfart)症候群; ゴーシェ病1型および亜急性神経障害性;進行性の脊椎側弯症を伴う、家族性水平注視麻痺;全般性優性ジストロフィー型表皮水疱症;全般性てんかん、熱性痙攣プラス3,1型,2型を伴う;レノックス・ガストー型てんかん脳症;巨大軸索ニューロパチー;グランツマン血栓症;緑内障1、開放角、e,FおよびG;緑内障3、原発性先天性、d;先天性緑内障、および先天性緑内障、コロボマ;緑内障、原発性開放角、若年性発症;神経膠腫感受性1;グルコーストランスポーター1型欠損症候群;ルコース-6-リン酸輸送欠損症;GLUT1欠損症候群2;特発性全般性てんかん感受性、12;グルタミン酸ホルミノトランスフェラーゼ欠損症;グルタル酸血症IIAおよびIIB;グルタル酸尿症1型;グルタチオン合成酵素欠損症;糖原病0(筋肉),II(成人形),IXa2,IXc,1A型;II型,IV型,IV(肝とミオパチーとの複合),V型およびVI型;ゴールドマン・ファーブル症候群;ゴードン症候群;ゴーリン症候群;全前脳胞症シークエンス;全前脳胞症7;顆粒腫性疾患、慢性、X連鎖性、バリアント;卵巣の顆粒膜細胞腫瘍;灰色血小板症候群;グリセリ症候群3型;グレーノー角膜ジストロフィーI型;成長および精神遅滞、下顎顔面異形症、小頭症、および口蓋裂;下垂体異常を伴う成長ホルモン欠損症;免疫不全を伴う成長ホルモン不感受性;GTPシクロハイドロラーゼI欠損症;ハジュ・チーニー症候群;手足子宮症候群;聴覚障害;小児毛細血管腫;血液腫瘍;ヘモクロマトーシス1型,2B型および3型;糖尿病の微小血管合併症7;トランスフェリン血清レベル量的形質座2;ヘモグロビンH病、無欠損;グルコースリン酸イソメラーゼ欠損症に起因する、溶血性貧血、非球状赤血球性;血球貪食性リンパ組織球症、家族性、2;血球貪食性リンパ組織球症、家族性、3;ヘパリン補因子II欠損症;遺伝性腸性先端皮膚炎;遺伝性乳がん・卵巣がん症候群;運動失調・毛細血管拡張症様障害;遺伝性びまん性胃がん;スフェロイドを伴う遺伝性びまん性白質脳症;遺伝性第II,第IX,第VIII因子欠損症;遺伝性出血性毛細血管拡張症2型;無汗症を伴う遺伝性無痛症;遺伝性リンパ浮腫I型;視神経萎縮を伴う遺伝性運動・感覚神経症;早期呼吸不全を伴う遺伝性ミオパチー;遺伝性神経痛性筋萎縮症;遺伝性非ポリポーシス大腸新生物;リンチ症候群IおよびII;遺伝性膵炎;慢性膵炎感受性;遺伝性感覚・自律神経障害IIB型およびIIA型;遺伝性鉄芽球性貧血;ヘルマンスキー・ポドラック症候群1,3,4および6;内臓錯位、2,4および6、常染色体;内臓錯位、X連鎖性;組織球性髄様細網症;異所形成;組織球症-リンパ節腫大プラス症候群;ホロカルボキシラーゼ合成酵素欠損症;全前脳胞症2,3,7および9;ホルト・オラム症候群;MTHFR欠損症、CBS欠損症、およびホモシステイン尿症に起因するホモシステイン血症、ピリドキシン応答性;コバラミン代謝異常に起因する、ホモシステイン尿症-巨赤芽球性貧血、cblE相補型;ハウエル・エバンス(Howel-Evans)症候群;ハーラー症候群;ハッチンソン・ギルフォード症候群;水頭症;高アンモニア血症、III型;高コレステロール血症、および高コレステロール血症、常染色体劣性;過剰驚愕症2および遺伝性の過剰驚愕症;高フェリチン血症白内障症候群;高グリシン尿症;周期性発熱を伴う高免疫グロブリンD;メバロン酸尿症;高免疫グロブリンE症候群;家族性の高インスリン血症性低血糖症3,4および5;高インスリン血症-高アンモニア血症症候群;高リシン血症;ジストニア、赤血球増加症、および肝硬変を伴う高マンガン血症;高オルニチン血症-高アンモニア血症-ホモシトルリン尿症症候群;副甲状腺機能亢進症1および2;副甲状腺機能亢進症、新生児重度;部分的pts欠損症、BH4欠損症、D、非pkuに起因する、高フェニルアラニン血症、bh4欠損症、a;精神遅滞症候群2,3および4を伴う高リン酸血症;多毛性骨軟骨異形成症;apob32に関連する、低ベータリポ蛋白血症、家族性;低カルシウム血症、常染色体優性1;低カルシウム尿性高カルシウム血症、家族性、1型および3型;低軟骨形成症;鉄過剰症を伴う低クロム小球性貧血;肝臓中グリコーゲン合成酵素の欠損症を伴う低血糖症;臭覚障害の有無に関わらない低ゴナドトロピン性性腺機能低下症11;免疫不全を伴う無汗性外胚葉形成不全症;発汗低下のX連鎖性外胚葉異形成;低カリウム性周期性四肢麻痺1および2;低マグネシウム血症1、腸の;低マグネシウム血症、発作、および精神遅滞;低髄性白質ジストロフィー7;左心低形成症候群;房室中隔欠損症および共通房室接合部;尿道下裂1および2、X連鎖性;甲状腺機能低下症、先天性非甲状腺腫、1;減毛症8および12;減毛症-リンパ浮腫-血管拡張症候群;I血液型系;シーメンス型水疱性魚鱗癬;剥脱性魚鱗癬;未熟児魚鱗癬症候群;特発性基底核石灰化症5;特発性線維性肺胞炎、慢性型;先天性角化不全症、常染色体優性、2および5;乳児期の特発性高カルシウム血症;カルシウム流入障害2に起因するT細胞不活性化を伴う免疫機能障害; 1型および2型高IgMを伴う、cd3-ゼータの欠陥に起因する、免疫不全15,16,19,30,31C,38,40,8、ならびにマグネシウム欠陥を伴う、X連鎖性、エプスタイン・バーウイルス感染、および新形成;免疫不全-動原体不安定性-顔面奇形症候群2;封入体ミオパチー2および3;野中ミオパチー;乳児痙攣および発作性舞踏症、家族性;乳児皮質過骨症;乳児GM1ガングリオシドーシス;乳児低ホスファタシアーゼ血症;乳児ネフロン癆;乳児眼振、X連鎖性;乳児パーキンソン病-ジストニア;多尾性精子および過剰なDNAに関連する不妊症;イ
ンスリン抵抗性;インスリン抵抗性糖尿病および黒色表皮腫;インスリン依存性糖尿病分泌性下痢症候群;間質性腎炎、核巨大化(karyomegalic);子宮内発育遅延、骨幹端異形成症、先天性副腎低形成、および性器奇形;ヨードチロシン結合欠損症;IRAK4欠損症;虹彩隅角異発生優性型および1型;脳内鉄蓄積;坐骨膝蓋骨異形成;膵島細胞過形成;17,20-リアーゼ単独欠損症;ルトロピン単独欠損症;イソバレリル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症;ヤンコヴィッチ・リベラ症候群;ジャーベルおよびランゲ・ニールセン症候群2;ジュベール症候群1,6,7,9/15(2遺伝子性),14,16および17、ならびに口顔面指症候群xiv;ヘルリッツの接合部表皮水疱症;若年性GM＞1＜ガングリオシドーシス;若年性ポリポーシス症候群;若年性ポリポーシス/遺伝性出血性毛細血管拡張症症候群;若年性網膜炎;歌舞伎メーキャップ症候群;カルマン症候群1,2および6;思春期遅延症;神崎病;カラック症候群;カルタゲナー症候群;ケニー・ケイフィ症候群2型;ケッペン・ルビンスキー(Keppen-Lubinsky)症候群;円錐角膜1;毛包性角化症;掌蹠膿疱症1;キンドラー症候群;L-2-ヒドロキシグルタル酸尿症;ラーセン症候群、優性型;格子状角膜ジストロフィーIII型;レーバー黒内障;ツェルウェガー症候群;ペルオキシソーム生合成異常症;ツェルウェガー症候群スペクトラム;レーバー先天性黒内障11,12,13,16,4,7および9;レーバー視神経萎縮症;アミノグリコシド誘発性難聴;難聴、非症候性感音性、ミトコンドリア;左心室非圧縮症5;左右軸奇形;リー病;ミトコンドリア短鎖エノイル-CoAヒドラターゼ1欠損症;ミトコンドリア複合体I欠損症に起因するリー症候群;ライナー病;レリー・ワイル軟骨骨異形成症;致死性先天性拘縮症候群6;白血球接着不全症I型およびIII型;白骨ジストロフィー、ミエリン形成不全性、11および6;白質脳症、運動失調を伴う、脳幹・脊髄障害と乳酸値上昇とを伴う、白質の消失を伴う、および進行性の、卵巣不全を伴う;全白爪;レビー小体型認知症;リヒテンシュタイン・クノール症候群;リー・フラウメニ症候群1;Lig4症候群;肢帯筋ジストロフィー1B型,2A型,2B型,2D型,C1型,C5型,C9型,C14型;脳および眼の異常を伴う先天性筋ジストロフィー-ジストログリカノパチー、A14型およびB14型;複合型リパーゼ欠損症;脂肪蛋白症;リポジストロフィー、家族性部分的、2型および3型;脳回欠損1,2(X連鎖性),3,6(小頭症を伴う),X連鎖性;皮質下帯状ヘテロトピア、X連鎖性;急性乳児肝不全;ロイス・ディーツ症候群1,2,3;QT延長症候群1,2,2/9,2/5,(2遺伝子性),3,5および5、後天性、感受性;肺がん;リンパ浮腫、遺伝性、id;リンパ浮腫、原発性、骨髄異形成を伴う;リンパ増殖症候群1,1(X連鎖性)および2;リソソーム酸リパーゼ欠損症;大頭症、巨人症、顔面異形症候群;黄斑変性症、卵黄様、成人期に発症;悪性高熱感受性1型;悪性リンパ腫、非ホジキン;悪性黒色腫;前立腺の悪性腫瘍;下顎骨異形成症;A型またはB型リポジストロフィーを伴う下顎骨異形成症、非定型;下顎顔面異形成症、トレーチャー・コリンズ型、常染色体劣性;マンノース結合タンパク質欠乏症;メープルシロップ尿症1A型および3型;マルデン・ウォーカー様症候群;マルファン症候群;マリネスコ・Sj＼xc3＼xb6gren症候群;マートソフル(Martsolf)症候群;成熟期に発症する若年性糖尿病、1型,2型,11型,3型および9型;メイ・ヘグリン異常症;MYH9関連疾患;セバスチャン症候群;マキュン・オルブライト症候群;体細胞腺腫;性索-間質性腫瘍;クッシング症候群;マクシック・カウフマン症候群;マクラウド神経赤血球症症候群;メッケル・グルーバー症候群;中鎖アシル-補酵素A脱水素酵素欠損症;髄芽腫;皮質下嚢胞1および2aを伴う大脳白質脳症;大頭-先天性大理石様皮膚;PIK3CA関連過成長スペクトラム;巨脳-多小脳回-多指-水頭症候群2;巨大芽球性貧血、チアミン反応性、糖尿病および感音性難聴を伴う;マイヤー・ゴーリン症候群1および4;メルニック・ニードルズ症候群;髄膜腫;精神遅滞、X連鎖性、3,21,30および72;精神遅滞および小頭症、脳橋および小脳の低形成を伴う;X連鎖精神遅滞症候群5;精神遅滞、上顎前突、および斜視;精神遅滞、常染色体優性12,13,15,24,3,30,4,5,6および9;精神遅滞、常染色体劣性15,44,46および5;精神遅滞、定型動作、てんかん、および/または脳奇形;精神遅滞、症候群性、クラース・ジェンセン(Claes-Jensen)型、X連鎖性;精神遅滞、X連鎖、非特異的、症候性、ヘデラ(Hedera)型、および症候性、ウー(wu)型;メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー;異染性白質ジストロフィー若年型、乳児期後期型、および成人型;異染性白質ジストロフィー;変容性骨異形成症;メトヘモグロビン血症I型および2型;メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ欠損症、常染色体優性;ホモシスチン尿症を伴うメチルマロン酸血症;メチルマロン酸尿症cblB型;メチルマロニル-CoAムターゼ欠損症に起因するメチルマロン酸尿症;メチルマロン酸尿症mut(0)型;小頭症性骨異形成原基性小人症2型;絨毛網膜症、リンパ浮腫、または精神遅滞の有無に関わらない小頭症;小頭症、裂孔ヘルニア、およびネフローゼ症候群;小頭症;脳梁の低形成症;痙性対麻痺50、常染色体劣性;全身性発育遅延;CNSミエリン形成不全症;脳萎縮;小頭症、正常な知能および免疫不全;小頭症-毛細血管奇形症候群;小球性貧血;症候群性小眼球症5,7および9;小眼球症、単独3,5,6,8、およびコロボマ6を伴う;微小球症;片頭痛、家族性片麻痺性;ミラー症候群;外眼筋麻痺を伴うミニコアミオパチー;コアを伴う先天性ミオパチー;ミッチェル・ライリー症候群;ミトコンドリア3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA合成酵素欠損症;ミトコンドリア複合体I,II,III,III(核型2,4または8)欠損症;ミトコンドリアDNA枯渇症候群11,12(心筋症型),2,4B(MNGIE型),8B(MNGIE型);ミトコンドリアDNA枯渇症候群3および7,肝脳型および13(脳筋症型);ミトコンドリアリン酸担体およびピルビン酸担体欠損症;ミトコンドリア三機能性タンパク質欠損症;長鎖3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症;三好型筋ジストロフィー1;遠位型ミオパチー、前脛骨発症を伴う;モーア・トラネジャーグ(Mohr-Tranebjaerg)症候群;モリブデン補因子欠損症、相補群A;モワット・ウィルソン症候群;ムコリピドーシスIIIガンマ;ムコ多糖症VI型,VI型(重症)およびVII型;ムコ多糖症、MPS-I-H/S,MPS-II,MPS-III-A,MPS-III-B,MPS-III-C、MPS-IV-A,MPS-IV-B;網膜色素変性症73;ガングリオシドーシスGM1型1(心臓障害を伴う)3;多中心性骨溶解腎症;多中心性骨溶解、結節症、および関節症;多発性先天異常;心房中隔欠損症2;多発性先天異常-筋緊張低下-発作症候群3;多発性の皮膚および粘膜静脈奇形;多発性内分泌腺新形成1型および4型;多発性骨端異形成症5型または優性;多発性腸管閉鎖症;多発性翼状片症候群エスコバール型;多発性スルファターゼ欠損症;多発性骨癒合症症候群3;筋AMPグアニンオキシダーゼ欠損症;筋眼脳疾患;筋ジストロフィー、先天性、巨円錐体型;筋無力症、家族性小児、1;アセチルコリン受容体欠損症に関連する、先天性筋無力症症候群11;先天性筋無力症症候群17,2A(スローチャネル),4B(ファストチャネル)および管状集合体を伴わない;ミエロペルオキシダーゼ欠損症;MYH関連ポリポーシス;子宮内膜癌;心筋梗塞1;ミオクローヌス性ジストニア;ミオクローヌス性-無緊張性てんかん;赤色ボロ繊維・ミオクローヌスてんかん;筋原線維ミオパチー1およびZASP関連;ミオグロビン尿、急性再発性、常染色体劣性;筋神経胃腸管性脳症症候群;進行性外眼筋麻痺を伴う小児小脳性運動失調症;ミトコンドリアDNA枯渇症候群4B、MNGIE型;ミオパチー、中心核、1、先天性、過剰の筋紡錘を伴う、遠位の、1、乳酸アシドーシス、および鉄芽球性貧血1、先天性白内障を伴うミトコンドリア進行性の、聴覚消失、および発育遅延、および管状集合体、2;近視6;筋硬化症、常染色体劣性;先天性筋強直症;先天性筋強直症、常染色体優性型および劣性型;爪膝蓋骨症候群;ナンス・ホラン症候群;小眼球症2;ナバホ神経肝障害;ネマリンミオパチー3および9;新生児筋緊張低下;知的障害;痙攣;言語発達遅延;精神遅滞、常染色体優性31;シトリン欠損症によって引き起こされる新生児肝内胆汁うっ滞;腎性尿崩症、腎性尿崩症、X連鎖性;腎結石症/骨粗鬆症、低リン酸血症性、2;ネフロン癆13,15および4;不妊症;脳-眼-腎症候群(ネフロン癆、眼球運動失効、および小脳異常);ネフローゼ症候群、3型,5型、眼球異常の有無に関わらない、7型および9型;ネスター・グレルモプロジェリア症候群;ノイ・ラクソバ(Neu-Laxova)症候群1;脳鉄蓄積を伴う神経変性症4および6;神経フェリチン症;神経線維腫症、1型および2型;神経線維肉腫;神経下垂体性尿崩症;ニューロパチー、遺伝性感覚性、IC型;中性1アミノ酸輸送障害;ミオパチーを伴う中性脂質蓄積症;好中球免疫不全症候群;ニコライデス・バライスター症候群;ニーマン・ピック病C1型,C2型,A型およびC1、成人型;非ケトーシス性高グリシン血症;ヌーナン症候群1および4、LEOPARD症候群1;若年性骨髄単球性白血病の有無に関わらないヌーナン症候群様障害;正常カリウム血性周期性四肢麻痺、カリウム感受性;ノルム病;てんかん、聴覚消失、および精神遅滞症候群;精神遅滞、X連鎖性102および症候性13;肥満;眼白子症、I型;眼皮膚白子症1B型,3型および4型;眼歯指異形成症;歯限局型低ホスファターゼ症;歯-毛髪-四肢症候群(Odontotrichomelic syndrome);大口病;減歯症-大腸直腸癌症候群;オピッツG/BBB症候群;視神経萎縮症9;口腔顔面指趾症候群;オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症;口腔顔面裂11および7、口唇/口蓋外胚葉異形成症候群;オルスタビック・リンデマン・ソルベルグ症候群;軽度の軟骨異形成症を伴う骨関節炎;離断性骨軟骨炎;骨形成不全症12型,5型,7型,8型,I型,III型、正常な強膜を伴う、優性型、劣性周産期致死性;頭蓋骨硬化症を伴う線条骨症;常染色体優性の大理石骨症1型および2型,劣性4型,劣性1型,劣性6型;偽神経膠腫を伴う骨粗鬆症;耳口蓋指症候群I型およびII型;卵巣形成不全1;卵巣白質脳症;先天性爪肥厚症4および2型;骨パジェット病、家族性;パリスター・ホール症候群;掌蹠角化症、非表皮剥離性、局所性またはびまん性;膵臓無形成および先天性心疾患;パピロン・Lef＼xc3＼xa8vre症候群;傍神経膠節腫3;フォン・オレインブルグ(von Eulenburg)の先天性異常筋強直症;副甲状腺癌;パーキンソン病14,15,19(若年性発症),2,20(早期発症),6,(常染色体劣性の早期発症)および9;限局性白皮証;ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ部分欠損症;網膜色素上皮の模様ジストロフィー;PC-K6a;ペリザウス・メルツバッハー病;ペンドレッド症候群;末梢性脱髄性神経障害、中枢性脱髄性;ヒルシュスプルング病;永続型新生児糖尿病;永続型新生児糖尿病、神経学的特色を伴う;新生児インスリン依存性糖尿病;若年発症成人型糖尿病、2型;ペルオキシソーム生合成障害14B,2A,4A,5B,6A,7Aおよび7B;ペロー症候群4;ペリー症候群;新生児の持続性高インスリン性低血糖症;家族性高インスリン症;表現型;フェニルケトン尿症;褐色細胞腫;遺伝性パラガングリオーマ-褐色細胞腫症候群;パラガングリオーマ1;腸のカルチノイド腫瘍;カウデン症候群3;ホスホグリセリン酸脱水素酵素欠損症;ホスホグリセリン酸キナーゼ1欠損症;光感受性硫黄欠乏性毛髪発育異常症;フィタン酸蓄積病;ピック病;ピアソン症候群;色素性網膜ジストロフィー;色素性結節状副腎皮質病変、原発性、1;石灰化上皮腫;ピット・ホプキンス症候群;下垂体依存性高コルチゾール症;下垂体ホルモン欠損症、複合型1,2,3および4;プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1型欠損症;プラスミノーゲン欠損症、I型;血小板型出血障害15および8;多形皮膚萎縮症、遺伝性線維化、腱性拘縮、ミオパチー、および肺線維症を伴う;多発性嚢胞腎疾患2、成人型および乳児型;硬化性白質脳症を伴う多嚢胞性脂肪膜性骨異形成症;免疫不全の有無に関わらないポリグルコサン体ミオパチー1;多小脳回、非対称性、両側性前頭頭頂部;多発性神経炎、聴覚消失、運動失調、網膜色素変性、および白内障;4型橋小脳形成不全症;膝窩部贅皮症候群;孔脳症2;汗孔角化症8、伝染性表層化学活性型;ポルフォビリノーゲン合成酵素欠損症;晩発性皮膚ポルフィリン症;網膜色素変性症を伴う脊髄後索性失調症;後極白内障2型;プラダー・ウィリー様症候群;早発卵巣不全4,5,7および9;原発性常染色体劣性小頭症10,2,3および5;原発性線毛機能不全24;原発性拡張
型心筋症;左心緻密化障害6;4、左心緻密化障害10;発作性心房細動;原発性高シュウ酸尿症、I型およびIII型;原発性肥大性骨関節症、常染色体劣性2;原発性低マグネシウム血症;原発性開放隅角緑内障若年発症1;原発性肺高血圧症;プリムローズ症候群;進行性家族性心ブロック1B型;進行性家族性肝内胆汁うっ滞2および3;進行性肝内胆汁うっ滞;運動失調症を伴う進行性ミオクローヌスてんかん;進行性偽リウマチ性異形成症;進行性硬化性灰白異栄養症;プロリダーゼ欠損症;プロリン脱水素酵素欠損症;統合失調症4;プロパジン欠損症、X連鎖性;プロピオン酸血症;プロタンパク質変換酵素1/3欠損症;前立腺がん、遺伝性、2;プロタン欠損症;蛋白尿;フィンランド型先天性ネフローゼ症候群;プロテウス症候群;乳腺癌;偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成症;偽性低アルドステロン症1型常染色体優性および劣性および2型;偽性副甲状腺機能低下症1A型;偽性偽性副甲状腺機能低下症;仮性新生児副腎白質ジストロフィー;偽原発性高アルドステロン症;弾性線維性仮性黄色腫;乳児の全身性動脈石灰化症2;多発性凝固因子欠損症を伴う弾性線維性仮性黄色腫様障害;乾癬感受性2;PTEN過誤腫症候群;遺伝性出血性毛細血管拡張症に関連する肺動脈性高血圧症;肺線維症および/または骨髄不全、テロメアに関連する、1および3;遺伝性出血性毛細血管拡張症を伴う、肺高血圧症、原発性、1;プリン-ヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症;ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症;ピルビン酸脱水素酵素E1-アルファ欠損症;赤血球のピルビン酸キナーゼ欠損症;レイン症候群;ラスオパチー;劣性栄養障害性表皮水疱症;爪障害、非症候性先天性、8;ライフェンスタイン症候群;腎欠損症;腎カルニチン輸送障害;腎コロボマ症候群;腎異形成症;腎異形成症、網膜色素性ジストロフィー、小脳性運動失調症、および骨格異形成症;遅発性感音性聴覚消失を伴うか、または溶血性貧血を伴う、腎尿細管性アシドーシス、遠位型、常染色体劣性;眼球異常および精神遅滞を伴う、腎尿細管性アシドーシス、近位型;網膜錐体ジストロフィー3B;網膜色素変性症;網膜色素変性症10,11,12,14,15,17および19;網膜色素変性症2,20,25,35,36,38,39,4,40,43,45,48,66,7,70,72;網膜芽細胞腫;レット障害;ラブドイド腫瘍素因症候群2;裂孔原生網膜剥離、常染色体優性;肢根型点状軟骨異形成症2型および3型;ロバーツ-SCあざらし肢奇形症候群;ロビノー・ソラウフ(Robinow Sorauf)症候群;ロビノー症候群、常染色体劣性、短合多指症を伴う常染色体劣性;ロスムンド・トムソン症候群;ラパデリノ症候群;RRM2B関連ミトコンドリア病;ルービンシュタイン・タイビ症候群;サラ病;サンドホフ病、成人型および乳児型;サルコイドーシス、早期発症;ブラウ症候群;シンドラー病、1型;裂脳症;統合失調症15;蝸牛様骨盤異形成症;神経鞘腫症2;シュワルツ・ヤンペル症候群1型;角膜硬化、常染色体劣性;硬結性骨化症;二次性甲状腺機能低下症;瀬川症候群、常染色体劣性;セニオール・ローケン症候群4および5;感覚性運動失調型ニューロパチー、構音障害、および眼麻痺;セピアプテリン還元酵素欠損症;SeSAME症候群;小頭症、成長遅延、電離放射線感受性を伴う、ADA欠損症に起因する重症複合免疫不全症、非定型、常染色体劣性、T細胞陰性、B細胞陽性、NK細胞陽性のNK細胞陰性;重症先天性好中球減少症;重症先天性好中球減少症3、常染色体劣性または優性;重症先天性好中球減少症および6、常染色体劣性;乳児期の重篤なミオクロニーてんかん;熱性痙攣プラスの全般てんかん、1型および2型;重篤なX連鎖性筋細管ミオパチー;QT短縮症候群3型;非特異的な骨格異常を伴う低身長;低身長、耳道狭窄症、下顎形成不全、骨格異常;低身長、爪甲形成不全、顔異形、および貧毛症;原基性小人症;多指症の有無に関わらない短肋胸郭異形成症11または3;シアリドーシスI型およびII型;シルバー痙性対麻痺症候群;神経伝導速度遅延、常染色体優性;スミス・レムリ・オピッツ症候群;スナイダー・ロビンソン症候群;成長ホルモン分泌腺腫;プロラクチノーマ;家族性、下垂体腺腫素因;ソトス症候群1または2;痙性失調症5、常染色体劣性、シャルルボワ・サグネ型、1,10または11、常染色体劣性;筋萎縮性側索硬化症5型;痙性対麻痺15,2,3,35,39,4、常染色体優性、55、常染色体劣性、および5A;胆汁酸合成障害、先天性、3;精子形成不全11,3および8;球状赤血球症4型および5型;球状体ミオパチー;脊髄性筋萎縮症、下肢優位2、常染色体優性;脊髄性筋萎縮症、II型;脊髄小脳失調症14,21,35,40および6;脊髄小脳失調症、常染色体劣性1および16;脾臓低形成;脊椎手根骨足根骨癒合症候群;脊椎手掌異形成、エーラス・ダンロス症候群様、免疫調節異常を伴う、アグリカン型、先天性関節脱臼を伴う、短肢-手型、セダガッテン(Sedaghatian)型、錐体桿体ジストロフィーを伴う、およびコズロウスキー型; 捩れ小人症;シュタルガルト病1;錐体桿体ジストロフィー3;スティックラー症候群1型;クニースト(Kniest)異形成症;スティックラー症候群、1型(非症候性眼性)および4型;スティング関連脈管障害、小児期発症;ストームオルケン症候群;スタージ・ウェーバー症候群、毛細血管奇形、先天性、1;サクシニル-CoAアセト酢酸転移酵素欠損症;スクラーゼ-イソマルターゼ欠損症;乳児突然死症候群;亜硫酸酸化酵素欠損症、独立型;大動脈弁上狭窄;肺サーファクタント代謝機能障害、2および3;指節癒合症、近位、1b;セナニー・レンツ型合指症;3型合指症;症候性X連鎖性精神遅滞16;内反尖足;タンジール病;TARP症候群;テイ・サックス病、B1バリアント、Gm2ガングリオシドーシス(成人)、Gm2ガングリオシドーシス(成人発症);テムタリー(Temtamy)症候群;テノリオ症候群;肢端骨異形成;テストステロン17-ベータ-デヒドロゲナーゼ欠損症;無四肢症、常染色体劣性;ファロー四徴症;左心低形成症候群2;動脈瘤;心臓および大血管の奇形;心室中隔欠損症1;ティール・ベーンケ(Thiel-Behnke)角膜ジストロフィー;胸部大動脈瘤および大動脈解離;マルファン様体型;3M症候群2;血小板減少症、血小板機能障害、溶血、およびグロビン合成不均衡;血小板減少症、X連鎖性;血栓症、遺伝性、プロテインC欠損症に起因、常染色体優性および劣性;甲状腺無形成;甲状腺がん、濾胞性;甲状腺ホルモン代謝異常;甲状腺ホルモン抵抗性、汎発性、常染色体優性;甲状腺中毒性周期性四肢麻痺および甲状腺中毒性周期性四肢麻痺2;サイトロピン放出ホルモン抵抗性、汎発性;チモシー症候群;TNF受容体関連周期熱症候群(TRAPS);歯無発生、選択的、3および4;多形性心室頻拍(Torsades de pointes);タウンズ・ブロックス鰓弓耳腎様症候群;新生児の一過性表皮水疱症;トリーチャー・コリンズ症候群1;精神遅滞、小人症、および網膜の色素変性を伴う長睫毛症;三叉神経節異形成症I型;三叉神経節症候群3型;トリメチルアミン尿症;結節性硬化症症候群;リンパ管筋腫症;結節性硬化症1および2;チロシナーゼ陰性眼皮膚白皮症;チロシナーゼ陽性眼皮膚白皮症;チロシン血症I型;UDPグルコース-4-エピメラーゼ欠損症;ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー;重度の四肢欠損を伴う尺骨・腓骨欠損症;アップショー・シュールマン症候群;ウロカニン酸加水酵素欠損症;アッシャー症候群、1型,1B型,1D型,1G型,2A型,2C型および2D型;網膜色素変性症39;紫外線感受性症候群;ファン・デル・ウーデ(Van der Woude)症候群;ヴァン・マルダーゲム(Van Maldergem)症候群2;ヘンカムリンパ管拡張症-リンパ浮腫症候群2;異型ポルフィリン症;嚢胞性腎疾患を伴う脳室拡大;ヴェルヘイ(Verheij)症候群;超長鎖アシル-CoA脱水素酵素欠損症;膀胱尿管逆流症8;内臓逆位5、常染色体;腹部ミオパチー;ビタミンD依存性くる病、1型および2型;卵黄型ジストロフィー;フォン・ヴィルブランド病2M型および3型;ワールデンブルグ症候群1型,4C型および2E型(神経学的病変を伴う);クライン・ワールデンブルグ症候群;ウォーカー・ワールブルグ先天性筋ジストロフィー;ワールブルグ・マイクロ症候群2および4;イボ、低ガンマグロブリン血症、感染症、および骨髄性細胞貯留;ウィーバー症候群;ヴァイユ・マルケザーニ症候群1および3;ヴァイユ・マルケザーニ様症候群;ワイセンバッハー・ツウェイミュラー(Weissenbacher-Zweymuller)症候群;ウェルドニッヒ・ホフマン病;シャルコー・マリー・トゥース病;ウェルナー症候群;WFS1関連障害;ウィデマン・スタイナー症候群;ウィルソン病;ウォルフラム様症候群、常染色体優性;ワース(Worth)病;ファン・ブッヘム病2型;色素性乾皮症、相補群b,群D,群Eおよび群G;X連鎖無ガンマグロブリン血症;X連鎖性 遺伝性運動感覚性ニューロパチー;ステリルスルファターゼ欠損症を伴うX連鎖性魚鱗癬;X連鎖性脳室周囲異所性灰白質;耳口蓋指症候群、I型;X連鎖性重症複合免疫不全症;チンメルマン・レーバンド(Zimmermann-Laband)症候群およびチンメルマン・レーバンド症候群2;ならびに小帯(Zonular)粉状白内障3。

標的ヌクレオチド配列は、疾患、障害、または疾病に関連する標的配列(例えば点変異)を含み得る。標的配列は疾患、障害、または疾病に関連するTからC(またはAからG)の点変異を含み得、変異体C塩基の脱アミノ化は、疾患、障害、または疾病に関連しない配列へのミスマッチ修復によって媒介される修正をもたらす。標的配列は疾患、障害、または疾病に関連するGからA(またはCからT)の点変異を含み得、変異体A塩基の脱アミノ化は、疾患、障害、または疾病に関連しない配列へのミスマッチ修復によって媒介される修正をもたらす。標的配列はタンパク質をコードし得、点変異がコドンにあるところでは、野生型コドンと比較して変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす。標的配列はスプライス部位にもまたあり得、点変異は野生型転写物と比較してmRNA転写物のスプライシングの変化をもたらす。加えて、標的は遺伝子の非コード配列、例えばプロモーターにもまたあり得、点変異は遺伝子の増大または減少した発現をもたらす。

それゆえに、いくつかの側面では、変異体Cの脱アミノ化は変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらし、これはいくつかのケースでは野生型アミノ酸の発現をもたらし得る。他の側面では、変異体Aの脱アミノ化は変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらし、これはいくつかのケースでは野生型アミノ酸の発現をもたらし得る。

細胞を組成物またはrAAV粒子と接触させることが関わる本明細書に記載の方法は、in vitroで、エクスビボで、またはインビボで生起し得る。ある態様において、接触させるステップは対象に生起する。ある態様において、対象は疾患、障害、または疾病と診断されている。

いくつかの態様では、本明細書に開示の方法には、哺乳類細胞を組成物またはrAAV粒子と接触させることが関わる。具体的な態様では、方法には、網膜細胞、皮質細胞、または小脳細胞に接触することが関わる。

本明細書に記載の方法を用いて送達される分裂されたCas9タンパク質または分裂されたプライム編集因子は、好ましくは、元々のCas9タンパク質またはプライム編集因子(すなわち、丸ごと細胞に送達または細胞によって発現される未分裂のタンパク質)と比較して遜色ない活性を有する。例えば、分裂されたCas9タンパク質または分裂されたプライム編集因子は、元々のCas9タンパク質またはプライム編集因子の活性の少なくとも50％(例えば、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％)を保持する。いくつかの態様では、分裂されたCas9タンパク質または分裂されたプライム編集因子は、元々のCas9タンパク質またはプライム編集因子のものよりも(例えば、2倍、5倍、10倍、100倍、1000倍、またはより多く)活性である。

本明細書に記載の組成物は、対象が患っている疾患または障害を処置および/または防止するための治療学的有効量でその必要がある対象に投与され得る。CRISPR/Cas9に基づくゲノム編集テクノロジーを用いて処置および/または防止され得るいずれかの疾患または障害は、本明細書に記載の分裂されたCas9タンパク質または分裂されたプライム編集因子によって処置され得る。分裂されたCas9タンパク質またはプライム編集因子をコードするヌクレオチド配列がさらにgRNAをコードしない場合には、gRNAをコードする別個の核酸ベクターが本明細書に記載の組成物と一緒に投与され得るということは理解されるはずである。

例示の好適な疾患、障害、または疾病は、限定なしに:嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、表皮剥離性角質増殖症(EHK)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、シャルコー・マリー・トゥース病4J型、神経芽腫(NB)、フォン・ヴィレブランド病(vWD)、先天性ミオトニー、遺伝性腎アミロイドーシス、拡張型心筋症、遺伝性リンパ浮腫、家族性アルツハイマー病、プリオン病、慢性乳児神経皮膚関節症候群(CINCA)、先天性難聴、ニーマン・ピック病C型(NPC)疾患、およびデスミン関連ミオパチー(DRM)からなる群から選択される疾患または障害を包含する。具体的な態様では、疾患または疾病はニーマン・ピック病C型(NPC)疾患である。

いくつかの態様では、疾患、障害、または状態はNPC遺伝子、DNMT1遺伝子、PCSK9遺伝子、またはTMC1遺伝子の点変異に関連する。ある態様において、点変異はNPCのT3182C変異であり、これはI1061Tアミノ酸置換をもたらす。

ある態様において、点変異はTMC1のA545G変異であり、これはY182Cアミノ酸置換をもたらす。TMC1は内耳の感覚有毛細胞の機械受容イオンチャネルを形成するタンパク質をコードし、正常な聴覚機能に要求される。Y182Cアミノ酸置換は先天性難聴に関連する。

いくつかの態様では、疾患、障害、または疾病は、停止コドン、例えば遺伝子のコード領域内の未成熟停止コドンを生成する点変異に関連する。

追加の例示の疾患、障害、または疾病は、嚢胞性線維症(例えば、Schwank et al.,Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.Cell stem cell.2013;13:653-658;およびWu et.al.,Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9.Cell stem cell.2013;13:659-662を見よ。これらのいずれも、遺伝子欠陥を修正するためにデアミナーゼ融合タンパク質を用いていない);フェニルケトン尿症－例えば、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子の位置835(マウス)もしくは240(ヒト)または相同残基におけるフェニルアラニンからセリンの変異(T＞C変異)－例えばMcDonald et al.,Genomics.1997;39:402-405を見よ;ベルナール・スーリエ症候群(BSS)－例えば、血小板膜糖タンパク質IXの位置55もしくは相同残基におけるフェニルアラニンからセリンの変異または残基24もしくは相同残基におけるシステインからアルギニン(T＞C変異)－例えばNoris et al.,British Journal of Haematology.1997;97:312-320およびAli et al.,Hematol.2014;93:381-384を見よ;表皮剥離性角質増殖症(EHK)－例えば、ケラチン1の位置160もしくは161(開始メチオニンをカウントする場合)または相同残基におけるロイシンからプロリンの変異(T＞C変異)－例えば、Chipev et al.,Cell.1992;70:821-828を見よ。www[dot]uniprot[dot]orgのUNIPROTデータベースのアクセッション番号P04264をもまた見よ;慢性閉塞性肺疾患(COPD)－例えば、α₁-アンチトリプシンのプロセシングされた形態の位置54もしくは55(開始メチオニンをカウントする場合)または相同残基あるいはプロセシングされない形態の残基78または相同残基におけるロイシンからプロリンの変異(T＞C変異)－例えば、Poller et al.,Genomics.1993;17:740-743を見よ。UNIPROTデータベースのアクセッション番号P01011をもまた見よ;シャルコー・マリー・トゥース病4J型 - 例えばFIG4の位置41または相同残基におけるイソロイシンからトレオニンの変異(T＞C変異)－例えば、Lenk et al.,PLoS Genetics.2011;7:e1002104を見よ;神経芽腫(NB)－例えば、カスパーゼ-9の位置197または相同残基におけるロイシンからプロリンの変異(T＞C変異)－例えば、Kundu et al.,3 Biotech.2013,3:225-234を見よ;フォン・ヴィレブランド病(vWD)－例えば、フォン・ヴィレブランド因子のプロセシングされた形態の位置509もしくは相同残基またはフォン・ヴィレブランド因子のプロセシングされない形態の位置1272もしくは相同残基におけるシステインからアルギニンの変異(T＞C変異)－例えば、Lavergne et al.,Br.J.Haematol.1992を見よ。UNIPROTデータベースのアクセッション番号P04275をもまた見よ;82:66-72;先天性ミオトニー－例えば、筋肉塩素チャネル遺伝子CLCN1の位置277または相同残基におけるシステインからアルギニンの変異(T＞C変異)－例えば、Weinberger et al.,The J.of Physiology.2012;590:3449-3464を見よ;遺伝性腎アミロイドーシス－例えば、アポリポタンパク質AIIのプロセシングされた形態の位置78もしくは相同残基またはプロセシングされない形態の位置101もしくは相同残基における停止コドンからアルギニンの変異(T＞C変異)－例えば、Yazaki et al.,Kidney Int.2003;64:11-16を見よ;拡張型心筋症(DCM)－例えば、FOXD4遺伝子の位置148または相同残基におけるトリプトファンからアルギニンの変異(T＞C変異)、例えば、Minoretti et.al.,Int.J.of Mol.Med.2007;19:369-372を見よ;遺伝性リンパ浮腫 - 例えば、VEGFR3チロシンキナーゼの位置1035または相同残基におけるヒスチジンからアルギニンの変異(A＞G変異)、例えば、Irrthum et al.,Am.J.Hum.Genet.2000;67:295-301を見よ;家族性アルツハイマー病－例えば、プレセニリン1の位置143または相同残基におけるイソロイシンからバリンの変異(A＞G変異)、例えば、Gallo et.al.,J.Alzheimer's Disease.2011;25:425-431を見よ;プリオン病－例えば、プリオンタンパク質の位置129または相同残基におけるメチオニンからバリンの変異(A＞G変異)－例えば、Lewis et.al.,J.of General Virology.2006;87:2443-2449を見よ;慢性乳児神経皮膚関節症候群(CINCA)－例えば、クリオピリンの位置570または相同残基におけるチロシンからシステインの変異(A＞G変異)－例えば、Fujisawa et.al.Blood.2007;109:2903-2911を見よ;ならびにデスミン関連ミオパチー(DRM)－例えば、αβクリスタリンの位置120または相同残基におけるアルギニンからグリシンの変異(A＞G変異)を包含する。例えば、Kumar et al.,J.Biol.Chem.1999;274:24137-24141を見よ。全ての参照およびデータベースエントリーの内容全体は参照によって本願に組み込まれる。

トリヌクレオチド反復拡大疾患
トリヌクレオチド反復拡大は、ハンチントン病、脆弱X症候群、およびフリードライヒ運動失調症を包含するいくつものヒト疾患に関連する。最も普通のトリヌクレオチド反復はCAGトリプレットを含有するが、GAAトリプレット(フリードライヒ運動失調症)およびCGGトリプレット(脆弱X症候群)もまた生起する。拡大の素因を受け継ぐことまたはすでに伸長した親のアレルを獲得することは、疾患を獲得する蓋然性を増大させる。トリヌクレオチド反復の病原性の拡大は仮説上はプライム編集を用いて修正され得る。

図1Gまたは図22に概説されている一般的な機序に従って、反復領域の上流の領域が、RNAによってガイドされるヌクレアーゼによってニッキングされ得、それから、健康な反復数(これは具体的な遺伝子および疾患に依存する)を含有する新たなDNA鎖の合成をプライムするために用いられ得る。反復配列の後には、反復の他端に隣接する配列のアイデンティティーにマッチする相同性の短いストレッチが追加される(赤色の鎖)。TPRTシステムによる新たに合成された鎖の侵入、および新たに合成されたフラップによる内生DNAの爾後の置き換えは、短縮された反復アレルに至る。用語「短縮された」はヌクレオチド反復領域の長さの短くなることを言い、それによって、トリヌクレオチド反復領域を修復することをもたらす。

本明細書に記載のプライム編集システムまたはプライム編集(PE)システムは、ハンチントン病および他のトリヌクレオチド反復障害などの疾病を処置するために、トリヌクレオチド反復変異(または「トリプレット拡大疾患」)を短縮するために用いられ得る。トリヌクレオチド反復拡大障害は発達神経生物学が関わる複雑な進行性の障害であり、多くの場合には、認知および感覚運動機能に影響する。障害は遺伝学的な表現促進現象(すなわち、各世代での増大した重症度)を示す。DNA伸長または短縮は、通常は減数分裂的に(すなわち、配偶子形成の時の間に、または胚発生中に早期に)起こり、多くの場合には性バイアスを有し、いくつかの遺伝子は女性から受け継がれるときにのみ、他は男性からのみ伸長するということを意味する。ヒトでは、トリヌクレオチド反復拡大障害は転写または翻訳レベルどちらかで遺伝子サイレンシングを引き起こし得、これは本質的に遺伝子機能をノックアウトする。代替的には、トリヌクレオチド反復拡大障害は、大きい繰り返しアミノ酸配列を有して生成された変改されたタンパク質を引き起こし得る。これは、多くの場合にはドミナントネガティブな様式で(例えばポリグルタミン疾患)、タンパク質機能を無効化するかまたは変化させるかどちらかである。

理論によって拘束されることなしに、トリプレット拡大はDNA複製またはDNA修復合成の間のスリップによって引き起こされる。タンデム反復は互いに同一の配列を有するので、2つのDNA鎖間の塩基対形成は配列上の複数の点において生起し得る。これはDNA複製またはDNA修復合成の間の「ループアウト」構造の形成に至り得る。これは繰り返し配列の繰り返しのコピーに至り得、反復数を伸長させる。ハイブリッドRNA:DNA中間体が関わる追加の機序が提案されている。プライム編集は、害をなす繰り返しのコドントリプレットの1つ以上を欠失させることによって、これらのトリプレット拡大領域を縮減または消去するために用いられ得る。この使用のある態様では、図23が、プライム編集によってトリヌクレオチド反復配列を短縮または縮減するためのPEgRNAデザインの模式図を提供する。

プライム編集は、カットされる部位へと標的化される充当されたPEgRNAを含むプライム編集因子によって、トリプレット反復領域の上流の領域へニックを入れることによって、トリプレット拡大領域を短縮するように実装され得る。それから、プライム編集因子は、健康な数のトリプレット反復(これは具体的な遺伝子および疾患に依存する)をコードする鋳型(すなわち、その編集鋳型)としてのPEgRNAに基づく新たなDNA鎖(ssDNAフラップ)を合成する。新たに合成されたssDNA鎖は健康なトリプレット反復配列を含み、また、反復の他端に隣接する配列にマッチする相同性の短いストレッチ(すなわち相同アーム)を包含するように合成される(赤色の鎖)。新たに合成された鎖の侵入、および新たに合成されたssDNAフラップによる内生DNAの爾後の置き換えは、短縮された反復アレルに至る。

具体的なトリヌクレオチド伸長障害に依存して、欠陥を誘導するトリプレット拡大は「トリヌクレオチド反復拡大タンパク質」において生起し得る。トリヌクレオチド反復拡大タンパク質は、トリヌクレオチド反復拡大障害を発生する感受性、トリヌクレオチド反復拡大障害の存在、トリヌクレオチド反復拡大障害の重症度、またはそれらのいずれかの組み合わせに関連するタンパク質の多様なセットである。トリヌクレオチド反復拡大障害は反復の型によって決定される2つのカテゴリーに分けられる。最も普通の反復はトリプレットCAGであり、これは遺伝子のコード領域に存在するときにはアミノ酸のグルタミン(Q)をコードする。よって、これらの障害はポリグルタミン(ポリQ)障害と言われ、次の疾患を含む:ハンチントン病(HD);球脊髄性筋萎縮症(SBMA);脊髄小脳失調症(SCA 1、2、3、6、7、および17型);および歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)。残りのトリヌクレオチド反復拡大障害にはCAGトリプレットが関わらないか、またはCAGトリプレットが遺伝子のコード領域にはないかどちらかであり、よって、非ポリグルタミン障害と言われる。非ポリグルタミン障害は、脆弱X症候群(FRAXA);脆弱XE精神遅滞(FRAXE);フリードライヒ運動失調症(FRDA);筋強直性ジストロフィー(DM);および脊髄小脳失調症(SCA 8および12型)を含む。

トリヌクレオチド反復拡大障害に関連するタンパク質は、トリヌクレオチド反復拡大障害に対するトリヌクレオチド反復拡大障害に関連するタンパク質の実験的関連に基づいて選択され得る。例えば、トリヌクレオチド反復拡大障害に関連するタンパク質の生産速度または循環濃度は、トリヌクレオチド反復拡大障害を欠く集団に対して相対的に、トリヌクレオチド反復拡大障害を有する集団において上昇または降下し得る。タンパク質レベルの違いは、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、および質量分析を包含するがこれらに限定されないプロテオミクス技術を用いて評価され得る。代替的には、トリヌクレオチド反復拡大障害に関連するタンパク質はタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることによって同定され得、DNAマイクロアレイ分析、遺伝子発現の連続分析(SAGE)、および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR)を包含するがこれらに限定されないゲノム技術を用いる。

プライム編集によって修正され得るトリヌクレオチド反復拡大障害に関連するタンパク質の限定しない例は、AR(アンドロゲン受容体)、FMR1(脆弱X精神遅滞1)、HTT(ハンチンチン)、DMPK(筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ)、FXN(フラタキシン)、ATXN2(アタキシン2)、ATN1(アトロフィン1)、FEN1(フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ1)、TNRC6A(トリヌクレオチド反復含有6A)、PABPN1(核ポリA結合タンパク質1)、JPH3(ジャンクトフィリン3)、MED15(メディエーター複合体サブユニット15)、ATXN1(アタキシン1)、ATXN3(アタキシン3)、TBP(TATAボックス結合タンパク質)、CACNA1A(電位依存性カルシウムチャネルP/Q型アルファ1Aサブユニット)、ATXN80S(ATXN8対向鎖(非タンパク質コード))、PPP2R2B(タンパク質ホスファターゼ2制御サブユニットBベータ)、ATXN7(アタキシン7)、TNRC6B(トリヌクレオチド反復含有6B)、TNRC6C(トリヌクレオチド反復含有6C)、CELF3(CUGBP Elav様ファミリーメンバー3)、MAB21L1(mab-21様1(C.elegans))、MSH2(mutSホモログ2結腸がん非ポリポーシス1型(E.coli))、TMEM185A(膜貫通タンパク質185A)、SIX5(SIXホメオボックス5)、CNPY3(canopy 3ホモログ(ゼブラフィッシュ))、FRAXE(脆弱部位、葉酸型、稀、fra(X)(q28)E)、GNB2(グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)ベータポリペプチド2)、RPL14(リボソームタンパク質L14)、ATXN8(アタキシン8)、INSR(インスリン受容体)、TTR(トランスサイレチン)、EP400(E1A結合タンパク質p400)、GIGYF2(GRB10相互作用GYFタンパク質2)、OGG1(8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼ)、STC1(スタニオカルシン1)、CNDP1(カルノシンジペプチダーゼ1(メタロペプチダーゼM20ファミリー))、C10orf2(染色体10オープンリーディングフレーム2)、MAML3 mastermind様3(Drosophila)、DKC1(先天性角化不全症1、ジスケリン)、PAXIP1(PAX相互作用(転写活性化ドメイン)タンパク質1)、CASK(カルシウム/カルモジュリン依存性セリンタンパク質キナーゼ(MAGUKファミリー))、MAPT(微小管関連タンパク質tau)、SP1(Sp1転写因子)、POLG(ポリメラーゼ(DNA依存性)ガンマ)、AFF2(AF4/FMR2ファミリーメンバー2)、THBS1(トロンボスポンジン1)、TP53(腫瘍タンパク質p53)、ESR1(エストロゲン受容体1)、CGGBP1(CGGリプレット反復結合タンパク質1)、ABT1(基本転写活性化因子1)、KLK3(カリクレイン関連ペプチダーゼ3)、PRNP(プリオンタンパク質)、JUN(junがん遺伝子)、KCNN3(カリウム中/小コンダクタンスカルシウム活性化チャネルサブファミリーNメンバー3)、BAX(BCL2関連Xタンパク質)、FRAXA(脆弱部位、葉酸型、稀、fra(X)(q27.3)A(巨睾丸、精神遅滞))、KBTBD10(kelch反復およびBTB(POZ)ドメイン含有10)、MBNL1(muscleblind様(Drosophila))、RAD51(RAD51ホモログ(RecAホモログ、E.coli)(S.cerevisiae))、NCOA3(核受容体コアクチベーター3)、ERDA1(伸長した反復ドメインCAG/CTG1)、TSC1(結節性硬化症1)、COMP(軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質)、GCLC(グルタミン酸-システインリガーゼ触媒サブユニット)、RRAD(糖尿病に関連するRas関連)、MSH3(mutSホモログ3(E.coli))、DRD2(ドーパミン受容体D2)、CD44(CD44分子(インド人血液型))、CTCF(CCCTC結合因子(ジンクフィンガータンパク質))、CCND1(サイクリンD1)、CLSPN(クラスピンホモログ(Xenopus laevis))、MEF2A(筋細胞エンハンサー因子2A)、PTPRU(タンパク質チロシンホスファターゼ受容体型U)、GAPDH(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ)、TRIM22(三節型モチーフ含有22)、WT1(ウィルムス腫瘍1)、AHR(アリール炭化水素受容体)、GPX1(グルタチオンペルオキシダーゼ1)、TPMT(チオプリンS-メチルトランスフェラーゼ)、NDP(ノリエ病(偽神経膠腫))、ARX(aristaless関連ホメオボックス)、MUS81(MUS81エンドヌクレアーゼホモログ(S.cerevisiae))、TYR(チロシナーゼ(眼皮膚白皮症IA))、EGR1(初期増殖応答1)、UNG(ウラシル-DNAグリコシラーゼ)、NUMBL(numbホモログ(Drosophila)様)、FABP2(腸脂肪酸結合タンパク質2)、EN2(engrailedホメオボックス2)、CRYGC(クリスタリンガンマC)、SRP14(シグナル認識粒子14kDa(相同的Alu RNA結合タンパク質))、CRYGBクリスタリンガンマB)、PDCD1(プログラム細胞死1)、HOXA1(ホメオボックスA1)、ATXN2L(アタキシン2様)、PMS2(PMS2減数分裂後分離増大2(S.cerevisiae))、GLA(ガラクトシダーゼアルファ)、CBL(Cas-Br-M(ネズミ)同種指向性レトロウイルス形質転換配列)、FTH1(フェリチン重鎖ポリペプチド1)、IL12RB2(インターロイキン12受容体ベータ2)、OTX2(orthodenticleホメオボックス2)、HOXA5(ホメオボックスA5)、POLG2(ポリメラーゼ(DNA依存性)ガンマ2補助的サブユニット)、DLX2(distal-lessホメオボックス2)、SIRPA(シグナル制御タンパク質アルファ)、OTX1(orthodenticleホメオボックス1)、AHRR(アリール炭化水素受容体リプレッサー)、MANF(中脳アストロサイト由来神経栄養因子)、TMEM158(膜貫通タンパク質158(遺伝子/偽遺伝子))、およびENSG00000078687を包含する。

具体的な側面において、本開示は、拡大反復障害(また反復拡大障害もしくはトリヌクレオチド反復障害としても知られている)と診断された対象の処置のためのTPRTベースの方法を提供する。拡大反復障害は、マイクロサテライト反復が長さ閾値を超えて拡大したときに生じる。目下、少なくとも30の遺伝的疾患は、反復拡大によって引き起こされるものと考えられている。この多様な群の障害への科学的理解は、1990年代初頭に、トリヌクレオチド反復が、脆弱X、球脊髄性筋萎縮症、筋強直症ジストロフィー、およびハンチントン病(Nelson et al,“The unstable repeats-3 evolving faces of neurological disease,”Neuron,March 6,2013,Vol.77;825-843(これは参照により本明細書に組み込まれる))、ならびにホー・リバー(Haw River)症候群、ヤコブセン症候群、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)、マシャド・ジョセフ病、合多指症(SPD II)、手足生殖器症候群(HFGS)、鎖骨頭蓋異形成症(CCD)、全前脳欠損障害(HPE)、先天性中枢性低換気症候群(CCHS)、ARX非症候性のX連鎖精神遅滞(XLMR)、および眼咽頭型筋ジストロフィー(OPMD)(参照を包含する、数種の主要な遺伝性疾病にあるという発見で明るみに出た。マイクロサテライト反復の不安定性は、反復拡大が、後に続く各世代に生じ得、子孫におけるより重度の表現型および発症の低年齢へ繋がるという現象が予想されたとおり、これらの疾病の証であることが見出された。反復拡大は、数種の異なる機序を介して疾患を引き起こすものと考えられている。つまり、拡大は、遺伝子、mRNA転写産物、および/またはコードされたタンパク質のレベルにて機能する細胞に干渉し得る。いくつかの疾病において、突然変異は、反復含有遺伝子をサイレンシングすることによる機能喪失型の機序を介して作用する。その他において、疾患は、mRNA転写産物またはタンパク質のいずれかが新しい異常な機能を帯びるようになる機能獲得型の機序の結果として生じる。

一態様において、トリヌクレオチド反復障害を処置する方法は、図23に描かれている。一般に、アプローチは、プライム編集プロセスの機序を通して内生の罹患トリヌクレオチド反復配列を置き換えることが意図される、所望されかつ健常な置き換えトリヌクレオチド反復配列をコードする領域を含む伸長されたgRNAと組み合わせて、TPRTゲノム編集(すなわち、プライム編集)を使用することを伴う。例示の、トリヌクレオチド反復配列を縮小するためのgRNAデザインおよびTPRTゲノム編集でのトリヌクレオチド反復縮小の概略図が、図23に示される。

プリオン病
プライム編集は、疾患の過程においてミスフォールディングされるようになるプリオンタンパク質(PRNP)上への1つ以上の防護性変異の組み入れによって、プリオン病を防止またはその進行を停止させるためにもまた用いられ得る。プリオン病または伝達性海綿状脳症(TSE)は、ヒトおよび動物両方を冒す稀な進行性の神経変性障害のファミリーである。それらは、長い潜伏期間、ニューロン喪失に関連する特徴的な海綿状変化、および炎症性応答を誘導することの失敗によって見分けられる。

ヒトでは、プリオン病は、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、およびクールー病を包含する。動物では、プリオン病は牛海綿状脳症(BSEまたは「狂牛病」)、慢性消耗病(CWD)、スクレイピー、伝達性ミンク脳症、ネコ海綿状脳症、および有蹄類海綿状脳症を包含する。これらのプリオン病のいずれか1つを防止またはその進行を停止させるために、プライム編集は防護性の点変異をプリオンタンパク質上に組み入れるために用いられ得る。

古典的CJDはヒトプリオン病である。それは、特徴的な臨床および診断特色を有する神経変性障害である。この疾患は急速に進行性であり、常に致死的である。この疾患による感染は通常は病気の発症から１年以内に死に至る。CJDは急速に進行性の変わることなく致死的な神経変性障害であり、プリオンタンパク質として公知の細胞性の糖タンパク質の異常なアイソフォームによって引き起こされると信じられている。CJDは世界的に生起し、米国を包含する多くの国の見積もられる年間発生率は100万人の集団あたり約1ケースであることが報告されている。CJD患者の大多数は通常は病気の発症から１年以内に死ぬ。CJDは、ヒトおよび動物において生起する他のプリオン病と併せて、伝達性海綿状脳症(TSE)として分類される。患者の約85％では、CJDは伝達の認識可能なパターンなしに特発性疾患として生起する。患者のより小さい割合(5から15％)は、プリオンタンパク質遺伝子の受け継がれた変異ゆえにCJDを発生する。これらの受け継がれる形態は、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群および致死性家族性不眠症を包含する。CJDについて、処置は現行では公知ではない。

変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)は英国で1996年に最初に記載されたプリオン病である。今や、牛のプリオン病の牛海綿状脳症(BSEまたは「狂牛」病)のアウトブレイクを担う物質が、ヒトのvCJDのアウトブレイクを担う同じ物質であるという強い科学的証拠がある。バリアントCJD(vCJD)は古典的CJD(多くの場合には単純にCJDと呼ばれる)と同じ疾患ではない。それは古典的CJDとは異なる臨床的および病理学的特徴を有する。各疾患はプリオンタンパク質遺伝子の具体的な遺伝子プロファイルをもまた有する。両方の障害は、年で測定される普通でなく長い潜伏期間を有する変わることなく致死的な脳疾患であり、プリオンと呼ばれる非従来的な伝達性物質によって引き起こされる。vCJDについて、処置は現行では公知ではない。

BSE(牛海綿状脳症または「狂牛病」)は、プリオンと呼ばれる普通でない伝達性物質による感染からもたらされる畜牛の進行性の神経学的障害である。伝達性物質の性質は良く理解されてはいない。現行では、最も受け入れられた理論は、物質が、プリオンタンパク質として公知の正常タンパク質の改変された形態であるということである。まだ理解されていない理由から、正常なプリオンタンパク質は病原性の(有害な)形態へと変化し、これはそれから畜牛の中枢神経系を損傷する。BSEの異なる株があるという増大して行く証拠がある:英国におけるアウトブレイクを担った典型的または古典的BSE株および2つの非典型的な株(HおよびL株)である。BSEについて、処置は現行では公知ではない。

慢性消耗病(CWD)は、鹿、ヘラジカ、トナカイ、ニホンジカ、およびムースを冒すプリオン病である。それはカナダおよび米国を包含する北米、ノルウェー、ならびに韓国のいくつかのエリアにおいて見出されている。感染動物が症状を発生する前には1年超がかかり得、これらは激しい体重減少(消耗)、よろめき、無気力、および他の神経症状を包含し得る。CWDは全ての年齢の動物を冒し得、いくつかの感染動物はいつか疾患を発生することなしに死に得る。CWDは動物にとって致死的であり、処置またはワクチンはない。

TSEの原因物質はプリオンであると信じられている。用語「プリオン」は、伝達性であり、脳に最も豊富に見出されるプリオンタンパク質と呼ばれる特定の正常な細胞性タンパク質の異常なフォールディングを誘導する能力がある異常な病原性物質を言う。これらの正常なプリオンタンパク質の機能はなお完全には理解されていない。プリオンタンパク質の異常なフォールディングは脳損傷と疾患の特徴的な徴候および症状とに至る。プリオン病は通常は急速に進行性であり、常に致死的である。

本願において用いられる用語「プリオン」は、ヒトおよび動物の疾患(海綿状脳症)を引き起こすことが公知の感染性粒子を意味する。用語「プリオン」は単語「タンパク質」および「感染」の短縮であり、粒子は、専らではないにしても、大きくは、立体配座を変化させてPRNP^ScになるPRNP^Cを発現するPRNP遺伝子によってコードされるPRNP^Sc分子からなる。プリオンは細菌、ウイルス、およびウイロイドとは別物である。公知のプリオンは、動物に感染して、羊および山羊の神経系の伝達性の変性疾患スクレイピー、ならびに牛海綿状脳症(BSE)または狂牛病および猫のネコ海綿状脳症を引き起こすものを包含する。ヒトを冒すことが公知の上で論じられている4つのプリオン病は(1)クールー病、(2)クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、(3)ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病(GSS)、および(4)致死性家族性不眠症(FFI)である。本願において用いられるプリオンは、用いられるいずれかの動物、具体的にはヒトおよび飼育畜産動物においてこれらの疾患または他の全てまたはいずれかを引き起こすプリオンの全ての形態を包含する。

一般的に、理論によって拘束されることなしに、プリオン病はプリオンタンパク質のミスフォールディングによって引き起こされる。多くの場合に沈着性疾患と呼ばれるかかる疾患、プリオンタンパク質のミスフォールディングは次のとおり説明され得る。Aが、意図される生理的役割をモノマーまたはオリゴマー状態で実行する正常に合成された遺伝子産物であり、かつA*が、劇的な立体配座変化を経過するために有能であるAの立体配座的に活性化された形態である場合には、Bは多量体アセンブリを好む立体配座的に変改された状態であり(すなわち、沈着を形成するミスフォールディングされた形態)、かつB_nは、病原性であり、リサイクルすることが相対的に困難である多量体材料である。プリオン病では、PRNP^CおよびPRNP^Scは状態AおよびB_nに対応し、ここで、Aは大きくはヘリカルかつモノマー性であり、B_nはβリッチかつ多量体性である。

プリオンタンパク質のある種の変異はプリオン(prior)病の増大したリスクに関連し得るということが公知である。反対に、プリオンタンパク質のある種の変異は天然に防護性であり得る。Bagynszky et al.,“Characterization of mutations in PRNP(prion)gene and their possible roles in neurodegenerative diseases,”Neuropsychiatr Dis Treat.,2018;14:2067-2085を見よ。これの内容は参照によって本願に組み込まれる。

PRNP(NCBI RefSeq No.NP_000302.1(配列番号291))ヒトプリオンタンパク質は、染色体20(4686151-4701588)上に位置付けられた16kb長の遺伝子によってコードされる。それは2つのエキソンを含有し、エキソン2はオープンリーディングフレームを持ち、これは253アミノ酸(AA)長のPrPタンパク質をコードする。エキソン1は非コードエキソンであり、これは転写開始部位としての用をなし得る。翻訳後修飾は最初の22AA N末端フラグメント(NTF)および最後の23AA C末端フラグメント(CTF)の除去をもたらす。NTFは小胞体(ER)へのPrP輸送後に切断され、CTF(グリコシルホスファチジルイノシトール[GPI]シグナルペプチド[GPI-SP])はGPIアンカーによって切断される。GPIアンカーはPrPタンパク質輸送に関わり得る。それは細胞膜の外側表面へのプリオンタンパク質の取り付けの役割をもまた演じ得る。正常なPrPは、長いN末端ループ(これはオクタペプチド反復領域を含有する)、2つの短いβシート、3つのαヘリックス、およびC末端領域(これはGPIアンカーを含有する)から成る。PrPの切断は、細胞膜にアンカー固定される208AA長の糖タンパク質をもたらす。

PRNP(NP_000302.1)の253アミノ酸配列は以下のとおりである:
MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPV(配列番号291)。

PRNP(NP_000302.1)の253アミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列(NCBI Ref.Seq No.NM_000311.5,“homo sapiens prion protein(PRNP),transcript variant 1,mRNA)によってコードされており、以下のとおりである:
GCGAACCTTGGCTGCTGGATGCTGGTTCTCTTTGTGGCCACATGGAGTGACCTGGGCCTCTGCAAGAAGCGCCCGAAGCCTGGAGGATGGAACACTGGGGGCAGCCGATACCCGGGGCAGGGCAGCCCTGGAGGCAACCGCTACCCACCTCAGGGCGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCCCATGGTGGTGGCTGGGGACAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGTCAAGGAGGTGGCACCCACAGTCAGTGGAACAAGCCGAGTAAGCCAAAAACCAACATGAAGCACATGGCTGGTGCTGCAGCAGCTGGGGCAGTGGTGGGGGGCCTTGGCGGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGAGCAGGCCCATCATACATTTCGGCAGTGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGATGAGGAAGGTCTTCCTGTTTTCACCATCTTTCTAATCTTTTTCCAGCTTGAGGGAGGCGGTATCCACCTGCAGCCCTTTTAGTGGTGGTGTCTCACTCTTTCTTCTCTCTTTGTCCCGGATAGGCTAATCAATACCCTTGGCACTGATGGGCACTGGAAAACATAGAGTAGACCTGAGATGCTGGTCAAGCCCCCTTTGATTGAGTTCATCATGAGCCGTTGCTAATGCCAGGCCAGTAAAAGTATAACAGCAAATAACCATTGGTTAATCTGGACTTATTTTTGGACTTAGTGCAACAGGTTGAGGCTAAAACAAATCTCAGAACAGTCTGAAATACCTTTGCCTGGATACCTCTGGCTCCTTCAGCAGCTAGAGCTCAGTATACTAATGCCCTATCTTAGTAGAGATTTCATAGCTATTTAGAGATATTTTCCATTTTAAGAAAACCCGACAACATTTCTGCCAGGTTTGTTAGGAGGCCACATGATACTTATTCAAAAAAATCCTAGAGATTCTTAGCTCTTGGGATGCAGGCTCAGCCCGCTGGAGCATGAGCTCTGTGTGTACCGAGAACTGGGGTGATGTTTTACTTTTCACAGTATGGGCTACACAGCAGCTGTTCAACAAGAGTAAATATTGTCACAACACTGAACCTCTGGCTAGAGGACATATTCACAGTGAACATAACTGTAACATATATGAAAGGCTTCTGGGACTTGAAATCAAATGTTTGGGAATGGTGCCCTTGGAGGCAACCTCCCATTTTAGATGTTTAAAGGACCCTATATGTGGCATTCCTTTCTTTAAACTATAGGTAATTAAGGCAGCTGAAAAGTAAATTGCCTTCTAGACACTGAAGGCAAATCTCCTTTGTCCATTTACCTGGAAACCAGAATGATTTTGACATACAGGAGAGCTGCAGTTGTGAAAGCACCATCATCATAGAGGATGATGTAATTAAAAAATGGTCAGTGTGCAAAGAAAAGAACTGCTTGCATTTCTTTATTTCTGTCTCATAATTGTCAAAAACCAGAATTAGGTCAAGTTCATAGTTTCTGTAATTGGCTTTTGAATCAAAGAATAGGGAGACAATCTAAAAAATATCTTAGGTTGGAGATGACAGAAATATGATTGATTTGAAGTGGAAAAAGAAATTCTGTTAATGTTAATTAAAGTAAAATTATTCCCTGAATTGTTTGATATTGTCACCTAGCAGATATGTATTACTTTTCTGCAATGTTATTATTGGCTTGCACTTTGTGAGTATTCTATGTAAAAATATATATGTATATAAAATATATATTGCATAGGACAGACTTAGGAGTTTTGTTTAGAGCAGTTAACATCTGAAGTGTCTAATGCATTAACTTTTGTAAGGTACTGAATACTTAATATGTGGGAAACCCTTTTGCGTGGTCCTTAGGCTTACAATGTGCACTGAATCGTTTCATGTAAGAATCCAAAGTGGACACCATTAACAGGTCTTTGAAATATGCATGTACTTTATATTTTCTATATTTGTAACTTTGCATGTTCTTGTTTTGTTATATAAAAAAATTGTAAATGTTTAATATCTGACTGAAATTAAACGAGCGAAGATGAGCACCA(配列番号292)

CJDおよびFFIにリンクしているPRNP(NP_000302.1)に対して相対的な変異部位は報告されており、次のとおりである。これらの変異は本明細書に開示のプライム編集因子を用いて除去または組み入れられ得る。

GSSにリンクしているPRNP(NP_000302.1)(配列番号291)に対して相対的な変異部位は次のとおり報告されている:

プリオン病に対する可能な防護性の性質にリンクしているPRNP(NP_000302.1)(配列番号291)に対して相対的な変異部位は次のとおり:

それゆえに、種々の態様において、プライム編集は、プリオン病にリンクしているPRNPの変異を除去するかまたはプリオン病に対して防護性であると考慮されるPRNPの変異を組み入れるために用いられ得る。例えば、プライム編集は、PRNPタンパク質のD178N、V180I、T188K、E196K、E196A、E200K、E200G、V203I、R208H、V210I、E211Q、I215V、またはM232R変異を除去または復元するために用いられ得る(NP_000302.1のPRNPに対して相対的)(配列番号291)。他の態様において、プライム編集は、PRNPタンパク質のP102L、P105L、A117V、G131V、V176G、H187R、F198S、D202N、Q212P、Q217R、またはM232T変異を除去または復元するために用いられ得る(NP_000302.1のPRNPに対して相対的)(配列番号291)。プライム編集を用いてPRNPのかかる変異の存在を除去または修正することによって、プリオン病のリスクが縮減または消去され得る。

他の態様において、プライム編集は、1つ以上のプリオン病に対する防護性の効果にリンクしているPRNPの防護性変異を組み入れるために用いられ得る。例えば、プライム編集は、PRNPのG127S、G127V、M129V、D167G、D167N、N171S、E219K、またはP238S防護性変異を組み入れるために用いられ得る(NP_000302.1のPRNPに対して相対的)(配列番号291)。なお他の態様において、防護性変異は、PRNPのG127、G127、M129、D167、D167、N171、E219、またはP238に組み入れされるいずれかの代替アミノ酸であり得る(NP_000302.1のPRNPに対して相対的)(配列番号291)。

具体的な態様では、図27において例解され例5において論じられるとおり、プライム編集はG127V防護性変異をPRNPに組み入れるために用いられ得る。

別の態様では、プライム編集はE219K防護性変異をPRNPに組み入れるために用いられ得る。

PRNPタンパク質および防護性変異部位は哺乳動物において保存されている。そのため、ヒト疾患を処置することに加えて、それは、プリオン病に対して免疫がある牛および羊を生成するか、またはさらにはプリオン病を患っている動物の野生集団を治癒させることを助けるためにもまた用いられ得る。プライム編集はヒト細胞における天然に存在する防護性アレルの～25％組み入れを達成するためにすでに用いられており、先のマウス実験は組み入れのこのレベルがほとんどのプリオン病に対する免疫を引き起こすために十分であるということを指示している。この方法は、ほとんどの細胞型においてかかる高い効率でこのアレルを組み入れるための第1のかつ可能性としては唯一の現行のやり方である。処置のための別の可能な戦略は、プライム編集を用いて、早期停止コドンを遺伝子に組み入れることによってPRNPの発現を縮減または消去することである。

PEgRNAデザインのための本明細書に記載の原理を用いて、適当なPEgRNAが、所望の防護性変異を組み入れるために、またはPRNPからプリオン病関連変異を除去するためにデザインされ得る。例えば、PEgRNAの下のリストは、G127V防護性アレルおよびE219K防護性アレルをヒトPRNPに、ならびにG127V防護性アレルを種々の動物のPRNPに組み入れるために用いられ得る。

[9]医薬組成物
他の本開示の側面は、本明細書に記載のプライム編集系の様々な構成要素のいずれも(例として、これらに限定されないが、napDNAbp、逆転写酵素、融合タンパク質(例として、napDNAbpsと逆転写酵素とを含む)、伸長されたガイドRNA、および融合タンパク質と伸長されたガイドRNAとを含む複合体、ならびに第2鎖へニックを入れる構成要素および5'内生DNAフラップ除去エンドヌクレアーゼなどの、編集済産物形成へのプライム編集プロセスを推進するのに役立つ付属要素を包含する)含む医薬組成物に関する。

用語「医薬組成物」は、本明細書に使用されるとき、医薬使用のために製剤化された組成物を指す。いくつかの態様において、医薬組成物はさらに、薬学的に許容し得る担体を含む。いくつかの態様において、医薬組成物は、追加の剤(例として、特定の送達、半減期の増大、または他の治療的化合物のための)を含む。

ここで使用されるとき、用語「薬学的に許容し得る担体」は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤(例として、潤滑剤、タルクマグネシウム、カルシウム、またはステアリン酸亜鉛もしくはステアリン酸)、あるいは身体のある部位(例として、送達部位)から別の部位(例として、器官、組織、もしくは身体部分)へ化合物を運搬または輸送することに関与する溶媒封入材料などの、薬学的に許容し得る材料、組成物、またはビヒクルを意味する。薬学的に許容し得る担体は、製剤の他の成分と相溶性があるが対象の組織に対しては傷害性がない(例として、生理学的に相溶性のある、滅菌された、生理学的なpH、等々)という意味で「許容し得る」ものである。薬学的に許容し得る担体として働き得る材料のいくつかの例は以下を包含する:(1)ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの、糖;(2)コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどの、デンプン;(3)ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、および酢酸セルロースなどの、セルロースおよびその誘導体;(4)粉末状トラガカント;(5)麦芽;(6)ゼラチン;(7)ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなどの、平滑剤;(8)カカオバターおよび坐薬蝋などの、賦形剤;(9)落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ 油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油などの、油;(10)プロピレングリコールなどの、グリコール;(11)グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール(PEG)などの、ポリオール;(12)オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどの、エステル;(13)寒天;(14)水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの、緩衝剤;(15)アルギン酸;(16)パイロジェンフリー水;(17)等浸透圧の生理食塩水;(18)リンガー溶液;(19)エチルアルコール;(20)pH緩衝溶液;(21)ポリエステル、ポリカーボネート、および/またはポリ酸無水物;(22)ポリペプチドおよびアミノ酸などの、増量剤;(23)血清アルブミン、HDL、およびLDLなどの、血清構成要素;(22)エタノールなどの、C2～C12アルコール;ならびに(23)医薬製剤に採用される、相溶性のある他の非毒性物質。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存料、および抗酸化剤もまた、製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容し得る担体」または同種のものなどの用語は本明細書中、互換的に使用される。

いくつかの態様において、医薬組成物は、対象への送達のために、例として、遺伝子編集のために、製剤化される。本明細書に記載の医薬組成物を投与する好適なルートは、限定せずに、以下を包含する:局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内(intradental)、蝸牛内、経鼓膜、器官内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、および脳室内の投与。

いくつかの態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、罹患部位(例として、腫瘍部位)へ局部的に投与される。いくつかの態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、注射によって、カテーテルを用いて、坐薬を用いて、あるいは移植片(多孔性材料、非多孔性材料、またはゼラチン材料(シラスティック膜などの膜もしくは繊維を包含する)の移植片)を用いて、対象へ投与される。

他の態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、制御放出系において送達される。一態様において、ポンプが使用されてもよい(例として、Langer,1990,Science 249:1527-1533;Sefton,1989,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201;Buchwald et al.,1980,Surgery 88:507;Saudek et al.,1989,N.Engl.J.Med.321:574を参照)。別の態様において、ポリマー材料が使用され得る。(例として、Langer and Wise eds.,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1974);Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance(Smolen and Ball eds.,Wiley,New York,1984);Ranger and Peppas,1983,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61を参照。またLevy et al.,1985,Science 228:190;During et al.,1989,Ann.Neurol.25:351;Howard et al.,1989,J.Neurosurg.71:105も参照。)他の制御放出系も、例えば、Langer(上記を参照)において考察されている。

いくつかの態様において、医薬組成物は、対象(例として、ヒト)への静脈内投与または皮下投与に適した組成物として、定型的な手順に従って製剤化される。いくつかの態様において、注射による投与のための医薬組成物は、滅菌された等浸透圧の水性緩衝液中の溶液である。必要なら、医薬はまた、可溶化剤、および注射部位での疼痛を和らげるリグノカインなどの局所麻酔薬も包含し得る。一般に、成分は、個別にまたは一緒に混合されて、例えば、活性剤の分量を示したアンプルもしくは小袋(sachette)などの密閉容器中の凍結乾燥された(dry liophilized)粉末または水がない濃縮物として単位剤形で供給される。医薬が注入によって投与されることになっている場合、滅菌医薬グレードの水または生理食塩水を含有する注入瓶で分配され得る。医薬組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルは、成分が投与に先立ち混合され得るように、提供され得る。

全身投与のための医薬組成物は、液体、例として、滅菌された生理食塩水、乳酸リンガー溶液またはハンクス溶液であってもよい。加えて、医薬組成物は固体形態であって、使用に先立ち即時に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥された形態もまた企図される。

医薬組成物は、非経口投与にも好適なリポソームもしくはマイクロ結晶などの脂質粒子またはベシクル内に含有され得る。粒子は、組成物がこれに含有される限り、単層(unilamellar)または多層(plurilamellar)などの、いずれの好適な構造でもあり得る。化合物は、膜融合(fusogenic)脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、低レベル(5～10mol％)のカチオン性脂質を含有し、かつポリエチレングリコール(PEG)コーティングによって安定化された「安定化プラスミド-脂質粒子」(SPLP)に封入され得る(Zhang Y.P.et al.,Gene Ther.1999,6:1438-47)。N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル-アンモニウムメチルスルファート、または「DOTAP」などの、正に帯電した脂質は、かかる粒子およびベシクルにとって具体的に好ましい。かかる脂質粒子の調製は周知である。例として、米国特許第4,880,635号;第4,906,477号;第4,911,928号;第4,917,951号;第4,920,016号;および第4,921,757号を参照;これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、単位用量として投与またはパッケージされてもよい。用語「単位用量」は、本開示の医薬組成物に関して使用されるとき、まとまった投薬量として対象に好適な、物理的に不連続な単位を指し、予め決められた分量の活性材料を含有する各単位は、要求される希釈剤;すなわち、担体またはビヒクルを伴って所望の治療効果を産生するよう算出される。

さらに、医薬組成物は、(a)本発明の化合物を凍結乾燥形態で含有する容器、および(b)注射のための薬学的に許容し得る希釈剤(例として、滅菌水)を含有する第2容器を含む医薬のキットとして提供され得る。薬学的に許容し得る希釈剤は、凍結乾燥された本発明の化合物の再構成または希釈のために使用され得る。任意に、かかる容器(単数または複数)に関連する通知は、医薬もしくは生物学的産物の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定される形態であり得、前記通知は、ヒト投与のための製造、使用、または販売の機関による承認を反映する。

別の側面において、上に記載の疾患の処置に有用な材料を含有する製造物品が、包含される。いくつかの態様において、製造物品は、容器およびラベルを含む。好適な容器は、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、および試験管を包含する。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。いくつかの態様において、容器は、本明細書に記載の疾患を処置するのに有効であって滅菌アクセスポートを有していてもよい組成物をとどめておく。例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい。組成物中の活性剤は本発明の化合物である。いくつかの態様において、容器上のまたはこれに関連したラベルは、組成物が、選んだ疾患を処置するのに使用されることを示す。製造物品はさらに、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容し得る緩衝液を含む第2容器を含んでもよい。これはさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用のための指示がある添付文書を包含する、商業的観点およびユーザーの観点から所望される他の材料も包含していてもよい。

[10]キット、ベクター、細胞、および送達
キット
本開示の組成物は、キット中へ集められ得る。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載のプライム編集因子の発現のための核酸ベクターを含む。他の態様において、キットはさらに、適切なガイドヌクレオチド配列(例として、PEgRNAおよび第2部位gRNA)、またはかかるガイドヌクレオチド配列(Cas9タンパク質またはプライム編集因子に所望の標的配列を標的にさせる)の発現のための核酸ベクターを含む。

本明細書に記載のキットは、本明細書に記載の方法を実施するための構成要素および任意に使用のための指示を収納する1以上の容器を包含していてもよい。本明細書に記載のキットのいずれも、アッセイ方法を実施するのに必要とされる構成要素をさらに含んでいてもよい。キットの各構成要素は、適用可能であれば、液体形態(例として、溶液中)で、または固体形態(例として、乾燥粉末)で提供されてもよい。あるケースにおいて、構成要素のいくつかは、例えば、好適な溶媒または他の種(例えば、水)(これらはキットとともに提供されてもまたはされなくてもよい)の添加によって、再構成可能または別様に(例として、活性形態へ)処理可能であってもよい。

いくつかの態様において、キットは任意に、提供される構成要素の使用のための指示および/または促進(promotion)を包含していてもよい。本明細書に使用されるとき、「指示」は、指示および/または促進の構成要素を定義し得るものであって、典型的には、本開示のパッケージング上にまたはこれに関連して書面の指示を伴い得る。指示はまた、ユーザーが明確に、指示がキットに関連するものであることを認識できるように(例えば、視聴覚に訴えるもの(例として、ビデオテープ、DVD、等々)、インターネット、および/またはウェブベースの連絡、等々)、形はどうあれ、いずれの口授または電子的指示も包含し得る。書面の指示は、医薬もしくは生物学的産物の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定される形態であってもよく、これは動物投与のための製造、使用、または販売の機関による承認も反映し得る。本明細書に使用されるとき、「促進された」は、本開示に関連する、教育方法、病院のおよび他の臨床の指示、科学研究、薬物の発見または開発、学術研究、医薬産業活動(医薬販売を包含する)、ならびにいずれの広告活動または他の宣伝活動(いずれの形態の書面の、口述の、および電子的な連絡を包含する)を包含する、営業行為のすべての方法を包含する。加えて、キットは、本明細書に記載のとおりの特定の用途に応じて、他の構成要素も包含していてもよい。

キットは、1以上の容器中に、本明細書に記載のいずれの構成要素の1以上を含有していてもよい。構成要素は、滅菌的に調製され、シリンジ中にパッケージされ、および冷凍保存されて出荷されてもよい。代替的に、これは、バイアルまたは保管のための他の容器に収納されてもよい。第2容器は、滅菌的に調製された他の構成要素も有していてもよい。代替的に、キットは、予め混合されて、バイアル、管、または他の容器中で出荷される活性剤を包含していてもよい。

キットは、パウチ、1以上の管、容器、箱、または袋内に緩くパックされた付属物とともに、ブリスターパウチ(blister pouch)、収縮包装パウチ、真空シール可能なパウチ、シール可能な熱成形トレイ、または同様のパウチもしくはトレイの形態などの様々な形態を有してもよい。キットは、付属物が加えられた後に滅菌されてもよく、これによって容器中の個々の付属物が別様に開封され得る。キットは、放射線滅菌、加熱滅菌、または当該技術分野において知られている他の滅菌方法などの、いずれの適切な滅菌技法も使用して滅菌され得る。キットはまた、特定の用途に応じて、他の構成要素、例えば、容器、細胞培地、塩、緩衝剤、試薬、シリンジ、針、殺菌剤を適用または除去するための生地(ガーゼなど)、使い捨て手袋、投与に先立ち剤を支持するためのもの等々も包含していてもよい。本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載のプライム編集系の様々な構成要素(例として、これらに限定されないが、napDNAbp、逆転写酵素、ポリメラーゼ、融合タンパク質(例として、napDNAbpと逆転写酵素(またはより広くは、ポリメラーゼ)とを含む)、伸長されたガイドRNA、および融合タンパク質と伸長されたガイドRNAとを含む複合体、ならびに第2鎖へニックを入れる構成要素(例として、第2鎖へニックを入れるgRNA)および5'内生DNAフラップ除去エンドヌクレアーゼなどの付属要素(編集済産物形成へのプライム編集プロセスを推進するのに役立つ)を包含する)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含むキットを提供する。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列(単数または複数)は、プライム編集系構成要素の発現を推進する異種プロモーター(または単一のプロモーターより多く)を含む。

本開示の他の側面は、本明細書に記載のプライム編集因子系の様々な構成要素(例として、標的DNA配列を修飾することが可能なプライム編集因子系の構成要素をコードするヌクレオチド配列を含む)をコードする1以上の核酸構築物を含むキットを提供する。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、プライム編集因子系構成要素の発現を推進する異種プロモーターを含む。

本開示のいくつかの側面は、(a)逆転写酵素と融合したnapDNAbp(例として、Cas9ドメイン)をコードするヌクレオチド配列、および(b)(a)の配列の発現を推進する異種プロモーターを含む核酸構築物を含むキットを提供する。

細胞
本明細書に記載の組成物のいずれも含有していてもよい細胞は、原核細胞および真核細胞を包含する。本明細書に記載の方法は、Cas9タンパク質またはプライム編集因子を真核細胞(例として、ヒト細胞などの哺乳動物の細胞)中へ送達するのに使用される。いくつかの態様において、細胞は、in vitroにある(例として、培養された細胞)。いくつかの態様において、細胞は、in vivoにある(例として、ヒト対象などの対象中にある)。いくつかの態様において、細胞は、ex vivoにある(例として、対象から単離され、同じ対象へ戻すかまたは異なる対象へ投与されてもよい)。

本開示の哺乳動物の細胞は、ヒト細胞、霊長目の動物細胞(例として、ベロ細胞)、ラット細胞(例として、GH3細胞、OC23細胞)、またはマウス細胞(例として、MC3T3細胞)を包含する。様々なヒト細胞株には、限定せずに、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞、HeLa細胞、国立がん研究所の60のがん細胞株(NCI60)からのがん細胞、DU145(前立腺がん)細胞、Lncap(前立腺がん)細胞、MCF-7(乳がん)細胞、MDA-MB-438(乳がん)細胞、PC3(前立腺がん)細胞、T47D(乳がん)細胞、THP-1(急性骨髄性白血病)細胞、U87(膠芽腫)細胞、SHSY5Yヒト神経芽細胞腫細胞(骨髄腫からクローン化)、およびSaos-2(骨がん)細胞が包含される。いくつかの態様において、rAAVベクターは、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞(例として、HEK293またはHEK 293T細胞)中へ送達される。いくつかの態様において、rAAVベクターは、例えば、多能性幹細胞(例として、ヒト人工(induced)多能性幹細胞(hiPSC)を包含するヒト多能性幹細胞)などの、幹細胞(例として、ヒト幹細胞)中へ送達される。幹細胞は培養中、無期限に分裂して、特化された細胞を生じさせる能力をもつ細胞を指す。多能性幹細胞は、分化して生物のすべての組織になることが可能であるが、完全な生物の発生を単独では支えることが可能でないある種の幹細胞を指す。ヒト人工多能性幹細胞は、胚性幹細胞を定義する特性を維持するのに重要な遺伝子および因子の発現が強いられることによって胚性幹細胞様状態へ再プログラムされる体細胞(例として、成熟した(mature)細胞または成熟(adult)細胞)を指す(例として、Takahashi and Yamanaka,Cell 126(4):663-76,2006を参照(参照により本明細書に組み込まれる))。ヒト人工多能性幹細胞は、幹細胞マーカーを発現しており、全3種の胚葉(外胚葉、内胚葉、中胚葉)の細胞特徴を生成するのが可能である。

本開示に従って使用されてもよい追加の細胞株の非限定例は、293-T、293-T、3T3、4T1、721、9L、A-549、A172、A20、A253、A2780、A2780ADR、A2780cis、A431、ALC、B16、B35、BCP-1、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C2C12、C3H-10T1/2、C6、C6/36、Cal-27、CGR8、CHO、CML T1、CMT、COR-L23、COR-L23/5010、COR-L23/CPR、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、E14Tg2a、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、Hepa1c1c7、High Five細胞、HL-60、HMEC、HT-29、HUVEC、J558L細胞、Jurkat、JY細胞、K562細胞、KCL22、KG1、Ku812、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1、2、3....48、MC-38、MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、MDCK II、MG63、MONO-MAC 6、MOR/0.2R、MRC5、MTD-1A、MyEnd、NALM-1、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NW-145、OPCN/OPCT Peer、PNT-1A/PNT 2、PTK2、Raji、RBL細胞、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、S2、Saos-2細胞、Sf21、Sf9、SiHa、SKBR3、SKOV-3、T-47D、T2、T84、THP1、U373、U87、U937、VCaP、WM39、WT-49、X63、YAC-1、およびYAR細胞を包含する。

本開示のいくつかの側面は、本明細書に開示される構築物のいずれも含む細胞を提供する。いくつかの態様において、宿主細胞は、本明細書に記載の1以上のベクターで一過的または非一過的にトランスフェクトされている。いくつかの態様において、細胞は、対象中に天然に存在するとき、トランスフェクトされる。いくつかの態様において、トランスフェクトされる細胞は、対象から採られる。いくつかの態様において、細胞は、細胞株などの、対象から採られた細胞に由来する。組織培養のための多種多様の細胞株が当該技術分野において知られている。細胞株の例は、これらに限定されないが、C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLa-S3、Huh1、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panc1、PC-3、TF1、CTLL-2、C1R、Rat6、CV1、RPTE、A10、T24、J82、A375、ARH-77、Calu1、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388D1、SEM-K2、WEHI-231、HB56、TIB55、Jurkat、J45.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、Hep G2、HeLa B、HeLa T4、COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1サル腎臓上皮、BALB/3T3マウス胚線維芽細胞、3T3 Swiss、3T3-L1、132-d5ヒト胎児線維芽細胞;10.1マウス線維芽細胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A 172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-1細胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293.BxPC3.C3H-10T1/2、C6/36、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-K1、CHO-K2、CHO-T、CHO Dhfr -/-、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L23/5010、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CML T1、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepa1c1c7、HL-60、HMEC、HT-29、Jurkat、JY細胞、K562細胞、Ku812、KCL22、KG1、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCK II、MDCK 11、MOR/0.2R、MONO-MAC 6、MTD-1A、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT細胞株、Peer、PNT-1A/PNT 2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2細胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THP1細胞株、U373、U87、U937、VCaP、Vero細胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR、およびそれらのトランスジェニック種を包含する。

細胞株は、当業者に知られている様々な供給源から利用可能である(例として、American Type Culture Collection(ATCC)(Manassus,Va.)を参照)。いくつかの態様において、本明細書に記載の1以上のベクターでトランスフェクトされた細胞は、1以上のベクター由来配列を含む新しい細胞株を確立するのに使用される。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりのCRISPR系の構成要素で(1以上のベクターの一過的なトランスフェクション、またはRNAでのトランスフェクションなどによって)一過的にトランスフェクトされて、CRISPR複合体の活性を通して修飾された細胞は、修飾は含有するが他の外来配列のいずれも欠く細胞を含む新しい細胞株を確立するのに使用される。いくつかの態様において、本明細書に記載の1以上のベクターで一過的もしくは非一過的にトランスフェクトされた細胞、またはかかる細胞に由来する細胞株は、1以上の試験化合物を査定するのに使用される。

ベクター
本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載のプライム編集因子またはその構成要素(例として、分裂Cas9タンパク質もしくは分裂核酸塩基プライム編集因子)の細胞中への送達のための、組換えウイルスベクター(例として、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクター)の使用に関する。分裂-PEアプローチのケースにおいて、全長Cas9タンパク質またはプライム編集因子が様々なウイルスベクター(例として、rAAV(～4.9kb))のパッケージング限界を超えることから、PE融合タンパク質のN末端部分およびPE融合のC末端部分は、別々の組換えウイルスベクター(例として、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクター)によって同じ細胞中へ送達される。

よって、一態様において、本開示は、分裂プライム編集因子融合タンパク質またはそれらの分裂構成要素を送達するのか可能なベクターを企図する。いくつかの態様において、分裂Cas9タンパク質または分裂プライム編集因子を細胞(例として、哺乳動物の細胞、ヒト細胞)中へ送達するための組成物が提供される。いくつかの態様において、本開示の組成物は以下を含む:(i)そのC末端にてインテイン-Nと融合したCas9タンパク質またはプライム編集因子のN末端部分をコードする第1ヌクレオチド配列を含む第1組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子;および(ii)Cas9のタンパク質またはプライム編集因子のC末端部分のN末端と融合したインテイン-Cをコードする第2ヌクレオチド配列を含む第2組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子。本開示のrAAV粒子は、ウイルスのカプシドタンパク質で包まれた(encapsidated)rAAVベクター(すなわち、rAAVの組換えゲノム)を含む。

いくつかの態様において、rAAVベクターは以下を含む:(1)本明細書に記載のとおりのいずれの形態の分裂Cas9タンパク質もしくは分裂プライム編集因子のN末端部分またはC末端部分をコードする第1あるいは第2ヌクレオチド配列を含む異種核酸領域、(2)異種核酸領域の発現を容易にさせる配列(例として、プロモーター)を含む1以上のヌクレオチド配列、および(3)異種核酸領域(任意に、発現を容易にさせる配列を含む1以上の核酸領域をもつ)の細胞ゲノム中への組み入れを容易にさせる配列を含む1以上の核酸領域。いくつかの態様において、組み入れを容易にさせるウイルスの配列は、逆方向末端反復(ITR)配列を含む。いくつかの態様において、分裂Cas9タンパク質もしくは分裂プライム編集因子のN末端部分またはC末端部分をコードする第1あるいは第2ヌクレオチド配列は、ITR配列によって両側から挟まれている。いくつかの態様において、核酸ベクターはさらに、本明細書に記載のとおりのAAV Repタンパク質をコードする領域を含むが、前記領域は、ITRによって挟まれる領域内またはその領域外のいずれかに含有される。ITR配列は、いずれかのAAV血清型(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)に由来し得るか、または1より多くの血清型に由来し得る。いくつかの態様において、ITR配列は、AAV2またはAAV6に由来する。

よって、いくつかの態様において、本明細書に開示のrAAV粒子は、少なくとも1のrAAV2粒子、rAAV6粒子、rAAV8粒子、rPHP.B粒子、rPHP.eB粒子、もしくはrAAV9粒子、またはそのバリアントを含む。具体的な態様において、開示されたrAAV粒子は、rPHP.B粒子、rPHP.eB粒子、rAAV9粒子である。

ITR配列およびITR配列含有プラスミドは当該技術分野において知られており、市販されている(例として、Vector Biolabs,Philadelphia,PA;Cellbiolabs,San Diego,CA;Agilent Technologies,Santa Clara,Ca;およびAddgene,Cambridge,MAから利用可能な製品ならびにサービス;ならびに、骨格筋への遺伝子送達は治療用タンパク質の持続発現および全身送達をもたらす。Kessler PD,Podsakoff GM,Chen X,McQuiston SA,Colosi PC,Matelis LA,Kurtzman GJ,Byrne BJ.Proc Natl Acad Sci USA.1996 Nov 26;93(24):14082-7;およびCurtis A.Machida.Methods in Molecular Medicine^TM.Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols.10.1385/1-59259-304-6:201cHumana Press Inc.2003.Chapter 10.Targeted Integration by Adeno-Associated Virus.Matthew D.Weitzman,Samuel M.Young Jr.,Toni Cathomen and Richard Jude Samulski;米国特許第5,139,941号および第5,962,313号を参照(これらすべては参照により本明細書に組み込まれる))。

いくつかの態様において、本開示のrAAVベクターは、異種核酸領域の発現を制御する1以上の調節要素(例として、プロモーター、転写ターミネータ、および/または他の調節要素)を含む。いくつかの態様において、第1および/または第2ヌクレオチド配列は、1以上の(例として、1、2、3、4、5、またはそれ以上の)転写ターミネータへ作動可能に(operably)連結されている。本開示に従って使用されてもよい転写ターミネータの非限定例は、ウシ成長ホルモン遺伝子(bGH)、ヒト成長ホルモン遺伝子(hGH)、SV40、CW3、φ、またはそれらの組み合わせの転写ターミネータを包含する。数種の転写ターミネータの効率が試験され、分裂Cas9タンパク質または分裂プライム編集因子の発現レベルにおけるそれら夫々の効果を決定した。いくつかの態様において、本開示に使用される転写ターミネータは、bGH転写ターミネータである。いくつかの態様において、rAAVベクターはさらに、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素(WPRE)を含む。ある態様において、WPREは、「W3」などのトランケートされたWPRE配列である。いくつかの態様において、WPREは、転写ターミネータの5'に挿入されている。かかる配列は、転写されたとき、発現、とりわけウイルスベクターからの発現を増強する3次構造を創出する。

いくつかの態様において、本明細書に使用されるベクターは、PE融合タンパク質、またはそれら構成要素(例として、napDNAbp、リンカー、もしくはポリメラーゼ)のいずれもコードしていてもよい。加えて、本明細書に使用されるベクターは、PEgRNA、および/または第2鎖へニックを入れるための付属(accessory)gRNAをコードしていてもよい。ベクターは、細胞中の1以上のコード配列の発現を推進するのが可能であってもよい。いくつかの態様において、細胞は、例として細菌性細胞などの、原核細胞であってもよい。いくつかの態様において、細胞は、例として、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物の細胞などの、真核細胞であってもよい。いくつかの態様において、真核細胞は、哺乳動物の細胞であってもよい。いくつかの態様において、真核細胞は、齧歯類の動物の細胞であってもよい。いくつかの態様において、真核細胞は、ヒトの細胞であってもよい。種々の型の細胞中の発現を推進する好適なプロモーターは当該技術分野において知られている。いくつかの態様において、プロモーターは、野生型であってもよい。他の態様において、プロモーターは、より効率的またはより効果的な発現のために修飾されていてもよい。もう1つの他の態様において、プロモーターは、トランケートされていてもよいが、依然としてその機能を保持する。例えば、プロモーターは、正常なサイズ、またはベクターのウイルス中への正しいパッケージングに好適な低減されたサイズを有していてもよい。

いくつかの態様において、プライム編集因子ベクターに使用されてもよいプロモーターは、構成的、誘導的、または組織特異的であってもよい。いくつかの態様において、プロモーターは、構成的プロモーターであってもよい。非限定的な例示の構成的プロモーターは、サイトメガロウイルス前初期プロモーター(CMV)、サルウイルス(SV40)プロモーター、アデノウイルス主要後期(MLP)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、伸長(elongation)因子-アルファ(EFla)プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらの機能的フラグメント、または上記のいずれの組み合わせを包含する。いくつかの態様において、プロモーターは、CMVプロモーターであってもよい。いくつかの態様において、プロモーターは、トランケートされたCMVプロモーターであってもよい。他の態様において、プロモーターは、EFlaプロモーターであってもよい。いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。非限定的な例示の誘導性プロモーターは、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって誘導可能なものを包含する。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、基底(非誘導)発現レベルが低いもの、例として、Tet-On(登録商標)プロモーター(Clontech)などであってもよい。いくつかの態様において、プロモーターは、組織特異的プロモーターであってもよい。いくつかの態様において、組織特異的プロモーターは、専らまたは主として、肝臓組織に発現される。非限定的な例示の組織特異的プロモーターは、B29プロモーター、CD14プロモーター、CD43プロモーター、CD45プロモーター、CD68プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ-1プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Flt-1プロモーター、GFAPプロモーター、GPIIbプロモーター、ICAM-2プロモーター、INF-βプロモーター、Mbプロモーター、Nphslプロモーター、OG-2プロモーター、SP-Bプロモーター、SYN1プロモーター、およびWASPプロモーターを包含する。

いくつかの態様において、プライム編集因子ベクター(例として、プライム編集因子融合タンパク質および/またはPEgRNA、および/または第2鎖へニックを入れる付属gRNAをコードするいずれのベクターも包含する)は、標的細胞へ送達された後にしか発現を開始しない誘導性プロモーターを含んでいてもよい。非限定的な例示の誘導性プロモーターは、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって誘導可能なものを包含する。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、基底(非誘導)発現レベルが低いもの、例として、Tet-On(登録商標)プロモーター(Clontech)などであってもよい。

追加の態様において、プライム編集因子ベクター(例として、プライム編集因子融合タンパク質および/またはPEgRNA、および/または第2鎖へニックを入れる付属gRNAをコードするいずれのベクターも包含する)は、特定の組織へ送達された後にしか発現を開始しない組織特異的なプロモーターを含んでいてもよい。非限定的な例示の組織特異的プロモーターは、B29プロモーター、CD14プロモーター、CD43プロモーター、CD45プロモーター、CD68プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ-1プロモーター、エンドクリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Flt-1プロモーター、GFAPプロモーター、GPIIbプロモーター、ICAM-2プロモーター、INF-βプロモーター、Mbプロモーター、Nphslプロモーター、OG-2プロモーター、SP-Bプロモーター、SYN1プロモーター、およびWASPプロモーターを包含する。

いくつかの態様において、PEgRNA(またはプライム編集に関係して使用されるいずれのガイドRNA)をコードするヌクレオチド配列は、少なくとも1の転写または翻訳制御配列へ作動可能に連結されていてもよい。いくつかの態様において、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも1のプロモーターへ作動可能に連結されていてもよい。いくつかの態様において、プロモーターは、RNAポリメラーゼ III(Pol III)によって認識されてもよい。Pol IIIプロモーターの非限定例は、U6、HI、およびtRNAプロモーターを包含する。いくつかの態様において、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトU6プロモーターへ作動可能に連結されていてもよい。他の態様において、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトHIプロモーターへ作動可能に連結されていてもよい。いくつかの態様において、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトtRNAプロモーターへ作動可能に連結されていてもよい。1より多くのガイドRNAを用いる態様において、発現を推進するのに使用されるプロモーターは、同じであっても、または異なっていてもよい。いくつかの態様において、ガイドRNAのcrRNAをコードするヌクレオチド、およびガイドRNAのtracr RNAをコードするヌクレオチドは、同じベクター上に提供されていてもよい。いくつかの態様において、crRNAをコードするヌクレオチド、およびtracr RNAをコードするヌクレオチドは、同じプロモーターによって推進されてもよい。いくつかの態様において、crRNAおよびtracr RNAは、転写されて単一の転写産物になってもよい。例えば、crRNAおよびtracr RNAは、単一の転写産物からプロセシングされて二本鎖分子(double-molecule)ガイドRNAを形成してもよい。代替的に、crRNAおよびtracr RNAは、転写されて単一分子ガイドRNAになってもよい。

いくつかの態様において、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、PE融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む同じベクター上に位置付けられていてもよい。いくつかの態様において、ガイドRNAの発現およびPE融合タンパク質の発現は、それらの対応するプロモーターによって推進されてもよい。いくつかの態様において、ガイドRNAの発現は、PE融合タンパク質の発現を推進する同じプロモーターによって推進されてもよい。いくつかの態様において、ガイドRNAおよびPE融合タンパク質の転写産物は、単一の転写産物内に含有されていてもよい。例えば、ガイドRNAは、Cas9タンパク質転写産物の非翻訳領域(UTR)内にあってもよい。いくつかの態様において、ガイドRNAは、PE融合タンパク質転写産物の5'UTR内にあってもよい。他の態様において、ガイドRNAは、PE融合タンパク質転写産物の3'UTR内にあってもよい。いくつかの態様において、PE融合タンパク質転写産物の細胞内半減期は、ガイドRNAをその3'UTR内に含有することによって低減されることもあり、これによってその3'UTRの長さが短縮される。追加の態様において、ガイドRNAは、PE融合タンパク質転写産物のイントロン内にあってもよい。いくつかの態様において、好適なスプライシング部位は、ガイドRNAが転写産物から正しくスプライシングされるように、ガイドRNAが位置付けられるイントロンに付加されてもよい。いくつかの態様において、同じベクター上の極めて近いところにあるCas9タンパク質およびガイドRNAの発現は、CRISPR複合体のより効率的な形成を容易にさせることもある。

プライム編集因子ベクター系は、1つのベクター、もしくは2つのベクター、もしくは3つのベクター、もしくは4つのベクター、もしくは5つのベクター、またはこれ以上を含んでいてもよい。いくつかの態様において、ベクター系は、PE融合タンパク質とPEgRNAとの両方をコードする1つの単一ベクターを含んでいてもよい。他の態様において、ベクター系は2つのベクターを含んでいてもよいが、ここで一方のベクターはPE融合タンパク質をコードし、他方がPEgRNAをコードする。追加の態様において、ベクター系は3つのベクターを含んでいてもよいが、ここで第3ベクターは、本明細書の方法に使用される、第2鎖へニックを入れるgRNAをコードする。

いくつかの態様において、rAAV粒子を含む組成物(本明細書に企図されるいずれの形態)はさらに、薬学的に許容し得る担体を含む。いくつかの態様において、組成物は、ヒトまたは動物の対象への投与に適切な医薬ビヒクル中で製剤化される。

薬学的に許容し得る担体として働き得る材料のいくつかの例は以下を包含する:(1)ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの、糖;(2)コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどの、デンプン;(3)ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、および酢酸セルロースなどの、セルロースおよびその誘導体;(4)粉末状トラガカント;(5)麦芽;(6)ゼラチン;(7)ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなどの、平滑剤;(8)カカオバターおよび坐薬蝋などの、賦形剤;(9)落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ 油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油などの、油;(10)プロピレングリコールなどの、グリコール;(11)グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール(PEG)などの、ポリオール;(12)オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどの、エステル;(13)寒天;(14)水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの、緩衝剤;(15)アルギン酸;(16)パイロジェンフリー水;(17)等浸透圧の生理食塩水;(18)リンガー溶液;(19)エチルアルコール;(20)pH緩衝溶液;(21)ポリエステル、ポリカーボネート、および/またはポリ酸無水物;(22)ポリペプチドおよびアミノ酸などの、増量剤;(23)血清アルブミン、HDL、およびLDLなどの、血清構成要素;(22)エタノールなどの、C2～C12アルコール;ならびに(23)医薬製剤に採用される、相溶性のある他の非毒性物質。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存料、および抗酸化剤もまた、製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容し得る担体」または同種のものなどの用語は本明細書中、互換的に使用される。

送達方法
いくつかの側面において、本発明は、それらの1以上の転写産物、および/またはそれらから転写される1以上のタンパク質をコードする1以上のベクターなどの、本明細書に記載のとおりの1以上のポリヌクレオチドを宿主細胞へ送達することを含む方法を提供する。いくつかの側面において、本発明はさらに、かかる方法によって産生される細胞、およびかかる細胞を含むかまたはかかる細胞から産生される生物(動物、植物、もしくは真菌など)を提供する。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの塩基編集因子は、ガイド配列と組み合わせて(任意にこれと複合化されて)、細胞へ送達される。

例示の送達ストラテジーは、本明細書のどこかに記載されるが、ベクターベースのストラテジー、PEリボヌクレオタンパク質複合体の送達、およびmRNA方法によるPEの送達を包含する。

いくつかの態様において、提供される送達方法は、ヌクレオフェクション、マイクロ注射、微粒子銃(biolistics)、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸抱合体、裸のDNA、人工ビリオン、およびDNAの取り込みを増強する剤を包含する。

例示の核酸送達方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、安定したゲノム組み入れ(例として、piggybac)、マイクロ注射、微粒子銃(biolistics)、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸抱合体、裸のDNA、人工ビリオン、およびDNAの取り込みを増強する剤を包含する。リポフェクションは、例として、米国特許第5,049,386号、第4,946,787号;および第4,897,355号)に記載されており、リポフェクション試薬は商業的に販売されている(例として、Transfectam(商標)、Lipofectin(商標)、およびSF細胞株4D-Nucleofector X Kit(商標)(Lonza))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質および中性脂質は、Feigner、WO91/17424;WO91/16024の脂質を包含する。送達は、細胞(例として、in vitro投与もしくはex vivo投与)、または標的組織(例として、in vivo投与)に対するものであり得る。送達は、RNP複合体の使用を通して達成されてもよい。

イムノ脂質複合体などの標的化リポソームを包含する脂質:核酸複合体の調製は、当業者に周知である(例として、Crystal,Science 270:404-410(1995);Blaese et al.,Cancer Gene Ther.2:291-297(1995);Behr et al.,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994);Remy et al.,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994);Gao et al.,Gene Therapy 2:710-722(1995);Ahmad et al.,Cancer Res.52:4817-4820(1992);米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、および第4,946,787号を参照)。

他の態様において、本明細書に提供される送達方法およびベクターは、RNP複合体である。融合タンパク質のRNP送達は、塩基編集のDNA特異性を著しく増大させる。融合タンパク質のRNP送達は、オン-およびオフ-ターゲットDNA編集の分断(decoupling)へ繋がる。RNP送達は、プラスミド送達に匹敵するオン-ターゲット編集を維持しながら、非反復部位にてオフターゲット編集を小さくし(ablates)、高度に反復したVEGFA部位2でさえもオフ-ターゲットDNA編集を大いに低減させる。Rees,H.A.et al.,Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery,Nat.Commun.8,15790(2017)、2016年12月27日に発行された米国特許第9,526,784号、および2017年8月22日に発行された米国特許第9,737,604号を参照(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)。

細胞への核酸送達のための追加の方法は当業者に知られている。例えば、US 2003/0087817を参照(参照により本明細書に組み込まれる)。

他の本開示の側面は、プライム編集因子構築物を細胞中へ送達して、完全かつ機能的なプライム編集因子を細胞内に形成する方法を提供する。例えば、いくつかの態様において、細胞は、本明細書に記載の組成物(例として、分裂Cas9もしくは分裂プライム編集因子をコードするヌクレオチド配列、またはかかるヌクレオチド配列を含む核酸ベクターを含有するAAV粒子を含む組成物)と接触させられる。いくつかの態様において、接触させることは、かかるヌクレオチド配列の細胞中への送達をもたらすが、ここでCas9タンパク質またはプライム編集因子のN末端部分、およびCas9タンパク質またはプライム編集因子のC末端部分は、細胞中で発現され結び合わされて、完全なCas9タンパク質または完全なプライム編集因子を形成する。

本明細書に提供されるいずれのrAAV粒子、核酸分子、または組成物も、安定的または一過的のいずれかのいずれか好適なやり方で、細胞中へ導入されてもよいことは解されるはずである。いくつかの態様において、開示されたタンパク質は、細胞中へトランスフェクトされてもよい。いくつかの態様において、細胞は、核酸分子で形質導入またはトランスフェクトされてもよい。例えば、細胞は、分裂タンパク質をコードする核酸分子、もしくは1以上の核酸分子をコードするウイルスのゲノムを含有するrAAV粒子で、形質導入されても(例として、分裂タンパク質をコードするウイルスで)、またはトランスフェクトされてもよい(例として、分裂タンパク質をコードするプラスミドで)。かかる形質導入は、安定的な形質導入または一過的な形質導入であってもよい。いくつかの態様において、分裂タンパク質を発現するかまたは分裂タンパク質を含有する細胞は、例えば、分裂Cas9(例として、nCas9)タンパク質の送達において、1以上のガイドRNA配列で形質導入またはトランスフェクトされてもよい。いくつかの態様において、分裂タンパク質を発現するプラスミドは、電気穿孔法、一過的な(例として、リポフェクション)および安定したゲノム取り入れ(例として、piggybac)、およびウイルスの形質導入または当業者に知られている他の方法を通して、細胞中へ導入されてもよい。

ある態様において、本明細書に提供される組成物は、脂質および/またはポリマーを含む。ある態様において、脂質および/またはポリマーはカチオン性である。かかる脂質粒子の調製は周知である。例として、米国特許第4,880,635号;第4,906,477号;第4,911,928号;第4,917,951号;第4,920,016号;第4,921,757号;および第9,737,604号を参照(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)。

ガイドRNA配列は長さが15～100ヌクレオチドであってもよく、標的ヌクレオチド配列に相補的な少なくとも10、少なくとも15、または少なくとも20の連続したヌクレオチドの配列を含む。ガイドRNAは、標的ヌクレオチド配列に相補的な15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40の連続したヌクレオチドの配列を含んでいてもよい。ガイドRNAは、長さが15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドであってもよい。

いくつかの態様において、標的ヌクレオチド配列は、ゲノム(例として、真核生物のゲノム)中のDNA配列である。ある態様において、標的ヌクレオチド配列は、哺乳類の動物(例として、ヒト)ゲノム中にある。

本開示の組成物は、例えば、単位用量として投与またはパッケージされてもよい。用語「単位用量」は、本開示の医薬組成物に関して使用されるとき、まとまった投薬量として対象に好適な、物理的に不連続な単位を指し、予め決められた分量の活性材料を含有する各単位は、要求される希釈剤;すなわち、担体またはビヒクルを伴って所望の治療効果を産生するよう算出される。

疾患または障害の処置は、疾患の発症もしくは進行を遅延させるか、または疾患の重症度を低減させることを包含する。疾患を処置することは、根治した(curative)結果を必ずしも要さない。

そこで使用されたとおり、疾患の発症を「遅延すること」は、疾患の進行を、先送りする(defer)、妨げる(hinder)、遅らせる(slow)、妨害する(retard)、留める(stabilize)、および/または延ばす(postpone)ことを意味する。この遅延は、病歴および/または処置される個体に応じて、時間の長さを変動させることでもあり得る。疾患の発症を「遅延」もしくは緩和する方法、または疾患の発病を遅延する方法は、この方法を使用しない場合と比較して、所定の時間枠での疾患の1以上の症状を発症する確率を低減するか、および/または所定の時間枠での症状の程度を低減する方法である。かかる比較は、典型的には、統計的に有意な結果を与えるのに充分数多の対象を使用する臨床研究に基づく。

疾患の「発症」または「進行」は、最初の兆候および/またはその後の疾患の進行を意味する。疾患の発症は、当該技術分野において周知のとおりの標準の臨床技法を使用し検出可能であり、かつ査定され得る。しかしながら、発症はまた、検出不能なこともある進行も指す。本開示の目的上、発症または進行は、症状の生物学的な経過を指す。「発症」は、発生、再発、および発病を包含する。

本明細書に使用されるとき、疾患の「発病」または「発生」は、最初の発病および/または再発を包含する。医学の当業者に知られている従来の方法は、処置されるべき疾患の型または疾患の部位に応じて、単離されたポリペプチドまたは医薬組成物を対象へ投与するのに使用され得る。

さらなる詳細化はしないが、当業者は、上の記載に基づき、本開示を最大限に利用し得るものと思われる。したがって、以下の特定の態様は、単なる説明として解釈されるべきであって、いずれにしても本開示の残りを何ら限定するものではない。本明細書に引用されるすべての刊行物は、本明細書に言及される目的または主題のため、参照により組み込まれる。

例
例1．ゲノム中に正確なヌクレオチド変化を組み入れるためのプライム編集(PE)
目的は、正確なゲノム編集の変革技術を開発すること、および哺乳動物ゲノム中の単一ヌクレオチドの変化の組み入れを生成することである。この技術は、研究者らに、事実上いずれの哺乳動物遺伝子においても、単一ヌクレオチドのバリエーションの効果を研究できるようにさせ、ヒト患者における病原性の点突然変異を修正するための治療的介入を潜在的に可能にさせるであろう。

ゲノム編集のための、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復(CRISPR)系の採用は、生命科学に革命をもたらした^1～3。CRISPRを使用する遺伝子の断絶は今やルーチンとなっているが、単一ヌクレオチドの編集の正確な組み入れは、疾患が原因の多数の突然変異を研究または修正するのに必要であるにも関わらず、大きな課題のままである。相同組み換え修復(HDR)は、かかる編集を達成させることは可能ではあるが、低い効率(しばしば＜5％)、ドナーDNA修復鋳型のための要件、および二本鎖DNA破壊(DSB)形成の有害効果に悩まされている。近年、Liu実験室が塩基編集を開発したが、これによってDSBのない効率的な単一ヌクレオチドの編集が達成される。塩基編集因子(BE)は、CRISPR系を塩基修飾デアミナーゼ酵素と組み合わせて、標的C・GまたはA・T塩基対を夫々A・TまたはG・Cへ変換する^4～6。研究者らによって既に幅広く世界的に使用されているが(Addgeneによって流通された＞5,000 Liu実験室のBE構築物)、最新のBEは12塩基対の起こり得る変換のうちたった4つしかできず、小さい挿入または欠失を修正することはできない。その上、塩基編集の標的範囲は、標的塩基に隣接する非標的CまたはA塩基の編集(「バイスタンダー(bystander)編集」)によって、およびPAM配列が標的塩基から15±2bpに存在するという要件によって限定されている。したがって、これらの欠点を克服することは、ゲノム編集の基礎研究および治療用途を大幅に広げるであろう。

ここで、塩基編集の利益の多く－つまり、二本鎖破壊の回避およびドナーDNA修復鋳型－を、その大きな欠点を克服しつつ与える、新しい高精度編集アプローチを開発することが提案される。この意欲的な目標を達成するため、標的にプライムされた逆転写(TPRT)を使用して、標的ゲノムの部位にて編集済DNA鎖を直接組み入れることを目的とする。本明細書に考察されるデザインにおいて、CRISPRガイドRNA(gRNA)は、結び付けられた逆転写酵素(RT)鋳型配列によって実行される、変異誘発DNA鎖合成をコードする鋳型を持つよう改変されるであろう。CRISPRヌクレアーゼ(Cas9)によってニックが入れられた標的部位DNAは、修飾gRNA上の鋳型配列の逆転写のためのプライマーとして働き、いずれの所望のヌクレオチド編集の直接的な組み込みを可能にするであろう。

セクション1
変異誘発DNA鎖の、ガイドRNAを鋳型にした逆転写を確立する。先行研究によって、DNA切断の後であって複合体解離の前に、Cas9が非標的DNA鎖を放出して遊離の3'末端を晒すことが示された。このDNA鎖が、ポリメラーゼ酵素による伸長へアクセス可能であって、gRNAが、それらの5'末端または3'末端の伸長を通してDNA合成の鋳型として働くよう改変され得るものと仮定する。in vitroでの予備研究において、Cas9:gRNA結合複合体内のニックが入ったDNA鎖が、結合したgRNAを鋳型として使用する逆転写(transのRT酵素)を実際にプライムし得ることが確立された。次に、種々のgRNAリンカー、プライマー結合部位、および合成鋳型を、in vitroでの最適なデザイン規則を決定するために詳しく研究する。次いで、transで作用するかまたはCas9との融合体として作用する種々のRT酵素をin vitroで評価する。最終的に、細胞中の効率的な結合および切断活性を保持する改変gRNAデザインを同定する。これを目的とした実証実験の成功によって、細胞中の変異誘発鎖合成を遂行するための基盤が提供される。

セクション2
ヒト細胞中のプライム編集を確立する。DNAプロセシングおよび修復機序に基づき、変異誘発DNA鎖(単鎖フラップ)は、標的ヌクレオチドの特異的かつ効率的な編集に向かうのに使用し得るものと仮定する。有望な予備研究において、このストラテジーの実現性を、変異誘発フラップを含有するモデルプラスミド基質での編集を実証することによって確立した。目的1と同時に、修復成果を、変異誘発フラップの長さ、配列組成、標的ヌクレオチドの同一性、および3'末端を系統的に変動させることによってさらに評価する。1～3ヌクレオチドの小さい挿入および欠失もまた試験する。目的1と並行して目的1から組み立て、融合タンパク質および非共有結合動員ストラテジーを包含するCas9-RT構造を評価する。Cas9-RT構造および伸長されたgRNAを、ヒトゲノム中の複数の標的部位での細胞の編集についてアッセイし、次いで高効率のために最適化する。成功した場合、この目的によって、基礎科学への適用のためのTPRTゲノム編集(すなわち、プライム編集)が即時に確立される。

セクション3
培養ヒト細胞中の病原性の突然変異の部位特異的編集を達成する。この技術の潜在的な普遍性は、目下BEによっては修正不能なトランスバージョン突然変異およびインデルの編集を可能にし得る。目的1および目的2の結果によって導かれて、鎌状赤血球病の創始者突然変異をベータグロビン中に(修正にはA・T→T・Aトランスバージョンを要する)および最も蔓延しているウィルソン病の突然変異をATP7B中に(修正にはG・C→T・Aトランスバージョンを要する)包含する培養ヒト細胞中の病原性のトランスバージョン突然変異を標的にする。嚢胞性線維症を引き起こすCFTR中の3ヌクレオチド△F508欠失を包含する、小さい挿入および欠失の突然変異の修正もまた調べる。成功した場合、これは、これらの重要なヒト疾患に対処する強力な治療的アプローチを開発するための基盤を据える。

アプローチ
目標は、標的にされたゲノム部位にて点突然変異を直接組み入れるゲノム編集ストラテジーを開発することである。技術開発段階において、CRISPR/Cas系中へTPRT機能性を組み込む努力が、タンパク質およびRNA工学に注がれる。TPRTの各ステップの機能を慎重に探り、基礎から組み立てるのにIn vitroアッセイを使用する(目的1)。第2集中領域は、モデル基質と改変CRISPR/Cas系との組み合わせを使用して哺乳動物の細胞中の編集成果を評価する(目的2)。最終的に、適用段階は、他の方法によるゲノム編集では解決困難な突然変異を修正する技術を使用する(目的3)。

一般的な編集デザインを図1A～1Bに示す。Cas9ニッカーゼは、PAM含有鎖(非標的鎖)へのDNA切断を制限する、HNHヌクレアーゼドメインに対する不活性化突然変異(Spy Cas9 H840AまたはN863A)を含有する。ガイドRNA(gRNA)を、逆転写のための鋳型を含有するよう改変する(デザインはスライド5上に詳細化)。示されるのはgRNAの5'伸長であるが、3'伸長でも実践できる。Cas9ニッカーゼを、C末端またはN末端のいずれかを通して、逆転写酵素(RT)酵素と融合させる。gRNA:Cas9-RT複合体は、着目するDNA領域を標的にし、非標的鎖に取って代わった後にRループを形成する。Cas9は非標的DNA鎖へニックを入れる。ニックが入った鎖の放出によって遊離の3'-OH末端が晒されるが、前記末端は、伸長されたgRNAを鋳型として使用する逆転写のプライム能がある。このDNA合成反応は、融合されたRT酵素によって遂行される。gRNA鋳型は、編集が標的にするヌクレオチドを除いて、元のDNA二重鎖と相同のDNA配列をコードする。逆転写産物は、所望の編集をコードする単鎖DNAフラップである。遊離の3'末端を含有するこのフラップは、隣接するDNA鎖と平衡化でき、5'フラップ種がもたらされる。後者の種は、FEN1(フラップエンドヌクレアーゼ1)の効率的な基質として働くものと仮定されており、前記酵素は、ラギング鎖DNA合成の最中に岡崎フラグメントから5'フラップを天然に切除し、長いパッチ(long-patch)の塩基切除修復の最中に生じる鎖置き換え合成の後に5'フラップを除去する。ニックが入ったDNAのライゲーションは、ミスマッチした塩基対を産生する。この中間体は、ミスマッチ修復(MMR)プロセスを介して、元の塩基対への復元または所望される編集済塩基対への変換のいずれかを経ることができる。代替的に、半保存的DNA複製によって、復元と編集との各1コピーが生み出され得る。

1．変異誘発DNA鎖の、ガイドRNAを鋳型にした逆転写を確立する。
背景および論拠
提案されたゲノム編集ストラテジーにおいて、Cas9によってニックが入れられた非標的DNA鎖(Rループを形成するPAM含有鎖)は、DNA合成のためのプライマーとして作用する。これは生化学的データおよび構造のデータの数種の実例(pieces)に基づき起こり得るものと仮定される。ヌクレアーゼ保護実験³²、結晶学的研究³³、および塩基編集窓^4,24は、Cas9結合複合体の所謂Rループ内の非標的鎖ヌクレオチド-20～-10について、柔軟性および障害のかなりの程度を実証した(ナンバリングは第1PAMヌクレオチドの5'からの距離を示す)。その上、相補的なssDNAが加えられたとき、切断された非標的鎖のPAM遠位部分は、緊密に結合した3元複合体から外され得る²⁰。これらの研究によって、非標的鎖が高度に柔軟であって酵素へのアクセスが可能であること、およびニックが入った後にPAM遠位フラグメントの3'末端がCas9解離に先立ち放出されることが支持される。さらにまた、gRNAが、鋳型DNA合成まで伸長され得るものと仮定される。先行研究によって、SpCas9、SaCas9、およびLbCas12a(かつてはCpf1)のためのgRNAが、RNAアプタマー³⁴、リガンド誘導性自己切断型リボザイム³⁵、および長鎖ノンコーディングRNA³⁶でのgRNA伸長を許容することが示された。生かされる2つの主要な特色に対し、この文献によって前例が確立される。このストラテジーの査定において、数種のCRISPR-Cas系を、in vitroでのアッセイと細胞アッセイとの組み合わせを使用し5'および3'伸長されたgRNAデザインと併せて評価する(図2A～2C)。

TRT編集のための改変gRNAのためのデザインを図3A～3Bに示す。DNA合成は5'→3'に進み、よってRNA鋳型を3'→5'方向にコピーする。5'伸長のためのデザインは、リンカー領域、ニックが入ったDNA鎖がアニールするプライマー結合部位、および逆転写によるDNA合成のための鋳型を含有する。3'伸長されたgRNAは、プライマー結合部位および逆転写鋳型を含有する。in vitroでの実験によって、逆転写が、3'伸長されたgRNA構築物のgRNAコア中へ、～3ヌクレオチド伸長することが示されたところ、いくつかのケースにおいて、gRNAコアの3'RNAヘアピンをDNA標的配列とマッチするよう修飾する(ヘアピンRNA構造の維持を代償する変化がなされる限り、ヘアピン配列の修飾には十分耐性があるように見える)。DNA合成は、ヌクレオチドが成長するDNA鎖の3'OHへ付加されながら5'→3'に進む。

予備実験結果
Cas9によってニックが入れられたDNAは、gRNA鋳型の逆転写をプライムする。ニックが入れられた非標的DNA鎖へのアクセス可能性を評価するため、in vitroでの生化学的アッセイを、S.pyogenes(SpCas9)からのCas9ヌクレアーゼおよびCy5蛍光標識二重鎖DNA基質(51塩基対)を使用して実施した。第1に、合成鋳型の長さが変動する一連の5'伸長含有gRNAを、in vitroでの転写によって調製した(全体的なデザインは図2Bに示される)。ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)を用いた電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によって、5'伸長されたgRNAが標的への結合親和性を維持することが確立された(データは示さず)。次に、TPRT活性を、dCas9、5'伸長されたgRNA、およびモロニー-マウス白血病ウイルス(M-MLV)逆転写酵素(Superscript III)を使用して、予めニックが入れられたCy5標識二重鎖DNA基質に対し試験した。37℃での1時間のインキュベーション後、産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって評価し、Cy5蛍光を使用して撮像した(図4A)。5'伸長されたgRNAバリアントは各々、有意な産物形成をもたらし、観察されたDNA産物サイズは伸長鋳型の長さと一致した(図4B)。重要なことに、dCas9の不在下で、予めニックが入れられた基質はDNA基質の全長51bpまで伸長されたが、これは相補的なDNA鎖(gRNAではない)が、dCas9が存在しないときにDNA合成のための鋳型として使用されたことを強く示唆する(図4C)。注目すべきは、新しく合成されたDNA鎖が、標的部位の編集に要求される産物(単一ヌクレオチドの変化と相同の鎖)を映し出す(mirrors)ように、系をデザインした。この結果は、Cas9:gRNA結合によってニックが入れられた非標的鎖の3'末が晒されること、および非標的鎖が逆転写へアクセス可能であることを確立する。

次に、ニックが入れられていないdsDNA基質を、非標的DNA鎖へニックを入れるCas9(H840A)突然変異体を使用して評価した。第1に、5'伸長されたgRNAを用いてCas9(H840A)ニッカーゼ活性を試験するため、in vitroでの切断アッセイを、これまでに記載されたとおりに実施した³⁷。ニックを入れることは、標準のgRNAと比較すると損なわれていたが、相当の切断産物が形成されていた(図4D)。重要なことに、TPRT反応を5'伸長されたgRNAおよびCas9(H840A)で遂行したとき、より低い収率(ニックを入れる活性の減少によって説明可能)ではあるがRT産物もまた観察された(図4D)。この結果によって、5'伸長されたgRNA:Cas9(H840A)複合体がDNAへニックを入れ、逆転写の鋳型となり得ることが確立される。

最終的に、3'gRNA伸長を、Cas9(H840A)のニック入れおよびTPRTについて評価した。5'伸長されたgRNAと比較すると、3'伸長されたgRNAによるDNA切断は、標準のgRNAと比較していずれも検出可能な程度までには損なわれていなかった。有意に、3'伸長されたgRNA鋳型もまた、M-MLV RTがtransで供給されたとき、予めニックが入れられた二重鎖DNA基質と無傷の二重鎖DNA基質との両方で効率的な逆転写を支持した(図4E)。驚くべきことに、3'伸長された鋳型について単一産物のみが観察されたが、これは逆転写がgRNA骨格に沿った特定の場所にて終止することを示す。末端トランスフェラーゼでの産物のホモポリマーテール化(Homopolymer tailing)、これに続くクレノウ伸長およびサンガー配列決定によって、全gRNA合成鋳型がgRNAコアの末端3ヌクレオチドが付加されてコピーされたことが明らかにされた。今後、フラップ末端は、末端gRNA配列を修飾することによって再プログラムされるであろう^38,39。この結果は、3'伸長されたgRNAが、効率的なヌクレアーゼ標的化ガイドとして働き、逆転写の鋳型となり得ることを実証する。

Cas9-TPRTは、ニックが入ったDNAおよびgRNAをcisで使用する。二色実験を、RT反応が優先的にgRNAとともにcisで(同じ複合体中に結合されている)生じるかを決定するのに使用した(図8を参照)。2つ別々の実験を、5'伸長されたgRNAおよび3'伸長されたgRNAについて行った。所定の実験について、dCas9、gRNA、およびDNA基質の3元複合体を別々の管中に形成させた。一方の管中、gRNAは長いRT産物をコードし、DNA基質はCy3(赤色)で標識されている;他方の管中、gRNAは短いRT産物をコードし、DNA基質はCy5(青色)で標識されている。短いインキュベーションの後、複合体を混合し、次いでRT酵素およびdNTPsで処置する。産物を尿素-変性PAGEによって分離し、Cy3およびCy5チャネルの蛍光によって視覚化した。反応産物は、予めDNA基質と複合体化されたgRNA鋳型を使用して優先的に形成されることが見出されたが、これはRT反応がcisで生じ得る可能性があることを示す。この結果は、単一のCas9:gRNA複合体がDNA部位を標的にし、変異誘発DNA鎖の逆転写の鋳型になり得ることを支持する。

TPRTを他のCas系で試験する
先のセクションにおいて提示されたものと同様の実験を、S.aureusからのCas9およびL.bacteriumからCas12aを包含する他のCas系を使用して、遂行する(図2A～2Cを参照)。TRPTもまた、これらのCasバリアントについて実証され得る場合、潜在的な編集範囲および細胞において全般的に成功する可能性が増大するであろう。

TPRTをRT-Cas9融合タンパク質で試験する
第1に、商業的に入手可能または精製可能な一連のRT酵素をTPRT活性についてtransで評価する。M-MLVからの既に試験されたRTに加えて、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)、Geobacillus stearothermophilusグループIIイントロン(GsI-IIC)^41,42、およびEubacterium rectaleグループIIイントロン(Eu.re.I2)^43,44からのRTを評価する。有意に、後者2つのRTは、それら天然の生物学的な文脈において、TPRTを実施する。関係のある場合、RNAse不活性化突然変異および他の潜在的に有益なRT酵素修飾も試験する。transで供給されたとき機能的RTが同定されたら、各々を融合タンパク質としてCas9バリアントに対し評価する。N末端融合配向とC末端融合配向との両方を、様々なリンカー長さおよび構造と併せて試験する。速度論的な時間経過実験を、TPRTがRT酵素をcisで使用して生じ得るか決定するのに使用する。効率的なTPRT化学を可能にするRT-Cas9融合構造体が構築され得る場合、これは、細胞という文脈における機能的編集の可能性を大いに増大するであろう。

細胞中の改変gRNAでのCas9標的化
先の副目的(sub-aims)において開発された改変gRNA候補を、Cas9標的化効率を確認するため、ヒト細胞培養実験(HEK293)において評価する。野生型SpCas9を採用する、確立されたインデル形成アッセイ⁴⁵を使用して、改変gRNAを、ヒトゲノム中5部位またはそれ以上の部位にわたり、標準のgRNAと並べて(side-by-side)比較する。ゲノム編集効率を、実験室に収納されているIllumina MiSeqプラットホームを使用する多重アンプリコン配列決定によって特徴付ける。本セクションおよび先行するセクションからの結果から、これに続くデザイン-組み立て-試験サイクルの反復(iterations)という情報を与える洞察力が生み出されることが予想されるが、ここでgRNAは細胞中、逆転写の鋳型化と効率的なCas9標的化との両方に最適化され得る。

in vitroでの検証結果を図5～7に示す。In vitroでの実験は、ニックが入れられた非標的DNA鎖がDNA合成をプライムするのに柔軟かつ利用可能であること、およびgRNA伸長が逆転写のための鋳型として働き得ることを実証した(図5を参照)。この一連の実験は、編集鋳型の長さを変動させた(左側へ列挙)、5'伸長されたgRNA(図3A～3Bに示されるとおりにデザインされた)を使用した。蛍光標識(Cy5)DNA標的を基質として使用し、この一連の実験においてこれへ予めニックを入れた。これらの実験に使用されたCas9は触媒不活性型Cas9(dCas9)であり、そのためDNAは切れないが、依然として効率的に結合することはできる。モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)に由来する商業的RTであるSuperscript IIIをtransで供給した。第1に、dCas9:gRNA複合体を精製された構成要素から構成させた。次いで、蛍光標識DNA基質をdNTPsおよびRT酵素と一緒に加えた。37Cでの1時間のインキュベーション後、反応産物を変性尿素-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分析した。ゲル画像は、逆転写鋳型の長さと一致する長さまで元のDNA鎖が伸長したことを示す。注目すべきことに、dCas9の不在下で遂行された反応は、使用されたgRNAを問わず、51ヌクレオチド長のDNA産物を産生した。この産物は、DNA合成のための鋳型として相補的なDNA(RNAではない)鎖の使用に対応する(データは示さず)。よって、Cas9結合は、DNA合成をRNA鋳型へ向けるのに要される。この一連のin vitroでの実験は、DNA基質へ予めニックが入れられておらず、かつCas9ニッカーゼ(SpyCas9 H840A 突然変異体)を使用する以外は、図5に示されるものと厳密に類似する(closely parallels)。ゲルに示されるとおり、ニッカーゼは、標準のgRNAを使用したときDNA鎖を効率的に切断する(gRNA_0、レーン3)。複数の切断産物が観察されるが、SpyCas9の先行する生化学的研究と一致する。5'伸長はニックを入れる活性(レーン4～8)を損なうが、あるRT産物は依然として観察される。図7は、3'伸長がDNA合成を支持し、Cas9ニッカーゼ活性を有意には生じさせないことを示す。予めニックが入れられた基質(黒色矢印)は、dCas9またはCas9ニッカーゼのいずれかを使用したとき、ほぼ定量的にRT産物へ変換される(レーン4および5)。RT産物(赤色矢印)への50％超の変換が全基質で観察される(レーン3)。RT産物の長さおよび配列を決定するため、産物バンドをゲルから切除し、抽出して配列決定した。これはRTがgRNAコアの3'末端ヘアピン中へ3ヌクレオチド伸長したことを明らかにした。これに続く実験(示されず)は、これらの3ヌクレオチドが、ヘアピンRNA構造を維持する相補的な変化がなされる限り、標的DNA配列とマッチするために変化され得ることを実証した。

潜在的な困難および代替手段
(1)RTは、融合体としては機能しない:分子密集および/または好ましくない形状(geometries)は、Cas9融合RT酵素によるポリメラーゼ伸長を妨げ得る。第1に、リンカー最適化は試験できる。DNAプライマーとgRNAとRT酵素との間の空間的な関係性を再配向し得るCas9の循環置換バリアントを評価する。目的2に詳述したとおりの非共有結合のRT動員ストラテジーは試験できる。(2)伸長されたgRNAバリアントによって減少したCas標的化効率:これは、最も5'伸長されたgRNAの問題点になり得るものである。構造データ²⁴に基づき、Cas9突然変異体をデザイン、スクリーニングし、gRNA伸長に対してより耐性があるバリアントを同定できる。加えて、gRNAライブラリは、標的化活性を改善するリンカーについて細胞中でスクリーニングできる。

有意性
これらの予備実験結果は、Cas9ニッカーゼおよび伸長されたgRNAが、transで供給された逆転写酵素を使用して、結合したDNA標的上、標的にプライムされた逆転写を開始し得ることを確立する。重要なことに、Cas9結合は、産物形成にとって極めて重要であることが見出された。おそらく細胞中のゲノム編集にとって絶対的な要件ではないが、RT酵素機能をcisで組み込む系のさらなる開発は、細胞ベースの適用において成功する可能性を有意に増大させるであろう。この目的の残りの側面を達成すると、ヒトゲノムという文脈における高精度ゲノム編集を遂行するための分子基盤が提供されるであろう。

2．ヒト細胞中のプライム編集を確立する。
背景および論拠
提案のストラテジーにおいて、改変RT-Cas9:gRNA複合体は、変異誘発3'DNAフラップをゲノムの標的部位にて導入する。単一ミスマッチを含有する変異誘発3'フラップは、エネルギー的に利用しやすい隣接5'フラップ(これは優先的に除去される)との平衡を通して、DNA修復機構によって組み込まれるものと仮定する(図1C～1D)。DNA複製および修復機構は、岡崎フラグメントをプロセシングするとき⁴⁶かつ長いパッチの塩基切除修復(LP-BER)の最中⁴⁷、5'ssDNAフラップに遭遇する。5'フラップは、幅広く発現されるフラップエンドヌクレアーゼFEN1の好ましい基質であって、前記酵素は、ホモ三量体のスライド型(sliding)クランプ複合体PCNAによってDNA修復部位へ動員される⁴⁸。PCNAはまた、他の修復因子(DNAリガーゼLig1を包含する)も同時に動員するための骨格としても働く⁴⁹。PCNAは、「ツールベルト(toolbelt)」として作用すると、細胞分裂の最中ごとに生成される数百万の岡崎フラグメントをプロセシングするのに不可欠である連続フラップ切断およびライゲーションを加速させる^50,51。これら天然のDNA中間体との類似点に基づき、変異誘発鎖は、5'フラップとの平衡、これに続く5'フラップ切除とライゲーションとの連携を通して組み込まれるものと仮定される。次いで、ミスマッチ修復(MMR)が、いずれかの鎖上に等しい確率で生じるはずであって、編集または復元へ繋がる(図1C～1D)。代替的に、DNA複製が最初に生じ、新しく合成された娘鎖中の編集の組み込みへ直接繋がり得る。このプロセスから期待される最も高い収率は50％ではあるが、複数の基質編集を試みることによって、編集修復の不可逆性に起因して完成へ向かう反応が推進され得る。

予備実験結果
DNAフラップは、酵母およびHEK細胞中のプラスミドモデル基質中に部位特異的変異誘発を包含する。提案の編集ストラテジーを試験するため、TPRT産物と似ている変異誘発3'フラップ含有モデルプラスミド基質で研究を始めた。GFPとmCherryとの間に停止コドンをコードする二重蛍光タンパク質レポーターを創出した。変異誘発フラップは停止コドンへの修正をコードしており(図9A)、mCherry合成を可能にさせる。よって、変異誘発効率はGFP:mCherry比率によって定量化できる。プラスミド基質をin vitroで調製し、酵母(S.cerevisiae)またはヒト細胞(HEK293)中へ導入した。高頻度変異誘発が両系ともに観察され(図9B)、単離された酵母コロニーは、元の状態の(reverted)塩基、突然変異塩基、または両産物の混合物のいずれかを含有していた(図9C)。後者の検出は、これらのケースにおいてプラスミド複製がMMRに先立ち生じたことを示唆し、さらに、フラップ切除およびライゲーションがMMRに先行することを示唆する。この結果は、3'変異誘発鎖を使用するDNA編集の実現性を確立する。

●モデルラップ基質での系統的な研究
上に記載の予備実験結果に基づき、効率的な編集の原理を推察するため、より広範囲のフラップ基質をHEK細胞において評価する。ミスマッチ対形成の影響、フラップに沿った変異誘発ヌクレオチドの場所、および末端ヌクレオチドの同一性を決定するため、3'ssDNAフラップを系統的に変動させる(図9D)。単一ヌクレオチドの挿入および欠失もまた試験する。編集高精度を分析するため、アンプリコン配列決定を使用する。これらの結果は、gRNA逆転写鋳型のデザイン情報を与えるのに役立つ。

プラスミド基質上のIn vitroでのTPRTは、効率的な編集成果へ繋がる。目的1において開発されたTPRT反応を、プラスミド基質内に変異誘発を導入するのに使用した。反応を環状DNAプラスミド基質上で遂行した(図10を参照)。これは、先のin vitroでの実験におけるRT伸長の機序としてDNA鎖が解離する可能性を除外する。これはまた、細胞中のフラップ基質のDNA修復も可能にさせる。二重蛍光レポータープラスミドを酵母(S.cerevisiae)発現のために構築した。このプラスミドは、停止コドン(TGA)を介在してGFP(緑色蛍光タンパク質)およびmCherry(赤色蛍光タンパク質)をコードする。この構築物の酵母中の発現は、GFPしか産生しない。プラスミドを、in vitroでのTRT[Cas9(H840A)ニッカーゼ、改変gRNA、MLV RT酵素、dNTPS]のための基質として使用した。gRNA伸長は、停止コドンに対する突然変異をコードする。フラップ鎖を停止コドンの修復のために使用すると、GFPとmCherryとの両方を発現するプラスミドを融合タンパク質として産生するものと予想される。酵母二重FPプラスミド形質転換体を図10に示す。親プラスミドまたはin vitroでCas9(H840A)がニックを入れたプラスミドを形質転換すると、緑色GFP発現コロニーのみがもたらされる。5'伸長されたgRNAまたは3'伸長されたgRNAでのTRT反応は、緑色コロニーと黄色コロニーとの混合を産生する。後者はGFPとmCherryとの両方を発現する。より多くの黄色コロニーが3'伸長されたgRNAで観察される。停止コドンを含有しない陽性対照も示す。

この結果は、長い二本鎖の基質がTPRTを経り得ること、およびTPRT産物が真核細胞中に編集を誘導することを確立する。

上記のプライム編集実験と同様の別の実験も遂行したが、停止コドン中に点突然変異を組み入れる代わりに、TRT編集は、フレームシフト突然変異を修復しかつ下流mCherryの合成を可能にさせる単一ヌクレオチドの挿入(左)または欠失(右)を取り入れる(図11を参照)。両実験とも、3'伸長されたgRNAを使用した。TRT形質転換体からの個々のコロニーを選択し、サンガー配列決定によって分析した(図12を参照)。緑色コロニーは元のDNA配列をもつプラスミドを含有し、一方黄色コロニーは、TRT編集gRNAによってデザインされた正確な突然変異を含有していた。他の点突然変異もインデルも観察されなかった。

RT-Cas9構造体を使用するHEK細胞中のプライム編集を確立する
先の目的から最適化された構築物を、哺乳動物発現およびヒトゲノム中の標的部位での編集のために適合させる。複数のRT酵素および融合構造体を、2次gRNA(ニックが入れられるのを防止するためにトランケートされた)での隣接標的化に加えて、試験する。非共有結合のRT動員もまた、Sun-Tag系⁵²およびMS2アプタマー系⁵³を使用して評価する。インデル形成アッセイを、標準のgRNAおよびRT-Cas9融合体(上のとおり)での標的化効率を評価するのに使用する。次いで、各ゲノムの部位について、伸長されたgRNAとRT-Cas9との対を、単一ヌクレオチドの編集についてアッセイする。編集成果をMiSeqで評価する。

HEK細胞における最初の実験を、Cas9-RT融合体を使用して実施した。細胞内に発現される構成要素による編集には、Cas9(H840A)ニッカーゼ、逆転写酵素(融合体として発現されるか、またはtransで供給される)、および3'伸長をもつ改変gRNAを要する(図14を参照)。予備研究は、gRNA伸長内のプライマー結合部位の長さがヒト細胞中の編集の効率を増大させるのに重要であることを示した(図15を参照)。

HEK細胞中のプライム編集パラメータを最適化する
細胞中でプライム編集を実施できるCas9-RT構造体を同定した後、構成要素およびデザインを、高効率編集を達成するのに最適化する。コードされた点突然変異の場所およびヌクレオチド同一性、ならびに新しく合成されたDNA鎖の全長を、編集範囲および潜在的な欠点を評価するために変動させる。短い挿入および欠失の突然変異もまた評価する。タンパク質発現構築物をコドン最適化する。成功した場合、これは、哺乳動物細胞中の効率的なプライム編集を確立するであろう。

予備実験結果。
万一、融合RT酵素による分子内逆転写が起こり得なかったという場合には、追加のgRNAを、RT酵素が編集遺伝子座にてより高い局所濃度になるようデザインした。これらの補助ガイドを5'末にてトランケートするが(14～15ntスペーサー)、これによってCas9切断は防止されるが結合は保持されることがこれまでに示されている(図16を参照)。HEK3遺伝子座を、このストラテジーを探索するために選んだ。

潜在的な困難および代替手段
(1)細胞中のgRNA分解:伸長されたgRNA末端が細胞中でトランケートされた場合、安定化2次構造を組み入れるか、または安定化修飾をもつ合成gRNAを試験できる。(2)ヒト細胞中で編集が観察されない:RT-Cas9融合体の隣接ゲノム部位への2次標的化を包含する、追加のストラテジーを探索する⁵⁴。加えて、E.coliまたはS.cerevisiae中の潜在的な指向進化ストラテジーも探索できる。

有意性
プライム編集を実験の細胞株中で確立できた場合、これは、ヒト遺伝子中の多数の点突然変異の迅速な生成および特徴付けを可能にすることによって、生物医学の基礎研究に直接の影響を有するであろう。塩基編集因子に関する方法の一般論、およびその直交する編集窓は、目下アクセス不能な多くの突然変異を取り入れるアプローチを提供する。その上、プライム編集を高い効率および産物純度に最適化できた場合、他のヒト細胞型中の疾患突然変異を修正することへのその潜在的な適用性は意義深い。

3．培養ヒト細胞中の病原性の突然変異の部位特異的編集を達成する。
背景および論拠。

多数の病原性の突然変異は、PAMの制限に起因する最新の塩基編集因子によっては修正できない、すなわちトランスバージョンまたはインデル突然変異の修正が必要とされる。プライム編集で、すべてのトランジションおよびトランスバージョンは、挿入および欠失が小さい場合ではあるが、理論上起こり得る。その上、PAMとの関係において、プライム編集窓(-3～+4と予想される)は、塩基編集因子(-18～-12)とは違う(図13)。目下、塩基編集因子によって修正不能であるメンデル型疾病は、以下を包含する:(1)ヘモグロビンベータ中の鎌状赤血球病Glu6Val創始者突然変異(A・T→T・Aトランスバージョンを要する);(2)ATP7B中の最も一般的なウィルソン病バリアントHis1069Gln(G・C→T・Aトランスバージョンを要する);および(3)嚢胞性線維症を引き起こすCFTR中の△Phe508突然変異(3ヌクレオチド挿入を要する)。これらの標的の各々は、SpCas9標的化およびプライム編集にとって適切に位置付けられたPAMを含有する。
予備実験結果。
●HEK3細胞中のT→A編集は、最新の塩基編集では達成できないが、TRPT編集では達成できる(図17A～17Cを参照)。

図17Aは、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞中の構成要素のトランスフェクション後の標的ヌクレオチドでの％T→A変換を表示するグラフを示す。このデータは、野生型MLV逆転写酵素のCas9(H840A)ニッカーゼ(32アミノ酸リンカー)とのN末端融合体を使用する結果を提示する。編集効率は、プライマー結合部位の長さが7ヌクレオチドから11または12ヌクレオチドまで伸長されたとき劇的に改善した。加えて、編集遺伝子座のちょうど上流に位置付けられる補助(auxiliary)ガイドAは(図16を参照)、具体的にはプライマー結合部位の長さがより短い場合に、編集活性を有意に改善する。編集効率を、MiSeqプラットホームを使用するアンプリコン配列決定によって定量化した。図17Bはまた、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞中の構成要素のトランスフェクション後の標的ヌクレオチドでの％T→A変換も示すが、このデータは、RT酵素のC末端融合体を使用する結果を提示する。ここで、補助ガイドAはそれほどの(as much of)効果を有さず、編集効率全体はより高い。図17Cは、図17Aにおいて使用されたものと同様の野生型MLV逆転写酵素のCas9(H840A)ニッカーゼとのN末端融合体を使用する結果を提示するデータを示す;しかしながら、MLV RTとCas9との間のリンカーは、32アミノ酸の代わりに60アミノ酸長である。

●RPT編集結果によるHEK3部位でのT→A編集は高純度を表示する。
図18は、ハイスループットアンプリコン配列決定による配列決定分析の入力を示す。入力は、編集済細胞の最も豊富な遺伝子型を表示する。注目すべきことに、主要なインデル産物は得られず、所望の点突然変異(T→A)は、バイスタンダー編集をせずとも明確に取り入れられる。第1配列は参照遺伝子型を示す。上側2つの産物は、内生多型を含有する出発遺伝子型(GまたはA)である。下側2つの産物は、修正して編集された遺伝子型を表す。

●MLV RT突然変異体は編集を改善する。
Baranauskasら(doi:10.1093/protein/gzs034)に記載される突然変異逆転写酵素を、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞中の標的ヌクレオチド編集について、Cas9(H840A)ニッカーゼとのC末端融合体として試験した。Cas9-RT編集因子プラスミドを、逆転写の鋳型となる3'プライム編集ガイドRNAをコードするプラスミドとともに共トランスフェクトした。図19において標的ヌクレオチドでの編集効率(青色バー)を、インデル率(オレンジ色バー)と並べて示す。WTは野生型MLV RT酵素を指す。突然変異酵素(M1～M4)は、右に列挙された突然変異を含有する。編集率をゲノムDNAアンプリコンのハイスループット配列決定によって定量化した。

第2gRNAで相補鎖へニックを入れることは編集を改善する。
この実験は、単鎖ニックが、標的ヌクレオチドに近接する相補的なDNA鎖中に導入されたときの、標的ヌクレオチドの編集効率を評価する(これがミスマッチ修復へ指向して、元のヌクレオチドを優先的に除去しかつ塩基対を所望の編集へ変換するとの仮説から)。Cas9(H840A)-RT編集構築物を、2つのガイドRNA(その一方が逆転写反応の鋳型になり、他方が、ニックを入れるための相補的なDNA鎖を標的にする)をコードするプラスミドとともに共トランスフェクトした。標的ヌクレオチドから様々な距離にてニックを入れることを試験した(オレンジ色三角形)(図20を参照)。標的塩基対での編集効率(青色バー)を、インデル率(オレンジ色バー)と並べて示す。「なし」の例は、相補鎖へニックを入れるガイドRNAを含有しない。編集率をゲノムDNAアンプリコンのハイスループット配列決定によって定量化した。

図21は、所望のT→Aトランスバージョン突然変異と、他の主要ゲノム編集副産物が全体的に存在しないこととを示す、処理済ハイスループット配列決定データを示す。

範囲。
新しい編集技術のための潜在的な範囲を図13に示し、デアミナーゼ媒介の塩基編集因子技術と比較する。これまでに開発された塩基編集因子は、PAMの上流、～15±2bp領域を標的にする。標的CまたはAヌクレオチドを夫々、TまたはGへ変換することによって、これまでに開発された塩基編集因子は、すべてのトランジション突然変異(A:T→G:C変換)を可能にする。しかしながら、これまでに開発された塩基編集因子は、トランスバージョン突然変異(A→T、A→C、G→T、G→C、T→A、T→G、C→A、C→G)を取り入れることはできない。その上、編集窓に複数の標的ヌクレオチドがある場合、望ましくない追加の編集をもたらすことがある。

新しいプライム編集技術は理論上、いずれのヌクレオチドおよび塩基対の変換も、潜在的に小さい挿入および欠失の編集も取り入れられる。PAMに関し、プライム編集窓は、DNAへニックを入れる部位(PAMの3塩基上流)にて始まり、PAMの下流の、これまでのところ決定されていない位置にて終わる。注目すべきことに、この編集窓は、デアミナーゼ塩基編集因子とは違う。TPRT系は、DNAポリメラーゼ酵素を使用して編集を実施することから、一般性、高精度、および忠実度を包含するそれら利益のすべてを有する。

患者由来細胞株中の病原性の突然変異を修正する。
関係のある突然変異を内包する細胞株(鎌状赤血球病:CD34+造血幹細胞;ウィルソン病:培養線維芽細胞;嚢胞性線維症:培養気管支上皮)を、ATCC、Coriell Biobank、またはハーバード/ブロード連携共同研究所(collaborating Harvard/Broad affiliate laboratories)から得る。編集効率をハイスループット配列決定によって評価し、修正された遺伝子型の有効性を、表現型アッセイ(ヘモグロビンHPLC、ATP7B免疫染色、およびCFTR膜電位アッセイ)を使用して試験する。

オフターゲット編集活性を特徴付けする。
潜在的なオフターゲット編集を、野生型Cas9と対になった標的gRNAを使用し、GUIDE-seq⁵⁵およびCIRCLE-seq⁵⁶などの確立された方法でスクリーニングする。潜在的なオフターゲットが同定された場合、これらの遺伝子座をTPRT編集済細胞から探り、真のオフターゲット編集事象を同定する。

潜在的な困難および代替手段。
(1)低い編集効率:プライム編集因子(PE)は各標的について最適化を要することがある。このケースにおいて、gRNAライブラリは、特定の用途への最高機能バリアントを同定するのに試験できる。RT-Cas融合体の発現および核局在化は最適化できる。リポソームRNP送達を、オフターゲット編集を制限するのに使用できる。

次の実験。
gRNAデザインの最適化は、プライマー結合部位の長さおよび編集鋳型の伸長のさらなる探査によって達成できる。範囲および一般性を試験することは、種々のヌクレオチド変換、小さい挿入および欠失、ならびに、PAMに関する種々の編集位置、およびヒトゲノム中の複数部位を包含する。RT構成要素の最適化は、MLV RT中の活性(Rnase Hの不活化、プライマー-鋳型結合親和性の増大、処理能力(processivity)の調整)を増強する突然変異、および新しいRT酵素(グループIIイントロンRT、他のレトロウイルスのRT)中の突然変異を探査することを包含する。

有意性。
無数の遺伝性障害は、個々の遺伝子中の単一ヌクレオチドの変化からもたらされる。ここに記載のゲノム編集技術を開発すること、およびこれを疾患に関係のある細胞型に適用することは、臨床へ移行するための基礎を確立するであろう。鎌状赤血球病などのいくつかの疾患について、単一の点突然変異は、その集団全体にわたって優性遺伝子型を表す。しかしながら、多くの他の遺伝性障害について、単一遺伝子内の種々の点突然変異の大きな不均一性は、患者集団(この各々は同様の疾患表現型を生じている)全体にわたって観察される。したがって、一般のゲノム編集方法は理論上かかる多数の突然変異を標的にできるところ、この技術はこれら患者および彼らの家族の多くへ莫大な潜在的利益を提供できる。これら適用のための原理の証明が細胞中で確立できた場合、疾患の動物モデルにおいて研究するための基盤を確立するであろう。

利点
高精度:所望の編集は、核酸配列にコード、指向される。一般性:理論上、トランスバージョン編集、ならびに小さい挿入または欠失を包含する、いずれの塩基対変換もなし得る。Cas9プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列に関する塩基編集因子とは違う編集窓がある。この方法は相同組み換え修復(HDR)の編集能の多くを獲得するが、HDRの主な欠点(ほとんどの細胞型において非効率であって、大抵、インデルなどの望ましくない過剰の副産物が付随する)がない。前記方法はまた、二本鎖DNA破壊(DSB)、極少数のインデル、転座、大きな欠失、p53活性化等々もない。

例2－エラーを起こしやすいプライム編集(PE)

本明細書に記載のプライム編集(PE)システムは、ゲノム上に変異を組み入れるためにエラーを起こしやすい逆転写酵素酵素と併せてもまた用いられ得る。

ある態様が図22に図示されている。これは、標的座位に対してエラーを起こしやすい逆転写酵素による標的化された変異導入を行うための例示のプロセスの模式図であり、伸長されたガイドRNAと複合体化した核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)を用いている。このプロセスは標的化された変異導入のためのプライム編集のある態様と言われ得る。伸長されたガイドRNAは、ガイドRNAの3'もしくは5'端にまたはガイドRNAの分子内の位置付けに伸長を含む。ステップ(a)では、napDNAbp/gRNA複合体がDNA分子に接触し、gRNAがnapDNAbpをガイドして、変異導入されるべき標的座位に結合させる。ステップ(b)では、ニックが標的座位のDNAの鎖の1つに導入され(例えば、ヌクレアーゼまたは化学的薬剤による)、それによって利用可能な3'端を標的座位の鎖の1つに生出する。ある態様において、ニックは、Rループ鎖に対応するDNAの鎖、すなわちガイドRNA配列にハイブリダイズされない鎖上に生出される。ステップ(c)では、3'端DNA鎖が、逆転写をプライムするためにガイドRNAの伸長された部分と相互作用する。ある態様において、3'端DNA鎖は、ガイドRNAの伸長された部分の特定のRTプライム配列にハイブリダイズする。ステップ(d)では、エラーを起こしやすい逆転写酵素が導入され、これが、プライムされた部位の3'端からガイドRNAの3'端の方へDNAの変異導入された一本鎖を合成する。例示の変異がアステリスク「*」によって指示されている。これは所望の変異導入された領域を含む一本鎖DNAフラップを形成する。ステップ(e)では、napDNAbpおよびガイドRNAがリリースされる。ステップ(f)および(g)は一本鎖DNAフラップ(変異導入された領域を含む)の分解に関し、その結果、所望の変異導入された領域が標的座位に組み込まれるようになる。このプロセスは、ひとたび3'一本鎖DNAフラップが他の鎖上の相補的な配列に侵入およびハイブリダイズすると形成する対応する5'内生DNAフラップを除去することによって、所望の産物形成の方へ駆動され得る。プロセスは、図1Fにおいて例示されるとおり第2鎖ニッキングによってもまた産物形成の方へ駆動され得る。内生DNA修復および/または複製プロセス後に、変異導入された領域はDNA座位のDNAの両方の鎖上に組み込まれるようになる。

例3－PEによるトリヌクレオチド反復短縮
本明細書に記載のプライム編集システムまたはプライム編集(PE)システムは、トリヌクレオチド反復変異(または「トリプレット拡大疾患」)を短縮してハンチントン病および他のトリヌクレオチド反復障害などの疾病を処置するために用いられ得る。理論によって拘束されることなしに、トリプレット拡大はDNA複製またはDNA修復合成の間のスリップによって引き起こされる。タンデム反復は互いに同一の配列を有するので、2つのDNA鎖間の塩基対形成は配列上の複数の点において生起し得る。これはDNA複製またはDNA修復合成の間の「ループアウト」構造の形成に至り得る。これは繰り返し配列の繰り返しのコピーに至り得、反復数を伸長させる。ハイブリッドRNA:DNA中間体が関わる追加の機序が提案されている。プライム編集は、害をなす繰り返しのコドントリプレットの(or)1つ以上を欠失させること(deletion)によって、これらのトリプレット拡大領域を縮減または消去するために用いられ得る。この使用のある態様では、図23が、プライム編集によってトリヌクレオチド反復配列を短縮または縮減するためのPEgRNAデザインの模式図を提供する。

それゆえに、プライム編集は、ハンチントン病、脆弱X症候群、およびフリードライヒ運動失調症を包含するいずれかのトリヌクレオチド反復障害を修正するために用いられる能力があり得る。

最も普通のトリヌクレオチド反復はCAGトリプレットを含有するが、GAAトリプレット(フリードライヒ運動失調症)およびCGGトリプレット(脆弱X症候群)もまた生起する。CAGトリプレットはグルタミン(Q)をコードし、それゆえに、CAG反復は有疾患タンパク質のコード領域においてはポリグルタミントラクトをもたらす。トリヌクレオチド反復障害のこの具体的なクラスは「ポリグルタミン(ポリQ)疾患」ともまた呼ばれる。他のトリヌクレオチド反復は遺伝子制御の変改を引き起こし得、「非ポリグルタミン疾患」と言われる。拡大の素因を受け継ぐことまたはすでに伸長した親のアレルを獲得することは、疾患を獲得する蓋然性を増大させる。トリヌクレオチド反復の病原性の拡大はプライム編集を用いて修正され得る。

プライム編集は、カットされる部位へと標的化される充当されたPEgRNAを含むプライム編集因子によって、トリプレット反復領域の上流の領域へニックを入れることによって、トリプレット拡大領域を短縮するように実装され得る。それから、プライム編集因子は、健康な数のトリプレット反復(これは具体的な遺伝子および疾患に依存する)をコードする鋳型(すなわち、その編集鋳型)としてのPEgRNAに基づく新たなDNA鎖(ssDNAフラップ)を合成する。健康なトリプレット反復配列を含む新たに合成されたssDNA鎖は、また、反復の他端に隣接する配列にマッチする相同性の短いストレッチ(すなわち相同アーム)を包含するように合成される(赤色の鎖)。新たに合成された鎖の侵入、および新たに合成されたssDNAフラップによる内生DNAの爾後の置き換えは、短縮された反復アレルに至る。

例4－PEによるペプチドタグ付け
本明細書に記載のプライム編集システム(すなわち、PEシステム)は、種々のペプチドタグをタンパク質コード遺伝子上に導入するためにもまた用いられ得る。かかるタグはHEXAヒスチジンタグ、FLAGタグ、V5タグ、GCN4タグ、HAタグ、Mycタグ、および他を包含し得る。このアプローチは、タンパク質蛍光標識、免疫沈降、イムノブロッティング、免疫組織化学、タンパク質動員、誘導可能なタンパク質デグロン、およびゲノムワイドスクリーニングなどの適用に有用であり得る。態様が図25および26に図示されている。

図25は、内生ゲノム座位の遺伝子をペプチドタグ付けするためのgRNAデザインと、TPRTゲノム編集(すなわち、プライム編集)によるペプチドタグ付けとを示す模式図である。FlAsHおよびReAsHタグ付けシステムは2つのパーツを含む:(1)フルオロフォア-二ヒ素系プローブおよび(2)配列FLNCCPGCCMEP(配列番号1)によって例示されるテトラシステインモチーフを含有する遺伝子によってコードされるペプチドである。細胞内で発現されるときに、テトラシステインモチーフを含有するタンパク質はフルオロフォア-ヒ素プローブによって蛍光標識され得る(ref:J.Am.Chem.Soc.,2002,124(21),pp 6063-6076.DOI:10.1021/ja017687nを見よ)。「ソルタギング」システムは、標識されたペプチドプローブを好適なペプチド基質を含有するタンパク質に共有結合的にコンジュゲート化する細菌ソルターゼ酵素を使用する(ref:Nat.Chem.Biol.2007 Nov;3(11):707-8.DOI:10.1038/nchembio.2007.31を見よ)。FLAGタグ(DYKDDDDK(配列番号2))、V5タグ(GKPIPNPLLGLDST(配列番号3))、GCN4タグ(EELLSKNYHLENEVARLKK(配列番号4))、HAタグ(YPYDVPDYA(配列番号5))、およびMycタグ(EQKLISEEDL(配列番号6))はエピトープタグとしてイムノアッセイに普通に使用される。パイクランプはペンタフルオロ-芳香族基質によって標識され得るペプチド配列(FCPF)(配列番号622)をコードする(ref:Nat.Chem.2016 Feb;8(2):120-8.doi:10.1038/nchem.2413)。

図26は、ゲノムDNA上へのHis6タグおよびFLAGタグの精密な組み入れを示す。18nt Hisタグ挿入または24nt FLAGタグ挿入どちらかをコードする逆転写鋳型を有するHEK3座位を標的化するガイドRNAをデザインした。トランスフェクションされたHEK細胞の編集効率をアンプリコン配列決定を用いて評価した。FLAGタグの完全な24nt配列はビューフレーム外であるということに注意せよ(配列決定は完全なかつ精密な挿入を確認した)。

例5－PEによるプリオン病の防止または処置

本発明はヒト、家畜、および野生生物のプリオン病の問題に対処することを助け得る。先に記載されている編集戦略は、防護性変異を組み入れまたはPRNPを確かにノックダウンするために十分に効率的かつクリーンではない。Cas9ヌクレアーゼおよびHDRは用いられ得るが、ほぼPRNPインデルバリアントの混合物を生成するであろう。これらのいくつかは病原性であると考えられる。その上、HDRは細胞のほとんどの型においては働かない。プライム編集は、余分な二本鎖DNA切断またはもたらされるインデルを生成することなしに、変異の両方の型を組み入れることにおいて確かでかつ効率的である。

本発明は、どのようにしてプリオン病を防止またはその進行を停止させるPRNPの防護性変異を組み入れるのかを記載する。この部位は哺乳動物において保存され、そのため、ヒト疾患を処置することに加えて、それはプリオン病に対して免疫がある牛および羊を生成するかまたはさらにはプリオン病を患う動物の野生集団を治癒させることを助けるためにもまた用いられ得る。プライム編集はヒト細胞における天然に存在する防護性アレルの～25％の組み入れを達成するためにすでに用いられており、先のマウス実験は、このレベルの組み入れがほとんどのプリオン病に対する免疫を引き起こすために十分であるということを指示している。この方法は、かかる高い効率でほとんどの細胞型においてこのアレルを組み入れるための第1のかつ可能性としては唯一の現行のやり方である。処置のための別の可能な戦略は、プライム編集を用いて、早期停止コドンを遺伝子に組み入れることによってPRNPの発現を縮減または消去することである。多くの研究者がそうすることは疾患を処置するであろうということを予測している。

3つの可能性ある治療学的戦略は、PrPの発現を縮減するためのプライム編集を包含する。このゴールは、未成熟停止コドンをPRNPに引き起こすか、スタートコドンを消去するか、必須アミノ酸コドンを変異もしくは欠失させるか、異状な転写物を生成するためのスプライス部位を導入もしくは除去するか、または転写物レベルを縮減する制御エレメントを変改する変異の導入によって達成され得る。疾患変異を消去するためのプライム編集。疾患に罹患する増大した蓋然性に至るPRNPの多くのバリアントが記載されている(ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6097508/#b154-ndt-14-2067)。プライム編集は全ての可能な型の点変異、局所的挿入、および局所的欠失をなし得るので、各公知のバリアントはプライム編集を用いて逆転させられ得る。プリオン形成および/または伝達を遮断する1つ以上の防護性変異をPRNPに導入するためのプライム編集。例えば、ヒトPRNP遺伝子のG127Vは、プリオン病の多くの形態から防護することが実証されている(ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4486072/)。後に、この変異は安定なベータシートおよび二量体の形成を防止することによってプリオン形成に干渉することが記載された(ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30181558、ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26906032)。1ヌクレオチド多型の導入に加えて、プリオン形成に干渉するであろうPRNP上の配列の挿入または欠失もまた、プリオン病から防護またはそれを処置するために用いられ得る。

防護性のバリアントの導入は相対的に小さい数の細胞が編集を経験するときでさえも利益を付与し得るので、第3の治療学的戦略は特に有利である。さらにその上、防護性のバリアント、特にG127Vなどのヒト集団に天然に存在するものの導入は、いずれかの不利益な帰結を有することは予想されないであろうが、PRNPノックアウトマウスにおいて立証されているとおり、戦略1のようにプリオンタンパク質の発現を縮減することはいくつかの不利益な表現型を有し得る(ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4601510/、ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2634447/)。

およそ2:1の比の野生型ヒトプリオンタンパク質:ヒトプリオンタンパク質の防護性G127Vバリアント(防護性のバリアントのおよそ33％発現)を発現するマウスは、プリオン病のほとんどの試験された形態に対して全く免疫があり、牛海綿状脳症(BSEまたは狂牛病)から伝達されるヒト疾患の変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)に対してもまた耐性であったということが先に実証されている⁹¹。防護性のG127Vバリアントのみを発現するマウスは、vCJDを包含する全ての試験されたプリオン病課題に対して全く免疫があった。

防護性のG127V変異はプライム編集を用いて組織培養においてヒト細胞に効率的に組み入れられ得るということが本願において実証される(図27を見よ)。

これらの結果によって情報提供され、PRNP編集が用いられ得る3つの設定が記載される。1つの設定のPRNP編集は、プリオン病を防止または処置するためのヒト患者におけるプライム編集に用いられ得る。第2の設定のPRNP編集は、プリオン病の生起および広がりを防止するための家畜におけるプライム編集に(is)用いられ得る。牛および羊両方の家畜は、PRNP遺伝子によって生成されるタンパク質によって引き起こされるプリオン病の特発性の生起を経験している。動物が患う衰弱性のかつ致命的な疾患に加えて、これらのケースは経済的にもまた破壊的である。部分的には、極めて感染性の疾患の広がりを防止するために取られなければならないケアを原因とする。ワシントン州の単一の乳牛が2003年の12月にBSEについて検査陽性となり、これは次の年の牛肉売上の28-42億ドルという推測される損失に至った(bookstore.ksre.ksu.edu/pubs/MF2678.pdf)。PRNP遺伝子は哺乳動物において高度に保存されている。G127VなどのPRNP変異を家畜生殖細胞系列に導入することは、BSEまたは羊におけるプリオン病の現れのスクレイピーの生起を消去し得る。第3の設定のPRNP編集は野生生物のプライム編集に(is)用いられ得、野生のプリオン病の広がりを防止し得る。現行では、北米の鹿、ヘラジカ、およびムースを包含するシカ科集団が、これらの種においてPNRPによって引き起こされるプリオン病の現れの慢性消耗病(CWD)を患う。生起はいくつかの集団においては25％ほども高いことが報告されている(cdc.gov/prions/cwd/occurrence.html)。CWDはノルウェー、フィンランド、および韓国においてもまた報告されている。疾患がこれらの種からヒト(cdc.gov/prions/cwd/transmission.html)または家畜へと伝達性であるかどうかはまだ未知である。これらの種の生殖細胞系列におけるG127VなどのPRNP変異の導入は、それらをCWDから防護し得、ヒトを包含する他の種への伝達のリスクを縮減し得る。

この方法はクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、致死性家族性不眠症(FFI)、牛海綿状脳症(BSE;狂牛病)、スクレイピー(羊)、および慢性消耗病(CWD;鹿、ヘラジカ、およびムース)を処置するために用いられ得る。

方法は、胚または成体ニューロンのための送達方法論、例えばマイクロインジェクション、脂質ナノ粒子、またはAAVベクターと組み合わせられることを必要とするであろう。

例6－PEを用いるRNAタグ付けおよび操作
哺乳類、真核生物、および細菌細胞においてRNAをタグ付けまたは別様に操作する遺伝子配列上へのモチーフの挿入のための新たな方法が、本明細書に記載の。ヒトゲノムの1％のみがタンパク質をコードするということが見積もられているが、ゲノムの実質的に全ては何らかのレベルで転写される。もたらされる非コードRNA(ncRNA)のどれくらい多くが機能的な役割を演ずるのか、ましてやこれらの推定RNAのほとんどの役割が何であるのかは、未解決の問いかけである。目当ての遺伝子上への有用な特性を有する新規のRNAコード配列の挿入によるこれらのRNA分子の「タグ付け」は、細胞におけるRNA分子の生物学的機能を研究するための有用な方法である。それは、どのようにしてmRNA修飾が細胞機能に影響し得るかを撹乱し、それゆえにより良く理解するための手段として、タンパク質をコードするmRNA上にタグを組み入れるにもまた有用であり得る。例えば、ユビキタスな天然のRNAタグのポリアデニル化は、細胞質へのmRNAの輸送に影響するために細胞によって用いられる。異なる型のポリアデニル化シグナルは、異なる輸送速度および異なるmRNA寿命、それゆえにコードされるタンパク質が発現されるレベルの違いをもたらす。

タグ付けされたRNAを細胞内で発現するための普通のアプローチは、合成構築物を外因的に導入することであり、(i)短期的な突発的な遺伝子発現を多くの場合には超生理学的レベルで生ずる一過性プラスミドトランスフェクション;または(ii)遷延した発現を可能化するレンチウイルス取り入れもしくはトランスポゾンを用いるゲノム上への(ランダムな部位における)タグ付けされたRNA遺伝子の永久的な取り入れどちらかを用いる。これらのアプローチの両方は、変改された発現レベルの生産によっておよび遺伝子の発現または活性を制御する天然の機序の不在によって限定される。代替的な戦略は、Cas9または他の標的化されたDNAヌクレアーゼによって誘導される二本鎖DNA切断の相同組み換え修復(HDR)を用いて、目当ての遺伝子をその内生座位において直接的にタグ付けすることである。このアプローチは広い範囲の内生でタグ付けされた遺伝子の生成を可能化するが、HDRは顕著に非効率的であり、そのため、首尾良くタグ付けされた細胞の所望のクローン集団を同定するための有意なスクリーニングを要求する。その上、HDRは、多数の細胞型、最も注意すべきことに有糸分裂後細胞において典型的には非常に非効率的または全く不活性である。HDRの低い効率は望まれないインデル産物の生成によってさらに複雑化し、これはRNA遺伝子のケースにおいて特に問題であり得る。なぜなら、それらはその活性が正常アレルの機能に干渉するRNAの生産に至り得るからである。最後に、最適な性能を達成するためには、研究者は多くの場合にはRNA分子上の種々のタグ付け位置をスクリーニングすることを必要とする。組み合わせると、これらの欠点は、HDRをRNA上のタグの組み入れのためのより望ましくない方法にしている。

プライム編集は新たなゲノム編集テクノロジーであり、これはRNAからDNAへの遺伝情報の移入によってゲノム座位の標的化された編集を可能化する。プライム編集を用いて、RNA遺伝子は、種々の構成要素、例えばRNAアプタマー、リボザイム、または他のRNAモチーフによってタグ付けされ得る。プライム編集は、HDR戦略と比較して、多大な種々の細胞型において高速、安価、有効であるポテンシャルを有する。そのため、記載される発明は、健康および疾患におけるRNA遺伝子の生物学を取り調べるための新規の有用なかつ非自明のツールを表す。プライム編集因子(PE)を用いてRNAをタグ付けまたは別様に操作する遺伝子配列上へのRNAモチーフの挿入のための新たな方法が、本明細書に記載の。PEは、CRISPR/Casシステムによって標的化可能である所望のゲノム座位において、複数のヌクレオチドを部位特異的に挿入、変異、および/または欠失させることができる。PEはCas9ヌクレアーゼドメインと逆転写酵素ドメインとの間の融合体からなる。それらは、DNA標的化のためのガイドスペーサー部分と所望のゲノム編集をコードする逆転写の鋳型とを含有する操作されたPEgRNA(プライム編集ガイドRNA)によってそれらのゲノム標的へとガイドされる(図28Aを見よ)。PEは、RNAレベルで機能的であるモチーフ(これ以降ではRNAモチーフ)を挿入して非コードRNAまたはmRNAをタグ付けまたは別様に操作するために用いられ得るということが想定される。これらのモチーフは、遺伝子発現を増大させるか、遺伝子発現を減少させるか、スプライシングを変改するか、転写後修飾を変化させるか、RNAの細胞下レベル位置付けに影響するか、RNAの単離またはその細胞内もしくは外の位置付けの決定を可能化するか(例えば、蛍光RNAアプタマー、例えばSpinach、Spinach2、Baby Spinach、またはBroccoliを用いる)、内生または外因的なタンパク質またはRNA結合因子を動員するか、sgRNAを導入するか、あるいは自己切断またはRNAseどちらかによるRNAのプロセシングを誘導するための用をなし得る(図28Bを見よ)。プライム編集のフレキシビリティーを原因として、ゲノム上に組み入れられ得るRNAモチーフの網羅的なリストを提供することは可能ではない。ここでは、RNA遺伝子にタグ付けするために用いられ得るPEによって組み入れされるRNAモチーフの予測される範囲を幅広く例解する一連の例が示される。PE以外のいずれかの他の報告されたゲノム編集法を用いては、これらの変化を効率的にかつ相当クリーンになすことは、ほとんどの型の細胞(HDRを支持しない多くを包含する)において現行では可能ではない。

遺伝子発現は、核輸送もしくは保持またはmRNA寿命の変化をもたらす3'非翻訳領域(UTR)をコードすることによって影響され得る。例えば、ポリオーマウイルスサルウイルス40(SV40)からのポリAテールは、効率的な転写終結を可能化する追加のヘルパー配列を有し、他の3'UTRに対して相対的に遺伝子発現を増大させ得る^57,58。SV40ポリAテールの例の配列:

ポリアデニル化シグナル以外の翻訳後修飾シグナルもまたPEによってコードされ得る。これらの包含されるシグナルは、N6-メチルアデノシン、N1-メチルアデノシン、5-メチルシトシン、およびシュードウリジン修飾を組み込む⁵⁹。PEを用いて、RNA転写物上のこれらの修飾を書き込むかまたは除去する酵素によって結合される配列を包含することによって、それらの書き込みまたは消し去りを誘導することが可能であろう。これは、これらのマーカーの効果を研究するための、細胞分化を誘導するための、ストレス応答に影響するための、またはこれらのマーカーの機能がまだ未調査であるということからは、他の様式で標的細胞に影響するためのツールとして用いられ得る。

PEは細胞下レベル局在に影響する変異をコードし得る。例えば、mRNA上のtRNA-Lysの組み込みは、理論的にはミトコンドリアへの輸送をもたらし得るが⁶⁰、種々の3'UTRは核保持または輸送をもたらし得る⁶¹。

例:

SV40ポリAシグナルが輸送をもたらす。

U1 snRNA 3ボックスは保持をもたらす。

内生RNAの細胞下レベル局在を決定することは難しくあり得、FISHのケースのように外因的な蛍光タグ付けされたヌクレオチドプローブの追加、または時間を消費するかつ可能性として不正確な細胞分画、次にRNA検出を要求する。内生RNA上にプローブをコードすることは、これらのイシューの多くを取り除くであろう。1つの例は、蛍光RNAアプタマー、例えばSpinach⁶²またはBroccoliを内生RNA上にコードし、それによって、低分子プロトフルオロフォアの追加によってRNAの存在を視覚化することであろう。

Broccoliアプタマー:

PEは、RNA結合タンパク質によって認識されるRNAをコードする配列を挿入または除去し得、RNA安定性、発現、局在、または修飾に影響する(例えば、列記されているタンパク質を見よ⁶³)。

ウイルスまたはがん防御機序として、PEはsgRNAをコードする配列をゲノム上に挿入し得る。類似に、それは、標的遺伝子のサイレンシングを導くためのマイクロRNA(例えば、プレマイクロRNA)を挿入するために用いられ得る。

PEは、治療、またはRNAの種々の部分の機能を研究するためのツールとしてどちらかで、それ自体によるかまたは外部の因子によるかどちらかのRNAのプロセシングをもたらす配列を挿入し得る。例えば、HDVリボザイム⁶⁴は、RNA配列上に包含されるときには、リボザイムの直ちに5'のRNAのプロセシングをもたらし、ハンマーヘッドリボザイムはリボザイム上の第3のステムに先行して切断する⁶⁵。他の自己切断リボザイムは、ピストル⁶⁶、ハチェット⁶⁶、ヘアピン⁶⁷、Neuropora Varkudサテライト⁶⁸、glmS⁶⁹、ツイスター⁷⁰、およびツイスターシスター⁶⁶を包含する。これらの配列はリボザイムの野生型のまたは操作されたまたは進化したバージョンを包含し得る。リボザイムによってカットされる部位がどこに位置付けられるかに依存して、これらのリボザイムの多数はそれらが関連するRNAの領域に依存して異なる配列を有し得る。外部の因子、例えば配列特異的RNAse⁷¹、特定の構造を認識するRNAse⁷²、例えばDicer⁷³およびDrosha⁷⁴によるRNAのプロセシングを導くであろう配列もまた達成され得る。

例6のための参考文献

以下の参考文献はこれら全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる。

例7－PEによる遺伝子ライブラリの生成
定められたまたは可変の挿入、欠失、または定められたアミノ酸/ヌクレオチド変換を有するタンパク質またはRNAをコードする遺伝子の高度に高性能なライブラリの細胞性の生成のための新たな方法と、高スループットスクリーニングおよび指向性進化へのそれらの使用とが、本明細書に記載の。例において引用される参照はこの例の終わりに包含される参照のリストに基づく。

可変の遺伝子ライブラリの生成は最も普通には変異誘発PCRによって達成されている¹。この方法は、DNAポリメラーゼの忠実性を縮減する反応条件を用いることまたはより高い変異率を有する改変されたDNAポリメラーゼを用いることどちらかに依拠する。そのため、これらのポリメラーゼのバイアスはライブラリ産物に反映される(例えば、トランスバージョンに対してトランジション変異の選好性)。ライブラリ構築のこのアプローチの内在する限定は、変えられようとする遺伝子のサイズに影響することの相対的不能である。ほとんどのDNAポリメラーゼは極めて低いインデル変異²(挿入または欠失)率を有し、これらのほとんどはタンパク質をコードする領域のフレームシフト変異をもたらし、ライブラリのメンバーがいずれかの下流セレクションを通過することを非蓋然的にするであろう。加えて、PCRおよびクローニングのバイアスは、異なるサイズの遺伝子からなる単一のライブラリを生成することを困難にし得る。これらの限定は、存在するタンパク質機能を増強または新規のタンパク質機能を操作するための指向性進化の効力を厳しく限定し得る。天然の進化では、タンパク質機能または効力の大きい変化は典型的には挿入および欠失変異に関連し、これらは変異導入のための標準的なライブラリ生成の間に生起することが非蓋然的である。さらにその上、これらの変異は、最も普通には、疎水性コアと対比してループを形成することが予測される当のタンパク質の領域に生起する。それゆえに、従来のバイアスがないアプローチを用いて生成されるほとんどのインデルは、害があるかまたは無効であるかどちらかであることが蓋然的である。

全てのライブラリは可能な変異空間のある画分のみにアクセスするということから、それらが有益であることが最も蓋然的であろうタンパク質上の部位、例えばループ領域にかかる変異を偏らせ得るライブラリは、従来のライブラリと比べて有意な利点を有するであろう。最後に、NNKプライマーを用いるマルチステップPCRおよびクローンアセンブリによってまたはDNAシャッフリングによって、部位特異的なインデル変異を有する遺伝子ライブラリを生成することは可能であるが、これらのライブラリは連続的進化の「インデルジェネシス」の追加のラウンドを経過し得ない。連続的進化は、最小限のユーザー介入によるある型の指向性進化である。1つのかかる例はPACEである³。連続的進化は最小限のユーザー介入によって生起するので、進化の間のライブラリ多様性のいずれかの増大はネイティブな複製機構を用いて生起するはずである。そのため、PACEでは、特定の座位として挿入または除去されたコドンを有する遺伝子のライブラリが生成およびスクリーニングされ得るが、「インデルジェネシス」の追加のラウンドは可能ではない。

プライム編集(PE)のプログラム可能性は、高スループットスクリーニングおよび指向性進化への使用のための高度に高性能なプログラムされた遺伝子ライブラリを生成するために活用され得るということが想定される(図29Aを見よ)。PEは、プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)上にコードされた情報を用いて、規定された遺伝子座位から定められた数のヌクレオチドを挿入、変化、または除去し得る(図29Bを見よ)。これは、非機能的なフレームシフト変異のバックグラウンド導入なしに、変異が機能の変化を生じさせることが最も蓋然的であるループ領域から挿入または除去された1つ以上のアミノ酸を有する標的化されたライブラリの生成を可能化する(図29Cを見よ)。PEは、DNAポリメラーゼまたは変異させられようとする配列どちらかに内在するバイアスにかかわらず、特定のセットの変異を組み入れるために用いられ得る。

例えば、それは2つのトランスバージョンを包含する3つの連続した変異を要求するであろうから、CCCコドンを停止コドンに変換することは標準的なライブラリ生成によっては非蓋然的な生起であろうが、PEは、いずれかの所与の標的コドンをTGA停止コドンへと1ステップで変換するために用いられ得る。それらは、例えば、いずれかの疎水性アミノ酸をコードしながらいずれかの他をコードしないコドンを所与の部位に組み込むことによって、プログラムされた多様性を所与の位置に組み入れるためにもまた用いられ得る。さらにその上、PEのプログラム可能性ゆえに、複数のPEgRNAが複数の異なる編集を複数の部位に同時に生成するために利用され得、高度にプログラムされたライブラリの生成を可能化する(図29Dを見よ)。加えて、より低い忠実性を有する逆転写酵素を用いて、さもなければ不変のライブラリにおいて変異導入の領域を生成することが可能である(例えば、HIV-I逆転写酵素⁴またはBordetellaファージ逆転写酵素⁵)。

同じ部位に対するPEの反復的なラウンドの可能性もまた想定され、例えば、単一の部位におけるコドンの繰り返しの挿入を許す。最後に、上に記載されているアプローチの全てが連続的進化に組み込まれ得るということが想定され、新規のin situ進化ライブラリの生成を可能化する(図30を見よ)。それらは、大きいライブラリをアセンブリすることがさもなければ困難であろう他の細胞型内において、例えば哺乳類細胞内において、これらのライブラリを構築するためにもまた用いられ得る。指向性進化のための最適化されたPEをコードする細菌株の生成は、改善されたまたは新規の機能性を有するタンパク質およびRNAの同定のための有用な追加のツールであろう。PEのこれらの使用の全てはPEの新規の性質を原因として非自明である。結論として、PEによるライブラリ生成は、合成生物学および指向性進化において、ならびにタンパク質およびRNAのコンビナトリアル変異体の高スループットスクリーニングにとって、高度に有用なツールであろう。

競合するアプローチ
多様なライブラリが現行で生成される主だった方法は、上に記載されている変異誘発PCRによってである¹。挿入または欠失はPCRの間に定められた部位において縮重したNNKプライマーによって導入され得るが、かかる変異を複数の部位において導入することは、より多様なライブラリを変異誘発PCRによって構築する前に複数のラウンドの反復的なPCRおよびクローニングを要求し、方法を低速にする。代替的な補完的な方法はDNAシャッフリングであり、ここでは、DNase処置によって生成された遺伝子のライブラリのフラグメントがプライマーなしのPCR反応に導入され、互いに対する異なるフラグメントのアニーリングと、変異誘発PCR単独よりも多様なライブラリの急速な生成とをもたらす⁶。このアプローチは理論的にはインデル変異を生成し得るが、それはより多くの場合には遺伝子機能を破壊するフレームシフト変異をもたらす。さらにその上、DNAシャッフリングは遺伝子フラグメント間に高い度合の相同性を要求する。これらの方法の両方はin vitroでされなければならず、もたらされるライブラリは細胞に形質転換されるが、PEによって生成されるライブラリはin situで構築され得、連続的進化へのそれらの使用を可能化する。ライブラリはインビボの変異導入によってin situで構築され得、これらのライブラリはホスト細胞機構に依拠し、インデルに対してバイアスを発揮する。類似に、従来のクローニング方法は部位特異的な変異プロファイルを生成するために用いられ得るが、それらはin situでは用いられ得ず、一般的には、細胞に形質転換される前にin vitroで1度に1つずつアセンブリされる。原核および真核細胞型両方におけるPEの効率および幅広い機能性は、さらに、E.coliなどのモデル生物にクローニングされることおよびそれから目当ての細胞または生物に移入されることと対比して、これらのライブラリが目当ての細胞型内において直接的に構築され得るということを示唆する。標的化された多様化の別の競合するアプローチは自動多重ゲノム工学またはMAGEであり、複数の一本鎖DNAオリゴヌクレオチドが複製フォークに組み込まれ得、プログラム可能な変異をもたらし得る⁷。しかしながら、MAGEはホスト株の有意な改変を要求し、オフターゲットまたはバックグラウンド変異の100倍の増大に至り得るが⁸、PEはより高度にプログラムされており、より少数のオフターゲット効果をもたらすことが予期される。加えて、MAGEは哺乳類細胞を包含する広い種々の細胞型においては実証されていない。プライム編集はライブラリ生成のための新規のかつ非自明な補完的な技術である。
遺伝子ライブラリを構築するための指向性進化におけるPEの例

1つの例では、PEは、PACEを用いる連続的進化実験の間に遺伝子ライブラリにタンパク質バリアントを導入するために指向性進化実験に用いられ得、従来のアプローチでは可能ではない様式で点変異およびインデル両方の反復的蓄積を許す。PEは部位特異的にかつプログラム可能にヌクレオチドをE.coliの遺伝子配列上に挿入し得るということがすでに示されている。概説された指向性進化では、改変されたツーハイブリッドタンパク質:タンパク質結合PACEセレクションによって、特異的なエピトープに対する改善された結合を有するモノボディを同定することが提案されている。これらのモノボディ上の特異的なかつ高度に可変のループは親和性および特異性に有意に寄与する。改善されたモノボディ結合は、PACEにおいてはこれらのループの長さおよび組成を標的化された様式で変えることによって急速に得られ得る。しかしながら、配列長さを変えることはPACEの確立された機能性ではない。様々なループサイズのライブラリがPACEの出発点として用いられ得るが、長さの爾後の改善はPACEセレクションの間に発生せず、点変異およびインデル変異の有益な相乗的組み合わせへのアクセスを妨害するであろう。PEをPACEセレクションに導入することは、様々なループ長さを有するモノボディのin situ生成および進化を可能化するであろう。そうするためには、それは、ホストE.coli株へのPE酵素および1つ以上のPEgRNAをコードする追加のPEプラスミドの導入を想定される。PE酵素およびPEgRNAの発現は、実験者によって選択される速度でPACEラグーンに送達される低分子のコントロール下にあるであろう。

種々の態様において、PEgRNA構成要素は、セレクションファージ上の目当ての部位へとPEを導くスペーサーを含有し、複数の3ヌクレオチドが標的部位に挿入され得るようにしてデザインされるであろう。その結果、新たなPEgRNA結合部位が導入され、標的部位における1つ以上のコドンの反復的挿入を可能化するであろう。

並行して、別のホストE.coli株は、1つ以上のコドンの除去の鋳型となるPEgRNAを包含し得、ループサイズが進化の間に縮むことを可能化する。PACE実験は両方の株の混合物を利用し得るか、または2つを交互にしてループ配列の低速のかつコントロールされた追加もしくは除去を許し得る。

この技術は抗体の進化にもまた適用され得るということが注意される。抗体を支配する結合原理は、モノボディを支配するものに非常に類似である:抗体相補性決定領域ループの長さはそれらの結合機能にとって重大である。さらに、より長いループ長さは、HIV-1および他のウイルス感染に対する幅広く防護性の活性を有する稀な抗体の開発において重大であることが見出されている⁹。抗体または抗体由来分子への上に記載されているPEの適用は、多様なループ長さおよび様々なループ配列を有する抗体の生成を許すであろう。PACEとの組み合わせで、かかるアプローチは標準のPACEにとってはアクセス可能でないループジオメトリによる増強された結合を許し、それゆえに高度に機能的な抗体の進化を許すであろう。

実験は、ファージによって補助される非連続的進化(PANCE)においてバクテリオファージM3の害がある変異を修正するためにPEを用いる能力を示すであろう。連続的進化にPEを用いるための必要な第1ステップである(図69を見よ)。

例7のための参考文献

以下の参考文献はこれら全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる。

例8－PEによる免疫エピトープ挿入
CRISPR/Casシステムを用いる精密なゲノム標的化テクノロジーが、最近では、標的ゲノム座位上への操作されたDNA配列の挿入を包含する広い範囲の適用において調査されている。先には、相同組み換え修復(HDR)がこの適用について用いられ、ssDNAドナー鋳型と二本鎖DNA切断(DSB)の手段による修復開始とを要求した。この戦略は、細胞になされるべき可能な変化の最も幅広い範囲をオファーし、大きいDNA配列を哺乳類細胞に挿入するために利用可能な唯一の方法である。しかしながら、HDRは、そのDSBを開始することから派生する望まれない細胞副作用、例えば高いレベルのインデル形成、DNA転座、大きい欠失、およびP53活性化によって邪魔される。これらの欠点に加えて、HDRは多くの細胞型における低い効率によって限定される(T細胞はこの観察の注意すべき例外である)。これらの欠点を克服するための最近の作業は、ヒトRad51変異体をCas9 D10Aニッカーゼに融合することを包含し(RDN)、DSBフリーHDRシステムをもたらす。これは、改善されたHDR産物:インデル比およびより低いオフターゲット編集を特色とするが、細胞型依存性および控えめなのみのHDR編集効率によってなお邪魔される。

PEgRNAとカップリングされた逆転写酵素へのCas9の最近開発された融合体(「プライム編集因子」)は、存在するゲノム編集法と比べていくつもの利点をオファーする新規のゲノム編集テクノロジーを表し、部位特異的な様式で、いずれかの1ヌクレオチド置換を組み入れおよびヌクレオチドのいずれかの短いストレッチ(最高で少なくとも何ダースもの塩基)を挿入または欠失する能力を包含する。注意すべきことに、PE編集は一般的に低い意図されないインデル率で達成される。そのため、PEは、先には不可能または非実用的であった標的化された挿入に基づく編集適用を可能化する。

具体的な本発明は、公知の免疫原性エピトープを内生または外生のゲノムDNA上に挿入するための手段としてプライム編集を用いるための方法を記載し、治療学的またはバイオテクノロジー的適用のための対応するタンパク質の改変をもたらす(図31および32を見よ)。プライム編集の本発明に先行しては、かかる挿入は、非効率的にかつDSBからの高いインデル形成率によってのみ達成され得た。プライム編集は挿入編集からの高いインデル形成の問題を解決しながら、一般的にHDRよりも高い効率をオファーする。このより低いインデル形成率は、特に免疫原性エピトープを挿入するという記載されている適用において、標的化されたDNA挿入のための方法としてのHDRと比べたプライム編集の主要な利点を提示する。エピトープの長さは少数塩基から数百塩基の範囲である。プライム編集因子はかかる標的化された挿入を哺乳類細胞において達成するための効率的なかつ最もクリーンなテクノロジーである。

本発明の鍵の概念は、それらのタンパク質産物および/または発現細胞型の下方制御および/または破壊のために、先に記載された免疫原性エピトープを含有するヌクレオチド配列を内生または外生のゲノムDNA上に挿入するためのプライム編集因子の使用である。標的遺伝子のコードされるタンパク質と挿入される免疫原性のエピトープの対応するタンパク質翻訳との融合タンパク質を生ずる様式で、免疫原性のエピトープ挿入のためのヌクレオチド配列は、遺伝子へと標的化されるであろう。患者の免疫系は、例えば破傷風またジフテリアまたは麻疹に対するルーチンの予防接種からの先行する標準免疫化の結果として、これらのエピトープを認識するように先に訓練されているであろう。融合されるエピトープの免疫原性の性質の結果として、患者の免疫系は、プライム編集されたタンパク質(ただの挿入されるエピトープではない)と可能性としてはそれが発現された細胞とを認識および不能化することが予想されるであろう。

標的遺伝子への融合体は、挿入されたエピトープタンパク質翻訳が免疫系認識のために暴露されるということを保証するために必要とされるとおり操作されるであろう。これは、標的遺伝子への免疫原性エピトープのC末端融合体、標的遺伝子への免疫原性エピトープのN末端融合体、または遺伝子上へのヌクレオチドの挿入を生むタンパク質翻訳をもたらす標的化されたヌクレオチド挿入を包含し得、その結果、免疫原性エピトープがタンパク質構造の表面の暴露された領域にコードされる。

標的遺伝子の免疫系認識、細胞輸送、タンパク質機能、またはタンパク質フォールディングを容易化するために、標的遺伝子配列と挿入される免疫原性エピトープヌクレオチド配列との間に挿入されるヌクレオチドとしてコードされるタンパク質リンカーが、本発明の一部として操作されることを必要とし得る。これらの挿入されるヌクレオチドによってコードされるタンパク質リンカーは、可変の長さおよび配列のXTENリンカーまたは可変の長さおよび配列のグリシン-セリンリンカーを包含し得る(が、これらに限定されない)。これらの操作されたリンカーは、タンパク質融合を首尾良く容易化するために先に用いられている。

本発明の際立った特色は、さもなければ非免疫原性のタンパク質に対する免疫応答を誘導するための手段として、特定のアミノ酸配列に対する先に獲得された免疫応答を用いる能力を包含する。別の際立った特色は、副産物編集としての欲されないインデルの高いレベルを誘導せずかつその挿入が効率的である標的様式で、これらの免疫原性のエピトープのヌクレオチド配列を挿入する能力である。本願において論じられる本発明は、細胞型特異的な送達方法(例えばAAV血清型)を組み合わせて、それに対する免疫応答を誘発することが目当てである細胞型にエピトープを挿入する能力をもまた有する。

免疫原性のエピトープを病原性の遺伝子上に挿入する手段としてのプライム編集は、広い種々の疾患(免疫腫瘍学戦略のがんに限定されない)と戦うように患者の免疫系をプログラムするために用いられ得る。このテクノロジーの直ちに該当する使用は、がんの治療学としてであろう。なぜなら、それは、HER2のような該当するがん遺伝子またはEGFRのような増殖因子に対する免疫応答を引き起こすことによって、腫瘍の免疫エスケープ機序を阻み得るからである。かかるアプローチはT細胞操作に類似に見え得るが、このアプローチの1つの新規の進歩は、操作されたT細胞を生成し患者に導入することを必要とすることなしに、それが多くの細胞型におよびがん以外の疾患に利用され得るということである。

PEを用いて、ほとんどの者がすでに予防接種されている免疫原性エピトープ(破傷風、百日咳、ジフテリア、麻疹、ムンプス、風疹など)を疾患を駆動する外生のまたは内生遺伝子上に挿入し、そのため、患者の免疫系はそのタンパク質を不能化することを学習する。

前述の戦略からの可能性ある治療学的な利益を有しそうな疾患は、毒性のタンパク質の凝集によって引き起こされるもの、例えば致死性家族性不眠症を包含する。利し得る他の疾患は、さもなければ非毒性の内生タンパク質の病原性の過剰発現によって引き起こされるもの、および外生の病原体によって引き起こされるものを包含する。

一次的な治療学的適応は、上で言及されているもの、例えばがん、プリオン、および他の神経変性疾患の治療学、感染性疾患、ならびに予防的な医療を包含する。二次的な治療学的適応は、遅発性の遺伝子疾患を有する患者の予防的ケアを包含し得る。特に侵襲性のがんのようないくつかの疾患では、または薬物治療が疾患が完全に治癒するまで疾患症状を緩和することを助けるケースでは、現行の標準治療の医療がプライム編集と併せて用いられ得るということが予想される。下は、プライム編集因子によって挿入され得る、達成するために用いられ得る免疫エピトープの例である:

下は、免疫エピトープタグ付けのために標的遺伝子上に取り入れされ得るエピトープの追加の例である:

例8に引用された参考文献
以下の参考文献はこれら全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる。

例9－PE薬剤のインビボ送達
CRISPR/Casシステムを用いる精密なゲノム標的化テクノロジーが、最近では、遺伝子治療を包含する広い範囲の適用において調査されている。遺伝子治療におけるCas9およびCas9に基づくゲノム編集薬剤の適用の主要な限定はCas9のサイズ(＞4kb)であり、組み換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)によるその効率的な送達の足枷となる。逆転写酵素へのCas9の最近開発された融合体(「プライム編集因子」)は、存在するゲノム編集法と比べていくつもの利点を所有する新規のゲノム編集テクノロジーを表し、部位特異的な様式でいずれかの1ヌクレオチド置換を組み入れおよびヌクレオチドのいずれかの随意に定められた短い(＜～20)ストレッチを挿入または欠失する能力を包含する。そのため、この方法は先には修正をし難かったヒト病原性バリアントの編集を可能化する。プライム編集試薬の送達は、ヒト疾患を引き起こす遺伝子配列の修正を可能化し得るか、または疾患を防止する遺伝子バリアントの組み入れを許し得る。

本発明は、in vitroおよびインビボの細胞にプライム編集因子を送達するための方法を記載する。プライム編集因子は培養細胞だけにおいて開発および特徴付けられている。公知の方法はプライム編集因子をインビボで送達し得ない。rAAVまたは予めアセンブリされたリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体によってプライム編集因子を送達するための本開示の方法は、インビボの送達へのいくつかの関門を克服するであろう。例えば、プライム編集因子をコードするDNAはrAAVパッケージング限界よりも大きく、そのため、特殊な解決を要求する。1つのかかる解決は分裂インテインペアに融合された編集因子を製剤することであり、これらが2つの別個のrAAV粒子にパッケージングされる。これらは細胞に同時送達されるときに機能的な編集因子タンパク質を再構成する。プライム編集の固有の特色を説明するいくつかの他の特殊な考慮事項が記載され、第2部位ニッキング標的の最適化とプライム編集因子をレンチウイルスおよびrAAVを包含するウイルスベクターに適切にパッケージングすることとを包含する。

際立った特色はリボヌクレオタンパク質(RNP)送達製剤を用いることを包含し、プライム編集因子および近傍のニッキング標的がそれらの特異的なsgRNA/PEgRNAと予め複合体化され得る。これは可能な標的化可能な部位の範囲を増強し、DNA送達を用いた現行のデータに対して相対的に編集効率の多大な最適化を許すであろう。RNPまたはmRNA送達製剤どちらかを用いて、夫々がそれら自身のガイドRNAバリアントと複合体化するバリアントCasタンパク質が用いられ得る。これは、可能性あるニッキング座位のより多大な多様性をもまた許すであろう。そのため、いずれかの所与の適用について、より多大な効率のための最適化が達成され得るということが予想される。RNPを用いると、それは先のRNP報告に基づいて編集特異性を増大させることが予想される(Rees et al.,2017)。これはオフターゲットプライム編集を縮減するであろう。インビボまたはエクスビボの送達のためにプライム編集因子を2つのAAVベクターへと分裂するための可能性あるアーキテクチャが記載される。プライム編集因子を二元的AAVシステムにパッケージングすることは、分裂部位、再構成方法(例えばインテイン)、およびガイド発現アーキテクチャを包含するデザイン考慮事項の最適化を要求する。プライム編集因子の送達のためのウイルスおよびRNPの混合物を用いると、編集が経時的にコントロールされるであろうということが予想される。なぜなら、RNPはインビボでは結局は分解し、これはRNPがもはや供給されない後にはプライム編集をストップするであろうからである。

インビボおよびエクスビボのゲノムDNAを変改するために、プライム編集因子リボヌクレオタンパク質(RNP)、プライム編集因子ガイドRNAと共にmRNA、またはDNAは脂質ナノ粒子、rAAV、もしくはレンチウイルスにパッケージング、注射、摂取、または吸入され得る。ヒト疾患の動物モデルを確立、ヒト疾患の動物モデルにおいて治療学的および科学的仮説を試験、ならびにヒトの疾患を処置する目的のためを包含する。

インビボの該当する細胞型への送達の好適な手段が開発される場合には、プライム編集因子は、実現可能に、全ての遺伝子疾患の大きい画分(Clinvarの病原性のヒト遺伝子バリアントの～89％)を修正するために用いられ得る。血液疾患、網膜疾患、および肝臓疾患は、他の試薬の確立された送達システムを原因として、最も蓋然的な第1の適用である。AAVカプシド、他の進化したまたは操作されたウイルスベクター、および脂質ナノ粒子製剤が、本発明との組み合わせで用いられることを必要とするであろう。

ある態様において、プライム編集因子ドメインの1つ以上(例えば、napDNAbpドメインまたはRTドメイン)がインテイン配列を有して操作され得る。

例10－オフターゲット編集を同定するためのPEの使用
現行では、プライム編集因子によるオフターゲット編集を検出するための記載された方法はない(プライム編集それ自体がまだ公開されていない)。これらの方法は、研究者がプライム編集因子を用いてオフターゲット編集の可能性ある部位を同定することを許すであろう。これは、この技術が患者の遺伝子疾患を処置するために用いられる場合には重要な考慮事項であろう。

ここに記載される方法は、Casヌクレアーゼのオフターゲットを同定するためにもまた有用であり得る。これらのオフターゲットはBLESS、Guide-Seq、CIRCLE-Seq、およびDigenome-Seqを用いて先に同定されている。しかしながら、この方法はプロセスの感度および単純さにおいて有利である。

この側面の鍵の概念は、プライム編集を用いて、PEgRNAを鋳型とするアダプター配列またはプライマー結合部位を挿入して、Casヌクレアーゼまたはプライム編集因子のゲノムオフターゲット改変部位の急速な同定を可能化するという発想である。

バイアスがない様式でプライム編集オフターゲット部位を同定するための方法は公知ではない。アダプター配列がDNA結合およびニッキングと同じイベントにおいて挿入され、下流プロセシングを単純化するので、この方法はヌクレアーゼオフターゲット部位を同定する他の技術から見分けられる。

本発明は、組織培養または動物モデルにおいて、生細胞内で編集するときのオフターゲット編集部位の同定を包含する(図33を見よ)。この方法を行うためには、最終的な所望の編集因子と同一のプロトスペーサー(およびプライム編集オフターゲットを検査する場合には最終的な所望の編集因子と同一のプライマー結合部位配列)を有するが、プライム編集による逆転写後にアダプターまたはプライマー結合部位を組み入れるための必要な配列を包含するPEgRNAが生成される。インビボ編集がプライム編集因子またはRT融合ヌクレアーゼを用いて行われ、ゲノムDNAを単離する。ゲノムDNAが酵素的または機械的手段によってフラグメント化され、異なるアダプターをDNAフラグメント化の部位に付加する。PCRが用いられて、1つのアダプターからPEgRNAによって組み入れされたアダプターまで増幅する。もたらされた産物がディープ配列決定されて、全ての改変された部位を同定する。

本発明は、ゲノムDNAのin vitro改変を用いるオフターゲット編集部位の同定をもまた包含する(図33を見よ)。この方法を行うためには、精製されたプライム編集因子タンパク質と、アダプターまたはプライマー結合配列を組み入れるであろうが、さもなければ目当てのPEgRNAと同じであるPEgRNAとのRNPがアセンブリされる。このRNPは、DNAのフラグメント化およびDNA切断の部位への異なるアダプターの取り付けの前または後に、抽出されたゲノムDNAとインキュベーションされる。PCRが用いられて、フラグメント化された部位からPEによって組み入れされたアダプターまで増幅する。ディープ配列決定して改変の部位を同定する。細胞性のDNA修復はプライム編集因子によって追加される逆転写されたDNAアダプターを消去することがないであろうから、このin vitro編集法は検出の感度を増強するはずである。

これらの方法は、いずれかのプライム編集因子、または標的のカットされる部位を認識するためにガイドRNAを用いるいずれかのゲノム編集因子(ほとんどのCasヌクレアーゼ)について、オフターゲット編集を同定するために用いられ得る。

これらの方法は、ゲノム編集因子が処置への使用を考慮される全ての遺伝子疾患に適用され得る。

例11－インビボの標的タンパク質の化学物質によって誘導される二量体化を可能化するためのPEの使用
本明細書に記載のプライム編集因子は、プライム編集による低分子結合タンパク質をコードする遺伝子のゲノム取り入れによって、二量体化によって誘導される生物学的プロセス、例えば受容体シグナルを、便利な低分子薬物のコントロール下に置くためにもまた用いられ得、本明細書に記載の。本明細書に記載のプライム編集因子を用いて、低分子結合タンパク質をコードする遺伝子配列が、生細胞または患者の目当ての標的タンパク質をコードする遺伝子上に挿入され得る。この編集は単独では生理学的効果を有さないはずである。典型的には夫々が標的タンパク質のコピーに融合されている2つの薬物結合タンパク質ドメインに同時に結合し得る二量体低分子である低分子薬物の投与によって、低分子は標的タンパク質の二量体化を誘導する。それから、この標的タンパク質二量体化イベントは、生物学的シグナルイベント、例えば赤血球形成またはインスリンシグナルを誘導する。

例12－プライム編集:二本鎖DNA切断なしのヒト細胞における高度に汎用的なかつ精密な検索置換ゲノム編集
現行のゲノム編集法は、プログラム可能なヌクレアーゼを用いて二本鎖DNA切断の随伴する副産物と共に標的遺伝子を遮断、欠失、または挿入し得、塩基編集因子を用いて標的座位に4つのトランジション点変異を組み入れ組み入れ得る。しかしながら、小さい挿入、小さい欠失、および8つのトランスバージョン点変異は、集合的にはほとんどの病原性の遺伝子バリアントを表すが、ほとんどの細胞型において、効率的にかつ余分な副産物なしに修正はされ得ない。標的部位を規定することおよび所望の編集をコードすることの両方をする操作されたプライム編集ガイドRNA(PEgRNA)によってプログラムされる操作された逆転写酵素に融合された触媒的に損なわれたCas9を用いて、新たな遺伝情報を規定されたDNA部位に直接的に書き込む高度に汎用的なかつ精密なゲノム編集法、プライム編集が本明細書に記載の。ヒト細胞の175よりも多大な別物の編集を行って、プライム編集が、標的化された挿入、欠失、全ての12の可能な型の点変異、およびそれらの組み合わせを、効率的に(未ソーティングの細胞において典型的には20-60％、最高で77％)かつ低い副産物(典型的には1-10％)によって、二本鎖切断またはドナーDNA鋳型を要求することなしになし得るということを確立した。プライム編集をヒト細胞において適用して、鎌状赤血球症(HBBのA・TからT・Aのトランスバージョンを要求する)およびテイ・サックス病(HEXAの4塩基欠失を要求する)の一次的な遺伝学的原因を修正し、両方のケースにおいて、最小限の副産物によって病原性のゲノムアレルを野生型に効率的に復帰させた。これらの病原性のHBBトランスバージョンおよびHEXA挿入変異を有するヒト細胞株を生出するために、プリオン病に対する耐性を付与するG127V変異をPRNPに組み入れるために(G・CからT・Aのトランスバージョンを要求する)、ならびにHis6タグ、FLAGエピトープタグ、および伸長されたLoxP部位をヒト細胞の標的座位に効率的に挿入するためにもまた、プライム編集を用いた。プライム編集は、HDRと比べて効率および産物純度の利点、ならびに塩基編集と比較して補完的な強さおよび弱さをオファーする。3つの別物の塩基対形成イベントを要求するその検索置換機序と整合して、プライム編集は公知のCas9オフターゲット部位においてCas9よりもかなりオフターゲットDNA改変をしにくい。プライム編集はゲノム編集の範囲および能力を実質的に拡張し、原理的には、公知の病原性のヒト遺伝子バリアントの～89％を修正し得る。

実質的にいずれかの標的化された変化をいずれかの生細胞または生物のゲノムになす能力は、生命科学の長年の熱望である。ゲノム編集テクノロジーの急速な進歩にもかかわらず、疾患に関連する＞75,000の公知のヒト遺伝子バリアントの多数は¹¹¹、ほとんどの治療学的に該当する細胞においては修正または組み入れされ得ない(図38A)。CRISPR-Cas9などのプログラム可能なヌクレアーゼは二本鎖DNA切断(DSB)を作り、これは挿入および欠失の混合物(インデル)を標的部位において誘導することによって遺伝子を遮断し得る^112～114。ヌクレアーゼは、相同性非依存的プロセスによって、標的遺伝子を欠失^115,116または外因的な遺伝子を挿入^117-119するためにもまた用いられ得る。しかしながら、二本鎖DNA切断は、産物の複雑な混合物、転座¹²⁰、およびp53活性化^121,122を包含する望まれないアウトカムにもまた関連する。その上、病原性のアレルの大多数は、それらの非病原性のカウンターパートとは小さい挿入、欠失、または塩基置換が異なり、これらは修正するためにはかなりより精密な編集テクノロジーを要求する(図38A)。ヌクレアーゼによって誘導されるDSBによって刺激される相同組み換え修復(HDR)¹²³は、種々の精密なDNA変化を組み入れるために広く用いられている。しかしながら、HDRは外因的なドナーDNA修復鋳型に依拠し、典型的にはDSBの末端結合修復からの余分なインデル副産物を生成し、ほとんどの治療学的に該当する細胞型では非効率的である(T細胞およびいくつかの幹細胞は重要な例外である)^124,125。DSBによって媒介されるゲノム編集の効率および精度を増強することは有望な作業のフォーカスのままに留まっており^126～130、これらの課題は代替的な精密ゲノム編集戦略の調査を要する。

塩基編集は、哺乳動物を包含する広い種々の細胞型および生物において、DSBを要求することなしに、4つの型のトランジション変異(CからT、GからA、AからG、およびTからC)を効率的に組み入れまたは修正し得るが^128～131、現行では、8つのトランスバージョン変異(CからA、CからG、GからC、GからT、AからC、AからT、TからA、およびTからG)のいずれか、例えば鎌状赤血球症の最も普通の原因(HBB E6V)を直接的に修正するために必要とされるT・AからA・Tの変異を達成し得ない¹³²。加えて、標的の欠失、例えばテイ・サックス病を引き起こす4塩基重複(HEXA 1278+TATC)の除去¹³³、または標的化された挿入、例えば嚢胞性線維症の最も普通の原因(CFTR ΔF508)を直接的に修正するために要求される精密な3塩基挿入¹³⁴を行うためのDSBフリーの方法は報告されていない。それゆえに、それらは集合的にほとんどの公知の病原性アレルを説明するにもかかわらず、標的化されたトランスバージョン点変異、挿入、および欠失は、ほとんどの細胞型においては効率的にかつ余分な副産物なしに組み入れまたは修正することが困難である(図38A)。

二本鎖DNA切断またはドナーDNA鋳型を要求することなしに、ヒト細胞の標的座位における標的化された挿入、欠失、および全ての12の可能な塩基から塩基の変換を媒介する新たな「検索置換」ゲノム編集テクノロジー、プライム編集の開発が本明細書に記載の。当初にPE1によって例示されたプライム編集因子は、プログラム可能なニッカーゼに融合された逆転写酵素とプライム編集の伸長されたガイドRNA(PEgRNA)とを用いて、遺伝情報をPEgRNA上の伸長から標的ゲノム座位に直接的にコピーする。第2世代プライム編集因子(PE2)は、操作された逆転写酵素を用いて最小限の(典型的には＜2％)インデル形成によって編集効率を実質的に増大させ、第3世代PE3システムは第2のガイドRNAを追加して非編集鎖にニッキングし、それによって非編集鎖の置き換えを好み、約1～10％インデル形成によってヒト細胞において典型的には約20～50％まで編集効率をさらに増大させる。PE3は最適化されたCas9ヌクレアーゼによって開始されるHDRと比較してずっと少数の副産物および高いかまたは類似の効率をオファーし、現行世代の塩基編集因子と比較して補完的な強さおよび弱さをオファーする。

PE3をヒトHEK293T細胞のゲノム座位において適用して、HBB E6Vから野生型HBBへの効率的変換、HEXA 1278+TATCを野生型HEXAに復元するための挿入されたTATCの欠失、プリオン病に対する耐性を付与するG127V変異のPRNPへの組み入れ¹³⁵(G・CからT・Aのトランスバージョンを要求する)、ならびにHis6タグ(18bp)、FLAGエピトープタグ(24bp)、およびCreによって媒介される組み換えのための伸長されたLoxP部位(44bp)の標的化された挿入を達成した。プライム編集は3つの他のヒト細胞株および有糸分裂後初代マウス皮質ニューロンにおいてもまた様々な効率で首尾良かった。当初のニックおよび編集の位置付けの間の距離の高い度合のフレキシビリティーを原因として、プライム編集はCas9のPAM要件によって実質的に制約されず、原理的にはゲノム座位の大多数を標的化し得る。蓋然的には、生産的なプライム編集が生起するための3つの別物のDNA塩基対形成イベントという要件を原因として、オフターゲットプライム編集は公知のCas9オフターゲット座位におけるオフターゲットCas9編集よりもかなり稀である。精密な標的化された挿入、欠失、および全ての12の可能なクラスの点変異を広い種々のゲノム座位においてDSBまたはドナーDNA鋳型の必要なしに可能化することによって、プライム編集は多くの遺伝子バリアントの研究および修正を進歩させるポテンシャルを有する。

結果
伸長されたガイドRNAからの情報を標的DNA座位上に移入するための戦略
Cas9は、標的DNA部位にハイブリダイズするスペーサー配列を含有するガイドRNAを用いてDNAを標的化する^{112～114,136,137}。狙いは、天然のCRISPRシステムのようにDNA標的を規定するように^138,139、また、標的座位の対応するDNAヌクレオチドを置き換える新たな遺伝情報を含有するように両方でガイドRNAを操作することであった。伸長されたガイドRNAから規定されたDNA部位への遺伝情報の直接的移入、次に元々の編集されないDNAの置き換えは、原理的には、DSBまたはドナーDNA鋳型への依存性なしに、標的化されたDNA配列変化を生細胞に組み入れる一般的手段を提供し得る。この直接的情報移入を達成するために、狙いは、3'-ヒドロキシル基を暴露するように標的部位においてニッキングされたゲノムDNAを用いて、操作されたガイドRNA(これ以降では、プライム編集ガイドRNAまたはPEgRNAと言われる)の伸長から直接的に標的部位への遺伝情報の逆転写をプライムすることであった(図38A)。

いくつかの天然の可動遺伝因子によって用いられる機序に似るニッキングおよび逆転写のこれらの当初のステップは¹⁴⁰、2つの冗長性の一本鎖DNAフラップを1つの鎖上に有する分岐した中間体をもたらす:編集されないDNA配列を含有する5'フラップおよびPEgRNAからコピーされた編集された配列を含有する3'フラップである(図38B)。首尾良い編集を達成するためには、編集された3'フラップが編集されない5'フラップを置き換えるようにして、この分岐した中間体は分解されなければならない。編集された3'フラップは編集されない鎖とより少数の塩基対を作り得るので、編集されない鎖との5'フラップのハイブリダイゼーションは熱力学的に有利であることが蓋然的であるが、5'フラップはFEN1などの構造特異的エンドヌクレアーゼの好ましい基質である¹⁴¹。これは、ラギング鎖DNA合成およびロングパッチ塩基除去修復の間に生成された5'フラップを切り出す。選好的5'フラップ切除および3'フラップライゲーションは、編集されたDNA鎖の組み込みを駆動し得、1つの編集された鎖および1つの編集されない鎖を含有するヘテロ二重鎖DNAを生出するということが推論された(図38B)。

編集の永久的な組み入れは、編集された鎖から相補的なDNA鎖に情報をコピーする様式で、2つのDNA鎖間のミスマッチを分解する爾後のDNA修復から発生し得る(図38C)。DNA塩基編集の効率を最大化するために開発された類似の戦略に基づいて^131～133、二本鎖切断形成を最小化するために当初のニックの部位から十分遠くにおける非編集DNA鎖へニックを入れることは、非編集鎖を選好的に置き換えるようにDNA修復を偏らせ得るということが想定された。

in vitroおよび酵母細胞におけるプライム編集ステップの検証
Cas9のRuvCヌクレアーゼドメインによるPAM含有DNA鎖の切断後に、この鎖のPAM遠位フラグメントは、さもなければ安定なCas9:sgRNA:DNA複合体から解離し得る¹⁴³。この解放された鎖の3'端は、DNA重合をプライムするために十分にアクセス可能であり得るという仮説が立てられた。ガイドRNA操作作業^144～146およびCas9:sgRNA:DNA複合体の結晶構造^147～149は、sgRNAの5'および3'末端がCas9:sgRNA活性を廃止することなしに伸長され得るということを示唆する。2つの重大な構成要素を包含するようにsgRNAを伸長することによって、PEgRNAをデザインした:ニッキングされたDNA鎖の3'端がPEgRNAにハイブリダイズすることを許すプライマー結合部位(PBS)、およびニッキングされたDNA鎖の3'端がポリメラーゼによってRNA鋳型上を伸長されるとゲノムDNA部位に直接的にコピーされるであろう所望の編集を含有する逆転写酵素(RT)鋳型である(図38C)。

これらの仮説を、精製されたS.pyogenes Cas9タンパク質を用いてin vitroで試験した。sgRNAをどちらかの末端においてPBS配列(5から6ヌクレオチド、nt)およびRT鋳型(7から22nt)によって伸長することによって、一連のPEgRNA候補を構築した。5'伸長されたPEgRNAは標的DNAに対するCas9結合を導くということ、ならびに5'伸長されたPEgRNAおよび3'伸長されたPEgRNA両方がin vitroのCas9によって媒介される標的ニッキングと哺乳類細胞におけるDNA切断活性とを支持するということが確認された(図44A～44C)。これらの候補PEgRNAデザインを、予めニックが入った5'-Cy5標識dsDNA基質、触媒的に不活性型Cas9(dCas9)、およびモロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)逆転写酵素の市販のバリアントを用いて試験した(図44D)。全ての構成要素が存在するときには、ゲル移動度によって、蛍光標識されたDNA鎖からより長いDNA産物への効率的な変換が観察され、RT鋳型に沿った逆転写と整合した(図38D、図44D～44E)。所望の長さの産物が、5'伸長または3'伸長されたPEgRNAどちらかで形成された(図38D-38E)。dCas9の省略は、PEgRNA情報移入なしに、DNA鋳型上の逆転写酵素によって媒介されるDNA重合に由来するニックトランスレーション産物に至った(図38D)。PEgRNAが従来のsgRNAによって置き換えられたときには、DNA重合産物は観察されず、PEgRNAのPBSおよびRT鋳型構成要素の必要性を確認した(図38D)。これらの結果は、Cas9によって媒介されるDNA融解が一本鎖Rループを暴露し、これは、ニッキングされる場合には、5'伸長または3'伸長されたPEgRNAどちらかからの逆転写をプライムすることに有能であるということを実証している。

次に、ニッキングされないdsDNA基質を、専らPAM含有鎖へニックを入れるCas9ニッカーゼ(H840A変異体)によって試験した¹¹²。これらの反応では、ことによると損なわれたCas9ニッカーゼ活性を原因として、5'伸長されたPEgRNAは逆転写産物を非効率的に生成した(図44F)。しかしながら、3'伸長されたPEgRNAはロバストなCas9ニッキングおよび効率的な逆転写を可能化した(図38E)。原理的には逆転写がPEgRNAの残りのどこかで終結するポテンシャルにもかかわらず、3'伸長されたPEgRNAの使用は単一の明らかな産物のみを生成した。Cas9ニッカーゼ、RT、および3'伸長されたPEgRNAによる反応の産物のDNA配列決定は、完全なRT鋳型配列がDNA基質へと逆転写されるということを明らかにした(図44G)。これらの実験は、3'伸長されたPEgRNAが、Cas9ニッカーゼ活性を導く能力を保持しながら、新たなDNA鎖の逆転写の鋳型となり得るということを確立した。

in vitroのPEgRNAによってプログラムされる逆転写によって生ずる3'フラップの真核細胞DNA修復アウトカムを評価するために、レポータープラスミド基質に対するin vitroのPEgRNA、Cas9ニッカーゼ、およびRTを用いるDNAニッキングおよび逆転写を行い、それから、反応産物を酵母(S.cerevisiae)細胞に形質転換した(図45A)。心強いことに、プラスミドが、未成熟停止コドンを修正するT・AからA・Tのトランスバージョンをコードする3'伸長されたPEgRNAによってin vitroで編集されたときには、酵母形質転換体の37％がGFPおよびmCherryタンパク質両方を発現した(図38F、図45C)。図38Eおよび図44Fの結果と整合して、5'伸長されたPEgRNAによってin vitroで実行された編集反応は、3'伸長されたPEgRNAによるものよりも少数のGFPおよびmCherry二重陽性コロニー(9％)を生んだ(図38Fおよび図45D)。生産的な編集は、フレームシフト変異を修正するために1ヌクレオチドを挿入するか(15％の二重陽性形質転換体)または1ヌクレオチドを欠失する(29％の二重陽性形質転換体)3'伸長されたPEgRNAを用いてもまた観察された(図38Fおよび図45E～45F)。二重陽性の酵母コロニーから回復した編集されたプラスミドのDNA配列決定は、コードされるトランスバージョン編集が所望の配列位置において生起するということを確認した(図45G)。これらの結果は、真核細胞のDNA修復がプライム編集から発生する3'DNAフラップを分解して、トランスバージョン、挿入、および欠失を包含する精密なDNA編集を組み込み得るということを実証している。

プライム編集因子1(PE1)のデザイン
in vitroのおよび酵母の結果によって促されて、哺乳類細胞のゲノムDNAを編集することができる最小の数の構成要素によるプライム編集システムを、開発のために探求した。3'伸長されたPEgRNA(これ以降では単純にPEgRNAと言われる。図39A)とフレキシブルなリンカーを介した逆転写酵素へのCas9 H840Aの直接的融合体とは、機能的な2構成要素プライム編集システムを構成し得るという仮説が立てられた。HEK293T(不死化ヒト胎児腎臓)細胞を、Cas9 H840Aニッカーゼのどちらかの末端への野生型M-MLV逆転写酵素の融合体をコードする1つのプラスミドと、PEgRNAをコードする第2のプラスミドとによってトランスフェクションした。当初の試みはHEK3標的座位における検出可能なT・AからA・Tの変換には至らなかった。

しかしながら、8-15塩基へのPEgRNA上のPBSの伸長は(図39A)、HEK3標的部位における検出可能なT・AからA・Tの編集に至った(図39B)。RTがCas9ニッカーゼのC末端に融合されたプライム編集因子構築物(8～15ntの範囲であるPBS長さによって、3.7％の最大のT・AからA・Tの変換)では、N末端RT-Cas9ニッカーゼ融合体(1.3％の最大のT・AからA・Tの変換)と比較して高い効率であった(図39B;別様に規定されない限り、本願の全ての哺乳類細胞データは、セレクションまたはソーティングなしの処置された細胞集団全体の値を報告している)。これらの結果は、トランスで供給されるM-MLV RTの市販のバリアントを用いてin vitroで要求されるものと比較して、Cas9に融合された野生型M-MLV RTがヒト細胞におけるゲノム編集のための長いPBS配列を要求するということを示唆する。Cas9 H840AニッカーゼのC末端に融合されたこの第1世代野生型M-MLV逆転写酵素はPE1として指定された。

PEgRNAによって規定される4つの追加のゲノム標的部位におけるトランスバージョン点変異を精密に導入するPE1の能力(図39C)を試験した。HEK3座位における編集と類似に、これらのゲノム部位における効率はPBS長さに依存的であり、最大の編集効率は0.7-5.5％の範囲であった(図39C)。PE1からのインデルは低く、各部位の編集効率を最大化する条件下において、5つの部位について平均で0.2±0.1％であった(図46A)。PE1は、HEK3座位において、1ヌクレオチド欠失(4.0％効率)、1ヌクレオチド挿入(9.7％)、および3ヌクレオチド挿入(17％)によって例示される標的化された挿入および欠失を組み入れる能力があった(図39C)。これらの結果は、二本鎖DNA切断またはDNA鋳型を要求することなしに、標的化されたトランスバージョン、挿入、および欠失を直接的に組み入れるPE1の能力を確立する。

プライム編集因子2(PE2)のデザイン

PE1は種々の編集をHEK293T細胞のいくつかの座位において組み入れ組み入れ得るが、編集効率は一般的に低かった(典型的には≦5％)(図39C)。PE1の逆転写酵素を操作することは、プライム編集複合体の固有の立体配座制約内でDNA合成の効率を改善し得、より高いゲノム編集収量をもたらすという仮説が立てられた。酵素熱安定性^150,151、処理能力¹⁵⁰、およびDNA:RNAヘテロ二重鎖基質親和性¹⁵²を増大させる、ならびにRNaseH活性を不活性化する¹⁵³M-MLV RT変異が先に報告されている。種々の逆転写酵素変異を含有する19のPE1バリアントを構築して、それらのプライム編集効率をヒト細胞において評価した。

第1に、上昇した温度における逆転写を支持するそれらの能力について先に実験室進化から新興した一連のM-MLV RTバリアント¹⁵⁰を取り調べた。これ以降ではM3と言われるM-MLV RT上へのこれらのアミノ酸置換の3つ(D200N、L603W、およびT330P)の順次の導入は、PE1のものと比較して、HEK293T細胞の5つのゲノム座位におけるトランスバージョンおよび挿入編集効率の6.8倍の平均の増大に至った(図47A-47S)。

次に、M3との組み合わせで、鋳型:PBS複合体に対する結合、酵素処理能力、および熱安定性を増強することが先に示された追加の逆転写酵素変異¹⁵²を試験した。分析された14の追加の変異体のうち、M3変異に加えてT306KおよびW313F置換を有するバリアントは、ヒト細胞の5つのゲノム部位における6つのトランスバージョンまたは挿入編集について、M3と比較して編集効率を追加の1.3倍から3.0倍改善した(図47A～47S)。PE1アーキテクチャに組み込まれたM-MLV逆転写酵素のこの五重変異体(Cas9 H840A-M-MLV RT(D200N L603W T330P T306K W313F))はこれ以降ではPE2と言われる。

PE2は、1ヌクレオチドトランスバージョン、挿入、および欠失変異をPE1よりも実質的に高い効率で組み入れし(図39C)、より短いPBS PEgRNA配列と適合性であり(図39C)、一過性のゲノムDNA:PBS複合体に生産的に係合する増強された能力と整合する。平均で、PE2はPE1と比べてプライム編集点変異効率の1.6から5.1倍の改善に至り(図39C)、いくつかのケースでは、編集収量を最高で46倍まで劇的に改善した(図47Fおよび図47I)。PE2は標的化された挿入および欠失をPE1よりも効率的に成し遂げ、PE1によってこの挿入を組み入れる効率と比べて15倍の改善の4.5％の効率でHEK3座位における24bp FLAGエピトープタグの標的化された挿入を達成し(図47D)、PE1のものよりも2.1倍高い8.6％の効率でHEK3の1bp欠失を媒介した(図39C)。これらの結果はPE2をPE1よりも効率的なプライム編集因子として確立する。

PEgRNA特色の最適化

PEgRNAアーキテクチャおよびプライム編集効率の間の関係性をHEK293T細胞の5つのゲノム座位においてPE2によって体系的に探査した(図39C)。一般的に、より低いGC含量を有するプライム部位はより長いPBS配列を要求するが(EMX1およびRNF2。夫々40％および30％GC含量をニックの上流の最初の10ntに含有する)、より多大なGC含量を有するものはより短いPBS配列によるプライム編集を支持し(HEK4およびFANCF。夫々80％および60％GC含量をニックの上流の最初の10ntに含有する)(図39C)、PEgRNA PBSに対するニッキングされたDNA鎖のハイブリダイゼーションのためのエネルギー的要件と整合する。PBS長さまたはGC含量レベルはプライム編集効率を厳格には予測せず、DNAプライマーまたはPEgRNA伸長の二次構造などの他の因子もまた編集活性に影響を及ぼし得る。典型的な標的配列では～13ntのPBS長さから出発し、配列が、～40～60％GC含量から逸脱する場合には異なるPBS長さを調査することが推奨される。必要なときには、最適なPBS配列は経験的に決定されるはずである。

次に、PEgRNAのRT鋳型部分の性能決定要因を研究した。長さが10～20ntの範囲であるRT鋳型を有するPEgRNAを、5つのゲノム標的部位においてPE2を用いて(図39D)および31ntほども長いより長いRT鋳型によって3つのゲノム部位において(図48A～48C)体系的に評価した。PBS長さのように、RT鋳型長さもまたプライム編集効率を最大化するために変えられ得るが、一般的には、多くのRT鋳型長さ≧10nt長はより効率的なプライム編集を支持する(図39D)。いくつかの標的部位はより高い編集効率(FANCF、EMX1)を達成するためにはより長いRT鋳型(＞15nt)を好み、他の座位は短いRT鋳型(HEK3、HEK4)を好むので(図39D)、～10～16ntから出発して、PEgRNAを最適化するときには、短いおよび長いRT鋳型両方が試験されるということが推奨される。

重要なことに、sgRNA骨格の末端ヘアピンに隣接するヌクレオチドとしてCを置くRT鋳型は、一般的に、類似の長さのRT鋳型を有する他のPEgRNAと比較して低い編集効率をもたらした(図48A～48C)。Cas9に結合したsgRNAの構造に基づいて^148,149、標準的なsgRNAの3'伸長の最初のヌクレオチドとしてのCの存在は、Cas9のTyr 1356とのパイスタックおよびsgRNA A68との非標準的な塩基対をネイティブに形成するヌクレオチドG81との対形成によって、sgRNA骨格折り畳みを遮断し得るということが推量された。多くのRT鋳型長さはプライム編集を支持するので、3'伸長の最初の塩基(RT鋳型の最後の逆転写される塩基)がCではないPEgRNAを選ぶことが推奨される。

プライム編集因子3システム(PE3およびPE3b)のデザイン

PE2は遺伝情報をPEgRNAから標的座位にPE1よりも効率的に移入し得るが、細胞が1つの編集された鎖および1つの編集されない鎖によって生出されるもたらされるヘテロ二重鎖DNAを分解する様式は、編集が耐久性であるかどうかを決定する。シトシンまたはアデニン脱アミノ化の当初の産物は1つの編集されたおよび1つの非編集の鎖を含有するヘテロ二重鎖DNAであるので、塩基編集の先の開発は類似の課題に当面した。塩基編集の効率を増大させるために、Cas9 D10Aニッカーゼを用いてニックを非編集鎖に導入し、編集された鎖を鋳型として用いるDNA修復をその鎖へと導いた^129,130,142。この原理を有効利用してプライム編集効率を増強するために、細胞による非編集鎖の選好的置き換えを誘導するために、すでにPE2に存在するCas9 H840Aニッカーゼと単純なsgRNAとを用いて非編集鎖へニックを入れる類似の戦略(図40A)を試験した。編集されたDNA鎖もまたプライム編集を開始するためにニッキングされたので、種々のsgRNAによってプログラムされるニックの位置付けを非編集鎖について試験して、インデルに至る二本鎖DNA切断の生産を最小化した。

PAMの5'または3'どちらかのPEgRNAによって誘導されるニックの部位から14から116塩基に位置付けられるニックを誘導するsgRNAをスクリーニングすることによって、このPE3戦略を最初にHEK293T細胞の5つのゲノム部位において試験した。試験された5つの部位のうち4つでは、非編集鎖へニックを入れることは、インデルフリーなプライム編集産物の量を、PE2システムと比較して1.5から4.2倍、55％ほども高くまで増大させた(図40B)。最適なニッキング位置はゲノム部位に依存して変わったが、PEgRNAによって誘導されるニックからおよそ40-90bpのPAMの3'に位置取るニックは(図40Bの正の距離)、一般的には、プライム編集効率の好ましい増大(平均で41％である)を余分なインデル形成なしに生じた(試験された5つの部位の夫々において、最も高い編集効率をもたらすsgRNAでは6.8％の平均インデル)(図40B)。予想されるとおり、いくつかの部位では、PEgRNAによって誘導されるニックの40bp以内に非編集鎖ニックを置くことは、最高で22％のインデル形成の大きい増大に至った(図40B)。おそらくは、近接する両方の鎖に一緒へニックを入れることからの二本鎖切断の形成を原因とする。しかしながら、他の部位では、PEgRNAによって誘導されるニックから14bpほども近接するニッキングは5％インデルのみを生じ(図40B)、座位依存性因子が近位の二元的なニックから二本鎖DNA切断への変換をコントロールするということを示唆した。1つの試験された部位(HEK4)では、PEgRNAによって誘導されるニックから距離＞70bpに置かれるときでさえも、相補鎖ニックは利益を提供しないかまたは編集効率を越えるインデルレベル(最高で26％)に至るかどちらかであり、その部位の編集された鎖が細胞によってニッキングされるかまたは非効率的にライゲーションされる普通でない傾向と整合した。PEgRNAによって媒介されるニックからおよそ50bpの非編集鎖ニックから出発することと、インデル度数が許容されるレベルを超過する場合には代替的なニック位置付けを試験することとが推奨される。

どのようにして相補鎖ニッキングがプライム編集効率を改善するのかについてのこのモデルは(図40A)、編集された鎖のフラップ分解後にのみ非編集鎖へニックを入れることが、同時的なニックの存在を最小化し得、引き続きインデルを形成する二本鎖切断の度数を減少させるということを予測した。非編集鎖ニッキングの時間的コントロールを達成するために、元々のアレルではなく編集された鎖にマッチするスペーサー配列を有するsgRNAをデザインした。これ以降ではPE3bと言われるこの戦略を用いて、スペーサーおよび編集されないアレルの間のミスマッチは、PAM鎖上の編集イベントが生起する後までは、sgRNAによるニッキングを好まないはずである。このPE3bアプローチを、HEK293T細胞の3つのゲノム部位における5つの異なる編集によって試験し、アウトカムをPE2およびPE3システムによって達成されるものと比較した。全てのケースで、PE3bは、PE3と比較して総体的な編集効率のいずれかの明白な減少なしに、PE3と比較して実質的に低いレベルのインデルに関連した(3.5から30倍。平均で12倍低いインデルまたは0.85％である)(図40C)。よって、編集が第2のプロトスペーサー上に在ったときには、PE3bシステムは、PE2と比較して編集効率を多くの場合にはPE3のものと類似のレベルまでなお改善しながら、インデルを減少させ得た(図40C)。

一緒になって、これらの知見は、PE3システム(Cas9ニッカーゼ-最適化逆転写酵素+PEgRNA+sgRNA)が編集効率をPE2と比較して～3倍改善するということを確立した(図40B～40C)。PE3の追加のニッキング活性から、予想されるとおり、PE3はPE2よりも広い範囲のインデルによって随伴された。PE3の使用はプライム編集効率を優先するときに推奨される。インデルの最小化が重大であるときには、PE2は～10倍低いインデル度数をオファーする。組み入れされた編集を認識して非編集鎖へニックを入れるsgRNAを用いることが可能であるときには、PE3bシステムはインデル形成を多大に縮減しながらPE3様の編集レベルを達成し得る。

PE3によるプライム編集の標的化範囲および汎用性を実証するために、HEK3標的部位の+1から+8位置(PEgRNAによって誘導されるニックの3'の最初の塩基を位置+1としてカウントする)における全ての可能な1ヌクレオチド置換の組み入れを、PE3と10ヌクレオチドRT鋳型を有するPEgRNAとを用いて(図41A)調査した。集合的に、これらの24の別物の編集は全ての4つのトランジション変異および全ての8つのトランスバージョン変異をカバーし、平均で33±7.9％である(14％および48％の間の範囲である)編集効率(インデルを含有しない)で、平均で7.5±1.8％のインデルによって進む。

重要なことに、長距離RT鋳型もまたPE3による効率的なプライム編集を生じさせ得る。例えば、PE3を34nt RT鋳型と共に用いて、点変異をHEK3座位の位置+12、+14、+17、+20、+23、+24、+26、+30、および+33(PEgRNAによって誘導されるニックから12から33塩基)に組み入れし、平均で36±8.7％の効率および8.6±2.0％のインデルを有した(図41B)。他の座位における+10位置以降の編集は試みなかったが、3つの代替的な部位における他のRT鋳型≧30ntもまた効率的編集を支持する(図48A-C)。長いRT鋳型の実行可能性は、当初のニック部位から何ダースものヌクレオチドについて効率的なプライム編集を可能化した。どちらかのDNA鎖上のNGG PAMは、効率的なプライム編集を支持する編集およびPAMの間の最大距離よりもずっと少ない平均で～8bp毎に生起するので、他の精密ゲノム編集法とは対照的に、プライム編集は近傍のPAM配列の利用可能性によって実質的に制約されない^125,142,154。RNA二次構造とプライム編集効率との間の推定される関係性から、ロングレンジ編集のためのPEgRNAをデザインするときには、種々の長さおよび必要な場合には配列組成(例えば、同義コドン)のRT鋳型を試験して編集効率を最適化することが賢明である。

トランジションおよびトランスバージョン点変異を導入するためのPE3システムの範囲および限定をさらに試験するために、全ての12の可能な方の点変異をカバーする72の追加の編集を6つの追加のゲノム標的部位(図41C～41H)について試験した。総体的に、インデルフリーな編集効率は平均で25±14％であり、インデル形成は平均で8.3±7.5％であった。PEgRNA RT鋳型はPAM配列を包含したので、プライム編集はPAM配列の変化を誘導し得た。これらのケースでは、より高い編集効率(平均で39±9.7％である)およびより低いインデル生成(平均で5.0±2.9％である)が観察された(図41A～41K。位置+5または+6における点変異)。PAM編集の効率のこの増大およびインデル形成の減少は、Cas9ニッカーゼが相補鎖の修復に先行して編集された鎖に再結合およびニッキングすることの不能から発生し得る。プライム編集は編集効率の明らかな損失なしに組み合わせ編集を支持するので、可能なときには、他の所望の変化に加えてPAMを編集することが推奨される。

次に、14の標的化された小さい挿入および14の標的化された小さい欠失を、7つのゲノム部位において、PE3を用いて(図41I)行った。標的化された1bp挿入は32±9.8％の平均効率で進み、3bp挿入は39±16％の平均効率で組み入れされた。標的化された1bpおよび3bp欠失もまた効率的であり、夫々29±14％および32±11％の平均収量で進んだ。インデル生成(標的化された挿入または欠失以外)は平均で6.8±5.4％であった。位置+1および+6の間に導入された挿入および欠失はPAMの位置または構造を変改するので、PAMを編集する点変異と類似に、Cas9ニッカーゼが相補鎖の修復に先行して編集された鎖に再結合およびニッキングすることの不能を原因として、この範囲の挿入および欠失編集は典型的にはより効率的であるということが推量された。

PE3は、HEK3部位における5bpから80bpのより大きい精密な欠失を媒介するその能力についてもまた試験された(図41J)。13nt PBSと夫々29、24、または19bpの相同性を標的座位に対して含有するRT鋳型とを用いたときには、非常に高い編集効率(52から78％)が5、10、および15bp欠失について観察された。26nt RT鋳型を用いることは、72±4.2％の効率で25bpというより大きい欠失を支持し、20nt RT鋳型は52±3.8％の効率で80bp欠失を可能化した。これらの標的化された欠失は平均で11±4.8％であるインデル度数によって随伴された(図41J)。

最後に、3つのゲノム部位における挿入および欠失、挿入および点変異、欠失および点変異、または2つの点変異からなる同じ標的座位における複数の編集の12の組み合わせを媒介するPE3の能力を試験した。これらの組み合わせ編集は非常に効率的であり、6.4％のインデルによって平均で55％の標的編集であり(図41K)、精密な挿入、欠失、および点変異の組み合わせを個々の標的部位において高い効率および低いインデル度数でなすプライム編集の能力を実証した。

一緒になって、図41A-41Kの例は7つのヒトゲノム座位における156の別物のトランジション、トランスバージョン、挿入、欠失、および組み合わせ編集を表す。これらの知見はプライム編集の汎用性、精度、および標的化フレキシビリティーを確立する。

塩基編集と比較したプライム編集

現行世代のシチジン塩基編集因子(CBE)およびアデニン塩基編集因子(ABE)は、C・GからT・Aのトランジション変異およびA・TからG・Cのトランジション変異を高い効率および低いインデルで組み入れ組み入れ得る^129,130,142。塩基編集の適用は、欲されないバイスタンダー編集を生じさせる塩基編集活性窓(典型的には～5bpの幅)上の複数のシチジンまたはアデニン塩基の存在によって^{129,130,142,155}、または標的ヌクレオチドからおよそ15±2ntに位置取るPAMの不在によって^142,156限定され得る。プライム編集は、バイスタンダー編集なしの、または好適に位置取ったPAMの欠如が標的ヌクレオチドをCBEまたはABE活性窓上に好ましく位置取らせることを不可能にするときの、トランジション変異の精密な組み入れにとって特に有用であり得るということが予期された。

プライム編集およびシトシン塩基編集を、複数の標的シチジンを標準的な塩基編集窓(プロトスペーサー位置4～8。PAMを位置21～23としてカウントする)上に含有する3つのゲノム座位を編集することによって比較した。ニッカーゼ活性なしの(BE2max)もしくはニッカーゼ活性ありの(BE4max)最適化されたCBE¹⁵⁷を用いるか、または類縁のPE2およびPE3プライム編集システムを用いた。3つの部位の塩基編集窓上の9つのトータルの標的シトシンのうち、BE4maxは、PE3よりも2.2倍高い平均のトータルのC・GからT・Aの変換を塩基編集窓の中心の塩基(プロトスペーサー位置5～7。図42A)について生んだ。同様に、非ニッキングBE2maxはこれらの良く位置取った塩基においてPE2に平均で1.4倍優った(図42A)。しかしながら、塩基編集窓の中心以外のシトシンについて、PE3はBE4maxに2.7倍優り、PE2はBE2maxに2.0倍優った(PE3の40±17％対BE4maxの15±18％、およびPE2の22±11％対BE2maxの11±13％の平均編集)。総体的に、PE2のインデル度数は非常に低く(平均で0.86±0.47％であった)、PE3では、BE4maxのものに類似かまたはそれよりも控えめに高かった(BE4max範囲:2.5％から14％;PE3範囲:2.5％から21％)(図42B)。

精密なC・GからT・Aの編集の組み入れ(いずれかのバイスタンダー編集なし)について塩基編集の効率をプライム編集と比較したときには、プライム編集の効率は上の部位において塩基編集のものを多大に超過した。これらは、ほとんどのゲノムDNA部位のように、複数のシトシンを～5bp塩基編集窓上に含有する(図42C)。シトシンをプロトスペーサー位置C5、C6、およびC7に含有するEMX1などのこれらの部位では、BE4maxは、バイスタンダー編集なしの単一の標的塩基対変換のみを含有する少数の産物を生成した。対照的に、この部位におけるプライム編集は、C・GからT・Aの編集をいずれかの位置または位置の組み合わせ(C5、C6、C7、C5+C6、C6+C7、C5+C7、またはC5+C6+C7)において選択的に組み入れるために用いられ得た(図42C)。全ての精密な1塩基または2塩基編集(つまり、いずれかの他の近傍塩基を改変しない編集)は、PE3またはPE2では夫々BE4maxまたはBE2よりもかなり効率的であったが、3塩基のC・GからT・Aの編集はBE4maxでより効率的であり(図42C)、活性窓上の全ての標的塩基を編集する塩基編集因子の傾向を反映した。一緒にすると、これらの結果は、シトシン塩基編集因子は最適に位置取った標的塩基においてPE2またはPE3よりも高いレベルの編集をもたらし得るが、プライム編集は非最適に位置取った標的塩基において塩基編集に優り得、複数の編集可能な塩基ではかなり高い精度で編集し得るということを実証している。

最適化された非ニッキングABE(Cas9ニッカーゼの代わりにdCas9によるABEmax¹⁵²。これ以降ではABEdmaxと言われる)対PE2によるおよび最適化されたニッキングアデニン塩基編集因子ABEmax対PE3によるA・TからG・Cの編集を2つのゲノム座位において比較した。2つの標的アデニンを塩基編集窓上に含有する部位(HEK3)では、ABEはA5の変換についてPE2またはPE3よりも効率的であったが、PE3はABEmax編集窓の縁部に在るA8の変換についてより効率的であった(図42D)。単一のアデニンのみが変換される精密編集の効率を比較するときには、PE3はA5およびA8両方においてABEmaxに優った(図42E)。総体的には、ABEはプライム編集因子よりもずっと少数のインデルをHEK3において生じた(ABEdmaxの0.19±0.02％対PE2の1.5±0.46％、およびABEmaxの0.53±0.16％対PE3の11±2.3％、図42F)。単一のAのみが塩基編集窓上に存在するFANCFにおいては、ABE2およびABEmaxはトータルの標的塩基対変換がそれらのプライム編集カウンターパートに1.8から2.9倍優り、塩基編集およびプライム編集両方からの実質的に全ての編集された産物は精密な編集のみを含有した(図42D～42E)。HEK3部位のように、ABEはFANCF部位においてずっと少数のインデルを生じた(図42F)。

集合的に、これらの結果は、標的化されたトランジション変異を作ることについて、塩基編集およびプライム編集が補完的な強さおよび弱さをオファーするということを指示する。単一の標的ヌクレオチドが塩基編集窓上に存在するケースでは、またはバイスタンダー編集が許容されるときには、現行の塩基編集因子は典型的にはプライム編集因子よりも効率的であり、少数のインデルをもたらす。複数のシトシンまたはアデニンが存在しかつバイスタンダー編集が望ましくないときには、または標的塩基が利用可能なPAMに対して相対的に塩基編集にとって不良に位置取るときには、プライム編集因子は実質的な利点をオファーする。

オフターゲットプライム編集

生産的な編集をもたらすためには、プライム編集は、Cas9ドメインが結合するための相補的な標的座位:PEgRNAスペーサー、PEgRNAによってプライムされる逆転写が開始するための標的座位:PEgRNA PBS相補性、およびフラップ分解のための標的座位:逆転写酵素産物相補性を要求する。これらの3つの別物のDNAハイブリダイゼーション要件は、他のゲノム編集法のものと比較してオフターゲットプライム編集を最小化し得るという仮説が立てられた。この可能性を試験するために、HEK293T細胞を、PE3またはPE2と4つのオンターゲットゲノム座位を標的化するようにデザインされたトータルで16のPEgRNAとによって、Cas9と同じプロトスペーサーを標的化する4つの対応するsgRNAとによって、またはCas9と同じ16のPEgRNAとによって処置した。夫々が、Cas9および対応するオンターゲットsgRNAがHEK293T細胞において実質的なオフターゲットDNA改変を引き起こすことが公知である少なくとも4つの良く特徴付けられたオフターゲット部位を有するので^118,159、これらの4つの標的座位が選ばれた。処置後に、各オンターゲットスペーサーにとっての4つのオンターゲット座位および上位4つの公知のCas9オフターゲット部位をトータルで16のオフターゲット部位について配列決定した(表1)。

先の研究と整合して¹¹⁸、Cas9および4つの標的sgRNAは、先に報告されたオフターゲット座位の全ての16を改変した(図42G)。HEK3標的座位について、4つのオフターゲット部位におけるCas9オフターゲット改変効率は平均で16％であった。Cas9およびHEK4を標的化するsgRNAは、4つの試験された公知のオフターゲット部位の平均で60％の改変をもたらした。同様に、EMX1およびFANCFのオフターゲット部位は、Cas9:sgRNAによって夫々48％および4.3％の平均度数で改変された(図42G)。sgRNAと比較して、PEgRNAはCas9ヌクレアーゼと共にオンターゲット部位を平均して類似の(1から1.5倍低い)効率で改変するが、PEgRNAはCas9ヌクレアーゼと共にオフターゲット部位をsgRNAよりも～4倍低い平均効率で改変するということが注意された。

著しくは、これらの4つの標的スペーサーを含有する同じ16の試験されたPEgRNAによるPE3またはPE2はかなり低いオフターゲット編集をもたらした(図42H)。Cas9+sgRNAによるオフターゲット編集を経過することが公知の16の部位のうち、PE3+PEgRNAまたはPE2+PEgRNAは16のオフターゲット部位のうち3つのみにおいて検出可能なオフターゲットプライム編集をもたらし、16のうち1つのみがオフターゲット編集効率≧1％を示した(図42H)。これらの16の公知のCas9オフターゲット部位におけるHEK3、HEK4、EMX1、およびFANCFを標的化するPEgRNAの平均オフターゲットプライム編集は、夫々＜0.1％、＜2.2±5.2％、＜0.1％、および＜0.13±0.11％であった(図42H)。注意すべきことに、Cas9+PEgRNA1が97％効率で編集するHEK4オフターゲット3部位では、PE2+PEgRNA1は同じスペーサー配列を共有するにもかかわらず0.7％オフターゲット編集のみをもたらし、Cas9編集と比較してプライム編集に要求される2つの追加のDNAハイブリダイゼーションイベントが、どのようにしてオフターゲット編集を多大に縮減し得るのかということを実証する。一緒にすると、これらの結果は、PE3およびPEgRNAが、Cas9および同じプロトスペーサーを標的化するsgRNAよりもヒト細胞におけるかなり低いオフターゲットDNA編集を誘導するということを示唆する。

3'伸長されたPEgRNAの逆転写は原理的にはガイドRNA骨格上へと進み得る。もたらされる3'フラップが、編集されないDNA鎖とのその3'端における相補性の欠如にもかかわらず、標的座位に組み込まれる場合には、アウトカムはPEgRNA骨格ヌクレオチドの挿入であり、これはインデル度数に寄与する。我々は、HEK293T細胞の4つの座位における66のPE3によって媒介される編集実験からの配列決定データを分析し、いずれかの数のPEgRNA骨格ヌクレオチドの平均で1.7±1.5％のトータルの挿入である低い度数で、PEgRNA骨格挿入を観察した(図56A～56D)。Cas9ドメイン結合を原因とする逆転写酵素にとってのガイドRNA骨格のアクセス不可能性と、PEgRNA骨格逆転写からもたらされる3'フラップのミスマッチの3'端のフラップ分解の間の細胞性の切除とは、PEgRNA骨格ヌクレオチドを組み込む産物を最小化するということが推量される。かかるイベントは稀であるが、PEgRNA骨格組み込みを最小化するPEgRNAまたはプライム編集因子タンパク質を操作するための将来の作業は、インデル度数をさらに減少させ得る。

デアミナーゼはいくつかの塩基編集因子ではCas9非依存的様式で作用し得、低レベルだが広範囲のオフターゲットDNA編集を(ABEではなく)第1世代CBEにおいて^160～162、ならびにオフターゲットRNA編集を第1世代CBEおよびABEにおいてもたらすが^163～165、操作されたデアミナーゼによるより新たなCBEおよびABEバリアントはCas9非依存的なオフターゲットDNAおよびRNA編集を多大に縮減する^163～165。プライム編集因子はデアミナーゼなどの塩基修飾酵素を欠き、よって、Cas9非依存的様式でDNAまたはRNA塩基を改変する内在的能力を有さない。

原理的には、プライム編集因子の逆転写酵素ドメインは適切にプライムされたRNAまたはDNA鋳型を細胞内でプロセシングし得るが、レトロトランスポゾン、例えばLINE-1ファミリー¹⁶⁶、内生レトロウイルス^167,168、およびヒトテロメラーゼのものは全て、活性な内生ヒト逆転写酵素を提供するということが注意された。ヒト細胞におけるそれらの天然の存在は、逆転写酵素活性それ自体は実質的に毒性ではないということを示唆する。実に、dCas9、Cas9 H840Aニッカーゼ、または逆転写酵素を不活性化するR110S+K103L変異を有するPE2(PE2-dRT)を発現する対照のものと比較して、HEK293T細胞生存性のPE3依存的な違いは観察されなかった¹⁶⁹(図49A～49B)。

上のデータおよび分析にもかかわらず、オフターゲットプライム編集をバイアスがないゲノムワイドな様式で評価するために、およびプライム編集因子またはプライム編集中間体の逆転写酵素バリアントが細胞に影響し得る程度を特徴付けるために、追加の研究が必要とされる。

ヒト細胞の病原性のトランスバージョン、挿入、および欠失変異をプライム編集する

遺伝子疾患を引き起こすトランスバージョン、小さい挿入、および小さい欠失変異をヒト細胞に直接的に組み入れまたは修正するPE3の能力を試験した。鎌状赤血球症は最も普通にはHBBのA・TからT・Aのトランスバージョン変異によって引き起こされ、ベータグロビンのGlu6→Valの変異をもたらす。Cas9ヌクレアーゼとHDRのためのドナーDNA鋳型とによるエクスビボの造血幹細胞の処置、次に編集された細胞の濃縮、移植、および定着は、鎌状赤血球症の処置のための有望な可能性ある戦略である¹⁷⁰。しかしながら、このアプローチは、正しく編集されたHBBアレルに加えてなお多くのインデル含有副産物を生成する^170～171。塩基編集因子は一般的にはずっと少数のインデルを生ずるが、それらはHBBの正常配列を直接的に復元するために必要とされるT・AからA・Tのトランスバージョン変異を現行ではなし得ない。

PE3を用いて、44％の効率および4.8％インデルでHEK293T細胞にHBB E6V変異を組み入れした(図43A)。PE3処置された細胞の混合物から、我々はHBB E6Vアレルについてホモ接合(三倍体)である6つのHEK293T細胞株を単離し(図53A～53D)、プライム編集が病原性の変異を有するヒト細胞株を生成する能力を実証した。HBB E6Vアレルを野生型HBBに修正するために、我々は、HBB E6V変異を野生型HBBに直接的に復帰させるようにプログラムされたPE3およびPEgRNAによってホモ接合HBB E6V HEK293T細胞を処置した。トータルで、14のPEgRNAデザインを試験した。3日後に、DNA配列決定は、全ての14のPEgRNAがPE3と組み合わせられたときに、HBB E6Vから野生型HBBへの効率的な修正と(インデルなしの≧26％野生型HBB)平均で2.8±0.70％であるインデルレベルとを与えるということを明らかにした(図50A)。最も良好なPEgRNAはHBB E6Vから野生型への52％修正を2.4％インデルでもたらした(図43A)。PEgRNAによって認識されるPAMを改変するサイレントな変異の導入は、編集効率および産物純度を1.4％インデルによる58％修正まで控えめに改善した(図43A)。これらの結果は、プライム編集がヒト細胞株の病原性のトランスバージョン点変異を高い効率および最小限の副産物によって組み入れおよび修正し得るということを確立する。

テイ・サックス病は最も多くの場合にはHEXA遺伝子上への4bp挿入(HEXA 1278+TATC)によって引き起こされる¹³⁶。PE3を用いて、この4bp挿入をHEK293T細胞に31％の効率および0.8％のインデルで組み入れし(図43B)、HEXA 1278+TATCアレルについてホモ接合である2つのHEK293T細胞株を単離した(図53A-53D)。これらの細胞を用いて、43のPEgRNAおよび3つのニッキングsgRNAを、PE3またはPE3bシステムによって、HEXAの病原性の挿入の修正について試験した(図50B)。野生型アレルへの完璧な復帰によるか、またはPAMを遮断しかつサイレントな変異を組み入れるシフトした4bp欠失によるかどちらかである。試験された43のPEgRNAのうち19は≧20％編集をもたらした。PE3またはPE3bおよび最も良好なPEgRNAによる野生型HEXAへの完璧な修正は類似の平均効率で進んだが(PE3の30％対PE3bの33％)、PE3bシステムは5.3倍少数のインデル産物によって随伴された(PE3の1.7％対PE3bの0.32％)(図43Bおよび図50B)。これらの知見は、哺乳類細胞の病原性のアレルを効率的にかつ最小の副産物によって組み入れまたは修正する精密な小さい挿入および欠失をなすプライム編集の能力を実証する。

最後に、ヒトプリオンタンパク質(PrP)をコードする遺伝子PRNP上への防護性のSNPの組み入れを試験した。PrPミスフォールディングは進行性のかつ致死的な神経変性プリオン病を引き起こし、これはPRNP遺伝子上の受け継がれた優性変異によってまたはミスフォールディングしたPrPに対する暴露によって自発的に発生し得る¹⁷²。天然に存在するPRNP G127V変異体アレルはヒト¹³⁸およびマウス¹⁷³においてプリオン病に対する耐性を付与する。PE3を用いてG127VをHEK293T細胞のヒトPRNPアレルに組み入れした。これはG・CからT・Aのトランスバージョンを要求する。4つのPEgRNAおよび3つのニッキングsgRNAをPE3システムによって評価した。最も有効なPE3およびPEgRNAに対する3日の暴露後に、DNA配列決定は、G127V変異を組み入れる53±11％の効率と1.7±0.7％のインデルレベルとを明らかにした(図43C)。一緒にすると、これらの結果は、プライム編集がヒト細胞においてトランスバージョン、挿入、または欠失変異を組み入れまたは修正する能力を確立する。これらは、疾患に対する耐性を効率的にかつ最小の副産物によって引き起こすかまたは付与する。

種々のヒト細胞株および初代マウスニューロンのプライム編集

次に、プライム編集を、3つの追加のヒト細胞株の内生部位を編集するその能力について試験した。K562(白血病骨髄)細胞では、PE3を用いて、HEK3、EMX1、およびFANCF部位のトランスバージョン編集、ならびにHEK3における6xHisタグの18bp挿入を行った。15-30％の平均編集効率がこれらの4つのPE3によって媒介される編集の夫々について観察され、インデルは平均で0.85～2.2％であった(図43A)。U2OS(骨肉腫)細胞では、HEK3およびFANCFのトランスバージョン変異、ならびにHEK3への3bp挿入および6xHisタグ挿入を、インデル形成を10から76倍超過する7.9-22％の編集効率によって組み入れした(図43A)。最後に、HeLa(子宮頸がん)細胞では、HEK3への3bp挿入を12％平均効率および1.3％インデルによって行った(図43A)。集合的に、これらのデータはHEK293T細胞以外の複数の細胞株がプライム編集を支持するということを指示しているが、編集効率は細胞型によって変わり、一般的にはHEK293T細胞よりも効率的ではない。編集:インデル比は、全ての試験されたヒト細胞株において高いままに留まった。

プライム編集が有糸分裂後の終末分化した初代細胞において可能であるかどうかを決定するために、E18.5マウスから収穫された初代皮質ニューロンを二元的な分裂PE3レンチウイルス送達システムによって形質導入した。これにおいては、分裂インテインスプライシング²⁰³が、夫々が別個のウイルスから送達されるN末端およびC末端半分からPE2タンパク質を再構成する。編集を有糸分裂後ニューロンに制限するために、成熟したニューロンに高度に特異的であるヒトシナプシンプロモーター²⁰⁴を用いて両方のPE2タンパク質構成要素の発現を駆動した。GFPを自己切断P2Aペプチド²⁰⁵を介してPE2のN末端半分に融合した。ニューロンからの核を二元的なウイルス形質導入の2週後に単離し、直接的に配列決定するかまたは配列決定前にGFP発現についてソーティングした。ソーティングされた核において0.58±0.14％の平均インデルによってDNMT1座位におけるトランスバージョンを組み入れるための7.1±1.2％の平均プライム編集(図43D)が観察された。同じ分裂インテインの二元的レンチウイルスシステムにおけるCas9ヌクレアーゼは、ソーティングされた皮質ニューロン核において31±5.5％のインデルをもたらした(図43D)。これらのデータは、有糸分裂後の終末分化した初代細胞がプライム編集を支持し得るということを指示し、それゆえにプライム編集が細胞複製を要求しないということを確立する。

Cas9によって開始されるHDRと比較したプライム編集

PE3の性能を、HDRを支持する有糸分裂細胞株において¹²⁸、最適化されたCas9によって開始されるHDR^128,125のものと比較した。HEK293T、HeLa、K562、およびU2OS細胞を、種々のトランスバージョンおよび挿入編集を組み入れるようにデザインされたCas9ヌクレアーゼ、sgRNA、およびssDNAドナーオリゴヌクレオチド鋳型によって処置した(図43E-43Gおよび図51A-51F)。Cas9によって開始されるHDRは、全てのケースにおいて、二本鎖切断を引き起こす処置から予想されるとおりずっと高いレベルの副産物(支配的にはインデル)によって、所望の編集を首尾良く組み入れした。PE3をHEK293T細胞に用いて、HBB E6V組み入れおよび修正は夫々42％および58％の平均編集効率で2.6％および1.4％の平均インデルによって進んだ(図43Eおよび図43G)。対照的に、Cas9ヌクレアーゼおよびHDR鋳型による同じ編集は、5.2％および6.7％の平均編集効率を79％および51％の平均インデル度数によってもたらした(図43Eおよび図43G)。類似に、PE3はPRNP G127Vを53％の効率および1.7％インデルで組み入れしたが、Cas9によって開始されるHDRはこの変異を6.9％の効率および53％インデルで組み入れした(図43Eおよび図43G)。それゆえに、HBB E6V組み入れ、HBB E6V修正、およびPRNP G127V組み入れの編集:インデルの比は、Cas9によって開始されるHDRよりもPE3では平均で270倍高かった。

HEK293T以外のヒト細胞株におけるPE3およびHDRの間の比較は、より低いPE3編集効率でだが、類似の結果を示した。例えば、K562細胞では、HEK3上へのPE3によって媒介される3bp挿入は、Cas9によって開始されるHDRの17％編集および72％インデルと比較して25％の効率および2.8％のインデル、PE3を好む40倍の編集:インデル率という利点によって進んだ(図43F～43G)。U2OS細胞では、PE3はこの3bp挿入を22％効率および2.2％インデルで行い、Cas9によって開始されるHDRは、74％のインデルによる15％の編集、49倍低い編集:インデル比をもたらした(図43F-43G)。HeLa細胞では、Cas9によって開始されるHDRの3.0％の編集および69％のインデルに対して、PE3はこの挿入を12％の効率および1.3％のインデル、210倍の編集:インデル比の違いによってなした(図43F～43G)。集合的に、これらのデータは、HDRが、典型的には、試験された4つの細胞株においてPE3よりも低いかまたは類似の編集効率およびずっと高いインデルをもたらすということを指示した(図51A～51F)。

考察および将来の方向

1ヌクレオチド精度でDNA配列を挿入する能力は、特に有能なプライム編集能力である。例えば、PE3を用いて、HEK293T細胞のHEK3座位にHis₆タグ(18bp、65％平均効率)、FLAGエピトープタグ(24bp、18％平均効率)、およびCreリコンビナーゼのネイティブな基質である伸長されたLoxP部位(44bp、23％平均効率)を精密に挿入した。平均インデルはこれらの例では3.0％および5.9％の間の範囲であった(図43H)。多くのバイオテクノロジー、合成生物学、および治療学的適用が、新たなDNA配列を生細胞の目当ての標的部位に効率的にかつ精密に導入する能力から発生することが想定される。

集合的に、本明細書に記載のプライム編集実験は、最高で44bpの18の挿入、最高で80bpの22の欠失、77のトランスバージョンを包含する113の点変異、および18の組み合わせ編集を、ヒトおよびマウスゲノムの12の内生座位において、PAMのスタートの3bp上流から29bp下流の範囲である位置付けにおいて、あからさまな二本鎖DNA切断を作ることなしに組み入れした。これらの結果はプライム編集を著しく汎用的なゲノム編集法として確立する。ClinVarの挿入、欠失、インデル、および重複の圧倒的多数(85-99％)は≦30bpであるので(図52A～52D)、原理的には、プライム編集はClinVarの75,122の現行で公知の病原性のヒト遺伝子バリアントの最高で～89％を修正し得(図38Aのトランジション、トランスバージョン、挿入、欠失、インデル、および重複)、コピー数獲得または損失によって引き起こされる疾患を改善する追加のポテンシャルを有する。

重要なことに、いずれかの所望の編集について、プライム編集のフレキシビリティーは、PEgRNAによって誘導されるニックの位置付け、sgRNAによって誘導される第2のニックの位置付け、PBS長さ、RT鋳型長さ、およびどの鎖が最初に編集されるかの多くの可能な選択肢を、本願において鋭意実証されるとおりオファーする。他の精密ゲノム編集法で典型的に利用可能なより限定されたオプション^125,142,154とは対照をなすこのフレキシビリティーは、編集効率、産物純度、DNA特異性、または他のパラメータが、所与の適用の必要に適するように最適化されることを許す。図50A～50Bに示されているとおりであり、これらにおいては、ある範囲のプライム編集戦略をカバーする14および43のPEgRNAを試験することが、夫々病原性のHBBおよびHEXAアレルの修正を最適化した。

かなりの追加の研究が、プライム編集をさらに理解および改善するために必要とされる。プライム編集因子システムの追加の改変が、有糸分裂後細胞などの他の細胞型を包含するようにそれらの適合性を拡張するために要求され得る。プライム編集をウイルス的および非ウイルス的なin vitroおよびインビボ送達戦略とインターフェース接続することが、遺伝子疾患の研究および処置を包含する広い範囲の適用を可能化するプライム編集のポテンシャルを十分に調査するために必要とされる。しかしながら、二本鎖切断またはHDRを要求することなしに、哺乳類細胞のゲノム上の高度に精密な標的化されたトランジション、トランスバージョン、小さい挿入、および小さい欠失を可能化することによって、プライム編集は、ゲノム編集の範囲を実質的に拡張する新たな「検索置換」能力を提供する。

方法
一般的な方法

別様に記されない限り、DNA増幅はPhusion U Green Multiplex PCRマスターミックス(ThermoFisher Scientific)またはQ5 Hot Start高忠実性2×マスターミックス(New England BioLabs)を用いるPCRによって行った。Cy5標識DNAオリゴヌクレオチド、dCas9タンパク質、およびCas9 H840Aタンパク質を包含するDNAオリゴヌクレオチドはIntegrated DNA Technologiesから得た。酵母レポータープラスミドは先に記載されたプラスミド⁶⁴に由来し、Gibsonアセンブリ法によってクローニングされた。本願において用いられる全ての哺乳類編集因子プラスミドは先に記載されているとおりUSERクローニング法を用いてアセンブリされた¹⁷⁵。sgRNAを発現するプラスミドは、BsmBI消化されたアクセプターベクター上へのアニーリングされたオリゴヌクレオチドのライゲーションによって構築した。PEgRNAを発現するプラスミドはGibsonアセンブリまたはゴールデンゲートアセンブリによってカスタムのアクセプタープラスミドを用いて構築した(補足の「ゴールデンゲートアセンブリ」概説を見よ)。本願において用いられるsgRNAおよびPEgRNA構築物の配列は表2A-2Cおよび表3A-3Rに列記されている。哺乳類細胞実験のための全てのベクターはPlasmid Plusミニプレップキット(Qiagen)またはPureYieldプラスミドミニプレップキット(Promega)を用いて精製した。これらはエンドトキシン除去ステップを包含する。生きた動物を用いる全ての実験はBroad Institute動物実験委員会によって認可された。野生型C57BL/6マウスはCharles Riverから得た(#027)。

in vitroの生化学アッセイ

PEgRNAおよびsgRNAは、HiScribe T7in vitro転写キット(New England Biolabs)を用いて、T7プロモーター配列を含有するPCR増幅された鋳型からin vitro転写した。RNAを変性尿素PAGEによって精製し、使用に先行して分析ゲルによって品質確認した。5'-Cy5標識DNA二重鎖基質は、ニッキングされていない基質には2つのオリゴヌクレオチド(Cy5-AVA024およびAVA025;1:1.1比)または予めニックが入った基質には3つのオリゴヌクレオチド(Cy5-AVA023、AVA025、およびAVA026;1:1.1:1.1)を用いて、95℃への3分に渡る加熱、次に室温への低速の冷却によってアニーリングした(表2A～2C)。Cas9切断および逆転写反応はdNTPを足された1×切断緩衝液中で実行した²⁰⁵(20mM HEPES-K、pH7.5;100mM KCl;5％グリセロール;0.2mM EDTA、pH8.0;3mM MgCl2;0.5mM dNTPミックス;5mM DTT)。dCas9またはCas9 H840A(最終5μM)およびsgRNAまたはPEgRNA(最終5μM)を、二重鎖DNA基質(最終400nM)の追加、適用可能なときには次に開示されていないM-MLV RTバリアントSuperscript III逆転写酵素(ThermoFisher Scientific)の追加に先立って、10分に渡って5μL反応混合物中で室温においてプレインキュベーションした。反応を37℃で1時間に渡って実行し、それから水によって10μLの体積まで希釈し、0.2μLのプロテイナーゼK溶液(20mg/mL、ThermoFisher Scientific)によって処置し、室温で30分に渡ってインキュベーションした。10分の95℃における熱不活性化後に、反応産物を2×ホルムアミドゲルローディング緩衝液(90％ホルムアミド;10％グリセロール;0.01％ブロモフェノールブルー)と組み合わせ、95℃で5分に渡って変性し、変性尿素-PAGEゲル(15％TBE-尿素、55℃、200V)によって分離した。DNA産物はTyphoon FLA 7000バイオ分子イメージャーを用いてCy5蛍光シグナルによって視覚化した。

電気泳動移動度シフトアッセイを、プレインキュベーションされたdCas9:sgRNAまたはdCas9:PEgRNA複合体(最終5nMおよび1μMの間の濃度範囲)およびCy5標識された二重鎖DNA(Cy5-AVA024およびAVA025;最終20nM)を用いて、1×結合緩衝液(1×切断緩衝液+10μg/mLヘパリン)中で実行した。37℃における15分のインキュベーション後に、サンプルをネイティブPAGEゲル(10％TBE)によって分析し、Cy5蛍光についてイメージングした。

逆転写産物のDNA配列決定のために、蛍光バンドを尿素-PAGEゲルから切除、精製し、それから、ターミナルトランスフェラーゼ(TdT;New England Biolabs)によってdGTPまたはdATPの存在下において製造者のプロトコールに従って3'テーリングした。テーリングされたDNA産物を結合緩衝液(40％塩化グアニジニウム飽和水溶液+60％イソプロパノール)によって10倍希釈し、QIAquickスピンカラム(Qiagen)によって精製し、それから、プライマーAVA134(Aテーリングされた産物)またはAVA135(Gテーリングされた産物)を用いるKlenowフラグメント(New England Biolabs)によるプライマー伸長のための鋳型として用いた(表2A-2C)。伸長を10サイクルのPCRによってプライマーAVA110およびAVA122を用いて増幅し、それからAVA037によってSanger法を用いて配列決定した(表2A-2C)。

酵母蛍光レポーターアッセイ

インフレーム停止コドン、+1フレームシフト、または-1フレームシフトを含有する二元的な蛍光レポータープラスミドを、上に記載されているとおりin vitroの5'伸長されたPEgRNAまたは3'伸長されたPEgRNAのプライム編集反応に付した。37℃での1時間のインキュベーション後に、反応を水によって希釈し、プラスミドDNAを0.3M酢酸ナトリウムおよび70％エタノールによって沈殿した。再懸濁されたDNAを先に記載されているとおりエレクトロポレーションによってS.cerevisiaeに形質転換し⁶⁷、ロイシンなしの合成完全培地(SC(グルコース)、L-)にプレーティングした。GFPおよびmCherry蛍光シグナルをTyphoon FLA 7000バイオ分子イメージャーによってコロニーから視覚化した。

一般的な哺乳類細胞培養条件

HEK293T(ATCC CRL-3216)、U2OS(ATTC HTB-96)、K562(CCL-243)、およびHeLa(CCL-2)細胞はATCCから購入し、夫々が10％(v/v)ウシ胎児血清(Gibco、品質保証)および1×ペニシリンストレプトマイシン(Corning)を足された夫々ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)プラスGlutaMAX(ThermoFisher Scientific)、マッコイ5A培地(Gibco)、RPMI培地1640プラスGlutaMAX(Gibco)、またはイーグル最小必須培地(EMEM、ATCC)によって培養および継代した。全ての細胞型は37℃において5％CO₂でインキュベーション、維持、および培養した。細胞株はそれらの夫々のサプライヤーによって認証され、マイコプラズマ検査陰性であった。

HEK293T組織培養トランスフェクションプロトコールおよびゲノムDNA調製

成長したHEK293T細胞を48ウェルポリD-リジンコーティングプレート(Corning)上に播種した。播種の16から24時間後に、細胞を、およそ60％コンフルエンシーで、製造者のプロトコールに従う1μLのLipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)、ならびに750ngのPEプラスミド、250ngのPEgRNAプラスミド、および83ngのsgRNAプラスミド(PE3およびPE3bについて)によってトランスフェクションした。別様に申し立てられない限り、細胞はトランスフェクション後に3日培養し、これの後に培地を除去し、細胞を1×PBS溶液(Thermo Fisher Scientific)によって洗浄し、ゲノムDNAを、直接的に組織培養プレートの各ウェルへの150μLの新しく調製されたリシス緩衝液(10mM Tris-HCl、pH7.5;0.05％SDS;25μg/mLプロテイナーゼK(ThermoFisher Scientific))の追加によって抽出した。ゲノムDNA混合物を37℃で1から2時間に渡ってインキュベーションし、次に30分の80℃の酵素不活性化ステップをした。哺乳類細胞ゲノムDNA増幅に用いられたプライマーは表4に列記されている。HEK293T細胞におけるHDR実験では、231 ngのヌクレアーゼ発現プラスミド、69 ngのsgRNA発現プラスミド、50 ng(1.51 pmol)の100nt ssDNAドナー鋳型(PAGE精製済み;Integrated DNA Technologies)を、1.4 μLのLipofectamine 2000(ThermoFisher)を用いてウェル当たりリポフェクションした。全てのHDR実験からのゲノムDNAはAgencourt DNAdvanceキット(Beckman Coulter)を用いて製造者のプロトコールに従って精製した。

ゲノムDNAサンプルの高スループットDNA配列決定

目当てのゲノム部位をゲノムDNAサンプルから増幅し、次の改変によって先に記載されているとおりIllumina MiSeqによって配列決定した^129,130。手短かには、Illuminaフォワードおよびリバースアダプターを含有する増幅プライマー(表4)を第1ラウンドのPCR(PCR1)に用い、目当てのゲノム領域を増幅した。25μLのPCR1反応を、0.5μMの各フォワードおよびリバースプライマー、1μLのゲノムDNA抽出物、および12.5μLのPhusion U Green Multiplex PCRマスターミックスによって行った。PCR反応は次のとおり実行した:2分の98℃、それから30サイクルの[10秒の98℃、20秒の61℃、および30秒の72℃]、次に2分の最終の72℃伸長。固有のIlluminaバーコード化プライマーペアを二次PCR反応(PCR2)の各サンプルに追加した。具体的には、25μLの所与のPCR2反応は、0.5μMの各固有のフォワードおよびリバースilluminaバーコード化プライマーペア、1μLの未精製のPCR1反応混合物、および12.5μLのPhusion U Green Multiplex PCR 2×マスターミックスを含有した。バーコード化PCR2反応は次のとおり実行した:2分の98℃、それから12サイクルの[10秒の98℃、20秒の61℃、および30秒の72℃]、次に2分の最終の72℃伸長。PCR産物は1.5％アガロースゲルによる電気泳動によって分析的に評価した。PCR2産物(共通アンプリコンによってプールされた)を1.5％アガロースゲルによる電気泳動によって精製した。QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用い、40μLの水によって溶出した。DNA濃度をフルオロメトリー定量(Qubit、ThermoFisher Scientific)またはqPCR(KAPAライブラリ定量キット-Illumina、KAPA Biosystems)によって測定し、製造者のプロトコールに従ってIllumina MiSeq装置によって配列決定した。

配列決定読取をMiSeqレポーター(Illumina)を用いてデマルチプレックスした。参照配列に対するアンプリコン配列のアラインメントをCRISPResso2を用いて行った¹⁷⁸。点変異編集の定量のためには、CRISPResso2を「discard_indel_reads」オンによる標準モードで走らせた。編集効率は:(捨てられなかった読取における規定された点変異の度数)×(捨てられなかった読取の＃)÷トータル読取として計算した。挿入または欠失編集では、CRISPResso2を「discard_indel_reads」オンで予想されるアレル(e flag)として所望のアレルを用いてHDRモードで走らせた。編集収量はトータル読取によって割られたHDRアラインメント読取の数として計算した。全ての編集について、インデル収量はトータル読取によって割られた捨てられた読取の数として計算した。

U2OS、K562、およびHeLa細胞のヌクレオフェクション

ヌクレオフェクションは全ての実験においてK562、HeLa、およびU2OS細胞を用いて行った。これらの細胞型のPE条件では、800ngプライム編集因子発現プラスミド、200ngのPEgRNA発現プラスミド、および83ngのニッキングプラスミドを20μLの最終体積で16ウェルnucleocuvetteストリップ(Lonza)上でヌクレオフェクションした。これらの3つの細胞型のHDR条件では、350ngヌクレアーゼ発現プラスミド、150ngのsgRNA発現プラスミド、および200pmol(6.6μg)の100nt ssDNAドナー鋳型(PAGE精製済み;Integrated DNA Technologies)をサンプル当たり20 μLの最終体積で16ウェルNucleocuvetteストリップ(Lonza)上でヌクレオフェクションした。K562細胞は、SF Cell Line 4D-Nucleofector Xキット(Lonza)を用いて、サンプル当たり5×10⁵細胞で(プログラムFF-120)、製造者のプロトコールに従ってヌクレオフェクションした。U2OS細胞は、SE Cell Line 4D-Nucleofector Xキット(Lonza)を用いて、サンプル当たり3-4×10⁵細胞で(プログラムDN-100)、製造者のプロトコールに従ってヌクレオフェクションした。HeLa細胞は、SE Cell Line 4D-Nucleofector Xキット(Lonza)を用いて、サンプル当たり2×10⁵細胞で(プログラムCN-114)、製造者のプロトコールに従ってヌクレオフェクションした。細胞はヌクレオフェクションの72時間後にゲノムDNA抽出のために収穫した。

HDR実験のためのゲノムDNA抽出

HEK293T、HEK293T HBB E6V、K562、U2OS、およびHeLa細胞における全てのHDR比較実験からのゲノムDNAは、製造者のプロトコールに従ってAgencourt DNAdvanceキット(Beckman Coulter)を用いて精製した。

PE2、PE3、BE2、BE4max、ABEdmax、およびABEmaxの間の比較

HEK293T細胞を48ウェルポリD-リジンコーティングプレート(Corning)に播種した。16から24時間後に、細胞をおよそ60％コンフルエンシーでトランスフェクションした。CBEまたはABE構築物による塩基編集では、細胞を750ngの塩基編集因子プラスミド、250ngのsgRNA発現プラスミド、および1μLのLipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)によってトランスフェクションした。PEトランスフェクションは上に記載されているとおり行った。PEおよびBEのゲノムDNA抽出は上に記載されているとおり行った。

公知のCas9オフターゲット部位におけるPE3活性の決定

公知のCas9オフターゲット部位におけるPE3オフターゲット編集活性を評価するために、PE3によるトランスフェクションの3日後にHEK293T細胞から抽出されたゲノムDNAを、16の先に報告されたCas9オフターゲットゲノム部位のPCR増幅のための鋳型として用いた^118,159(夫々HEK3、EMX1、FANCF、およびHEK4スペーサーの上位4つのオフターゲット部位;プライマー配列は表4に列記されている)。これらのゲノムDNAサンプルは、図41A-41Kに示されているオンターゲットPE3編集活性を定量するために用いられたものと同一であった;PEgRNAおよびニッキングsgRNA配列は表3A-3Rに列記されている。オフターゲット部位のPCR増幅後に、アンプリコンを上に記載されているとおりIllumina MiSeqプラットフォームによって配列決定した(HTS分析)。Cas9ヌクレアーゼ、Cas9 H840Aニッカーゼ、dCas9、ならびにPE2-dRTオンターゲットおよびオフターゲット編集活性を決定するために、HEK293T細胞を750ngの編集因子プラスミド(Cas9ヌクレアーゼ、Cas9 H840Aニッカーゼ、dCas9、またはPE2-dRT)、250ngのPEgRNAまたはsgRNAプラスミド、および1μLのLipofectamine 2000によってトランスフェクションした。ゲノムDNAを上に記載されているとおりトランスフェクションの3日後に細胞から単離した。オンターゲットおよびオフターゲットゲノム座位を表4のプライマー配列を用いてPCRによって増幅し、Illumina MiSeqによって配列決定した。

HTSデータ分析をCRISPResso2を用いて行った¹⁷⁸。Cas9ヌクレアーゼ、Cas9 H840Aニッカーゼ、およびdCas9の編集効率を、インデルを含有する配列決定総読取のパーセントとして定量した。PE3およびPE3-dRTオフターゲットの定量のために、アラインメントされた配列決定読取を、Cas9ニック部位において開始されるPEgRNA逆転写の予期される産物と整合する点変異、挿入、または欠失について検分した。サンプル中のトータル読取のうち＜0.1％の総体的な度数で生起する1ヌクレオチドバリエーションは、分析から排除した。度数≧0.1％で生起するかつPEgRNAによってコードされる編集と部分的に整合する両方である1ヌクレオチドバリエーションを含有する読取については、t検定(対応なし、片側、α=0.5)を用いて、同じスペーサーを含有するが異なる編集をコードするPEgRNAによって処置されたサンプルと比較して、バリアントが有意に高いレベルで生起するかどうかを決定した。配列決定エラーの違いを回避するために、同じMiSeqランによって同時に配列決定されたサンプル間の比較をなした。p値＞0.05の基準を満たさなかったバリアントは排除した。それから、オフターゲットPE3編集活性を上の基準を満たす配列決定総読取のパーセンテージとして計算した。

Cas9によって開始されるHDRを用いるHBB E6V変異を含有するHEK293T細胞株の生成

HEK293T細胞を48ウェルプレートに播種し、およそ60％コンフルエンシーで、1.5μLのLipofectamine 2000、300ngのCas9 D10Aニッカーゼプラスミド、100ngのsgRNAプラスミド、および200ngの100mer ssDNAドナー鋳型(表5)によってトランスフェクションした。トランスフェクションの3日後に、培地を新しい培地に交換した。トランスフェクションの4日後に、細胞を30μLのTrypLE溶液を用いて解離させ、1.5mLの培地に懸濁した。単細胞を蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)(Beckman-Coulter Astrios)によって2つの96ウェルプレートの個々のウェルに単離した。代表的なFACSソーティング例は図53A-53Bを見よ。細胞を、上に記載されているとおりゲノムDNA配列決定に先行して14日に渡って拡大培養した。単離されたクローン集団からは、いずれもHBB E6V変異についてホモ接合であることは見出されなかった。そのため、リポフェクションによる編集、ソーティング、およびアウトグロースの第2ラウンドを部分的に編集された細胞株において繰り返して、E6Vアレルについてホモ接合の細胞株を生んだ。

PE3を用いるHBB E6V変異を含有するHEK293T細胞株の生成

抗生物質の不在下で成長させた2.5×104のHEK293T細胞を48ウェルポリD-リジンコーティングプレート(Corning)に播種した。播種の16から24時間後に、細胞を、およそ70％コンフルエンシーで、製造者のプロトコールに従って1μLのLipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)、ならびに750ngのPE2-P2A-GFPプラスミド、250ngのPEgRNAプラスミド、および83ngのsgRNAプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクション後の3日後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(Gibco)によって洗浄し、TrypLE Express(Gibco)を用いて解離させた。それから、細胞を10％(v/v)FBS(Gibco)を足されたDMEMプラスGlutaMax(Thermo Fisher Scientific)によって希釈し、ソーティングに先行して35μmセルストレーナー(Corning)を通過させた。フローサイトメトリーをLE-MA900セルソーター(Sony)によって実行した。細胞は3nM DAPI(BioLegend)によってソーティングに15分先行して処置した。ダブレット除去のためのゲーティング後に、GFP陰性対照細胞集団のものよりも上のGFP蛍光を有するDAPI陰性単細胞を、10％FBSを足されたGlutaMaxありの予冷されたDMEMを充填した96ウェル平底細胞培養プレート(Corning)にソーティングした。代表的なFACSソーティング例は図53A-53Bを見よ。細胞は、上に記載されているとおり、ゲノムDNA抽出およびHTSによる特徴付けに先行して10日に渡って培養した。HBBのE6V変異についてホモ接合であるトータルで6つのクローン細胞株を同定した。

PE3を用いるHEXA 1278+TATC挿入を含有するHEK293T細胞株の生成

HEXA 1278+TATCアレルを含有するHEK293T細胞を、HBB E6V細胞株の生出について上に記載されているプロトコールを踏襲して生成した;PEgRNAおよびsgRNA配列は表2A-2Cにおいて図43A-43H小見出し下に列記されている。トランスフェクションおよびソーティング後に、細胞を、上に記載されているとおりゲノムDNA抽出およびHTSによる特徴付けに先行して10日に渡って培養した。50％のHEXA 1278+TATCアレルを含有する2つのヘテロ接合体細胞株を単離し、100％のHEXA 1278+TATCアレルを含有する2つのホモ接合細胞株を回復した。

細胞生存性アッセイ

HEK293T細胞を48ウェルプレートに播種し、およそ70％コンフルエンシーにおいて、750ngの編集因子プラスミド(PE3、PE3 R110S K103L、Cas9 H840Aニッカーゼ、またはdCas9)、250ngのHEK3標的化PEgRNAプラスミド、および1μLのLipofectamine 2000によって、上に記載されているとおりトランスフェクションした。細胞生存性を、トランスフェクション後に3日に渡って24時間毎に測定した。製造者のプロトコールに従ってCellTiter-Glo 2.0アッセイ(Promega)を用いた。ルミネセンスを96ウェル平底ポリスチレンマイクロプレート(Corning)上でM1000 Proマイクロプレートリーダー(Tecan)を用いて1秒の積算時間で測定した。

レンチウイルス生産

レンチウイルスは先に記載されているとおり生じた²⁰⁶。T-75フラスコの急速に分裂するHEK293T細胞(ATCC;マナサス、VA、USA)を、インテイン分裂PE2編集因子を持つ改変されたlentiCRISPR_v2ゲノムとの組み合わせで、レンチウイルス生産ヘルパープラスミドpVSV-GおよびpsPAX2によってトランスフェクションした。製造者の説明に従ってFuGENE HD(Promega、マディソン、WI、USA)を用いた。4つの分裂インテイン編集因子構築物をデザインした:1)U6-PEgRNA発現カセットとNpu Nインテイン、自己切断P2Aペプチド、およびGFP-KASHに融合されたCas9 H840AニッカーゼのN末端部分(1-573)とをコードするウイルスゲノム;2)PE2のC末端残りに融合されたNpu Cインテインをコードするウイルスゲノム;3)Cas9対照のためのCas9のC末端残りに融合されたNpu Cインテインをコードするウイルスゲノム;および4)DNMT1のニッキングsgRNAである。分裂インテインはPE2またはCas9の2つの半分同士を連結するためのトランススプライシングを媒介し、P2A GFP-KASHは核膜局在したGFPの共翻訳的生産を可能化する。48時間後に、上清を収集し、500gで5分に渡って遠心して細胞破片を除去し、0.45μmフィルターを用いて濾過した。濾過された上清を製造者の説明に従ってPEG-itウイルス沈殿溶液(System Biosciences、パロアルト、CA、USA)を用いて濃縮した。もたらされたペレットを元々の培地体積の1％を用いてOpti-MEM(Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、MA、USA)に再懸濁した。再懸濁されたペレットを瞬間凍結し、使用まで-80℃で貯蔵した。

マウス初代皮質ニューロン解剖および培養

E18.5解離皮質培養物を計画妊娠C57BL/6マウス(Charles River)から収穫した。CO2による安楽死後に、胎児を妊娠マウスから収穫し、次に断頭をした。皮質キャップをペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies)を足された氷冷Hibernate-E中で解剖した。氷冷Hibernate-Eによるリンス後に、組織を37℃で8分に渡ってパパイン/DNase(Worthington/Sigma)によって消化した。組織をDNaseを足されたNBActiv4(BrainBits)中でトリチュレーションした。細胞をカウントし、ウェル当たり100,000細胞で24ウェルプレートに置いた。培地の半分を週当たり2回換えた。

初代ニューロンのプライム編集および核単離

DIV1において、15μLのレンチウイルスを10:10:1比のN末端:C末端:ニッキングsgRNAで追加した。DIV14において、ニューロン核を製造者のプロトコールを踏襲してEZ-PREP緩衝液(Sigma D8938)を用いて単離した。全てのステップは氷上でまたは4℃で行った。培地を解離した培養物から除去し、培養物を氷冷PBSによって洗浄した。PBSをアスピレーションし、200μLのEZ-PREP溶液によって置き換えた。氷上での5分のインキュベーション後に、EZ-PREPをウェルの表面上にピペッティングし、残りの細胞を取り去った。サンプルを500gで5分に渡って遠心し、上清を除去した。サンプルを200μLのEZ-PREPによって洗浄し、500gで5分に渡って遠心した。サンプルは、穏やかなピペッティングによって、1×PBS中の100μg/mL BSAおよび3.33μM Vybrant DyeCycle Ruby(Thermo Fisher)からなる200μL氷冷核懸濁緩衝液(NSB)に再懸濁し、それから500gで5分に渡って遠心した。上清を除去し、核を100μLのNSBに再懸濁し、Broad Instituteフローサイトメトリー施設においてMoFlo Astrios(Beckman Coulter)を用いて100μLのAgencourt DNAdvanceリシス緩衝液中にソーティングした。ゲノムDNAは製造者のAgencourt DNAdvanceの説明書に従って精製した。

RNA配列決定およびデータ分析

HEK293T細胞を、PRNP標的化またはHEXA標的化PEgRNAおよびPE2、PE2-dRT、またはCas9 H840Aニッカーゼによってコトランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後に、トータルRNAをTRIzol試薬(Thermo Fisher)を用いて細胞から収穫し、オンカラムのDNaseI処置を包含するRNeasyミニキット(Qiagen)によって精製した。TruSeq StrandedトータルRNAライブラリプレップキット(Illumina)のrRNA除去プロトコールを用いて、リボソームをトータルRNAから枯渇させ、爾後にRNAClean XPビーズ(Beckman Coulter)によって洗浄した。製造者のプロトコールを踏襲して、SMARTer PrepX Apollo NGSライブラリプレップシステム(Takara)によって、配列決定ライブラリをリボ枯渇したRNAを用いて調製した。もたらされたライブラリを2200 TapeStation(Agilent Technologies)によって視覚化し、Qubit dsDNA HSアッセイ(Thermo Fisher)を用いて正規化し、75bpペアエンド読取として高アウトプットv2フローセル(Illumina)を用いてNextSeq 550によって配列決定した。Fastqファイルをbcl2fastq2バージョン2.20によって生成し、TrimGaloreバージョン0.6.2を用いてトリミングして(https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore)、低品質塩基、非ペア配列、およびアダプター配列を除去した。トリミングされた読取を、RSEMバージョン1.3.1²⁰⁷を用いて、カスタムのCas9 H840A遺伝子エントリーによって、Homo sapiensゲノムアセンブリGRCh¹⁴⁸とアラインメントした。limma-voom²⁰⁸パッケージを用いて遺伝子発現レベルを正規化し、バッチ効果補正によって差次的発現分析を行った。差次的に発現される遺伝子をFDR補正されたp値＜0.05および～倍の変化＞2のカットオフでコールし、結果をRによって視覚化した。

ClinVar分析

ClinVarバリアントサマリーをNCBIからダウンロードし(2019年7月15日にアクセス)、それに含有される情報を全ての下流分析に用いた。全ての報告されたバリアントのリストを、重複物を除去するためのアレルIDによって、および分析を病原性のバリアントに制限するための臨床的有意性によってフィルタリングした。挿入、欠失などである病原性のバリアントの画分を計算するためには、病原性のバリアントのリストをバリアント型によって逐次的にフィルタリングした。1ヌクレオチドバリアント(SNV)を、報告された参照および代替対立遺伝子に基づいて2つのカテゴリー(トランジションおよびトランスバージョン)に分離した。参照または代替対立遺伝子を報告しなかったSNVは分析から排除した。

報告された挿入、欠失、および重複の長さを、参照/代替対立遺伝子、バリアントスタート/ストップ位置、またはバリアント名称の適当な識別情報を用いて計算した。上の情報のいずれかを報告しないバリアントは分析から排除した。報告されたインデル(参照ゲノムに対して相対的に挿入および欠失両方を包含する単一のバリアント)の長さは、参照および代替対立遺伝子間の最も良好なペアワイズアラインメントにおけるミスマッチまたはギャップの数を決定することによって計算された。バリアント長さの度数分布はGraphPad Prism 8を用いて計算された。

データ利用性

高スループット配列決定データはNCBI配列読取アーカイブデータベースに寄託されている。PE1、PE2/PE3、およびPEgRNA発現ベクターをコードするプラスミドはAddgeneから利用可能であろう。

コード利用性

PEgRNA骨格挿入を定量するために用いられるスクリプトは図60A-60Bに提供される。

補足情報:表および配列

表１:HEK3、HEK4、EMX1、およびFANCFオンターゲットおよびオフターゲット部位におけるプライム編集因子、Cas9ヌクレアーゼ、Cas9 H840Aニッカーゼ、およびPE2-dRTの活性。PE2/PE3編集が％インデル(括弧内)と並べて％プライム編集として示されている。％インデルは、Cas9、Cas9 H840Aニッカーゼ(nCas9)、およびPE2-dRTについて、上位4つの先に特徴付けられたオフターゲット部位において示されている^179,180。sgRNAおよびPEgRNA配列は表3A～3Rにおいて図42A-42Hの見出しの下に見出され得る。全ての値は3つの独立した生物学的レプリケートの平均である。

表2A～2C:in vitroでの実験のために使用されたDNAオリゴヌクレオチド、PEgRNA、およびsgRNAの配列。

表2A:DNAオリゴヌクレオチド

表2B:5'-伸長されたPEgRNA

表2C:3'-伸長されたPEgRNA

表3A～3R:哺乳類細胞実験に用いられたPEgRNAおよびsgRNAの配列。全ての配列は5'から3'の向きで示されている。PEgRNAを構築するためには、下に列記されるスペーサー配列をsgRNA骨格の5'端に追加し、プライマー結合部位とRT鋳型とを含有する下に列記される3'伸長をsgRNA骨格の3'端に追加した。sgRNA骨格配列はGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(配列番号131)である。

表3A:図39A～39D PEgRNA

表3B:図40A～40C PEgRNA

表3C:図40A～40C ニックを入れるsgRNA配列

表3D:図41A～41K PEgRNA

表3E:図41A～41Kニックを入れるsgRNA

表3F:図42A～42H PEgRNA

表3G:図42A～42Hニックを入れるsgRNA

表3H:図42A～42H塩基編集sgRNA

表3I:図42A～42HオンターゲットsgRNA

表3J:図42A～42H オンターゲットPEgRNA

表3K:図49A～49B PEgRNA

表3L:図47A～74D PEgRNA

表3M:図48A～48C PEgRNA

表3N:図48A～48C PEgRNA

表3O:図48A～48Cニックを入れるsgRNA

表3P:図50A～50B PRgRNA

表3Q:図50A～50Bニックを入れるsgRNA

表3R:図51A～51F PEgRNA

表4:哺乳動物細胞ゲノムDNA増幅およびHTS¹⁸¹に使用されたプライマーの配列。

表5:HDR実験におよびHBB E6V HEK293T細胞株の生出に用いられた100mer一本鎖DNAオリゴヌクレオチドドナー鋳型の配列。オリゴヌクレオチドは長さが100-103ntであり、編集の部位を中心とした相同アームを有する。オリゴヌクレオチドはIntegrated DNA Technologiesからであり、PAGEによって精製された。

追加の配列

本明細書に使用された酵母二重蛍光レポータープラスミドの配列
p425-GFP_停止_mCherry:

哺乳動物プライム編集因子プラスミドおよび例となるPEgRNAプラスミドのDNA配列

pLenti-U6-DNMT1_ニックを入れる_sgRNA:

本明細書に使用されたモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(M-MLV RT)バリアントのアミノ酸配列。
PE1 M-MLV RT:
TLNIEDEYRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFDEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGTAGFCRLWIPGFAEMAAPLYPLTKTGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLLIENSSP(配列番号739)

M3 M-MLV RT(D200N、T330P、L603W)(Baranauskas et al.¹⁸²を参照):

PE2 M-MLV RT(D200N、T306K、W313F、T330P、L603W):

M3-不活性型RT M-MLV RT:

例12のための参考文献
以下の参考文献の各々は例12に引用され、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

例13－PEによる細胞データ記録および系統トレース
背景
ゲノム改変は、細胞性のプロセスおよび発生を研究および記録するためにもまた用いられ得る。細胞分裂またはシグナルカスケード活性化のような細胞性のイベントをDNA配列改変にリンクすることは、解釈可能なDNA配列変化として細胞の履歴を貯蔵し、これらは特定の細胞性のイベントが生起したかどうかを記述するであろう。DNAは、RNAおよびタンパク質がされないやり方で1つの細胞から次へと忠実に受け渡されるので、DNA編集はこれらの適用にとって必要である。改変が短寿命のタンパク質およびRNA分子になされるときには、細胞状態および系統に関する情報は一般的には失われる。単一の細胞内の細胞性のイベントを記録することは、どのようにして疾患状態が開始、維持、および健康な対照に対して相対的に変化するかを理解するための強力なやり方である。これらの問いかけを探査する能力は、がん、神経学的疾患、およびヒトの健康の幾多の他の重要な問題の発生を理解することに関連性を有する。プライム編集(PE)は、標的化されたかつ配列によって規定されたゲノム挿入、欠失、または変異を生出するためのシステムを提供する。標的アンプリコン配列決定および/またはRNA配列決定(これは単細胞記録実験にとって特に価値がある)によって配列決定され得るDNA標的の繰り返しの改変が、シグナルカスケードの活性化、代謝状態、および細胞分化プログラムを包含する幾多の重要な生物学的プロセスを記録するために用いられ得る。内部のおよび外部の細胞性シグナルをゲノム上の配列改変に接続することは、理論上は、シグナル応答性プロモーターが存在するいずれかのシグナルについて可能である。PEは、培養条件およびインビボの両方において真核および原核細胞の細胞系統およびシグナルの履歴を探査するための多大に拡張されたツールキットを可能化するということが信じられる。

先の標準

標的化された配列挿入、欠失、または変異は、系統トレースおよび細胞性の刺激の記録を包含するいくつもの重要な生物学的問いかけを研究するために用いられ得る。ゲノム上にこれらのシグネチャーを生成するための現行のツールキットは限定されている。標的座位の変異導入は今日までDNAヌクレアーゼおよび塩基編集因子両方を用いて開発されている。

標的配列のCRISPR/Cas9ヌクレアーゼカットは、確率的な配列変化を生成して、多数の挿入または欠失(インデル)産物を生成する。Cas9カットから発生する多数の配列アウトカムは、ヌクレアーゼによってカットされた配列の明瞭な決定を許す。カット対非カット配列を見分ける能力は2つの支配的なやり方で用いられた。

第1に、Cas9ヌクレアーゼおよび/またはそのシングルガイドRNA(sgRNA)の発現が細胞シグナルに接続された。加えて、Cas9標的ゲノム座位の配列改変に基づいて、そのシグナルが生起したかどうかが記録された。しかしながら、このアプローチは限定される。なぜなら、各シグナルは固有の標的座位を要求し、これは複数のシグナルの相対的タイミングを追跡することを解釈困難にするからである。このアプローチの別の限定は、ある特定のsgRNAについて、複数の標的座位が望まれるということである。なぜなら、インデルの生成は多くの場合には標的座位の追加の変異導入を厳しく妨げるからである;多くの場合には、これは、内生座位の直接的変異導入の代わりに、予め操作された標的座位が編集のために細胞に取り入れられるということを意味する。

第2に、Cas9インデルが細胞系統を追跡するために用いられた。本明細書に記載のとおり、Cas9ヌクレアーゼ活性によって生成される多数の可能なインデル状態は、細胞発生樹形図の生成を許す。これらは時間的にどの細胞が互いから発生したかを示唆する。このアプローチは、どのようにして細胞が互いから発生したかを理解するための強力なやり方であり、選択された細胞プールに対するRNA配列決定を行うことによって固有の細胞状態および型を発生時間的に同定することを助けるために用いられている。このアプローチは細胞シグナルイベント、それらの順序について独立しては報告し得ず、前駆体対終末分化した細胞状態について報告するときにはバイアスを有し得る。

Cas9ヌクレアーゼによって媒介される系統トレースおよびシグナル記録は、いくつかの重要な警告を伴う強力な技術である。Cas9ヌクレアーゼによるシグナル記録は多くの場合には非常に技術的に難しい。Cas9カットは標的座位を消耗させ(ひとたびインデルが生成されると、繰り返しのカットは困難である)、単一細胞レベルにおいて長期的刺激を記録することを困難にする。Cas9カットのキネティクスはイベントをより長期間記録することを可能化するようにチューニングされ得るが、複数の刺激の順序、強度、および持続時間を取り入れする能力は非常に難しい技術的問題のままに留まり、これはこのツールでは達成可能でなくあり得る。Cas9系統トレース実験はとてつもなく強力であるが、標的座位における同時のCas9カットを原因とする配列の崩れという軽度の技術的課題を患う。これらの系統トレース実験は予めデザインされた標的座位の編集を要求し、このアプローチのフレキシビリティーを限定する。

DNA塩基編集は細胞シグナルイベントを追跡するためにもまた用いられている。Cas9インデルによって生成される状態の数に対して相対的に編集イベントによって生成されるアウトカム状態の低い数を原因として、塩基編集は系統トレースにはあまり適さない;しかしながら、塩基編集因子によって作られる配列改変の予め定められた性質は、内部のおよび外部の細胞性の刺激を追跡することにとって特に有用である。本明細書に記載の塩基編集因子またはsgRNA発現どちらかは、具体的な生物学的または化学的刺激に接続され得る。哺乳類および細菌細胞両方において多数の個々の刺激を追跡するために、塩基編集活性が用いられた。このアプローチは、第2の編集が生起し得る前に第1の編集イベントが必要である連続した刺激を追跡するためにもまた用いられた。

塩基編集シグナル記録は分野にとって重要な第1ステップであるが、それはいくつもの限定を有する。1つのかかる限定は、塩基編集が編集後にその標的を消耗させ、技術のダイナミックレンジを限定するということである。これは、イベントを記録するために内生標的を用いることが多くの場合には困難であり、単一細胞レベルにおける活性の代わりにバルクの活性を記録することに限定されるということを意味する。これの代替は予めデザインされた繰り返し記録座位の導入であるが、これは今日まで行われていない。2シグナル記録のイシューもまたある。これらの2シグナル記録実験は第1の後の第2の刺激の存在についてのみ報告する;それは、どの刺激が最初に起こったのかまたはどのくらい長く刺激が存在したのかを報告しない。これは実験から拾い集められる生物学的理解を根本的に限定する。

ゲノム標的配列および取り入れされた予めデザインされた配列を改変することによって、PE系統トレースは系統トレースおよび細胞シグナル記録両方をし得るということが提案されている。PEは、Cas9ニッカーゼフラグメント(多くの場合にはSpCas9 H840Aバリアント)と逆転写酵素(RT)ドメインとを含む合成融合タンパク質を、操作されたプライム編集ガイドRNA(PEgRNA)と併せて用いる。一緒になって、これらの構成要素は特定のゲノム配列を標的化し、予め決定された編集を組み入れる。PEgRNAは標的ゲノム配列および編集アウトカム両方を規定するので、高度に特異的なかつコントロールされたゲノム改変が、同じ細胞内の複数のPEgRNAを用いて同時に達成され得る。アクセス可能なゲノム改変は、全ての1ヌクレオチド置換、小から中程度のサイズの配列挿入、および小から中程度のサイズの配列欠失を包含する。このゲノム編集テクノロジーの汎用性は、細胞内の時間的にカップリングされたシグナル特異的な記録を可能化するはずである。

PE系統および細胞シグナル記録の有用性

細胞シグナルを記録することはいくつものやり方で達成され得る。このアプローチの1つの重要な第1の適用は、DNA改変イベントをサイクリン、CDK、または細胞寿命の局面に特異的な他のタンパク質の発現のような細胞周期関連シグナルに接続することであり、細胞時計を生成し得る。細胞時計は、研究者が個々の細胞によって受容およびプロセシングされている種々のシグナルの順序を理解することを許す。分子時計は長期的なシグナル対短期的な突発的シグナルの決定をもまた可能化するであろう。細胞周期に1回のみ編集し得るプライム編集構成要素を用いることもまた分子時計に至り得る。連続したDNA改変なしに(おそらく、非編集DNA鎖にニッキングしないことによって)、編集が細胞周期に1回のみ進み得る場合には、爾後の細胞分裂において第2の標的化PEsgRNAによってのみ編集され得るシステムを想像し得る。それは規定されたやり方で座位を繰り返して挿入、欠失、または変異させ得るので、PEは細胞時計として特に有用であり、挿入は特に重宝である。なぜなら、繰り返しの規則的挿入がいずれかの標的ゲノム座位においてなされ得るからである。

細胞シグナルを記録することに関する別の重要な適用は、多数の細胞性のインプットの並行的な記録である。細胞シグナルイベントをDNA改変にリンクすることは、かかるシグナルイベントが生起したかどうかを記録することを可能化する。Cas9ヌクレアーゼに基づくまたは塩基編集に基づく記録システムに類似に、細胞性のイベントの記録はgRNAまたは編集因子発現にテザリングされ得る。これらの他のアプローチとは違って、系統プライム編集は、順序付けられた編集のための厳格な配列モチーフを要求することなしに、シグナルイベントの順序、強度、および持続時間を記録する能力があるはずである。実に、系統プライム編集は、生物学的シグナルの順序、強度、および持続時間を研究するために、上に記載されている細胞性のカウンターをシグナル特異的な挿入、欠失、または変異と取り入れする能力があるはずである。プライム編集のプログラム可能な性質を原因として、このアプローチは目当ての標的細胞に予め存在するゲノム座位において達成され得る(これが細菌、マウス、ラット、サル、ブタ、ヒト、ゼブラフィッシュ、C.elegansなどにおいてであるかにかかわらない)。プライム編集記録はガイドRNA依存的な様式でバーコードを組み入れるということに注意することも重要であり、インプットの数は、確かなシグナル特異的なガイドRNA発現カセットがあるシグナルの数に限定される(これは、これらの発現をRNA Pol IIプロモーターの活性にテザリングする能力を原因として非常に高いはずである)。記録可能なシグナルの数は必要とされるPEgRNAの数に直線的に比例する。

PEは細胞系統をトレースするためにもまた用いられ得る。個々の細胞を追跡するための固有の細胞バーコードを生成するために、繰り返しの配列改変が用いられ得る。バーコードのアレイ、それらの順序、およびサイズは全て、Cas9ヌクレアーゼによって生成される多数のインデル状態に対して相補的であり得るやり方で、細胞系統を推論するために用いられ得る。

繰り返しの配列改変のためのプライム編集方法論

プライム編集(PE)を用いる繰り返しの配列改変のいくつもの別物のモダリティーが想定された:DNA変異導入;配列欠失;および配列挿入である。注意すべきことに、これらの適用は、予め存在するゲノムDNA標的に対してまたは研究者が標的細胞に取り入れする予めデザインされたDNA配列に対してどちらかで用いられ得る。連続配列改変のこれらの技術は、連続的な様式で、情報を記録することにとって、および標的座位のデザインされたまたは確率的な改変にとって価値を有する。連続標的座位改変は、種々のホストにおいてバリアントのライブラリを生成ことにとって特に有用であり得る。

繰り返しの配列変異は、細胞シグナルイベントについて報告するために、反復的な様式で、ゲノムDNAまたは予めデザインされた取り入れされたDNA配列どちらかを変改するために用いられ得る。このパラダイムでは、PE gRNA活性によって組み入れされる変異は細胞性のシグナルの存在に対応するであろう。これらの点変異は、連続編集イベントにとって必要なPAMモチーフ、および特定のシグナルの存在に対応する点変異を組み入れ組み入れ得る。各順次のガイドRNAは新規のプロトスペーサーを用いるであろうから、このシステムは使用に先行してgRNAデザインを要求するであろう;しかしながら、それは特に目当ての個々のまたは小さい数の刺激を検分することにとって特に強力であり得る。これらの変異の組み入れは個々の生物学的刺激に依存的であり得るか、または細胞時間をマークするであろう整合する細胞性のプロセスに接続され得る。下の配列は配列番号743、744、744、および745に対応する。

別の類似のPEガイドRNA集約型の方法は標的配列の繰り返しの欠失である。標的座位からの個々の配列の除去は、DNAモチーフの喪失によってシグナルイベントを再構築する能力を許すであろう。順次の配列を欠失するPEgRNAのデザインは、連続したシグナルの追跡を可能化するであろう。これは、研究者が1つのシグナルが別のものに後続する場合を同定することを許すであろう。これは、研究者がどのシグナルイベントがどの順序で起こるかを探査することを許すであろう。かかるシステムはCAMERAを用いて試験されている;しかしながら、これは固有の配列要件を有する具体的な座位の予めの選択を要求する。特定の配列決定要因が要求されないので、PEを用いる順次の配列欠失は、個々の細胞におけるペアワイズなイベントの並行的な記録を許すであろう。これは、目当てのいずれかの標的細胞内における多重化された様式のペアワイズなシグナルイベントを探査する能力を研究者に許すであろう。下の配列は配列番号746、747、および748に対応する。

配列挿入は、細胞シグナルイベントを追跡するための第3のアプローチである。この戦略のいくつかのバリアントは変異導入または欠失よりもPEgRNA依存的でない。短い配列の挿入、プロトスペーサーの挿入、プロトスペーサーおよびバーコードの挿入、新規の相同性配列の挿入、ならびにバーコードを有する相同性配列の挿入の、いくつもの異なる挿入戦略が存在する。

短い繰り返し配列の挿入は、細胞時間の経過を測定するために標的配列のサイズを漸増的に増大させるためのやり方である。このシステムでは、5ヌクレオチド以上の繰り返し配列の挿入が、時間の経過または予め決定された刺激の連続した存在どちらかに関して反復拡大を引き起こし得る。系統PEの座位アグノスティックな性質は、再度、別々の生物学的シグナルに関して複数の固有の配列伸長の並行的な追跡を可能化する。これは、個々の細胞において細胞時間に渡って複数の生物学的シグナルの強度の測定を可能化するはずである。下の配列は配列番号749、750、および751に対応する。

異なる短い配列の挿入は、欠失空間に類似の様式でわずかのPEgRNAを要求するであろう。記録されようとするシグナルの数および挿入される配列のサイズは、必要とされるPEgRNAの組み合わせの数を決定するであろう。このシステムにおいて複数の配列を記録することの1つの課題は、そのカーゴ配列を挿入することにおける各PEgRNAの異なる効率であろう。

細胞シグナルの指標としてのプロトスペーサーの挿入は魅惑的であるが、技術的課題がこのアプローチの効率を侵害し得る。PEgRNAカセットはそれら自体が基質であり、順次の編集の効率および忠実性を毀損するPEgRNA上への挿入を引き起こすであろうから、単一PEgRNAシステムは用いることが難しいであろう。この同じ問題は2または3 PEgRNAシステムについても残存する。なぜなら、各ガイドは別のものの基質であり、ガイドカセットそれ自体への他の配列の挿入を可能化し、これは間違ったシグナルに関してプロトスペーサー配列の不適当な挿入に至り得るからである。これらのプロトスペーサー挿入システムはバーコード配列の包含について想像することもまた困難である。単一PEgRNAバーコードシステムは用いられるバーコードを単純に書き換え、第1の編集に貯蔵されたデータを除去するであろう。再度、複数ガイドシステムは他のPEgRNA発現構築物上への挿入を患い、その有用性を(特にインビボで)限定する。下の配列は配列番号752、752、753、754、754、755、および756に対応する。

相同性配列(すなわち、Cas9ニックの位置付けの3'の配列)、特に関連するバーコードを有する相同性配列の挿入は、特に有用な系統PE戦略であるように見える。このシステムは、編集の順次のラウンドが、同じ細胞の他のPEgRNA編集イベントによっては改変され得ないPEgRNAカセットからのバーコードの挿入をもたらすということを保証することによって、プロトスペーサー挿入に関連するイシューを回避する。バーコード化システムは、複数のバーコードが所与の刺激に関連し得るので重宝である。このシステムは標的プロトスペーサーの多数を保全するが、シード配列、PAM、および下流の隣接ヌクレオチドを変改する。これは、用いられようとするPEgRNAの有意な再デザインなしに、複数のシグナルが1つの編集座位に接続されることを可能化する。この戦略は、多数の細胞性の刺激(内部または外部どちらかの)に応答して単一の座位において多重化されたバーコード挿入を可能化するであろう。それは、固有のバーコードが存在するだけ多くのシグナルの強度、持続時間、および順序の記録を可能化し得る(これらは4^Nの可能なバーコードを生成するように複数のNヌクレオチドによってデザインされ得る。すなわち、5ntバーコードは4^5または1024の固有のシグナルの一度での記録を可能化するであろう)。このシステムはin vitroおよびインビボ両方で用いられ得る。

例13において引用された参考文献
以下の参考文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
1．Recording development with single cell dynamic lineage tracing. Aaron McKenna,James A.Gagnon.
2．Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing.Mckenna et al.Science.2016 Jul 29;353(6298):aaf7907.doi10.1126/science.aaf7907. Epub 2016 May 26.
3．Molecular recording of mammalian embryogenesis.Chan et al.2019.Nature.Jun;570(7759):77-82.doi:10.1038/s41586-019-1184-5.Epub 2019 May 13.

例14－PEによってバイオ分子活性および/または局在を調節する
バイオ分子の細胞下レベルの局在および修飾状態はそれらの活性を制御する。転写コントロール、細胞代謝、およびシグナル伝達カスケードのような特定の生物学的機能は、全て、細胞内の具体的な位置付けにおいて丁寧にオーケストレーションされている。そのため、タンパク質の細胞局在および修飾状態を調節することは、疾患の処置のための可能性ある治療学的戦略を表す。標的タンパク質の局在を変改するためのいくつかの存在する治療学が開発されている。例えば、ファルネシル化阻害剤は、KRASのような重要な発がんタンパク質の脂質修飾および膜標的化を防止するようにデザインされる。類似に、標的タンパク質の低分子によって誘導されるユビキチン化は、それらを分解のためのプロテアソームに導く。タンパク質をこれらのおよび他の固有の細胞区画に輸送する能力は、いくつもの生物学的プロセスを変改するための機会を提供する。治療学の目的で、遺伝子にコードされたシグナルによってバイオ分子(例えばタンパク質、脂質、糖、および核酸)の修飾状態および細胞下レベルの輸送を変改するための遺伝子にコードされたハンドルを組み入れるために、プライム編集(PE)を用いることが本願において提案される。

PEは、Cas9酵素によって標的化可能ないずれかのゲノム座位上への短いDNA配列の組み入れ、欠失、または置き換えを可能化するゲノム編集テクノロジーである。このテクノロジーを用いて、原理的には、これらの重要なバイオ分子の活性を変化させる重要なDNA、RNA、またはタンパク質コード配列を組み入れまたは除去し得る。より具体的には、プライム編集は、バイオ分子の局在または修飾特性を変化させるモチーフまたはシグナルを組み入れるために用いられ得る。いくつかの例は:タンパク質アミノ酸配列;翻訳後修飾のモチーフ;フォールディングまたは局在を変化させるRNAモチーフ;および周囲のDNAの局所的クロマチン状態またはアーキテクチャを変化させるDNA配列の組み入れの改変を包含する。

PEによって媒介される改変の1つの標的バイオ分子はDNAである。標的座位のアクセス可能性を変化させるいくつものDNA配列を組み入れるためのDNAの改変がなされ得る。クロマチンアクセス可能性は遺伝子転写アウトプットをコントロールする。クロマチンコンパクト化酵素を動員するためのマークの組み入れは、隣り合う遺伝子の転写アウトプットを減少させるはずであるが、クロマチン開放に関連する配列の組み入れは、領域をよりアクセス可能にし、翻って転写を増大させるはずである。ネイティブな制御配列を真似たより複雑な配列モチーフの組み入れは、現行で利用可能なdCas9融合体よりも微妙なかつ生物学的に敏感なコントロールを異なるエピジェネティックなリーダー、ライター、またはイレーサー酵素に提供するはずである。典型的には、具体的な生物学的祖先を有さずにあり得る多数の単一型のマークを組み入れるツールである。3Dゲノムアーキテクチャの急成長分野において実証されているとおり、2つの座位を近接する近位に持って来るかまたは座位を核膜との接触に持って来るであろう配列の組み入れもまた、それらの座位の転写アウトプットを変改するはずである。

それらの細胞局在、相互作用パートナー、構造ダイナミクス、またはフォールディングの熱力学を変化させることによってそれらの活性を変改するためのRNAの改変もまたなされ得る。翻訳中断またはフレームシフトを引き起こすであろうモチーフの組み入れは、種々のmRNAプロセシング機序によってmRNA種の存在量を変化させ得る。コンセンサススプライス配列を改変することもまた、異なるRNA種の存在量および保有率を変改するであろう。異なるスプライスアイソフォームの相対比を変化させることは、予測可能に、タンパク質翻訳産物の比の変化に至るであろう。これは多くの生物学的経路を変改するために用いられ得る。例えば、ミトコンドリア対核のDNA修復タンパク質のバランスをシフトさせることは、化学療法試薬に対する異なるがんのレジリエンスを変改するであろう。さらにその上、RNAは、新規のタンパク質標的への結合を可能化する配列によって修飾され得る。高い親和性で細胞タンパク質に結合するいくつものRNAアプタマーが開発されている。これらのアプタマーの1つの組み入れは、それらの翻訳、生物活性を防止するであろうタンパク質標的への結合によって異なるRNA種を隔離するために、またはRNA種を特定の細胞下レベル区画に持って来るためにどちらかで用いられ得る。バイオ分子分解は局在改変の別のクラスである。例えば、細胞内のRNAを制御するためのRNAメチル化が用いられる。メチル化のコンセンサスモチーフがPEによって標的RNAコード配列上に導入され得る。RNAは、ナンセンスによって媒介される崩壊機構または標的RNA種を分解するための他の核酸代謝経路を導く配列を包含するようにもまた改変され得、細胞内のRNAのプールを変化させるであろう。加えて、RNA種はそれらの凝集状態を変改するように改変され得る。RNAの絡まりを生成するための配列が目当ての単一のRNAまたは複数のRNA上に組み入れされ得、これはそれらを翻訳またはシグナルにとって無効な基質にするであろう。

翻訳後修飾(PTM)によるタンパク質の修飾もまたPEによって実行され得るバイオ分子操作の重要なクラスを表す。RNA種のように、細胞内のタンパク質の存在量を変化させることは、PEの重要な能力である。オープンリーディングフレームに停止コドンを組み入れるための編集がされ得る。これは編集されたDNA配列から生ずる全長産物を消去するであろう。代替的には、タンパク質分解の速度が標的タンパク質について変改されることを引き起こすペプチドモチーフが組み入れられ得る。遺伝子本体上への分解タグの組み入れが、細胞内のタンパク質の存在量を変改するために用いられ得る。その上、低分子によって誘導されるデグロンの導入はタンパク質分解の時間的コントロールを可能化し得る。これは研究および治療学両方にとって重要な関連性を有し得る。なぜなら、研究者は所与の標的の低分子によって媒介される治療学的タンパク質分解が見込みある治療学的戦略であるかどうかを難なく評価し得るからである。タンパク質の細胞下レベル局在を変化させるためのタンパク質モチーフもまた組み入れられ得る。核、ミトコンドリア、細胞膜、ペルオキシソーム、リソソーム、プロテアソーム、エキソソーム、および他を包含するいくつもの細胞下レベル区画にタンパク質を選好的に輸送するためのアミノ酸モチーフが組み入れられ得る。

PTM機構によって修飾されるモチーフを組み入れまたは破壊することはタンパク質翻訳後修飾を変改し得る。リン酸化、ユビキチン化、グリコシル化、脂質修飾(例えばファルネシル化、ミリストイル化、パルミトイル化、プレニル化、GPIアンカー)、ヒドロキシル化、メチル化、アセチル化、クロトニル化、SUMO化、ジスルフィド結合形成、側鎖結合切断イベント、ポリペプチドバックボーン切断イベント(タンパク質分解)、およびいくつもの他のタンパク質PTMが同定されている。これらのPTMは、多くの場合には細胞下レベル局在を変化させることによってタンパク質機能を変化させる。実に、キナーゼは多くの場合にはリン酸化イベントによって下流のシグナルカスケードを活性化する。標的ホスホ部位の除去はシグナル伝達を防止するであろう。全長タンパク質発現を保持しながらいずれかのPTMモチーフを部位特異的に切除または組み入れる能力は、基礎研究および治療学両方にとって重要な進歩であろう。PEの配列組み入れ範囲および標的窓は、それを幅広いPTM改変空間に良く適するようにしている。

脂質修飾部位の除去は細胞膜へのタンパク質の輸送を防止するはずである。翻訳後修飾プロセスを標的化する現行の治療学における主要な限定はそれらの特異性である。ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤は細胞膜へのKRAS局在を消去するそれらの能力について鋭意に試験されている。残念ながら、ファルネシル化の全面的な阻害は数々のオフターゲット効果を伴い、これらはこれらの低分子の幅広い使用を防止している。類似に、低分子によるタンパク質キナーゼの特異的阻害は、ヒトゲノムの大きいサイズおよび種々のキナーゼ間の類似性を原因として非常に難しくあり得る。PEはこの特異性問題に可能性ある解決をオファーする。なぜなら、それは全面的な酵素阻害の代わりに修飾部位の切除による標的タンパク質の修飾の阻害を可能化するからである。例えば、KRAS上の脂質修飾ペプチドモチーフの除去は、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害の代わりに用いられ得る標的化されたアプローチであろう。このアプローチは、膜結合するようにデザインされていないタンパク質上に脂質標的化モチーフを組み入れることによって標的タンパク質活性を阻害することの機能的な反対物である。

PEはタンパク質-タンパク質複合体化イベントを取り調べるためにもまた用いられ得る。タンパク質は多くの場合には複合体内で機能してそれらの生物活性を遂行する。PEは、タンパク質がこれらの複合体内に存在する能力を生出するかまたは破壊するかどちらかのために用いられ得る。複合体形成イベントを消去するためには、タンパク質:タンパク質インターフェース上のアミノ酸置換または挿入が、複合体化を好まないように組み入れられ得る。SSX18は重要なヒストンリモデリング複合体のBAF複合体のタンパク質構成要素である。SSX18の変異は滑膜肉腫を駆動する。PEは、SSX18が複合体のそのタンパク質パートナーに結合することを防止する側鎖を組み入れしてその発がん活性を防止するために用いられ得る。PEは病原性の変異を除去してこのタンパク質のWT活性を復元するためにもまた用いられ得る。代替的には、PEは、タンパク質をそれらのネイティブな複合体中に保つために、またはそれらのネイティブな活性とは無関係である相互作用に関与するようにそれらを引っ張ってそれらの活性を阻害するためにどちらかで用いられ得る。別のものと比べて1つの相互作用状態を維持する複合体を形成することは、重要な治療学的モダリティーを表し得る。タンパク質:タンパク質インターフェースを変改して相互作用のKdを減少させることは、それらのタンパク質がより長く互いにくっついていることを保つであろう。疾患においては神経芽腫シグナルカスケードを駆動するが、さもなければ他の細胞では健康な転写コントロールに関与するn-mycのように、タンパク質複合体は複数のシグナル複合体を有し得る。PEは、健康な相互作用パートナーとのn-myc会合を駆動しかつ発がん相互作用パートナーに対するその親和性を減少させる変異を組み入れるために用いられ得る。

例14において引用された参考文献
以下の参考文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
1. Selective Target Protein Degradation via Phthalimide Conjugation.Winter et al.Science.Author manuscript;available in PMC 2016 Jul 8.

2. Reversible disruption of mSWI/SNF(BAF)complexes by the SS18-SSX oncogenic fusion in synovial sarcoma.Kadoch and Crabtree.Cell.2013 Mar 28;153(1):71-85.doi:10.1016/j.cell.2013.02.036.
3. Ribosomal frameshifting and transcriptional slippage:From genetic steganography and cryptography to adventitious use.Atkins et al.Nucleic Acids Research,Volume 44,Issue 15,6 September 2016,Pages 7007-7078.
4. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease.Lee and Young.Cell.Author manuscript;available in PMC 2014 Mar 14.
5. Protein localization in disease and therapy.Mien-Chie Hung,Wolfgang Link Journal of Cell Science 2011 124:3381-3392.
6. Loss of post-translational modification sites in disease.Li et al.Pac Symp Biocomput.2010:337-47.PTMD:A Database of Human Disease-associated Post-translational Modifications.Xu et al.Genomics Proteomics Bioinformatics.2018 Aug;16(4):244-251.Epub 2018 Sep 21.
7. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.Zhao et al.Nature Reviews Molecular Cell Biology volume18,pages31-42(2017).

例15－PEgRNASのデザインおよび改変
本明細書に記載されるのは、プライム編集(PE)効率を改善し得る一連のPEgRNAデザインおよびストラテジーである。

プライム編集(PE)は、プライム編集因子ガイドRNA(PEgRNA)内にコードされた情報を使用して、標的にされた遺伝子座内の定義されたDNA配列を置き換え得、挿入し得、または除去し得るゲノム編集技術である。プライム編集因子(PE)は、逆転写酵素(RT)酵素と融合したヌクレアーゼ活性(Cas9)をもつ配列-プログラム型DNA結合タンパク質からなる。PEはPEgRNAと複合体を形成するが、前記複合体は、それらのスペーサー配列内に標的化特定DNA遺伝子座のための情報、ならびに標準のsgRNA骨格中へ備えられた改変伸長中に所望の編集を特定する情報を含有する。PE:PEgRNA複合体は、プログラムされた標的DNA遺伝子座に結合しニックを入れるが、これによってニックが入れられたDNA鎖の、PEgRNAの改変プライマー結合配列(PBS)とのハイブリダイゼーションが可能になる。次いで、逆転写酵素ドメインは、ニックが入れられたゲノムDNAをDNA重合のためのプライマーとして使用して、PEgRNAのRT鋳型部分内の編集コード情報をコピーする。これに続くDNA修復プロセスは、新しく合成された編集済DNA鎖をゲノム遺伝子座中へ組み込む。プライム編集の多用途性は、研究ツールおよび潜在的な治療薬として前途有望ではあるものの、効率および範囲における数種の限界が、編集に要される多段階プロセスに起因して存在する。例えば、PEgRNA内に形成される好ましくないRNA構造は、PEgRNAからゲノム遺伝子座へのDNA編集のコピーを阻害し得る。PE技術を改善する潜在的な1つのやり方は、不可欠なPEgRNA構成要素の再デザインおよび改変を介する。これらPEgRNAのデザインへの改善は、改善されたPE効率に必要とされそうであって、挿入されるより長い配列のゲノム中への組み入れを可能にさせそうである。

本明細書に記載されるのは、PEの有効性を改善するのを思い描いた一連のPEgRNAデザインである。これらのデザインは、sgRNAの有効性および/または安定性を改善するための、これまでに公開された数多のアプローチ利点を生かし、ならびに数多の新規ストラテジーを利用する。これらの改善点は、数多の種々のカテゴリーの1以上に属し得る:

(1)より長いPEgRNA。このカテゴリーは、非ポリメラーゼIII(pol III)プロモーターからの機能的PEgRNAの効率的な発現を可能にさせる、改善されたデザイン(これによって厄介な配列要件もなく、より長いPEgRNAの発現が可能になるであろう)に関する;

(2)コア改善。このカテゴリーはコアのCas9結合PEgRNA骨格の改善に関し、これは効力を改善し得る;

(3)RT処理能力。このカテゴリーは、RT処理能力を改善するPEgRNAの改善に関し、標的ゲノム座位におけるより長い配列の挿入を可能化する;および

(4)末端モチーフ。このカテゴリーはPEgRNAの5'および/または3'末端へのRNAモチーフの追加に関し、これらはPEgRNA安定性を改善するか、RT処理能力を増強するか、PEgRNAのミスフォールディングを防止するか、またはゲノム編集にとって重要な追加の因子を動員する。

本明細書に記載されるのは、各カテゴリーにおいて、数多の潜在的なかかるPEgRNAである。これらのデザインの数種は、Cas9をもつsgRNA活性を改善するためにこれまでにも記載されており、それ自体示されている。また本明細書に記載されるのには、PEgRNA骨格の洗練化(polishing)を可能にさせてPE活性(5)を増強させる、所定の配列標的のためのPEgRNAの進化のためのプラットホームもある。注目すべきことに、これらのデザインはまた、いずれのCas9またはその進化バリアントによって認識されるPEgRNAを改善するのにも容易に適用され得る。

(1)より長いPEgRNA。

sgRNAは、典型的には、U6 snRNAプロモーターから発現される。このプロモーターは、pol IIIを動員して関連RNAを発現するものであって、核内に保持される短いRNAの発現に有用である。しかしながら、pol IIIは、処理能力がそれほど高くなく、効率的なゲノム編集に要されるレベルにて長さが数百ヌクレオチドより長いRNAを発現することができない¹⁸³。加えて、pol IIIは、伸展したUにて失速または終止し、PEgRNAを使用して挿入され得る配列多様性を潜在的に限定し得る。ポリメラーゼII(pCMVなど)またはポリメラーゼI(U1 snRNAプロモーターなど)を動員する他のプロモーターも、それらのより長いsgRNAの発現能について調べられている¹⁸³。しかしながら、これらのプロモーターは、典型的には、部分的に転写され、これによって、発現されたPEgRNA中スペーサーの5'に余分な配列がもたらされ、このことは部位依存的なやり方で著しく低減されたCas9:sgRNA活性をもたらすことが示されている。加えて、pol III転写のPEgRNAは、6～7つ伸びたUにおいて簡単に終止し得るのに対し、pol IIまたはpol Iから転写されたPEgRNAは、異なる終止シグナルを要するであろう。しばしば、かかるシグナルはまた、ポリアデニル化ももたらし、これによってPEgRNAの核からの望ましくない輸送がもたらされるであろう。同様に、pol IIプロモーター(pCMVなど)から発現されるRNAは、典型的には、5'にキャップされており、それらの核外輸送もまたもたらされる。

これまでに、Rinnおよび共同研究者らは、長鎖非コーディングRNA(lncRNA)でタグ付けされたsgRNAの産生のための様々な発現プラットホームをスクリーニングした¹⁸³。これらのプラットホームは、pCMVから発現され、ヒトのMALAT1 ncRNAからのENE要素¹⁸⁴、KSHVからのPAN ENE要素¹⁸⁵、またはU1 snRNAからの3'ボックス¹⁸⁶において終止するRNAを包含する。注目すべきことに、MALAT1 ncRNAおよびPAN ENEは、ポリAテールを保護する三重ヘリックスを形成する^184,187。これらの構築物はまた、RNAの発現を可能にさせることに加え、RNA安定性をも増強し得ることが予想される(セクションivを参照)。U1 snRNAからのプロモーターを使用すると、これらのより長いsgRNAの発現が可能になることもまた¹⁸³、探索した。これらの発現系はまた、より長いPEgRNAの発現も可能にさせるであろうことが予想される。加えて、一連の方法は、PEgRNAの一部として転写されるであろうpol IIプロモーターの部分の切断のためにデザインされており、自己切断型リボザイム(ハンマーヘッド¹⁸⁸、ピストル¹⁸⁹、ハチェット¹⁸⁹、ヘアピン¹⁹⁰、VS¹⁹¹、ツイスター¹⁹²、もしくはツイスターシスター¹⁹²リボザイムなど)、または転写されたガイドを処理する他の自己切断型要素、またはCsy4によって認識されまたガイドのプロセシングへも繋がるヘアピン¹⁹³のいずれかが付加されている。また、複数のENEモチーフの組み込みは、これまでKSHV PAN RNAおよび要素について実証されたとおり¹⁸⁵、改善されたPEgRNA発現および安定性へ繋がり得ることも仮定される。PEgRNAを環状イントロンRNA(ciRNA)の形態に環化することはまた、増強されたRNAの発現および安定性、ならびに核局在化へも繋がり得ることもまた、予想される¹⁹⁴。

pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、およびMALAT1 ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTAGGGTCATGAAGGTTTTTCTTTTCCTGAGAAAACAACACGTATTGTTTTCTCAGGTTTTGCTTTTTGGCCTTTTTCTAGCTTAAAAAAAAAAAAAGCAAAAGATGCTGGTGGTTGGCACTCCTGGTTTCCAGGACGGGGTTCAAATCCCTGCGGCGTCTTTGCTTTGACT(配列番号757)

pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、およびPAN ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号758)

pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3×PAN ENEからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACACACTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTCTCTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号759)

pCMV、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3'ボックスからなるPEgRNA発現プラットホーム
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号760)

pU1、Csy4ヘアピン、PEgRNA、および3'ボックスからなるPEgRNA発現プラットホーム
CTAAGGACCAGCTTCTTTGGGAGAGAACAGACGCAGGGGCGGGAGGGAAAAAGGGAGAGGCAGACGTCACTTCCCCTTGGCGGCTCTGGCAGCAGATTGGTCGGTTGAGTGGCAGAAAGGCAGACGGGGACTGGGCAAGGCACTGTCGGTGACATCACGGACAGGGCGACTTCTATGTAGATGAGGCAGCGCAGAGGCTGCTGCTTCGCCACTTGCTGCTTCACCACGAAGGAGTTCCCGTGCCCTGGGAGCGGGTTCAGGACCGCTGATCGGAAGTGAGAATCCCAGCTGTGTGTCAGGGCTGGAAAGGGCTCGGGAGTGCGCGGGGCAAGTGACCGTGTGTGTAAAGAGTGAGGCGTATGAGGCTGTGTCGGGGCAGAGGCCCAAGATCTCAGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTCAGCAAGTTCAGAGAAATCTGAACTTGCTGGATTTTTGGAGCAGGGAGATGGAATAGGAGCTTGCTCCGTCCACTCCACGCATCGACCTGGTATTGCAGTACCTCCAGGAACGGTGCACCCACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号761)

(2)コアの改善。

コア、Cas9結合PEgRNA骨格はおそらく、PE活性を増強するのにも改善され得る。数種のかかるアプローチは既に実証されている。実例として、骨格の第1の対形成要素(P1)は、GTTTT-AAAAC対形成要素を含有する。かかるT(複数)の伸びは、RNA転写産物のpol III休止(pausing)および未成熟終止をもたらすことが示されている。このP1の部分におけるT-A対の1つの、G-C対への合理的な突然変異は、sgRNA活性を増強するのが示されたが、このアプローチもまたPEgRNAに対して実現可能であろうことを示唆する¹⁹⁵。加えて、P1の長さを増大することはまた、sgRNAの折り畳みを増強して改善された活性へ繋がることも示されたが¹⁹⁵、これはPEgRNA活性の改善のための別の道として示唆される。最終的に、所定DNA標的上のPEgRNAの指向進化を通じたPEgRNA骨格の洗練化がまた、改善された活性ももたらす可能性がある。これはセクション(v)に記載される。

P1まで6ntの伸長を含有するPEgRNA
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGCTCATGAAAATGAGCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号228)

P1内にT-A→G-C突然変異を含有するPEgRNA
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTGAGAGCTAGAAATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号229)

(iii)PEgRNAの鋳型領域への修飾を介したRT処理能力の改善

PEgRNAによって鋳型にされた(templated)挿入のサイズが増大するにつれて、エンドヌクレアーゼによって分解されるか、自発的加水分解を経るか、または折り畳まれることで2次構造(RTによって逆転写され得ないか、もしくはPEgRNA骨格の折り畳みおよびこれに続くCas9-RT結合を妨害する)になるか、になる可能性が高い。結果的に、PEgRNAの鋳型への修飾が、遺伝子全体の挿入などの大きな挿入に影響を及ぼす必要もあり得る。そうするためのいくつかのストラテジーは、合成または半合成PEgRNA内の修飾ヌクレオチドの組み込み(RNAを、分解もしくは加水分解に対してより耐性があるようにさせるか、または阻害性の2次構造を採用する可能性を低くさせる)を包含する¹⁹⁶。かかる修飾は、Gリッチ配列中のRNA2次構造を低減するであろう、8-アザ-7-デアザグアノシン;分解を低減してある種のRNA2次構造を増強する、ロックド核酸(LNA);RNA安定性を増強する、2'-O-メチル修飾、2'-フルオロ修飾、または2'-O-メトキシエトキシ修飾を包含し得る。かかる修飾はまた、安定性および活性を増強するために、PEgRNA中の他のどこかにも包含され得る。代わりに、または加えて、PEgRNAの鋳型は、所望のタンパク質産物をコードするのとともに、RTによって折り畳まれ得ない単純な2次構造を採用する可能性もまた高くなるように、デザインされ得る。かかる単純な構造は、熱力学的な流し台(sink)として作用するであろうが、これによって逆転写を防止するであろうより複雑な構造が生じる可能性が低くなる。最終的に、鋳型を分裂させて2つ別々のPEgRNAにすることもまたあり得ることである。かかるデザインにおいて、PEは、Cas9と融合したRNA結合タンパク質またはPEgRNA自身上のRNA認識要素(MS2アプタマーなど)を介して、転写を開始すること、また別々の鋳型RNAを標的にされた部位へ動員することにも使用されるであろう。RTは、この別々の鋳型RNAへ直接結合するか、または第2鋳型と入れ替える前に元のPEgRNA上で逆転写を開始するか、のいずれかであり得る。かかるアプローチは、長い鋳型を付加した際にPEgRNAの誤った折り畳みを予防することのみならず、長い挿入を生じさせるのにゲノムからのCas9の解離(おそらくPEベースの長い挿入を阻害している可能性がある)を要さないことによってもまた、長い挿入を可能にさせ得る。

(iv)追加のRNAモチーフの5'末端または3'末端での組み入れ

PEgRNAデザインはまた、追加のモチーフの、RNAの末端のいずれかの末での組み入れを介しても改善され得る。数種のかかるモチーフ－KSHVからのPAN ENEおよびMALAT1からのENEなどを、非pol IIIプロモーターからのより長いPEgRNAの発現を終止させ得る手段として、前にパート(i)において考察した^184,185。これらの要素は、ポリAテールを飲み込むRNA三重ヘリックスを形成し、それらの核内への保持をもたらす^184,187。しかしながら、末端ヌクレオチドを塞ぐ複合体構造をPEgRNAの3'末端にて形成することによって、これらの構造はまた、PEgRNAのエキソヌクレアーゼ媒介分解を予防するのにも役立つ可能性があろう。3'末端にて挿入された他の構造要素もまた、非pol IIIプロモーターからの終止を可能にさせることはせずとも、RNA安定性を増強し得る。かかるモチーフは、3'末端を塞ぐであろうヘアピンもしくはRNA四重鎖¹⁹⁷、または3'末端にて2'-3'-環状ホスファートの形成をもたらし、また潜在的にPEgRNAをエキソヌクレアーゼによって分解される可能性を低くもさせるHDVなどの自己切断型リボザイム¹⁹⁸を包含し得る。不完全なスプライシングを介してPEgRNAを環化するのに誘導する－ciRNAを形成する－ことはまた、PEgRNA安定性を増大させてPEgRNAが核内に保持されることももたらし得る¹⁹⁴。

追加のRNAモチーフはまた、RT処理能力をも改善し得るか、またはDNA-RNA二重鎖へのRTの結合を増強することによってPEgRNA活性をも増強し得る。RTによって結合されるネイティブ配列の、その同族のレトロウイルスゲノム中での付加は、RT活性を増強し得る¹⁹⁹。これは、レトロウイルスゲノム二量体化および転写開始に関与する、ネイティブプライマー結合部位(PBS)、ポリプリントラクト(PPT)、またはキッシングループを包含し得る¹⁹⁹。二量体化チーフ－キッシングループまたはGNRAテトラループ/テトラループ受容体対²⁰⁰など－の、PEgRNAの5'末端および3'末端での付加はまた、PEgRNAの有効な環状化をももたらし得、安定性が改善される。加えて、これらモチーフの付加は、PEgRNAスペーサーとプライマーとの物理的な分離、PE活性の妨げになるであろうスペーサー閉塞への予防を可能にさせ得ることが想像される。スペーサー領域中に小さいトウホールド(toehold)ヘアピンを形成する、PEgRNAへの短い5'伸長はまた、好ましくは、PEgRNA結合スペーサーのアニーリング領域に対しても競合し得る。最終的に、キッシングループはまた、他の鋳型RNAをゲノム部位へ動員するのにも、あるRNAから他のセクションiii)のRT活性の入れ替えを可能にさせるのにも、使用され得る。

PEgRNA-HDV融合体
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号230)

PEgRNA-MMLVキッシングループ
GGTGGGAGACGTCCCACCGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCTTTTTTT(配列番号231)

PEgRNA-VSリボザイムキッシングループ
GAGCAGCATGGCGTCGCTGCTCACGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTCCATCAGTTGACACCCTGAGGTTTTTTT(配列番号232)

PEgRNA-GNRAテトラループ/テトラループ受容体
GCAGACCTAAGTGGUGACATATGGTCTGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAUACGTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTUACGAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGCATGCGATTAGAAATAATCGCATGTTTTTTT(配列番号233)

2次RNA-HDV融合体を切り替えるPEgRNA鋳型
TCTGCCATCAAAGCTGCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号234)

(v)PEgRNAの進化

PEgRNA骨格は、SpCas9および塩基編集因子の改善のされ方に類似した様式で、指向進化を介してさらに改善され得る。指向進化は、Cas9または進化したCas9バリアントによるPEgRNA認識を増強し得る。加えて、種々のPEgRNA骨格配列はおそらく、種々のゲノム遺伝子座にて最適であって、問題になっている部位にてPE活性を増強するか、オフターゲット活性を低減するか、またはその両方のいずれかであろう。最終的に、他のRNAモチーフが付加されたPEgRNA骨格の進化は、未進化の融合RNAと比べて、融合されたPEgRNAの活性をほぼ必ず改善するであろう。実例として、c-ジ-GMP-Iアプタマーおよびハンマーヘッド型リボザイムから構成されるアロステリックリボザイムの進化は、劇的に改善された活性へ繋がったが²⁰²、これは進化がハンマーヘッド-PEgRNA融合体の活性も改善するであろうことを示唆する。加えて、目下Cas9は一般にsgRNAの5'伸長の耐性がないものの、指向進化は、この不耐性を和らげることを可能にする突然変異を生成し、追加のRNAモチーフが利用され得るようになる可能性があろう。

本明細書に記載のとおり、数多のこれらアプローチは既に、Cas9:sgRNA複合体との使用のために記載されているが、PEgRNA活性を改善するためのデザインは報告されていない。プログラム可能な突然変異をゲノム中へ組み入れるための他のストラテジーも、塩基編集、相同組み換え修復(HDR)、正確なマイクロ相同媒介末端結合(MMEJ)、またはトランスポサーゼ媒介編集を包含する。しかしながら、これらアプローチのすべてが、PEと比較すると著しい難点を有する。最新の塩基編集因子は、現行のPEより効率的ではあるが、あるクラスのゲノム突然変異しか組み入れられず、着目部位にて、望ましくない追加のヌクレオチド変換をもたらし得る。HDRは、極少数の細胞型にしか実現可能でなく、比較的高比率のランダムな挿入および欠失の突然変異(インデル)をもたらす。正確なMMEJは、二本鎖破壊の予測可能な修復へ繋がり得るが、欠失の組み入れに大きく限定されており、極めて部位依存性であって、また比較的高比率の望ましくないインデルも有し得る。トランスポサーゼ媒介編集は、今日まで、細菌において機能することしか示されていない。してみると、PEへの改善点は、ゲノム突然変異の広範な見本の治療的修正へのおそらく最良の道を表す。

References cited in例15において引用された参考文献
以下の参考文献の各々は例15において引用されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
1. Schechner,DM,Hacisuleyman E.,Younger ST,Rinn JL.Nat Methods 664-70(2015).
2. Brown JA,et al.Nat Struct Mol Biol 633-40(2014).
3. Conrad NA and Steitz JA.EMBO J 1831-41(2005).
4. Bartlett JS,et al.Proc Natl Acad Sci USA 8852-7(1996).
5. Mitton-Fry RM,DeGregorio SJ,Wang J,Steitz TA,Steitz JA.Science 1244-7(2010).
6. Forster AC,Symons RH.Cell.1987.
7. Weinberg Z,Kim PB,Chen TH,Li S,Harris KA,Lunse CE,Breaker RR.Nat.Chem.Biol.2015.
8. Feldstein PA,Buzayan JM,Bruening G.Gene 1989.
9. Saville BJ,Collins RA.Cell.1990.
10. Roth A,Weinberg Z,Chen AG,Kim PG,Ames TD,Breaker RR.Nat Chem Biol.2013.
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13. Dang Y,et al.Genome Biol 280(2015).
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15. Nahar S,et al.Chem Comm 2377-80(2018).

例16－SPCAS9以外のDNA結合タンパク質を用いてPEの標的化範囲を拡張する
SpCas9が効率的に結合し得る好適に置かれたNGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)があるゲノム座位において、Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)を用いるプライム編集(PE)は全ての1塩基置換、挿入、欠失、およびそれらの組み合わせを効率的に組み入れ組み入れ得る。本明細書に記載の方法は、効率的なPEにとってアクセス可能なPAM、よってアクセス可能な標的化可能なゲノム座位を拡張することによって、PEの標的化能力を幅広くする。SpCas9以外のRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質を用いるプライム編集因子は、異なるPAMへのアクセスを許すことによってゲノム座位の拡張された標的化可能な範囲を可能化する。加えて、SpCas9よりも小さいRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質の使用は、より効率的なウイルス送達をもまた許す。SpCas9以外のCasタンパク質または他のRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質によるPEは、SpCas9に基づくPEを用いてはアクセス不可能または非効率的どちらかであった高効率の治療学的編集を許すであろう。

これは、NGG PAMに対して相対的な編集の非理想的な間隔を原因として、SpCas9に基づくPEが非効率的であるか、またはSpCas9に基づく構築物の総体的なサイズが細胞発現および/または送達にとって法外であるかどちらかの状況に用いられることが予想される。SpCas9の少数のかつ不良に位置付けられたNGG PAMを標的領域の近くに有するハンチンチン遺伝子などの特定の疾患に該当する(relevent)座位は、NGA PAMを認識するSpCas9-VRQRなどのPEシステムの異なるCasタンパク質を用いて容易に標的化され得る。より効率的にAAVベクターにパッケージングされ得るより小さいPE構築物を生成するために、より小さいCasタンパク質が用いられ、標的組織へのより良好な送達を可能化するであろう。図61は、RNAによってガイドされるDNA結合タンパク質としてStaphylococcus aureus CRISPR-Casを用いるプライム編集の実施化を示す。NTは無処置の対照である。

図62A～62Bは、プライム編集による精密な位置付けにおける所望の編集の効率的な組み入れのためのプロトスペーサーの重要性の実証を提供する。これは、このテクノロジーの新規の特色としての代替的なPAMおよびプロトスペーサーの重要性を強調する。図62Aの「n.d.」は「検出されない」である。

図63は、プライム編集因子システムのRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質としてSpCas9(H840A)-VRQRおよびSpCas9(H840A)-VRERを用いるPEの実施化を示す。SpCas9(H840A)-VRQR napDNAbpは配列番号87として本明細書に開示の。SpCas9(H840A)-VRER napDNAbpは配列番号88として本明細書に開示の。SpCas9(H840A)-VRER-MMLV RT融合タンパク質は配列番号516として本願において開示され、MMLV RTはD200N、L603W、T330P、T306K、およびW313F置換を野生型MMLV RTに対して相対的に含む。SpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RT融合タンパク質は配列番号515として本願において開示され、MMLV RTはD200N、L603W、T330P、T306K、およびW313F置換を野生型MMLV RTに対して相対的に含む。ヒトゲノム上の7つの異なる座位が標的化される:4つはSpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RTプライム編集因子システムにより、3つはSpCas9(H840A)-VRER-MMLV RTシステムによる。試験された構築物のアミノ酸配列は次のとおりである:

図63に示されているとおり、SpCas9(H840A)-VRQR-MMLV RTは「AGAG」および「GGAG」を包含するPAM部位において作動性であり、いくらかの編集活性を「GGAT」および「AGAT」PAM配列において有した。SpCas9(H840A)-VRER-MMLV RTは「AGCG」および「GGCG」を包含するPAM部位において作動性であり、いくらかの編集活性を「TGCG」において有した。

データは、プライム編集が、異なるPAM特異性を持つnapDNAbp、例えば本明細書に記載のCas9バリアントを用いて行われ得るということを実証している。

例17－PEによるリコンビナーゼ標的部位の導入
この例は、高い特異性および効率で哺乳類および他のゲノムにリコンビナーゼ標的部位(SSR標的部位)を導入するためにプライム編集(PE)を用いることによって、遺伝子疾患に対処するかまたはテーラーメイド動物もしくは植物モデルを生成するための方法を記載する。

この例は、ヒトまたは他のゲノム上の高価値の座位にリコンビナーゼ認識配列を導入するためのPEの使用を記載する。これらは、部位特異的リコンビナーゼ(単数または複数)に対する暴露後に、精密なかつ効率的なゲノム改変を導くであろう(図64)。図64に示されている種々の態様では、PEは、(b)DNAドナー鋳型のゲノム取り入れの部位としての使用のための単一のSSR標的を挿入するために用いられ得る。(c)は、どのようにしてSSR標的部位のタンデム挿入がゲノムのある部分を欠失させるために用いられ得るかを示す。(d)は、どのようにしてSSR標的部位のタンデム挿入がゲノムのある部分を逆位させるために用いられ得るかを示す。(e)は、どのようにして2つの遠位の染色体領域における2つのSSR標的部位の挿入が染色体転座をもたらし得るかを示す。(f)は、どのようにしてゲノム上の2つの異なるSSR標的部位の挿入がDNAドナー鋳型からのカセットを交換するために用いられ得るかを示す。ゲノム改変の型の夫々は、SSR標的を挿入するためにPEを用いることによって想定されるが、このリストもまた限定することを意味されない。

多くの大スケールゲノム変化、例えば遺伝子挿入、欠失、逆位、または染色体転座が遺伝子疾患に関連付けられている^1-7。加えて、真核ゲノムのカスタムのかつ標的化された操作は、ヒト疾患の研究、およびトランスジェニック植物^8,9またはほかのバイオテクノロジー製品の生成にとって重要である。例えば、染色体の微小欠失は疾患に至り得、重大なDNAエレメントの挿入によるこれらの欠失の置き換えは疾患の永久的な改善に至り得る。加えて、逆位、遺伝子コピー数変化、または染色体転座からもたらされる疾患は、有疾患細胞の先の遺伝子構造を復元することによって対処され得る。代替的には、産業に用いられる植物または他の高価値真核生物において、組み換えDNAまたは標的化されたゲノム再構成の導入は、改善された製品、例えばより少数の資源を要求するかまたは病原体に対して耐性である作物に至り得る。大スケールゲノム変化を成し遂げるための現行のテクノロジーはランダムなまたは確率的なプロセス、例えばトランスポゾンまたはレトロウイルスの使用に依拠し、他の所望のゲノム改変は相同組み換え戦略のみによって達成されている。

標的化されたかつ効率的なゲノム改変を達成するためのタンパク質の1つの魅力的なクラスは部位特異的リコンビナーゼ(SSR)である。SSRはゲノム改変のためのツールとして用いられた長い履歴を有する^10～13。SSRは遺伝子治療のための有望なツールとして考慮される。なぜなら、それらは、インデル、転座、他のDNA再構成、またはp53活性化を誘導し得る二本鎖切断の内生修復に依拠することなしに^15～18、定められた組み換え標的における精密な切断、鎖交換、およびDNAフラグメントの再連結を誘導し得るからである¹⁴。SSRによって触媒される反応は、相同組み換え修復のものを超過する効率で標的DNAフラグメントの直接的置き換え、挿入、または欠失をもたらし得る^14,19。

SSRは多くの利点をオファーするが、それらはそれらの対応する標的配列に対して強い自然の選好性を有するので、それらは広く用いられてはいない。SSRの認識配列は典型的には≧20塩基対であり、それゆえに、ヒトまたはモデル生物のゲノム上に生起することは非蓋然的である。さらに、SSRのネイティブな基質選好性は大規模な実験室操作または進化によってであっても容易には変改されない²⁰。この限定は、リコンビナーゼ標的をゲノム上に直接的に導入するためにまたはリコンビナーゼ標的にネイティブに似ている内生ゲノム配列を改変するためにPEを用いることによって克服される。リコンビナーゼタンパク質に対する細胞の爾後の暴露は、リコンビナーゼ標的(単数または複数)の位置付けおよび向きによって導かれる精密なかつ効率的なゲノム改変を許すであろう(図64)。

リコンビナーゼ標的のPEによって媒介される導入は、大スケールゲノム欠陥、例えば遺伝子喪失、逆位、もしくは重複、または染色体転座によって引き起こされる遺伝子疾患の処置にとって特に有用であり得る^1-7(表6)。例えば、ウィリアムズ・ボイレン症候群は染色体7上の24の欠失によって引き起こされる発達障害である21。現行では、生細胞における複数の遺伝子全体の効率的なかつ標的化された挿入のためのテクノロジーは存在しない(かかる全長遺伝子挿入をするPEのポテンシャルは現行では調査されているが、まだ確立されていない);しかしながら、PEによって挿入される標的におけるリコンビナーゼによって媒介される取り入れは、このおよび他の疾患の永久的な治癒への1つのアプローチをオファーする。加えて、リコンビナーゼ認識配列の標的化された導入は、トランスジェニック植物、動物研究モデル、バイオプロダクション細胞株、または他のカスタム真核細胞株の生成を包含する適用にとって高度に有能であり得る。例えば、PE特異的な標的におけるトランスジェニック植物のリコンビナーゼによって媒介されるゲノム再構成は、改善された特性を有する農作物を生成することのボトルネックの1つを克服し得る8,9。

いくつものSSRファミリーメンバーが特徴付けられ、それらの標的配列が記載されており、天然のおよび操作されたチロシンリコンビナーゼ(表7)、ラージセリンインテグラーゼ(表8)、セリンリゾルバーゼ(表9)、およびチロシンインテグラーゼ(表10)を包含する。増強されたゲノム取り入れ率を実証する改変された標的配列もまたいくつかのSSRについて記載されている^22～30。天然のリコンビナーゼに加えて、別物の特異性を有するプログラム可能なリコンビナーゼが開発されている^31～40。所望の適用に依存して、PEを用いて、これらの認識配列の1つ以上が、規定された位置付け、例えばセーフハーバー座位においてゲノム上に導入され得る^41～43。

例えば、ゲノム上の単一のリコンビナーゼ標的の導入は、DNAドナー鋳型との取り入れ的な組み換えをもたらすであろう(図64b)。ヒト細胞においてロバストに作動するセリンインテグラーゼは、遺伝子取り入れに特に良く適し得る^44,45。加えて、標的のアイデンティティーおよび向きに依存して、2つのリコンビナーゼ標的の導入は介在配列の欠失、介在配列の逆位、染色体転座、またはカセット交換をもたらし得る(図64c～f)。すでにリコンビナーゼ標的に密に似ている内生配列を選ぶことによって、完全なリコンビナーゼ標的を導入するために要求される編集の範囲は縮減されるであろう。

最後に、いくつかのリコンビナーゼは、ネイティブに生起する偽部位においてヒトまたは真核ゲノムに取り入れすることが実証されている^46-64。PE編集は、これらの天然の偽部位における取り入れ率を増強するために、または代替的には欲されないオフターゲット配列としての用をなし得る偽部位を消去するために、これらの座位を改変するために用いられ得る。

この報告は、PEを用いて真核ゲノム上にリコンビナーゼ標的配列を導入するための一般的な方法論を記載する。これの適用は無限に近い。ゲノム編集反応はCRISPR/Cas9タンパク質と逆転写酵素ドメインとのキメラ融合体の「プライム編集因子」による使用を意図され、これはカスタムのプライム編集ガイドRNA(PEgRNA)を利用する。さらに伸長して、Cas9ツールおよび相同組み換え修復(HDR)経路もまた、いくつかの技術を用いてインデル率を低下させることによって、DNA鋳型からリコンビナーゼ標的を導入するために有効利用され得る^65～67。ヒト細胞培養における概念実証実験が図65に示されている。
表6．大スケールゲノム改変にリンクした遺伝子疾患の例。

表7.チロシンリコンビナーゼおよびSSR標的配列

表8.大セリンインテグラーゼおよびSSR標的配列。

表9.セリンリゾルバーゼおよびSSR標的配列。

表10.チロシンインテグラーゼおよび標的配列。

例17において引用された参考文献
以下の参考文献の各々は例17において引用されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

例18－プライマー結合部位(PBS)中の3'トウループの組み込みはPEgRNA活性を改善する
さらにPE活性を改善するために、本発明者らは、3'伸長アームを有するPEgRNAの3'末にてトウループ配列を付加することを企図した。図71Aは、3'伸長アームを有する全体的な(generic)SpCas9 PEgRNAの例(上の分子)を提供する。次に、3'伸長アームは、RT鋳型(これは、その所望の編集を包含する)および分子の3'末にてプライマー結合部位(PBS)を含む。分子は、3つのU核酸塩基を含むポリ(U)配列(すなわち、5'-UUU-3')で終止する。

これに反して、図71Aの下部は、図71Aの上部と同じPEgRNA分子を示すが、ここで5'-GAAANNNNN-3'の9核酸塩基配列は、プライマー結合部位の3'末と末端ポリ(U)配列の5'末との間に挿入されている。この構造は、自身を180°まで後方へ折り畳み「トウループ」RNA構造を形成するが、ここで9核酸塩基挿入の5'-NNNNN-3'の配列はプライマー結合部位中の相補的な配列とアニールし、5'-GAAA-3'部分は180°のひねり(turn)を形成する。図71Aに描かれるトウループ配列の特色は、その場所において使用され得るトウループの範囲を限定も制限もする意図はない。さらに、トウループの配列は、プライマー結合部位の相補的な配列に依存するであろう。とは言え、本質的にはトウループ配列は、様々な態様において、180°を形成する第1配列部分、およびプライマー結合部位の部分に相補的な配列を有する第2配列部分を有していてもよい。

理論によって拘泥されないが、トウループ配列は、別様には可能性が十二分にあるものより(than would otherwise be possible)、プライマー結合部位が益々長くなるPEgRNAの使用をPEgRNAに可能にさせると考えられる。次に、より長いPBS配列は、PE活性を改善すると考えられる。PEgRNAのより具体的には、トウループのあり得る機能は、PBSを塞ぐか、または少なくともスペーサーと相互作用するPBSを最小化することである。PBSとスペーサーとの間の安定したヘアピン形成は、不活性なPEgRNAへ繋がり得る。トウループがないと、この相互作用は、PBSの長さ制限を要することになり得る。3'末トウループを使用してスペーサーとPBSとの間の相互作用を遮断または最小化することは、PE活性の改善へ繋がることもある。

例19－代替的な核酸鋳型および編集因子タンパク質構築物によるプライム編集
この例に先行して、プライム編集はPEgRNAを要求することが記載される。プライム編集への使用のための好適なPEgRNAの可能な構成を記載する例示の態様が、図3A(5'伸長アームを有するPEgRNA)、図3B(3'伸長アームを有するPEgRNA)、図3C(内部に伸長されたPEgRNA)、図3D(3'伸長アームを有し、プライマー結合部位、編集鋳型、相同アーム、ならびに任意の3'および5'修飾領域と、DNA合成鋳型として指示される領域とを含むPEgRNA)、および図3E(5’伸長アームを有し、プライマー結合部位、編集鋳型、相同アーム、ならびに任意の3'および5'修飾領域と、DNA合成鋳型として指示される領域とを含むPEgRNA)に図示されている。加えて、PEgRNA構造および組成は本願において発明を実施するための形態および至る所で鋭意に記載される。

この例は、PEgRNAの追加のデザインバリエーション、いくつかのケースでは、細胞外で丸ごとまたは部分的に化学合成されるPEgRNAを記載する。これらは、本明細書のプライム編集因子と併せて働くことが想定される。かかる代替的なデザインはプライム編集の種々の側面を改善し得、プライム編集によるより長いDNA配列の挿入、可能性としては増大した効率および/または忠実性で作動する代替的なポリメラーゼ(すなわち、逆転写酵素の代替)の使用、ならびにプライム編集を増強または拡大するための代替的なおよび/または追加のプライム編集因子タンパク質エフェクター構成要素の使用または動員を包含する。加えて、化学合成PEgRNAのPEgRNAの使用は、可能性としては、より安定であり、かつプライム編集効率および能力を増強する望ましい特色を所有する分子の生産に至り得る。

PEgRNAPEgRNAPEgRNAAのPEgRNAは、標的部位に組み込まれるべきである所望の編集された遺伝情報をコードする核酸鋳型としての用をなす。一側面において、PEgRNAは、伸長アームをsgRNAの5'端もしくは3’端どちらかに追加することによって(例えば、図3A、3B、3D、もしくは3Eの態様に示されているとおり)または類似の配列をsgRNA上の内部に挿入することによって(例えば、図3Cの態様に示されているとおり)生出される。伸長アームはDNA合成鋳型を含み、これはポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)によるssDNA産物をコードすることができ、かつこれは目当ての編集された遺伝情報を包含する。伸長アームは、napDNAbpによってニッキングされたゲノムDNA鎖にアニールするためのプライマー結合部位(PBS)と、カウンターパートDNA鎖を置き換えることによって内生DNA標的部位に組み込まれるようになる目当ての編集されたDNA鎖をコードするためのDNA合成鋳型とを含む。PEgRNAは、プラスミドDNAもしくはゲノム取り入れされたDNAカセットから細胞内で発現され得るか、またはそれらは細胞外でin vitro転写によってもしくは化学合成によって作られ得、爾後に細胞に送達され得る。特に化学合成による細胞外におけるPEgRNAの調製は、実質的にPEgRNAを改変するための機会をオファーする。本発明はプライム編集鋳型の代替的なデザインを記載する(図72)。

(A)ガイドRNAとは別個の分子として発現されるDNA合成鋳型(すなわち、プライム編集因子複合体(napDNAbp+ガイドRNA)にトランスで提供されるDNA合成鋳型。
本明細書に記載の種々の態様では、プライム編集はプログラム可能な標的化分子および編集をコードする分子両方としての用をなす単一のPEgRNAを利用する。この態様は3’伸長アームを有するPEgRNAについて図72(a)に図示されている。しかしながら、いくつかのケースでは、これは、特に、より複雑なPEgRNA分子、例えば大きい挿入をコードするものにとっては不利であり得る。これらのRNAは大規模な二次構造を含有し得、これがPEgRNA骨格構造およびCas9との相互作用に干渉し得る。代替的には、プライム編集はPEgRNAを2つの別個のRNA分子によって置換することによって実行され得る:図72(b)に図示されているとおりsgRNAおよびトランスプライム編集RNA鋳型(tPERT)である。sgRNAはCas9(またはより一般的にはnapDNAbp)を所望のゲノム標的部位へと標的化するための用をなし、tPERTは新たなDNA配列を標的座位に書き込むためにポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)によって用いられる。

一般的に、tPERTの単純な発現はPEgRNAと比較して低い編集効率に至る。しかしながら、トランスプライム編集の効率は、プライム編集因子タンパク質へのMS2コートタンパク質(MS2cp)の融合体(MS2cp-Cas9-RTを作るため)と併せたtPERT RNA上への1つ以上のMS2 RNAアプタマーの導入によって増強され得る。これはMS2 RNAアプタマーがMS2cpに結合することを許し、それによって、プライム編集因子複合体によってtPERT(これはDNA合成鋳型を含む)を編集の部位に共局在させる。アプタマー配列の逆転写を回避するために、MS2アプタマーは好ましくはtPERTの3’端に置かれる。

この例はMS2タグ付け技術を利用するが(プライム編集因子に融合されたMS2cpタンパク質とペアリングされたtPERTのMS2 RNAアプタマーを含む)、他のRNA-タンパク質動員システムが代替で用いられ得る。ここで想定される一般的な概念は、tPERTのDNA合成鋳型がRNA動員二次構造(例えば、MS2アプタマーのような特殊化したヘアピン)を含有するように改変され、その結果、tPERTが、tPERT分子上のRNA動員二次(second)構造を特異的に認識および結合するRNA結合タンパク質をさらに含む改変されたプライム編集因子融合タンパク質によって動員され得るということである。他のRNA-タンパク質動員ドメインの総説は当該技術分野において例えばJohansson et al.,“RNA recognition by the MS2 phage coat protein,”Sem Virol.,1997,Vol.8(3):176-185;Delebecque et al.,“Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies,”Science,2011,Vol.333:470-474;Mali et al.,“Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering,”Nat.Biotechnol.,2013,Vol.31:833-838;およびZalatan et al.,“Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds,”Cell,2015,Vol.160:339-350に記載されている。これらの夫々はそれらの全体が参照によって本願に組み込まれる。他のシステムは、PCPタンパク質を特異的に動員するPP7ヘアピンおよびComタンパク質を特異的に動員する「com」ヘアピンを包含する。Zalatan et al.を見よ。これらの周知の動員システムのいずれかは本明細書に記載のトランスプライム編集に使用され得る。

本tPERTトランスプライム編集システムの効率を試験した。His6挿入(18bp)の最高で20％の効率がHEK293T細胞のHEK3部位において達成された。単一の3’MS2アプタマー、13ntプライマー結合部位、および挿入配列と座位に対する34ntの相同性とを含有するRT鋳型を含有するtPERTを、PE2のN末端に融合されたMS2cpを含有する編集因子と併せて用いた。図73を見よ。トランスプライム編集の戦略は、PEgRNAのPEgRNAデザインに関連する複雑化に対処するポテンシャルを有し、プライム編集因子ニック部位からさらに遠くの距離におけるより大きい挿入、欠失、または編集を達成するためのより長いRT鋳型により適し得る。

(B)RNAおよびDNA合成鋳型を有する化学合成PEgRNA
代替的な核酸鋳型が化学合成PEgRNA上に用いられ得る(図72c)。例えば、合成PEgRNAはRNA/DNAハイブリッドとして構築され得、スペーサー配列およびsgRNA骨格がRNAヌクレオチドから成り、プライマー結合部位および合成鋳型(図72cにおいて3'伸長として示される)がDNAヌクレオチドから成る。これはDNA依存性DNAポリメラーゼが逆転写酵素の代わりにプライム編集因子上に用いられることを許し得る。それはsgRNA骨格配列を鋳型とするDNAの合成をもまた防止し得る。他のデザインでは、鋳型とされないヌクレオチドから成る化学的リンカーまたは他の好適なリンカー部分が、核酸編集鋳型(RNAまたはDNAから成る)をsgRNA骨格にテザリングするために用いられ得る。これはsgRNA骨格の連続したDNA重合を防止し得、より効率的な鋳型による合成を許す伸長のフレキシビリティーを許し得る。最後に、核酸合成鋳型の方向性が逆位させられ得、その結果、DNA重合が、それの方と対比してsgRNA骨格から別方向に進む。

(C)トランスで発現されるDNAポリメラーゼの動員
プライム編集の主な態様では、ポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素酵素)はnapDNAbp(例えば、Cas9ニッカーゼ)への融合体として発現される。代替的には、ポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)はトランスで発現され得、その活性が、MS2 RNAアプタマーおよびMS2コートタンパク質などの動員システム、または当該技術分野で公知の他の類似の動員システムを用いて編集部位に局在し得る。このシステムでは、PEgRNAはMS2アプタマーをsgRNA骨格ヘアピンの1つに包含するように改変され、ポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)はMS2cpへの融合タンパク質として発現される。napDNAbp(例えば、Cas9ニッカーゼ)は独立したポリペプチドとしてもまた発現される。このシステムは野生型M-MLV逆転写酵素について実証されており(図74)、他のRTバリアントに適用可能であるはずである。加えて、他のRNA-タンパク質相互作用またはタンパク質-タンパク質相互作用がRT動員に用いられ得る。
次の配列は例19に当てはまる:
tPERTの配列:

MS2 PEgRNAの配列:

タンパク質配列:

例20.プライム編集因子の分裂インテイン送達
この例は、別個のベクターによって細胞にプライム編集因子を送達するための手段として、プライム編集因子がインテインを用いて分裂され得るということを実証する。各ベクターはプライム編集因子融合タンパク質のある部分をコードする。この例は標準的なSpCas9(配列番号18)を含むPE融合タンパク質にフォーカスする。他のCas9タンパク質の分裂部位は対応する同じ部位であり得るか、または各異なるCas9タンパク質について最適化されることを必要とし得る。本例では、プライム編集因子をSpCas9(配列番号18)の残基1023および1024の間で分裂した。これは「1023/1024」分裂部位と言われる。

プライム編集因子(PE)はAAVパッケージング容量を超過する。よって、トランススプライシングNpuインテインを配列番号18のS. pyogenes Cas9残基1024に挿入することによってPEを分裂し、夫々が二元的AAVシステムの1つによってコードされる2つの別個のポリペプチドとしての分裂SpPEの送達を許すことが企図された。それは(1)ガイドカセット(単数または複数)および最小限の制御エレメントのための空間を容れながら、2つのAAVへのパッケージングを許す、(2)ネイティブなセリンからシステインへの変異は相対的に保存的であろう、(3)部位は、スプライシングが生起することを許すことが立体的に予測されるCas9の辺縁部の近くのフレキシブルなループである、そして(4)Cas9は(先には、この特定の分裂部位ではないが)このループにおいて循環置換によって首尾良く変改されているので、分裂部位1023/1024が選ばれた。

Npu分裂プライム編集因子が活性化であるかどうかを決定するために、HEK細胞を分裂編集因子をコードするプラスミドによってトランスフェクションし、それらが全長PE3の活性を再現するということを見出した。高スループット配列決定によって分析した。さらにその上、C末端エクステインの3つのネイティブなNpuアミノ末端残基は最も効率的にスプライシングすることが公知であるが、Cas9残基1024をネイティブにフランキングするものとは異なる。ネイティブなNpu残基によるこれらのCas9残基の置き換えは、プライム編集因子の活性を変改し得る。よって、Cas9にネイティブな「SEQ」からNpuインテイン「CFN」配列への変異がプライム編集の効率を変改するかどうかを決定した。「SEQ」残基は、全長に類似の効率でプライム編集を容易化し、インテイン分裂PEの半分同士が会合しプライム編集を媒介する能力があるということを示唆する。「CFN」への変異によるさらなる増大は見られず、我々が先にインテイン分裂塩基編集因子で観察したとおり、会合単独が分裂PE活性にとって十分であり得るということを示唆した。

会合した未スプライシングの編集因子は活性であり得るが、開始ステップの間の不完全なスプライシングからもたらされるプライム編集因子の立体性の撹乱が編集アウトカムに影響し得る。よって、1024-CFNをさらなる研究のために選んだ。なぜなら、それもまた全長PE3活性を再現するからである。

以下は1023/1024分裂のアミノ酸配列である。

1023/1024 N末端半分でのSpPE2分裂

1023/1024 C末端半分でのSpPE2分裂

二元的AAVシステムによってパッケージングされた(packages)プライム編集因子
Npuトランススプライシングインテインによって残基1023および1024の間で分裂されたプライム編集因子はAAV内にパッケージングされる(packages)ようになり、同じ様式で生じた類似のゲノムサイズの塩基編集因子のものと遜色ない高い力価を有する。

インビボのプライム編集
P0マウスへの脳室内注射によってAAV9によって送達された分裂SpPE3は、インビボの脳組織においてプライム編集を媒介する。GからTの位置+5におけるヌクレオチド置換(すなわち、ニック部位の5ヌクレオチド塩基下流かつPAM配列上)は、DNMT1のN末端の近くのPro＞Glnをコードする変異の組み入れをもたらす。この編集はインビボのプライム編集の実行可能性を実証し、編集された細胞に対するいずれかの選択圧を導入するとは考えられない(「+5」はニック部位の下流の+5位置を言う)。試験されたAAVアーキテクチャは全長MMLV RTとRNAse Hドメインを欠く短縮されたバリアントとを包含する。短縮された転写後制御エレメントW3をもまた評価した。なぜなら、それは、インビボのウイルスカセットからの発現を増大させることが示されているが、その重要性は塩基編集因子またはプライム編集因子コンテキストにおいては試験されていなかったからである。全長RTは短縮されたRTに優り、W3配列の追加は活性を改善するということが見出された。W3が存在するときの編集活性の増大は、プライム編集因子の発現がインビボでは限定されるということを指示し、細胞培養に対してインビボのプライム編集の別物の課題を実証する。

参考文献
Oakes,B.L.,Fellmann,C.et al.CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification.Cell.2019 Jan 10;176(1-2):254-267.e16.doi:10.1016/j.cell.2018.11.052.

例21.PE2フォーマットでのリンカー最適化
この例は、全てPE2に基づくいくつものバリアントプライム編集因子を構築した。PE2は次の配列および構造を有する:

本願において用いられる「PE2」は、次の構造を有するCas9(H840A)とバリアントMMLV RTとを含む融合タンパク質を含むPE複合体を言う:[NLS]-[Cas9(H840A)]-[リンカー]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)]+所望のPEgRNA。PE融合体は配列番号134のアミノ酸配列を有し、これは次のとおり示される:

M-MLV逆転写酵素(配列番号139)。

PE2リンカーは、SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS(配列番号127)である。

この実験では、PE2のリンカーを次の代わりのリンカーの1つによって置き換えた(または1つの場合にはリンカーなし):

図79は置き換えリンカー構築物の編集効率を示す。特に、データは、現行のリンカーによるPE2構築物(PE2として記されている。白色のボックス)の編集効率を、指示されている配列によって置き換えられたリンカーによる種々のバージョンと比較して、HEK3、EMX1、FANCF、RNF2座位において、トランジション、トランスバージョン、挿入、および欠失編集のための代表的なPEgRNAについて示す。置き換えリンカーは「1×SGGS」、「2×SGGS」、「3×SGGS」、「1×XTEN」、「リンカーなし」、「1×Gly」、「1×Pro」、「1×EAAAK」、「2×EAAAK」、および「3×EAAAK」と言われる。編集効率は棒グラフフォーマットでPE2の「対照」編集効率に対して相対的に測定される。PE2のリンカーはSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS(配列番号127)である。全ての編集はPE3システムという文脈でされた。すなわち、これはPE2編集構築物プラス最適な二次sgRNAニッキングガイドの追加を言う。

図80は、1×XTENリンカーが編集効率の増大を提供したということを示す。PE2に対して相対的な平均の～倍効力を取ることは、示されているグラフを生み、1×XTENリンカー配列の使用が編集効率を平均で1.14倍改善するということを指示している(n=15)。

例22.改善された活性を有するプライム編集因子ガイドRNA
種々の態様において、PEgRNAは標的DNA部位および編集依存的であることが蓋然的である。つまり、PEgRNAの配列は、標的DNA配列およびプライム編集によってそれに導入されようとする具体的な編集(例えば、欠失、挿入、逆位、置換)に依存するであろう。例えば、ある態様において、PEgRNAのプライマー結合部位(PBS)の3'のモチーフを取り付けるときには、PE融合タンパク質のポリメラーゼドメイン(例えば、逆転写酵素)との立体的衝突を防止するために、PBSおよびモチーフの間のリンカーが好ましい。しかしながら、そのリンカーの性質は各部位について異なり得る。例えば、同じリンカーが各部位に用いられた場合には、それはスペーサー配列に対する偶然の対形成によって偽性的に13nt PBSを16nt PBSにし得る。類似に、リンカーはPBSそれ自体に塩基対形成し得、その閉じ込めをもたらし、可能性としては活性を縮減する。そのため、PEまたはBE4などのタンパク質に基づく編集因子とは違って、2つのエレメントを接続する単一リンカー配列オプションは各構築物に有効ではなくあり得、部分的には、標的DNA配列および目当ての編集の配列に依存するであろう。

部分的には、例15(PEgRNAのデザインおよび操作)において提示されている情報に立脚して、この例は、PEgRNAになされた種々の構造改変を構築し、それから、他の側面の中でも編集機能に対するそれの効果を試験した。
非pol IIIプロモーターからのPEgRNAの発現

種々のPEgRNA発現システムを、PEgRNAを生成するそれらの能力について試験した。読み出しとしてFKBPからの102ヌクレオチド配列の挿入を用いた。

PEgRNAの転写はU6プロモーターなどの典型的な恒常的プロモーターによって導かれ得る。U6プロモーターはほとんどのケースではPEgRNAの転写を導くことに有効であるが、U6プロモーターはより長いPEgRNAまたはUリッチなRNAの転写を導くことにはあまり有効ではない。UリッチなRNAストレッチは転写の未成熟な終結を引き起こす。この例は、CMVプロモーターまたはU1プロモーターから発現されるガイドの編集アウトカムをU6プロモーターと比較した。これらのプロモーターは下で提供されるMASC ENEまたはPAN ENEなどの異なるターミネーター配列を要求する。編集の増大がpCMV/MASC-ENEシステムでは観察された。しかしながら、これらのガイドは配列の不完全な挿入をもたらしたが、U6プロモーターでは、完全な挿入がより低いレベルの編集において観察された。図81を見よ。データは、代替的な発現システムが長い挿入にとって有用であり得るという蓋然性を示唆している。

pCMV/MASC-ENE発現システムのヌクレオチド配列は次のとおり(5'から3'の方向)(モチーフの名称はそれが指す領域に直ちに先立って太字である):

PEgRNA骨格の改善

gRNA骨格のいくつもの構造改変をもまた試験した。これらのいずれも編集活性の有意な増大を示さなかった(3.30と比較してX軸の3.30.13から3.30.19において図82を見よ)。しかしながら、このデータは注意する価値がある2つの警告を有する。第1に、このガイドはすでに割と良く働いており、より有効でないガイドが試験される方が良かったであろう。第2に、HEK細胞では、トランスフェクションが割と効率的であり、トランスフェクションされるガイドRNAの量は、必要とされるものと比較して大過剰であるということが注意された(量を、～4～8倍縮減することは編集に対する効果を有さない)。これらの改善は、トランスフェクション効率がより低い他の細胞型で、またはより有効でないガイドによってのみ見られ得る。これらの変化の多くは、他の細胞株においてsgRNA活性を改善するための前例とされる。

図82の構築物の配列は次のとおりである:

末端モチーフが存在しないかまたは一続きのUで終わらない末端モチーフが存在するかどちらかであるところではいつも、転写物は次のHDVリボザイムを用いて終結させられたということに注意せよ:
GGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACAUGCUUCGGCAUGGCGAAUGGGAC [配列番号3923]

追加のRNAモチーフ
ある種のモチーフ、例えばPEgRNAの3'のHDVリボザイム、またはG四重鎖挿入、P1伸長、鋳型ヘアピン、およびテトラループサークルの詳細については、図82を見よ。これらはその性能を改善するためにPEgRNA上に導入され得る。

特に、この例は、プライマー結合部位の3'にtRNAモチーフを組み入れることの効果を試験した。このエレメントは複数の可能性ある機能ゆえに選ばれた:

(1)tRNAモチーフは非常に安定なRNAモチーフであり、そのため、可能性としてはPEgRNA分解を縮減し得る;

(2)MMLV RTは転写の間にウイルスゲノムをDNAに変換するときのプライマーとしてプロリル-tRNAを用いる。そのため、同じキャップがRTによって結合され得、PEによるPEgRNAの結合、RNA安定性を改善し、PBSをゲノム部位の近接する近位に再び持って来て、可能性としては活性をもまた改善するのではないかと思われた。

これらの構築物では、tRNAのP1(図84を見よ)を伸長した。P1はtRNAの第1のステム/塩基対形成エレメントを言う(図84を見よ)。これは、PEgRNAからのその除去をもたらすであろうP1の5’のtRNAのRNAsePによって媒介される切断を防止するために必要であると信じられた。

このデザインでは、tRNAおよびPBSの間の短い3ntリンカーおよび伸長されたP1を有するプロリル-tRNA(コドンCGG)を用いた。種々のtRNAデザインを試験し、編集効率をtRNAキャップを有さないPEgRNAと比較して試験した。図83(HEK3遺伝子の編集を標的化したPE実験を図示する。ニック部位に対して相対的に位置+1における10nt挿入の挿入を特異的に標的化し、PE3を用いた)、図85(FANCF遺伝子の編集を標的化したPE実験を図示する。ニック部位に対して相対的に位置+5におけるGからTの変換を特異的に標的化し、PE3構築物を用いた)、および図86(HEK3遺伝子の編集を標的化したPE実験を図示する。ニック部位に対して相対的に位置+1における71nt FLAGタグ挿入の挿入を特異的に標的化し、PE3構築物を用いた)の比較データを見よ。tRNA修飾されたPEgRNAを未修飾のPEgRNA対照に対して試験した。

UGG/CGGは用いられたコドンを言い、数は追加されたP1伸長の長さを言い、長は8ntリンカーを指示し、指定なしは3ntリンカーである。

データは、tRNAの組み入れがより短いPBSの使用を可能化し得るということを示唆している。これは蓋然的には追加の活性改善をもたらすであろう。RNF2のケースでは、用いられたリンカーが、スペーサーに対する改善されたPBS結合と活性のもたらされる逓減とをもたらしたということが可能/蓋然的である。

使用されたいくつかの配列:

HEK3+1 FLAG-タグ挿入、プロリル-tRNA{UGG} P1 ext 5nt、リンカー3nt

GGCCCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUGGAGGAAGCAGGGCUUCCUUUCCUCUGCCAUCACUUAUCGUCGUCAUCCUUGUAAUCCGUGCUCAGUCUGUCUGGCGGGGCUCGUUGGUCUAGGGGUAUGAUUCUCGCUUCGGGUGCGAGAGGUCCCGGGUUCAAAUCCCGGACGAGCCCCGCCUUUU[配列番号3902]

FANCF+5G→Tプロリル-tRNA{CGG} P1 ext 5nt、リンカー3nt

GGAAUCCCUUCUGCAGCACCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCGGAAAAGCGAUCAAGGUGCUGCAGAAGGGAUCUGGCGGGGCUCGUUGGUCUAGGGGUAUGAUUCUCGCUUCGGGUGCGAGAGGUCCCGGGUUCAAAUCCCGGACGAGCCCCGCCUUUU[配列番号3903]

HEK3++1 10nt挿入,、プロリル-tRNA{UGG} P1 ext 5nt、リンカー3nt

GGCCCAGACUGAGCACGUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGGACCGAGUCGGUCCUCUGCCAUCAAAGCUUCGACCGUGCUCAGUCUUCUGCUCGAGGCGGGGCUCGUUGGUCUAGGGGUAUGAUUCUCGCUUCGGGUGCGAGAGGUCCCGGGUUCAAAUCCCGGACGAGCCCCGCCUCGAGCUUUU[配列番号3904]

図85および86のデータに報告された配列は以下のとおりである:

例23.CDKL5および鎌状赤血球症を修正するためのプライム編集の使用
1412delA変異を有するCDKL5のマウスモデルをデザインするためのPEの使用
CDKL5欠損症障害(CDD)は神経変性疾患であり、最も多くの場合にはサイクリン依存性キナーゼ様5遺伝子の自然突然変異によって引き起こされる。症状は早期小児期に現れ、痙攣発作、不規則な睡眠パターン、胃腸ストレス、および発達遅滞を包含する。1412delAを包含するCDDを引き起こすいくつかの変異は塩基編集によって修正され得ない。しかしながら、プライム編集は全ての塩基から塩基の変化、欠失、および挿入を精密に修正するポテンシャルを有する。1412delA変異へのフォーカスによって、変異を抱くマウスニューロン細胞株(N2A)を確立することを期待して、この例は変異を挿入することができるpegRNAをデザインおよび試験した。これは、変異を修正する可能性として治療学的なpegRNAを大規模スクリーニングすることを許すであろう。究極的なゴールは、1412delA変異を有するCDDマウスモデルまで進展して、治療学的効果を評価する能力があることである。CDDの現行のマウスモデルはヒト化アレルを有さない。しかしながら、pegRNAの最適化がHEK293T細胞においても進行中である。図87および88はpegRNAが1412Adelを組み入れるN2A細胞におけるパイロットスクリーンからの結果であり、プライマー結合部位(PBS)長さおよび逆転写酵素(RT)鋳型長さについての詳細を有する(インデルありおよびなしで示されている)。

鎌状赤血球症(SCA)を処置するためのPEの使用
鎌状赤血球症(SCA)は劣性血液障害であり、β-グロビン遺伝子の位置6におけるグルタミン酸からバリンの変異によって引き起こされる。結果は鎌状赤血球であり、これらは不良な酸素輸送体であり、凝集をしやすい。凝集の症状は生命を脅かし得る。先に、D. LiuラボはDNAプラスミドトランスフェクションによるプライム編集を用いてHEK293T細胞のSCA座位の組み入れおよび修正両方を示す能力があった。造血幹細胞(HSC)はDNAプラスミドトランスフェクションによって編集することが困難であるので、この例はタンパク質およびmRNAヌクレオフェクションによってHSCにおいてPE3システムを試験した。図89は、健康なHSCのβ-グロビン遺伝子の近位(proxy)座位およびHEK3における編集の結果であり、編集因子対pegRNAおよびニッキングgRNAの濃度を変えている。

mRNAヌクレオフェクションプロトコール:
編集因子対ガイドの比([編集因子]対[ガイド]比または編集因子:ガイド比)を調整することによって、プロトコールを改善した。

ニッキングガイドプロトスペーサー配列は:CCTTGATACCAACCTGCCCAであった。

pegRNA配列は:
CATGGTGCACCTGACTCCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAGACTTCTCTTCAGGAGTCAGGTGCACTTTであった。

1．CD34+細胞を融解し、X-Vivo15培地においてサイトカイン(SCF、Flt3、およびTPO)によって24hrに渡って予備刺激する。播種密度100万細胞/mL。

2．次の日に(24hr後に)、CD34+細胞(1×105)をアスピレーションし、PBSによって1回洗浄し(遠心は300gで10minに渡ってRTで行う)、P3溶液(Lonza)に再懸濁する(条件当たり20ul)。

3．フード内で、2ugのSpPE2 mRNA、pegRNAおよびsgRNAの組み合わせた1ugを氷上の無菌PCRストリップ上で組み合わせる。体積を20ulに調整する(P3溶液中の細胞+mRNA&gRNAミックス)。

4．細胞懸濁液を20uLのLonza4D 16ウェルストリップにピペッティングし、プログラムDS130でエレクトロポレーションする。

5．エレクトロポレーション後に10から15min待ち、80uLのX-Vivo10+サイトカイン培地を細胞懸濁液に追加し、サイトカインを有する予温したX-Vivo10培地に移入する。

6．細胞をエレクトロポレーションの72時間後に収穫し、細胞回復をチェックし、バルク集団およびソーティングされたCD34+およびCD34+90+集団についても遺伝子型判定する。
野生型CDKL5タンパク質(受託番号NP_001032420)(アイソフォーム1-ヒト)
MKIPNIGNVM NKFEILGVVG EGAYGVVLKC RHKETHEIVA IKKFKDSEEN EEVKETTLRE LKMLRTLKQE NIVELKEAFR RRGKLYLVFE YVEKNMLELL EEMPNGVPPE KVKSYIYQLI KAIHWCHKND IVHRDIKPEN LLISHNDVLK LCDFGFARNL SEGNNANYTE YVATRWYRSP ELLLGAPYGK SVDMWSVGCI LGELSDGQPL FPGESEIDQL FTIQKVLGPL PSEQMKLFYS NPRFHGLRFP AVNHPQSLER RYLGILNSVL LDLMKNLLKL DPADRYLTEQ CLNHPTFQTQ RLLDRSPSRS AKRKPYHVES STLSNRNQAG KSTALQSHHR SNSKDIQNLS VGLPRADEGL PANESFLNGN LAGASLSPLH TKTYQASSQP GSTSKDLTNN NIPHLLSPKE AKSKTEFDFN IDPKPSEGPG TKYLKSNSRS QQNRHSFMES SQSKAGTLQP NEKQSRHSYI DTIPQSSRSP SYRTKAKSHG ALSDSKSVSN LSEARAQIAE PSTSRYFPSS CLDLNSPTSP TPTRHSDTRT LLSPSGRNNR NEGTLDSRRT TTRHSKTMEE LKLPEHMDSS HSHSLSAPHE SFSYGLGYTS PFSSQQRPHR HSMYVTRDKV RAKGLDGSLS IGQGMAARAN SLQLLSPQPG EQLPPEMTVA RSSVKETSRE GTSSFHTRQK SEGGVYHDPH SDDGTAPKEN RHLYNDPVPR RVGSFYRVPS PRPDNSFHEN NVSTRVSSLP SESSSGTNHS KRQPAFDPWK SPENISHSEQ LKEKEKQGFF RSMKKKKKKS QTVPNSDSPD LLTLQKSIHS ASTPSSRPKE WRPEKISDLQ TQSQPLKSLR KLLHLSSASN HPASSDPRFQ PLTAQQTKNS FSEIRIHPLS QASGGSSNIR QEPAPKGRPA LQLPDGGCDG RRQRHHSGPQ DRRFMLRTTE QQGEYFCCGD PKKPHTPCVP NRALHRPISS PAPYPVLQVR GTSMCPTLQV RGTDAFSCPT QQSGFSFFVR HVMREALIHR AQVNQAALLT YHENAALTGK

野生型CDKL5タンパク質(受託番号NP_001310218)(アイソフォーム2-ヒト)
MKIPNIGNVM NKFEILGVVG EGAYGVVLKC RHKETHEIVA IKKFKDSEEN EEVKETTLRE LKMLRTLKQE NIVELKEAFR RRGKLYLVFE YVEKNMLELL EEMPNGVPPE KVKSYIYQLI KAIHWCHKND IVHRDIKPEN LLISHNDVLK LCDFGFARNL SEGNNANYTE YVATRWYRSP ELLLGAPYGK SVDMWSVGCI LGELSDGQPL FPGESEIDQL FTIQKVLGPL PSEQMKLFYS NPRFHGLRFP AVNHPQSLER RYLGILNSVL LDLMKNLLKL DPADRYLTEQ CLNHPTFQTQ
RLLDRSPSRS AKRKPYHVES STLSNRNQAG KSTALQSHHR SNSKDIQNLS VGLPRADEGL PANESFLNGN LAGASLSPLH TKTYQASSQP GSTSKDLTNN NIPHLLSPKE AKSKTEFDFN IDPKPSEGPG TKYLKSNSRS QQNRHSFMES SQSKAGTLQP NEKQSRHSYI DTIPQSSRSP SYRTKAKSHG ALSDSKSVSN LSEARAQIAE PSTSRYFPSS CLDLNSPTSP TPTRHSDTRT LLSPSGRNNR NEGTLDSRRT TTRHSKTMEE LKLPEHMDSS HSHSLSAPHE SFSYGLGYTS PFSSQQRPHR HSMYVTRDKV RAKGLDGSLS IGQGMAARAN SLQLLSPQPG EQLPPEMTVARSSVKETSRE GTSSFHTRQK SEGGVYHDPH SDDGTAPKEN RHLYNDPVPR RVGSFYRVPS PRPDNSFHEN NVSTRVSSLP SESSSGTNHS KRQPAFDPWK SPENISHSEQ LKEKEKQGFF RSMKKKKKKS QTVPNSDSPD LLTLQKSIHS ASTPSSRPKE WRPEKISDLQ TQSQPLKSLR KLLHLSSASN HPASSDPRFQ PLTAQQTKNS FSEIRIHPLS QASGGSSNIR QEPAPKGRPA LQLPGQMDPG WHVSSVTRSA TEGPSYSEQL GAKSGPNGHP YNRTNRSRMP NLNDLKETAL

例24.非糖尿病性慢性腎臓病の処置のために病原性のAOL1アレルを標的化するためのプライム編集の使用
この例は、腎疾患を処置またはそれを発生する蓋然性を縮減するためのプライム編集への使用のための、病原性のAPOL1アレルを標的化することができるPEgRNAをデザインした。

末期腎不全(ESKD)は今や米国の50万超の個人を冒す成長していく問題である。ESKDを有する患者をケアするコストは現行では年当たり400億ドル超である。米国では、アフリカ系血統の対象がESKDを発生するであろう蓋然性はアフリカ家系なしのアメリカ人よりも4から5倍高い。これらの事実は、アフリカ系血統を有するU.S.集団の12～13％とアフリカ系アメリカ人であるU.S.透析患者の40％との間の相違に反映されている。肥満および代謝症候群などの腎疾患リスク因子の流行は、この問題の大きさは増大するのみであろうということを示唆している。

進行性の腎臓病の大多数について、特定の治療はない。いくつかの型の慢性腎疾患進行は特定の薬剤による血圧コントロールによって低速化され得るが、腎臓病医はどの患者が応答するであろうかを正確には予測し得ない。その上、首尾良い処置は典型的には進行を低速化させるが、それは疾患を防止も疾患進行を停止させもしない。

最近では、アポリポタンパク質L1(APOL1)のタンパク質配列を変改する特定の遺伝子バリアントは進行性の腎臓病に関連するということが決定された。驚くべきことに、APOL1腎臓病バリアントは、高血圧関連末期腎疾患(H-ESRD)、巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)、およびHIV関連腎症(HIVAN)を包含する腎臓病の複数の異なる型に対して主要なインパクトを有する。これらのバリアントAPOL1アレルを有する個人は7～30倍増大したリスクを腎臓病について有する。これらのAPOL1リスクアレルの高い度数に基づくと、350万よりも多くのアフリカ系アメリカ人が蓋然的には高リスクAPOL1遺伝子型を有する。高リスク遺伝子型なしのアフリカ系アメリカ人はヨーロッパ家系のアメリカ人と比較してわずかな余分なリスクしか有さない。

APOL1遺伝子のバリアントが腎疾患を引き起こすという証拠にもかかわらず、その産物APOL1の生物学または腎臓におけるその役割については、非常にわずかしか公知ではない。APOL1はトリパノソーマに対する耐性において定められた役割を有し、G1およびG2バリアントはアフリカにおいては普通になっているように見える。なぜなら、それらはアフリカ睡眠病を引き起こすトリパノソーマの形態からの防護を付与するからである。

1つ以上のAPOL1リスクアレルを有する患者の腎臓病のための治療の必要がなお存在する。これらは、このおよび他の対象集団において多大な罹患率および死亡率を引き起こし、高い経済的インパクトを有する。

この例は、3つの例示のPEgRNAデザインオプションを提供する。APOL1欠陥アレルを修正するためにプライム編集に用いられ得る特定の例示の標的配列に基づく。

PEgRNA 1

APOL1アレルrs73885319(p.S342G)のPEgRNAをデザインする。これは有疾患個体のG→A修正を表す。標的配列は5-GGAGTCAAGCTCACGGATGTGGCCCCTGTA(GからA)GCTTCTTTCTTGTGCTGGATGTAGTCTACCT-3である。

プロトスペーサー(上の太字)はAAGCTCACGGATGTGGCCCCである。選択されたPEはSaCas9(D10A)を含む。

プライマー結合部位は以下であってもよい:

GTGGCCCC

TGTGGCCCC

ATGTGGCCCC

GATGTGGCCCC

GGATGTGGCCCC

CGGATGTGGCCCC

ACGGATGTGGCCCC

CACGGATGTGGCCCC

TCACGGATGTGGCCCC

CTCACGGATGTGGCCCC。

RT鋳型は以下であってもよい:

AAGAAGCTTACA

AAAGAAGCTTACA

GAAAGAAGCTTACA

AGAAAGAAGCTTACA

AAGAAAGAAGCTTACA

CAAGAAAGAAGCTTACA

ACAAGAAAGAAGCTTACA

CACAAGAAAGAAGCTTACA

GCACAAGAAAGAAGCTTACA

AGCACAAGAAAGAAGCTTACA

CAGCACAAGAAAGAAGCTTACA

CCAGCACAAGAAAGAAGCTTACA

TCCAGCACAAGAAAGAAGCTTACA

ATCCAGCACAAGAAAGAAGCTTACA。

ニックを入れる鋳型は、GCTTTGATTCGTACACGAGGであってもよい。

PEgRNA 2

APOL1アレルrs60910145のPEgRNAをデザインする。これは有疾患個体におけるG→T修正を表す。

プロトスペーサーはGCTGGAGGAGAAGCTAAACAである。選択されるPEは、SpCas9(D10A)-NGを含む。

プライマー結合部位は以下であってもよい:

GAAGCTAA

AGAAGCTAA

GAGAAGCTAA

GGAGAAGCTAA

AGGAGAAGCTAA

GAGGAGAAGCTAA

GGAGGAGAAGCTAA

TGGAGGAGAAGCTAA

CTGGAGGAGAAGCTAA

GCTGGAGGAGAAGCTAA。

RT鋳型は以下であってもよい(Cでは終われない):

AGAATGT

GAGAATGT

TGAGAATGT

TTGAGAATGT

GTTGAGAATGT

TGTTGAGAATGT

TTGTTGAGAATGT

ATTGTTGAGAATGT

TATTGTTGAGAATGT

TTATTGTTGAGAATGT

ATTATTGTTGAGAATGT

AATTATTGTTGAGAATGT

TAATTATTGTTGAGAATGT

ATAATTATTGTTGAGAATGT。

ニックを入れる鋳型は以下であってもよい:

CCTGTGGTCACAGTTCTTGG

CCACAGGGCAGGGCAGCCAC。

PEgRNA 3

APOL1アレルrs71785313のPEgRNAをデザインする。これは次のとおり挿入を表す:ATTCTCAACAA[挿入:TAATTA]TAAGATTC。

プロトスペーサーは以下:TCTCAACAATAAGATTCTGCであり得る。

PEはSaKKH-PE2を含む。

プライマー結合部位は以下であってもよい:

TTCTCAAC

ATTCTCAAC

CATTCTCAAC

ACATTCTCAAC

AACATTCTCAAC

AAACATTCTCAAC

TAAACATTCTCAAC

CTAAACATTCTCAAC

GCTAAACATTCTCAAC

AGCTAAACATTCTCAAC。

RT鋳型は以下であってもよい:

AATCTTATAATTATT

GAATCTTATAATTATT

AGAATCTTATAATTATT

CAGAATCTTATAATTATT

GCAGAATCTTATAATTATT

TGCAGAATCTTATAATTATT

CTGCAGAATCTTATAATTATT

CCTGCAGAATCTTATAATTATT

GCCTGCAGAATCTTATAATTATT

CGCCTGCAGAATCTTATAATTATT

CCGCCTGCAGAATCTTATAATTATT

TCCGCCTGCAGAATCTTATAATTATT

GTCCGCCTGCAGAATCTTATAATTATT

GGTCCGCCTGCAGAATCTTATAATTATT。

ニックを入れる鋳型は以下であってもい:

CCTGTGGTCACAGTTCTTGG

CCACAGGGCAGGGCAGCCAC。
本開示を通して言及された他の参考文献
以下の参考文献は各々、これら全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる。

態様
以下の態様は本開示の範囲内にある。しかも、本開示は、列挙された態様の1以上からの1以上の限定、要素、節、および記述用語(descriptive terms)が、本セクション中に列挙された別の態様中へ導入される、すべてのバリエーション、組み合わせ、および順列を包括する。例えば、列挙された別の態様に従属する、列挙されたいずれの態様も、同じ基本態様に従属する、本セクション中に列挙されたいずれか他の態様中に見出される1以上の限定を包含するように修飾され得る。要素が、例として、マーカッシュ群形式において列挙されたものとして提示されている場合、要素の各下位群もまた開示されており、いずれの要素(単数または複数)も群から除去され得る。一般に、本開示、または本開示の側面が、具体的な要素および/または特色を含むものとして見なされる場合、本発明のある態様または本発明の側面は、かかる要素および/または特色からなるか、あるいは実質的にそれらからなると理解されるはずである。用語「含むこと(comprising)」および「含有すること(containing)」が、オープンであることを意図し、追加の要素またはステップの包含を容認することにもまた留意する。範囲が与えられるとき、エンドポイントも包含される。しかも、別段の指示がないか、またはそれとは別に、文脈および当業者の理解から明らかでない場合に限り、範囲として表現された値は、いずれか具体的な値、または本発明の異なる態様において述べられた範囲内の部分範囲を、文脈が明確に別段の指図をしない限り範囲の下限の単位の10倍まで、想定し得る。
群1．態様1～212
1．融合タンパク質であって、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む。
2．態様1の融合タンパク質であって、融合タンパク質が、伸長されたガイドRNAの存在下において、プライム標的にプライムされた逆転写によるゲノム編集を実行することができる。
3．態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpがニッカーゼ活性を有する。
4．態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpがCas9タンパク質またはそのバリアントである。
5．態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
6．態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
7．態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpが:Cas9、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2C3、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する。
8．態様1の融合タンパク質であって、融合タンパク質が伸長されたガイドRNAと複合体化したときに標的DNA配列に結合することができる。
9．態様8の融合タンパク質であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含む。
10．態様8の融合タンパク質であって、伸長されたガイドRNAと複合体化した融合タンパク質の結合がRループを形成する。
11．態様10の融合タンパク質であって、Rループが、(i)伸長されたガイドRNAと標的鎖とを含むRNA-DNAハイブリッド、および(ii)相補的な非標的鎖を含む。
12．態様11の融合タンパク質であって、相補的な非標的鎖がニッキングされて、遊離の3’端を有する逆転写酵素プライム配列を形成する。
13．態様2の融合タンパク質であって、伸長されたガイドRNAが(a)ガイドRNAおよび(b)ガイドRNAの5'もしくは3’端またはガイドRNAの分子内の位置付けにおけるRNA伸長を含む。
14．態様13の融合タンパク質であって、RNA伸長が(i)所望のヌクレオチド変化を含む逆転写鋳型配列、(ii)逆転写プライマー結合部位、および(iii)任意にリンカー配列を含む。
15．態様14の融合タンパク質であって、逆転写鋳型配列が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。
16．態様13の融合タンパク質であって、RNA伸長が、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。
17．態様15の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップがニック部位に隣接する内生DNA配列にハイブリダイズし、それによって所望のヌクレオチド変化を組み入れる。
18．態様15の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップが、遊離の5'端を有しかつニック部位に隣接する内生DNA配列に取って代わる。
19．態様18の融合タンパク質であって、5'端を有する内生DNA配列が細胞によって切除される。
20．態様18の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。
21．態様14の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化がPAM配列の約-4から+10の間もしくはPAM配列の約-10から+20の間もしくはPAM配列の約-20から+40の間もしくはPAM配列の約-30から+100の間である編集窓上に組み入れされるか、または所望のヌクレオチド変化がニック部位の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100ヌクレオチド下流に組み入れされる。
22．態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpが、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％同一であるアミノ酸配列を含む。
23．態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpが、配列番号2-10のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含む。
24．態様1の融合タンパク質であって、逆転写酵素が配列番号11-17のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
25．態様1の融合タンパク質であって、逆転写酵素が、配列番号11-17のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含む。
26．態様1の融合タンパク質であって、逆転写酵素が、レトロウイルスまたはレトロトランスポゾンからの天然に存在する逆転写酵素である。
27．先の態様のいずれか1つの融合タンパク質であって、融合タンパク質が構造NH₂-[napDNAbp]-[逆転写酵素]-COOH;またはNH₂-[逆転写酵素]-[napDNAbp]-COOHを含み、「]-[」の夫々のものが任意のリンカー配列の存在を指示する。
28．態様27の融合タンパク質であって、リンカー配列が配列番号37-47のアミノ酸配列を含む。
29．態様14の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化が、1ヌクレオチド変化、1つ以上のヌクレオチドの挿入、または1つ以上のヌクレオチドの欠失である。
30．態様29の融合タンパク質であって、挿入または欠失が少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、少なくとも41、少なくとも42、少なくとも43、少なくとも44、少なくとも45、少なくとも46、少なくとも47、少なくとも48、少なくとも49、または少なくとも50である。
31．ガイドRNAと少なくとも1つのRNA伸長とを含む伸長されたガイドRNA。
32．態様1の伸長されたガイドRNAであって、RNA伸長が、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置の位置である。
33．態様31の伸長されたガイドRNAであって、伸長されたガイドRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。
34．態様33の伸長されたガイドRNAであって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズしてRNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。
35．態様31の伸長されたガイドRNAであって、少なくとも1つのRNA伸長が、(i)逆転写鋳型配列、(ii)逆転写プライマー結合部位、および(iii)任意にリンカー配列を含む。
36．態様35の伸長されたガイドRNAであって、RNA伸長が、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。
37．態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写鋳型配列が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。
38．態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写プライマー結合部位配列が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。
39．態様35の伸長されたガイドRNAであって、任意のリンカー配列が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。
40．態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写鋳型配列が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。
41．態様40の伸長されたガイドRNAであって、一本鎖DNAフラップが、ニッキングされた標的DNA配列上の5'端を有する内生一本鎖DNAを押し除け、内生一本鎖DNAがニック部位の下流において直ちに隣接する。
42．態様41の伸長されたガイドRNAであって、遊離の5'端を有する内生一本鎖DNAが細胞によって切除される。
43．態様41の伸長されたガイドRNAであって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が、所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。
44．態様31の伸長されたガイドRNAであって、配列番号18-36のヌクレオチド配列、または配列番号18～36のいずれか1つとの少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％もしくは少なくとも98％もしくは少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
45．態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写鋳型配列が、内生DNA標的と少なくとも80％または85％または90％または95％または99％同一であるヌクレオチド配列を含む。
46．態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。
47．態様35の伸長されたガイドRNAであって、任意のリンカー配列が、長さが少なくとも1ヌクレオチド、または少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、または少なくとも15ヌクレオチドである。
48．態様1～30のいずれか1つの融合タンパク質と伸長されたガイドRNAとを含むことを含む複合体。
49．態様48の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、ガイドRNAと、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置におけるRNA伸長とを含む。
50．態様48の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。
51．態様50の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。
52．態様49の複合体であって、少なくとも1つのRNA伸長が、(i)逆転写鋳型配列、(ii)逆転写プライマー結合部位、および(iii)任意にリンカー配列を含む。
53．態様48の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、配列番号18-36のヌクレオチド配列、または配列番号18-36のいずれか1つとの少なくとも85％、もしくは少なくとも90％、もしくは少なくとも95％、もしくは少なくとも98％、もしくは少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
54．態様52の複合体であって、逆転写鋳型配列が、内生DNA標的との少なくとも80％または85％または90％または95％または99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
55．態様52の複合体であって、逆転写プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。
56．napDNAbpおよび伸長されたガイドRNAを含むことを含む複合体。
57．態様56の複合体であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼである。
58．態様56の複合体であって、napDNAbpが、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
59．態様57の複合体であって、napDNAbpが、配列番号2-10のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
60．態様57の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、ガイドRNAと、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置におけるRNA伸長とを含む。
61．態様57の複合体であって、伸長されたガイドRNAがnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。
62．態様61の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、スペーサー配列が標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。
63．態様61の複合体であって、RNA伸長が、(i)逆転写鋳型配列、(ii)逆転写プライマー結合部位、および(iii)任意にリンカー配列を含む。
64．態様57の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、配列番号18-36のヌクレオチド配列、または配列番号18-36のいずれか1つとの少なくとも85％、もしくは少なくとも90％、もしくは少なくとも95％、もしくは少なくとも98％、もしくは少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
65．態様63の複合体であって、逆転写鋳型配列が、内生DNA標的と少なくとも80％または85％または90％または95％または99％同一であるヌクレオチド配列を含む。
66．態様63の複合体であって、逆転写プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。
67．態様63の複合体であって、任意のリンカー配列が、長さが少なくとも1ヌクレオチド、または少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、または少なくとも15ヌクレオチドである。
68．態様1～30のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
69．態様68のポリヌクレオチドを含むベクター。
70．態様1～30のいずれかの融合タンパク質と融合タンパク質のnapDNAbpに結合した伸長されたガイドRNAとを含む細胞。
71．態様48～67のいずれか1つの複合体を含む細胞。
72．(i)態様1～30のいずれかの融合タンパク質、態様48-67の複合体、態様68のポリヌクレオチド、または態様69のベクター;および(ii)薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
73．(i)態様48～67の複合体、(ii)トランスで提供される逆転写酵素;および(iii)薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
74．キットであって:(i)態様1～30のいずれか1つの融合タンパク質をコードする核酸配列;および(ii)(i)の配列の発現を駆動するプロモーターを含む核酸構築物を含む。
75．所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列に組み入れるための方法であって、方法が:
(i)融合タンパク質および伸長されたガイドRNAを含む複合体と二本鎖DNA配列を接触させ、融合タンパク質がnapDNAbpおよび逆転写酵素を含み、伸長されたガイドRNAが所望のヌクレオチド変化を含む逆転写鋳型配列を含むこと;
(ii)非標的鎖上において二本鎖DNA配列にニッキングし、それによって3'端を有する遊離の一本鎖DNAを生成すること;
(iii)遊離の一本鎖DNAの3'端を逆転写鋳型配列にハイブリダイズさせ、それによって逆転写酵素ドメインをプライムすること;
(iv)3'端からDNAの鎖を重合し、それによって所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを生成すること;
(v)カットされた部位に隣接する内生DNA鎖を一本鎖DNAフラップによって置き換え、それによって所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列に組み入れること、
を含む。
76．態様75の方法であって、(v)置き換えるステップが:(i)一本鎖DNAフラップをカットされた部位に隣接する内生DNA鎖にハイブリダイズさせて、配列ミスマッチを生出すること;(ii)内生DNA鎖を切り出すこと;および(iii)ミスマッチを修復して、所望のヌクレオチド変化をDNAの両方の鎖に含む所望の産物を形成すること、を含む。
77．態様76の方法であって、所望のヌクレオチド変化が1ヌクレオチド置換、欠失、または挿入である。
78．態様77の方法であって、1ヌクレオチド置換がトランジションまたはトランスバージョンである。
79．態様76の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)GからTの置換、(2)GからAの置換、(3)GからCの置換、(4)TからGの置換、(5)TからAの置換、(6)TからCの置換、(7)CからGの置換、(8)CからTの置換、(9)CからAの置換、(10)AからTの置換、(11)AからGの置換、または(12)AからCの置換である。
80．態様76の方法であって、所望のヌクレオチド(nucleoid)変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変換する。
81．態様76の方法であって、所望のヌクレオチド変化が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの挿入または欠失である。
82．態様76の方法であって、所望のヌクレオチド変化が疾患関連遺伝子を修正する。
83．態様82の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。
84．態様82の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。
85．態様76の方法であって、napDNAbpが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、Cas9ニッカーゼ(nCas9)、またはヌクレアーゼ活性Cas9である。
86．態様76の方法であって、napDNAbpが配列番号2のアミノ酸配列を含む。
87．態様76の方法であって、napDNAbpが、配列番号2-10のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
88．態様76の方法であって、逆転写酵素が配列番号11-17のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
89．態様76の方法であって、逆転写酵素ドメインが、配列番号11-17のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
90．態様76の方法であって、伸長されたガイドRNAが、ガイドRNAの5'もしくは3'端または分子内の位置付けにおけるRNA伸長を含み、RNA伸長が逆転写鋳型配列を含む。
91．態様90の方法であって、RNA伸長が、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。
92．態様76の方法であって、伸長されたガイドRNAが、配列番号18-36からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
93．標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって:
(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびnapDNAbpを標的座位へと標的化するガイドRNAとDNA分子を接触させ、ガイドRNAが少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む逆転写酵素(RT)鋳型配列を含むこと;
(ii)標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成すること;
(iii)暴露された3'端をRT鋳型配列にハイブリダイズさせて逆転写をプライムすること;
(vi)逆転写酵素によって、RT鋳型配列に基づく少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを合成すること;および
(v)少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を対応する内生DNA上に組み込み、それによって、標的座位においてDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入すること、
を含む。
94．態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化がトランジションを含む。
95．態様94の方法であって、トランジションが:(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択される。
96．態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化がトランスバージョンを含む。
97．態様96の方法であって、トランスバージョンが、(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択される。
98．態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。
99．態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの挿入または欠失を含む。
100．態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が疾患関連遺伝子の修正を含む。
101．態様100の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。
102．態様100の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。
103．態様93の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9またはそのバリアントである。
104．態様93の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)もしくはCas9ニッカーゼ(nCas9)またはそのバリアントである。
105．態様93の方法であって、napDNAbpが配列番号2のアミノ酸配列を含む。
106．態様93の方法であって、napDNAbpが、配列番号2-10のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
107．態様93の方法であって、逆転写酵素がトランスで導入される。
108．態様93の方法であって、napDNAbpが逆転写酵素への融合体を含む。
109．態様93の方法であって、逆転写酵素が配列番号11～17のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
110．態様93の方法であって、逆転写酵素が、配列番号11～17のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
111．態様93の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、ヌクレアーゼによってDNA鎖へニックを入れることを含む。
112．態様111の方法であって、ヌクレアーゼがnapDNAbpであるか、napDNAbpの融合ドメインとして提供されるか、またはトランスで提供される。
113．態様93の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、DNA鎖を化学的薬剤と接触させることを含む。
114．態様93の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、複製エラーを導入することを含む。
115．態様93の方法であって、DNA分子をnapDNAbpおよびガイドRNAと接触させるステップがRループを形成する。
116．態様115の方法であって、暴露された3’端が形成されるDNA鎖がRループ上にある。
117．態様93の方法であって、ガイドRNAが、逆転写酵素(RT)鋳型配列を含む伸長された部分を含む。
118．態様117の方法であって、伸長された部分が、ガイドRNAの3’端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置にある。
119．態様93の方法であって、ガイドRNAがさらにプライマー結合部位を含む。
120．態様93の方法であって、ガイドRNAがさらにスペーサー配列を含む。
121．態様93の方法であって、RT鋳型配列が、対応する内生DNAに対して相同的である。
122．プライム標的にプライムされた逆転写によって標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって標的座位におけるDNA分子上に所望のヌクレオチド変化を組み込むことを含む。
123．態様122の方法であって、RT鋳型が、ガイドRNAの3'端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置付けに位置付けられる。
124．態様122の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、トランジション、トランスバージョン、挿入、もしくは欠失、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。
125．請求項122の方法であって、所望のヌクレオチド変化が:(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択されるトランジションを含む。
126．請求項122の方法であって、所望のヌクレオチド変化が:(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択されるトランスバージョンを含む。
127．態様122の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。
128．態様31～47のいずれか1つの伸長されたガイドRNAをコードするポリヌクレオチド。
129．態様128のポリヌクレオチドを含むベクター。
130．態様129のベクターを含む細胞。
131．態様1-30のいずれかの融合タンパク質であって、逆転写酵素がエラーを起こしやすい逆転写酵素である。
132．プライム標的にプライムされた逆転写によって標的座位におけるDNA分子に変異導入するための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびエラーを起こしやすい逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、変異導入された一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、変異導入された一本鎖DNAを標的座位におけるDNA分子上に組み込むことを含む。
133．態様132の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
134．態様132の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
135．態様132の方法であって、napDNAbpが配列番号18-25のアミノ酸配列を含む。
136．態様132の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。
137．態様132の方法であって、(b)プライム標的にプライムされた逆転写を行うステップが、ガイドRNA上のプライマー結合部位へのアニーリングによって逆転写をプライムすることができる標的座位における3'端プライマー結合配列を生成することを含む。
138．健康な数の反復トリヌクレオチドを含む健康な配列によって標的DNA分子上のトリヌクレオチド反復拡大変異を置き換えるための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)置き換え配列を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させ、前記融合タンパク質が導入すること;(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、置き換え配列を含む一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的座位におけるDNA分子上に一本鎖DNAを組み込むことを含む。
139．態様138の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
140．態様138の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
141．態様138の方法であって、napDNAbpが配列番号18～25のアミノ酸配列を含む。
142．態様138の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。
143．態様138の方法であって、(b)プライム標的にプライムされた逆転写を行うステップが、ガイドRNA上のプライマー結合部位へのアニーリングによって逆転写をプライムすることができる標的座位における3’端プライマー結合配列を生成することを含む。
144．態様138の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がハンチントン病、脆弱X症候群、またはフリードライヒ運動失調症に関連する。
145．態様138の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がCAGトリプレットの繰り返し単位を含む。
146．態様138の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がGAAトリプレットの繰り返し単位を含む。
147．プライム編集によって標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に機能部分を組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)機能部分をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と機能部分とを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
148．態様147の方法であって、機能部分がペプチドタグである。
149．態様148の方法であって、ペプチドタグがアフィニティータグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、または蛍光タグである。
150．態様148の方法であって、ペプチドタグが:AviTag(配列番号245);Cタグ(配列番号246);カルモジュリンタグ(配列番号247);ポリグルタミン酸タグ(配列番号248);Eタグ(配列番号249);FLAGタグ(配列番号250);HAタグ(配列番号251);Hisタグ(配列番号252-262);Mycタグ(配列番号263);NEタグ(配列番号264);Rho1D4タグ(配列番号265);Sタグ(配列番号266);SBPタグ(配列番号267);Softag-1(配列番号268);Softag-2(配列番号269);Spotタグ(配列番号270);Strepタグ(配列番号271);TCタグ(配列番号272);Tyタグ(配列番号273);V5タグ(配列番号274);VSVタグ(配列番号275);およびXpressタグ(配列番号276)からなる群から選択される。
151．態様148の方法であって、ペプチドタグが:AU1エピトープ(配列番号278);AU5エピトープ(配列番号279);バクテリオファージT7エピトープ(T7タグ)(配列番号280);ブルータングウイルスタグ(Bタグ)(配列番号281);E2エピトープ(配列番号282);ヒスチジンアフィニティータグ(HAT)(配列番号283);HSVエピトープ(配列番号284);ポリアルギニン(Argタグ)(配列番号285);ポリアスパラギン酸(Aspタグ)(配列番号286);ポリフェニルアラニン(Pheタグ)(配列番号287);S1タグ(配列番号288);Sタグ(配列番号289);およびVSV-G(配列番号290)からなる群から選択される。
152．態様147の方法であって、機能部分が免疫エピトープである。
153．態様152の方法であって、免疫エピトープが:破傷風トキソイド(配列番号396);ジフテリア毒素変異体CRM197(配列番号398);ムンプス免疫エピトープ1(配列番号400);ムンプス免疫エピトープ2(配列番号402);ムンプス免疫エピトープ3(配列番号404);風疹ウイルス(配列番号406);ヘマグルチニン(配列番号408);ノイラミニダーゼ(配列番号410);TAP1(配列番号412);TAP2(配列番号414);クラスI HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号416);クラス I HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号418);クラスII HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号420);クラスII HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号422);ヘマグルチニンエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号424);ノイラミニダーゼエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号426)からなる群から選択される。
154．態様147の方法であって、機能部分が目当てのタンパク質の局在を変改する。
155．態様147の方法であって、機能部分が分解タグであり、その結果、目当てのタンパク質の分解速度が変改される。
156．態様155の方法であって、分解タグ。
157．態様147の方法であって、機能部分が低分子結合ドメインである。
158．態様157の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号488のFKBP12である。
159．態様157の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号489のFKBP12-F36Vである。
160．態様157の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号492～494のシクロフィリンである。
161．態様157の方法であって、低分子結合ドメインが目当ての2つ以上のタンパク質上に組み入れされる。
162．態様161の方法であって、目当ての2つ以上のタンパク質が低分子に接触することによって二量体化し得る。
163．態様157の方法であって、低分子が:

からなる群から選択される低分子の二量体である。
164．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質に免疫エピトープを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)免疫エピトープをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と免疫エピトープとを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
165．態様164の方法であって、免疫エピトープが:破傷風トキソイド(配列番号396);ジフテリア毒素変異体CRM197(配列番号398);ムンプス免疫エピトープ1(配列番号400);ムンプス免疫エピトープ2(配列番号402);ムンプス免疫エピトープ3(配列番号404);風疹ウイルス(配列番号406);ヘマグルチニン(配列番号408);ノイラミニダーゼ(配列番号410);TAP1(配列番号412);TAP2(配列番号414);クラスI HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号416);クラスI HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号418);クラスII HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号420);クラスII HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号422);ヘマグルチニンエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号424);ノイラミニダーゼエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号426)からなる群から選択される。
166．態様164の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
167．態様164の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
168．態様164の方法であって、napDNAbpが配列番号18～25のアミノ酸配列を含む。
169．態様164の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。
170．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に低分子二量体化ドメインを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)低分子二量体化ドメインをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)免疫エピトープをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と低分子二量体化ドメインとを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
171．態様170の方法であって、さらに、目当ての第2のタンパク質に対して方法を行うことを含む。
172．態様171の方法であって、目当ての第1のタンパク質および目当ての第2のタンパク質が、前記タンパク質の夫々の二量体化ドメインに結合する低分子の存在下において二量体化する。
173．態様170の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号488のFKBP12である。
174．態様170の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号489のFKBP12-F36Vである。
175．態様170の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号492～494のシクロフィリンである。
176．態様170の方法であって、低分子が:

からなる群から選択される低分子の二量体である。
177．態様170の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
178．態様170の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
179．態様170の方法であって、napDNAbpが配列番号18-25のアミノ酸配列を含む。
180．態様170の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。
181．プライム編集を用いてタンパク質上にペプチドタグまたはエピトープを組み入れる方法であって:タンパク質をコードする標的ヌクレオチド配列を、ペプチドタグをコードする第2のヌクレオチド配列をそれに挿入するように構成されたプライム編集因子構築物と接触させて、組み換えヌクレオチド配列をもたらすことを含み、その結果、ペプチドタグおよびタンパク質が融合タンパク質として組み換えヌクレオチド配列から発現される。
182．態様181の方法であって、ペプチドタグがタンパク質の精製および/または検出に用いられる。
183．態様181の方法であって、ペプチドタグが、ポリヒスチジン(例えば、HHHHHH)、FLAG(例えば、DYKDDDDK)、V5(例えば、GKPIPNPLLGLDST)、GCN4、HA(例えば、YPYDVPDYA)、Myc(例えばEQKLISEED)、GSTなどである。
184．態様181の方法であって、ペプチドタグが、配列番号245-290からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
185．態様181の方法であって、ペプチドタグがリンカーによってタンパク質に融合される。
186．態様181の方法であって、融合タンパク質が次の構造を有し:[タンパク質]-[ペプチドタグ]または[ペプチドタグ]-[タンパク質]、「]-[」が任意のリンカーを表す。
187．態様181の方法であって、リンカーが配列番号127、165-176、446、453、および767-769のアミノ酸配列を有する。
188．態様181の方法であって、プライム編集因子構築物が、配列番号18-25のヌクレオチド配列を含むPEgRNAを含む。
189．態様181の方法であって、PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、伸長アームがペプチドタグをコードする逆転写酵素鋳型を含む。
190．態様181の方法であって、PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、伸長アームがペプチドタグをコードする逆転写酵素鋳型を含む。
191．プライム編集によって標的ヌクレオチド配列によってコードされるPRNP上に1つ以上の防護性変異を組み入れることによって、プリオン病を防止またはその進行を停止させる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)防護性変異をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、ミスフォールディングに対して耐性である防護性変異を含むPRNPをコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
192．態様191の方法であって、プリオン病がヒトプリオン病である。
193．態様191の方法であって、プリオン病が動物プリオン病である。
194．態様192の方法であって、プリオン病がクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、またはクールー病である。
195．態様193の方法であって、プリオン病が牛海綿状脳症(BSEまたは「狂牛病」)、慢性消耗病(CWD)、スクレイピー、伝達性ミンク脳症、ネコ海綿状脳症、および有蹄類海綿状脳症である。
196．態様191の方法であって、野生型PRNPアミノ酸配列が配列番号291-292である。
197．態様191の方法であって、方法が、配列番号293-323からなる群から選択される改変されたPRNPアミノ酸配列をもたらし、前記改変されたPRNPタンパク質がミスフォールディングに対して耐性である。
198．態様191の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
199．態様191の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
200．態様191の方法であって、napDNAbpが配列番号18-25のアミノ酸配列を含む。
201．態様191の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。
202．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのRNA上にリボヌクレオチドモチーフまたはタグを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、リボヌクレオチドモチーフまたはタグを含む目当ての修飾されたRNAをコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
203．態様202の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが検出部分である。
204．態様202の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが目当てのRNAの発現レベルに影響する。
205．態様202の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが目当てのRNAの輸送または細胞下レベル位置付けに影響する。
206．態様202の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが、SV40 1型、SV40 2型、SV40 3型、hGH、BGH、rbGlob、TK、MALAT1 ENE-mascRNA、KSHV PAN ENE、Smbox/U1 snRNAボックス、U1 snRNA 3'ボックス、tRNA-リジン、broccoliアプタマー、spinachアプタマー、mangoアプタマー、HDVリボザイム、およびm6Aからなる群から選択される。
207．態様202の方法であって、PEgRNAが配列番号18～25を含む。
208．態様202の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
209．態様202の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
210．態様202の方法であって、napDNAbpが配列番号18～25のアミノ酸配列を含む。
211．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上の機能部分を組み入れまたは欠失する方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分またはその欠失をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)機能部分またはその欠失をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質および機能部分またはその除去を含む改変されたタンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生じ、機能部分がタンパク質の修飾状態または局在状態を変改する。
212．態様211の方法であって、機能部分が、目当てのタンパク質のリン酸化、ユビキチン化、グリコシル化、脂質修飾、ヒドロキシル化、メチル化、アセチル化、クロトニル化、SUMO化状態を変改する。
群2．態様213～424
213．融合タンパク質であって、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含む。
214．態様213の融合タンパク質であって、融合タンパク質が、プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)の存在下においてプライム編集を実行することができる。
215．態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpがニッカーゼ活性を有する。
216．態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpがCas9タンパク質またはそのバリアントである。
217．態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
218．態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
219．態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpが:Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する。
220．態様213の融合タンパク質であって、融合タンパク質がPEgRNAと複合体化したときに標的DNA配列に結合することができる。
221．態様220の融合タンパク質であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含む。
222．態様220の融合タンパク質であって、PEgRNAと複合体化した融合タンパク質の結合がRループを形成する。
223．態様222の融合タンパク質であって、Rループが、(i)PEgRNAと標的鎖とを含むRNA-DNAハイブリッドおよび(ii)相補的な非標的鎖を含む。
224．態様223の融合タンパク質であって、相補的な非標的鎖がニッキングされて、遊離の3’端を有するプライム配列を形成する。
225．態様214の融合タンパク質であって、PEgRNAが(a)ガイドRNAおよび(b)ガイドRNAの5'もしくは3’端またはガイドRNAの分子内の位置付けにおける伸長アームを含む。
226．態様225の融合タンパク質であって、伸長アームが(i)所望のヌクレオチド変化を含むDNA合成鋳型配列および(ii)プライマー結合部位を含む。
227．態様226の融合タンパク質であって、DNA合成鋳型配列が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。
228．態様225の融合タンパク質であって、伸長アームが、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。
229．態様227の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップが、ニック部位に隣接する内生DNA配列にハイブリダイズし、それによって所望のヌクレオチド変化を組み入れる。
230．態様227の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップが、遊離の5'端を有しかつニック部位に隣接する内生DNA配列に取って代わる。
231．態様230の融合タンパク質であって、5'端を有する内生DNA配列が細胞によって切除される。
232．態様230の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。
233．態様226の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化がPAM配列の約-4から+10の間もしくはPAM配列の約-10から+20の間もしくはPAM配列の約-20から+40の間もしくはPAM配列の約-30から+100の間である編集窓上に組み入れされるか、または所望のヌクレオチド変化がニック部位の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100ヌクレオチド下流に組み入れされる。
234．態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpが、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2のアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
235．態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpが、配列番号2-10のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
236．態様213の融合タンパク質であって、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、配列番号11-17のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
237．態様213の融合タンパク質であって、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、配列番号11-17のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
238．態様213の融合タンパク質であって、ポリメラーゼがレトロウイルスまたはレトロトランスポゾンからの天然に存在する逆転写酵素である。
239．先の態様のいずれか1つの融合タンパク質であって、融合タンパク質が構造NH₂-[napDNAbp]-[ポリメラーゼ]-COOH;またはNH₂-[ポリメラーゼ]-[napDNAbp]-COOHを含み、「]-[」の夫々のものが任意のリンカー配列の存在を指示する。
240．態様239の融合タンパク質であって、リンカー配列が配列番号37-47のアミノ酸配列を含む。
241．態様226の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化が1ヌクレオチド変化、1つ以上のヌクレオチドの挿入、または1つ以上のヌクレオチドの欠失である。
242．態様241の融合タンパク質であって、挿入または欠失が、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、少なくとも41、少なくとも42、少なくとも43、少なくとも44、少なくとも45、少なくとも46、少なくとも47、少なくとも48、少なくとも49、または少なくとも50である。
243．ガイドRNAとDNA合成鋳型を含む少なくとも1つの核酸伸長アームとを含むPEgRNA。
244．態様241のPEgRNAであって、核酸伸長アームがガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置の位置であり、核酸伸長アームがDNAまたはRNAである。
245．態様242のPEgRNAであって、PEgRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。
246．態様245のPEgRNAであって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズしてRNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。
247．態様243のPEgRNAであって、少なくとも1つの核酸伸長アームが(i)DNA合成鋳型および(ii)プライマー結合部位を含む。
248．態様247のPEgRNAであって、核酸伸長アームが、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。
249．態様247のPEgRNAであって、DNA合成鋳型が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。
250．態様247のPEgRNAであって、プライマー結合部位が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。
251．態様243のPEgRNAであって、さらに、リンカー、ステムループ、ヘアピン、トウループ、アプタマー、またはRNA-タンパク質動員ドメインからなる群から選択される少なくとも1つの追加の構造を含む。
252．態様247のPEgRNAであって、DNA合成鋳型が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。
253．態様252のPEgRNAであって、一本鎖DNAフラップが、ニッキングされた標的DNA配列上の5'端を有する内生一本鎖DNAを押し除け、内生一本鎖DNAがニック部位の下流において直ちに隣接する。
254．態様253のPEgRNAであって、遊離の5'端を有する内生一本鎖DNAが細胞によって切除される。
255．態様253のPEgRNAであって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。
256．態様243のPEgRNAであって、配列番号18-36のヌクレオチド配列、または配列番号18-36のいずれか1つとの少なくとも85％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも98％、または少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
257．態様247のPEgRNAであって、DNA合成鋳型が、内生DNA標的と少なくとも80％または85％または90％または95％または99％同一であるヌクレオチド配列を含む。
258．態様247のPEgRNAであって、プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。
259．態様251のPEgRNAであって、少なくとも1つの追加の構造がPEgRNAの3'または5'端に位置付けられる。
260．態様213-242のいずれか1つの融合タンパク質とPEgRNAとを含むことを含む複合体。
261．態様260の複合体であって、PEgRNAが、ガイドRNAと、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置における核酸伸長アームとを含む。
262．態様260の複合体であって、PEgRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。
263．態様262の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。
264．態様261の複合体であって、少なくとも1つの核酸伸長アームが(i)DNA合成鋳型および(ii)プライマー結合部位を含む。
265．態様260の複合体であって、PEgRNAが、配列番号18～36のヌクレオチド配列、または配列番号18～36のいずれか1つとの少なくとも85％、もしくは少なくとも90％、もしくは少なくとも95％、もしくは少なくとも98％、もしくは少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
266．態様264の複合体であって、DNA合成鋳型が、内生DNA標的と少なくとも80％または85％または90％または95％または99％同一であるヌクレオチド配列を含む。
267．態様264の複合体であって、プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。
268．napDNAbpおよびPEgRNAを含むことを含む複合体。
269．態様268の複合体であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼである。
270．態様268の複合体であって、napDNAbpが配列番号2のアミノ酸配列を含む。
271．態様268の複合体であって、napDNAbpが、配列番号2-10のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
272．態様268の複合体であって、PEgRNAが、ガイドRNAと、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置における核酸伸長アームとを含む。
273．態様268の複合体であって、PEgRNAがnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。
274．態様272の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、PEgRNAのスペーサー配列が標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。
275．態様273の複合体であって、核酸伸長アームが(i)DNA合成鋳型および(ii)プライマー結合部位を含む。
276．態様269の複合体であって、PEgRNAが、配列番号18-36のヌクレオチド配列、または配列番号18-36のいずれか1つとの少なくとも85％、もしくは少なくとも90％、もしくは少なくとも95％、もしくは少なくとも98％、もしくは少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
277．態様276の複合体であって、DNA合成鋳型が、内生DNA標的と少なくとも80％または85％または90％または95％または99％同一であるヌクレオチド配列を含む。
278．態様276の複合体であって、プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。
279．態様276の複合体であって、PEgRNAが、さらに、リンカー、ステムループ、ヘアピン、トウループ、アプタマー、またはRNA-タンパク質動員ドメインからなる群から選択される少なくとも1つの追加の構造を含む。
280．態様213～242のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
281．態様280のポリヌクレオチドを含むベクター。
282．態様213～242のいずれかの融合タンパク質と融合タンパク質のnapDNAbpに結合したPEgRNAとを含む細胞。
283．態様260～279のいずれか1つの複合体を含む細胞。
284．医薬組成物であって:(i)態様213～242のいずれかの融合タンパク質、態様260～279の複合体、態様68のポリヌクレオチド、または態様69のベクター;および(ii)薬学的に許容される賦形剤を含む。
285．医薬組成物であって:(i)態様260～279の複合体、(ii)トランスで提供されるポリメラーゼ;および(iii)薬学的に許容される賦形剤を含む。
286．キットであって:(i)態様213～242のいずれか1つの融合タンパク質をコードする核酸配列;および(ii)(i)の配列の発現を駆動するプロモーターを含む核酸構築物を含む。
287．所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列に組み入れるための方法であって、方法が:
(i)融合タンパク質およびPEgRNAを含む複合体と二本鎖DNA配列を接触させ、融合タンパク質がnapDNAbpおよびポリメラーゼを含み、PEgRNAが所望のヌクレオチド変化を含むDNA合成鋳型とプライマー結合部位とを含むこと;
(ii)二本鎖DNA配列にニッキングし、それによって、3'端を有する遊離の一本鎖DNAを生成すること;
(iii)遊離の一本鎖DNAの3'端をプライマー結合部位にハイブリダイズさせ、それによってポリメラーゼをプライムすること;
(iv)プライマー結合部位にハイブリダイズした3'端からDNAの鎖を重合し、それによって、DNA合成鋳型に対して相補的であるかつ所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを生成すること;
(v)カットされた部位に隣接する内生DNA鎖を一本鎖DNAフラップによって置き換え、それによって所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列に組み入れること、
を含む。
288．態様287の方法であって、(v)置き換えるステップが:(i)一本鎖DNAフラップをカットされた部位に隣接する内生DNA鎖にハイブリダイズさせて、配列ミスマッチを生出すること;(ii)内生DNA鎖を切り出すこと;および(iii)ミスマッチを修復して、所望のヌクレオチド変化をDNAの両方の鎖に含む所望の産物を形成すること、を含む。
289．態様288の方法であって、所望のヌクレオチド変化が1ヌクレオチド置換、欠失、または挿入である。
290．態様289の方法であって、1ヌクレオチド置換がトランジションまたはトランスバージョンである。
291．態様288の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)GからTの置換、(2)GからAの置換、(3)GからCの置換、(4)TからGの置換、(5)TからAの置換、(6)TからCの置換、(7)CからGの置換、(8)CからTの置換、(9)CからAの置換、(10)AからTの置換、(11)AからGの置換、または(12)AからCの置換である。
292．態様288の方法であって、所望のヌクレオチド(nucleoid)変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変換する。
293．態様288の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの挿入または欠失である。
294．態様288の方法であって、所望のヌクレオチド変化が疾患関連遺伝子を修正する。
295．態様294の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;トリヌクレオチド反復障害;プリオン病;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。
296．態様294の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。
297．態様287の方法であって、napDNAbpが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、Cas9ニッカーゼ(nCas9)、またはヌクレアーゼ活性Cas9である。
298．態様287の方法であって、napDNAbpが、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2のアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
299．態様287の方法であって、napDNAbpが、配列番号2～10のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
300．態様287の方法であって、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、配列番号11～17のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
301．態様287の方法であって、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、配列番号11～17のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
302．態様287の方法であって、PEgRNAが核酸伸長アームをガイドRNAの3'もしくは5'端または分子内の位置付けに含み、伸長アームがDNA合成鋳型配列およびプライマー結合部位を含む。
303．態様302の方法であって、伸長アームが、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。
304．態様287の方法であって、PEgRNAが、配列番号18～36からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
305．標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって:
(i)DNA分子を、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびnapDNAbpを標的座位へと標的化するPEgRNAと接触させ、PEgRNAが、少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む逆転写酵素(RT)鋳型配列とプライマー結合部位とを含むことと;
(ii)標的座位におけるDNA鎖の暴露された3'端を形成すること;
(iii)暴露された3'端をプライマー結合部位にハイブリダイズさせて逆転写をプライムすること;
(iv)逆転写酵素によって、RT鋳型配列に基づく少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを合成すること;および
(v)少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を対応する内生DNA上に組み込み、それによって、標的座位においてDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入すること、
を含む。
306．態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化がトランジションを含む。
307．態様306の方法であって、トランジションが、(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択される。
308．態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化がトランスバージョンを含む。
309．態様308の方法であって、トランスバージョンが、(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択される。
310．態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(9)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。
311．態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの挿入または欠失を含む。
312．態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が疾患関連遺伝子の修正を含む。
313．態様312の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;トリヌクレオチド反復障害;プリオン病;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。
314．態様312の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。
315．態様305の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9またはそのバリアントである。
316．態様305の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)もしくはCas9ニッカーゼ(nCas9)またはそのバリアントである。
317．態様305の方法であって、napDNAbpが、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
318．態様305の方法であって、napDNAbpが、配列番号2～10のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
319．態様305の方法であって、逆転写酵素がトランスで導入される。
320．態様305の方法であって、napDNAbpが逆転写酵素への融合体を含む。
321．態様305の方法であって、逆転写酵素が配列番号11～17のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
322．態様305の方法であって、逆転写酵素が、配列番号11～17のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
323．態様305の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、ヌクレアーゼによってDNA鎖へニックを入れることを含む。
324．態様323の方法であって、ヌクレアーゼがトランスで提供される.
325．態様305の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、DNA鎖を化学的薬剤と接触させることを含む。
326．態様305の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、複製エラーを導入することを含む。
327．態様305の方法であって、DNA分子をnapDNAbpおよびガイドRNAと接触させるステップがRループを形成する。
328．態様327の方法であって、暴露された3’端が形成されるDNA鎖がRループ上にある。
329．態様315の方法であって、PEgRNAが、逆転写酵素(RT)鋳型配列とプライマー結合部位とを含む伸長アームを含む。
330．態様329の方法であって、伸長アームが、ガイドRNAの3'端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置にある。
331．態様305の方法であって、PEgRNAが、さらに、リンカー、ステムループ、ヘアピン、トウループ、アプタマー、またはRNA-タンパク質動員ドメインからなる群から選択される少なくとも1つの追加の構造を含む。
332．態様305の方法であって、PEgRNAがさらに相同アームを含む。
333．態様305の方法であって、RT鋳型配列が、対応する内生DNAに対して相同的である。
334．プライム標的にプライムされた逆転写によって標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって標的座位におけるDNA分子上に所望のヌクレオチド変化を組み込むことを含む。
335．態様334の方法であって、RT鋳型が、ガイドRNAの3'端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置付けに位置付けられる。
336．態様334の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、トランジション、トランスバージョン、挿入、もしくは欠失、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。
337．態様334の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択されるトランジションを含む。
338．請求項334の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択されるトランスバージョンを含む。
339．請求項334の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。
340．態様243～259のいずれか1つのPEgRNAをコードするポリヌクレオチド。
341．態様340のポリヌクレオチドを含むベクター。
342．態様341のベクターを含む細胞。
343．態様213の融合タンパク質であって、ポリメラーゼがエラーを起こしやすい逆転写酵素である。
344．プライム標的にプライムされた逆転写によって標的座位におけるDNA分子に変異導入するための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびエラーを起こしやすい逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、変異導入された一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、変異導入された一本鎖DNAを標的座位におけるDNA分子上に組み込むことを含む。
345．いずれかの先行する態様の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
346．いずれかの先行する態様の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
347．態様344の方法であって、napDNAbpが配列番号18-25のアミノ酸配列を含む。
348．態様344の方法であって、ガイドRNAが配列番号26-36を含む。
349．態様344の方法であって、(b)プライム標的にプライムされた逆転写を行うステップが、ガイドRNA上のプライマー結合部位へのアニーリングによって逆転写をプライムすることができる標的座位における3'端プライマー結合配列を生成することを含む。
350．健康な数の反復トリヌクレオチドを含む健康な配列によって標的DNA分子上のトリヌクレオチド反復拡大変異を置き換えるための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含む融合タンパク質ならびに(ii)置き換え配列を含むDNA合成鋳型とプライマー結合部位とを含むPEgRNAと接触させること;(b)プライム編集を行なって、置き換え配列を含む一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的座位におけるDNA分子上に一本鎖DNAを組み込むことを含む。
351．態様350の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
352．態様350の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
353．態様350の方法であって、napDNAbpが配列番号18～25のアミノ酸配列を含む。
354．態様350の方法であって、ガイドRNAが配列番号26～36を含む。
355．態様350の方法であって、(b)プライム編集を行うステップが、ガイドRNA上のプライマー結合部位へのアニーリングによってポリメラーゼをプライムすることができる標的座位における3'端プライマー結合配列を生成することを含む。
356．態様350の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がハンチントン病、脆弱X症候群、またはフリードライヒ運動失調症に関連する。
357．態様350の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がCAGトリプレットの繰り返し単位を含む。
358．態様350の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がGAAトリプレットの繰り返し単位を含む。
359．プライム編集によって標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に機能部分を組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードするDNA合成鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)機能部分をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と機能部分とを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
360．態様359の方法であって、機能部分がペプチドタグである。
361．態様360の方法であって、ペプチドタグがアフィニティータグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープもしくは免疫エピトープタグ、または蛍光タグである。
362．態様360の方法であって、ペプチドタグが:AviTag(配列番号245);Cタグ(配列番号246);カルモジュリンタグ(配列番号247);ポリグルタミン酸タグ(配列番号248);Eタグ(配列番号249);FLAGタグ(配列番号250);HAタグ(配列番号251);Hisタグ(配列番号252-262);Mycタグ(配列番号263);NEタグ(配列番号264);Rho1D4タグ(配列番号265);Sタグ(配列番号266);SBPタグ(配列番号267);Softag-1(配列番号268);Softag-2(配列番号269);Spotタグ(配列番号270);Strepタグ(配列番号271);TCタグ(配列番号272);Tyタグ(配列番号273);V5タグ(配列番号274);VSVタグ(配列番号275);およびXpressタグ(配列番号276)からなる群から選択される。
363．態様360の方法であって、ペプチドタグが:AU1エピトープ(配列番号278);AU5エピトープ(配列番号279);バクテリオファージT7エピトープ(T7タグ)(配列番号280);ブルータングウイルスタグ(Bタグ)(配列番号281);E2エピトープ(配列番号282);ヒスチジンアフィニティータグ(HAT)(配列番号283);HSVエピトープ(配列番号284);ポリアルギニン(Argタグ)(配列番号285);ポリアスパラギン酸(Aspタグ)(配列番号286);ポリフェニルアラニン(Pheタグ)(配列番号287);S1タグ(配列番号288);Sタグ(配列番号289);およびVSV-G(配列番号290)からなる群から選択される。
364．態様359の方法であって、機能部分が免疫エピトープである。
365．態様364の方法であって、免疫エピトープが:破傷風トキソイド(配列番号396);ジフテリア毒素変異体CRM197(配列番号398);ムンプス免疫エピトープ1(配列番号400);ムンプス免疫エピトープ2(配列番号402);ムンプス免疫エピトープ3(配列番号404);風疹ウイルス(配列番号406);ヘマグルチニン(配列番号408);ノイラミニダーゼ(配列番号410);TAP1(配列番号412);TAP2(配列番号414);クラスI HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号416);クラスI HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号418);クラスII HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号420);クラスII HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号422);ヘマグルチニンエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号424);ノイラミニダーゼエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号426)からなる群から選択される。
366．態様359の方法であって、機能部分が目当てのタンパク質の局在を変改する。
367．態様359の方法であって、機能部分が分解タグであり、その結果、目当てのタンパク質の分解速度が変改される。
368．態様367の方法であって、分解タグが、タグ付けされたタンパク質の消去をもたらす。
369．態様359の方法であって、機能部分が低分子結合ドメインである。
370．態様359の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号488のFKBP12である。
371．態様359の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号489のFKBP12-F36Vである。
372．態様359の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号492-494のシクロフィリンである。
373．態様359の方法であって、低分子結合ドメインが目当ての2つ以上のタンパク質上に組み入れされる。
374．態様373の方法であって、目当ての2つ以上のタンパク質が低分子に接触することによって二量体化し得る。
375．態様369の方法であって、低分子が:

からなる群から選択される低分子の二量体である。
376．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質に免疫エピトープを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)免疫エピトープをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と免疫エピトープとを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
377．態様376の方法であって、免疫エピトープが:破傷風トキソイド(配列番号396);ジフテリア毒素変異体CRM197(配列番号398);ムンプス免疫エピトープ1(配列番号400);ムンプス免疫エピトープ2(配列番号402);ムンプス免疫エピトープ3(配列番号404);風疹ウイルス(配列番号406);ヘマグルチニン(配列番号408);ノイラミニダーゼ(配列番号410);TAP1(配列番号412);TAP2(配列番号414);クラスI HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号416);クラスI HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号418);クラスII HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号420);クラスII HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号422);ヘマグルチニンエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号424);ノイラミニダーゼエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号426)からなる群から選択される。
378．態様376の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
379．態様376の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
380．態様376の方法であって、napDNAbpが配列番号18～25のアミノ酸配列を含む。
381．態様376の方法であって、PEgRNAが配列番号26～36を含む。
382．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に低分子二量体化ドメインを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)低分子二量体化ドメインをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)免疫エピトープをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と低分子二量体化ドメインとを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
383．態様382の方法であって、さらに、目当ての第2のタンパク質に対して方法を行うことを含む。
384．態様383の方法であって、目当ての第1のタンパク質および目当ての第2のタンパク質が、前記タンパク質の夫々の二量体化ドメインに結合する低分子の存在下において二量体化する。
385．態様382の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号488のFKBP12である。
386．態様382の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号489のFKBP12-F36Vである。
387．態様382の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号492-494のシクロフィリンである。
388．態様382の方法であって、低分子が:

からなる群から選択される低分子の二量体である。
389．態様382の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
390．態様382の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
391．態様382の方法であって、napDNAbpが配列番号18～25のアミノ酸配列を含む。
392．態様382の方法であって、PEgRNAが配列番号26～36を含む。
393．プライム編集を用いてタンパク質上にペプチドタグまたはエピトープを組み入れる方法であって:タンパク質をコードする標的ヌクレオチド配列を、ペプチドタグをコードする第2のヌクレオチド配列をそれに挿入するように構成されたプライム編集因子構築物と接触させて、組み換えヌクレオチド配列をもたらすことを含み、その結果、ペプチドタグおよびタンパク質が融合タンパク質として組み換えヌクレオチド配列から発現される。
394．態様383の方法であって、ペプチドタグがタンパク質の精製および/または検出に用いられる。
395．態様383の方法であって、ペプチドタグが、ポリヒスチジン(例えば、HHHHHH)、FLAG(例えば、DYKDDDDK)、V5(例えば、GKPIPNPLLGLDST)、GCN4、HA(例えば、YPYDVPDYA)、Myc(例えばEQKLISEED)、またはGSTである。
396．態様383の方法であって、ペプチドタグが、配列番号245-290からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
397．態様383の方法であって、ペプチドタグがリンカーによってタンパク質に融合される。
398．態様383の方法であって、融合タンパク質が次の構造を有し:[タンパク質]-[ペプチドタグ]または[ペプチドタグ]-[タンパク質]、「]-[」が任意のリンカーを表す。
399．態様383の方法であって、リンカーが配列番号37-47のアミノ酸配列を有する。
400．態様383の方法であって、プライム編集因子構築物が、配列番号18-25のヌクレオチド配列を含むPEgRNAを含む。
401．態様383の方法であって、PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、伸長アームがペプチドタグをコードする逆転写酵素鋳型を含む。
402．態様383の方法であって、PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、伸長アームがペプチドタグをコードする逆転写酵素鋳型を含む。
403．プライム編集によって標的ヌクレオチド配列によってコードされるPRNP上に1つ以上の防護性変異を組み入れることによって、プリオン病を防止またはその進行を停止させる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)防護性変異をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、ミスフォールディングに対して耐性である防護性変異を含むPRNPをコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
404．態様403の方法であって、プリオン病がヒトプリオン病である。
405．態様403の方法であって、プリオン病が動物プリオン病である。
406．態様404の方法であって、プリオン病がクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、またはクールー病である。
407．態様403の方法であって、プリオン病が牛海綿状脳症(BSEまたは「狂牛病」)、慢性消耗病(CWD)、スクレイピー、伝達性ミンク脳症、ネコ海綿状脳症、および有蹄類海綿状脳症である。
408．態様403の方法であって、野生型PRNPアミノ酸配列が配列番号291～292である。
409．態様403の方法であって、方法が、配列番号293～323からなる群から選択される改変されたPRNPアミノ酸配列をもたらし、前記改変されたPRNPタンパク質がミスフォールディングに対して耐性である。
410．態様403の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
411．態様403の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
412．態様403の方法であって、napDNAbpが配列番号18-25のアミノ酸配列を含む。
414．態様403の方法であって、PEgRNAが配列番号26-36を含む。
414．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのRNA上にリボヌクレオチドモチーフまたはタグを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、リボヌクレオチドモチーフまたはタグを含む目当ての修飾されたRNAをコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
415．態様414の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが検出部分である。
416．態様414の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが目当てのRNAの発現レベルに影響する。
417．態様414の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが目当てのRNAの輸送または細胞下レベル位置付けに影響する。
418．態様414の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが、SV40 1型、SV40 2型、SV40 3型、hGH、BGH、rbGlob、TK、MALAT1 ENE-mascRNA、KSHV PAN ENE、Smbox/U1 snRNAボックス、U1 snRNA 3’ボックス、tRNA-リジン、broccoliアプタマー、spinachアプタマー、mangoアプタマー、HDVリボザイム、およびm6Aからなる群から選択される。
419．態様414の方法であって、PEgRNAが配列番号18～25を含む。
420．態様414の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
421．態様414の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
422．態様414の方法であって、napDNAbpが配列番号18-25のアミノ酸配列を含む。
423．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上の機能部分を組み入れまたは欠失する方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分またはその欠失をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)機能部分またはその欠失をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質および機能部分またはその除去を含む改変されたタンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生じ、機能部分がタンパク質の修飾状態または局在状態を変改する。
424．態様423の方法であって、機能部分が、目当てのタンパク質のリン酸化、ユビキチン化、グリコシル化、脂質修飾、ヒドロキシル化、メチル化、アセチル化、クロトニル化、SUMO化状態を変改する。

群A．融合タンパク質、ガイド、および方法
態様1．融合タンパク質であって、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む。

態様2．態様1の融合タンパク質であって、融合タンパク質が、伸長されたガイドRNAの存在下において、プライム標的にプライムされた逆転写によるゲノム編集を実行することができる。

態様3．態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpがニッカーゼ活性を有する。

態様4．態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpがCas9タンパク質またはそのバリアントである。

態様5．態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様6．態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様7．態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpが:Cas9、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2C3、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する。

態様8．態様1の融合タンパク質であって、融合タンパク質が伸長されたガイドRNAと複合体化したときに標的DNA配列に結合することができる。

態様9．態様8の融合タンパク質であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含む。

態様10．態様8の融合タンパク質であって、伸長されたガイドRNAと複合体化した融合タンパク質の結合がRループを形成する。

態様11．態様10の融合タンパク質であって、Rループが、(i)伸長されたガイドRNAと標的鎖とを含むRNA-DNAハイブリッドおよび(ii)相補的な非標的鎖を含む。

態様12．態様11の融合タンパク質であって、相補的な非標的鎖がニッキングされて、遊離の3’端を有する逆転写酵素プライム配列を形成する。

態様13．態様2の融合タンパク質であって、伸長されたガイドRNAが、(a)ガイドRNA、および(b)ガイドRNAの5'もしくは3’端またはガイドRNAの分子内の位置付けにおけるRNA伸長を含む。

態様14．態様13の融合タンパク質であって、RNA伸長が、(i)所望のヌクレオチド変化を含む逆転写鋳型配列、(ii)逆転写プライマー結合部位、および(iii)任意にリンカー配列を含む。

態様15．態様14の融合タンパク質であって、逆転写鋳型配列が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。

態様16．態様13の融合タンパク質であって、RNA伸長が、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。

態様17．態様15の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップが、ニック部位に隣接する内生DNA配列にハイブリダイズし、それによって所望のヌクレオチド変化を組み入れる。

態様18．態様15の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップが、遊離の5'端を有しかつニック部位に隣接する内生DNA配列に取って代わる。

態様19．態様18の融合タンパク質であって、5'端を有する内生DNA配列が細胞によって切除される。

態様20．態様18の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。

態様21．態様14の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化がPAM配列の約-4から+10の間もしくはPAM配列の約-10から+20の間もしくはPAM配列の約-20から+40の間もしくはPAM配列の約-30から+100の間である編集窓上に組み入れされるか、または所望のヌクレオチド変化がニック部位の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100ヌクレオチド下流に組み入れされる。

態様22．態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpが、配列番号18のアミノ酸配列、または配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％同一であるアミノ酸配列を含む。

態様23．態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpが、配列番号18-88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482-487のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含む。

[0001]態様1の融合タンパク質であって、逆転写酵素が配列番号89のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

態様24．態様1の融合タンパク質であって、逆転写酵素が、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

[0002] 態様1の融合タンパク質であって、逆転写酵素が、配列番号89のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含む。

態様25．態様1の融合タンパク質であって、逆転写酵素が、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含む。

態様26．態様1の融合タンパク質であって、逆転写酵素がレトロウイルスまたはレトロトランスポゾンからの天然に存在する逆転写酵素である。

態様27．先の態様のいずれか1つの融合タンパク質であって、融合タンパク質が構造NH2-[napDNAbp]-[逆転写酵素]-COOH;またはNH2-[逆転写酵素]-[napDNAbp]-COOHを含み、「]-[」の夫々のものが任意のリンカー配列の存在を指示する。

態様28．態様27の融合タンパク質であって、リンカー配列が配列番号127、165-176、446、453、および767-769のアミノ酸配列を含む。

態様29．態様14の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化が1ヌクレオチド変化、1つ以上のヌクレオチドの挿入、または1つ以上のヌクレオチドの欠失である。

態様30．態様29の融合タンパク質であって、挿入または欠失が、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、少なくとも41、少なくとも42、少なくとも43、少なくとも44、少なくとも45、少なくとも46、少なくとも47、少なくとも48、少なくとも49、または少なくとも50である。

態様31．ガイドRNAと少なくとも1つのRNA伸長とを含む伸長されたガイドRNA。

態様32．態様1の伸長されたガイドRNAであって、RNA伸長が、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置の位置である。

態様33．態様31の伸長されたガイドRNAであって、伸長されたガイドRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。

態様34．態様33の伸長されたガイドRNAであって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。

態様35．態様31の伸長されたガイドRNAであって、少なくとも1つのRNA伸長が、(i)逆転写鋳型配列、(ii)逆転写プライマー結合部位、および(iii)任意にリンカー配列を含む。

態様36．態様35の伸長されたガイドRNAであって、RNA伸長が、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。

態様37．態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写鋳型配列が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。

態様38．態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写プライマー結合部位配列が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。

態様39．態様35の伸長されたガイドRNAであって、任意のリンカー配列が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。

態様40．態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写鋳型配列が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。

態様41．態様40の伸長されたガイドRNAであって、一本鎖DNAフラップが、ニッキングされた標的DNA配列上の5'端を有する内生一本鎖DNAを押し除け、内生一本鎖DNAがニック部位の下流において直ちに隣接する。

態様42．態様41の伸長されたガイドRNAであって、遊離の5'端を有する内生一本鎖DNAが細胞によって切除される。

態様43．態様41の伸長されたガイドRNAであって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。

態様44．態様31の伸長されたガイドRNAであって、配列番号18-36のヌクレオチド配列、または配列番号394、429～442、641～649、678～692、2997～3103、3113～3121、3305～3455、3479～3493、3522～3556、3628～3698、および3755～3810のいずれか1つとの少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％もしくは少なくとも98％もしくは少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

態様45．態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写鋳型配列が、内生DNA標的と少なくとも80％または85％または90％または95％または99％同一であるヌクレオチド配列を含む。

態様46．態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3’端とハイブリダイズする。

態様47．態様35の伸長されたガイドRNAであって、任意のリンカー配列が、長さが少なくとも1ヌクレオチド、または少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、または少なくとも15ヌクレオチドである。

態様48．態様1-30のいずれか1つの融合タンパク質と伸長されたガイドRNAとを含むことを含む複合体。

態様49．態様48の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、ガイドRNAと、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置におけるRNA伸長とを含む。

態様50．態様48の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。

態様51．態様50の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。

態様52．態様49の複合体であって、少なくとも1つのRNA伸長が、(i)逆転写鋳型配列、(ii)逆転写プライマー結合部位、および(iii)任意にリンカー配列を含む。

態様53．態様48の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、配列番号394、429～442、641～649、678～692、2997～3103、3113～3121、3305～3455、3479～3493、3522～3556、3628～3698、および3755～3810のヌクレオチド配列、または配列番号394、429～442、641～649、678～692、2997～3103、3113～3121、3305～3455、3479～3493、3522～3556、3628～3698、および3755～3810のいずれか1つとの少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％もしくは少なくとも98％もしくは少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

態様54．態様52の複合体であって、逆転写鋳型配列が、内生DNA標的との少なくとも80％または85％または90％または95％または99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

態様55．態様52の複合体であって、逆転写プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。

態様56．napDNAbpおよび伸長されたガイドRNAを含むことを含む複合体。

態様57．態様56の複合体であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼである。

態様58．態様56の複合体であって、napDNAbpが、配列番号18のアミノ酸配列、または配列番号18との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様59．態様57の複合体であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様60．態様57の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、ガイドRNAと、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置におけるRNA伸長とを含む。

態様61．態様57の複合体であって、伸長されたガイドRNAがnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。

態様62．態様61の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、スペーサー配列が標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。

態様63．態様61の複合体であって、RNA伸長が、(i)逆転写鋳型配列、(ii)逆転写プライマー結合部位、および(iii)任意にリンカー配列を含む。

態様64．態様57の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、配列番号394、429～442、641～649、678～692、2997～3103、3113～3121、3305～3455、3479～3493、3522～3556、3628～3698、および3755～3810のヌクレオチド配列、または配列番号394、429～442、641～649、678～692、2997～3103、3113～3121、3305～3455、3479～3493、3522～3556、3628～3698、および3755～3810のいずれか1つとの少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％もしくは少なくとも98％もしくは少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

態様65．態様63の複合体であって、逆転写鋳型配列が、内生DNA標的と少なくとも80％または85％または90％または95％または99％同一であるヌクレオチド配列を含む。

態様66．態様63の複合体であって、逆転写プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。

態様67．態様63の複合体であって、任意のリンカー配列が、長さが少なくとも1ヌクレオチド、または少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、または少なくとも15ヌクレオチドである。

態様68．態様1～30のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

態様69．態様68のポリヌクレオチドを含むベクター。

態様70．態様1～30のいずれかの融合タンパク質と融合タンパク質のnapDNAbpに結合した伸長されたガイドRNAとを含む細胞。

態様71．態様48～67のいずれか1つの複合体を含む細胞。

態様72．医薬組成物であって:(i)態様1～30のいずれかの融合タンパク質、態様48～67の複合体、態様68のポリヌクレオチド、または態様69のベクターと;(ii)薬学的に許容される賦形剤とを含む。

態様73．医薬組成物であって:(i)態様48～67の複合体、(ii)トランスで提供される逆転写酵素;および(iii)薬学的に許容される賦形剤を含む。

態様74．キットであって:(i)態様1～30のいずれか1つの融合タンパク質をコードする核酸配列;および(ii)(i)の配列の発現を駆動するプロモーターを含む核酸構築物を含む。

態様75．所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列に組み入れるための方法であって、方法が:

(i)融合タンパク質および伸長されたガイドRNAを含む複合体と二本鎖DNA配列を接触させ、融合タンパク質がnapDNAbpおよび逆転写酵素を含み、伸長されたガイドRNAが所望のヌクレオチド変化を含む逆転写鋳型配列を含むこと;

(ii)非標的鎖上において二本鎖DNA配列にニッキングし、それによって3’端を有する遊離の一本鎖DNAを生成すること;

(iii)遊離の一本鎖DNAの3'端を逆転写鋳型配列にハイブリダイズさせ、それによって逆転写酵素ドメインをプライムすること;

(iv)3'端からDNAの鎖を重合し、それによって所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを生成すること;

(v)カットされた部位に隣接する内生DNA鎖を一本鎖DNAフラップによって置き換え、それによって所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列に組み入れること、
を含む。

態様76．態様75の方法であって、(v)置き換えるステップが:(i)一本鎖DNAフラップをカットされた部位に隣接する内生DNA鎖にハイブリダイズさせて、配列ミスマッチを生出すること;(ii)内生DNA鎖を切り出すこと;および(iii)ミスマッチを修復して、所望のヌクレオチド変化をDNAの両方の鎖に含む所望の産物を形成すること、を含む。

態様77．態様76の方法であって、所望のヌクレオチド変化が1ヌクレオチド置換、欠失、または挿入である。

態様78．態様77の方法であって、1ヌクレオチド置換がトランジションまたはトランスバージョンである。

態様79．態様76の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)GからTの置換、(2)GからAの置換、(3)GからCの置換、(4)TからGの置換、(5)TからAの置換、(6)TからCの置換、(7)CからGの置換、(8)CからTの置換、(9)CからAの置換、(10)AからTの置換、(11)AからG置換、または(12)AからCの置換である。

態様80．態様76の方法であって、所望のヌクレオチド(nucleoid)変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変換する。

態様81．態様76の方法であって、所望のヌクレオチド変化が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの挿入または欠失である。

態様82．態様76の方法であって、所望のヌクレオチド変化が疾患関連遺伝子を修正する。

態様83．態様82の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。

態様84．態様82の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。

態様85．態様76の方法であって、napDNAbpが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、Cas9ニッカーゼ(nCas9)、またはヌクレアーゼ活性Cas9である。

態様86．態様76の方法であって、napDNAbpが配列番号18のアミノ酸配列を含む。

態様87．態様76の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様88．態様76の方法であって、逆転写酵素が、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

態様89．態様76の方法であって、逆転写酵素ドメインが、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様90．態様76の方法であって、伸長されたガイドRNAが、RNA伸長をガイドRNAの3'もしくは5'端または分子内の位置付けに含み、RNA伸長が逆転写鋳型配列を含む。

態様91．態様90の方法であって、RNA伸長が、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。

態様92．態様76の方法であって、伸長されたガイドRNAが、配列番号394、429～442、641～649、678～692、2997～3103、3113～3121、3305～3455、3479～3493、3522～3556、3628～3698、および3755～3810からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。

態様93．標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって:

(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびnapDNAbpを標的座位へと標的化するガイドRNAとDNA分子を接触させ、ガイドRNAが少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む逆転写酵素(RT)鋳型配列を含むこと;

(ii)標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成すること;

(iii)暴露された3’端をRT鋳型配列にハイブリダイズさせて逆転写をプライムすること;

(iv)逆転写酵素によって、RT鋳型配列に基づく少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを合成すること;および

(v)少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を対応する内生DNA上に組み込み、それによって、標的座位においてDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入すること、
を含む。

態様94．態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化がトランジションを含む。

態様95．態様94の方法であって、トランジションが、(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択される。

態様96．態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化がトランスバージョンを含む。

態様97．態様96の方法であって、トランスバージョンが、(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択される。

態様98．態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。

態様99．態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの挿入または欠失を含む。

態様100．態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が疾患関連遺伝子の修正を含む。

態様101．態様100の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。

態様102．態様100の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。

態様103．態様93の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9またはそのバリアントである。

態様104．態様93の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)もしくはCas9ニッカーゼ(nCas9)またはそのバリアントである。

態様105．態様93の方法であって、napDNAbpが配列番号18のアミノ酸配列を含む。

態様106．態様93の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様107．態様93の方法であって、逆転写酵素がトランスで導入される。

態様108．態様93の方法であって、napDNAbpが逆転写酵素への融合体を含む。

態様109．態様93の方法であって、逆転写酵素が、f配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

態様110．態様93の方法であって、逆転写酵素が、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様111．態様93の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、ヌクレアーゼによってDNA鎖へニックを入れることを含む。

態様112．態様111の方法であって、ヌクレアーゼがnapDNAbpであるか、napDNAbpの融合ドメインとして提供されるか、またはトランスで提供される。

態様113．態様93の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、DNA鎖を化学的薬剤と接触させることを含む。

態様114．態様93の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、複製エラーを導入することを含む。

態様115．態様93の方法であって、DNA分子をnapDNAbpおよびガイドRNAと接触させるステップがRループを形成する。

態様116．態様115の方法であって、暴露された3’端が形成されるDNA鎖がRループ上にある。

態様117．態様93の方法であって、ガイドRNAが、逆転写酵素(RT)鋳型配列を含む伸長された部分を含む。

態様118．態様117の方法であって、伸長された部分が、ガイドRNAの3’端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置にある。

態様119．態様93の方法であって、ガイドRNAがさらにプライマー結合部位を含む。

態様120．態様93の方法であって、ガイドRNAがさらにスペーサー配列を含む。

態様121．態様93の方法であって、RT鋳型配列が、対応する内生DNAに対して相同的である。

態様122．プライム標的にプライムされた逆転写によって、標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって標的座位におけるDNA分子上に所望のヌクレオチド変化を組み込むことを含む。

態様123．態様122の方法であって、RT鋳型が、ガイドRNAの3'端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置付けに位置付けられる。

態様124．態様122の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、トランジション、トランスバージョン、挿入、もしくは欠失、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。

態様125．請求項122の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択されるトランジションを含む。

態様126．請求項122の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択されるトランスバージョンを含む。

態様127．態様122の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。

態様128．態様31～47のいずれか1つの伸長されたガイドRNAをコードするポリヌクレオチド。

態様129．態様128のポリヌクレオチドを含むベクター。

態様130．態様129のベクターを含む細胞。

態様131．態様1～30のいずれかの融合タンパク質であって、逆転写酵素がエラーを起こしやすい逆転写酵素である。

態様132．プライム標的にプライムされた逆転写によって標的座位におけるDNA分子に変異導入するための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびエラーを起こしやすい逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、変異導入された一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、変異導入された一本鎖DNAを標的座位におけるDNA分子上に組み込むことを含む。

態様133．態様132の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様134．態様132の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様135．態様132の方法であって、napDNAbpが配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様136．態様132の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。

態様137．態様132の方法であって、(b)プライム標的にプライムされた逆転写を行うステップが、ガイドRNA上のプライマー結合部位へのアニーリングによって逆転写をプライムすることができる標的座位における3'端プライマー結合配列を生成することを含む。

態様138．健康な数の反復トリヌクレオチドを含む健康な配列によって標的DNA分子上のトリヌクレオチド反復拡大変異を置き換えるための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)置き換え配列を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させ、前記融合タンパク質が導入すること(intr);(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、置き換え配列を含む一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的座位におけるDNA分子上に一本鎖DNAを組み込むことを含む。

態様139．態様138の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様140．態様138の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様141．態様138の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様142．態様138の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。

態様143．態様138の方法であって、(b)プライム標的にプライムされた逆転写を行うステップが、ガイドRNA上のプライマー結合部位へのアニーリングによって逆転写をプライムすることができる標的座位における3'端プライマー結合配列を生成することを含む。

態様144．態様138の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がハンチントン病、脆弱X症候群、またはフリードライヒ運動失調症に関連する。

態様145．態様138の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がCAGトリプレットの繰り返し単位を含む。

態様146．態様138の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がGAAトリプレットの繰り返し単位を含む。

態様147．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に機能部分を組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)機能部分をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と機能部分とを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様148．態様147の方法であって、機能部分がペプチドタグである。

態様149．態様148の方法であって、ペプチドタグがアフィニティータグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、または蛍光タグである。

態様150．態様148の方法であって、ペプチドタグが:AviTag(配列番号245);Cタグ(配列番号246);カルモジュリンタグ(配列番号247);ポリグルタミン酸タグ(配列番号248);Eタグ(配列番号249);FLAGタグ(配列番号2);HAタグ(配列番号5);Hisタグ(配列番号252-262);Mycタグ(配列番号6);NEタグ(配列番号264);Rho1D4タグ(配列番号265);Sタグ(配列番号266);SBPタグ(配列番号267);Softag-1(配列番号268);Softag-2(配列番号269);Spotタグ(配列番号270);Strepタグ(配列番号271);TCタグ(配列番号272);Tyタグ(配列番号273);V5タグ(配列番号3);VSVタグ(配列番号275);およびXpressタグ(配列番号276)からなる群から選択される。

態様151．態様148の方法であって、ペプチドタグが:AU1エピトープ(配列番号278);AU5エピトープ(配列番号279);バクテリオファージT7エピトープ(T7タグ)(配列番号280);ブルータングウイルスタグ(Bタグ)(配列番号281);E2エピトープ(配列番号282);ヒスチジンアフィニティータグ(HAT)(配列番号283);HSVエピトープ(配列番号284);ポリアルギニン(Argタグ)(配列番号285);ポリアスパラギン酸(Aspタグ)(配列番号286);ポリフェニルアラニン(Pheタグ)(配列番号287);S1タグ(配列番号288);Sタグ(配列番号266);およびVSV-G(配列番号275)からなる群から選択される。

態様152．態様147の方法であって、機能部分が免疫エピトープである。

態様153．態様152の方法であって、免疫エピトープが:破傷風トキソイド(配列番号396);ジフテリア毒素変異体CRM197(配列番号398);ムンプス免疫エピトープ1(配列番号400);ムンプス免疫エピトープ2(配列番号402);ムンプス免疫エピトープ3(配列番号404);風疹ウイルス(配列番号406);ヘマグルチニン(配列番号408);ノイラミニダーゼ(配列番号410);TAP1(配列番号412);TAP2(配列番号414);クラスI HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号416);クラスI HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号418);クラスII HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号420);クラスII HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号422);ヘマグルチニンエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号424);ノイラミニダーゼエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号426)からなる群から選択される。

態様154．態様147の方法であって、機能部分が目当てのタンパク質の局在を変改する。

態様155．態様147の方法であって、機能部分が分解タグであり、その結果、目当てのタンパク質の分解速度が変改される。

態様156．態様155の方法であって、分解タグが、本明細書に開示の分解タグをコードするアミノ酸配列を含む。

態様157．態様147の方法であって、機能部分が低分子結合ドメインである。

態様158．態様157の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号488のFKBP12である。

態様159．態様157の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号489のFKBP12-F36Vである。

態様160．態様157の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号492-494のシクロフィリンである。

態様161．態様157の方法であって、低分子結合ドメインが目当ての2つ以上のタンパク質上に組み入れされる。

態様162．態様161の方法であって、目当ての2つ以上のタンパク質が低分子と接触することによって二量体化し得る。

態様163．態様157の方法であって、低分子が、群1の態様163に開示される化合物からなる群から選択される低分子の二量体である。

態様164．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に免疫エピトープを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)免疫エピトープをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と免疫エピトープとを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様165．態様164の方法であって、免疫エピトープが:破傷風トキソイド(配列番号396);ジフテリア毒素変異体CRM197(配列番号630);ムンプス免疫エピトープ1(配列番号400);ムンプス免疫エピトープ2(配列番号402);ムンプス免疫エピトープ3(配列番号404);風疹ウイルス(配列番号406);ヘマグルチニン(配列番号408);ノイラミニダーゼ(配列番号410);TAP1(配列番号412);TAP2(配列番号414);クラスI HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号416);クラスI HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号418);クラスII HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号420);クラスII HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号422);ヘマグルチニンエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号424);ノイラミニダーゼエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号426)からなる群から選択される。

態様166．態様164の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様167．態様164の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様168．態様164の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様169．態様164の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。

態様170．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に低分子二量体化ドメインを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)低分子二量体化ドメインをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)免疫エピトープをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と低分子二量体化ドメインとを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様171．態様170の方法であって、さらに、目当ての第2のタンパク質に対して方法を行うことを含む。

態様172．態様171の方法であって、目当ての第1のタンパク質および目当ての第2のタンパク質が、前記タンパク質の夫々の二量体化ドメインに結合する低分子の存在下において二量体化する。

態様173．態様170の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号488のFKBP12である。

態様174．態様170の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号489のFKBP12-F36Vである。

態様175．態様170の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号490および493-494のシクロフィリンである。

態様176．態様170の方法であって、低分子が、群1の態様163に開示される化合物からなる群から選択される低分子の二量体である。

態様177．態様170の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様178．態様170の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様179．態様170の方法であって、napDNAbpが配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様180．態様170の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。

態様181．プライム編集を用いてタンパク質上にペプチドタグまたはエピトープを組み入れる方法であって:タンパク質をコードする標的ヌクレオチド配列を、ペプチドタグをコードする第2のヌクレオチド配列をそれに挿入するように構成されたプライム編集因子構築物と接触させて、組み換えヌクレオチド配列をもたらすことを含み、その結果、ペプチドタグおよびタンパク質が融合タンパク質として組み換えヌクレオチド配列から発現される。

態様182．態様181の方法であって、ペプチドタグがタンパク質の精製および/または検出に用いられる。

態様183．態様181の方法であって、ペプチドタグが、ポリヒスチジン(例えば、HHHHHH)(配列番号252～262)、FLAG(例えば、DYKDDDDK)(配列番号2)、V5(例えば、GKPIPNPLLGLDST)(配列番号3)、GCN4、HA(例えば、YPYDVPDYA)(配列番号5)、Myc(例えばEQKLISEED)(配列番号6)、GSTなどである。

態様184．態様181の方法であって、ペプチドタグが、配列番号1～6、245～249、252～262、264～273、275～276、281、278～288、および622からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

態様185．態様181の方法であって、ペプチドタグがリンカーによってタンパク質に融合される。

態様186．態様181の方法であって、融合タンパク質が次の構造を有し:[タンパク質]-[ペプチドタグ]または[ペプチドタグ]-[タンパク質]、「]-[」が任意のリンカーを表す。

態様187．態様181の方法であって、リンカーが配列番号127、165～176、446、453、および767～769のアミノ酸配列を有する。

態様188．態様181の方法であって、プライム編集因子構築物が、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777のヌクレオチド配列を含むPEgRNAを含む。

態様189．態様181の方法であって、PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、伸長アームがペプチドタグをコードする逆転写酵素鋳型を含む。

態様190．態様181の方法であって、PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、伸長アームがペプチドタグをコードする逆転写酵素鋳型を含む。

態様191．プライム編集によって標的ヌクレオチド配列によってコードされるPRNP上に1つ以上の防護性変異を組み入れることによって、プリオン病を防止またはその進行を停止させる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)防護性変異をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、ミスフォールディングに対して耐性である防護性変異を含むPRNPをコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様192．態様191の方法であって、プリオン病がヒトプリオン病である。

態様193．態様191の方法であって、プリオン病が動物プリオン病である。

態様194．態様192の方法であって、プリオン病が、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、またはクールー病である。

態様195．態様193の方法であって、プリオン病が、牛海綿状脳症(BSEまたは「狂牛病」)、慢性消耗病(CWD)、スクレイピー、伝達性ミンク脳症、ネコ海綿状脳症、および有蹄類海綿状脳症である。

態様196．態様191の方法であって、野生型PRNPアミノ酸配列が配列番号291～292である。

態様197．態様191の方法であって、方法が、配列番号293～309および311～323からなる群から選択される改変されたPRNPアミノ酸配列をもたらし、前記改変されたPRNPタンパク質がミスフォールディングに対して耐性である。

態様198．態様191の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様199．態様191の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様200．態様191の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様201．態様191の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。

態様202．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのRNA上にリボヌクレオチドモチーフまたはタグを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、リボヌクレオチドモチーフまたはタグを含む目当ての修飾されたRNAをコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様203．態様202の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが検出部分である。

態様204．態様202の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが目当てのRNAの発現レベルに影響する。

態様205．態様202の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが目当てのRNAの輸送または細胞下レベル位置付けに影響する。

態様206．態様202の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが、SV40 1型、SV40 2型、SV40 3型、hGH、BGH、rbGlob、TK、MALAT1 ENE-mascRNA、KSHV PAN ENE、Smbox/U1 snRNAボックス、U1 snRNA 3'ボックス、tRNA-リジン、broccoliアプタマー、spinachアプタマー、mangoアプタマー、HDVリボザイム、およびm6Aからなる群から選択される。

態様207．態様202の方法であって、PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777を含む。

態様208．態様202の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様209．態様202の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様210．態様202の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様211．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上の機能部分を組み入れまたは欠失する方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分またはその欠失をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)機能部分またはその欠失をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質および機能部分またはその除去を含む改変されたタンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生じ、機能部分がタンパク質の修飾状態または局在状態を変改する。

態様212．態様211の方法であって、機能部分が、目当てのタンパク質のリン酸化、ユビキチン化、グリコシル化、脂質修飾、ヒドロキシル化、メチル化、アセチル化、クロトニル化、SUMO化状態を変改する。

態様213．融合タンパク質であって、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)とポリメラーゼとを含む。

態様214．態様213の融合タンパク質であって、融合タンパク質が、プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)の存在下においてプライム編集を実行することができる。

態様215．態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpがニッカーゼ活性を有する。

態様216．態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpがCas9タンパク質またはそのバリアントである。

態様217．態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様218．態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様219．態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpが:Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する。

態様220．態様213の融合タンパク質であって、融合タンパク質がPEgRNAと複合体化したときに標的DNA配列に結合することができる。

態様221．態様220の融合タンパク質であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含む。

態様222．態様220の融合タンパク質であって、PEgRNAと複合体化した融合タンパク質の結合がRループを形成する。

態様223．態様222の融合タンパク質であって、Rループが、(i)PEgRNAと標的鎖とを含むRNA-DNAハイブリッドおよび(ii)相補的な非標的鎖を含む。

態様224．態様223の融合タンパク質であって、相補的な非標的鎖がニッキングされて、遊離の3'端を有するプライム配列を形成する。

態様225．態様214の融合タンパク質であって、PEgRNAが、(a)ガイドRNAと、(b)ガイドRNAの5'もしくは3’端またはガイドRNAの分子内の位置付けにおける伸長アームとを含む。

態様226．態様225の融合タンパク質であって、伸長アームが(i)所望のヌクレオチド変化を含むDNA合成鋳型配列および(ii)プライマー結合部位を含む。

態様227．態様226の融合タンパク質であって、DNA合成鋳型配列が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。

態様228．態様225の融合タンパク質であって、伸長アームが、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。

態様229．態様227の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップが、ニック部位に隣接する内生DNA配列にハイブリダイズし、それによって所望のヌクレオチド変化を組み入れる。

態様230．態様227の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップが、遊離の5'端を有しかつニック部位に隣接する内生DNA配列に取って代わる。

態様231．態様230の融合タンパク質であって、5'端を有する内生DNA配列が細胞によって切除される。

態様232．態様230の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。

態様233．態様226の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化がPAM配列の約-4から+10の間もしくはPAM配列の約-10から+20の間もしくはPAM配列の約-20から+40の間もしくはPAM配列の約-30から+100の間である編集窓上に組み入れされるか、または所望のヌクレオチド変化がニック部位の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100ヌクレオチド下流に組み入れされる。

態様234．態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpが、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号18のアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様235．態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様236．態様213の融合タンパク質であって、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

態様237．態様213の融合タンパク質であって、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様238．態様213の融合タンパク質であって、ポリメラーゼがレトロウイルスまたはレトロトランスポゾンからの天然に存在する逆転写酵素である。

態様239．先の態様のいずれか1つの融合タンパク質であって、融合タンパク質が構造NH2-[napDNAbp]-[ポリメラーゼ]-COOH;またはNH2-[ポリメラーゼ]-[napDNAbp]-COOHを含み、「]-[」の夫々のものが任意のリンカー配列の存在を指示する。

態様240．態様239の融合タンパク質であって、リンカー配列が配列番号127、165～176、446、453、および767～769のアミノ酸配列を含む。

態様241．態様226の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化が1ヌクレオチド変化、1つ以上のヌクレオチドの挿入、または1つ以上のヌクレオチドの欠失である。

態様242．態様241の融合タンパク質であって、挿入または欠失が、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、少なくとも41、少なくとも42、少なくとも43、少なくとも44、少なくとも45、少なくとも46、少なくとも47、少なくとも48、少なくとも49、または少なくとも50である。

態様243．ガイドRNAとDNA合成鋳型を含む少なくとも1つの核酸伸長アームとを含むPEgRNA。

態様244．態様241のPEgRNAであって、核酸伸長アームがガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置の位置であり、核酸伸長アームがDNAまたはRNAである。

態様245．態様242のPEgRNAであって、PEgRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。

態様246．態様245のPEgRNAであって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。

態様247．態様243のPEgRNAであって、少なくとも1つの核酸伸長アームが(i)DNA合成鋳型および(ii)プライマー結合部位を含む。

態様248．態様247のPEgRNAであって、核酸伸長アームが、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。

態様249．態様247のPEgRNAであって、DNA合成鋳型が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。

態様250．態様247のPEgRNAであって、プライマー結合部位が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。

態様251．態様243のPEgRNAであって、さらに、リンカー、ステムループ、ヘアピン、トウループ、アプタマー、またはRNA-タンパク質動員ドメインからなる群から選択される少なくとも1つの追加の構造を含む。

態様252．態様247のPEgRNAであって、DNA合成鋳型が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。

態様253．態様252のPEgRNAであって、一本鎖DNAフラップが、ニッキングされた標的DNA配列上の5'端を有する内生一本鎖DNAを押し除け、内生一本鎖DNAがニック部位の下流において直ちに隣接する。

態様254．態様253のPEgRNAであって、遊離の5'端を有する内生一本鎖DNAが細胞によって切除される。

態様255．態様253のPEgRNAであって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。

態様256．態様243のPEgRNAであって、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777のヌクレオチド配列、または配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777のいずれか1つとの少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％もしくは少なくとも98％もしくは少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

態様257．態様247のPEgRNAであって、DNA合成鋳型が、内生DNA標的と少なくとも80％または85％または90％または95％または99％同一であるヌクレオチド配列を含む。

態様258．態様247のPEgRNAであって、プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。

態様259．態様251のPEgRNAであって、少なくとも1つの追加の構造がPEgRNAの3'または5'端に位置付けられる。

態様260．態様213-242のいずれか1つの融合タンパク質とPEgRNAとを含むことを含む複合体。

態様261．態様260の複合体であって、PEgRNAが、ガイドRNAと、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置における核酸伸長アームとを含む。

態様262．態様260の複合体であって、PEgRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。

態様263．態様262の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。

態様264．態様261の複合体であって、少なくとも1つの核酸伸長アームが(i)DNA合成鋳型および(ii)プライマー結合部位を含む。

態様265．態様260の複合体であって、PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777のヌクレオチド配列、または配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777のいずれか1つとの少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％もしくは少なくとも98％もしくは少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

態様266．態様264の複合体であって、DNA合成鋳型が、内生DNA標的と少なくとも80％または85％または90％または95％または99％同一であるヌクレオチド配列を含む。

態様267．態様264の複合体であって、プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3’端とハイブリダイズする。

態様268．napDNAbpおよびPEgRNAを含むことを含む複合体。

態様269．態様268の複合体であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼである。

態様270．態様268の複合体であって、napDNAbpが配列番号18のアミノ酸配列を含む。

態様271．態様268の複合体であって、napDNAbpが、配列番号18-88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482-487のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様272．態様268の複合体であって、PEgRNAが、ガイドRNAと、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置における核酸伸長アームとを含む。

態様273．態様268の複合体であって、PEgRNAがnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。

態様274．態様272の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、PEgRNAのスペーサー配列が標的鎖にハイブリダイズしてRNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。

態様275．態様273の複合体であって、核酸伸長アームが(i)DNA合成鋳型および(ii)プライマー結合部位を含む。

態様276．態様269の複合体であって、PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777のヌクレオチド配列、または配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777のいずれか1つとの少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％もしくは少なくとも98％もしくは少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

態様277．態様276の複合体であって、DNA合成鋳型が、内生DNA標的と少なくとも80％または85％または90％または95％または99％同一であるヌクレオチド配列を含む。

態様278．態様276の複合体であって、プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3’端とハイブリダイズする。

態様279．態様276の複合体であって、PEgRNAが、さらに、リンカー、ステムループ、ヘアピン、トウループ、アプタマー、またはRNA-タンパク質動員ドメインからなる群から選択される少なくとも1つの追加の構造を含む。

態様280．態様213～242のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

態様281．態様280のポリヌクレオチドを含むベクター。

態様282．態様213～242のいずれかの融合タンパク質と融合タンパク質のnapDNAbpに結合したPEgRNAとを含む細胞。

態様283．態様260-279のいずれか1つの複合体を含む細胞。

態様284．医薬組成物であって:(i)態様213～242のいずれかの融合タンパク質、態様260～279の複合体、態様68のポリヌクレオチド、または態様69のベクター;および(ii)薬学的に許容される賦形剤を含む。

態様285．医薬組成物であって:(i)態様260～279の複合体、(ii)トランスで提供されるポリメラーゼ;および(iii)薬学的に許容される賦形剤を含む。

態様286．キットであって:(i)態様213-242のいずれか1つの融合タンパク質をコードする核酸配列(nuleic acid sequencing);および(ii)(i)の配列の発現を駆動するプロモーターを含む核酸構築物を含む。

態様287．所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列に組み入れるための方法であって、方法が:

(i)融合タンパク質およびPEgRNAを含む複合体と二本鎖DNA配列を接触させ、融合タンパク質がnapDNAbpおよびポリメラーゼを含み、PEgRNAが所望のヌクレオチド変化を含むDNA合成鋳型とプライマー結合部位とを含むこと;

(ii)二本鎖DNA配列にニッキングし、それによって、3'端を有する遊離の一本鎖DNAを生成すること;

(iii)遊離の一本鎖DNAの3'端をプライマー結合部位にハイブリダイズさせ、それによってポリメラーゼをプライムすること;

(iv)プライマー結合部位にハイブリダイズした3'端からDNAの鎖を重合し、それによって、DNA合成鋳型に対して相補的であるかつ所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを生成すること;

(v)カットされた部位に隣接する内生DNA鎖を一本鎖DNAフラップによって置き換え、それによって所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列に組み入れること、
を含む。

態様288．態様287の方法であって、(v)置き換えるステップが:(i)一本鎖DNAフラップをカットされた部位に隣接する内生DNA鎖にハイブリダイズさせて、配列ミスマッチを生出すること;(ii)内生DNA鎖を切り出すこと;および(iii)ミスマッチを修復して、所望のヌクレオチド変化をDNAの両方の鎖に含む所望の産物を形成すること、を含む。

態様289．態様288の方法であって、所望のヌクレオチド変化が1ヌクレオチド置換、欠失、または挿入である。

態様290．態様289の方法であって、1ヌクレオチド置換がトランジションまたはトランスバージョンである。

態様291．態様288の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)GからTの置換、(2)GからAの置換、(3)GからCの置換、(4)TからGの置換、(5)TからAの置換、(6)TからCの置換、(7)CからGの置換、(8)CからTの置換、(9)CからAの置換、(10)AからTの置換、(11)AからGの置換、または(12)AからCの置換である。

態様292．態様288の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変換する。

態様293．態様288の方法であって、所望のヌクレオチド変化が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの挿入または欠失である。

態様294．態様288の方法であって、所望のヌクレオチド変化が疾患関連遺伝子を修正する。

態様295．態様294の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;トリヌクレオチド反復障害;プリオン病;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。

態様296．態様294の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。

態様297．態様287の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、Cas9ニッカーゼ(nCas9)、またはヌクレアーゼ活性Cas9である。

態様298．態様287の方法であって、napDNAbpが、配列番号18のアミノ酸配列、または配列番号18のアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様299．態様287の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様300．態様287の方法であって、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

態様301．態様287の方法であって、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様302．態様287の方法であって、PEgRNAが核酸伸長アームをガイドRNAの3'もしくは5'端または分子内の位置付けに含み、伸長アームがDNA合成鋳型配列およびプライマー結合部位を含む。

態様303．態様302の方法であって、伸長アームが、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。

態様304．態様287の方法であって、PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。

態様305．標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって:

(i)DNA分子を、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびnapDNAbpを標的座位へと標的化するPEgRNAと接触させ、PEgRNAが少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む逆転写酵素(RT)鋳型配列とプライマー結合部位とを含むこと;

(ii)標的座位におけるDNA鎖の暴露された3'端を形成すること;

(iii)暴露された3'端をプライマー結合部位にハイブリダイズさせて逆転写をプライムすること;

(iv)逆転写酵素によって、RT鋳型配列に基づく少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを合成すること;および

(v)少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を対応する内生DNA上に組み込み、それによって、標的座位においてDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入すること、
を含む。

態様306．態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化がトランジションを含む。

態様307．態様306の方法であって、トランジションが、(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択される。

態様308．態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化がトランスバージョンを含む。

態様309．態様308の方法であって、トランスバージョンが、(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択される。

態様310．態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(9)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。

態様311．態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの挿入または欠失を含む。

態様312．態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が疾患関連遺伝子の修正を含む。

態様313．態様312の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;トリヌクレオチド反復障害;プリオン病;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。

態様314．態様312の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。

態様315．態様305の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9またはそのバリアントである。

態様316．態様305の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)もしくはCas9ニッカーゼ(nCas9)またはそのバリアントである。

態様317．態様305の方法であって、napDNAbpが、配列番号18のアミノ酸配列、または配列番号18との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様318．態様305の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様319．態様305の方法であって、逆転写酵素がトランスで導入される。

態様320．態様305の方法であって、napDNAbpが逆転写酵素への融合体を含む。

態様321．態様305の方法であって、逆転写酵素が、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

態様322．態様305の方法であって、逆転写酵素が、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様323．態様305の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3'端を形成するステップが、ヌクレアーゼによってDNA鎖へニックを入れることを含む。

態様324．態様323の方法であって、ヌクレアーゼがトランスで提供され、提供される。

態様325．態様305の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3'端を形成するステップが、DNA鎖を化学的薬剤と接触させることを含む。

態様326．態様305の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3'端を形成するステップが、複製エラーを導入することを含む。

態様327．態様305の方法であって、DNA分子をnapDNAbpおよびガイドRNAと接触させるステップがRループを形成する。

態様328．態様327の方法であって、暴露された3'端が形成されるDNA鎖がRループ上にある。

態様329．態様315の方法であって、PEgRNAが、逆転写酵素(RT)鋳型配列とプライマー結合部位とを含む伸長アームを含む。

態様330．態様329の方法であって、伸長アームが、ガイドRNAの3'端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置にある。

態様331．態様305の方法であって、PEgRNAが、さらに、リンカー、ステムループ、ヘアピン、トウループ、アプタマー、またはRNA-タンパク質動員ドメインからなる群から選択される少なくとも1つの追加の構造を含む。

態様332．態様305の方法であって、PEgRNAがさらに相同アームを含む。

態様333．態様305の方法であって、RT鋳型配列が、対応する内生DNAに対して相同的である。

態様334．プライム標的にプライムされた逆転写によって、標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって標的座位におけるDNA分子上に所望のヌクレオチド変化を組み込むことを含む。

態様335．態様334の方法であって、RT鋳型が、ガイドRNAの3'端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置付けに位置付けられる。

態様336．態様334の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、トランジション、トランスバージョン、挿入、もしくは欠失、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。

態様337．態様334の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択されるトランジションを含む。

態様338．請求項334の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択されるトランスバージョンを含む。

態様339．態様334の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。

態様340．態様243-259のいずれか1つのPEgRNAをコードするポリヌクレオチド。

態様341．態様340のポリヌクレオチドを含むベクター。

態様342．態様341のベクターを含む細胞。

態様343．態様213の融合タンパク質であって、ポリメラーゼがエラーを起こしやすい逆転写酵素である。

態様344．プライム標的にプライムされた逆転写によって標的座位におけるDNA分子に変異導入するための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびエラーを起こしやすい逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、変異導入された一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、変異導入された一本鎖DNAを標的座位におけるDNA分子上に組み込むことを含む。

態様345．いずれかの先行する態様の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様346．いずれかの先行する態様の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様347．態様344の方法であって、napDNAbpが配列番号18-25のアミノ酸配列を含む。

態様348．態様344の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。

態様349．態様344の方法であって、(b)プライム標的にプライムされた逆転写を行うステップが、ガイドRNA上のプライマー結合部位へのアニーリングによって逆転写をプライムすることができる標的座位における3'端プライマー結合配列を生成することを含む。

態様350．健康な数の反復トリヌクレオチドを含む健康な配列によって標的DNA分子上のトリヌクレオチド反復拡大変異を置き換えるための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含む融合タンパク質ならびに(ii)置き換え配列を含むDNA合成鋳型とプライマー結合部位とを含むPEgRNAと接触させること;(b)プライム編集を行なって、置き換え配列を含む一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的座位におけるDNA分子上に一本鎖DNAを組み込むことを含む。

態様351．態様350の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様352．態様350の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様353．態様350の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様354．態様350の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。

態様355．態様350の方法であって、(b)プライム編集を行うステップが、ガイドRNA上のプライマー結合部位へのアニーリングによってポリメラーゼをプライムすることができる標的座位における3’端プライマー結合配列を生成することを含む。

態様356．態様350の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がハンチントン病、脆弱X症候群、またはフリードライヒ運動失調症に関連する。

態様357．態様350の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がCAGトリプレットの繰り返し単位を含む。

態様358．態様350の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がGAAトリプレットの繰り返し単位を含む。

態様359．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に機能部分を組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードするDNA合成鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)機能部分をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と機能部分とを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様360．態様359の方法であって、機能部分がペプチドタグである。

態様361．態様360の方法であって、ペプチドタグがアフィニティータグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープもしくは免疫エピトープタグ、または蛍光タグである。

態様362．態様360の方法であって、ペプチドタグが:AviTag(配列番号245);Cタグ(配列番号246);カルモジュリンタグ(配列番号247);ポリグルタミン酸タグ(配列番号248);Eタグ(配列番号249);FLAGタグ(配列番号2);HAタグ(配列番号5);Hisタグ(配列番号252-262);Mycタグ(配列番号6);NEタグ(配列番号264);Rho1D4タグ(配列番号265);Sタグ(配列番号266);SBPタグ(配列番号267);Softag-1(配列番号268);Softag-2(配列番号269);Spotタグ(配列番号270);Strepタグ(配列番号271);TCタグ(配列番号272);Tyタグ(配列番号273);V5タグ(配列番号3);VSVタグ(配列番号275);およびXpressタグ(配列番号276)からなる群から選択される。

態様363．態様360の方法であって、ペプチドタグが:AU1エピトープ(配列番号278);AU5エピトープ(配列番号279);バクテリオファージT7エピトープ(T7タグ)(配列番号280);ブルータングウイルスタグ(Bタグ)(配列番号281);E2エピトープ(配列番号282);ヒスチジンアフィニティータグ(HAT)(配列番号283);HSVエピトープ(配列番号284);ポリアルギニン(Argタグ)(配列番号285);ポリアスパラギン酸(Aspタグ)(配列番号286);ポリフェニルアラニン(Pheタグ)(配列番号287);S1タグ(配列番号288);Sタグ(配列番号266);およびVSV-G(配列番号275)からなる群から選択される。

態様364．態様359の方法であって、機能部分が免疫エピトープである。

態様365．態様364の方法であって、免疫エピトープが:破傷風トキソイド(配列番号396);ジフテリア毒素変異体CRM197(配列番号630);ムンプス免疫エピトープ1(配列番号400);ムンプス免疫エピトープ2(配列番号402);ムンプス免疫エピトープ3(配列番号404);風疹ウイルス(配列番号406);ヘマグルチニン(配列番号408);ノイラミニダーゼ(配列番号410);TAP1(配列番号412);TAP2(配列番号414);クラスI HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号416);クラスI HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号418);クラスII HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号420);クラスII HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号422);ヘマグルチニンエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号424);ノイラミニダーゼエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号426)からなる群から選択される。

態様366．態様359の方法であって、機能部分が目当てのタンパク質の局在を変改する。

態様367．態様359の方法であって、機能部分が分解タグであり、その結果、目当てのタンパク質の分解速度が変改される。

態様368．態様367の方法であって、分解タグが、タグ付けされたタンパク質の消去をもたらす。

態様369．態様359の方法であって、機能部分が低分子結合ドメインである。

態様370．態様359の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号488のFKBP12である。

態様371．態様359の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号489のFKBP12-F36Vである。

態様372．態様359の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号490および493～494のシクロフィリンである。

態様373．態様359の方法であって、低分子結合ドメインが目当ての2つ以上のタンパク質上に組み入れされる。

態様374．態様373の方法であって、目当ての2つ以上のタンパク質が低分子と接触することによって二量体化し得る。

態様375．態様369の方法であって、低分子が、群1の態様163に開示される化合物からなる群から選択される低分子の二量体である。

態様376．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に免疫エピトープを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)免疫エピトープをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と免疫エピトープとを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様377．態様376の方法であって、免疫エピトープが:破傷風トキソイド(配列番号396);ジフテリア毒素変異体CRM197(配列番号630);ムンプス免疫エピトープ1(配列番号400);ムンプス免疫エピトープ2(配列番号402);ムンプス免疫エピトープ3(配列番号404);風疹ウイルス(配列番号406);ヘマグルチニン(配列番号408);ノイラミニダーゼ(配列番号410);TAP1(配列番号412);TAP2(配列番号414);クラスI HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号416);クラスI HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号418);クラスII HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号420);クラスII HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号422);ヘマグルチニンエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号424);ノイラミニダーゼエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号426)からなる群から選択される。

態様378．態様376の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様379．態様376の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様380．態様376の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様381．態様376の方法であって、PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777を含む。

態様382．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に低分子二量体化ドメインを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)低分子二量体化ドメインをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)免疫エピトープをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と低分子二量体化ドメインとを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様383．態様382の方法であって、さらに、目当ての第2のタンパク質に対して方法を行うことを含む。

態様384．態様383の方法であって、目当ての第1のタンパク質および目当ての第2のタンパク質が、前記タンパク質の夫々の二量体化ドメインに結合する低分子の存在下において二量体化する。

態様385．態様382の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号488のFKBP12である。

態様386．態様382の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号489のFKBP12-F36Vである。

態様387．態様382の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号490および493～494のシクロフィリンである。

態様388．態様382の方法であって、低分子が、群1の態様163に開示される化合物からなる群から選択される低分子の二量体である。

態様389．態様382の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様390．態様382の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様391．態様382の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様392．態様382の方法であって、PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777を含む。

態様393．プライム編集を用いてタンパク質上にペプチドタグまたはエピトープを組み入れる方法であって:タンパク質をコードする標的ヌクレオチド配列を、ペプチドタグをコードする第2のヌクレオチド配列をそれに挿入するように構成されたプライム編集因子構築物と接触させて、組み換えヌクレオチド配列をもたらすことを含み、その結果、ペプチドタグおよびタンパク質が融合タンパク質として組み換えヌクレオチド配列から発現される。

態様394．態様383の方法であって、ペプチドタグがタンパク質の精製および/または検出に用いられる。

態様395．態様383の方法であって、ペプチドタグが、ポリヒスチジン(例えば、HHHHHH)(配列番号252～262)、FLAG(例えば、DYKDDDDK)(配列番号2)、V5(例えば、GKPIPNPLLGLDST)(配列番号3)、GCN4、HA(例えば、YPYDVPDYA)(配列番号5)、Myc(例えばEQKLISEED)(配列番号6)、またはGSTである。

態様396．態様383の方法であって、ペプチドタグが、配列番号1～6、245～249、252～262、264～273、275～276、281、278～288、および622からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

態様397．態様383の方法であって、ペプチドタグがリンカーによってタンパク質に融合される。

態様398．態様383の方法であって、融合タンパク質が次の構造を有し:[タンパク質]-[ペプチドタグ]または[ペプチドタグ]-[タンパク質]、「]-[」が任意のリンカーを表す。

態様399．態様383の方法であって、リンカーが配列番号127、165～176、446、453、および767～769のアミノ酸配列を有する。

態様400．態様383の方法であって、プライム編集因子構築物が、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735-761、776-777のヌクレオチド配列を含むPEgRNAを含む。

態様401．態様383の方法であって、PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、伸長アームがペプチドタグをコードする逆転写酵素鋳型を含む。

態様402．態様383の方法であって、PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、伸長アームがペプチドタグをコードする逆転写酵素鋳型を含む。

態様403．プライム編集によって標的ヌクレオチド配列によってコードされるPRNP上に1つ以上の防護性変異を組み入れることによって、プリオン病を防止またはその進行を停止させる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)防護性変異をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、ミスフォールディングに対して耐性である防護性変異を含むPRNPをコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様404．態様403の方法であって、プリオン病がヒトプリオン病である。

態様405．態様403の方法であって、プリオン病が動物プリオン病である。

態様406．態様404の方法であって、プリオン病がクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、またはクールー病である。

態様407．態様403の方法であって、プリオン病が牛海綿状脳症(BSEまたは「狂牛病」)、慢性消耗病(CWD)、スクレイピー、伝達性ミンク脳症、ネコ海綿状脳症、および有蹄類海綿状脳症である。

態様408．態様403の方法であって、野生型PRNPアミノ酸配列が配列番号291～292である。

態様409．態様403の方法であって、方法が、配列番号293～309、311～323からなる群から選択される改変されたPRNPアミノ酸配列をもたらし、前記改変されたPRNPタンパク質がミスフォールディングに対して耐性である。

態様410．態様403の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様411．態様403の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様412．態様403の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様413．態様403の方法であって、PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777を含む。

態様414．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのRNA上にリボヌクレオチドモチーフまたはタグを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、リボヌクレオチドモチーフまたはタグを含む目当ての修飾されたRNAをコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様415．態様414の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが検出部分である。

態様416．態様414の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが目当てのRNAの発現レベルに影響する。

態様417．態様414の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが目当てのRNAの輸送または細胞下レベル位置付けに影響する。

態様418．態様414の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが、SV40 1型、SV40 2型、SV40 3型、hGH、BGH、rbGlob、TK、MALAT1 ENE-mascRNA、KSHV PAN ENE、Smbox/U1 snRNAボックス、U1 snRNA 3’ボックス、tRNA-リジン、broccoliアプタマー、spinachアプタマー、mangoアプタマー、HDVリボザイム、およびm6Aからなる群から選択される。

態様419．態様414の方法であって、PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777を含む。

態様420．態様414の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様421．態様414の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様422．態様414の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様423．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上の機能部分を組み入れまたは欠失する方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分またはその欠失をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)機能部分またはその欠失をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質および機能部分またはその除去を含む改変されたタンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生じ、機能部分がタンパク質の修飾状態または局在状態を変改する。

態様424．態様423の方法であって、機能部分が、目当てのタンパク質のリン酸化、ユビキチン化、グリコシル化、脂質修飾、ヒドロキシル化、メチル化、アセチル化、クロトニル化、SUMO化状態を変改する。

態様425．融合タンパク質であって、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)ドメインとRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインとを含む。

態様426．態様425の融合タンパク質であって、融合タンパク質が、プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)の存在下においてプライム編集を実行して、所望のヌクレオチド変化を標的配列上に組み入れることができる。

態様427．態様425の融合タンパク質であって、napDNAbpドメインがニッカーゼ活性を有する。

態様428．態様425の融合タンパク質であって、napDNAbpドメインがCas9タンパク質またはそのバリアントである。

態様429．態様425の融合タンパク質であって、napDNAbpドメインが、ヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様430．態様425の融合タンパク質であって、napDNAbpドメインがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様431．態様425の融合タンパク質であって、napDNAbpドメインが:Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する。

態様432．態様425の融合タンパク質であって、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインが逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

態様433．態様425の融合タンパク質であって、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインが逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意に、RNA依存性DNAポリメラーゼを含むドメインがエラーを起こしやすいである。

態様434．態様425の融合タンパク質であって、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインが、レトロウイルスまたはレトロトランスポゾンからの天然に存在する逆転写酵素である。

態様435．態様425の融合タンパク質であって、融合タンパク質がPEgRNAと複合体化したときに標的DNA配列に結合することができる。

態様436．態様435の融合タンパク質であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含む。

態様437．態様435の融合タンパク質であって、PEgRNAと複合体化した融合タンパク質の結合がRループを形成する。

態様438．態様437の融合タンパク質であって、Rループが、(i)PEgRNAと標的鎖とを含むRNA-DNAハイブリッドおよび(ii)相補的な非標的鎖を含む。

態様439．態様437の融合タンパク質であって、標的または相補的な非標的鎖がニッキングされて、遊離の3’端を有するプライム配列を形成する。

態様440．態様439の融合タンパク質であって、ニック部位が標的鎖上のPAM配列の上流にある。

態様441．態様439の融合タンパク質であって、ニック部位が非標的鎖上のPAM配列の上流にある。

態様442．態様439の融合タンパク質であって、ニック部位がPAM配列の5'端に対して相対的に-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、または-9である。

態様443．態様426の融合タンパク質であって、PEgRNAがガイドRNAおよび少なくとも1つの核酸伸長アームを含む。

態様444．態様443の融合タンパク質であって、伸長アームが、ガイドRNAの5'もしくは3'端またはガイドRNAの分子内の位置付けにある。

態様445．態様443の融合タンパク質であって、伸長アームが(i)所望のヌクレオチド変化を含むDNA合成鋳型配列および(ii)プライマー結合部位を含む。

態様446．態様445の融合タンパク質であって、DNA合成鋳型配列が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。

態様447．態様443の融合タンパク質であって、伸長アームが、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも41ヌクレオチド、少なくとも42ヌクレオチド、少なくとも43ヌクレオチド、少なくとも44ヌクレオチド、少なくとも45ヌクレオチド、少なくとも46ヌクレオチド、少なくとも47ヌクレオチド、少なくとも48ヌクレオチド、少なくとも49ヌクレオチド、または少なくとも50ヌクレオチドである。

態様448．態様443の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップが、ニック部位に隣接する内生DNA配列にハイブリダイズし、それによって所望のヌクレオチド変化を標的鎖上に組み入れる。

態様449．態様443の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップが、遊離の5'端を有しかつニック部位に隣接する内生DNA配列に取って代わる。

態様450．態様446の融合タンパク質であって、5'端を有する内生DNA配列が細胞によって切除される。

態様451．態様446の融合タンパク質であって、5'端を有する内生DNA配列がフラップエンドヌクレアーゼによって切除される。

態様452．態様448の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が、所望のヌクレオチド変化を非標的鎖上に組み込み、それによって所望の産物を形成する。

態様453．態様449の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化が、PAM配列の約-4から+10の間、またはPAM配列の約-10から+20の間、またはPAM配列の約-20から+40の間、またはPAM配列の約-30から+100の間である編集窓上に組み入れされる。

態様454．態様449の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化が、ニック部位の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100ヌクレオチド下流に組み入れされる。

態様455．態様425の融合タンパク質であって、napDNAbpが、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号18のアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様456．態様425の融合タンパク質であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様457．先の態様のいずれか1つの融合タンパク質であって、融合タンパク質が構造NH2-[napDNAbp]-[RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメイン]-COOH;またはNH2-[RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメイン]-[napDNAbp]-COOHを含み、「]-[」の夫々のものが任意のリンカー配列の存在を指示する。

態様458．態様457の融合タンパク質であって、リンカー配列が配列番号127、165～176、446、453、および767～769のアミノ酸配列を含む。

態様459．態様425の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化が1ヌクレオチド変化、1つ以上のヌクレオチドの挿入、または1つ以上のヌクレオチドの欠失である。

態様460．態様459の融合タンパク質であって、挿入または欠失が、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、少なくとも41、少なくとも42、少なくとも43、少なくとも44、少なくとも45、少なくとも46、少なくとも47、少なくとも48、少なくとも49、または少なくとも50である。

態様461．態様425～460のいずれかの融合タンパク質とPEgRNAとを含む複合体であって、PEgRNAが融合タンパク質をプライム編集の標的DNA配列へと導く。

態様462．態様461の複合体であって、PEgRNAが、ガイドRNAと、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置における核酸伸長アームとを含む。

態様463．態様462の複合体であって、PEgRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。

態様464．態様463の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。

態様465．態様464の複合体であって、少なくとも1つの核酸伸長アームが(i)DNA合成鋳型および(ii)プライマー結合部位を含む。

態様466．態様464の複合体であって、PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777のヌクレオチド配列、または配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777のいずれか1つとの少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％もしくは少なくとも98％もしくは少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

態様467．態様465の複合体であって、DNA合成鋳型が、内生DNA標的と少なくとも80％または85％または90％または95％または99％同一であるヌクレオチド配列を含む。

態様468．態様465の複合体であって、プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。

態様469．態様461の複合体であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼである。

態様470．態様461の複合体であって、napDNAbpが、配列番号18のアミノ酸配列、または配列番号18との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様471．態様461の複合体であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様472．態様461の複合体であって、PEgRNAが、ガイドRNAと、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置における核酸伸長アームとを含む。

態様473．態様465の複合体であって、DNA合成鋳型が、内生DNA標的と少なくとも80％または85％または90％または95％または99％同一であるヌクレオチド配列を含む。

態様474．態様465の複合体であって、プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。

態様475．態様462の複合体であって、PEgRNAが、さらに、リンカー、ステムループ、ヘアピン、トウループ、アプタマー、またはRNA-タンパク質動員ドメインからなる群から選択される少なくとも1つの追加の構造を含む。

態様476．態様425～461のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

態様477．上の態様のいずれかのPEgRNAをコードするポリヌクレオチド。

態様478．態様476のポリヌクレオチドを含むベクターであって、融合タンパク質の発現がプロモーターのコントロール下にある。

態様479．態様477のポリヌクレオチドを含むベクターであって、PEgRNAの発現がプロモーターのコントロール下にある。

態様480．態様479のベクターであって、プロモーターがU6プロモーターである。

態様481．態様479のベクターであって、プロモーターがCMVプロモーターである。

態様482．態様480のベクターであって、PEgRNAが、U6プロモーターによる転写効率を改善するために、伸長アーム上のTの1つ以上の繰り返しのクラスターを除去するように操作される。

態様483．態様482のベクターであって、除去されるTの1つ以上の繰り返しのクラスターが、少なくとも3つのT、少なくとも4つのT、少なくとも5つのT、少なくとも6つのT、少なくとも7つのT、少なくとも8つのT、少なくとも9つのT、少なくとも10のT、少なくとも11のT、少なくとも12のT、少なくとも13のT、少なくとも14のT、少なくとも15のT、少なくとも16のT、少なくとも17のT、少なくとも18のT、少なくとも19のT、または少なくとも20のTを含む。

態様484．態様425～460のいずれかの融合タンパク質と融合タンパク質のnapDNAbpに結合したPEgRNAとを含む細胞。

態様485．態様461～475のいずれか1つの複合体を含む細胞。

態様486．医薬組成物であって:(i)態様425～460のいずれかの融合タンパク質、態様461～475の複合体、態様476～477のポリヌクレオチド、または態様478～483のベクター;および(ii)薬学的に許容される賦形剤を含む。

態様487．医薬組成物であって:(i)態様461～475の複合体、(ii)トランスで提供されるポリメラーゼ;および(iii)薬学的に許容される賦形剤を含む。

態様488．プライム編集のためのキットであって:(i)態様425～460のいずれか1つの融合タンパク質をコードする核酸分子;および(ii)融合タンパク質を標的DNA部位へと導くことができるPEgRNAをコードする核酸分子を含み、(i)および(ii)の核酸分子が単一のDNA構築物または別個のDNA構築物上に含有され得る。

態様489．態様488のキットであって、(i)の核酸分子が、さらに、融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターを含む。

態様490．態様488のキットであって、(ii)の核酸分子が、さらに、PEgRNAの発現を駆動するプロモーターを含む。

態様491．態様490のキットであって、プロモーターがU6プロモーターである。

態様492．態様490のキットであって、プロモーターがCMVプロモーターである。

態様493．態様457の融合タンパク質であって、リンカー配列が配列番号174(1×SGGS)、3888(2×SGGS)、3889(3×SGGS)、3890(1×XTEN)、3891(1×EAAAK)、3892(2×EAAAK)、および3893(3×EAAAK)のアミノ酸配列を含む。

群B．PEガイドおよびデザインの方法
態様1．ガイドRNAとDNA合成鋳型を含む少なくとも1つの核酸伸長アームとを含むPEgRNA。

態様2．態様1のPEgRNAであって、核酸伸長アームがガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置の位置であり、核酸伸長アームがDNAまたはRNAである。

態様3．態様1のPEgRNAであって、PEgRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。

態様4．態様3のPEgRNAであって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含む。

態様5．態様3のPEgRNAであって、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。

態様6．態様1のPEgRNAであって、少なくとも1つの核酸伸長アームがさらにプライマー結合部位を含む。

態様7．態様1のPEgRNAであって、核酸伸長アームが、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも41ヌクレオチド、少なくとも42ヌクレオチド、少なくとも43ヌクレオチド、少なくとも44ヌクレオチド、少なくとも45ヌクレオチド、少なくとも46ヌクレオチド、少なくとも47ヌクレオチド、少なくとも48ヌクレオチド、少なくとも49ヌクレオチド、または少なくとも50ヌクレオチドである。

態様8．態様1のPEgRNAであって、DNA合成鋳型が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。

態様9．態様6のPEgRNAであって、プライマー結合部位が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。

態様10．態様1のPEgRNAであって、さらに、tRNA、リンカー、ステムループ、ヘアピン、トウループ、アプタマー、またはRNA-タンパク質動員ドメインからなる群から選択される少なくとも1つの追加の構造を含む。

態様11．態様1のPEgRNAであって、DNA合成鋳型が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。

態様12．態様11のPEgRNAであって、一本鎖DNAフラップが、ニッキングされた標的DNA配列上の5'端を有する内生一本鎖DNAを押し除け、内生一本鎖DNAがニック部位の下流において直ちに隣接する。

態様13．態様11のPEgRNAであって、遊離の5'端を有する内生一本鎖DNAが細胞によって切除される。

態様14．態様13のPEgRNAであって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。

態様15．態様1のPEgRNAであって、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777のヌクレオチド配列、または配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777のいずれか1つとの少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％もしくは少なくとも98％もしくは少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

態様16．態様1のPEgRNAであって、DNA合成鋳型が、内生DNA標的と少なくとも80％または85％または90％または95％または99％同一であるヌクレオチド配列を含む。

態様17．態様6のPEgRNAであって、プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。

態様18．態様10のPEgRNAであって、少なくとも1つの追加の構造がPEgRNAの3'または5'端に位置付けられる。

態様19．態様10のPEgRNAであって、リンカーが、配列番号127、165～176、446、453、および767～769からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

態様20．態様10のPEgRNAであって、ステムループが本明細書に記載のステムループから選択されるヌクレオチド配列を含む。

態様21．態様10のPEgRNAであって、ヘアピンが本明細書に記載のヘアピンから選択されるヌクレオチド配列を含む。

態様22．態様10のPEgRNAであって、トウループが本明細書に記載のトウループから選択されるヌクレオチド配列を含む。

態様23．態様10のPEgRNAであって、アプタマーが、本明細書に記載のアプタマーから選択されるヌクレオチド配列を含む。

態様24．態様10のPEgRNAであって、RNA-タンパク質動員ドメインが、本明細書に記載のRNA-タンパク質動員ドメインから選択されるヌクレオチド配列を含む。

態様25．所望のヌクレオチド変化を標的ヌクレオチド配列上に組み入れるためのプライム編集への使用のためのPEgRNAをデザインするための方法であって、前記PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、前記伸長アームがプライマー結合部位およびDNA合成鋳型を含み、前記方法が:

(i)標的ヌクレオチド配列上の所望の標的編集部位を選択すること;

(ii)標的編集部位の上流および下流のコンテキストヌクレオチド配列を得ること;

(iii)所望の標的編集部位に対して近位であるコンテキストヌクレオチド配列上の推定プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)部位を位置付けること;

(iv)各推定PAM部位について対応するニック部位を同定すること;

(v)スペーサーをデザインすること;

(vi)gRNAコアをデザインすること;

(vii)伸長アームをデザインすること;および

(viii)スペーサー、gRNAコア、および伸長アームをコンカテネーションすることによって完全なPEgRNAを構築すること、
を含む。

態様26．態様25の方法であって、所望の標的編集部位を選択するステップ(i)が、疾患を引き起こす変異を選択することを含む。

態様27．態様26の方法であって、疾患を引き起こす変異が:がん、自己免疫障害、神経学的障害、皮膚障害、呼吸疾患、および心臓疾患からなる群から選択される疾患に関連する。

態様28．態様25の方法であって、標的編集部位から上流および下流のコンテキストヌクレオチド配列を得るステップ(ii)が、所望の標的編集部位を含む領域の約50～55塩基対(bp)、約55～60bp、約60～65bp、約65～70bp、約70～75bp、約75～80bp、約80～85bp、約85～90bp、約90～95bp、約95～100bp、約100～105bp、約105～110bp、約110～125bp、約125～130bp、約130～135bp、約135～140bp、約140～145bp、約145～150bp、約150～155bp、約155～160bp、約160～165bp、約165～170bp、約170～175bp、約175～180bp、約180～185bp、約185～190bp、約190～195bp、約195～200bp、約200～205bp、約205～210bp、約210～215bp、約215～220bp、約220～225bp、約225～230bp、約230～235bp、約235～240bp、約240～245bp、または約245～250bpを得ることを含む。

態様29．態様28の方法であって、所望の標的編集部位が、コンテキストヌクレオチド配列の各端からおよそ等距離に位置取る。

態様30．態様25の方法であって、ステップ(iii)において、推定PAM部位が所望の標的編集部位に対して近位である。

態様31．態様25の方法であって、ステップ(iii)において、推定PAM部位が、標的編集部位から30ヌクレオチド未満の、または標的編集部位から29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、もしくは2ヌクレオチド未満の位置に位置付けられた関連するニック部位を有するものを含む。

態様32．態様25の方法であって、ステップ(iii)において、推定PAM部位が、標的編集部位から30ヌクレオチド超の、または標的編集部位から31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100ヌクレオチド超の位置に位置付けられた関連するニック部位を有するものを含む。

態様33．態様25の方法であって、ステップ(iii)において、推定PAM部位が、前記PAM部位に結合する1つのまたは対応するnapDNAbpに関連する。

態様34．態様33の方法であって、推定PAM部位およびそれらの対応するnapDNAbpが、次の群分けのいずれかから選択される:(a)配列番号18～25および87～88のSpCas9ならびにNGG;(b)Sp VQR nCas9;ならびに(c)NGAN。

態様35．態様25の方法であって、スペーサーをデザインするステップ(v)が、各推定PAMに関連するプロトスペーサー配列の相補ヌクレオチド配列を決定することを含む。

態様36．態様25の方法であって、gRNAコアをデザインするステップ(vi)が、各推定PAMという文脈において、前記推定PAMの夫々に関連するnapDNAbpに結合することができるgRNAコア配列を選択することを含む。

態様37．態様25の方法であって、伸長アームをデザインするステップ(vii)が、(a)目当ての編集を含むDNA合成鋳型および(b)プライマー結合部位をデザインすることを含む。

態様38．態様37の方法であって、プライマー結合部位をデザインすることが、(a)標的ヌクレオチド配列のPAM含有鎖上のDNAプライマーを同定し、DNAプライマーの3'端が、PAM部位に関連するニック部位の上流の最初のヌクレオチドであること、および(b)DNAプライマーの相補体をデザインし、前記相補体がプライマー結合部位を形成することを含む。

態様39．態様38の方法であって、プライマー結合部位が長さが8から15ヌクレオチドである。

態様40．態様38の方法であって、DNAプライマーが約40～60％GC含量を含有する場合に、プライマー結合部位が12～13ヌクレオチドである。

態様41．態様38の方法であって、DNAプライマーが約40％未満のGC含量を含有する場合に、プライマー結合部位が14～15ヌクレオチドである。

態様42．態様38の方法であって、DNAプライマーが約60％よりも多大なGC含量を含有する場合に、プライマー結合部位が8～11ヌクレオチドである。

態様43．プライム編集の方法であって、標的DNA配列を、態様1～24のいずれかのPEgRNAならびにnapDNAbpおよびRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有するドメインを含むプライム編集因子融合タンパク質と接触させることを含む。

態様44．態様43の方法であって、napDNAbpがニッカーゼ活性を有する。

態様45．態様43の方法であって、napDNAbpがCas9タンパク質またはそのバリアントである。

態様46．態様43の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様47．態様43の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様48．態様43の方法であって、napDNAbpが:Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する。

態様49．態様43の方法であって、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインが逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

態様50．態様43の方法であって、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインが逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様51．態様43の方法であって、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインが、レトロウイルスまたはレトロトランスポゾンからの天然に存在する逆転写酵素である。

群C．PE複合体
態様1．プライム編集のための複合体であって:

(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)とaRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインとを含む融合タンパク質;および

(ii)プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)、
を含む。

態様2．態様1の複合体であって、融合タンパク質が、プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)の存在下においてプライム編集を実行して、所望のヌクレオチド変化を標的配列上に組み入れることができる。

態様3．態様11の複合体であって、napDNAbpがニッカーゼ活性を有する。

態様4．態様1の複合体であって、napDNAbpがCas9タンパク質またはそのバリアントである。

態様5．態様1の複合体であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様6．態様1の複合体であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様7．態様1の複合体であって、napDNAbpが:Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する。

態様8．態様1の複合体であって、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインが逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

態様9．態様1の複合体であって、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインが逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様10．態様1の複合体であって、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインが、レトロウイルスまたはレトロトランスポゾンからの天然に存在する逆転写酵素である。

態様11．態様1の複合体であって、融合タンパク質がPEgRNAと複合体化したときに標的DNA配列に結合することができる。

態様12．態様1の複合体であって、PEgRNAが、ガイドRNAとDNA合成鋳型を含む少なくとも1つの核酸伸長アームとを含む。

態様13．態様12の複合体であって、核酸伸長アームがガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置の位置であり、核酸伸長アームがDNAまたはRNAである。

態様14．態様12の複合体であって、PEgRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。

態様15．態様14の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含む。

態様16．態様12の複合体であって、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。

態様17．態様12の複合体であって、少なくとも1つの核酸伸長アームがさらにプライマー結合部位を含む。

態様18．態様12の複合体であって、核酸伸長アームが、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも41ヌクレオチド、少なくとも42ヌクレオチド、少なくとも43ヌクレオチド、少なくとも44ヌクレオチド、少なくとも45ヌクレオチド、少なくとも46ヌクレオチド、少なくとも47ヌクレオチド、少なくとも48ヌクレオチド、少なくとも49ヌクレオチド、または少なくとも50ヌクレオチドである。

態様19．態様12の複合体であって、DNA合成鋳型が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。

態様20．態様17の複合体であって、プライマー結合部位が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。

態様21．態様12の複合体であって、PEgRNAが、さらに、リンカー、ステムループ、ヘアピン、トウループ、アプタマー、またはRNA-タンパク質動員ドメインからなる群から選択される少なくとも1つの追加の構造を含む。

態様22．態様12の複合体であって、DNA合成鋳型が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。

態様23．態様22の複合体であって、一本鎖DNAフラップが、ニッキングされた標的DNA配列上の5'端を有する内生一本鎖DNAを押し除け、内生一本鎖DNAがニック部位の下流において直ちに隣接する。

態様24．態様23の複合体であって、遊離の5'端を有する内生一本鎖DNAが細胞によって切除される。

態様25．態様23の複合体であって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。

態様26．態様12の複合体であって、PEgRNAが、配列番号18～36のヌクレオチド配列、または配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777のいずれか1つとの少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％もしくは少なくとも98％もしくは少なくとも99％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

態様27．態様12の複合体であって、DNA合成鋳型が、内生DNA標的と少なくとも80％または85％または90％または95％または99％同一であるヌクレオチド配列を含む。

態様28．態様17の複合体であって、プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。

態様29．態様21の複合体であって、少なくとも1つの追加の構造がPEgRNAの3'または5'端に位置付けられる。

態様30．態様29の複合体であって、リンカーが、配列番号127、165～176、446、453、および767～769からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

態様31．態様29の複合体であって、ステムループが、本明細書に記載のステムループから選択されるヌクレオチド配列を含む。

態様32．態様29の複合体であって、ヘアピンが、本明細書に記載のヘアピンから選択されるヌクレオチド配列を含む。

態様33．態様29の複合体であって、トウループが、本明細書に記載のトウループから選択されるヌクレオチド配列を含む。

態様34．態様29の複合体であって、アプタマーが、本明細書に記載のアプタマーから選択されるヌクレオチド配列を含む。

態様35．態様29の複合体であって、RNA-タンパク質動員ドメインが、本明細書に記載のRNA-タンパク質動員ドメインから選択されるヌクレオチド配列を含む。

態様36．態様1の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含む。

態様37．態様36の複合体であって、Rループが、(i)PEgRNAと標的鎖とを含むRNA-DNAハイブリッドおよび(ii)相補的な非標的鎖を含む。

態様38．態様37の複合体であって、標的または相補的な非標的鎖がニッキングされて、遊離の3’端を有するプライム配列を形成する。

態様39．態様38の複合体であって、ニック部位が標的鎖上のPAM配列の上流にある。

態様40．態様38の複合体であって、ニック部位が非標的鎖上のPAM配列の上流にある。

態様41．態様38の複合体であって、ニック部位がPAM配列の5'端に対して相対的に-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、または-9である。

態様42．態様22の複合体であって、一本鎖DNAフラップが、ニック部位に隣接する内生DNA配列にハイブリダイズし、それによって所望のヌクレオチド変化を標的鎖上に組み入れる。

態様43．態様22の複合体であって、一本鎖DNAフラップが、遊離の5'端を有しかつニック部位に隣接する内生DNA配列に取って代わる。

態様44．態様22の複合体であって、5'端を有する内生DNA配列が細胞によって切除される。

態様45．態様44の複合体であって、5'端を有する内生DNA配列がフラップエンドヌクレアーゼによって切除される。

態様46．態様43の複合体であって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が、所望のヌクレオチド変化を非標的鎖上に組み込み、それによって所望の産物を形成する。

態様47．態様46の複合体であって、所望のヌクレオチド変化が、PAM配列の約-4から+10の間、またはPAM配列の約-10から+20の間、またはPAM配列の約-20から+40の間、またはPAM配列の約-30から+100の間である編集窓上に組み入れされる。

態様48．態様47の複合体であって、所望のヌクレオチド変化が、ニック部位の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100ヌクレオチド下流に組み入れされる。

態様49．先の態様のいずれか1つの複合体であって、融合タンパク質が構造NH2-[napDNAbp]-[RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメイン]-COOH;またはNH2-[RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメイン]-[napDNAbp]-COOHを含み、「]-[」の夫々のものが任意のリンカー配列の存在を指示する。

態様50．態様49の複合体であって、リンカー配列が配列番号127、165～176、446、453、および767～769のアミノ酸配列を含む。

態様51．態様1の複合体であって、融合タンパク質が、さらに、napDNAbpとRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインとを連結するリンカーを含む。

態様52．態様51の複合体であって、リンカー配列が配列番号3887(1×SGGS)、3888(2×SGGS)、3889(3×SGGS)、3890(1×XTEN)、3891(1×EAAAK)、3892(2×EAAAK)、および3893(3×EAAAK)のアミノ酸配列を含む。
群D．変異を修正するためのPE法

態様1．所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列に組み入れるための方法であって、方法が:
融合タンパク質およびPEgRNAを含む複合体と二本鎖DNA配列を接触させ、融合タンパク質がnapDNAbpおよびポリメラーゼを含み、PEgRNAが所望のヌクレオチド変化を含むDNA合成鋳型とプライマー結合部位とを含むこと;

それによって、二本鎖DNA配列にニッキングし、それによって3’端を有する遊離の一本鎖DNAを生成すること;

それによって、遊離の一本鎖DNAの3’端をプライマー結合部位にハイブリダイズさせ、それによってポリメラーゼをプライムすること;

それによって、プライマー結合部位にハイブリダイズした3’端からDNAの鎖を重合し、それによって、DNA合成鋳型に対して相補的であるかつ所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを生成すること;

それによって、カットされた部位に隣接する内生DNA鎖を一本鎖DNAフラップによって置き換え、それによって所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列に組み入れること、
を含む。

態様2．態様1の方法であって、内生DNA鎖を置き換えることが:(i)一本鎖DNAフラップをカットされた部位に隣接する内生DNA鎖にハイブリダイズさせて、配列ミスマッチを生出すること;(ii)内生DNA鎖を切り出すこと;および(iii)ミスマッチを修復して、所望のヌクレオチド変化をDNAの両方の鎖に含む所望の産物を形成することを含む。

態様3．態様1の方法であって、所望のヌクレオチド変化が1ヌクレオチド置換、欠失、または挿入である。

態様4．態様3の方法であって、1ヌクレオチド置換がトランジションまたはトランスバージョンである。

態様5．態様1の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)GからTの置換、(2)GからAの置換、(3)GからCの置換、(4)TからGの置換、(5)TからAの置換、(6)TからCの置換、(7)CからGの置換、(8)CからTの置換、(9)CからAの置換、(10)AからTの置換、(11)AからGの置換、または(12)AからCの置換である。

態様6．態様1の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変換する。

態様7．態様1の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの挿入または欠失である。

態様8．態様1の方法であって、所望のヌクレオチド変化が疾患関連遺伝子を修正する。

態様9．態様8の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;トリヌクレオチド反復障害;プリオン病;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。

態様10．態様8の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。

態様11．態様1の方法であって、napDNAbpが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、Cas9ニッカーゼ(nCas9)、またはヌクレアーゼ活性Cas9である。

態様12．態様1の方法であって、napDNAbpが配列番号18のアミノ酸配列を含む。

態様13．態様1の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様14．態様1の方法であって、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

態様15．態様1の方法であって、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様16．態様1の方法であって、PEgRNAが核酸伸長アームをガイドRNAの3'もしくは5'端または分子内の位置付けに含み、伸長アームがDNA合成鋳型配列およびプライマー結合部位を含む。

態様17．態様16の方法であって、伸長アームが、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。

態様18．態様1の方法であって、PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。

態様19．標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって:
DNA分子を、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびnapDNAbpを標的座位へと標的化するPEgRNAと接触させ、PEgRNAが少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む逆転写酵素(RT)鋳型配列とプライマー結合部位とを含むこと;

それによって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3'端を形成すること;

それによって、暴露された3'端をプライマー結合部位にハイブリダイズさせて逆転写をプライムすること;

それによって、逆転写酵素によって、RT鋳型配列に基づく少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを合成すること;

それによって、少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を対応する内生DNA上に組み込み、それによって、標的座位においてDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入すること、
を含む。

態様20．態様19の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化がトランジションを含む。

態様21．態様19の方法であって、トランジションが、(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択される。

態様22．態様19の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化がトランスバージョンを含む。

態様23．態様22の方法であって、トランスバージョンが、(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択される。

態様24．態様19の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(9)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。

態様25．態様19の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの挿入または欠失を含む。

態様26．態様19の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が疾患関連遺伝子の修正を含む。

態様27．態様26の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;トリヌクレオチド反復障害;プリオン病;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。

態様28．態様26の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。

態様29．態様19の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9またはそのバリアントである。

態様30．態様19の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)もしくはCas9ニッカーゼ(nCas9)またはそのバリアントである。

態様31．態様19の方法であって、napDNAbpが配列番号18のアミノ酸配列を含む。

態様32．態様19の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様33．態様19の方法であって、逆転写酵素がトランスで導入される。

態様34．態様19の方法であって、napDNAbpが逆転写酵素への融合体を含む。

態様35．態様19の方法であって、逆転写酵素が、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

態様36．態様19の方法であって、逆転写酵素が、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様37．態様19の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、ヌクレアーゼによってDNA鎖へニックを入れることを含む。

態様38．態様37の方法であって、ヌクレアーゼがnapDNAbpであるか、napDNAbpの融合ドメインとして提供されるか、またはトランスで提供される。

態様39．態様19の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3'端を形成するステップが、DNA鎖を化学的薬剤と接触させることを含む。

態様40．態様19の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3'端を形成するステップが、複製エラーを導入することを含む。

態様41．態様19の方法であって、DNA分子をnapDNAbpおよびガイドRNAと接触させるステップがRループを形成する。

態様42．態様41の方法であって、暴露された3'端が形成されるDNA鎖がRループ上にある。

態様43．態様19の方法であって、PEgRNAが、逆転写酵素(RT)鋳型配列とプライマー結合部位とを含む伸長アームを含む。

態様44．態様43の方法であって、伸長アームが、ガイドRNAの3'端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置にある。

態様45．態様19の方法であって、PEgRNAが、さらに、リンカー、ステムループ、ヘアピン、トウループ、アプタマー、またはRNA-タンパク質動員ドメインからなる群から選択される少なくとも1つの追加の構造を含む。

態様46．態様19の方法であって、PEgRNAがさらに相同アームを含む。

態様47．態様19の方法であって、RT鋳型配列が、対応する内生DNAに対して相同的である。

態様48．プライム標的にプライムされた逆転写によって、標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;

それによって、RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAを生成すること;

それによって、DNA修復および/または複製プロセスによって標的座位におけるDNA分子上に所望のヌクレオチド変化を組み込むこと、
を含む。

態様49．態様48の方法であって、RT鋳型が、ガイドRNAの3'端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置付けに位置付けられる。

態様50．態様48の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、トランジション、トランスバージョン、挿入、もしくは欠失、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。

態様51．態様48の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択されるトランジションを含む。

態様52．態様48の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択されるトランスバージョンを含む。

態様53．態様48の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。

態様54．健康な数の反復トリヌクレオチドを含む健康な配列によって標的DNA分子上のトリヌクレオチド反復拡大変異を置き換えるための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含む融合タンパク質ならびに(ii)置き換え配列を含むDNA合成鋳型とプライマー結合部位とを含むPEgRNAと接触させること;(b)プライム編集を行なって、置き換え配列を含む一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的座位におけるDNA分子上に一本鎖DNAを組み込むことを含む。

態様55．態様54の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様56．態様54の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様57．態様54の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様58．態様54の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。

態様59．態様54の方法であって、(b)プライム編集を行うステップが、ガイドRNA上のプライマー結合部位へのアニーリングによってポリメラーゼをプライムすることができる標的座位における3’端プライマー結合配列を生成することを含む。

態様60．態様54の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がハンチントン病、脆弱X症候群、またはフリードライヒ運動失調症に関連する。

態様61．態様54の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がCAGトリプレットの繰り返し単位を含む。

態様62．態様54の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がGAAトリプレットの繰り返し単位を含む。

態様63．プライム標的にプライムされた逆転写によって、標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって、方法が:
(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;

それによって、RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAを生成すること;

それによって、DNA修復および/または複製プロセスによって標的座位におけるDNA分子上に所望のヌクレオチド変化を組み込むこと、
を含む。

態様64．態様63の方法であって、RT鋳型が、ガイドRNAの3'端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置付けに位置付けられる。

態様65．態様63の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、トランジション、トランスバージョン、挿入、もしくは欠失、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。

態様66．態様63の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択されるトランジションを含む。

態様67．態様63の方法であって、所望のヌクレオチド変化が:(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択されるトランスバージョンを含む。

態様68．態様63の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。

態様69．プライム編集によって標的ヌクレオチド配列によってコードされるPRNP上に1つ以上の防護性変異を組み入れることによって、プリオン病を防止またはその進行を停止させる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;

それによって、防護性変異をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;

それによって、DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むこと、
を含み;

方法が、ミスフォールディングに対して耐性である防護性変異を含むPRNPをコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様70．態様69の方法であって、プリオン病がヒトプリオン病である。

態様71．態様69の方法であって、プリオン病が動物プリオン病である。

態様72．態様69の方法であって、プリオン病がクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、またはクールー病である。

態様73．態様69の方法であって、プリオン病が牛海綿状脳症(BSEまたは「狂牛病」)、慢性消耗病(CWD)、スクレイピー、伝達性ミンク脳症、ネコ海綿状脳症、および有蹄類海綿状脳症である。

態様74．態様69の方法であって、野生型PRNPアミノ酸配列が配列番号291～292である。

態様75．態様69の方法であって、方法が、配列番号293～309、311～323からなる群から選択される改変されたPRNPアミノ酸配列をもたらし、前記改変されたPRNPタンパク質がミスフォールディングに対して耐性である。

態様76．態様69の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様77．態様69の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様78．態様69の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様79．態様69の方法であって、PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777を含む。

態様80．プライム編集によって標的ヌクレオチド配列上のサイクリン依存性キナーゼ様5遺伝子(CDKL5)の変異を修正することによって、CDKL5欠損症障害を処置する方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)CDKL5の変異を修正する編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;

それによって、編集をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;

それによって、DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むこと、
を含み;

方法が、修復されたCDKL5遺伝子をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様81．態様D80の方法であって、CDKL5の変異が1412delAである。

群E．タンパク質構造/機能を改変することおよび/または変異導入のためのPE法
態様1．プライム編集によって標的座位におけるDNA分子に変異導入する方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびエラーを起こしやすいポリメラーゼ(polymer)(例えば、エラーを起こしやすい逆転写酵素)を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含む編集鋳型を含むガイドRNAと接触させること;それによって、編集鋳型を鋳型とする一本鎖DNAを重合すること、ならびにDNA修復および/または複製プロセスによって、標的座位におけるDNA分子上に一本鎖DNAを組み込むことを含む。

態様2．いずれかの先行する態様の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様3．いずれかの先行する態様の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様4．態様1の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様5．態様1の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。

態様6．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に免疫エピトープを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;

それによって、免疫エピトープをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;

それによって、DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むこと、
を含み;

方法が、目当てのタンパク質と免疫エピトープとを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様7．態様6の方法であって、免疫エピトープが:破傷風トキソイド(配列番号396);ジフテリア毒素変異体CRM197(配列番号630);ムンプス免疫エピトープ1(配列番号400);ムンプス免疫エピトープ2(配列番号402);ムンプス免疫エピトープ3(配列番号404);風疹ウイルス(配列番号406);ヘマグルチニン(配列番号408);ノイラミニダーゼ(配列番号410);TAP1(配列番号412);TAP2(配列番号414);クラスI HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号416);クラスI HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号418);クラスII HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号420);クラスII HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号422);ヘマグルチニンエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号424);ならびにノイラミニダーゼエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号426)からなる群から選択される。

態様8．態様6の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様9．態様6の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様10．態様6の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様11．態様6の方法であって、PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777を含む。

態様12．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に低分子二量体化ドメインを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)低分子二量体化ドメインをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;

それによって、免疫エピトープをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;

それによって、DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むこと、
を含み;

方法が、目当てのタンパク質と低分子二量体化ドメインとを含む融合タンパク質をコードする改変された標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様13．態様12の方法であって、さらに、目当ての第2のタンパク質に対して方法を行うことを含む。

態様14．態様13の方法であって、目当ての第1のタンパク質および目当ての第2のタンパク質が、前記タンパク質の夫々の二量体化ドメインに結合する低分子の存在下において二量体化する。

態様15．態様12の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号488のFKBP12である。

態様16．態様12の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号489のFKBP12-F36Vである。

態様17．態様12の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号490および493～494のシクロフィリンである。

態様18．態様12の方法であって、低分子が本明細書に記載の低分子の二量体である。

態様19．態様12の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様20．態様12の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様21．態様12の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

態様22．態様12の方法であって、PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325-334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777を含む。

態様23．プライム編集を用いてタンパク質上にペプチドタグまたはエピトープを組み入れる方法であって:タンパク質をコードする標的ヌクレオチド配列を、ペプチドタグをコードする第2のヌクレオチド配列をそれに挿入するように構成されたプライム編集因子構築物と接触させて、組み換えヌクレオチド配列をもたらすことを含み、その結果、ペプチドタグおよびタンパク質が融合タンパク質として組み換えヌクレオチド配列から発現される。

態様24．態様23の方法であって、ペプチドタグがタンパク質の精製および/または検出に用いられる。

態様25．態様23の方法であって、ペプチドタグが、ポリヒスチジン(例えば、HHHHHH)(配列番号252～262)、FLAG(例えば、DYKDDDDK)(配列番号2)、V5(例えば、GKPIPNPLLGLDST)(配列番号3)、GCN4、HA(例えば、YPYDVPDYA)(配列番号5)、Myc(例えばEQKLISEED)(配列番号6)、またはGSTである。

態様26．態様23の方法であって、ペプチドタグが、配列番号1～6、245～249、252～262、264～273、275～276、281、278～288、および622からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

態様27．態様23の方法であって、ペプチドタグがリンカーによってタンパク質に融合される。

態様28．態様23の方法であって、融合タンパク質が次の構造を有し:[タンパク質]-[ペプチドタグ]または[ペプチドタグ]-[タンパク質]、「]-[」が任意のリンカーを表す。

態様29．態様23の方法であって、リンカーが配列番号127、165～176、446、453、および767～769のアミノ酸配列を有する。

態様30．態様23の方法であって、プライム編集因子構築物が、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777のヌクレオチド配列を含むPEgRNAを含む。

態様31．態様23の方法であって、PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、伸長アームがペプチドタグをコードする逆転写酵素鋳型を含む。

態様32．態様23の方法であって、PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、伸長アームがペプチドタグをコードする逆転写酵素鋳型を含む。

態様33．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上の機能部分を組み入れまたは欠失する方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分またはその欠失をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)機能部分またはその欠失をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質および機能部分またはその除去を含む改変されたタンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生じ、機能部分がタンパク質の修飾状態または局在状態を変改する。

態様34．態様33の方法であって、機能部分が、目当てのタンパク質のリン酸化、ユビキチン化、グリコシル化、脂質修飾、ヒドロキシル化、メチル化、アセチル化、クロトニル化、またはSUMO化状態を変改する。

群F．PE送達方法および組成物
態様1．ポリペプチドであって、プライム編集因子融合タンパク質のN末端半分またはC末端半分を含む。

態様2．態様1のポリペプチドであって、プライム編集因子融合タンパク質が、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)ドメインとポリメラーゼドメインとを含む。

態様3．態様1のポリペプチドであって、プライム編集因子融合タンパク質が、プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)の存在下においてプライム編集を実行することができる。

態様4．態様2のポリペプチドであって、napDNAbpがCas9タンパク質またはそのバリアントである。

態様5．態様2のポリペプチドであって、napDNAbpがニッカーゼ活性を有するヌクレアーゼである。

態様6．態様2のポリペプチドであって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様7．態様2のポリペプチドであって、napDNAbpが:Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する。

態様8．態様1のポリペプチドであって、ポリペプチドが、プライム編集因子融合タンパク質を分裂部位において分裂することによって形成される。

態様9．態様8のポリペプチドであって、分裂部位がnapDNAbpドメイン上のペプチド結合である。

態様10．態様8のポリペプチドであって、分裂部位がポリメラーゼドメイン上のペプチド結合である。

態様11．態様8のポリペプチドであって、分裂部位がnapDNAbpドメインとポリメラーゼドメインとの間のリンカー上のペプチド結合である。

態様12．態様9のポリペプチドであって、分裂部位が、配列番号18(標準的なSpCas9)の残基1および2、2および3、3および4、4および5、5および6、6および7、7および8、8および9、9および10、10および11、11および12、12および13、13および14、14および15、16および17、17および18、18および19、19および20、20および21、21および22、22および23、23および24、24および25、25および26、26および27、27および(ad)28、28および29、29および30、30および31、31および32、32および33、33および34、34および35、35および36、36および37、37および38、38および39、39および40、40および41、41および42、42および43、43および44、44および45、45および46、46および47、47および48、48および49、49および50の間、または残基50～100、100～150、150～200、200～250、250～300、300～350、350～400、400～450、450～500、500～600、600～700、700～800、800～900、900～1000、1000～1100、1100～1200、1200～1300、もしくは1300～1368の間のいずれか2つの残基の間、あるいは配列番号18のSpCas9ホモログまたは等価物のいずれか2つの同等アミノ酸残基の間のペプチド結合である。

態様13．態様9のポリペプチドであって、分裂部位が、配列番号89(標準的な逆転写酵素、M-MLV RT)の残基1および2、2および3、3および4、4および5、5および6、6および7、7および8、8および9、9および10、10および11、11および12、12および13、13および14、14および15、16および17、17および18、18および19、19および20、20および21、21および22、22および23、23および24、24および25、25および26、26および27、27および(ad)28、28および29、29および30、30および31、31および32、32および33、33および34、34および35、35および36、36および37、37および38、38および39、39および40、40および41、41および42、42および43、43および44、44および45、45および46、46および47、47および48、48および49、49および50の間、または残基50～100、100～150、150～200、200～250、250～300、300～350、350～400、400～450、450～500、500～600、もしくは600～667の間のいずれか2つの残基の間、あるいは配列番号89の逆転写酵素ホモログまたは等価物のいずれか2つの同等アミノ酸残基の間のペプチド結合である。

態様14．態様1のポリペプチドであって、ポリペプチドがプライム編集因子融合タンパク質のN末端半分である。

態様15．態様1のポリペプチドであって、ポリペプチドがプライム編集因子融合タンパク質のC末端半分である。

態様16．態様1～15のいずれかのポリペプチドと任意にPEgRNAとをコードするヌクレオチド配列。

態様17．ウイルスゲノムであって、態様1～15のいずれかのポリペプチドと任意にPEgRNAとをコードするヌクレオチド配列を含む。

態様18．態様17のウイルスゲノムであって、ヌクレオチド配列が、さらに、態様1-15のいずれかのポリペプチドを発現することにとって好適なプロモーター配列を含む。

態様19．態様17のウイルスゲノムであって、ヌクレオチド配列が、さらに、PEgRNAをコードする配列を含む。

態様20．ウイルス粒子であって、態様1～15のいずれかのポリペプチドと任意にPEgRNAとをコードするヌクレオチド配列を含むゲノムを含む。

態様21．態様20のウイルス粒子であって、ウイルス粒子がアデノウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス粒子、またはレンチウイルス粒子である。

態様22．態様20のウイルス粒子であって、ゲノムによってコードされるポリペプチドがプライム編集因子融合タンパク質のN末端半分である。

態様23．態様20のウイルス粒子であって、ゲノムによってコードされるポリペプチドがプライム編集因子融合タンパク質のC末端半分である。

態様24．医薬組成物であって、態様20～23のいずれかのウイルス粒子および医薬賦形剤を含む。

態様25．医薬組成物であって、態様22のウイルス粒子(N末端半分をコードする)および医薬賦形剤を含む。

態様26．医薬組成物であって、態様23のウイルス粒子(C末端半分をコードする)および医薬賦形剤を含む。

態様27．リボヌクレオタンパク質(RNP)複合体であって、態様1～15のいずれかのポリペプチドと任意にPEgRNAとをコードするヌクレオチド配列を含む。

態様28．態様27のリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体であって、ゲノムによってコードされるポリペプチドがプライム編集因子融合タンパク質のN末端半分である。

態様29．態様27のリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体であって、ゲノムによってコードされるポリペプチドがプライム編集因子融合タンパク質のC末端半分である。

態様30．医薬組成物であって、態様27～29のいずれかのリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体および医薬賦形剤を含む。

態様31．医薬組成物であって、態様28のリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体(N末端半分をコードする)および医薬賦形剤を含む。

態様32．医薬組成物であって、態様29のリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体(C末端半分をコードする)および医薬賦形剤を含む。

態様33．医薬組成物であって、第1のAAV粒子および第2のAAV粒子を含み、第1のAAVベクターがプライム編集因子融合タンパク質のN末端半分を発現し、第2のAAVベクターがプライム編集因子融合タンパク質のC末端半分を発現し、N末端半分およびC末端半分が細胞内で組み合わせられてプライム編集因子を再構成する。

態様34．態様33の医薬組成物であって、第1または第2のAAV粒子がPEgRNAをもまた発現し、これが再構成されたプライム編集因子を標的DNA部位へと標的化する。

態様35．態様33の医薬組成物であって、プライム編集因子融合タンパク質が核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)ドメインとポリメラーゼドメインとを含む。

態様36．態様33の医薬組成物であって、プライム編集因子融合タンパク質が、プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)の存在下においてプライム編集を実行することができる。

態様37．態様35の医薬組成物であって、napDNAbpがCas9タンパク質またはそのバリアントである。

態様38．態様35の医薬組成物であって、napDNAbpがニッカーゼ活性を有するヌクレアーゼである。

態様39．態様35の医薬組成物であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様40．態様35の医薬組成物であって、napDNAbpが:Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する。

態様41．態様33の医薬組成物であって、N末端およびC末端半分がプライム編集因子融合タンパク質を分裂部位において分裂することによって形成される。

態様42．態様41の医薬組成物であって、分裂部位がnapDNAbpドメイン上のペプチド結合である。

態様43．態様41の医薬組成物であって、分裂部位がポリメラーゼドメイン上のペプチド結合である。

態様44．態様41の医薬組成物であって、分裂部位がリンカー上のペプチド結合である。

態様45．態様41の医薬組成物であって、分裂部位が、配列番号18(標準的なSpCas9)の残基1および2、2および3、3および4、4および5、5および6、6および7、7および8、8および9、9および10、10および11、11および12、12および13、13および14、14および15、16および17、17および18、18および19、19および20、20および21、21および22、22および23、23および24、24および25、25および26、26および27、27および(ad)28、28および29、29および30、30および31、31および32、32および33、33および34、34および35、35および36、36および37、37および38、38および39、39および40、40および41、41および42、42および43、43および44、44および45、45および46、46および47、47および48、48および49、49および50の間、または残基50～100、100～150、150～200、200～250、250～300、300～350、350～400、400～450、450～500、500～600、600～700、700～800、800～900、900～1000、1000～1100、1100～1200、1200～1300、もしくは1300～1368の間のいずれか2つの残基の間、あるいは配列番号18のSpCas9ホモログまたは等価物のいずれか2つの同等アミノ酸残基の間のペプチド結合である。

態様46．態様41の医薬組成物であって、分裂部位が、配列番号89(標準的な逆転写酵素、M-MLV RT)の残基1および2、2および3、3および4、4および5、5および6、6および7、7および8、8および9、9および10、10および11、11および12、12および13、13および14、14および15、16および17、17および18、18および19、19および20、20および21、21および22、22および23、23および24、24および25、25および26、26および27、27および(ad)28、28および29、29および30、30および31、31および32、32および33、33および34、34および35、35および36、36および37、37および38、38および39、39および40、40および41、41および42、42および43、43および44、44および45、45および46、46および47、47および48、48および49、49および50の間、または残基50～100、100～150、150～200、200～250、250～300、300～350、350～400、400～450、450～500、500～600、もしくは600～667の間のいずれか2つの残基の間、あるいは配列番号89の逆転写酵素ホモログまたは等価物のいずれか2つの同等アミノ酸残基の間のペプチド結合である。

態様47．態様33の医薬組成物であって、プライム編集因子融合タンパク質のN末端半分が、本明細書に記載のN末端プライム編集因子融合タンパク質をコードするアミノ酸配列を有する。

態様48．態様33の医薬組成物であって、プライム編集因子融合タンパク質のC末端半分が、本明細書に記載のN末端プライム編集因子融合タンパク質をコードするアミノ酸配列を有する。

態様49．プライム編集因子融合タンパク質を細胞に送達する方法であって、細胞を第1のAAV粒子および第2のAAV粒子によってトランスフェクションすることを含み、第1のAAVベクターがプライム編集因子融合タンパク質のN末端半分を発現し、第2のAAVベクターがプライム編集因子融合タンパク質のC末端半分を発現し、N末端半分およびC末端半分が細胞内で組み合わせられてプライム編集因子融合タンパク質を再構成する。

態様50．態様49の方法であって、第1または第2のAAV粒子がPEgRNAをもまた発現し、これが再構成されたプライム編集因子を標的DNA部位へと標的化する。

態様51．態様49の方法であって、プライム編集因子融合タンパク質が核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)ドメインとポリメラーゼドメインとを含む。

態様52．態様49の方法であって、プライム編集因子融合タンパク質が、プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)の存在下においてプライム編集を実行することができる。

態様53．態様51の方法であって、napDNAbpがCas9タンパク質またはそのバリアントである。

態様54．態様53の方法であって、napDNAbpがニッカーゼ活性を有するヌクレアーゼである。

態様55．態様53の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様56．態様53の方法であって、napDNAbpが:Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する。

態様57．態様49の方法であって、N末端およびC末端半分がプライム編集因子融合タンパク質を分裂部位において分裂することによって形成される。

態様58．態様57の方法であって、分裂部位がnapDNAbpドメイン上のペプチド結合である。

態様59．態様57の方法であって、分裂部位がポリメラーゼドメイン上のペプチド結合である。

態様60．態様57の方法であって、分裂部位がリンカー上のペプチド結合である。

態様61．態様57の方法であって、分裂部位が、配列番号18(標準的なSpCas9)の残基1および2、2および3、3および4、4および5、5および6、6および7、7および8、8および9、9および10、10および11、11および12、12および13、13および14、14および15、16および17、17および18、18および19、19および20、20および21、21および22、22および23、23および24、24および25、25および26、26および27、27および(ad)28、28および29、29および30、30および31、31および32、32および33、33および34、34および35、35および36、36および37、37および38、38および39、39および40、40および41、41および42、42および43、43および44、44および45、45および46、46および47、47および48、48および49、49および50の間、または残基50～100、100～150、150～200、200～250、250～300、300～350、350～400、400～450、450～500、500～600、600～700、700～800、800～900、900～1000、1000～1100、1100～1200、1200～1300、もしくは1300～1368の間のいずれか2つの残基の間、あるいは配列番号18のSpCas9ホモログまたは等価物のいずれか2つの同等アミノ酸残基の間のペプチド結合である。

態様62．態様57の方法であって、分裂部位が、配列番号89(標準的な逆転写酵素、M-MLV RT)の残基1および2、2および3、3および4、4および5、5および6、6および7、7および8、8および9、9および10、10および11、11および12、12および13、13および14、14および15、16および17、17および18、18および19、19および20、20および21、21および22、22および23、23および24、24および25、25および26、26および27、27および(ad)28、28および29、29および30、30および31、31および32、32および33、33および34、34および35、35および36、36および37、37および38、38および39、39および40、40および41、41および42、42および43、43および44、44および45、45および46、46および47、47および48、48および49、49および50の間、または残基50～100、100～150、150～200、200～250、250～300、300～350、350～400、400～450、450～500、500～600、もしくは600～667の間のいずれか2つの残基の間、あるいは配列番号89の逆転写酵素ホモログまたは等価物のいずれか2つの同等アミノ酸残基の間のペプチド結合である。

態様63．態様49の方法であって、プライム編集因子融合タンパク質のN末端半分が、本明細書に記載のN末端プライム編集因子融合タンパク質をコードするアミノ酸配列を有する。

態様64．態様49の方法であって、プライム編集因子融合タンパク質のC末端半分が、本明細書に記載のC末端プライム編集因子融合タンパク質をコードするアミノ酸配列を有する。

態様65．態様49の方法であって、第1のAAV粒子が、第1のプライム編集因子構成要素をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えAAVゲノムを含む。

態様66．態様49の方法であって、第2のAAV粒子が、第2のプライム編集因子構成要素をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えAAVゲノムを含む。

態様67．態様49の方法であって、トランスフェクションステップがインビボで行われる。

態様68．態様49の方法であって、トランスフェクションステップがエクスビボで行われる。

態様69．態様50の方法であって、標的DNA部位が疾患関連遺伝子である。

態様70．態様69の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;トリヌクレオチド反復障害;プリオン病;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。

態様71．態様69の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。

態様72．態様51の方法であって、プログラム可能なDNA結合タンパク質(napDNAbp)ドメイン。

態様73．態様51の方法であって、ポリメラーゼドメインが逆転写酵素である。

態様74．態様73の方法であって、逆転写酵素が、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

態様75．態様73の方法であって、逆転写酵素が、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様76．態様73の方法であって、napDNAbpが配列番号18のアミノ酸配列を含む。

態様77．態様73の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
態様78．態様8のポリペプチドであって、分裂部位が、配列番号18の1023および1024の間、または配列番号18との少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、もしくは少なくとも99.5％配列同一性を有するアミノ酸配列上の対応する位置である。

群G．RNA構造/機能を改変するためのPE法
態様1．プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのRNA上にリボヌクレオチドモチーフまたはタグを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;それによって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびにDNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、リボヌクレオチドモチーフまたはタグを含む目当ての修飾されたRNAをコードする標的ヌクレオチド配列を生ずる。

態様2．態様1の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが検出部分である。

態様3．態様1の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが目当てのRNAの発現レベルに影響する。

態様4．態様1の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが目当てのRNAの輸送または細胞下レベル位置付けに影響する。

態様5．態様1の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが、SV40 1型、SV40 2型、SV40 3型、hGH、BGH、rbGlob、TK、MALAT1 ENE-mascRNA、KSHV PAN ENE、Smbox/U1 snRNAボックス、U1 snRNA 3'ボックス、tRNA-リジン、broccoliアプタマー、spinachアプタマー、mangoアプタマー、HDVリボザイム、およびm6Aからなる群から選択される。

態様6．態様1の方法であって、PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777を含む(表を見よ)。

態様7．態様1の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。

態様8．態様1の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様9．態様1の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む。

群H．遺伝子ライブラリを作るためのPE法
態様1．プライム編集によって、プログラムされた変異体遺伝子ライブラリを構築する方法であって、方法が:

(a)1つ以上の標的遺伝子座位を夫々が含む標的ヌクレオチド配列のライブラリを(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)1つ以上の標的遺伝子座位に対して相対的に少なくとも1つの遺伝子変化を有する配列を含む編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;

それによって、編集鋳型を鋳型とする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに

DNA修復および/または複製プロセスによって、1つ以上の標的遺伝子座位の代わりに一本鎖DNA配列を組み込み、それによって、少なくとも1つの遺伝子変化を前記ライブラリの標的ヌクレオチド配列の標的遺伝子座位上に組み込むこと、
を含む。

態様2．態様1の方法であって、ライブラリがプラスミドライブラリである。

態様3．態様1の方法であって、ライブラリがファージライブラリである。

態様4．態様1の方法であって、1つ以上の標的遺伝子座位がタンパク質をコードする領域を含む。

態様5．態様1の方法であって、1つ以上の標的遺伝子座位がタンパク質の二次構造モチーフをコードする領域を含む。

態様6．態様5の方法であって、二次構造モチーフがアルファヘリックスである。

態様7．態様5の方法であって、二次構造モチーフがベータシートである。

態様8．態様1の方法であって、napDNAbpがCas9タンパク質またはそのバリアントである。

態様9．態様1の方法であって、napDNAbpがニッカーゼ活性を有するヌクレアーゼである。

態様10．態様1の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様11．態様1の方法であって、napDNAbpが配列番号18のアミノ酸配列を含む。

態様12．態様1の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様13．態様1の方法であって、ポリメラーゼドメインが逆転写酵素である。

態様14．態様13の方法であって、逆転写酵素が、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

態様15．態様14の方法であって、逆転写酵素が、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様16．態様1の方法であって、編集鋳型の少なくとも1つの遺伝子変化が挿入である。

態様17．態様1の方法であって、編集鋳型の少なくとも1つの遺伝子変化が欠失である。

態様18．態様1の方法であって、編集鋳型の少なくとも1つの遺伝子変化が置換である。

態様19．態様1の方法であって、少なくとも1つの遺伝子変化が1つ以上のコドンの挿入である。

態様20．態様1の方法であって、少なくとも1つの遺伝子変化が1つ以上のコドンの欠失である。

態様21．態様1の方法であって、少なくとも1つの遺伝子変化が停止コドンの挿入である。

態様22．態様1の方法であって、少なくとも1つの遺伝子変化が非停止コドンから停止コドンへの変換である。

態様23．態様1の方法であって、方法が、同時に、少なくとも2、または3、または4、または5、または6、または7、または8、または9、または10、または10～100の間、または100～200の間、または200～300の間、または300～400の間、または400～500の間の標的遺伝子座位に対して、ライブラリの標的ヌクレオチド配列の夫々について行われる。

態様24．態様1の方法であって、方法がPACEまたはPANCE進化の間に行われ、少なくとも1つの遺伝子変化を前記ライブラリの標的ヌクレオチド配列の標的遺伝子座位に組み込むことの夫々のものが、新たな標的配列をもまた組み入れる。

群I．オフターゲット検出のためのPE法
態様1．プライム編集因子によるオフターゲット編集を評価する方法であって、方法が:

(a)編集部位を有する標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子融合タンパク質ならびに(ii)検出可能な配列をコードするDNA合成鋳型を含むPEgRNAと接触させ;

PEgRNAが融合タンパク質と複合体化し、前記融合タンパク質を編集部位へと、および存在する場合には1つ以上のオフターゲット部位へとガイドし;

プライム編集因子融合タンパク質が、検出可能な配列を編集部位に、および存在する場合には1つ以上のオフターゲット部位に組み入れること;

(b)編集部位および1つ以上のオフターゲット部位のヌクレオチド配列を決定すること、
を含む。

態様2．態様1の方法であって、標的ヌクレオチド配列がゲノムである。

態様3．態様1の方法であって、接触させるステップがin vitroである。

態様4．態様1の方法であって、接触させるステップがインビボである。

態様5．態様1の方法であって、編集部位が疾患関連遺伝子の変異である。

態様6．態様5の方法であって、変異が1塩基置換、挿入、欠失、または逆位である。

態様7．態様1の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。

態様8．態様1の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。

態様9．態様1の方法であって、融合タンパク質が、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777のアミノ酸配列、または配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

態様10．態様1の方法であって、napDNAbpがCas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、もしくはアルゴノート、またはCas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、もしくはアルゴノートのバリアントである。

態様11．態様1の方法であって、napDNAbpがCas9またはそのバリアントである。

態様12．態様1の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様13．態様1の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様14．態様1の方法であって、napDNAbpが、配列番号18のアミノ酸配列、または配列番号18との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様15．態様1の方法であって、napDNAbpが、SpCas9野生型、あるいはアミノ酸配列18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つまたは配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれかとの少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列のそのバリアントである。

態様16．態様1の方法であって、napDNAbpがSpCas9オーソログである。

態様17．態様1の方法であって、napDNAbpが、アミノ酸配列18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つ、または配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれかとの少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列である。

態様18．態様1の方法であって、napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様19．態様1の方法であって、ポリメラーゼがRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含む。

態様20．態様1の方法であって、ポリメラーゼが逆転写酵素である。

態様21．態様1の方法であって、逆転写酵素が天然に存在する野生型逆転写酵素であり、配列番号89のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号89のいずれかとの少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

態様22．態様1の方法であって、逆転写酵素がバリアント逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれかとの少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

態様23．態様1の方法であって、逆転写酵素が、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

態様24．態様1の方法であって、逆転写酵素が、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様25．態様1の方法であって、検出可能な配列が、少なくとも1、または少なくとも2、または少なくとも3、または少なくとも4、または少なくとも5、または少なくとも6、または少なくとも7、または少なくとも8、または少なくとも9、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、または少なくとも13、または少なくとも14、または少なくとも15、または少なくとも16、または少なくとも17、または少なくとも18、または少なくとも19、または少なくとも20、または少なくとも21、または少なくとも22、または少なくとも23、または少なくとも24、または少なくとも25、または少なくとも26、または少なくとも27、または少なくとも28、または少なくとも29、または少なくとも30、または少なくとも31、または少なくとも32、または少なくとも33、または少なくとも34、または少なくとも35、または少なくとも40、または少なくとも50、または少なくとも60、または少なくとも70、または少なくとも80、または少なくとも90、または少なくとも100核酸塩基の挿入である。

態様26．態様1の方法であって、検出可能な配列が、少なくとも1、または少なくとも2、または少なくとも3、または少なくとも4、または少なくとも5、または少なくとも6、または少なくとも7、または少なくとも8、または少なくとも9、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、または少なくとも13、または少なくとも14、または少なくとも15、または少なくとも16、または少なくとも17、または少なくとも18、または少なくとも19、または少なくとも20、または少なくとも21、または少なくとも22、または少なくとも23、または少なくとも24、または少なくとも25、または少なくとも26、または少なくとも27、または少なくとも28、または少なくとも29、または少なくとも30、または少なくとも31、または少なくとも32、または少なくとも33、または少なくとも34、または少なくとも35、または少なくとも40、または少なくとも50、または少なくとも60、または少なくとも70、または少なくとも80、または少なくとも90、または少なくとも100核酸塩基の欠失である。

態様27．態様1の方法であって、検出可能な配列が核酸塩基置換である。

態様28．態様1の方法であって、検出可能な配列がトランジション変異である。

態様29．態様1の方法であって、検出可能な配列がトランスバージョン変異である。

態様30．態様1の方法であって、検出可能な配列が1ヌクレオチド置換であり:(1)GからTの置換、(2)GからAの置換、(3)GからCの置換、(4)TからGの置換、(5)TからAの置換、(6)TからCの置換、(7)CからGの置換、(8)CからTの置換、(9)CからAの置換、(10)AからTの置換、(11)AからGの置換、および(12)AからCの置換からなる群から選択される。

態様31．態様1の方法であって、検出可能な配列が1ヌクレオチド置換であり、これが、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変換する。

態様32．態様1の方法であって、検出可能な配列がバーコード配列である。

態様33．態様1の方法であって、オンターゲットおよびオフターゲット部位におけるヌクレオチド配列を決定するステップ(d)が、(i)標的ヌクレオチド配列をフラグメント化してフラグメントを形成すること、(ii)アダプター配列をフラグメントの端に取り付けること、(iii)プライマーのペアを用いてアンプリコンをPCR増幅し、1つのプライマーが、フラグメントの1つの端に取り付けられたアダプター配列にアニーリング、別のプライマー、それがフラグメント上に位置付けられたプライム編集によって挿入されたアダプター配列にアニールすること、および(iv)アンプリコンを配列決定して編集の位置付けを決定することを含む。

群J．細胞データ記録のためのPE法
態様1．プライム編集によって細胞性のイベントを記録する方法であって、方法が:(A)細胞に(i)napDNAbpおよびRNA依存性DNAポリメラーゼを含むプライム編集因子融合タンパク質と(ii)PEgRNAとをコードする1つ以上の構築物を導入し、融合タンパク質および/またはPEgRNAの発現が、細胞性のイベントの生起によって誘導され、融合タンパク質および/またはPEgRNAの発現によって、細胞のゲノム上の標的編集部位のプライム編集をもたらして、検出可能な配列を導入すること、ならびに(B)検出可能な配列を同定し、それによって細胞性のイベントの生起を同定することを含む。

態様2．態様1の方法であって、ステップ(A)のプライム編集が新たな標的編集部位を同時に導入し、その結果、細胞性のイベントの記録が反復的に生起し得る。

態様3．態様1の方法であって、PEgRNAが、検出可能な配列をコードする編集鋳型を含む。

態様4．態様3の方法であって、編集鋳型がさらに新たな標的編集部位をコードする。

態様5．態様1の方法であって、検出可能な配列が、少なくとも1、または少なくとも2、または少なくとも3、または少なくとも4、または少なくとも5、または少なくとも6、または少なくとも7、または少なくとも8、または少なくとも9、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、または少なくとも13、または少なくとも14、または少なくとも15、または少なくとも16、または少なくとも17、または少なくとも18、または少なくとも19、または少なくとも20、または少なくとも21、または少なくとも22、または少なくとも23、または少なくとも24、または少なくとも25、または少なくとも26、または少なくとも27、または少なくとも28、または少なくとも29、または少なくとも30、または少なくとも31、または少なくとも32、または少なくとも33、または少なくとも34、または少なくとも35、または少なくとも40、または少なくとも50、または少なくとも60、または少なくとも70、または少なくとも80、または少なくとも90、または少なくとも100核酸塩基の挿入である。

態様6．態様1の方法であって、検出可能な配列が、少なくとも1、または少なくとも2、または少なくとも3、または少なくとも4、または少なくとも5、または少なくとも6、または少なくとも7、または少なくとも8、または少なくとも9、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、または少なくとも13、または少なくとも14、または少なくとも15、または少なくとも16、または少なくとも17、または少なくとも18、または少なくとも19、または少なくとも20、または少なくとも21、または少なくとも22、または少なくとも23、または少なくとも24、または少なくとも25、または少なくとも26、または少なくとも27、または少なくとも28、または少なくとも29、または少なくとも30、または少なくとも31、または少なくとも32、または少なくとも33、または少なくとも34、または少なくとも35、または少なくとも40、または少なくとも50、または少なくとも60、または少なくとも70、または少なくとも80、または少なくとも90、または少なくとも100核酸塩基の欠失である。

態様7．態様1の方法であって、検出可能な配列が核酸塩基置換である。

態様8．態様1の方法であって、検出可能な配列がトランジション変異である。

態様9．態様1の方法であって、検出可能な配列がトランスバージョン変異である。

態様10．態様1の方法であって、検出可能な配列が1ヌクレオチド置換であり、そこについて、1ヌクレオチド置換が(1)GからTの置換、(2)GからAの置換、(3)GからCの置換、(4)TからGの置換、(5)TからAの置換、(6)TからCの置換、(7)CからGの置換、(8)CからTの置換、(9)CからAの置換、(10)AからTの置換、(11)AからGの置換、または(12)AからCの置換である。

態様11．態様1の方法であって、検出可能な配列が1ヌクレオチド置換であり、これが、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変換する。

態様12．態様1の方法であって、検出可能な配列がバーコード配列である。

態様13．態様1の方法であって、検出可能な配列が、細胞性のイベントの各生起について、検出可能な配列の反復的な挿入の結果として、長さが経時的に増大する。

態様14．態様1の方法であって、検出ステップが、編集された標的部位、または編集された標的部位のアンプリコンを配列決定することを含む。

態様15．態様1の方法であって、napDNAbpが、Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、もしくはアルゴノート、またはCas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、もしくはアルゴノートのバリアントである。

態様16．態様1の方法であって、napDNAbpがCas9またはそのバリアントである。

態様17．態様1の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様18．態様1の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様19．態様1の方法であって、napDNAbpが、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号18との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様20．態様1の方法であって、napDNAbpが、SpCas9野生型、あるいはアミノ酸配列18-88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482-487のいずれか1つまたは配列番号18-88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482-487のいずれかとの少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列のそのバリアントである。

態様21．態様1の方法であって、napDNAbpがSpCas9オーソログである。

態様22．態様1の方法であって、napDNAbpが、アミノ酸配列18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つ、または配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれかとの少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列である。

態様23．態様1の方法であって、RNA依存性DNAポリメラーゼが逆転写酵素である。

態様24．態様23の方法であって、逆転写酵素が天然に存在する野生型逆転写酵素であり、配列番号89のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号89のいずれかとの少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

態様25．態様23の方法であって、逆転写酵素がバリアント逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれかとの少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

態様26．態様1の方法であって、融合タンパク質が、配列番号123および134(PE1、PE2)のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号123および134(PE1、PE2)のいずれかとの少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様27．態様1の方法であって、プライム編集因子融合タンパク質および/またはPEgRNAをコードする1つ以上の構築物が、さらに、細胞性のイベントが生起するときに誘導可能である1つ以上のプロモーターを含む。

態様28．態様1の方法であって、細胞性のイベントが、細胞によって受容される刺激によってマークされる。

態様29．態様28の方法であって、刺激が、低分子、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、代謝物質、無機分子、有機金属分子、有機分子、薬物もしくは薬物候補、糖、脂質、金属、核酸、内生もしくは外因的なシグナルカスケードの活性化の間に生ずる分子、光、熱、音、圧力、機械的ストレス、剪断ストレス、またはウイルスもしくは他の微生物、pHの変化、または酸化還元状態の変化である。

態様30．プライム編集を用いて細胞性のイベントを記録するための細胞データ記録プラスミドであって:

i．(a)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)をコードする核酸配列および(b)RNA依存性DNAポリメラーゼを含む融合タンパク質(前記融合タンパク質は第1のプロモーターに作動可能に連結される);

ii．第2のプロモーターに作動可能に連結されたプライム編集因子ガイドRNA(PEgRNA)をコードする核酸配列(PEgRNAは標的配列に対して相補的である);ならびに

iii．複製起点;
を含み、

プロモーターの少なくとも1つが誘導性プロモーターであり、PEgRNAが、検出可能な配列を標的編集部位において組み入れるために十分にPEgRNAの発現およびnapDNAbpの発現を誘導する条件下において、napDNAbpと会合する。

態様31．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、誘導性プロモーターが細胞性のイベントによって誘導される。

態様32．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、細胞性のイベントが、細胞によって受容される刺激によってマークされる。

態様33．態様32の細胞データ記録プラスミドであって、刺激が、低分子、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、代謝物質、無機分子、有機金属分子、有機分子、薬物もしくは薬物候補、糖、脂質、金属、核酸、内生もしくは外因的なシグナルカスケードの活性化の間に生ずる分子、光、熱、音、圧力、機械的ストレス、剪断ストレス、またはウイルスもしくは他の微生物、pHの変化、または酸化還元状態の変化である。

態様34．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、第1および第2のプロモーターが同じである。

態様35．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、第1および第2のプロモーターが異なる。

態様36．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、少なくとも1つの誘導性プロモーターがアンヒドロテトラサイクリン誘導性プロモーター、IPTG誘導性プロモーター、ラムノース誘導性プロモーター、またはアラビノース誘導性プロモーターである。

態様37．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、第1または第2のプロモーターが恒常的プロモーターである。

態様38．態様37の細胞データ記録プラスミドであって、恒常的プロモーターがLacプロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、恒常的RNAポリメラーゼIIIプロモーター、またはUBCプロモーターである。

態様39．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、複製起点がpSC101、pMB1、pBR322、ColE1、またはp15A複製起点配列を含む。

態様40．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、PEgRNAが、検出可能な配列をコードする編集鋳型を含む。

態様41．態様40の細胞データ記録プラスミドであって、編集鋳型がさらに新たな標的編集部位をコードする。

態様42．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、検出可能な配列が、少なくとも1、または少なくとも2、または少なくとも3、または少なくとも4、または少なくとも5、または少なくとも6、または少なくとも7、または少なくとも8、または少なくとも9、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、または少なくとも13、または少なくとも14、または少なくとも15、または少なくとも16、または少なくとも17、または少なくとも18、または少なくとも19、または少なくとも20、または少なくとも21、または少なくとも22、または少なくとも23、または少なくとも24、または少なくとも25、または少なくとも26、または少なくとも27、または少なくとも28、または少なくとも29、または少なくとも30、または少なくとも31、または少なくとも32、または少なくとも33、または少なくとも34、または少なくとも35、または少なくとも40、または少なくとも50、または少なくとも60、または少なくとも70、または少なくとも80、または少なくとも90、または少なくとも100核酸塩基の挿入である。

態様43．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、検出可能な配列が、少なくとも1、または少なくとも2、または少なくとも3、または少なくとも4、または少なくとも5、または少なくとも6、または少なくとも7、または少なくとも8、または少なくとも9、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、または少なくとも13、または少なくとも14、または少なくとも15、または少なくとも16、または少なくとも17、または少なくとも18、または少なくとも19、または少なくとも20、または少なくとも21、または少なくとも22、または少なくとも23、または少なくとも24、または少なくとも25、または少なくとも26、または少なくとも27、または少なくとも28、または少なくとも29、または少なくとも30、または少なくとも31、または少なくとも32、または少なくとも33、または少なくとも34、または少なくとも35、または少なくとも40、または少なくとも50、または少なくとも60、または少なくとも70、または少なくとも80、または少なくとも90、または少なくとも100核酸塩基の欠失である。

態様44．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、検出可能な配列が核酸塩基置換である。

態様45．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、検出可能な配列がトランジション変異である。

態様46．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、検出可能な配列がトランスバージョン変異である。

態様47．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、検出可能な配列が1ヌクレオチド置換であり、そこから、1ヌクレオチド置換が、(1)GからTの置換、(2)GからAの置換、(3)GからCの置換、(4)TからGの置換、(5)TからAの置換、(6)TからCの置換、(7)CからGの置換、(8)CからTの置換、(9)CからAの置換、(10)AからTの置換、(11)AからGの置換、または(12)AからCの置換である。

態様48．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、検出可能な配列が1ヌクレオチド置換であり、これが、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変換する。

態様49．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、検出可能な配列がバーコード配列である。

態様50．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、検出可能な配列が、細胞性のイベントの各生起について、検出可能な配列の反復的な挿入の結果として、長さが経時的に増大する。

態様51．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、検出ステップが、編集された標的部位、または編集された標的部位のアンプリコンを配列決定することを含む。

態様52．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、napDNAbpが、Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、もしくはアルゴノート、またはCas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、もしくはアルゴノートのバリアントである。

態様53．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、napDNAbpがCas9またはそのバリアントである。

態様54．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様55．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。

態様56．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、napDNAbpが、配列番号18のアミノ酸配列、または配列番号18との少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様57．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、napDNAbpが、SpCas9野生型、あるいはアミノ酸配列18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つ、または配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれかとの少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列のそのバリアントである。

態様58．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、napDNAbpがSpCas9オーソログである。

態様59．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、napDNAbpが、アミノ酸配列18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれか1つ、または配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のいずれかとの少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列である。

態様60．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、RNA依存性DNAポリメラーゼが逆転写酵素である。

態様61．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、逆転写酵素が天然に存在する野生型逆転写酵素であり、配列番号89のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号89のいずれかとの少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

態様62．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、逆転写酵素がバリアント逆転写酵素であり、配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号89～100、105～122、128～129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701～716、739～741、および766のいずれかとの少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

態様63．態様30の細胞データ記録プラスミドであって、融合タンパク質が、配列番号123および134(PE1、PE2)のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号123および134(PE1、PE2)のいずれかと少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

態様64．態様30-63のいずれか1つの細胞データレコーダプラスミドを含む細胞への使用のためのキット。

態様65．態様64のキットであって、細胞が原核細胞である。

態様66．態様64のキットであって、細胞が真核細胞である。

態様67．態様30-63のいずれか1つの細胞データ記録プラスミドを含む細胞。

態様68．態様67の細胞であって、細胞が原核細胞である。

態様69．態様67の細胞であって、細胞が真核細胞である。

態様70．態様69の細胞であって、真核細胞が哺乳類細胞である。

態様71．態様70の細胞であって、哺乳類細胞がヒト細胞である。

態様72．プライム編集によって細胞性のイベントを記録する方法であって、方法が:(A)態様30～63のいずれかの細胞データ記録プラスミドを細胞に導入し、融合タンパク質および/またはPEgRNAが細胞性のイベントの生起によって誘導され、融合タンパク質および/またはPEgRNAの発現が、検出可能な配列を導入するための細胞のゲノム上の標的編集部位のプライム編集をもたらすことと、(B)検出可能な配列を同定し、それによって細胞性のイベントの生起を同定することとを含む。

態様73．態様72の方法であって、(A)導入するステップが、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによってである。

均等物および範囲
クレームにおいて、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、1または1より多いことを意味してもよいが、それと反する指示がないか、またはそれとは別に、文脈から明らかでない場合に限る。ある群の1以上のメンバー間に「または」を包含するクレームまたは記載は、その群のメンバーのうち、1つ、1つより多いか、または、すべてが、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それに採用されるか、またはそれとは別に、それに関係があるか、を満たすと考えるが、それと反する指示がないか、またはそれとは別に、文脈から明らかでない場合に限る。本発明は、その群のうち、正確に1つのメンバーが、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それに採用されるか、またはそれとは別に、それに関係がある態様を包含する。本発明は、その群のメンバーのうち、1つより多いかまたはすべてが、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それに採用されるか、またはそれとは別に、それに関係がある態様を包含する。

しかも、本発明は、列挙されたクレームの1以上からの1以上の限定、要素、節、および記述用語(descriptive terms)が、別のクレーム中へ導入される、すべての変動、組み合わせ、および順列を包括する。例えば、別のクレームに従属するいずれのクレームも、同じ基本クレームに従属するいずれか他のクレーム中に見出される1以上の限定を包含するように修飾され得る。要素が、例として、マーカッシュ群形式において列挙されたものとして提示されている場合、要素の各下位群もまた開示されており、いずれの要素(単数または複数)も群から除去され得る。一般に、本発明、または本発明の側面が、特定の要素および/または特長を含むとして見なされる場合、本発明のある態様または本発明のある側面は、かかる要素および/または特長からなるか、または実質的にそれからなると理解されるべきである。簡潔さを目的として、それらの態様は、本明細書中、in haec verbaで具体的に表明されていない。用語「含むこと(comprising)」および「含有すること(containing)」が、オープンであることを意図し、追加の要素またはステップの包含を容認することにもまた留意する。範囲が与えられるとき、エンドポイントも包含される。しかも、別段の指示がないか、またはそれとは別に、文脈および当業者の理解から明らかでない場合に限り、範囲として表現された値は、いずれか具体的な値、または本発明の異なる態様において述べられた範囲内の部分範囲を、文脈が明確に別段の指図をしない限り範囲の下限の単位の10倍まで、想定し得る。

本出願は、種々の発行済み特許、公開特許出願、雑誌記事、および他の公刊物を参照し、これらのすべては参照によって本明細書に組み込まれる。組み込まれる参照のいずれかと本明細書との間に矛盾がある場合、本明細書がコントロールする(control)ものとする。加えて、先行技術に属する本発明のいずれか特定の態様は、クレームのいずれかの1以上からはっきりと除外され得る。かかる態様は当業者に知られていると思われるので、それらは、除外が本明細書においてはっきりと表明されていない場合であっても、除外され得る。本発明のいずれか特定の態様は、先行技術の存在に関するか否かにかかわらず、いずれかのクレームから、いずれかの理由で除外され得る。

当業者は、本明細書に記載の具体的な態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜいルーチンな実験法を使用して確かめる能力があるであろう。本明細書に記載の本態様の範囲は、上の記載に限定されることを意図せず、むしろ添付のクレームに表明されているとおりである。当業者は、以下のクレームにおいて定義されるとおり、本発明の精神または範囲から逸脱せずに、この記載への種々の変化および修飾がなされてもよいことを解するであろう。

Claims (9)

1. 標的ヌクレオチド配列によってコードされる着目したRNA中にリボヌクレオチドモチーフまたはタグをプライム編集によって組み入れる方法であって、方法が、以下:
   (a)標的ヌクレオチド配列を、(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子と、および(ii)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと、接触させること;それによって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする単鎖DNA配列を重合すること;ならびに
   DNA修復および/または複製プロセスを通し、標的ヌクレオチド配列にて、対応する内生鎖の代わりに単鎖DNA配列を組み込むこと
   を含み、
   ここで方法が、リボヌクレオチドモチーフまたはタグを含む着目した改変RNAをコードする標的ヌクレオチド配列を産生する、前記方法。
2. リボヌクレオチドモチーフまたはタグが、検出部分である、請求項1に記載の方法。
3. リボヌクレオチドモチーフまたはタグが、着目したRNAの発現レベルに影響を及ぼす、請求項1に記載の方法。
4. リボヌクレオチドモチーフまたはタグが、着目したRNAの輸送または細胞内局在に影響を及ぼす、請求項1に記載の方法。
5. リボヌクレオチドモチーフまたはタグが、1型SV40、2型SV40、3型SV40、hGH、BGH、rbGlob、TK、MALAT1 ENE-mascRNA、KSHV PAN ENE、Smbox/U1 snRNA 1ボックス、U1 snRNA 3'ボックス、tRNA-リシン、ブロッコリーアプタマー、ホウレンソウアプタマー、マンゴーアプタマー、HDVリボザイム、およびm6Aからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
6. PEgRNAが、配列番号101～104、181～183、223～244、277、325～334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499～505、735～761、776～777(表を参照)を含む、請求項1に記載の方法。
7. 融合タンパク質が、PE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
8. napDNAbpが、Cas9ニッカーゼ(nCas9)である、請求項1に記載の方法。
9. napDNAbpが、配列番号18～88、126、130、137、141、147、153、157、445、460、467、および482～487のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。

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