TW202304529A - 連續電穿孔方法 - Google Patents

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迪瓦許 阿查里亞
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Abstract

本發明之態樣係有關一種用於連續電穿孔之技術，該技術提供多個時間上分開之電脈衝向細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體遞送，或提高一或多種所關注藥劑進入細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體、組織或其衍生物之效率，且將電弧或熱衝擊造成之損壞降至最低；提高所關注藥劑的負載效率；且維持該等細胞、細胞顆粒、脂質囊泡或組織之生存力以及該等細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織產生臨床效果的能力。

Description

連續電穿孔方法
本發明大體上係關於用於將藥劑引入活細胞或細胞顆粒或脂質囊泡中之方法及設備。
電穿孔係在短時間內施加受控電脈衝來轉型細菌、酵母、植物原生質體、經培養細胞、其他細胞、細胞顆粒、脂質體、囊泡、組織或其他生物媒介物。該脈衝誘導引起細胞膜可逆擊穿之跨膜電位。此作用導致細胞膜的滲透或「孔形成」，其允許將細胞外藥劑，諸如小分子(諸如分子探針、藥物、染料、寡核苷酸或肽)或大分子(諸如蛋白質、DNA及RNA)引入細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織。此程序對於引入特異性干預組織培養細胞或初細胞，尤其哺乳動物細胞中之分子途徑的化學或生物製劑亦為高效的。例如，電穿孔用於產生基因剔除小鼠之過程，以及用於腫瘤治療、基因療法及基於細胞之療法。
關於細胞的轉染，許多因素促成轉染的困難或成功。例如，試劑-基因複合物之細胞結合及內化、核酸釋放至細胞質中、基因之細胞核吸取及表現；細胞之健康、代謝活性、胞吞速率及分裂速率；及經培養細胞之齡期、匯合度及繼代次數均為可能導致細胞難以轉染的因素。不成熟細胞，包括幹細胞及未定型先驅細胞，缺乏此等特徵。同樣，在藥物發現、毒理學及基礎研究中越來越多地用作模型之初細胞不分裂，內化能力較低，且通常缺乏與轉染複合物結合的能力。
電穿孔過程之結果很大程度上受外加電場(EF)脈衝之量值及脈衝之持續時間的控制。只要脈衝量值高於特定臨限值位準，脈衝之量值或持續時間的增加通常會導致細胞外分子在細胞內更多的累積。
施加至細胞懸浮液之每個電脈衝都可以用一定量的能量來表徵，該能量等於電極上之電壓、通過緩衝液之電流及高壓脈衝之持續時間的乘積。然而，僅一小部分施加之電能被用於修飾脂質膜及將細胞外物質移動至細胞中的有用工作。其餘電能以在周圍介質中產生之熱量的形式耗散。略微加熱細胞懸浮液之功率耗散係施加EF的不可避免的結果，即使加熱本身不會導致細胞滲透。電穿孔緩衝液之導電性越高，熱生產時浪費之能量就越多。熱量積累至高於環境溫度20-24度之溫度會對細胞及細胞組分造成永久性損壞，且降低電穿孔過程之效率；此限制了能夠用於成功電穿孔細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織的能量。
電穿孔樣品中之溫度升高亦與樣品導電率之增加有關，在簡單的鹽溶液中，導電率每℃增加約2%。施加之電場會導致電流流過細胞或顆粒懸浮液，此會導致溫度升高，從而轉化為導電率增加及自電源汲取更大的電流，等等。若此類正反饋過程未中斷(例如，藉由關閉脈衝)，電流增加以雪崩式之方式進行，且導致飛弧及樣品損失。此效應主要在相對較高的場強度(＞2 kV/cm)下觀察到。
例如，難以轉染之細胞(諸如不成熟細胞或初細胞)的電穿孔需要強電場，且因此必須限制緩衝液導電率或脈衝寬度。然而，細胞對環境之生物化學變化極為敏感，且與對細胞、細胞顆粒、脂質囊泡或組織施加電場相關之環境中的物理化學變化可調節細胞、細胞顆粒、脂質囊泡或組織之生理狀態、活化特性及生物功能，影響電穿孔材料提供臨床效果的能力。
因此，本發明人認為需要用所關注之藥劑以高效率對難以轉染之細胞、細胞顆粒、脂質囊泡或組織進行電穿孔之方法而不損壞細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織超出其產生臨床效果的能力。
在一些態樣中，本文描述使用包含連續電脈衝之新穎電穿孔方案用所關注之藥劑對難以轉染之細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織進行有效電穿孔的方法及設備。在某些態樣中，細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織之連續電穿孔出人意料地導致與細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織之單次電穿孔相比顯著較高的轉基因表現。在某些態樣中，本文所述之方法及設備為獨特的，因為它們可以增加所關注之藥劑負載至細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織中之效率，同時保持細胞、細胞顆粒、脂質囊泡或組織之生存力且維持細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織產生臨床效果的能力。在某些態樣中，本文揭示之方法及設備可以藉由改變每輪電穿孔期間使用之電穿孔能量來使連續電穿孔後的效率及生存力達最佳。
本發明之態樣係關於轉染所關注之藥劑之方法；瞬時滲透膜以允許所關注的藥劑通過膜輸送之方法；電穿孔細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織之方法；產生電穿孔細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織之方法；及增加電穿孔效率同時維持電穿孔材料之臨床效果的方法。考慮本發明中所論述之步驟及態樣作為任何此等方法的一部分。在一些態樣中，本文考慮之方法可包含或排除以下步驟中的1、2、3、4、5或更多個：使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；使該樣品經受第一電脈衝與第二電脈衝之間的時間延遲；在該樣品中提供核酸、多肽、蛋白質或小分子；使細胞、細胞顆粒或脂質囊泡經受足以電穿孔該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡的條件；在細胞中表現電穿孔核酸、多肽、蛋白質；及藉由改變樣品經受之電脈衝的電氣參數及/或電脈衝之間的時間延遲來改變藥劑負載至樣品中的效率、電穿孔樣品之臨床效果及/或樣品生存力。此等步驟中之任何一或多者可自所揭示之方法排除。
本發明之態樣包括電穿孔方法，其包含：
(1) 使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間；
(2) 使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該樣品恢復至少24小時；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；
(3) 使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該樣品恢復至少24小時；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間；
(4) 使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間。其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間；
(5) 使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該樣品恢復至少24小時；及 使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；或
(6) 使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該樣品恢復至少24小時；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
本發明之態樣包括連續編輯細胞基因之方法，其包含：
(1) 使包含一或多個完整細胞之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間；
(2) 使包含一或多個完整細胞之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該樣品恢復至少24小時；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；
(3) 使包含一或多個完整細胞之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該樣品恢復至少24小時；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間；
(4) 使包含一或多個完整細胞之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以使該等細胞負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以使該等細胞負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間；
(5) 使包含一或多個完整細胞之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以使該等細胞負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該樣品恢復至少24小時；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以使該等細胞負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；或
(6) 使包含一或多個完整細胞之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以使該等細胞負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該樣品恢復至少24小時；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以使該等細胞負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
本發明之其他態樣包括電穿孔方法，其包含：
(1) 使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使細胞負載有包含RNA之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該細胞樣品恢復至少24小時；及使該細胞樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使細胞負載有包含RNA之第二藥劑的第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間；
(2) 使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使細胞負載有包含DNA之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該細胞樣品恢復至少24小時；及使該細胞樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使細胞負載有包含DNA之第二藥劑的第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間；或
(3) 使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使細胞負載有包含一或多種蛋白質之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該細胞樣品恢復至少24小時；及使該細胞樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使細胞負載有包含一或多種蛋白質之第二藥劑的第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間；或
(4) 使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使細胞負載有包含核糖核蛋白之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該細胞樣品恢復至少24小時；及使該細胞樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使細胞負載有包含核糖核蛋白之第二藥劑的第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間；或
(5) 使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以使細胞負載有包含RNA之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該細胞樣品恢復至少24小時；及使該細胞樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以使細胞負載有包含RNA之第二藥劑的第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間；
(6) 使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以使細胞負載有包含DNA之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該細胞樣品恢復至少24小時；及使該細胞樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以使細胞負載有包含DNA之第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間；或
(7) 使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以使細胞負載有包含一或多種蛋白質之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該細胞樣品恢復至少24小時；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以使細胞負載有包含一或多種蛋白質之第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間；或
(8) 使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以使細胞負載有包含核糖核蛋白之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該細胞樣品恢復至少24小時；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以使細胞負載有包含核糖核蛋白之第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
在一些態樣中，第一及第二藥劑為相同藥劑。在一些態樣中，第一及第二藥劑為不同藥劑。在一些態樣中，第一及第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。在一些態樣中，該核酸為RNA，且其中該RNA為mRNA、miRNA、shRNA、siRNA或反義寡核苷酸。在一些態樣中，該核酸為DNA，且其中該DNA為反義寡核苷酸、載體或雙義線性DNA。在一些態樣中，蛋白質為核糖核蛋白。在一些態樣中，核糖核蛋白包含Cas9蛋白及引導RNA。
在一些態樣中，該方法進一步包含在第一及/或第二電脈衝之後的靜止步驟。在一些態樣中，該靜止步驟包含培育該樣品10-30分鐘。在一些態樣中，靜止步驟包含在25-50℃下培育樣品。在一些態樣中，該靜止步驟包含以3-8% CO2培育該樣品。在一些態樣中，該樣品在該等第一及/或第二電脈衝之後不經受靜止步驟。
在一些態樣中，該第一場強度等於該第二場強度，且該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。在一些態樣中，該第一場強度等於該第二場強度，且該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。在一些態樣中，該第一場強度等於該第二場強度，且該第一脈衝持續時間等於該第二脈衝持續時間。在一些態樣中，該第一場強度小於該第二場強度，且該第一脈衝持續時間等於該第二脈衝持續時間。在一些態樣中，該第一場強度大於該第二場強度，且該第一脈衝持續時間等於該第二脈衝持續時間。在一些態樣中，該第一場強度小於該第二場強度，且該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。在一些態樣中，該第一場強度大於該第二場強度，且該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。在一些態樣中，該第一場強度小於該第二場強度，且該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。在一些態樣中，該第一場強度大於該第二場強度，且該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。
在一些態樣中，第一電脈衝之場強度及第一電脈衝之脈衝持續時間產生第一總施加電能且第二電脈衝之場強度及第二電脈衝之脈衝持續時間產生第二總施加電能，且其中該第一總施加電能大於該第二總施加電能。在一些態樣中，該第一總施加電能小於該第二總施加電能。
在一些態樣中，該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數。該等電脈衝之該電壓量值可介於0.001伏與10,000伏、0.01伏與10,000伏、0.1伏與10,000伏、1伏與10,000伏、1伏與9,000伏、1伏與8,000伏、1伏與7,000伏、1伏與6,000伏、1伏與5,000伏、1伏與4,000伏、1伏與3,000伏、1伏與2,000伏之間，或1伏與1,000伏之間。在一些態樣中，該等電脈衝之電壓量值係介於100伏與900伏之間。在一些態樣中，該樣品之導電率為包含電穿孔緩衝液之離子組成、待負載至該等細胞中的藥劑之濃度、細胞密度、溫度及壓力之參數的函數。該樣品之導電率係介於0.01西門子/公尺(Siemens/meter)與10西門子/公尺、0.01西門子/公尺與1西門子/公尺、0.1西門子/公尺與10西門子/公尺、0.1西門子/公尺與1西門子/公尺或1西門子/公尺與10西門子/公尺之間。在一些態樣中，該樣品之導電率係介於1.0與3.0西門子/公尺之間。在一些態樣中，該等第一及第二場強度進一步為電穿孔腔室之幾何的函數。該電穿孔腔室可包含介於0.001 cm與10 cm、0.001 cm與1 cm、0.01 cm與10 cm、0.01 cm與1 cm、0.1 cm與10 cm、0.1 cm與1 cm或1 cm與10 cm之間的電極間隙。在一些態樣中，該電穿孔腔室包含介於0.01 cm與1 cm之間的電極間隙。
該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度可介於0.01 kV/cm與10 kV/cm之間，0.01 kV/cm與1 kV/cm之間，0.1 kV/cm與10 kV/cm之間，0.1 kV/cm與1 kV/cm之間，或1 kV/cm與10 kV/cm之間。在一些態樣中，該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度係介於0.3 kV/cm與3 kV/cm之間。
該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二脈衝持續時間可介於10 -6秒與10秒、10 -6秒與1秒、10 -3秒與10秒或10 -3秒與1秒之間。在一些態樣中，該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二脈衝持續時間係介於1微秒與100毫秒之間。
在一些態樣中，該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵。該脈衝數目可介於1個脈衝與1000個脈衝、1個脈衝與900個脈衝、1個脈衝與800個脈衝、1個脈衝與700個脈衝、1個脈衝與600個脈衝、1個脈衝與500個脈衝、1個脈衝與400個脈衝、1個脈衝與300個脈衝、1個脈衝與200個脈衝、1個脈衝與100個脈衝、1個脈衝與90個脈衝、1個脈衝與80個脈衝、1個脈衝與70個脈衝、1個脈衝與60個脈衝、1個脈衝與50個脈衝、1個脈衝與40個脈衝、1個脈衝與30個脈衝、1個脈衝與20個脈衝或1個脈衝與10個脈衝之間。在一些態樣中，脈衝數目係介於1個脈衝與130個脈衝之間。
在一些態樣中，該脈衝寬度為指數衰減速率之函數。在一些態樣中，該指數衰減速率為該樣品之電阻及用於實現電穿孔之電源之電容的函數。該樣品之電阻可介於1歐姆與10000歐姆、1歐姆與9000歐姆、1歐姆與8000歐姆、1歐姆與7000歐姆、1歐姆與6000歐姆、1歐姆與5000歐姆、1歐姆與4000歐姆、1歐姆與3000歐姆、1歐姆與2000歐姆、1歐姆與1000歐姆、1歐姆與900歐姆、1歐姆與800歐姆、1歐姆與700歐姆、1歐姆與600歐姆、1歐姆與500歐姆、1歐姆與400歐姆、1歐姆與300歐姆、1歐姆與200歐姆、1歐姆與100歐姆、1歐姆與90歐姆、1歐姆與80歐姆、1歐姆與70歐姆、1歐姆與60歐姆、1歐姆與50歐姆、1歐姆與40歐姆、1歐姆與30歐姆、1歐姆與20歐姆，或1歐姆與10歐姆之間。在一些態樣中，樣品之電阻係介於1歐姆與1000歐姆之間。該電源電容可介於1 μF與1,000,000 μF、1 μF與100,000 μF、1 μF與10,000 μF、1 μF與1,000 μF或1 μF與100 μF之間。在一些態樣中，該電源電容係介於1000 μF與5000 μF之間。
在一些態樣中，該脈衝形狀為方波脈衝或指數衰減波脈衝。在一些態樣中，該脈衝模式包含對應於該第一脈衝或該第二脈衝之該持續時間的單個脈衝。在一些態樣中，該脈衝模式包含多個脈衝，其中該多個脈衝之組合持續時間對應於該第一脈衝或該第二脈衝之該持續時間。在一些態樣中，該等第一及第二電脈衝之極性為正或負。
在一些態樣中，該樣品在該樣品經受該第一脈衝之後至少12小時至至少48小時經受該第二電脈衝。在一些態樣中，該樣品在該樣品經受該第一脈衝之後至少24小時經受該第二電脈衝。
該等方法可藉由電穿孔系統進行，該電穿孔系統具有包含指令之非暫時性電腦可讀取媒體，該等指令在由處理器執行時使得該處理器執行該等第一及第二方案以對該樣品電穿孔。在一些態樣中，該電穿孔系統包含流動電穿孔設備且其中在該樣品在該流動電穿孔設備內流動的同時，使該樣品經受該等電脈衝。
在一些態樣中，該等細胞可為哺乳動物細胞，且在一些態樣中，該等細胞為人類細胞、鼠類細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞或靈長類動物細胞。在一些態樣中，細胞為初細胞。在一些態樣中，該等細胞為經培養細胞，且該等經培養細胞可為經培養細胞株，該等細胞株可包含3T3、697、10T½、1321N1、A549、AHR77、B-LCL、B16、B65、Ba/F3、BHK、C2C12、C6、CaCo-2、CAP、CaSki、ChaGo-K-1、CHO、COS、DG75、DLD-1、EL4、H1299、HaCaT、HAP1、HCT116、HEK、HeLa、HepG2、HL60、HOS、HT1080、HT29、Huh-7、HUVEC、INS-1/GRINCH、Jurkat、K46、K562、KG1、KHYG-1、L5278Y、L6、LNCaP、LS180、MCF7、MDA-MB-231、ME-180、MG-63、Min-6、MOLT4、Nalm6、ND7/23、Neuro2a、NK92、NS/0、P3U1、Panc-1、PC-3、PC12、PER.C6、PM1、Ramos、RAW 264.7、RBL、Renca、RLE、SH-SY5Y、SK-BR-3、SK-MES -1、SK-N-SH、SK-OV-3、SP2/0、SW403、THP-1、U2OS、U937、Vero、YB2/0或其衍生物。該等細胞可包含脂肪細胞、軟骨細胞、內皮細胞、上皮細胞、纖維母細胞、肝細胞、角質細胞、肌細胞、神經元、骨細胞、周邊血液單核細胞(PBMC)、脾細胞、幹細胞或胸腺細胞。在一些態樣中，PBMC為周邊血液淋巴球(PBL)，其可為自然殺手(NK)細胞、T細胞或B細胞。在一些態樣中，該等PBMC為單核球，其可為巨噬細胞或樹突狀細胞，且該等巨噬細胞可為微神經膠質細胞。在一些態樣中，該等幹細胞為脂肪幹細胞、胚胎幹細胞、造血幹細胞、誘導性富潛能幹細胞、間葉幹細胞或神經幹細胞。
在一些態樣中，該藥劑之負載效率為至少50%、60%、70%、80%或90%。
在一些態樣中，細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時可為至少50%；在該第二電脈衝之後12至96小時可為至少60%；在該第二電脈衝之後12至96小時可為至少70%；在該第二電脈衝之後12至96小時可為至少80%；或在該第二電脈衝之後12至96小時可為至少90%。
在一些態樣中，該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至96小時為大致50%至90%存活的；在該第二電脈衝之後12至72小時為大致50%至90%存活的；在該第二電脈衝之後12至48小時為大致50%至90%存活的；在該第二電脈衝之後24小時為大致50%至90%存活的；在該第二電脈衝之後12至96小時為大致60%至90%存活的；在該第二電脈衝之後12至72小時為大致60%至90%存活的；在該第二電脈衝之後12至48小時為大致60%至90%存活的；或在該第二電脈衝之後24小時為大致60%至90%存活的。
本發明之態樣亦關於一種電穿孔系統，其具有包含指令之非暫時性電腦可讀取媒體，該等指令在由處理器執行時使得該處理器：選擇與具有第一場強度及第一脈衝持續時間之第一電脈衝相關的第一方案；使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受由第一方案所定義足以根據第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第一藥劑的第一電脈衝；選擇與具有第二場強度及第二脈衝持續時間之第二電脈衝相關的第二方案；及使該樣品經受由第二方案所定義足以根據第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第二藥劑的第二電脈衝；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
本發明之態樣亦包括一種使用本文中所描述之任何方法產生或使用任何電穿孔系統產生之電穿孔細胞、細胞顆粒或脂質囊泡，該電穿孔系統具有包含指令之非暫時性電腦可讀取媒體，該等指令在由處理器執行時使得該處理器執行本文中所描述之任何方法。
本發明之其他態樣包括一種治療患有或疑似患有疾病或病狀之受試者的方法，其包含以減輕該疾病或病狀之量投與任一所描述之該等方法之產物。在某些態樣中，方法之產物為藥物遞送媒劑，且經考慮，廣泛多種已知藥物可經由所描述方法產生之負載顆粒遞送。疾病或病狀可包括能夠經由脂質體顆粒、細胞顆粒或藉由使用電穿孔方法製備(例如負載)之類似遞送媒劑遞送藥物或藥劑的任何疾病或病狀。
本發明之又其他態樣包括藉由投與有效量之包含於藉由所述方法產生之顆粒中的藥物、生物或另一生物活性分子來治療患有或疑似患有疾病或病狀之受試者的方法。在某些態樣中，疾病為傳染性疾病，包括但不限於細菌、真菌、寄生蟲或病毒感染。在另一態樣中，細菌感染為分支桿菌感染。在另一態樣中，病毒感染為反轉錄病毒感染，包括但不限於HIV感染。在另一態樣中，疾病為發炎性疾病或癌症或血管閉塞性疾病。
本發明之態樣包括經組態以執行所述方法中之任一者的電穿孔系統。
亦揭示本發明之以下態樣1至201。
態樣1為一種電穿孔方法，其包含：使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
態樣2為一種電穿孔方法，其包含：使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該樣品恢復至少24小時；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間。
態樣3為一種電穿孔方法，其包含：使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該樣品恢復至少24小時；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
態樣4為一種連續編輯細胞基因之方法，其包含：使包含一或多個完整細胞之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
態樣5為一種連續編輯細胞基因之方法，其包含：使包含一或多個完整細胞之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該樣品恢復至少24小時；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間。
態樣6為一種連續編輯細胞基因之方法，其包含：使包含一或多個完整細胞之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞負載有第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；允許該樣品恢復至少24小時；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞負載有第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
態樣7為如態樣1至6之方法，其中第一及第二藥劑為相同藥劑。態樣8為如態樣1至7之方法，其中第一及第二藥劑為不同藥劑。態樣9為如態樣1至8之方法，其中第一及第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣10為如態樣1至9之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣11為如態樣1至10之方法，其中第一藥劑為核酸，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣12為如態樣1至10之方法，其中第一藥劑為多肽，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣13為如態樣1至10之方法，其中第一藥劑為蛋白質，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣14為如態樣1至10之方法，其中第一藥劑為小分子，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣15為如態樣1至14之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為核酸。態樣16為如態樣1至14之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為多肽。態樣17為如態樣1至14之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為蛋白質。態樣18為如態樣1至14之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為小分子。態樣19為如態樣1至18之方法，其中核酸為RNA，且其中RNA為mRNA、miRNA、shRNA、siRNA或反義寡核苷酸。態樣20為如態樣1至19之方法，其中該核酸為DNA，且其中該DNA為反義寡核苷酸、載體或雙義線性DNA。態樣21如態樣1至20之方法，其中蛋白質為核糖核蛋白。態樣22為如態樣1至21之方法，其中核糖核蛋白包含Cas9蛋白及引導RNA。
態樣23為一種電穿孔方法，其包含：(a)使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使細胞負載有包含RNA之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；(b)允許該細胞樣品恢復至少24小時；及(c)使該細胞樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使細胞負載有包含RNA之第二藥劑的第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
態樣24為一種電穿孔方法，其包含：(a)使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使細胞負載有包含DNA之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；(b)允許該細胞樣品恢復至少24小時；及(c)使該細胞樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使細胞負載有包含DNA之第二藥劑的第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
態樣25為一種電穿孔方法，其包含：(a)使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使細胞負載有包含一或多種蛋白質之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；(b)允許該細胞樣品恢復至少24小時；及(c)使該細胞樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使細胞負載有包含一或多種蛋白質之第二藥劑的第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
態樣26為一種連續編輯細胞之方法，其包含：(a)使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使細胞負載有包含核糖核蛋白之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；(b)允許該細胞樣品恢復至少24小時；及(c)使該細胞樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使細胞負載有包含核糖核蛋白之第二藥劑的第二場強度及第二脈衝持續時間；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
態樣27為如態樣23至26之方法，其中第一及第二藥劑為相同藥劑。態樣28為如態樣23至26之方法，其中第一及第二藥劑為不同藥劑。態樣29為如態樣23至28之方法，其中第一及第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣30為如態樣23至29之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣31為如態樣23至30之方法，其中第一藥劑為核酸，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣32為如態樣23至30之方法，其中第一藥劑為多肽，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣33為如態樣23至30之方法，其中第一藥劑為蛋白質，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣34為如態樣23至30之方法，其中第一藥劑為小分子，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣35為如態樣23至34之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為核酸。態樣36為如態樣23至34之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為多肽。態樣37為如態樣23至34之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為蛋白質。態樣38為如態樣23至34之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為小分子。態樣39為如態樣23至38之方法，其中核酸為RNA，且其中RNA為mRNA、miRNA、shRNA、siRNA或反義寡核苷酸。態樣40為如態樣23至39之方法，其中該核酸為DNA，且其中該DNA為反義寡核苷酸、載體或雙義線性DNA。態樣41為如態樣23至40之方法，其中蛋白質為核糖核蛋白。態樣42為如態樣23至41之方法，其中核糖核蛋白包含Cas9蛋白及引導RNA。
態樣43為如態樣1至42之方法，其進一步包含在第一及/或第二電脈衝之後的靜止步驟。態樣44為如態樣1至43之方法，其進一步包含在第一及/或第二電脈衝之後的靜止步驟，其中該靜止步驟包含培育樣品10-30分鐘。態樣45為如態樣1至44之方法，其進一步包含在第一及/或第二電脈衝之後的靜止步驟，其中該靜止步驟包含在25-50℃下培育樣品。態樣46為如態樣1至45之方法，其進一步包含在第一及/或第二電脈衝之後的靜止步驟，其中該靜止步驟包含在3-8%CO 2下培育樣品。態樣47如態樣1至46之方法，其中該樣品在第一及/或第二電脈衝之後不經受靜止步驟。態樣48為如態樣1至47之方法，其中該第一場強度等於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。態樣49為如態樣1至47之方法，其中該第一場強度等於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。態樣50為如態樣1至47之方法，其中該第一場強度小於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間等於該第二脈衝持續時間。態樣51為如態樣1至47之方法，其中該第一場強度大於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間等於該第二脈衝持續時間。態樣52為如態樣1至47之方法，其中該第一場強度小於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。態樣53為如態樣1至47之方法，其中該第一場強度大於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。態樣54為如態樣1至47之方法，其中該第一場強度小於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。態樣55為如態樣1至47之方法，其中該第一場強度大於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。態樣56為如態樣1至55之方法，其中該第一場強度及第一脈衝持續時間產生第一總施加電能且該第二場強度及第二脈衝持續時間產生第二總施加電能，且其中該第一總施加電能不同於該第二總施加電能。態樣57為如態樣1至56之方法，其中該第一場強度及第一脈衝持續時間產生第一總施加電能且該第二場強度及第二脈衝持續時間產生第二總施加電能，其中該第一總施加電能不同於該第二總施加電能，且其中該第一總施加電能大於該第二總施加電能。態樣58為如態樣1至57之方法，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數。態樣59為如態樣1至58之方法，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，且其中該等電脈衝之該電壓量值係介於0.001伏與10,000伏、0.01伏與10,000伏、0.1伏與10,000伏、1伏與10,000伏、1伏與9,000伏、1伏與8,000伏、1伏與7,000伏、1伏與6,000伏、1伏與5,000伏、1伏與4,000伏、1伏與3,000伏、1伏與2,000伏之間，或1伏與1,000伏之間。態樣60為如態樣1至59之方法，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，且其中該等電脈衝之該電壓量值係介於100伏與900伏之間。態樣61為如態樣1至60之方法，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，且其中該樣品之導電率為包含電穿孔緩衝液之離子組成、待負載至該等細胞中的藥劑之濃度、細胞密度、溫度及壓力之參數的函數。態樣62為如態樣1至61之方法，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，且其中該樣品之導電率係介於0.01西門子/公尺與10西門子/公尺、0.01西門子/公尺與1西門子/公尺、0.1西門子/公尺與10西門子/公尺、0.1西門子/公尺與1西門子/公尺或1西門子/公尺與10西門子/公尺之間。態樣63為如態樣1至62之方法，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，且其中該樣品之導電率係介於1.0西門子/公尺與3.0西門子/公尺之間。態樣64為如態樣1至63之方法，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，且其中該等第一及第二場強度進一步為電穿孔腔室之幾何的函數。態樣65為如態樣1至64之方法，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，其中該等第一及第二場強度進一步為電穿孔腔室之幾何的函數，且其中該電穿孔腔室包含介於0.001 cm與10 cm、0.001 cm與1 cm、0.01 cm與10 cm、0.01 cm與1 cm、0.1 cm與10 cm、0.1 cm與1 cm或1 cm與10 cm之間的電極間隙。態樣66為如態樣1至65之方法，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，其中該等第一及第二場強度進一步為電穿孔腔室之幾何的函數，且其中該電穿孔腔室包含介於0.01 cm與1 cm之間的電極間隙。態樣67為如態樣1至66之方法，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度係介於0.01 kV/cm與10 kV/cm、0.01 kV/cm與1 kV/cm、0.1 kV/cm與10 kV/cm、0.1 kV/cm與1 kV/cm或1 kV/cm與10 kV/cm之間。態樣68為如態樣1至67之方法，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度係介於0.3 kV/cm與3 kV/cm之間。態樣69為如態樣1至68之方法，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二脈衝持續時間係介於10 -6秒與10秒、10 -6秒與1秒、10 -3秒與10秒或10 -3秒與1秒之間。態樣70為如態樣1至69之方法，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二脈衝持續時間係介於1微秒與100毫秒之間。態樣71為如態樣1至70之方法，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵。態樣72為如態樣1至71之方法，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，且其中該脈衝數目係介於1個脈衝與1000個脈衝、1個脈衝與900個脈衝、1個脈衝與800個脈衝、1個脈衝與700個脈衝、1個脈衝與600個脈衝、1個脈衝與500個脈衝、1個脈衝與400個脈衝、1個脈衝與300個脈衝、1個脈衝與200個脈衝、1個脈衝與100個脈衝、1個脈衝與90個脈衝、1個脈衝與80個脈衝、1個脈衝與70個脈衝、1個脈衝與60個脈衝、1個脈衝與50個脈衝、1個脈衝與40個脈衝、1個脈衝與30個脈衝、1個脈衝與20個脈衝或1個脈衝與10個脈衝之間。態樣73為如態樣1至72之方法，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，且其中該脈衝數目係介於1個脈衝與130個脈衝之間。態樣74為如態樣1至73之方法，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，且其中該脈衝寬度為指數衰減速率之函數。態樣75為如態樣1至74之方法，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，且其中該脈衝寬度為指數衰減速率之函數，且其中該指數衰減速率為該樣品的電阻及用於實現電穿孔之電源之電容之函數。態樣76為如態樣1至75之方法，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，其中該脈衝寬度為指數衰減速率之函數，其中該指數衰減速率為該樣品之電阻及用於實現電穿孔的電源之電容之函數，其中該樣品之電阻係介於1歐姆與10000歐姆、1歐姆與9000歐姆、1歐姆與8000歐姆、1歐姆與7000歐姆、1歐姆與6000歐姆、1歐姆與5000歐姆、1歐姆與4000歐姆、1歐姆與3000歐姆、1歐姆與2000歐姆、1歐姆與1000歐姆、1歐姆與900歐姆、1歐姆與800歐姆、1歐姆與700歐姆、1歐姆與600歐姆、1歐姆與500歐姆、1歐姆與400歐姆、1歐姆與300歐姆、1歐姆與200歐姆、1歐姆與100歐姆、1歐姆與90歐姆、1歐姆與80歐姆、1歐姆與70歐姆、1歐姆與60歐姆、1歐姆與50歐姆、1歐姆與40歐姆、1歐姆與30歐姆、1歐姆與20歐姆，或1歐姆與10歐姆之間。態樣77為如態樣1至76之方法，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，其中該脈衝寬度為指數衰減速率之函數，其中該指數衰減速率為該樣品之電阻及用於實現電穿孔的電源之電容之函數，且其中該樣品之電阻係介於1歐姆與1000歐姆之間。態樣78為如態樣1至77之方法，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，其中該脈衝寬度為指數衰減速率之函數，其中該指數衰減速率為該樣品之電阻及用於實現電穿孔的電源之電容之函數，且其中該電源電容係介於1 μF與1,000,000 μF、1 μF與100,000 μF、1 μF與10,000 μF、1 μF與1,000 μF或1 μF與100 μF之間。態樣79為如態樣1至78之方法，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，其中該脈衝寬度為指數衰減速率之函數，其中該指數衰減速率為該樣品之電阻及用於實現電穿孔的電源之電容之函數，且其中該電源電容係介於1000 μF與5000 μF之間。態樣80為如態樣1至79之方法，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，且其中該脈衝形狀為方波脈衝或指數衰減波脈衝。態樣81為如態樣1至80之方法，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，且其中該脈衝模式包含對應於該第一脈衝或該第二脈衝之該持續時間的單個脈衝。態樣82為如態樣1至81之方法，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，且其中該脈衝模式包含多個脈衝，其中該多個脈衝之組合持續時間對應於該第一脈衝或該第二脈衝之該持續時間。態樣83為如態樣1至82之方法，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，且其中該等第一及第二電脈衝之極性為正或負。態樣84為如態樣1至83之方法，其中該樣品在該樣品經受該第一脈衝之後至少12小時至至少48小時經受該第二電脈衝。態樣85為如態樣1至84之方法，其中該樣品在該樣品經受該第一脈衝之後至少24小時經受該第二電脈衝。態樣86為如態樣1至85之方法，其中該方法係藉由電穿孔系統進行，該電穿孔系統具有包含指令之非暫時性電腦可讀取媒體，該等指令在由處理器執行時使得該處理器執行該等第一及第二方案以對該樣品進行電穿孔。態樣87為如態樣1至86之方法，其中該電穿孔系統包含流動電穿孔設備。態樣88為如態樣1至87之方法，其中該電穿孔系統包含流動電穿孔設備且其中在該樣品在該流動電穿孔設備內流動的同時，該樣品經受該等電脈衝。態樣89為如態樣1至88之方法，其中該等細胞為哺乳動物細胞。態樣90為如態樣1至89之方法，其中該等細胞為人類細胞、鼠類細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞或靈長類動物細胞。態樣91為如態樣1至90之方法，其中該等細胞為初細胞。態樣92為如態樣1至91之方法，其中該等細胞為經培養細胞。態樣93為如態樣1至92之方法，其中該等細胞為經培養細胞，且其中經培養細胞為經培養細胞株。態樣94為如態樣1至93之方法，其中該等細胞為經培養細胞株，且其中該等經培養細胞株包含3T3、697、10T½、1321N1、A549、AHR77、B-LCL、B16、B65、Ba/F3、BHK、C2C12、C6、CaCo-2、CAP、CaSki、ChaGo-K-1、CHO、COS、DG75、DLD-1、EL4、H1299、HaCaT、HAP1、HCT116、HEK、HeLa、HepG2、HL60、HOS、HT1080、HT29、Huh-7、HUVEC、INS-1/GRINCH、Jurkat、K46、K562、KG1、KHYG-1、L5278Y、L6、LNCaP、LS180、MCF7、MDA-MB-231、ME-180、MG-63、Min-6、MOLT4、Nalm6、ND7/23、Neuro2a、NK92、NS/0、P3U1、Panc-1、PC-3、PC12、PER.C6、PM1、Ramos、RAW 264.7、RBL、Renca、RLE、SH-SY5Y、SK-BR-3、SK-MES -1、SK-N-SH、SK-OV-3、SP2/0、SW403、THP-1、U2OS、U937、Vero、YB2/0或其衍生物。態樣95為如態樣1至94之方法，其中該等細胞包含脂肪細胞、軟骨細胞、內皮細胞、上皮細胞、纖維母細胞、肝細胞、角質細胞、肌細胞、神經元、骨細胞、周邊血液單核細胞(PBMC)、脾細胞、幹細胞或胸腺細胞。態樣96為如態樣1至95之方法，其中該等細胞包含PBMC，且其中該等PBMC為周邊血液淋巴球(PBL)。態樣97為如態樣1至95之方法，其中該等細胞包含PBMC，其中該等PBMC包含PBL，且其中該等PBL為自然殺手(NK)細胞、T細胞或B細胞。態樣98為如態樣1至95之方法，其中該等細胞包含PBMC，且其中該等PBMC為單核球。態樣99為如態樣1至95之方法，其中該等細胞包含PBMC，其中該等PBMC為單核球，且其中該等單核球為巨噬細胞或樹突狀細胞。態樣100為如態樣1至95之方法，其中該等細胞包含PBMC，其中該等PBMC為單核球，其中該等單核球為巨噬細胞或樹突狀細胞，且其中該等巨噬細胞為微神經膠質細胞。態樣101為如態樣1至95之方法，其中該等細胞包含幹細胞，且其中該等幹細胞為脂肪幹細胞、胚胎幹細胞、造血幹細胞、誘導性富潛能幹細胞、間葉幹細胞或神經幹細胞。態樣102為如態樣1至101之方法，其中該藥劑之負載效率為至少50%、60%、70%、80%或90%。態樣103為如態樣1至102之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少50%。態樣104為如態樣1至103之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少60%。態樣105為如態樣1至104之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少70%。態樣106為如態樣1至105之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少80%。態樣107為如態樣1至106之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少90%。態樣108為如態樣1至107之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至96小時為大致50%至90%存活的。態樣109為如態樣1至108之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至72小時為大致50%至90%存活的。態樣110為如態樣1至109之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至48小時為大致50%至90%存活的。態樣111為如態樣1至110之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後24小時為大致50%至90%存活的。態樣112為如態樣1至111之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至96小時為大致60%至90%存活的。態樣113為如態樣1至112之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至72小時為大致60%至90%存活的。態樣114為如態樣1至113之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至48小時為大致60%至90%存活的。態樣115為如態樣1至114之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後24小時為大致60%至90%存活的。
態樣116為一種使用如態樣1至115之方法產生之電穿孔細胞、細胞顆粒或脂質囊泡。
態樣117為一種電穿孔系統，其具有包含指令之非暫時性電腦可讀取媒體，該等指令在由處理器執行時使得該處理器：選擇與具有第一場強度及第一脈衝持續時間之第一電脈衝相關的第一方案；使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受由第一方案所定義足以根據第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第一藥劑的第一電脈衝；選擇與具有第二場強度及第二脈衝持續時間之第二電脈衝相關的第二方案；及使該樣品經受由第二方案所定義足以根據第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有第二藥劑的第二電脈衝；其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。態樣118為如態樣117之電穿孔系統，其中該第一場強度等於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。態樣119為如態樣117之電穿孔系統，其中該第一場強度等於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。態樣120為如態樣117之電穿孔系統，其中該第一場強度小於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間等於該第二脈衝持續時間。態樣121為如態樣117之電穿孔系統，其中該第一場強度大於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間等於該第二脈衝持續時間。態樣122為如態樣117之電穿孔系統，其中該第一場強度小於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。態樣123為如態樣117之電穿孔系統，其中該第一場強度大於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。態樣124為如態樣117之電穿孔系統，其中該第一場強度小於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。態樣125為如態樣117之電穿孔系統，其中該第一場強度大於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。態樣126為如態樣117至態樣125之電穿孔系統，其中該第一場強度及第一脈衝持續時間產生第一總施加電能且該第二場強度及第二脈衝持續時間產生第二總施加電能，且其中該第一總施加電能不同於該第二總施加電能。態樣127為如態樣117至態樣126之電穿孔系統，其中該第一場強度及第一脈衝持續時間產生第一總施加電能且該第二場強度及第二脈衝持續時間產生第二總施加電能，其中該第一總施加電能不同於該第二總施加電能，且其中該第一總施加電能大於該第二總施加電能。態樣128為如態樣117至態樣127之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數。態樣129為如態樣117至態樣128之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，並且其中該等電脈衝之該電壓量值係介於0.001伏與10,000伏、0.01伏與10,000伏、0.1伏與10,000伏、1伏與10,000伏、1伏與9,000伏、1伏與8,000伏、1伏與7,000伏、1伏與6,000伏、1伏與5,000伏、1伏與4,000伏、1伏與3,000伏、1伏與2,000伏之間，或1伏與1,000伏之間。態樣130為如態樣117至態樣129之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，且其中該等電脈衝之該電壓量值係介於100伏與900伏之間。態樣131為如態樣117至態樣130之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，且其中該樣品之導電率為包含電穿孔緩衝液之離子組成、待負載至該等細胞中的藥劑之濃度、細胞密度、溫度及壓力之參數的函數。態樣132為如態樣117至態樣131之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，且其中該樣品之導電率係介於0.01西門子/公尺與10西門子/公尺、0.01西門子/公尺與1西門子/公尺、0.1西門子/公尺與10西門子/公尺、0.1西門子/公尺與1西門子/公尺或1西門子/公尺與10西門子/公尺之間。態樣133為如態樣117至態樣132之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，且其中該樣品之導電率係介於1.0西門子/公尺與3.0西門子/公尺之間。態樣134為如態樣117至態樣133之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，且其中該等第一及第二場強度進一步為電穿孔腔室之幾何的函數。態樣135為如態樣117至態樣134之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，其中該等第一及第二場強度進一步為電穿孔腔室之幾何的函數，且其中該電穿孔腔室包含介於0.001 cm與10 cm、0.001 cm與1 cm、0.01 cm與10 cm、0.01 cm與1 cm、0.1 cm與10 cm、0.1 cm與1 cm或1 cm與10 cm之間的電極間隙。態樣136為如態樣117至態樣135之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數，其中該等第一及第二場強度進一步為電穿孔腔室之幾何的函數，且其中該電穿孔腔室包含介於0.01 cm與1 cm之間的電極間隙。態樣137為如態樣117至態樣136之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度係介於0.01 kV/cm與10 kV/cm、0.01 kV/cm與1 kV/cm、0.1 kV/cm與10 kV/cm、0.1 kV/cm與1 kV/cm或1 kV/cm與10 kV/cm之間。態樣138為如態樣117至態樣137之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度係介於0.3 kV/cm與3 kV/cm之間。態樣139為如態樣117至態樣138之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二脈衝持續時間係介於10 -6秒與10秒、10 -6秒與1秒、10 -3秒與10秒或10 -3秒與1秒之間。態樣140為如態樣117至態樣139之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二脈衝持續時間係介於1微秒與100毫秒之間。態樣141為如態樣117至態樣140之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵。態樣142為如態樣117至態樣141之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，且其中該脈衝數目係介於1個脈衝與1000個脈衝、1個脈衝與900個脈衝、1個脈衝與800個脈衝、1個脈衝與700個脈衝、1個脈衝與600個脈衝、1個脈衝與500個脈衝、1個脈衝與400個脈衝、1個脈衝與300個脈衝、1個脈衝與200個脈衝、1個脈衝與100個脈衝、1個脈衝與90個脈衝、1個脈衝與80個脈衝、1個脈衝與70個脈衝、1個脈衝與60個脈衝、1個脈衝與50個脈衝、1個脈衝與40個脈衝、1個脈衝與30個脈衝、1個脈衝與20個脈衝或1個脈衝與10個脈衝之間。態樣143為如態樣117至態樣142之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，且其中該脈衝數目係介於1個脈衝與130個脈衝之間。態樣144為如態樣117至態樣143之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，且其中該脈衝寬度為指數衰減速率之函數。態樣145為如態樣117至態樣144之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，其中該脈衝寬度為指數衰減速率之函數，其中該指數衰減速率為該樣品之電阻及用於實現電穿孔的電源之電容之函數。態樣146為如態樣117至態樣145之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，其中該脈衝寬度為指數衰減速率之函數，其中該指數衰減速率為該樣品之電阻及用於實現電穿孔的電源之電容之函數，其中該樣品之電阻係介於1歐姆與10000歐姆、1歐姆與9000歐姆、1歐姆與8000歐姆、1歐姆與7000歐姆、1歐姆與6000歐姆、1歐姆與5000歐姆、1歐姆與4000歐姆、1歐姆與3000歐姆、1歐姆與2000歐姆、1歐姆與1000歐姆、1歐姆與900歐姆、1歐姆與800歐姆、1歐姆與700歐姆、1歐姆與600歐姆、1歐姆與500歐姆、1歐姆與400歐姆、1歐姆與300歐姆、1歐姆與200歐姆、1歐姆與100歐姆、1歐姆與90歐姆、1歐姆與80歐姆、1歐姆與70歐姆、1歐姆與60歐姆、1歐姆與50歐姆、1歐姆與40歐姆、1歐姆與30歐姆、1歐姆與20歐姆，或1歐姆與10歐姆之間。態樣147為如態樣117至態樣146之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，其中該脈衝寬度為指數衰減速率之函數，其中該指數衰減速率為該樣品之電阻及用於實現電穿孔的電源之電容之函數，且其中該樣品之電阻係介於1歐姆與1000歐姆之間。態樣148為如態樣117至態樣147之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，其中該脈衝寬度為指數衰減速率之函數，其中該指數衰減速率為該樣品之電阻及用於實現電穿孔的電源之電容之函數，且其中該電源電容係介於1 μF與1,000,000 μF、1 μF與100,000 μF、1 μF與10,000 μF、1 μF與1,000 μF或1 μF與100 μF之間。態樣149為如態樣117至態樣148之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，其中該脈衝寬度為指數衰減速率之函數，其中該指數衰減速率為該樣品之電阻及用於實現電穿孔的電源之電容之函數，且其中該電源電容係介於1000 μF與5000 μF之間。態樣150為如態樣117至態樣149之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，且其中該脈衝形狀為方波脈衝或指數衰減波脈衝。態樣151為如態樣117至態樣150之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵，且其中該脈衝模式包含對應於該第一脈衝或該第二脈衝之該持續時間的單個脈衝。態樣152為如態樣117至態樣150之電穿孔系統，其中該脈衝模式包含多個脈衝，其中該多個脈衝之組合持續時間對應於該第一脈衝或該第二脈衝之該持續時間。態樣153為如態樣117至態樣152之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之極性為正或負。態樣154為如態樣117至態樣153之電穿孔系統，其中該樣品在該樣品經受該第一脈衝之後至少12小時至至少48小時經受該第二電脈衝。態樣155為如態樣117至態樣154之電穿孔系統，其中該樣品在該樣品經受該第一脈衝之後至少24小時經受該第二電脈衝。態樣156為如態樣117至態樣155之電穿孔系統，其中該電穿孔系統包含流動電穿孔設備。態樣157為如態樣117至態樣156之電穿孔系統，其中該電穿孔系統包含流動電穿孔設備且其中在該樣品在該流動電穿孔設備內流動的同時，該樣品經受該等電脈衝。態樣158為如態樣117至態樣157之電穿孔系統，其中該等細胞為哺乳動物細胞。態樣159為如態樣117至態樣158之電穿孔系統，其中該等細胞為人類細胞、鼠類細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞或靈長類動物細胞。態樣160為如態樣117至態樣159之電穿孔系統，其中該等細胞為初細胞。態樣161為如態樣117至態樣160之電穿孔系統，其中該等細胞為經培養細胞。態樣162為如態樣117至態樣161之電穿孔系統，其中該等細胞為經培養細胞，且其中該等經培養細胞為經培養細胞株。態樣163為如態樣117至態樣162之電穿孔系統，其中該等細胞為經培養細胞株，且其中該等經培養細胞株包含3T3、697、10T½、1321N1、A549、AHR77、B-LCL、B16、B65、Ba/F3、BHK、C2C12、C6、CaCo-2、CAP、CaSki、ChaGo-K-1、CHO、COS、DG75、DLD-1、EL4、H1299、HaCaT、HAP1、HCT116、HEK、HeLa、HepG2、HL60、HOS、HT1080、HT29、Huh-7、HUVEC、INS-1/GRINCH、Jurkat、K46、K562、KG1、KHYG-1、L5278Y、L6、LNCaP、LS180、MCF7、MDA-MB-231、ME-180、MG-63、Min-6、MOLT4、Nalm6、ND7/23、Neuro2a、NK92、NS/0、P3U1、Panc-1、PC-3、PC12、PER.C6、PM1、Ramos、RAW 264.7、RBL、Renca、RLE、SH-SY5Y、SK-BR-3、SK-MES -1、SK-N-SH、SK-OV-3、SP2/0、SW403、THP-1、U2OS、U937、Vero、YB2/0或其衍生物。態樣164為如態樣117至態樣163之電穿孔系統，其中該等細胞包含脂肪細胞、軟骨細胞、內皮細胞、上皮細胞、纖維母細胞、肝細胞、角質細胞、肌細胞、神經元、骨細胞、周邊血液單核細胞(PBMC)、脾細胞、幹細胞或胸腺細胞。態樣165為如態樣117至態樣164之電穿孔系統，其中該等細胞包含PBMC，且其中該等PBMC為周邊血液淋巴球(PBL)。態樣166為如態樣117至態樣164之電穿孔系統，其中該等細胞包含PBMC，其中該等PBMC包含PBL，且其中該等PBL為自然殺手(NK)細胞、T細胞或B細胞。態樣167為如態樣117至態樣164之電穿孔系統，其中該等細胞包含PBMC，且其中該等PBMC為單核球。態樣168為如態樣117至態樣164之電穿孔系統，其中該等細胞包含PBMC，其中該等PBMC為單核球，且其中該等單核球為巨噬細胞或樹突狀細胞。態樣169為如態樣117至態樣164之電穿孔系統，其中該等細胞包含PBMC，其中該等PBMC為單核球，其中該等單核球為巨噬細胞或樹突狀細胞，且其中該等巨噬細胞為微神經膠質細胞。態樣170為如態樣117至態樣164之電穿孔系統，其中該等細胞包含幹細胞，其中該等幹細胞為脂肪幹細胞、胚胎幹細胞、造血幹細胞、誘導性富潛能幹細胞、間葉幹細胞或神經幹細胞。態樣171為如態樣117至態樣170之電穿孔系統，其中該等第一及第二藥劑為相同藥劑。態樣172為如態樣117至態樣170之電穿孔系統，其中該等第一及第二藥劑為不同藥劑。態樣173為如態樣117至172之方法，其中該等第一及第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣174為如態樣117至173之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣175為如態樣117至174之方法，其中第一藥劑為核酸，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣176為如態樣117至174之方法，其中第一藥劑為多肽，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣177為如態樣117至174之方法，其中第一藥劑為蛋白質，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣178為如態樣117至174之方法，其中第一藥劑為小分子，且其中第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。態樣179為如態樣117至178之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為核酸。態樣180為如態樣117至178之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為多肽。態樣181為如態樣117至178之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為蛋白質。態樣182為如態樣117至178之方法，其中第一藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子，且其中第二藥劑為小分子。態樣183為如態樣117至182之方法，其中核酸為RNA，且其中RNA為mRNA、miRNA、shRNA、siRNA或反義寡核苷酸。態樣184為如態樣117至183之方法，其中該核酸為DNA，且其中該DNA為反義寡核苷酸、載體或雙義線性DNA。態樣185為如態樣117至184之方法，其中蛋白質為核糖核蛋白。態樣186為如態樣117至185之方法，其中核糖核蛋白包含Cas9蛋白及引導RNA。態樣187為如態樣117至186之方法，其中該藥劑之負載效率為至少50%、60%、70%、80%或90%。態樣188為如態樣117至187之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少50%。態樣189為如態樣117至188之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少60%。態樣190為如態樣117至189之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少70%。態樣191為如態樣117至190之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少80%。態樣192為如態樣117至191之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少90%。態樣193為如態樣117至192之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至96小時為大致50%至90%存活的。態樣194為如態樣117至193之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至72小時為大致50%至90%存活的。態樣195為如態樣117至194之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至48小時為大致50%至90%存活的。態樣196為如態樣117至195之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後24小時為大致50%至90%存活的。態樣197為如態樣117至196之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至96小時為大致60%至90%存活的。態樣198為如態樣117至197之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至72小時為大致60%至90%存活的。態樣199為如態樣117至198之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至48小時為大致60%至90%存活的。態樣200為如態樣117至199之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後24小時為大致60%至90%存活的。
態樣201為一種使用如態樣117至200之電穿孔系統產生之電穿孔細胞、細胞顆粒或脂質囊泡。
在整個本申請案中，術語「細胞」或「遞送媒劑」係指電穿孔之目標或用於遞送藥劑、藥物或治療劑之媒劑時，意謂包括生物學意義上之人類或動物細胞。
如本文所用，術語「能量」係指在施加至樣品之電脈衝(或組合脈衝)期間產生的熱量，且它與電脈衝(或組合脈衝)期間施加至樣品之場強度與脈衝持續時間(或組合脈衝持續時間)兩者成比例。因此，為了向樣品施加「高能量」脈衝，需要修改包括場強度及脈衝持續時間(或組合脈衝持續時間)在內的變數比例，以便在電脈衝(或組合脈衝)期間產生與對樣品施加「中等能量」或「低能量」電脈衝(或組合脈衝)時相比更多的熱量，限制條件為緩衝液組成、處理總成及樣品體積保持不變。相反，為了向樣品施加「低能量」脈衝，需要修改包括場強度及脈衝持續時間(或組合脈衝持續時間)在內的變數比例，以便在電脈衝(或組合脈衝)期間產生與對樣品施加「高能量」或「中等能量」電脈衝(或組合脈衝)時相比更少的熱量，限制條件為緩衝液組成、處理總成及樣品體積保持不變。
在整個本申請案中，術語「約」、「實質上」及「大致」用於表示一個值包括量測或定量方法之固有誤差變異。
當與術語「包含」結合使用時，字組「一(a/an)」之使用可意謂「一個」，但其亦與「一或多個」、「至少一個」及「一個或多於一個」之含義相符。
片語「及/或」意謂「及」或「或」。為了說明，A、B及/或C包括：單獨的A、單獨的B、單獨的C、A與B之組合、A與C之組合、B與C之組合或A、B及C的組合。換言之，「及/或」作為包含性或操作。
組合物及方法在使用時可「包含本說明書通篇中所揭示之任何成分或步驟」、「基本上由本說明書通篇中所揭示之任何成分或步驟組成」或「由本說明書通篇中所揭示之任何成分或步驟組成」。「基本上由」任何所揭示的成分或步驟組成之組合物及方法將申請專利範圍之範疇限制在不實質影響本發明之基本及新穎特徵的指定材料或步驟。如本說明書及申請專利範圍中所用，片語「包含(comprising)」(及包含之任何形式，諸如「包含(comprise)」及「包含(comprises)」)、「具有(having)」(及具有之任何形式，諸如「具有(have)」及「具有(has)」)、「包括(including)」(及包括之任何形式，諸如「包括(includes)」及「包括(include)」)或「含有(containing)」(及含有之任何形式，諸如「含有(contains)」及「含有(contain)」)為包括性或開放的且不排除額外未列出之要素或方法步驟。經考慮，本文在術語「包含」之上下文中描述的態樣亦可在術語「由...組成」或「基本上由...組成」的上下文中實施。
經特別考慮關於本發明之一個態樣所論述的任何限制可應用於本發明之任何其他態樣。此外，本發明之任何組合物可用於本發明之任何方法中，且本發明之任何方法可用於產生或利用本發明之任何組合物。實例中所闡述的態樣亦為可在不同實例中其他處或本申請案中其他處(諸如發明內容、實施方式、申請專利範圍及圖式簡單說明中)所論述之態樣之上下文中實施的態樣。
本發明之其他目標、特徵及優勢將自以下實施方式而變得顯而易見。然而，應理解，實施方式及特定實例儘管指示本發明之特定態樣，但僅以說明方式給出，因為在本發明之精神及範疇內的各種變化及修改將由此實施方式而變得對熟習此項技術者顯而易見。
相關申請之交叉引用
本申請案主張2021年4月29日申請之美國臨時申請案第63/181,583號之優先權，其以全文引用之方式併人本文中。
本發明之某些態樣係有關用於對細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織進行連續電穿孔之方法及設備，其提供多輪時間上分開之電穿孔的遞送以增加一或多種所關注之藥劑進入細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體、組織或其衍生物之效率，且將電弧或熱衝擊造成之損壞降至最低。 I. 電穿孔
如本文所用，電穿孔或電負載係指施加電流或電場以促進所關注之藥劑進入細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體、組織或其衍生物中。熟習此項技術者應瞭解，本發明考慮任何電穿孔方法及技術。
電穿孔過程一般涉及藉由施加電場脈衝通過含有細胞、囊泡或脂質體之液體細胞懸浮液而在細胞膜中或在囊泡或脂質體中形成孔。在電穿孔過程期間，細胞通常懸浮於液體介質中且隨後經受電場脈衝。介質可為電解質、非電解質，或電解質與非電解質之混合物。施加至懸浮液之電場的強度及脈衝之長度(電場施加至細胞懸浮液之時間)根據細胞類型而變化。為了在細胞的外膜上產生一個孔，電場必須施加一定時長及一定電壓以增加細胞膜之滲透性，從而允許所關注之藥劑進入細胞。
可以調整電穿孔參數以最佳化施加之電場的強度及/或暴露之持續時間，使得藉由電脈衝在膜中形成的孔在短時間後再密封，在此期間細胞外化合物有機會進入細胞。然而，活細胞過度暴露於電場會導致細胞凋亡及/或壞死，從而導致細胞死亡。此部分係因為在電穿孔過程期間，流過導電介質之電流引起介質加熱且隨後增加介質之導電率。若控制不當，則此導電率之增加導致自電源汲取更多的電流，此會導致飛弧(arcing)及樣品損失。此效應典型地在相對較高場強度(＞2 kV/cm)觀察到。然而，例如難以轉染之細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織之電穿孔需要相對強的電場。
作為一個實例，針對電穿孔開發之緩衝液典型地具有相對高的導電率，且使用極短電脈衝。然而，為了有效地使難以轉染之細胞或脂質體負載所關注之藥劑，可能需要相對較長的時間間隔向高導電介質施加高電壓。此三個條件不容易同時符合，且如此做可能會對細胞或脂質體造成不可逆之損壞。在進行本文所述之實驗之前，本發明人假設多輪電穿孔可以提供難以轉染的細胞或脂質體有效地負載所關注之藥劑。然而，目前通常避免連續電穿孔，因為如同相對較長的時間間隔向高導電介質施加高電壓一樣，已知多輪電穿孔會不可逆地損壞細胞或脂質體且導致細胞死亡。例如，O'Dea等人(Vector-free intracellular delivery by reversible permeabilization. PLoS ONE.2017; 12(3): e0174779)明確指出，所描述之無載體可逆細胞滲透方法使得向細胞多次給予遺傳物質成為可能，此與諸如電穿孔之技術相反，因為多輪電穿孔導致細胞死亡，因此多次給藥係不可能的。事實上，Plews等人(Activation of Pluripotency Genes in Human Fibroblast Cells by a Novel mRNA Based Approach. PLoS ONE. 2010; 5(12): e14397)實際上證明嘗試多輪電穿孔會導致大量細胞死亡。類似地，Rols及Teissie (Electropermeabilization of Mammalia Cells to Macromolecules: Control by Pulse Duration. Biophys. J.1998; 75(3): 1415-1423)在圖2A及2C中顯示在脈衝持續時間或依序施加之脈衝數增加的情況下細胞生存力顯著下降。
此問題之解決方案涉及所揭示之用於電穿孔之方法和設備，其提供連續輪次的電穿孔，同時使電弧或熱衝擊對細胞、細胞顆粒、脂質囊泡或組織之損壞降至最低；提高所關注之藥劑的負載效率；且維持細胞、細胞顆粒、脂質囊泡或組織之生存力以及細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織產生臨床效果之能力。發明人已經開發了電穿孔方法，包含使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡的樣品經受兩次或更多次具有不同電場強度及/或不同脈衝持續時間之電脈衝，並且或者或另外，允許樣品在兩次或更多次電脈衝之間至少恢復24小時。發明人驚奇地發現，與先前描述之方法相比，此等電穿孔方法可以更有效地使難以轉染的樣品負載所關注之藥劑，而不會降低樣品完整性，或者對於細胞樣品而言，細胞生存力不會降低。
一些態樣包括囊封所關注之藥劑之方法；瞬時滲透膜以允許所關注之藥劑通過膜輸送的方法；電穿孔細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織之方法；產生電穿孔細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織之方法；及增加電穿孔效率的同時維持電穿孔材料之臨床效果之方法。一些態樣亦包括使用本文所揭示之電穿孔方法或設備中之任一者產生的電穿孔細胞、細胞顆粒或脂質囊泡。
本發明之一些方法包括使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有藥劑之第一場強度及第一脈衝持續時間，及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間。在一些此類方法中，該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。或者或另外，一些方法包括使該樣品在樣品經受第一電脈衝之後恢復至少24小時。
在一些態樣中，該藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。在一些態樣中，該核酸為RNA，且該RNA為mRNA、miRNA、shRNA、siRNA或反義寡核苷酸。在一些態樣中，該核酸為DNA，且該DNA為反義寡核苷酸、載體或雙義線性DNA。在一些態樣中，蛋白質為核糖核蛋白。在一些態樣中，核糖核蛋白包含Cas9蛋白及引導RNA。
在一些態樣中，本文揭示之方法係藉由電穿孔系統進行，該電穿孔系統具有包含指令之非暫時性電腦可讀取媒體，該等指令在由處理器執行時使得該處理器執行該等第一及第二方案以對該樣品電穿孔。在一些態樣中，該電穿孔系統包含流動電穿孔設備且其中在該樣品在該流動電穿孔設備內流動的同時，使該樣品經受該等電脈衝。
在一些態樣中，可以調整第一及第二電脈衝之時序及/或施加之電場及/或由兩次或更多次電脈衝提供之暴露持續時間，從而將電弧或熱衝擊對細胞、細胞顆粒、脂質囊泡或組織的損壞降至最低；增加所關注之藥劑的負載效率；且維持細胞、細胞顆粒、脂質囊泡或組織之生存力及細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織產生臨床效果之能力。
在一些態樣中，允許樣品在電脈衝(例如第一及/或第二電脈衝)之後靜止。在一些態樣中，樣品在電脈衝之後在25-50℃及3-8% CO 2下靜止10-30分鐘。因此，在一些態樣中，樣品在電脈衝之後靜止至多、至少或10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30分鐘，或其中可導出之任何範圍或值。在一些態樣中，樣品在電脈衝之後在至少、至多或約25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃或其中可導出之任何範圍或值靜止。在一些態樣中，樣品在電脈衝之後在至少、至多或約3、4、5、6、7或8% CO 2或其中可導出之任何範圍或值靜止。在具體態樣中，樣品在電脈衝之後在37℃及5% CO 2靜止20分鐘。在一些態樣中，樣品在電脈衝(例如第一及/或第二電脈衝)之後未靜止。
在一些態樣中，包含一或多個完整細胞之樣品允許藉由在樣品經受第一次脈衝之後，將細胞培養至少、至多或6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114或120小時，或其中可導出之任何範圍或值來恢復。在一些態樣中，包含一或多個完整細胞之樣品允許藉由在樣品經受第一次脈衝之後，將細胞培養至多或至少6小時至120小時、6小時至96小時、6小時至72小時、6小時至48小時、6小時至24小時、6小時至12小時，或其中可導出之任何範圍或值來恢復。因此，在一些態樣中，在樣品經受第一脈衝之後，樣品經受第二電脈衝至少、至多或6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114或120小時，或其中可導出之任何範圍或值。在一些態樣中，在樣品經受第一脈衝之後，樣品經受第二電脈衝至多或至少6小時至120小時、6小時至96小時、6小時至72小時、6小時至48小時、6小時至24小時、6小時至12小時，或其中可導出之任何範圍或值。在一些態樣中，在樣品經受第一脈衝之後，樣品經受第二電脈衝介於6小時與120小時、6小時與96小時、6小時與72小時、6小時與48小時、6小時與24小時、6小時與12小時之間，或其中可導出之任何範圍或值。在一些態樣中，該樣品在該樣品經受該第一脈衝之後至少約12小時至至少約48小時經受該第二電脈衝。在一些態樣中，該樣品在該樣品經受該第一脈衝之後至少約24小時經受該第二電脈衝。在一些態樣中，包含一或多個完整細胞之樣品在該樣品經受第一脈衝之後不藉由培養細胞來恢復。
恢復樣品或允許樣品恢復意謂在諸如本文揭示之彼等的條件下，在本文揭示之任何細胞培養容器及細胞培養基中的任一者中培養樣品之細胞，該等條件適於且足以促進細胞復原或返回到改良或期望之狀態或狀況。例如，在培養物恢復可允許細胞藉由例如修補細胞壁自電穿孔的創傷中恢復，且在細胞電穿孔時開始表現或代謝負載至細胞中之藥劑。
關於場強度及脈衝持續時間，在一些態樣中，第一電脈衝之場強等於第二電脈衝之場強度，且第一電脈衝之脈衝持續時間長於第二電脈衝之脈衝持續時間。在一些態樣中，第一電脈衝之場強等於第二電脈衝之場強度，且第一電脈衝之脈衝持續時間短於第二電脈衝之脈衝持續時間。在一些態樣中，第一電脈衝之場強等於第二電脈衝之場強度，且第一電脈衝之脈衝持續時間等於第二電脈衝之脈衝持續時間。在一些態樣中，第一電脈衝之場強大於第二電脈衝之場強度，且第一電脈衝之脈衝持續時間等於第二電脈衝之脈衝持續時間。在一些態樣中，第一電脈衝之場強大於第二電脈衝之場強度，且第一電脈衝之脈衝持續時間長於第二電脈衝之脈衝持續時間。在一些態樣中，第一電脈衝之場強大於第二電脈衝之場強度，且第一電脈衝之脈衝持續時間短於第二電脈衝之脈衝持續時間。在一些態樣中，第一電脈衝之場強小於第二電脈衝之場強度，且第一電脈衝之脈衝持續時間等於第二電脈衝之脈衝持續時間。在一些態樣中，第一電脈衝之場強小於第二電脈衝之場強度，且第一電脈衝之脈衝持續時間長於第二電脈衝之脈衝持續時間。在一些態樣中，第一電脈衝之場強小於第二電脈衝之場強度，且第一電脈衝之脈衝持續時間短於第二電脈衝之脈衝持續時間。
在一些態樣中，第一電脈衝之場強度及第一電脈衝之脈衝持續時間產生第一總施加電能且第二電脈衝之場強度及第二電脈衝之脈衝持續時間產生第二總施加電能。在一些態樣中，該第一總施加電能不同於該第二總施加電能。在一些態樣中，該第一總施加電能大於該第二總施加電能。在一些態樣中，該第一總施加電能小於該第二總施加電能。
為了實現等於、小於或大於第二場強度及/或第二脈衝持續時間的第一場強度及/或第一脈衝持續時間，可以使用以下本文所描述之程序及方法最佳化一或多個電穿孔變數或參數。本發明之態樣可用於靜態及流動電穿孔系統之上下文中。 1. 電場強度
場強度係量測為橫跨電極間隙遞送之電壓，且可以表示為kV/cm。場強度對於超過細胞膜之電位以允許在細胞膜中發生臨時可逆滲透或孔形成為關鍵的，並且本發明之方法能夠使細胞經受一系列的電場強度。在一些態樣中，第一及第二電脈衝之第一及第二場強可為、至少為或至多為0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10 kV/cm，或其中可導出之任何範圍或值。在一些態樣中，第一及第二電脈衝之第一及第二場強可至多為或至少為約0.01 kV/cm至10 kV/cm、0.01 kV/cm至1 kV/cm、0.1 kV/cm至10 kV/cm、0.1 kV/cm至1 kV/cm、1 kV/cm至10 kV/cm，或0.01 kV/cm至10 kV/cm的任何值或其中可導出之範圍。在一些態樣中，第一及第二電脈衝之第一及第二場強係介於0.01 kV/cm與10 kV/cm、0.01 kV/cm與1 kV/cm、0.1 kV/cm與10 kV/cm、0.1 kV/cm與1 kV/cm、1 kV/cm與10 kV/cm之間，或為0.01 kV/cm至10 kV/cm的任何值或其中可導出之範圍。在一些態樣中，第一及第二電脈衝之第一及第二場強係介於0.3 kV/cm與3 kV/cm之間，為0.3 kV/cm至3 kV/cm之任何值，或其中可導出之任何範圍或值。
場強度為若干因素之函數，包括所施加之電脈衝的電壓量值、電脈衝之持續時間及被電穿孔之樣品的導電率。因此，在一些態樣中，該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數。
在一些態樣中，該等電脈衝之電壓量值可為、可為約、為至少或為至多0.001、0.010、0.020、0.030、0.040、0.050、0.060、0.070、0.080、0.090、0.100、0.110、0.120、0.130、0.140、0.150、0.160、0.170、0.180、0.190、0.200、0.210、0.220、0.230、0.240、0.250、0.260、0.270、0.280、0.290、0.300、0.310、0.320、0.330、0.340、0.350、0.360、0.370、0.380、0.390、0.400、0.410、0.420、0.430、0.440、0.450、0.460、0.470、0.480、0.490、0.500、0.510、0.520、0.530、0.540、0.550、0.560、0.570、0.580、0.590、0.600、0.610、0.620、0.630、0.640、0.650、0.660、0.670、0.680、0.690、0.700、0.710、0.720、0.730、0.740、0.750、0.760、0.770、0.780、0.790、0.800、0.810、0.820、0.830、0.840、0.850、0.860、0.870、0.880、0.890、0.900、0.910、0.920、0.930、0.940、0.950、0.960、0.970、0.980、0.990、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900或10000伏，或其中可導出之任何範圍或值。在一些態樣中，電脈衝之電壓量值為至多或至少約0.001伏至10,000伏、0.01伏至10,000伏、0.1伏至10,000伏、1伏至10,000伏、1伏至9,000伏、1伏至8,000伏、1伏至7,000伏、1伏至6,000伏、1伏至5,000伏、1伏至4,000伏、1伏至3,000伏、1伏至2,000伏、1伏至1,000伏，或0.001伏至10,000伏之任何值或其中可導出之範圍。在一些態樣中，該等電脈衝之該電壓量值係介於0.001伏與10,000伏、0.01伏與10,000伏、0.1伏與10,000伏、1伏與10,000伏、1伏與9,000伏、1伏與8,000伏、1伏與7,000伏、1伏與6,000伏、1伏與5,000伏、1伏與4,000伏、1伏與3,000伏、1伏與2,000伏之間，或1伏與1,000伏之間，或為0.001伏至10,000伏之任何值或其中可導出之範圍。在一些態樣中，電脈衝之電壓量值係介於100伏與900伏之間，為100伏至900伏之任何值，或其中可導出之任何範圍或值。
在一些態樣中，該樣品之導電率為包含電穿孔緩衝液之離子組成、待負載至該等細胞中的藥劑之濃度、細胞密度、溫度及壓力之參數的函數。在一些態樣中，樣品之導電率可為、為至少或為至多0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10西門子/公尺(Siemens/meter)，或其中可衍生之任何範圍或值。在一些態樣中，樣品之導電率為至多或至少約0.01西門子/公尺至10西門子/公尺、0.01西門子/公尺至1西門子/公尺、0.1西門子/公尺至10西門子/公尺、0.1西門子/公尺至1西門子/公尺、1西門子/公尺至10西門子/公尺，或為0.01西門子/公尺至10西門子/公尺之任何值或其中可導出之範圍。在一些態樣中，該樣品之導電率係介於0.01西門子/公尺與10西門子/公尺、0.01西門子/公尺與1西門子/公尺、0.1西門子/公尺與10西門子/公尺、0.1西門子/公尺與1西門子/公尺或1西門子/公尺與10西門子/公尺之間，或為0.01西門子/公尺至10西門子/公尺之任何值或其中可導出之範圍。在一些態樣中，樣品之電導率係介於1.0與3.0西門子/公尺之間，為1.0西門子/公尺至3.0西門子/公尺之任何值或可其中可導出之任何範圍或值。
用於電穿孔之緩衝液之離子組成可視細胞類型而變化。舉例而言，可使用高導電性緩衝液，諸如PBS(磷酸鹽緩衝鹽水＜30歐姆)及HBSS(Hepes緩衝液＜30歐姆)或可能含有血清之標準培養基。其他緩衝液包括低滲緩衝液，其中細胞在電脈衝前不久吸收水分，此會導致細胞膨脹且降低最佳滲透電壓，同時確保膜更容易滲透。需要使用高電阻緩衝液(＞3000歐姆)之細胞可能需要準備且洗滌細胞以去除過量鹽離子，從而減少飛弧及樣品損失的機會。電穿孔緩衝液之離子強度直接影響樣品之電阻，進而影響脈衝長度或脈衝之時間常數。與電極接觸的液體體積亦對離子溶液之樣品電阻具有顯著影響，且樣品之電阻與溶液體積及pH成反比。隨著體積的增加，電阻降低，此增加了飛弧及樣品損失的概率，而降低體積則增加了電阻且降低了弧電位。
藥劑之尺寸及濃度將對用於轉染細胞之電氣參數具有影響。較小分子(例如，siRNA或miRNA)可能需要較高電壓及微秒脈衝長度，而較大分子(例如，DNA及蛋白質)可能需要較低電壓及較長的脈衝長度。電穿孔程序期間寡核苷酸之濃度可以為約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、75、100、150、200、250、300至約350、400、500、1000、1500、2000、3000、4000或5000 μg/mL，或為0.01 μg/mL至5000 μg/mL之任何值或其中可導出的範圍。在某些態樣中，寡核苷酸之濃度為至少1 μg/mL。在其他態樣中，寡核苷酸之濃度為至少、至多或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、125、150、175、200、225、250、275或300 μg/mL，或為1 μg/mL至300 μg/mL之任何值或其中可導出之範圍。電穿孔程序期間多肽之濃度可為約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、75、100、150、200、250、300至約350、400、500、1000、1500、2000、3000、4000或5000 μg/mL，或為0.01 μg/mL至5000 μg/mL之任何值或其中可導出的範圍。在某些態樣中，多肽之濃度為至少1 μg/mL。在其他態樣中，多肽之濃度為至少、至多或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275或300 μg/mL，或為1 μg/mL至300 μg/mL之任何值或其中可導出的範圍。
細胞密度可與細胞尺寸相關。一般而言，較小的細胞尺寸需要較高電壓，而較大的細胞尺寸需要較低電壓來成功地滲透細胞膜。
在電穿孔期間維持細胞之溫度會影響電穿孔的效率。在高壓脈衝或暴露於多個脈衝及長脈衝持續時間之樣品會導致樣品加熱，此可能導致細胞死亡增加及轉染效率降低。將樣品保持在較低溫度可以減少過熱對細胞生存力及效率的影響。一般而言，在室溫下用於細胞之標準脈衝電壓在4℃下電穿孔應大致加倍，以有效地滲透細胞膜。
在一些態樣中，可以調整電穿孔腔室之幾何形狀以調整電場強度。使用電壓除以間隙尺寸計算場強度。電穿孔腔室之幾何形狀可為電極之間的距離或「間隙尺寸」之函數。因此，在一些態樣中，可以控制電穿孔腔室內電極之間隙尺寸以調整電場強度。藉由增加間隙尺寸，可以在不改變電壓的情況下增加場強度。若已知所需場強度及間隙尺寸，為了得出完成電穿孔所需的電壓，將場強度(kV)乘以間隙尺寸(cm)。電穿孔腔室之電極可包含兩個或更多個「板」電極。電極板可包含任何有用的生物相容性及導電材料，包括鋁、鈦及金。如藉由本發明所確定，電極板可以用電脈衝定址。電極可包含1至100個陰極及1至100個陽極的陣列，陰極及陽極之數量為偶數，從而形成正電極及負電極對。板之寬度尺寸通常大於相對電極之間的距離或間隙，或大於間隙距離之兩倍。
陰極及陽極電極可以在電穿孔腔室之相對內側上間隔開，使得電穿孔腔室之電極間隙尺寸為至少、至多或約0.001、0.010、0.020、0.030、0.040、0.050、0.060、0.070、0.080、0.090、0.100、0.110、0.120、0.130、0.140、0.150、0.160、0.170、0.180、0.190、0.200、0.210、0.220、0.230、0.240、0.250、0.260、0.270、0.280、0.290、0.300、0.310、0.320、0.330、0.340、0.350、0.360、0.370、0.380、0.390、0.400、0.410、0.420、0.430、0.440、0.450、0.460、0.470、0.480、0.490、0.500、0.510、0.520、0.530、0.540、0.550、0.560、0.570、0.580、0.590、0.600、0.610、0.620、0.630、0.640、0.650、0.660、0.670、0.680、0.690、0.700、0.710、0.720、0.730、0.740、0.750、0.760、0.770、0.780、0.790、0.800、0.810、0.820、0.830、0.840、0.850、0.860、0.870、0.880、0.890、0.900、0.910、0.920、0.930、0.940、0.950、0.960、0.970、0.980、0.990、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10 cm，或其中可導出之任何範圍或值。陰極及陽極電極可以在電穿孔腔室之相對內側上間隔開，使得電穿孔腔室之電極間隙尺寸為至多或至少約0.001 cm至10 cm、0.001 cm至1 cm、0.01 cm至10 cm、0.01 cm至1 cm、0.1 cm至10 cm、0.1 cm至1 cm、1 cm至10 cm，或0.001 cm至10 cm之任何值或其中可導出的範圍。圖5展示在一些態樣中藉由相對的鋁電極匯流排120形成之電穿孔腔室108，該等匯流排位於電穿孔腔室108周圍且圍繞腔室108內之墊圈130；電極間隙包含墊圈130厚度，墊圈厚度對應於在相對電極匯流排120之間延伸的墊圈130之一側。在電穿孔腔室108由電極匯流排120及與相對電極匯流排120相對定位之鍍金塑膠薄膜128形成使得該鍍金塑膠薄膜128插入該等相對電極匯流排120之間之態樣中，包含電極間隙之墊圈厚度對應於在電極匯流排120與與相對電極匯流排120相對定位之鍍金塑膠薄膜128之間延伸的墊圈130之一側。在一些態樣中，電穿孔腔室之電極間隙可為至少或至多0.001、0.010、0.020、0.030、0.040、0.050、0.060、0.070、0.080、0.090、0.100、0.110、0.120、0.130、0.140、0.150、0.160、0.170、0.180、0.190、0.200、0.210、0.220、0.230、0.240、0.250、0.260、0.270、0.280、0.290、0.300、0.310、0.320、0.330、0.340、0.350、0.360、0.370、0.380、0.390、0.400、0.410、0.420、0.430、0.440、0.450、0.460、0.470、0.480、0.490、0.500、0.510、0.520、0.530、0.540、0.550、0.560、0.570、0.580、0.590、0.600、0.610、0.620、0.630、0.640、0.650、0.660、0.670、0.680、0.690、0.700、0.710、0.720、0.730、0.740、0.750、0.760、0.770、0.780、0.790、0.800、0.810、0.820、0.830、0.840、0.850、0.860、0.870、0.880、0.890、0.900、0.910、0.920、0.930、0.940、0.950、0.960、0.970、0.980、0.990、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10 cm，或其中可導出之任何範圍或值。在一些態樣中，該電穿孔腔室之電極間隙介於0.001 cm與10 cm、0.001 cm與1 cm、0.01 cm與10 cm、0.01 cm與1 cm、0.1 cm與10 cm、0.1 cm與1 cm或1 cm與10 cm之間，或為0.001 cm至10 cm之任何值或其中可導出之範圍。在一些態樣中，電穿孔腔室之電極間隙介於0.01 cm與1 cm之間，為0.01 cm至1 cm或其中可導出的任何範圍之任何值。在一些態樣中，電穿孔腔室之電極間隙介於0.4 cm與1 cm之間，為0.4 cm至1 cm或其中可導出的任何範圍之任何值。取決於腔室尺寸，每對該等陽極及陰極可以在負載電阻(以歐姆為單位)下給予能量。 2. 電脈衝特徵
脈衝持續時間或脈衝長度為樣品暴露於電脈衝之持續時間且典型地以微秒至毫秒範圍內的時間來量測。脈衝長度與場強度間接作用以增加孔的形成，且因此增加目標分子的吸收。一般而言，電壓之增加應該伴隨著脈衝長度之逐漸減少。降低電壓，反之亦然。
本文所述之樣品所經受之第一及第二電脈衝的第一及第二脈衝持續時間可為約、可為至少約或可為至多約10 -6、10 -5、10 -4、10 -3、10 -2、10 -1、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，或其中可導出之任何範圍或值。本文所述之樣品所經受之第一及第二電脈衝的第一及第二脈衝持續時間可為至多約或至少約10 -6秒至10秒、10 -6秒至1秒、10 -3秒至10秒、10 -3秒至1秒，或其中可導出的任何範圍或值。在一些態樣中，該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二脈衝持續時間係介於10 -6秒與10秒、10 -6秒與1秒、10 -3秒與10秒或10 -3秒與1秒之間，或為10 -6秒至10秒之任何值或其中可導出的範圍。在一些態樣中，第一及第二電脈衝之第一及第二脈衝持續時間係介於1微秒與100毫秒之間，為1微秒至100毫秒或其中可導出的任何範圍之任何值。在一些方面，第一及第二電脈衝之第一及第二脈衝持續時間係介於6微秒與65毫秒之間，為6微秒至65毫秒或其中可導出的任何範圍之任何值。
除了脈衝持續時間，電脈衝亦可藉由脈衝數目、脈衝寬度、脈衝形狀、脈衝模式及脈衝極性來表徵。因此，在一些態樣中，第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、脈衝寬度、脈衝形狀、脈衝模式或脈衝極性有關的特徵。
如本文所揭示，電穿孔可以單個脈衝或多個脈衝進行，以達成最大轉染效率。在一些態樣中，脈衝數目可為、為至少或為至多1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000個脈衝，或其中可導出之任何範圍。在一些態樣中，脈衝數目可為至多或至少1個脈衝至1000個脈衝、1個脈衝至900個脈衝、1個脈衝至800個脈衝、1個脈衝至700個脈衝、1個脈衝至600個脈衝、1個脈衝至500個脈衝、1個脈衝至400個脈衝、1個脈衝至300個脈衝、1個脈衝至個200個脈衝、1個脈衝至100個脈衝、1個脈衝至90個脈衝、1個脈衝至80個脈衝、1個脈衝至70個脈衝、1個脈衝至60個脈衝、1個脈衝至50個脈衝、1個脈衝至40個脈衝、1個脈衝至30個脈衝、1個脈衝至20個脈衝、1個脈衝至10個脈衝，或為1個脈衝至1000個脈衝之任何值或其中可導出的範圍。在一些態樣中，該脈衝數目係介於1個脈衝與1000個脈衝、1個脈衝與900個脈衝、1個脈衝與800個脈衝、1個脈衝與700個脈衝、1個脈衝與600個脈衝、1個脈衝與500個脈衝、1個脈衝與400個脈衝、1個脈衝與300個脈衝、1個脈衝與200個脈衝、1個脈衝與100個脈衝、1個脈衝與90個脈衝、1個脈衝與80個脈衝、1個脈衝與70個脈衝、1個脈衝與60個脈衝、1個脈衝與50個脈衝、1個脈衝與40個脈衝、1個脈衝與30個脈衝、1個脈衝與20個脈衝或1個脈衝與10個脈衝之間，或為1個脈衝至1000個脈衝之任何值或其中可導出的範圍。在一些態樣中，脈衝數目係介於1個與130個脈衝之間，為1個至130個脈衝之任何值，或其中可導出之任何範圍。
脈衝寬度取決於由電穿孔系統之脈衝產生器產生的波形。脈衝形狀或波形通常分為兩類，方波或指數衰減波。方波脈衝快速上升至設定電壓位準，且在設定脈衝長度之持續時間內保持此位準，然後快速關閉。在一些態樣中，脈衝產生器產生方波脈衝，且可以直接輸入脈衝寬度。指數衰減波係藉由允許電容器完全放電來產生電脈衝。一個脈衝放電至樣品中，且電壓迅速上升至設定的峰值電壓，然後隨著時間的推移而下降。在一些態樣中，脈衝產生器產生指數衰減波脈衝，且脈衝寬度為指數衰減速率之函數。
指數衰減波系統中之脈衝寬度對應於時間常數，且係藉由脈衝能量或電壓衰減到原始設定電壓的1/3之速率來表徵。藉由以指數衰減方式調整電阻及電容值來修改時間常數，時間的計算為T = RC，其中T為時間，R為樣品之電阻，C為電穿孔系統電源之電容。因此，在一些態樣中，該指數衰減速率為該樣品之電阻及用於實現電穿孔之電源之電容的函數。
樣品之電阻可為、可為至少或可為至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900或10000歐姆，或其中可導出之任何範圍或值。樣品之電阻可為至多或至少1歐姆至10000歐姆、1歐姆至9000歐姆、1歐姆至8000歐姆、1歐姆至7000歐姆、1歐姆至6000歐姆、1歐姆至5000歐姆、1歐姆至4000歐姆、1歐姆至3000歐姆、1歐姆至2000歐姆、1歐姆至1000歐姆、1歐姆至900歐姆、1歐姆至800歐姆、1歐姆至700歐姆、1歐姆至600歐姆、1歐姆至500歐姆、1歐姆至400歐姆、1歐姆至300歐姆，1歐姆至200歐姆、1歐姆至100歐姆、1歐姆至90歐姆、1歐姆至80歐姆、1歐姆至70歐姆、1歐姆至60歐姆、1歐姆至50歐姆、1歐姆至40歐姆、1歐姆至30歐姆、1歐姆至20歐姆、1歐姆至10歐姆，或為1歐姆至10000歐姆之任何值或其中可導出的範圍。在一些態樣中，該樣品之電阻係介於1歐姆與10000歐姆、1歐姆與9000歐姆、1歐姆與8000歐姆、1歐姆與7000歐姆、1歐姆與6000歐姆、1歐姆與5000歐姆、1歐姆與4000歐姆、1歐姆與3000歐姆、1歐姆與2000歐姆、1歐姆與1000歐姆、1歐姆與900歐姆、1歐姆與800歐姆、1歐姆與700歐姆、1歐姆與600歐姆、1歐姆與500歐姆、1歐姆與400歐姆、1歐姆與300歐姆、1歐姆與200歐姆、1歐姆與100歐姆、1歐姆與90歐姆、1歐姆與80歐姆、1歐姆與70歐姆、1歐姆與60歐姆、1歐姆與50歐姆、1歐姆與40歐姆、1歐姆與30歐姆、1歐姆與20歐姆，或1歐姆與10歐姆之間，或為1歐姆至10000歐姆之任何值或其中可導出的範圍。在一些態樣中，樣品之電阻係介於1歐姆與1000歐姆之間，為1歐姆至1000歐姆或其中可導出的任何範圍之任何值。
電源電容可為、可為至少或可為至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、46000、47000、48000、49000、50000、51000、52000、53000、54000、55000、56000、57000、58000、59000、60000、61000、62000、63000、64000、65000、66000、67000、68000、69000、70000、71000、72000、73000、74000、75000、76000、77000、78000、79000、80000、81000、82000、83000、84000、85000、86000、87000、88000、89000、90000、91000、92000、93000、94000、95000、96000、97000、98000、99000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、500000、510000、520000、530000、540000、550000、560000、570000、580000、590000、600000、610000、620000、630000、640000、650000、660000、670000、680000、690000、700000、710000、720000、730000、740000、750000、760000、770000、780000、790000、800000、810000、820000、830000、840000、850000、860000、870000、880000、890000、900000、910000、920000、930000、940000、950000、960000、970000、980000、990000或1000000 μF，或其中可導出之任何範圍或值。電源電容可為至多或至少1 μF至1,000,000  μF、1 μF至100,000 μF、1 μF至10,000 μF、1 μF至1,000 μF、1 μF至100 μF，或為1 μF至1,000,000 μF或其中可導出之範圍的任何值。在一些態樣中，電源電容係介於1 μF與1,000,000 μF、1 μF與100,000 μF、1 μF與10,000 μF、1 μF與1,000 μF、1 μF與100 μF之間，或為1 μF至1,000,000 μF或其中可導出的範圍之任何值。在一些態樣中，電源電容係介於1000 μF與5000 μF之間，為1000 μF至5000 μF或其中可導出的任何範圍之任何值。
在一些態樣中，該脈衝模式包含對應於該第一脈衝及/或該第二脈衝之該持續時間的單個脈衝。在一些態樣中，該脈衝模式包含多個脈衝，且該多個脈衝之組合持續時間對應於該第一脈衝及/或該第二脈衝之該持續時間。因此，在一些態樣中，脈衝持續時間為多個脈衝相加效應之結果。
本文所述之樣品可能經受之第一及第二電脈衝的極性可為正或負。在一些態樣中，第一及第二脈衝之極性為正。在一些態樣中，第一及第二脈衝之極性為負。在一些態樣中，第一脈衝之極性為正，且第二脈衝之極性為負。在一些態樣中，第一脈衝之極性為負，且第二脈衝之極性為正。
在某些態樣中，電負載可以如以下中所描述進行：美國專利第5,612,207號(尤其以引用的方式併入本文中)、美國專利第5,720,921號(尤其以引用的方式併入本文中)、第6,074,605號(尤其以引用的方式併入本文中)；美國專利第6,090,617號(尤其以引用的方式併入本文中)；美國專利第6,485,961號(尤其以引用的方式併入本文中)；美國專利第7,029,916號(尤其以引用的方式併入本文中)、美國專利第7,141,425號(尤其以引用的方式併入本文中)、美國專利第7,186,559號(尤其以引用的方式併入本文中)、美國專利第7,771,984號(尤其以引用的方式併入本文中)及/或美國公開案編號2011/0065171(尤其以引用的方式併入本文中)。
可以在本發明之上下文中使用的用於電負載的其他方法及裝置亦描述於例如公開之PCT申請案第WO 03/018751號及第WO 2004/031353號中；美國專利申請案序列號2004/0214333及2004/0115784號；及美國專利第6,773,669號、第6,090,617號、第6,617,154號及第7,029,916號中，以上所有都以引用的方式併入本文中。
在本發明之某些態樣中，電穿孔可如2006年11月28日授予之美國專利第7,141,425號中所描述進行，其全部揭示內容尤其以引用方式併入本文中。 II. 代表性電穿孔設備之描述
如 圖 48所示，本發明之一些態樣亦可包括電穿孔系統300，其包括裝置(例如，控制器，800)及非暫時性電腦可讀取媒體(例如，一或多個儲存裝置，804)，該非暫時性電腦可讀取媒體包含(例如，儲存)指令，該等指令當由處理器808執行時使得處理器808執行本文所描述之任一方法。
控制器800可以物理方式或無線方式耦接至電穿孔系統300的一或多個其他組件，且可以經組態以經由一或多個使用者啟動之或自動之命令或參數來控制電穿孔系統300的操作。控制器800可以包括處理器808(例如，微控制器/微處理器、中央處理單元(CPU)、現場可程式化閘陣列(FPGA)裝置、特殊應用積體電路(ASIC)、另一個硬體裝置、韌體裝置或其任何組合)及非暫時性電腦可讀取媒體(諸如記憶體)804，其經組態以(並且確實)儲存指令、一或多個資料集或其類似物。非暫時性電腦可讀取媒體可包括任何有形或非暫時性儲存媒體或諸如電子、磁性或光學介質之記憶體媒體。如本文所用，術語「有形」及「非暫時性」旨在描述不包括傳播電磁信號之非暫時性電腦可讀取媒體(諸如記憶體)，但不旨在以其他方式限制由片語非瞬時電腦可讀取媒體或記憶體涵蓋之實體電腦可讀儲存裝置的類型。例如，術語「非瞬時電腦可讀取媒體」或「有形記憶體」旨在涵蓋不一定永久儲存資訊之儲存裝置類型，包括例如隨機存取記憶體(RAM)。以非暫時性形式儲存於有形電腦可存取儲存媒體上之程式指令及資料可藉由傳輸媒體或信號(諸如電信號、電磁信號或數位信號)進一步傳輸，該等傳輸媒體或信號可經由通信媒體(諸如網路及/或無線鏈路)傳達。
記憶體之指令可由處理器808執行以進行或啟動如本文所述之一或多個操作或功能。在一些方面，控制器800可以包括一或多個介面、一或多個I/O裝置、電源、一或多個感測器、信號產生器(例如，RF產生器)或其組合。例如，控制器800可以包括允許使用者輸入資訊(例如，所需方案)以控制電穿孔系統300之操作的I/O裝置。
現在參考 圖 49，展示用於使樣品經受兩次或更多次電脈衝之本發明方法的態樣900，其可以使用 圖 48中描繪之電穿孔系統300來實施。在所示之態樣中，在步驟904，電穿孔系統300之非暫時性電腦可讀取媒體804包含指令，該等指令當由處理器808執行時使得處理器808選擇與具有第一場強度及第一脈衝持續時間之第一電脈衝相關的第一方案。在步驟908，在此態樣中，控制器800控制電穿孔系統300以產生由第一方案定義之第一電脈衝的電流，且將其傳送通過包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品，第一電脈衝足以根據第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有藥劑。視情況，在步驟908之後，允許樣品在培養物中恢復至少、至多、或約6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114或120小時，或其中可導出的任何範圍或值。在一些態樣中，在步驟908之後，允許樣品在培養物中恢復至多或至少6小時至120小時、6小時至96小時、6小時至72小時、6小時至48小時、6小時至24小時、6小時至12小時，或其中可導出之任何範圍或值。在步驟912，在此態樣中，電穿孔系統300之非暫時性電腦可讀取媒體804包含指令，該等指令當由處理器808執行時使得處理器808選擇與具有第二場強度及第二脈衝持續時間之第二電脈衝相關的第二方案。在步驟916，在此態樣中，控制器800控制電穿孔系統300以產生由第二方案定義之第二電脈衝的電流，且將其傳送通過包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品。第一場強度及/或第一脈衝持續時間不同於第二場強度及/或第二脈衝持續時間，且包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝足以根據第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有藥劑。
在一些態樣中，電穿孔系統300可藉由控制器800控制以產生電流且將電流傳送通過細胞溶液。在一些態樣中，本發明方法使用靜態電穿孔設備。在一些態樣中，本發明方法使用流式電穿孔設備，該設備可以由控制器800控制以產生用於電刺激細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體、組織或其衍生物之懸浮液的電流，該流動電穿孔設備具有一或多個進口流動端口、一或多個出口流動端口及一或多個流動通道，該流動通道由兩個或更多個壁構成，其中該等流動通道進一步經組態以接收及瞬時容納來自進口流動端口呈懸浮液之連續流動的顆粒；且成對電極相對於流動通道安置，使得每個電極形成該等流動通道之至少一個壁，該等電極進一步包含將電極放置成與電能源電連通，藉此流動通過該等通道之懸浮液可以經受形成於電極之間的電場。
在一些態樣中，使用MaxCyte STX®、MaxCyte VLX®或MaxCyte GT®流動電穿孔儀器進行流動電穿孔。在一些態樣中，使用MaxCyte ExPERT STx®、MaxCyte ExPERT ATx®、MaxCyte ExPERT GTx®或MaxCyte ExPERT VLx TM進行流動電穿孔。在特定態樣中，靜態或流動電穿孔與整個本發明中所述之參數一起使用。
在一些態樣中，使用流動電穿孔可以幫助克服關於靜態或分批電穿孔方法的可電穿孔之細胞數目、細胞可電穿孔之時間以及細胞懸浮其中之溶液體積的實際限制。使用此方法，細胞懸浮液通過平行棒電極，該等電極容納於拋棄式的流槽中。應當理解，在本發明中可以使用不同組態之流槽。在此通過期間，細胞經受具有預定特徵之電脈衝。然後所關注分子按照濃度及/或電梯度擴散至細胞中。此外，可藉由在不到5小時、較佳不到4小時、更佳不到3小時且最佳不到2小時內電穿孔樣品來轉染淋巴球群。電穿孔時間為樣品由流動電穿孔過程處理之時間。在某些態樣中，1E10細胞在30分鐘或更短時間內使用流動電穿孔轉染。在其他態樣中，2E11細胞可使用流動電穿孔在30分鐘或60分鐘或更短時間內轉染。
可以藉由例如將電穿孔腔室與容器中之溶液及細胞懸浮液流體連通(例如，經由管道)置放來啟動流動電穿孔過程，此可以在無菌或滅菌環境中進行。可以使用一或多個泵、真空、閥門、改變電穿孔腔室內之氣壓或體積的其他機械裝置及其組合將細胞懸浮液及/或其他試劑引入電穿孔腔室中，此可以導致細胞懸浮液及/或其他反應劑以所需時間及所需速率流入電穿孔腔室。若細胞懸浮液及/或其他試劑之一部分位於電穿孔腔室中，則將所需電壓、持續時間及/或間隔之電脈衝施加至細胞懸浮液及/或其他試劑。電穿孔後，可以使用一或多個泵，真空，閥門，其他會改變電穿孔腔室內部之位移、壓力或體積的電氣、機械、氣動或微流體裝置及其組合自電穿孔腔室中移出處理過的細胞懸浮液及/或其他試劑。在某些態樣中，重力或手動轉移可用於將樣品或處理過的樣品移入或移出電穿孔腔室。必要時，可以將新的細胞懸浮液及/或其他試劑引入電穿孔腔室中。電穿孔樣品可以與尚未電穿孔之樣品分開收集。前面的一系列事件可以藉由耦接至例如電子電路(例如，提供電脈衝)、泵、真空、閥門、其組合以及實現及控制樣品流入及流出電穿孔腔室的其他組件之電腦在時間上進行協調。作為一實例，電穿孔過程可以由電腦來實施，包括由操作員經由屏幕(例如，監視器)及/或鍵盤上之圖形使用者介面來實施。合適之閥的示例包括夾管閥、蝶形閥及/或球閥。合適之泵的實例包括離心泵或正排量泵。
作為一實例，流動電穿孔裝置可包含至少兩個由間隔物隔開之電極，其中間隔物及至少兩個電極界定腔室。在一些態樣中，電穿孔腔室可進一步包含至少三個橫越間隔物之埠，其中第一埠用於樣品流入腔室，第二埠用於處理過的樣品流出腔室且第三埠用於非-樣品流體流入或流出腔室。在一些態樣中，當樣品流入腔室時，非樣品流體流出腔室，且當處理過的樣品流出腔室時，非樣品流體流入腔室。作為另一實例，流動電穿孔裝置可包含具有頂部及底部之電穿孔腔室，該頂部及底部包含至少兩個平行電極，該腔室形成於兩個電極之間且在電穿孔腔室底部具有兩個腔室埠及在電穿孔腔室頂部具有兩個腔室埠。此類裝置可以進一步包含至少一個經由腔室底部之第一腔室埠與電穿孔腔室流體連通之樣品容器，且電穿孔腔室可以經由腔室頂部之第二腔室埠與樣品容器流體連通，形成第一流體路徑。此外，至少一個產物容器可以經由腔室底部之第三腔室埠與電穿孔腔室流體連通，且電穿孔腔室可以經由腔室頂部之第四腔室埠與產物容器流體連通，形成第二流體路徑。在一些態樣中，可以使用單埠電穿孔腔室。在其他態樣中，可以使用電極、間隔物、埠及容器之各種其他合適的組合。電穿孔腔室可包含約1-10 mL之內部體積；然而，在其他態樣中，電穿孔腔室可包含更小內部容積(例如，0.75 mL、0.5 mL、0.25 mL或更小)或更大內部容積(例如，15 mL、20 mL、25 mL或更大)。在一些態樣中，電穿孔腔室及相關部件可以係一次性的(例如，醫療級VI類材料)，諸如PVC袋、PVC管、連接器、聚矽氧泵管及其類似者。
任何數目之容器(例如1、2、3、4、5、6或更多個)均可與電穿孔腔室流體連通。容器可以為可摺疊、可擴展或固定體積之容器。例如，第一容器(例如，樣品源或樣品容器)可包含細胞懸浮液，且可包括或可不包括在電穿孔期間將進入細胞懸浮液中之細胞的物質。若不包括該物質，則可以包括包含此物質之第二容器，使得該物質可以在進入電穿孔腔室之前或在電穿孔室中在線混合。在額外組態中，可以連接另一容器，該容器可以容納將被丟棄之流體。一或多個額外容器可用作處理過的樣品或產物容器。處理過的樣品或產物容器將容納由電穿孔過程產生之細胞或其他產物。此外，一或多個額外容器可包含可用於將樣品分離成離散體積或單位體積之各種非樣品流體或氣體。非樣品流體或氣體容器可以經由第三及/或第四埠與電穿孔腔室流體連通。非樣品流體或氣體容器可以併入至處理過的樣品容器或樣品容器中(例如，非樣品流體容器可占處理過的樣品容器或樣品容器之一部分)；因此，在樣品處理期間，非樣品流體或氣體可以自處理過的樣品容器轉移至另一容器(其可包括樣品容器)。只要非樣品流體或氣體之壓縮不影響電穿孔，就可以將非樣品流體或氣體容器併入至腔室中。本發明之其他態樣可以包括耦接至樣品容器且可以向腔室供應試劑或其他樣品之其他容器。
在一個態樣中，可以與本發明結合使用之流動電穿孔設備由以下構成：具有電腦之電穿孔系統，該電腦與電子件模組連通以實時運行電穿孔過程且管理與電穿孔過程相關的資料及監視器(例如，它可為行動裝置或設計用於桌子、桌面、車或其類似物之裝置的一部分)，該監視器顯示圖形使用者介面且使得能夠使用者交互作用。操作員將所需電壓及其他參數輸入到流動電穿孔系統中。如上所述，一系列設定為視情況可得到的。電腦與電子件模組連通以將電容器組充電至所需電壓。然後適當的開關在電壓遞送至流動路徑以產生電場之前操縱電壓。該等開關提供交替脈衝或脈衝串，以將因長期暴露於電場而導致之電極磨損降至最低。根據操作員設定至流動電穿孔系統中之持續時間及頻率參數來遞送電壓。流動電穿孔系統之實例的細節描述於美國專利第7,186,559號，其以全文引用的方式併入本文中。
本發明電穿孔體系及方法亦可包括處理總成、托盤、墊圈、對接站、機架及容器以用於遞送至電穿孔系統。
圖1-10示出與本發明之態樣一致的處理總成100。處理總成100可提供用於電穿孔系統及裝置中。處理總成100可包括殼體102及蓋子104，該蓋子覆蓋通向腔室108之開口106。在一些態樣中，腔室108可接收樣品、培養物、液體介質等，該等樣品、培養物、液體介質等可提供給處理總成100可與之相容的電穿孔系統或裝置。
蓋子104可以具有至殼體102之鉸接連接件110，其允許蓋子104在蓋子覆蓋開口106且連接至殼體102之閉合位置(圖1)與蓋子經絞接遠離開口106且允許開口106露出之開啟位置(圖2)之間移動。蓋子104的鉸接連接件110可以提供處理總成100之改良之操作及易用性。在閉合位置，蓋子104可以防止處理總成100受到污染。在一些態樣中，蓋子104可以圍繞鉸接連接件110向上旋轉至多180°且可以連接至殼體102。在一些態樣中，蓋子104可以經由過盈配合連接至殼體102，其中蓋子104夾至殼體102上。例如，過盈配合可以在閉合位置在連接件109處及在開啟位置在連接件111處將蓋子104連接至殼體102。當蓋子104閉合時，過盈配合可以保持橫跨腔室108內之孔的緊密密封。蓋子104可以進一步包括波狀表面112，其可以連接至開口106且覆蓋開口106，且保持未受污染之密封。
處理總成100可以進一步包括鋁電極匯流排120，該等鋁電極匯流排位於腔室108周圍且可以圍繞腔室108內之墊圈(例如墊圈130)。殼體102可以包括彼此連接以形成殼體102之左把手122及右把手124。左把手122及右把手124可以由插銷125隔開，該等插銷可以彼此相對定位且可以連接左把手122及右把手124。在一些態樣中，電極匯流排120可以纏繞在右把手124周圍。在其他態樣中，電極匯流排120可定位於腔室108的一側上，與鍍金塑膠薄膜128相對。
處理總成100可以進一步包括鍍金塑膠薄膜128，該塑膠薄膜可以接收於左把手122與右把手124之間且定位成與電極匯流排120及成框墊圈130相對。鍍金塑膠薄膜128可以具有真空沈積於大卷塑膠薄膜上的金，該等大卷塑膠薄膜可以模切成一定尺寸且安設於處理總成100上。在一些態樣中，可以接合鍍金薄膜128、鋁電極匯流排120及黏接層卷。
處理總成100可包括墊圈130及可接收於腔室108中的塑膠間隔物。墊圈130可採用如下文更詳細描述之若干形狀及尺寸中的至少一種。例如，墊圈130可以經設定尺寸以接收各種尺寸之樣品，尤其包括尺寸為1000 μL、400 μL、100 μL、100 μL×2、50 μL×3及25 μL×3變體之樣品。在一些態樣中，墊圈130可以由聚矽氧橡膠或其他可撓性材料製成。處理總成100可經組態用於與本文所述之墊圈尺寸及佈置中的任一者一起使用，使得處理總成100可用於任何數目的經設定尺寸墊圈130。
處理總成100可以進一步包括裝置標記140，該裝置標記圍繞殼體102遠離電極匯流排120延伸。在一些態樣中，裝置標記140可以包括唯一產品序列號、尺寸、說明、標識等。一些態樣亦可提供在處理總成100之末端上的寫入空間141。
處理總成可提供若干優點，包括增加腔室108及墊圈130內樣品之體積範圍、改良之易用性以及細胞恢復及一致效能之改良。在一些態樣中，鍍金塑膠薄膜128可提供製造成本降低，且可以允許使用多種墊圈之反應體積為25-1000 μL，例如25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975或1000 µL，或其中可導出之任何範圍或值。
圖9及10展示處理總成100可經組態成經由負載裝置144填充，該負載裝置可以經由開口106在蓋子104處於開啟位置時插入腔室108中。負載裝置144可以用樣品填充腔室108以在電穿孔系統中進行測試或處理。在負載裝置144將樣品提供至腔室108之後，可以移出負載裝置144且蓋子104可以閉合以防止樣品被污染。
圖11-13示出了亦可提供一或多個托盤160之本發明之態樣。托盤160可以在槽162中接收一或多個處理總成(例如，處理總成100或其他處理總成)，該等槽橫跨托盤106間隔開。在一些態樣中，托盤160之形狀可以呈矩形，且每個槽160可以平行於其他槽160佈置。在其他態樣中，托盤160可為弧形、圓形或半圓形且可以具有圍繞托盤160以徑向模式佈置的槽160。
托盤160可包括用於接收處理總成之一或多個位置。在一些態樣中，托盤可包括一或多個位置164，使得第一位置及第二位置可以允許使用者區分置放於托盤160中之處理總成的狀態(例如，完整與不完整、測試與未測試，區分樣品類型)。托盤160可以具有支腳166，該等支腳可以允許一或多個托盤160堆疊於彼此的頂部，同時為負載至托盤中的處理總成提供間隙。托盤160可以提供處理總成之可運輸性及組織的改良，且可以允許一次性對處理總成之陣列進行滅菌。
圖14示出了可以在上述處理總成100內實施為墊圈130之複數個墊圈。墊圈130可以經設定尺寸以接收多種尺寸之樣品，包括經設定尺寸為4 x 50 µL、3 x 25 µL、2 x 100 µL、100 µL、400 µL及1 mL等等之樣品。在一些態樣中，經設定400 µL及1 mL尺寸之墊圈可具有傾斜的底面，可提供改良之樣品負載及卸載。
在一些態樣中，墊圈可以提供可撓性，其中單空/多孔選擇設計成使工作流達最佳。墊圈亦可藉由在單個平台上無縫地在小規模與大規模之間切換來提供可擴展性。墊圈亦可提供改良之功能性，其中功能設計可防止樣品污染，同時提供易用性。
圖15示出了與本發明之態樣一致的墊圈陣列之俯視圖及一個墊圈之正視圖，其中每個墊圈具有八個孔。
圖16示出了與本發明之態樣一致的袋子及處理設備的正視圖。處理設備可以具有用於細胞修復的V形設計。此外，處理總成可包括5-10 mL袋子，例如5、6、7、8、9或10 mL，或其中可導出的任何範圍或值之袋子，以橋接間隙。
圖17示出了具有八個孔172之墊圈170，其可針對每個孔172中的50 μL樣品設定尺寸。墊圈170可經組態成接收或插入至多孔處理總成200中。圖18-20示出了多孔處理總成200，其可經組態成允許藉由電穿孔系統處理多個負載孔(例如，孔172)。
多孔處理總成200可以包括帶有蓋子204之殼體202，該蓋子沿著殼體之長度延伸且覆蓋通向腔室208之開口206。在一些態樣中，腔室108可接收樣品、培養物、液體介質等，該等樣品、培養物、液體介質等可提供給處理總成200可與之相容的電穿孔系統或裝置。
蓋子204可以具有至殼體202之鉸接連接件210，其允許蓋子204在蓋子覆蓋開口206且連接至殼體202之閉合位置(圖18)與蓋子經絞接遠離開口206且允許開口206露出之開啟位置(圖19)之間移動。在閉合位置，蓋子204可以防止處理總成200受到污染。在一些態樣中，蓋子204可以經由過盈配合連接至殼體202，其中蓋子204夾至殼體202上。在一些態樣中，蓋子204可自殼體202移除。在一些態樣中，處理總成200可以具有允許殼體202獨立站立之基座205，此可以提供易於使用、負載及負載期間之穩定性。
處理總成200可以進一步包括鋁電極匯流排220，該等鋁電極匯流排位於腔室208周圍且可以圍繞腔室208內之墊圈(例如墊圈170)。殼體202可以包括彼此連接以形成殼體202之左把手222及右把手224(例如圖20)。左把手222及右把手224可以由插銷225隔開，該等插銷可以彼此相對定位且可以連接左把手222及右把手224。在一些態樣中，電極匯流排220可以纏繞在右把手224周圍。在其他態樣中，電極匯流排220可定位於腔室208的一側上，與鍍金塑膠薄膜228相對。
處理總成200可以進一步包括鍍金塑膠薄膜228，該塑膠薄膜可以接收於左把手122與右把手124之間且定位成與電極匯流排120及成框墊圈130相對。鍍金塑膠薄膜128可以具有真空沈積於大卷塑膠薄膜上的金，該等大卷塑膠薄膜可以模切成一定尺寸且安設於處理總成100上。在一些態樣中，可以接合鍍金薄膜128、鋁電極匯流排120及黏接層卷。在一些態樣中，鍍金之塑膠薄膜228可以具有佈置成反映或遵循墊圈170之形狀的形狀的金塗層。
處理總成200可包括墊圈170及可接收於腔室208中的塑膠間隔物。墊圈170可採用若干形狀中之至少一者。例如，墊圈170可能具有八個孔172，其可針對每個孔172中之50 μL樣品設定尺寸。在一些態樣中，墊圈170可以由聚矽氧橡膠或其他可撓性材料製成。處理總成200可經組態用於與本文所述之墊圈尺寸及佈置中的任一者一起使用，使得處理總成200可用於任何數目的經設定尺寸墊圈170。
圖21示出了經組態以接收複數個多孔處理總成200之托盤260。如圖21及22中所示出，多孔處理總成可在沒有蓋子之情況下負載至托盤260中。托盤260可接收十二個處理總成200，且每一處理總成可包括八個孔(例如，孔172)。因此，每一托盤260可包括96個孔。
圖23示出了托盤261，其經組態以接收六個處理總成200，其可用於手動工作流程中；及托盤262，其經組態以接收十二個處理總成或十二個個別墊圈樣品，該托盤可包括蓋板或蓋子閉合件270。
圖24示出了可以接收複數個處理總成200並且可以提供處理總成200之負載、卸載及組織的多孔機架280。
圖25及26示出了具有蓋板或蓋子閉合件270的托盤260以及處理總成200至托盤260中之負載及卸載。
圖27示出了例示性電穿孔系統300，所揭示之態樣可以與該等電穿孔系統相容。
圖28-32示出了可以將處理總成(例如處理總成200)連接至電穿孔系統(例如電穿孔系統300)之銜接台320。銜接台320可以包括蓋子322，該蓋子可以經由鉸鏈連接件連接至銜接台320。蓋子322可經組態成在開啟位置(圖28及29)與閉合位置(圖30)之間移動。銜接台320可以具有埠324，該埠經組態以接收一或多個處理總成200。銜接台320亦可具有可以連接至電穿孔系統(例如，電穿孔系統300)上之插孔的電觸點326。
圖33展示了多孔處理總成200、電穿孔系統300、銜接台320、托盤260、負載裝置144及機架280。
圖34A-圖34C示出了用於流動電穿孔總成之袋子的例示性態樣。如圖34A所示，袋子450可包括V形內部，其排出至可具有複數個連接器453之出口452。如圖34B所示，袋子460可以包括具有成角度之下表面462的較窄內部腔室，下表面462之一可以包括一或多個連接器464，且袋子460亦可包括居中定位之出口466。如圖34C所示，袋子470可以包括寬的上部腔室472及窄的下部腔室474，該下部腔室474可以包括在每個成角度之底表面處之連接器476及居中定位之出口478。袋子450、460、470可以包括魯爾(Luer)配件、魯爾激活埠、管道、管夾及標記(參見圖示)。袋子可以用作樣品袋、收集袋及空氣袋。 III. 電穿孔目標
電穿孔之目標包括源自多種生物體及來源的多種細胞類型或顆粒。在一些態樣中，目標可為有核或無核細胞或顆粒。本發明之細胞或顆粒可為初細胞或細胞株或源自其的顆粒。例如，目標可為原核、酵母、昆蟲、哺乳動物、嚙齒動物、倉鼠、靈長類動物、人類、鳥類、植物細胞或其部分/片段。在某些態樣中，本發明係關於用於將所關注之藥劑引入各種類型的活細胞或細胞顆粒或合成囊泡或脂質體之組合物、方法及設備。更具體地，本發明係關於用於將所關注之藥劑引入細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體、組織或其衍生物中的方法及設備。此等電穿孔目標可用作藥劑遞送系統以靶向感染、轉移或其他病理損傷之部位。 A. 細胞培養
如本文所用，術語「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換使用。所有此等術語亦包括新鮮分離之細胞及活體外培養、活化或擴增之細胞兩者。所有此等術語亦包括其子代，其為任何及所有後續世代。應理解，歸因於有意或無意突變，所有子代可能不相同。在表現異源核酸序列之情形下，「宿主細胞」係指原核或真核細胞，且其包括能夠複製載體及/或表現由載體編碼之異源基因的任何可轉型生物體。宿主細胞可以用作且已用作載體或病毒之接受者。宿主細胞可以「經轉染」或「經轉型」，此係指將諸如重組蛋白編碼序列之外源性核酸轉移或引入宿主細胞的過程。經轉型細胞包括初受試者細胞及其子代。
在某些態樣中，可在任何原核或真核細胞上進行電穿孔。在一些態樣中，電穿孔涉及哺乳動物細胞之電穿孔。在一些態樣中，哺乳動物細胞為人類細胞。在其他態樣中，哺乳動物細胞為動物細胞，例如鼠類細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞或靈長類動物細胞。
在某些態樣中，電穿孔涉及細胞株或雜交細胞類型之電穿孔。在一些態樣中，經電穿孔之一或多種細胞為癌細胞、腫瘤細胞或永生化細胞。在一些情況下，腫瘤、癌症、永生化細胞或細胞株經誘導，而在其他情況下，腫瘤、癌症、永生化細胞或細胞株自然地進入它們各自的狀態或狀況。
在某些態樣中，電穿孔之細胞或細胞株可為697、10T½、1321N1、A549、AHR77、B細胞、B-LCL、B16、B65、Ba/F3、BHK、C2C12、C6、CaCo-2、CAP/、CAP-T、CaSki、ChaGo-K-1、CHO、CHO2、CHO-DG44、CHO-K1、COS、COS-1、Cos-7、CV-1、樹突狀細胞、DG75、DLD-1、EL4、胚胎幹(ES)細胞或衍生物、H1299、HaCaT、HAP1、HCT116、HEK、293、293T、293FT、HeLa、Hep G2、HL60、造血幹細胞、HOS、HT1080、HT29、Huh-7、HUVEC、誘導性富潛能幹(iPS)細胞或衍生物、INS-1/GRINCH、Jurkat、K46、K562、KG1、KHYG-1、L5278Y、L6、LNCaP、LS180、MCF7、MDA-MB-231、MDCK、ME-180、間葉細胞、MG-63、Min-6、單核球性細胞、MOLT4、Nalm6、ND7/23、Neuro2a、NK92、NIH 3T3、NIH3T3L1、NS/0、NK細胞、P3U1、Panc-1、PC12、PC-3、PER.C6、PM1、周邊血細胞、漿細胞、初纖維母細胞、Ramos、RAW 264.7、RBL、Renca、RLE、SF21、SF9、SH-SY5Y、SK-BR-3、SK-MES-1、SK-N-SH、SK-OV-3、SP3/0、SL3、SW403、刺激觸發之多能性獲得(STAP)細胞或衍生物SW403、T細胞、THP-1、腫瘤細胞、U2OS、U205、U937、周邊血液淋巴球、擴增T細胞、造血幹細胞、YB2/0、Vero細胞或其衍生物。
在一些態樣中，細胞為脂肪細胞、軟骨細胞、內皮細胞、上皮細胞、纖維母細胞、肝細胞、角質細胞、肌細胞、神經元、骨細胞、周邊血液淋巴球、周邊血液單核細胞(PBMC)、擴增T細胞、脾細胞、幹細胞、造血幹細胞或胸腺細胞。在一些態樣中，細胞為初細胞。在一些態樣中，細胞為經培養細胞。在一些態樣中，細胞為經培養細胞株。在一些態樣中，PBMC為周邊血液淋巴球(PBL)。在一些態樣中，PBL為自然殺手(NK)細胞、T細胞或B細胞。在一些態樣中，PBMC為單核球。在一些態樣中，單核球為巨噬細胞或樹突狀細胞。在一些態樣中，巨噬細胞為微神經膠質細胞。在一些態樣中，該等幹細胞為脂肪幹細胞、胚胎幹細胞、造血幹細胞、誘導性富潛能幹細胞、間葉幹細胞或神經幹細胞。在一些態樣中排除了以上所揭示之細胞中之一或多者。
在一些態樣中，細胞為自患者分離之初細胞。在一些態樣中，細胞為新鮮分離的。經分離細胞可為同種異體細胞且可獲自標準來源，例如醫院服務。供體可使用歷史及標準血液測試來篩選。在一些態樣中，細胞在小於或恰好20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1天或20至1天之任何值或其中可導出的任何範圍，或小於或恰好24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1小時或24至1小時或其中可導出的任何範圍之任何值的時間段內轉染。在一些態樣中，經分離細胞從不冷凍。在一些態樣中，經分離細胞從未在活體外繼代或培養。在一些態樣中，經分離細胞已繼代或培養小於或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或其中可導出的任何範圍。術語「繼代」意欲指培養及分裂細胞以便自預先存在之細胞中產生大量細胞的過程。繼代涉及分裂細胞且將少量細胞轉移至每個新容器中進行培養。對於黏附培養物，細胞首先需要經剝離，通常用胰蛋白酶-EDTA之混合物進行。然後可以使用少量剝離之細胞來接種新的培養物，而丟棄其餘細胞。此外，藉由將所有細胞分配至新鮮燒瓶，可容易地擴大經培養細胞之量。
在某些態樣中，細胞為此項技術中已知難以轉染之細胞。此類細胞為此項技術中已知且包括例如初細胞、昆蟲細胞、SF9細胞、傑卡特細胞、CHO細胞、幹細胞、緩慢分裂細胞及非分裂細胞。在一些態樣中，細胞為生殖細胞，諸如卵細胞或精子細胞。在一些態樣中，細胞為受精胚胎。在一些態樣中，細胞為人類受精胚胎。
在一些態樣中，細胞在連續電穿孔過程期間及之後維持高生存力。細胞生存力可藉由此項技術中已知之方法量測。舉例而言，細胞可在電穿孔之前及之後藉由細胞計數器設備來計數。在其他態樣中，量測細胞凋亡。咸信引入大量核酸可誘發細胞凋亡。經考慮，本文所描述之方法將導致比此項技術中之其他方法更少的細胞凋亡。在某些態樣中，連續電穿孔後表現出細胞凋亡之細胞的量小於50、45、40、35、30、25、20、15、10或5%。細胞凋亡係指計劃性細胞死亡之特定過程，且可藉由此項技術中已知之方法來量測。例如，細胞凋亡可以藉由磷脂結合蛋白V分析、活化之凋亡蛋白酶3/7偵測分析及Vybrant®細胞凋亡分析(Life Technologies)來量測。
生存力通常超過50%或更高。連續電穿孔細胞之生存力可為起始未電穿孔群體或經對照構築體轉染之電穿孔群體的生存力之至多或至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%(或5%至95%或其中可導出的任何範圍之值)。在一些方面，在根據電穿孔方法投與第二電脈衝之後12至96小時，細胞生存力可為，可為至少，或可為至多50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%，該電穿孔方法方法包含使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；及使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載有藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間。在一些態樣中，在第二電脈衝之後12至96小時，細胞生存力為至少50%。在一些態樣中，在第二電脈衝之後12至96小時，細胞生存力為至少60%。在一些態樣中，在第二電脈衝之後12至96小時，細胞生存力為至少70%。在一些態樣中，在第二電脈衝之後12至96小時，細胞生存力為至少80%。在一些態樣中，在第二電脈衝之後12至96小時，細胞生存力為至少90%。
在一些態樣中，該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至96小時為大致50%至90%存活的。在一些態樣中，該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至72小時為大致50%至90%存活的。在一些態樣中，該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至48小時為大致50%至90%存活的。在一些態樣中，該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後24小時為大致50%至90%存活的。在一些態樣中，該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至96小時為大致60%至90%存活的。在一些態樣中，該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至72小時為大致60%至90%存活的。在一些態樣中，該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12小時至48小時為大致60%至90%存活的。在一些態樣中，該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後24小時為大致60%至90%存活的。
在一些態樣中，細胞可以經受限制稀釋法以使純系細胞群能夠擴增。限制稀釋選殖方法為熟習此項技術者所熟知。已描述此類方法例如用於融合瘤，但可應用於任何細胞。此類方法在Joan C. Rener、Bruce L. Brown及Roland M. Nardone之「Cloning hybridoma cells by limiting dilution」， Journal of Tissue Culture Methods，1985，第9卷，第3期，第175-177頁中進行了描述，其以引用的方式併入本文中。
在一些態樣中，在電穿孔之前或在電穿孔之後培養細胞。在一些態樣中，允許細胞在電穿孔之前或電穿孔之後在培養物中恢復。如本文所用，「允許樣品恢復」、「恢復樣品」或「在培養物中恢復」意謂在諸如本文揭示之彼等的條件下，在任何細胞培養容器及細胞培養基中的任一者中培養細胞，包括但不限於樣品之細胞，該等條件適於及足以促進細胞復原或返回到改良或期望之狀態或狀況。例如，在培養物中恢復可允許細胞藉由例如修補細胞壁自電穿孔的創傷中恢復，且在細胞電穿孔時開始表現或代謝負載至細胞中之藥劑。
在其他態樣中，在電穿孔後的選擇階段期間培養細胞。在其他態樣中，在維持及純系選擇以及初始擴增階段培養細胞。在又其他態樣中，在篩選階段培養細胞。在其他態樣中，在大規模生產階段培養細胞。培養懸浮細胞及黏附細胞的方法為熟習此項技術者熟知的。
在某些態樣中，電穿孔期間之細胞密度為受控變數。電穿孔期間細胞之細胞密度可根據(但不限於)細胞類型、所需電穿孔效率或所得電穿孔細胞之所需生存力變化或改變。在某些態樣中，細胞密度在整個電穿孔中為恆定的。在其他態樣中，細胞密度在電穿孔過程期間變化。在某些態樣中，電穿孔之前的細胞密度可在1×10 4個細胞/毫升至(y)×10 4之範圍內，其中y可為2、3、4、5、6、7、8、9或10 (或2至10或其中可導出之範圍的任何值)。在其他態樣中，電穿孔之前的細胞密度可在1×10 5個細胞/毫升至(y)×10 5之範圍內，其中y為2、3、4、5、6、7、8、9或10 (或2至10或其中可導出之範圍的任何值)。在其他態樣中，電穿孔之前的細胞密度可在1×10 6個細胞/毫升至(y)×10 6之範圍內，其中y可為2、3、4、5、6、7、8、9或10 (或2至10或其中可導出之範圍的任何值)。在某些態樣中，電穿孔之前的細胞密度可在1×10 7個細胞/毫升至(y)×10 7之範圍內，其中y可為2、3、4、5、6、7、8、9或10 (或2至10或其中可導出之範圍的任何值)。在其他態樣中，電穿孔之前的細胞密度可在1×10 7個細胞/毫升至1×10 8個細胞/毫升、1×10 8個細胞/毫升至1×10 9個細胞/毫升、1×10 9個細胞/毫升至1×10 10個細胞/毫升、1×10 10個細胞/毫升至1×10 11個細胞/毫升、1×10 11個細胞/毫升至1×10 12個細胞/毫升，或1×10 7個細胞/毫升至1×10 12個細胞/毫升之範圍內或其中可導出之範圍的任何值。在某些態樣中，電穿孔之前的細胞密度可為(y)×10 6，其中y可為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100中之任一者，或0.01至100或其中可導出之範圍的任何值。在某些態樣中，電穿孔之前的細胞密度可為(y)×10 10，其中y可為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000中之任一者(或0.01至1000或其中可導出之範圍的任何值)。
在某些態樣中，電穿孔期間之細胞密度為受控變數。電穿孔期間細胞之細胞密度可根據(但不限於)細胞類型、所需電穿孔效率或所得電穿孔細胞之所需生存力變化或改變。在某些態樣中，細胞密度在整個電穿孔中為恆定的。在其他態樣中，細胞密度在電穿孔過程期間變化。在某些態樣中，電穿孔期間之細胞密度可在1×10 4個細胞/毫升至(y)×10 4之範圍內，其中y可為2、3、4、5、6、7、8、9或10 (或2至10或其中可導出之範圍的任何值)。在其他態樣中，電穿孔期間之細胞密度可在1×10 5個細胞/毫升至(y)×10 5之範圍內，其中y為2、3、4、5、6、7、8、9或10 (或2至10或其中可導出之範圍的任何值)。在其他態樣中，電穿孔期間之細胞密度可在1×10 6個細胞/毫升至(y)×10 6之範圍內，其中y可為2、3、4、5、6、7、8、9或10 (或2至10或其中可導出之範圍的任何值)。在某些態樣中，電穿孔期間之細胞密度可在1×10 7個細胞/毫升至(y)×10 7之範圍內，其中y可為2、3、4、5、6、7、8、9或10 (或2至10或其中可導出之範圍的任何值)。在其他態樣中，電穿孔期間之細胞密度可在1×10 7個細胞/毫升至1×10 8個細胞/毫升、1×10 8個細胞/毫升至1×10 9個細胞/毫升、1×10 9個細胞/毫升至1×10 10個細胞/毫升、1×10 10個細胞/毫升至1×10 11個細胞/毫升、1×10 11個細胞/毫升至1×10 12個細胞/毫升之範圍內，或1×10 7個細胞/毫升至1×10 12個細胞/毫升或其中可導出之範圍的任何值。在某些態樣中，電穿孔期間之細胞密度可為(y)×10 6，其中y可為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100中之任一者，或0.01至100或其中可導出之範圍的任何值。在某些態樣中，電穿孔期間之細胞密度可為(y)×10 10，其中y可為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000中之任一者(或0.01至1000或其中可導出之範圍的任何值)。
在某些態樣中，電穿孔之後的細胞密度可在1×10 4個細胞/毫升至(y)×10 4之範圍內，其中y可為2、3、4、5、6、7、8、9或10 (或2至10或其中可導出之範圍的任何值)。在某些態樣中，電穿孔之後的細胞密度可在1×10 5個細胞/毫升至(y)×10 5之範圍內，其中y可為2、3、4、5、6、7、8、9或10(或2至10或其中可導出之範圍的任何值)。在某些態樣中，電穿孔之後的細胞密度可在1×10 6個細胞/毫升至(y)×10 6之範圍內，其中y可為2、3、4、5、6、7、8、9或10(或2至10或其中可導出之範圍的任何值)。在某些態樣中，電穿孔之後的細胞密度可在1×10 7個細胞/毫升至(y)×10 7之範圍內，其中y可為2、3、4、5、6、7、8、9或10(或2至10或其中可導出之範圍的任何值)。在其他態樣中，電穿孔之後的細胞密度可在1×10 7個細胞/毫升至1×10 8個細胞/毫升、1×10 8個細胞/毫升至1×10 9個細胞/毫升、1×10 9個細胞/毫升至1×10 10個細胞/毫升、1×10 10個細胞/毫升至1×10 11個細胞/毫升、1×10 11個細胞/毫升至1×10 12個細胞/毫升之範圍內，或1×10 7個細胞/毫升至1×10 12個細胞/毫升或其中可導出之範圍的任何值。在某些態樣中，電穿孔之後的細胞密度可為(y)×10 6，其中y可為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100中之任一者，或0.01至100或其中可導出之範圍的任何值。在某些態樣中，電穿孔之後的細胞密度可為(y)×10 10，其中y可為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000中之任一者(或0.01至1000或其中可導出之範圍的任何值)。
在一些情況下，一定數目之細胞可在一定時間量內電穿孔。鑒於所描述平台之靈活性、一致性及可複製性，可在小於0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100秒(或0.01秒至100秒或其中可導出之範圍的任何值)內電穿孔至多或超過約(y)×10 4、(y)×10 5、(y)×10 6、(y)×10 7、(y)×10 8、(y)×10 9、(y)×10 10、(y)×10 11、(y)×10 12、(y)×10 13、(y)×10 14或(y)×10 15個細胞(或(y)×10 4至(y)×10 15或其中可導出之範圍的任何值)，其中y可為1、2、3、4、5、6、7、8或9中的任何一者(或1至9或其中可導出之範圍的值)。在其他情況下，可以在小於0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120分鐘(或0.01分鐘至120分鐘或其中可導出之範圍的任何值)內電穿孔至多或超過約(y)×10 4、(y)×10 5、(y)×10 6、(y)×10 7、(y)×10 8、(y)×10 9、(y)×10 10、(y)×10 11、(y)×10 12、(y)×10 13、(y)×10 14或(y)×10 15個細胞(或(y)×10 4個細胞至(y)×10 15個細胞或其中可導出之範圍的任何值)，其中y可為1、2、3、4、5、6、7、8或9中的任何一者(或1至9或其中可導出之範圍的值)。在其他態樣中，可以在小於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時(或1小時至24小時或其中可導出之範圍的任何值)內電穿孔至多或超過約(y)×10 4、(y)×10 5、(y)×10 6、(y)×10 7、(y)×10 8、(y)×10 9、(y)×10 10、(y)×10 11、(y)×10 12、(y)×10 13、(y)×10 14或(y)×10 15個細胞(或(y)×10 4個細胞至(y)×10 15個細胞或其中可導出之範圍的任何值)，其中y可為1、2、3、4、5、6、7、8或9中的任何一者(或1至9或其中可導出之範圍的值)。
表達式『(y)×10e』應理解為意指可以取任何數值之變數『y』，乘以10(其升高至指數值e)。例如，(y)×10 4，其中y為2，應理解為意指2×10 4，相當於2×10,000，等於20,000。(y)×10e4亦可寫為(y)*10e4或(y)×10 4或(y)*10 4。
細胞或培養基之體積可以根據待電穿孔之細胞量、待篩選之細胞數目、待篩選之細胞類型、待產生之蛋白質類型、所需蛋白質量、細胞生存力，以及與所需細胞濃度相關的某些細胞特徵而變化。可用於方法及組合物中之體積之實例包括但不限於：0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000 mL或L(或0.01 mL或L至1000 mL或L或其中可導出之範圍的任何值)，及其中可導出之任何範圍。考慮可以容納此類體積之容器用於本文所述之態樣。此類容器包括但不限於細胞培養皿、培養皿、燒瓶、生物袋、生物容器、生物反應器或大桶。尤其考慮用於大規模體積之容器，諸如彼等能夠容納大於10 L或更大體積之容器。在某些態樣中，使用100 L或更大之體積。
在一些態樣中，使用市售可得之細胞培養容器及細胞培養基在懸浮液中培養細胞。可用於一些態樣之市售可得培養容器的實例包括ADME/TOX盤(GIBCO™)、細胞腔室載玻片及蓋玻片、細胞計數設備、細胞培養表面、HYPERFLASK®細胞培養容器(CORNING®)、經塗佈培養皿(Cultureware)、NALGENE® Cryoware、培養腔室、培養皿、玻璃培養燒瓶、塑膠培養燒瓶、3D培養格式、培養多孔盤、培養盤插件、玻璃培養管、塑膠培養管、可堆疊細胞培養容器、缺氧培養腔室、皮氏培養皿及燒瓶載體、Quickfit培養容器、使用滾瓶、轉瓶、3D細胞培養或細胞培養袋的按比例擴大細胞培養。
在其他態樣中，可以使用熟習此項技術者熟知之組分來調配培養基。培養細胞之調配物及方法詳細描述於以下參考文獻中：Short Protocols in Cell Biology, J. Bonifacino,等人, 編, John Wiley & Sons, 2003, 第826頁；Live Cell Imaging: A Laboratory Manual, D. Spector & R. Goldman, 編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2004, 第450頁；Stem Cells Handbook, S. Sell, 編, Humana Press, 2003, 第528頁；Animal Cell Culture: Essential Methods, John M. Davis, John Wiley & Sons,  3月16日, 2011；Basic Cell Culture Protocols, Cheryl D. Helgason, Cindy Miller, Humana Press, 2005；Human Cell Culture Protocols, Series: Methods in Molecular Biology, 第806卷, Mitry, Ragai R.; Hughes, Robin D. (編),第三版 2012, XIV, 435 第89頁, Humana Press; Cancer Cell Culture: Method and Protocols, Cheryl D. Helgason, Cindy Miller, Humana Press, 2005；Human Cell Culture Protocols, Series: Methods in Molecular Biology, 第806卷, Mitry, Ragai R.; Hughes, Robin D. (編), 第3版2012, XIV, 435 第89頁, Humana Press; Cancer Cell Culture: Method and Protocols, Simon P. Langdon, Springer, 2004；Molecular Cell Biology. 第4版, Lodish H, Berk A, Zipursky S L,等人, New York: W. H. Freeman; 2000, Section 6.2 Growth of Animal Cells in Culture，以上所有均以引用的方式併入本文中。
在一些態樣中，在篩選及擴增階段及/或在大規模生產階段(亦稱為分批補料&比較)期間，由選擇或篩選產生之擴增之電穿孔細胞可以包含所關注之藥劑。 B. 目標製造及收集
本文中所描述之組合物可用於治療應用中。本文所描述之組合物之治療用途的一個實例係在適當緩衝液中以所需的濃度調配所關注之治療劑，且使用諸如本文所述之電穿孔系統的系統處理調配物。若所關注之治療劑及電穿孔目標經無菌過濾至具有適當埠的容器中，則所關注之治療劑可以在常規實驗室環境中延行穿過封閉之無菌系統。該過程可在2至3小時內完成。系統之效能變數為即時產生的且可輔助品質控制操作。
通常，可以在中心設施或在護理點處製造負載有藥劑的目標。若存在一個中心設施(或幾個區域設施)，那麼負載藥劑之目標的穩定性為一個重要因素。至少幾天之穩定性可以支撐定製操作。在護理點系統中，調配之所關注之治療劑將供應至需要治療的部位。可以在此等部位獲得目標或遞送媒劑，且由技術人員使用詳細的標準操作程序在加工設施中執行最終製造步驟。此將類似於現場最終製備輸注產物。在此情況下，最終產物穩定性並非關鍵的。 C. 治療應用
本發明進一步涵蓋使用電穿孔實體或目標(例如，細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體、組織或其衍生物)作為遞送媒劑遞送所關注之治療劑的方法。本發明亦包括一種治療需要所關注之治療劑之患者的方法，其包含向該患者投與有效量之含有所關注之治療劑之細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體或組織。
使用本文所描述之方法生產之活性劑調配物典型地具有持續效果及較低毒性，從而允許不太頻繁的投藥及增強之治療指數。通過首先製備根據本文所描述之方法獲得的負載有至少一種所關注之治療劑的細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體、組織或其衍生物來產生治療劑。
在本發明之某些態樣中，可以將所關注之藥劑負載或引入遞送媒劑(即，電穿孔目標，例如細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體、組織或其衍生物)中。合適之所關注之藥劑的實例包括但不限於藥物；穩定劑、示蹤劑、螢光標籤及其他成像物質，諸如放射性標記；低溫保護劑；核酸；多肽；小分子；碳水化合物；及生物活性材料。特別適合併入電穿孔目標中之生物活性材料包括但不限於治療劑及預防劑。生物活性材料的實例包括但不限於蛋白質及肽(合成的、天然的及模擬物)、寡核苷酸(反義、核酶等)、核酸(例如，雙義線性DNA、抑制性RNA、siRNA、miRNA、shRNA、表現載體等)、核糖核蛋白、載體、小分子、碳水化合物、細胞激素、血液治療劑、抗癌藥、消炎藥、抗真菌藥、抗病毒藥、抗微生物藥、血栓調節劑、免疫調節劑及其類似者。應當理解，也可以將其他所關注之藥劑引入遞送媒劑或其他細胞中以遞送至受損組織。此等所關注之藥劑包括但不限於平滑肌抑制劑、抗感染劑(例如抗生素、抗真菌劑、抗細菌劑、抗病毒劑)、化療劑/抗腫瘤劑及其類似者。
所關注之藥劑可藉由多種方法引入至遞送媒劑中，其中最佳方法係根據本發明之設備及/或方法。在一些態樣中，將2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種所關注之藥劑連續引入至遞送媒劑中。在一些態樣中，待連續引入至遞送媒劑中之2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種藥劑可為相同藥劑、不同藥劑或其組合。舉例而言，在一些態樣中，待連續引入至遞送媒劑中之2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種藥劑可為相同藥劑。在一些態樣中，待連續引入至遞送媒劑中之2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種藥劑可為不同藥劑。在一些態樣中，待連續引入遞送媒劑中的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種藥劑可為相同及不同藥劑之組合(例如，第二、第三、第四藥劑可全部為同一種藥劑，而第五-第十藥劑可為不同藥劑或不同藥劑之組合)。
在一些態樣中，所主張之藉由電穿孔(諸如流動電穿孔)轉染細胞之方法實現的所關注之藥劑之負載或轉染效率為至少、至多或約40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90%，或其中可衍生的任何範圍或值。所主張之藉由電穿孔(諸如流動電穿孔)轉染細胞之方法能夠實現的所關注之藥劑之負載或轉染效率為大於40%、大於50%、大於60%、大於70%、大於80%或大於90%(或其中可衍生的任何範圍或值)。在一些態樣中，所關注之藥劑之負載效率為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。轉染效率可藉由表現基因產物之細胞百分比或由基因所表現之產物的分泌量來量測。
本發明之任何組合物的劑量將根據患者之症狀、年齡及體重、待治療或預防之病症的性質及嚴重程度、投藥途徑及本發明組合物之形式而變化。任何本發明調配物可以單次劑量或分次給藥投與。本發明之組合物之劑量可容易地藉由熟習此項技術者已知或如本文中教示之技術確定。
在一些態樣中，本發明化合物之劑量可為至多或可為至少每公斤體重0.001、0.010、0.020、0.030、0.040、0.050、0.060、0.070、0.080、0.090、0.100、0.110、0.120、0.130、0.140、0.150、0.160、0.170、0.180、0.190、0.200、0.210、0.220、0.230、0.240、0.250、0.260、0.270、0.280、0.290、0.300、0.310、0.320、0.330、0.340、0.350、0.360、0.370、0.380、0.390、0.400、0.410、0.420、0.430、0.440、0.450、0.460、0.470、0.480、0.490、0.500、0.510、0.520、0.530、0.540、0.550、0.560、0.570、0.580、0.590、0.600、0.610、0.620、0.630、0.640、0.650、0.660、0.670、0.680、0.690、0.700、0.710、0.720、0.730、0.740、0.750、0.760、0.770、0.780、0.790、0.800、0.810、0.820、0.830、0.840、0.850、0.860、0.870、0.880、0.890、0.900、0.910、0.920、0.930、0.940、0.950、0.960、0.970、0.980、0.990、1.000、1.100、1.200、1.300、1.400、1.500、1.600、1.700、1.800、1.900、2.000、2.100、2.200、2.300、2.400、2.500、2.600、2.700、2.800、2.900、3.000、3.100、3.200、3.300、3.400、3.500、3.600、3.700、3.800、3.900、4.000、4.100、4.200、4.300、4.400、4.500、4.600、4.700、4.800、4.900、5.000、5.100、5.200、5.300、5.400、5.500、5.600、5.700、5.800、5.900、6.000、6.100、6.200、6.300、6.400、6.500、6.600、6.700、6.800、6.900、7.000、7.100、7.200、7.300、7.400、7.500、7.600、7.700、7.800、7.900、8.000、8.100、8.200、8.300、8.400、8.500、8.600、8.700、8.800、8.900、9.000、9.100、9.200、9.300、9.400、9.500、9.600、9.700、9.800、9.900或10.000 pg/ng/mg/g，或其中可導出之任何範圍或值。在某些態樣中，本發明化合物之劑量通常在約每公斤體重0.001、0.01、1、5、10 pg/ng/mg至約0.1、1、5、10 pg/ng/mg/g的範圍內，包括其間之所有值及範圍。 1. 抗感染劑
在一個態樣中，所關注之藥劑為抗感染的。抗感染劑為對抗感染，諸如細菌、分枝桿菌、真菌、病毒或原蟲感染之藥劑。本發明涵蓋之抗感染劑包括但不限於氨基糖苷類(例如鏈黴素(streptomycin)、慶大黴素(gentamicin)、托普黴素(tobramycin)、氨丁卡黴素(amikacin)、奈替黴素(netilmicin)、卡那黴素(kanamycin)及其類似者)、四環素類(例如氯四環素(chlortetracycline)、土黴素(oxytetracycline)、美他環素(methacycline)、多西環素(doxycycline)、二甲胺四環素(minocycline)及其類似者)、磺醯胺類(例如對胺基苯磺醯胺、磺胺嘧啶、磺胺甲㗁唑、磺胺異㗁唑、磺胺乙醯胺及其類似者)、對胺基苯甲酸、二胺基嘧啶(例如甲氧苄啶(trimethoprim)，通常與磺胺甲基異㗁唑、吡𠯤甲醯胺及其類似者結合使用)、喹諾酮類(例如，萘啶酸、西諾沙星(cinoxacin)、環丙沙星(ciprofloxacin)及諾氟沙星(norfloxacin)及其類似者)、青黴素類(例如青黴素G、青黴素V、安比西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、巴卡西林(bacampicillin)、卡本西林(carbenicillin)、卡本西林二氫茚基、替卡西林(ticarcillin)、阿洛西林(azlocillin)、美洛西林(mezlocillin)、哌拉西林(piperacillin)及其類似者)、青黴素酶抗性青黴素(例如，甲氧西林(methicillin)、苯唑西林(oxacillin)、氯唑西林(cloxacillin)、雙氯西林(dicloxacillin)、萘夫西林(nafcillin)及其類似者)、第一代頭孢菌素(例如，頭孢羥胺苄(cefadroxil)、頭孢氨苄(cephalexin)、頭孢拉定(cephradine)、頭孢噻吩(cephalothin)、頭孢匹林(cephapirin)、頭孢唑啉(cefazolin)及其類似者)、第二代頭孢菌素(例如，頭孢克洛(cefaclor)、頭孢孟多(cefamandole)、頭孢尼西(cefonicid)、頭孢西丁(cefoxitin)、頭孢替坦(cefotetan)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢呋辛醋乙氧、頭孢美唑(cefmetazole)、頭孢丙烯(cefprozil)、氯碳頭孢(loracarbef)、頭孢雷特(ceforanide)及其類似者)、第三代頭孢菌素(例如頭孢吡肟(cefepime)、頭孢哌酮(cefoperazone)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢唑肟(ceftizoxime)、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢克肟(cefixime)、頭孢泊肟(cefpodoxime)、頭孢布坦(ceftibuten)及其類似者)、其他β-內醯胺類(例如亞胺培南(imipenem)、美羅培南(meropenem)、安曲南(aztreonam)、克拉維酸(clavulanic acid)、舒巴坦(sulbactam)、他唑巴坦(tazobactam)及其類似者)、β內醯胺酶抑制劑(例如，克拉維酸)、氯黴素(chlorampheriicol)、大環內酯類(例如，紅黴素(erythromycin)、阿奇黴素(azithromycin)、克拉黴素(clarithromycin)及其類似者)、林可黴素(lincomycin)、克林達黴素(clindamycin)、壯觀黴素(spectinomycin)、多黏菌素B、多黏菌素類(例如，多黏菌素A、B、C、D、E1(可利斯汀(colistin)A)或E2、可利斯汀B或C及其類似者)、可利斯汀、萬古黴素(vancomycin)、桿菌素(bacitracin)、異煙肼(isoniazid)、利福平(rifampin)、乙胺丁醇(ethambutol)、乙硫異煙胺(ethionamide)、胺基柳酸、環絲胺酸、卷麯黴素(capreomycin)、碸類(例如氨苯碸、碸鈉及其類似者)、氯法齊明(clofazimine)、沙利度胺(thalidomide)及任何其他可以被脂質囊封的抗細菌劑。
在某些態樣中，抗菌劑包括抗分枝桿菌劑，包括但不限於異煙肼、利福平、鏈黴素、利福布汀(rifabutin)、乙胺丁醇、吡𠯤甲醯胺、乙硫異煙胺、胺基柳酸及環絲胺酸。
抗感染劑可包括抗真菌劑，包括多烯抗真菌劑(例如兩性黴素(amphotericin)B、耐絲菌素(nystatin)、遊黴素(natamycin)及其類似者)、氟胞嘧啶、咪唑(例如咪康唑(n-ticonazole)、克氯黴唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、酮康唑(ketoconazole)及其類似者)、三唑(例如伊曲康唑(itraconazole)、氟康唑(fluconazole)及其類似者)、灰黃黴素(griseofulvin)、特康唑(terconazole)、環吡酮布康唑(butoconazole ciclopirax)、環吡酮乙醇胺(ciclopirox olamine)、鹵苯炔醚(haloprogin)、托萘酯(tolnaftate)、萘替芬(naftifine)、特比萘芬(terbinafine)及任何其他可以被脂質囊封或複合的抗真菌劑。可使用藥物之組合。
在某些態樣中，抗感染劑包括抗病毒劑，包括但不限於抗疱疹藥劑，諸如阿克洛韋(acyclovir)、泛昔洛韋(famciclovir)、膦甲酸(foscamet)、更昔洛韋(ganciclovir)、阿昔洛韋(acyclovir)、碘尿苷(idoxuridine)、索利夫定(sorivudine)、曲氟尿苷(trifluridine)、伐昔洛韋(valacyclovir)及阿糖腺苷(vidarabine)；抗反轉錄病毒藥劑，諸如利托那韋(ritonavir)、地達諾新(didanosine)、司他夫定(stavudine)、紮西他濱(zalcitabine)、替諾沃韋(tenovovir)及齊多夫定(zidovudine)；及其他抗病毒劑，諸如但不限於金剛烷胺(amantadine)、干擾素-α、利巴韋林(ribavirin)及金剛烷乙胺(rimantadine)。
亦作為用於本發明之調配物中的合適的抗感染劑包括的為藥物之醫藥學上可接受之加成鹽及複合物。在化合物可以具有一或多個對掌性中心的情況下，除非另有說明，否則本發明包含每種獨特之外消旋化合物，以及每種獨特之非外消旋化合物。 2. 抗腫瘤劑
在一個態樣中，活性劑為抗腫瘤藥物。目前，大約有20種公認之核准抗腫瘤藥物。分類係基於特定藥物共享之共同結構或基於藥物之共同作用機制的概括。一些通常已知的抗腫瘤藥劑之部分分類列表如下：
基於結構之類別包括氟嘧啶—5-FU、氟去氧尿苷、氟托拉呋(Ftorafur)、5'-去氧氟尿苷、UFT、S-1卡培他濱(Capecitabine)；嘧啶核苷—去氧胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氮雜胞嘧啶、吉西他濱、5-氮雜胞嘧啶-阿拉伯糖苷；嘌呤—6-巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、硫唑嘌呤、別嘌呤醇、克拉屈濱(Cladribine)、氟達拉濱(Fludarabine)、噴司他丁(Pentostatin)、2-氯腺苷；鉑類似物—順鉑、卡鉑(Carboplatin)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、四鉑、鉑-DACH、奧馬鉑(Ormaplatin)、CI-973、JM-216；蒽環黴素/蒽二酮—阿黴素(Doxorubicin)、道諾黴素(Daunorubicin)、表阿黴素(Epirubicin)、伊達阿黴素(Idarubicin)、米托蒽醌(Mitoxantrone)；表鬼臼毒素(Epipodophyllotoxins)—依託泊苷、替尼泊苷(Teniposide)；喜樹鹼(Camptothecins)—伊立替康(Irinotecan)、拓樸替康(Topotecan)、9-胺基喜樹鹼、10,11-亞甲基二氧基喜樹鹼、9-硝基喜樹鹼、TAS 103、7-(4-甲基-哌嗪子基-亞甲基)-10,11-伸乙二氧基-20(S)-喜樹鹼、7-(2-N-異丙胺基)乙基)-20(S)-喜樹鹼；激素及激素類似物—己烯雌酚、他莫昔芬(Tamoxifen)、托瑞美芬(Toremefine)、托木德(Tolmudex)、賽米他(Thymitaq)、氟他胺(Flutamide)、比卡魯胺(Bicalutamide)、非那雄胺(Finasteride)、雌二醇、曲沃昔芬(Trioxifene)、屈洛昔芬(Droloxifene)、醋酸甲羥孕酮(Medroxyprogesterone Acetate)、醋酸甲地孕酮(Megesterol Acetate)、胺麩精(Aminoglutethimide)、睾內酯(Testolactone)及其他；酶、蛋白質及抗體—天冬醯胺酶、介白素、干擾素、亮丙立德(Leuprolide)、培門冬酶(Pegaspargase)及其他；長春花生物鹼—長春新鹼(Vincristine)、長春鹼(Vinblastine)、長春瑞濱(Vinorelbine)、長春地辛(Vindesine)；紫杉烷—紫杉醇及多西他賽(Docetaxel)。
基於機制之類別包括抗激素劑—阿那曲唑；抗葉酸劑—甲胺喋呤(Methotrexate)、胺基喋呤(Aminopterin)、曲美沙特(Trimetrexate)、甲氧苄啶(Trimethoprim)、吡蟲啉(Pyritrexim)、乙胺嘧啶(Pyrimethamine)、依達曲沙(Edatrexate)、MDAM；抗微管藥劑—紫杉烷及長春花生物鹼；烷基化劑(經典及非經典)—氮芥(甲氮芥(Mechlorethamine)、苯丁酸氮芥、美法侖、尿嘧啶氮芥)、噁唑磷(Oxazaphosphorines)(異環磷醯胺、環磷醯胺、全磷醯胺(Perfosfamide)、原磷醯胺)、烷基磺酸鹽(白消安(Busulfan))、亞硝基脲(卡莫司汀(Carmustine)、洛莫司汀(Lomustine)、鏈脲佐菌素(Streptozocin))、噻替派(Thiotepa)、達卡巴嗪(Dacarbazine)及其他；抗代謝物—嘌呤、嘧啶及核苷，如上所列；抗生素-蒽環黴素/蒽二酮、博來黴素(Bleomycin)、放線菌素(Dactinomycin)、絲裂黴素(Mitomycin)、普卡黴素(Plicamycin)、噴司他丁(Pentostatin)、鏈脲佐菌素(Streptozocin)；拓樸異構酶抑制劑—喜樹鹼(拓樸(Topo)I)、表鬼臼毒素、m-AMSA、玫瑰樹鹼(Ellipticines) (拓樸II)；抗病毒劑—AZT、紮西他濱(Zalcitabine)、吉西他濱(Gemcitabine)、地達諾新(Didanosine)及其他；其他細胞毒素劑—siRNA、miRNA、羥基尿素(Hydroxyurea)、米托坦(Mitotane)、融合毒素、PZA、苔蘚抑素(Bryostatin)、類視黃素(Retinoids)、丁酸及其衍生物、戊聚糖、煙黴素(Fumagillin)及其他。 3. 抗血管生成劑
可以將抗血管生成劑併入至電穿孔目標中。抗血管生成藥物包括但不限於AGM-1470 (TNP-470)或其受體之一MetAP-2的拮抗劑；生長因子拮抗劑，或生長因子抗體(包括VEGF或bFGF)；生長因子受體拮抗劑或生長因子受體抗體；金屬蛋白酶抑制劑，包括TIMP、巴馬司他(batimastat)(BB-94)及馬立馬司他(marimastat)；酪胺酸激酶抑制劑，包括金雀異黃酮(genistein)及SU5416；整合素拮抗劑，包括拮抗劑αVβ3/5或整合素之抗體；類視黃素，包括視黃酸或合成的類視黃素非瑞替尼(fenretinide)；類固醇11α-表氫化皮質醇、皮質酮(corteloxone)、四氫可的松(tetrahydrocortisone)及17α-羥基孕酮；蛋白激酶抑制劑，包括星形孢菌素及MDL 27032；維生素D衍生物，包括22-氧雜-1α及25-二羥基維生素D3；花生四烯酸抑制劑，包括吲哚美辛(indomethacin)及舒林酸；四環素衍生物，包括米諾環素(minocycline)；沙利度胺及沙利度胺類似物及衍生物；2-甲氧雌二醇；腫瘤壞死因子-α；干擾素-γ-誘導蛋白10 (IP-10)；介白素1及介白素12；干擾素α、β或γ；血管生長抑素蛋白或纖維蛋白溶酶原片段；內皮生長抑素蛋白或膠原蛋白18片段；增殖素相關蛋白；B組鏈球菌毒素；CM101；CAI；肌鈣蛋白I；角鯊胺(squalamine)；一氧化氮合酶抑制劑，包括L-NAME；凝血酶致敏蛋白(thrombospondin)；渥曼青黴素；胺氯吡脒(amiloride)；螺內酯；熊去氧膽酸；蟾蜍靈(bufalin)；蘇拉明(suramin)；替康蘭鈉(tecogalan sodium)；亞麻油酸；卡托普利(captopril)；伊索拉定(irsogladine)；FR-118487；三萜酸；栗樹精胺(castanospermine)；白血病抑制因子；薰衣草素(lavendustin)A；血小板因子-4；除莠黴素(herbimycin)A；二胺基蒽醌(diaminoantraquinone)；紫杉醇(taxol)；金黃三羧酸(aurintricarboxylic acid)；DS-4152；戊聚糖多亞硫酸鹽；根赤殼菌素(radicicol)；人類促乳素片段；厄布他汀(erbstatin)；埃彭黴素(eponemycin)；鯊魚軟骨；魚精蛋白；路易斯安那A、C及D；PAF拮抗劑WEB2086；金諾芬(auranofin)；抗壞血酸醚(ascorbic ethers)；及硫酸化多醣D 4152。 4. 生物分子藥劑
待使用本發明方法用核酸藥劑靶向之基因包括但不限於其表現與不期望的表型性狀相關的彼等基因。因此，舉例而言，可靶向與癌症及病毒相關之基因。癌症相關基因包括癌基因(例如，K-ras、c-myc、bcr/abl、c-myb、c-fms、c-fos及cerb-B)、生長因子基因(例如，編碼表皮生長因子及其受體、纖維母細胞生長因子-結合蛋白的基因)、基質金屬蛋白酶基因(例如，編碼MMP-9之基因)、黏附-分子基因(例如，編碼VLA-6整合素之基因)、腫瘤抑制基因(例如，bcl-2及bcl-X1)、血管生成基因及轉移基因。病毒基因包括人類乳頭狀瘤病毒基因(例如與宮頸癌相關)、B型及C型肝炎基因及細胞巨大病毒(CMV)基因(例如與視網膜炎相關)。亦可靶向與此等疾病或其他者相關之許多其他基因。在某些態樣中，核酸可以靶向編碼c-myc、VEGF、CD4、CCRS、gag、MDM2、Apex、Ku70或ErbB2之mRNA。
基因調節之方法包括投與siRNA、miRNA、shRNA、反義寡核苷酸及其他抑制性核酸及/或投與編碼治療性聚核苷酸、蛋白質、核糖核蛋白或肽之載體或核酸。在另一態樣中，本公開提供一種製備及/或向受試者投與一定劑量之治療性抑制性寡核苷酸或核酸(反義寡核苷酸、核糖核酸酶、siRNA、shRNA、miRNA、dsRNA)分子的方法，其中投與的核酸抑制諸如轉錄或翻譯之生物學過程。本公開提供向使用核酸遞送媒劑向受試者投與一或多種治療性核酸分子以給受試者帶來治療益處的方法，該遞送媒劑係使用所描述之方法製備。如本文所用，「治療性核酸分子」或「治療性核酸」為任何核酸(例如，DNA、RNA、非天然產生之核酸及其類似物，諸如肽核酸，及其化學結合物)，其作為核酸或作為表現之核酸或多肽賦予受試者治療益處。受試者可為哺乳動物，例如小鼠或人類。
基因調節之方法亦包括對細胞進行基因編輯以移除細胞中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種內源基因。基因編輯之方法包括但不限於RNA引導的核酸內切酶(RGEN)(例如核糖核蛋白)、限制酶、鋅指核酸酶(ZFN)及類轉錄活化子效應物核酸酶(TALEN)。在特定態樣中，細胞之一或多種內源基因經修飾，諸如表現被破壞，其中表現部分或全部降低。在具體態樣中，使用本發明之製程減弱或剔除一或多個基因。根據本發明之電穿孔設備及/或方法，可以藉由電穿孔細胞以引入一或多種RGEN、限制酶、ZFN或TALEN來實現基因表現之破壞或基因剔除或減弱。在一些態樣中，當連續引入一或多種RGEN、限制酶、ZFN或TALEN以連續破壞、剔除或減弱2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種基因時，連續電穿孔細胞以允許細胞的連續編輯。在細胞中編輯之基因可為任何種類，但在具體態樣中，基因為基因產物與如本文所述之非所需表型性狀相關之基因。 a.      核酸
態樣係關於用包含治療性核酸之組合物對細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體、組織或其衍生物進行電穿孔。在某些態樣中，核酸分子可呈寡核苷酸形式。
術語「寡」或「寡核苷酸」係指聚核苷酸，諸如去氧核糖核酸(DNA)，並且在適當的情況下，係指核糖核酸(RNA)。該術語亦應理解為包括由核苷酸類似物製成之RNA或DNA的等效物、衍生物、變異體及類似物，以及當適用於所描述的態樣時，包括單股(有義或反義)及雙股聚核苷酸。去氧核糖核苷酸包含去氧腺苷、去氧胞苷、去氧鳥苷及去氧胸苷。為了清楚起見，當本文提及核酸之核苷酸時，其可為DNA或RNA，使用術語「腺苷」、「胞苷」、「鳥苷」及「胸苷」。應理解，若核酸為RNA，則具有尿嘧啶鹼基之核苷酸為尿苷。
術語「聚核苷酸」及「寡核苷酸」可互換使用，且係指任何長度之核苷酸的聚合形式，該等核苷酸為去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。聚核苷酸可具有任何三維結構，且可執行任何已知或未知的功能。以下為聚核苷酸之非限制性實例：基因或基因片段(例如探針、引子、EST或SAGE標籤)、外顯子、內含子、信使RNA (mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核糖核酸酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、重組聚核苷酸、分支聚核苷酸、質體、載體、任何序列的經分離DNA、任何序列的經分離RNA、核酸探針及引子。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物。若存在，可在聚核苷酸組裝之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸序列可間雜有非核苷酸組分。聚核苷酸可在聚合後進一步修飾，諸如藉由與標記組分結合。該術語亦指雙股與單股分子兩者。除非另有規定或要求，否則本發明之作為聚核苷酸之任何態樣均涵蓋雙股形式與已知或預測構成雙股形式之兩個互補單股形式中之每一者。
DNA寡核苷酸之長度可以自至少、至多或約10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600個核苷酸至至少、至多或約100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750或5000個核苷酸，或10個核苷酸到5000個核苷酸或其可導出之範圍的任何值。在某些態樣中，寡核苷酸超過10個核苷酸，或超過11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或40個核苷酸。在特定態樣中，寡核苷酸為約30至約300個核苷酸、約20至約200個核苷酸、約15至約150個核苷酸、約10至約100個核苷酸或約40至約100個核苷酸。在某些態樣中，無論編碼序列之長度如何，寡核苷酸都可以與其他核酸序列組合，諸如啟動子、聚腺苷酸化信號、限制酶位點、多個選殖位點、其他編碼區段及其類似者，使得它們的總長度可能相差很大。
電穿孔過程中寡核苷酸之濃度可為電穿孔腔室及/或樣品容器中寡核苷酸之最終濃度。寡核苷酸濃度可以自至少、至多或約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、75、100、150、200、250或300至約350、400、500、1000、1500、2000、3000、4000或5000 μg/mL，或0.01 μg/mL至5000 μg/mL或其中可導出之範圍的任何值。在某些態樣中，寡核苷酸濃度為至少1 μg/mL。在其他態樣中，寡核苷酸之濃度為至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275或300 μg/mL，或1 μg/mL至300 μg/mL或其中可導出之範圍的任何值。
在本公開的上下文中，術語「未經修飾之寡核苷酸」通常係指核糖核酸(RNA)或去氧核糖核酸(DNA)之寡聚物或聚合物。在一些態樣中，核酸分子係未經修飾之寡核苷酸。此術語包括由天然存在之核鹼基、糖及共價核苷間鍵構成之寡核苷酸。術語「寡核苷酸類似物」係指具有一或多個非天然存在之部分的寡核苷酸，其以類似於寡核苷酸之方式起作用。此類非天然存在之寡核苷酸通常因為諸如增強細胞攝取、增強對其他寡核苷酸或核酸目標之親和力以及在核酸酶存在下增加穩定性的所需特性經選擇而非天然存在之形式。術語「寡核苷酸」可用以指代未經修飾之寡核苷酸或寡核苷酸類似物。
核酸分子之具體實例包括含有經修飾之，即非天然存在之核苷間鍵的核酸分子。此類非天然核苷間鍵通常因為諸如增強細胞攝取、增強對其他寡核苷酸或核酸目標之親和力以及在核酸酶存在下增加穩定性的所需特性經選擇而非天然存在之形式。在一具體態樣中，修飾包含甲基。
核酸分子可具有一或多個經修飾之核苷間鍵。如本說明書中所定義，具有經修飾之核苷間鍵的寡核苷酸包括保留磷原子之核苷間鍵及不具有磷原子之核苷間鍵。出於本說明書之目的，且如此項技術中有時提及，核苷內主鏈中不具有磷原子之經修飾之寡核苷酸亦可視為寡核苷。
對核酸分子之修飾可包括一個或兩個末端核苷酸經修飾的修飾。
一種合適的含磷經修飾之核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。許多其他經修飾之寡核苷酸主鏈(核苷間鍵)係此項技術中已知的，並且可以用於此態樣之情況。教示以上含磷核苷間鍵之製備的代表性美國專利包括但不限於美國專利第3,687,808號；第4,469,863號；第4,476,301號；第5,023,243號；第5,177,196號；第5,188,897號；第5,264,423號；第5,276,019號；第5,278,302號；第5,286,717號；第5,321,131號；第5,399,676號；第5,405,939號；第5,453,496號；第5,455,233號；第5,466,677號；第5,476,925號；第5,519,126號；第5,536,821號；第5,541,306號；第5,550,111號；第5,563,253號；第5,571,799號；第5,587,361號；第5,194,599號；第5,565,555號；第5,527,899號；第5,721,218號；第5,672,697號；第5,625,050號；第5,489,677號；及第5,602,240號，該等專利中之每一者以引用的方式併入本文中。
其中不包括磷原子的經修飾之寡核苷主鏈(核苷間鍵)具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵、混合雜原子及烷基或環烷基核苷間鍵或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵形成的核苷間鍵。此等包括具有醯胺主鏈之彼等；及其他，包括混合了N、O、S及CH2組分部分的彼等。教示以上不含磷寡核苷之製備的代表性美國專利包括但不限於美國專利第5,034,506號；5,166,315號；第5,185,444號；第5,214,134號；第5,216,141號；第5,235,033號；第5,264,562號；第5,264,564號；第5,405,938號；第5,434,257號；第5,466,677號；第5,470,967號；第5,489,677號；第5,541,307號；第5,561,225號；第5,596,086號；第5,602,240號；第5,610,289號；第5,602,240號；第5,608,046號；第5,610,289號；第5,618,704號；第5,623,070號；第5,663,312號；第5,633,360號；第5,677,437號；第5,792,608號；第5,646,269號；及第5,677,439號，該等專利中之每一者以引用的方式併入本文中。
寡聚化合物亦可包括寡核苷酸模擬物。應用於寡核苷酸之術語模擬物旨在包括其中僅呋喃糖環或呋喃糖環與核苷酸間鍵兩者經新基團置換之寡聚化合物，僅呋喃糖環經例如N-嗎啉基環置換在此項技術中稱作糖替代物。維持雜環鹼基部分或經修飾雜環鹼基部分與適當目標核酸雜交。寡核苷酸模擬物可包括寡聚化合物，諸如肽核酸(PNA)及環己烯基核酸(稱作CeNA，參見Wang等人, J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602)。教示以上寡核苷酸模擬物之製備的代表性美國專利包括但不限於美國專利第5,539,082號；第5,714,331號；及第5,719,262號，該等專利中之每一者以引用的方式併入本文中。另一類別寡核苷酸模擬物稱作膦醯基單酯核酸且在主鏈中併入磷基。據報告，此類寡核苷酸模擬物在抑制基因表現(反義寡核苷酸、核糖核酸酶、有義寡核苷酸及形成三螺旋體的寡核苷酸)方面具有有用的物理及生物學及藥理學特性，可作為偵測核酸之探針及作為用於分子生物學之助劑。已報告了另一種寡核苷酸模擬物，其中呋喃糖基環已經環丁基部分置換。
核酸分子亦可含有一或多個經修飾或經取代之糖部分。維持鹼基部分與適當核酸目標化合物雜交。糖修飾可賦予寡聚化合物核酸酶穩定性、結合親和力或一些其他有益生物特性。
代表性經修飾之糖包括碳環或無環糖、在其2'、3'或4'位置中之一或多個位置具有取代基的糖，具有取代基以代替糖之一或多個氫原子的糖，以及糖中任何兩個其他原子之間具有鍵的糖。大量糖修飾係此項技術中已知的，在2'位置修飾之糖及在糖的任何2個原子之間具有橋之彼等糖(使得糖為雙環)特別適用於此態樣。可用於此態樣之糖修飾的實例包括但不限於包含選自以下之糖取代基的化合物：OH；F；O-、S-或N-烷基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基及炔基可為經取代或未取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。特別合適的為：2-甲氧基乙氧基(亦稱為2'-O-甲氧基乙基、2'-MOE或2'-OCH2CH2OCH3)、2'-O-甲基(2'-O-CH3)、2'-氟( 2'-F)，或具有將4'碳原子連接至2'碳原子之橋基的雙環糖修飾之核苷，其中示例性橋基包括-CH2-O-、-(CH2)2-O-或-CH2-N(R3)-O，其中R3為H或C1-C12烷基。
一種賦予增加之核酸酶抗性及對核苷酸非常高之結合親和力的修飾為2'-MOE側鏈(Baker等人, J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000)。2'-MOE取代之直接優勢之一為結合親和力的改良，其比許多類似的2'修飾諸如O-甲基、O-丙基及O-胺丙基更大。具有2'-MOE取代基之寡核苷酸亦已被證明為基因表現之反義抑制劑，具有有望用於活體內使用的特徵(Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504；Altmann等人, Chimia, 1996, 50, 168-176；Altmann等人, Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637；及Altmann等人, Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926)。
2'-糖取代基可在阿拉伯糖(上)位或核糖(下)位。一種2'-阿拉伯型修飾為2'-F。類似的修飾亦可在寡聚化合物之其他位置進行，尤其3'末端核苷上或2'-5'鍵聯之寡核苷酸中糖之3'位置及5'末端核苷酸之5'位置。寡聚化合物亦可具有糖模擬物(諸如環丁基部分)替代呋喃戊糖基糖。教示此類經修飾之糖之製備的代表性美國專利包括但不限於美國專利第4,981,957號；第5,118,800號；第5,319,080號；第5,359,044號；第5,393,878號；第5,446,137號；第5,466,786號；第5,514,785號；第5,519,134號；第5,567,811號；第5,576,427號；第5,591,722號；第5,597,909號；第5,610,300號；第5,627,053號；第5,639,873號；第5,646,265號；第5,658,873號；第5,670,633號；第5,792,747號；及第5,700,920號，該等專利中之每一者以全文引用的方式併入本文中。
代表性的糖取代基揭示於名為「Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotides」之美國專利第6,172,209號中，其以全文引用之方式併入本文中。代表性環狀糖取代基揭示於名為「RNA Targeted 2'-Oligomeric compounds that are Conformationally Preorganized」之美國專利第6,271,358號中，其以全文引用之方式併入本文中。代表性的胍基取代基揭示於名為「Functionalized Oligomers」之美國專利第6,593,466號中，其以全文引用之方式併入本文中。代表性乙醯胺基取代基揭示於美國專利第6,147,200號中，其以全文引用的方式併入本文中。
核酸分子亦可含有一或多個核鹼基(此項技術中通常簡稱為「鹼基」)修飾或取代，其在結構上與天然存在之或合成之未經修飾的核鹼基可區分，但在功能上可互換。此類核鹼基修飾可賦予寡聚化合物核酸酶穩定性、結合親和力或一些其他有益生物特性。如本文所用，「未經修飾」或「天然」核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。在本文中亦稱為雜環鹼基部分的經修飾核鹼基包括其他合成及天然核鹼基，其中的許多實例尤其諸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤。
雜環鹼基部分亦可包括其中嘌呤或嘧啶鹼基經其他雜環置換之彼等鹼基，例如，7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鳥苷、2-胺基吡啶及2-吡啶酮。一些核鹼基包括彼等揭示於以下中之核鹼基：美國專利第3,687,808號；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 第858-859頁, Kroschwitz, J. I., 編 John Wiley & Sons, 1990；Englisch等人, Angewandte Chemie, 國際版, 1991, 30, 613及Sanghvi, Y. S., 第15章, Antisense Research and Applications, 第289-302頁, Crooke, S. T. and Lebleu, B., 編, CRC Press, 1993。某些此等核鹼基尤其適用於增加寡聚化合物之結合親和力。此等包括5-取代嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及O-6取代嘌呤，包括2胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。
核酸分子之額外修飾揭示於美國專利公開案2009/0221685中，其以引用之方式併入本文中。本文亦揭示與核酸分子之額外適合結合物。 b.     蛋白質
態樣係關於用包含治療性蛋白或肽之組合物對細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體、組織或其衍生物進行電穿孔。
如本文所用，「蛋白質」或「肽」或「多肽」係指包含至少兩個胺基酸殘基之分子。如本文中所使用，術語「野生型」係指在生物體中天然存在之分子之內源性版本。在一些態樣中，採用蛋白質或多肽之野生型型式，然而在本發明之許多態樣中，採用經修飾之蛋白質或多肽以產生免疫反應。上文所描述之術語可互換使用。「經修飾之蛋白質」或「經修飾之多肽」或「變異體」係指其化學結構，尤其其胺基酸序列相對於野生型蛋白質或多肽改變之蛋白質或多肽。在一些態樣中，經修飾之蛋白質/變異蛋白或多肽具有至少一種經修飾之活性或功能(認識到蛋白質或多肽可具有多種活性或功能)。經特別考慮，經修飾之蛋白質/變異蛋白或多肽可相對於一種活性或功能改變，但在其他方面中保留野生型活性或功能，諸如免疫原性。
在本文中特別提及蛋白質之情況下，一般指代天然(野生型)或重組(經修飾之)蛋白質或視情況已移除任何信號序列之蛋白質。蛋白質可自天然的生物體直接分離，藉由重組DNA/外源性表現方法產生，藉由固相肽合成(SPPS)或其他活體外方法產生。在特定態樣中，存在經分離之核酸區段及重組載體，其併入編碼多肽(例如抗體或其片段)之核酸序列。術語「重組」可與多肽或特異性多肽之名稱結合使用，且此一般係指由已經活體外操作或為此類分子之複製產物之核酸分子產生的多肽。
在某些態樣中，蛋白質或多肽大小(野生型或經修飾)可包含但不限於至少、至多或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500個胺基酸殘基或更多個，或1個胺基酸至2500個胺基酸或其中可導出之範圍的任何值，或本文中描述或參考的對應胺基序列之衍生物。經考慮，可藉由截斷使多肽突變，使其短於其對應野生型形式，此外，其可能藉由融合或結合具有特定功能(例如用於靶向或定位，用於增強免疫原性，用於純化目的等)之異源蛋白質或多肽序列而改變。如本文所用，術語「域」係指蛋白質或多肽的任何相異功能或結構單元，且通常係指具有熟習此項技術者可辨識之結構或功能之胺基酸序列。
各種基因之核苷酸以及蛋白質、多肽及肽序列先前已經揭示且可見於認可的電腦化資料庫中。兩種常用資料庫為美國國家生物技術信息中心(the National Center for Biotechnology Information)之GENEBANK®及GENPEPT®資料庫(在全球資訊網ncbi.nlm.nih.gov)及通用蛋白質資源(The Universal Protein Resource，UNIPROT®；在全球資訊網uniprot.org)。此等基因之編碼區可使用本文所揭示或如一般熟習此項技術者已知之技術進行電穿孔。
電穿孔程序期間蛋白質或多肽之濃度可為電穿孔腔室及/或樣品容器中蛋白質之最終濃度。電穿孔程序期間多肽之濃度可以自至少、至多或約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、75、100、150、200、250、300至至少、至多或約350、400、500、1000、1500、2000、3000、4000或5000 μg/mL，或0.01 μg/mL至5000 μg/mL或其中可導出之範圍的任何值。在某些態樣中，多肽之濃度為至少1 μg/mL。在其他態樣中，多肽之濃度為至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275或300 μg/mL，或1 μg/mL至300 μg/mL或其中可導出之範圍的任何值。
與野生型蛋白質相比，本發明之蛋白質亦可包含蛋白質之替代胺基酸亞基以產生等效或甚至改良的第二代變異多肽或肽。由於蛋白質之交互能力及性質定義蛋白質之功能活性，因此可在蛋白質序列中且在其對應DNA編碼序列中進行某些胺基酸取代，且仍然產生具有類似或所需特性之蛋白質。
術語「功能上等效之密碼子」在本文中用於指代編碼相同胺基酸之密碼子，諸如精胺酸之六個不同密碼子。亦考慮「中性取代」或「中性突變」，其係指編碼生物學上等效之胺基酸之一或多個密碼子之變化。
本發明之胺基酸序列變異體可為取代、插入或缺失變異體。與野生型多肽相比，本發明多肽中之變異可影響蛋白質或多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多非連續或連續胺基酸。變異體可以包含與野生型蛋白質序列至少50%、60%、70%、80%或90%(包括其間之所有值及範圍)一致的胺基酸序列。變異體可以包括例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個取代胺基酸。
亦應理解，胺基酸及核酸序列可以分別包括額外殘基，諸如額外的N-或C-末端胺基酸，或5'或3'核酸序列，但仍與野生型序列基本上一致，只要該序列在涉及蛋白質表現的情況下保持生物蛋白活性。末端序列之添加尤其適用於可能例如包括各種側接編碼區之5'或3'部分中之任一者之非編碼序列之核酸序列。
缺失變異體典型地缺乏天然或野生型蛋白質之一或多個殘基。可缺失個別殘基或可缺失多個連續胺基酸。可將終止密碼子引入(藉由取代或插入來引入)編碼核酸序列中以產生截斷的蛋白質。
插入突變體典型地涉及在多肽中之非封端點處添加胺基酸殘基。此可包括插入一或多個胺基酸殘基。亦可產生末端添加物且可包括融合蛋白，該等融合蛋白為本文中描述或參考之一或多種肽或多肽之多聚體或串聯體。
取代變異體典型地含有一個胺基酸更換蛋白質或多肽內之一或多個位點處之另一胺基酸，且可經設計以在損失或不損失其他功能或特性之情況下調節多肽之一或多種特性。取代可為保守性的，亦即，一個胺基酸由具有類似化學特性之胺基酸置換。「保守性胺基酸取代」可涉及一種胺基酸類別之成員由相同類別之另一成員更換。保守胺基酸取代可涵蓋非天然存在之胺基酸殘基，其典型地藉由化學肽合成而非藉由生物系統中之合成來併入。此等殘基包括肽模擬物或胺基酸部分之其他逆轉或反轉形式。
或者，取代可為或「非-保守性的」(亦為「非保守性的」)。在一些態樣中，非-保守性取代影響多肽之功能或活性。在一些態樣中，非-保守性取代不影響多肽之功能或活性。非-保守性變化典型地涉及用化學上相異的胺基酸殘基取代胺基酸殘基，諸如用極性或帶電胺基酸取代非極性或不帶電胺基酸，且反之亦然。非-保守性取代可能涉及將一種胺基酸類別中之成員更換成另一類別中之成員。 c.      核糖核蛋白
態樣涉及用包含一或多種DNA結合核酸之組合物對細胞進行電穿孔，諸如經由RNA引導之核酸內切酶(RGEN)(例如核糖核蛋白)進行改變以對細胞進行基因編輯。在某些態樣中，核糖核蛋白包含成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)及CRISPR-相關(Cas)蛋白。
一般而言，「CRISPR系統」係共同地指涉及CRISPR-相關(「Cas」)基因之表現或引導其活性的轉錄物及其他元件，包括編碼Cas基因之序列、反式活化CRISPR(tracr)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配對序列(在內源性CRISPR系統之情形下涵蓋「直接重複序列」及經tracrRNA處理之部分直接重複序列)、引導序列(在內源性CRISPR系統之情形下亦稱為「間隔子」)，及/或來自CRISPR基因座之其他序列及轉錄物。
CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系統可包括非編碼RNA分子(引導)RNA，其序列特異性地結合至DNA；及具有核酸酶官能基(例如兩個核酸酶域)之Cas蛋白質(例如Cas9)。CRISPR系統之一或多個元件可來源於I型、II型或III型CRISPR系統，例如來源於包含內源性CRISPR系統之特定生物體，諸如化膿性鏈球菌( Streptococcus pyogenes)。
在一些態樣中，將Cas核酸酶及gRNA引入細胞中。一般而言，gRNA之5'端處之目標位點使用互補鹼基配對將Cas核酸酶靶向至目標位點，例如基因。可基於其緊接在原間隔序列相鄰模體(PAM)序列(諸如通常為NGG或NAG)之5'端之位置選擇目標位點。就此而言，藉由修飾引導RNA之前20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10個核苷酸以對應於目標DNA序列而將gRNA靶向至所要序列。一般而言，CRISPR系統之特徵在於促進在目標序列位點形成CRISPR複合物之元件。通常，「目標序列」一般係指引導序列設計成與其具有互補性之序列，其中目標序列與引導序列之間的雜交促進CRISPR複合物之形成。未必需要完全互補性，其限制條件為存在足夠的互補性以引起雜交且促進形成CRISPR複合物。
CRISPR系統可在目標位點處誘導雙股裂解(DSB)，繼之以如本文所論述之破壞或改變。在其他態樣中，稱作「切口酶」之Cas9變異體用於在目標位點處對單股進行切口。可使用成對之切口酶，例如以提高特異性，其各自由一對不同gRNA靶向序列引導，以使得在同時引入切口時，引入5'懸垂物。在其他態樣中，無催化活性Cas9融合至異源效應子域，諸如轉錄抑制因子或活化因子，以影響基因表現。
目標序列可包含任何聚核苷酸，諸如DNA或RNA聚核苷酸。目標序列可位於細胞之細胞核或細胞質中，諸如位於細胞之細胞器內。一般而言，可用於重組至包含目標序列之所靶向基因座中之序列或模板稱為「編輯模板」或「編輯聚核苷酸」或「編輯序列」。在一些態樣中，外源性模板聚核苷酸可稱為編輯模板。在一些態樣中，重組為同源重組。
通常，在內源性CRISPR系統之情形下，形成CRISPR複合物(包含與目標序列雜交且與一或多種Cas蛋白質複合之引導序列)使得在目標序列中或附近(例如距目標序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多個鹼基對內)的一個或兩個股裂解。tracr序列，可能包含野生型tracr序列之全部或一部分或由野生型tracr序列之全部或一部分組成(例如，野生型tracr序列之至多，至少，或約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85或更多個核苷酸)，亦可形成CRISPR複合物的一部分，諸如藉由沿著tracr序列的至少一部分雜交至可操作地連接至引導序列之tracr配對序列之全部或一部分。tracr序列與tracr配對序列具有足夠互補性以雜交且參與CRISPR複合物之形成，諸如當最佳比對時，沿著tracr配對序列長度至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的序列互補性。
可以將驅動CRISPR系統之一或多個元件之表現的一或多種載體引入細胞中(例如，藉由電穿孔)，使得CRISPR系統之元件的表現直接在一或多個目標位點形成CRISPR複合物。組分亦可作為蛋白質及/或RNA及/或核糖核蛋白遞送至細胞。舉例而言，Cas酶、連接於tracr配對序列之引導序列及tracr序列可各自可操作地連接於獨立載體上之獨立調節元件。或者，由相同或不同調節元件所表現之元件中之兩者或更多者可組合於單一載體中，並且一或多個額外載體提供不包括於第一載體中之CRISPR系統的任何組分。載體可包含一或多個插入位點，諸如限制性核酸內切酶識別序列(亦稱為「選殖位點」)。在一些態樣中，一或多個插入位點位於一或多個載體之一或多個序列元件上游及/或下游。當使用多個不同引導序列時，可使用單個表現構築體將CRISPR活性靶向至細胞內之多個不同對應目標序列。
載體可包含可操作地連接於編碼CRISPR酶，諸如Cas蛋白質之酶編碼序列的調節元件。Cas蛋白質之非限制性實例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (亦稱為Csn1及Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4，其同系物或其經修飾型式。此等酶為已知的；舉例而言，釀膿鏈球菌( S. pyogenes)Cas9蛋白質之胺基酸序列可以寄存編號Q99ZW2見於SWISSPROT®資料庫中。
CRISPR酶可為Cas9(例如來自釀膿鏈球菌或肺炎鏈球菌( S.pneumonia))。CRISPR酶可在目標序列之位置，諸如在目標序列內及/或在目標序列之互補序列內引導一個或兩個股裂解。載體可編碼相對於相應野生型酶突變之CRISPR酶，使得經突變CRISPR酶不具有裂解含有目標序列之目標聚核苷酸的一個或兩個股的能力。舉例而言，來自釀膿鏈球菌之Cas9之RuvC I催化域中之天冬胺酸至丙胺酸取代(D10A)將Cas9自裂解兩股之核酸酶轉化為切口酶(裂解單股)。在一些態樣中，Cas9切口酶可以與引導序列組合使用，例如兩個引導序列，其分別靶向DNA目標之有義股及反義股。此組合允許兩股被切口且用於誘導NHEJ或HDR。
在一些態樣中，編碼CRISPR酶之酶編碼序列經密碼子最佳化以在特定細胞，諸如真核細胞中表現。真核細胞可為特定生物體之真核細胞或來源於特定生物體，諸如哺乳動物，包括但不限於人類、小鼠、大鼠、兔、犬或非人類靈長類動物。一般而言，密碼子最佳化係指一種修飾核酸序列以增強在相關宿主細胞中之表現的過程，其係藉由用更常或最常用於該宿主細胞之基因中之密碼子置換原生序列之至少一個密碼子，同時維持原生胺基酸序列。各種物種對特定胺基酸之某些密碼子展現出特定傾向。密碼子偏移(生物體之間在密碼子使用方面之差異)通常與信使RNA (mRNA)之翻譯效率相關，咸信信使RNA翻譯效率又尤其依賴於所翻譯之密碼子特性及特定轉移RNA (tRNA)分子之可用性。所選tRNA在細胞中佔優勢一般為肽合成中最常使用的密碼子的反映。因此，為了既定生物體中的最佳基因表現，可基於密碼子最佳化調整基因。
一般而言，引導序列係與目標聚核苷酸序列具有足夠互補性以與目標序列雜交且引導CRISPR複合物與目標序列的序列特異性結合之任何聚核苷酸序列。在一些態樣中，當使用適合的比對算法最佳比對時，引導序列與其相應目標序列之間的互補程度為約或超過約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多。
最佳比對可以使用任何適用於比對序列之算法來確定，其非限制性實例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基於Burrows-Wheeler變換之算法(例如，Burrows Wheeler Aligner)、Clustal W, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies)、ELAND (ILLUMINA®, San Diego, Calif.)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn獲得)及Maq(可在maq.sourceforge.net獲得)。
CRISPR酶可為包含一或多個異源蛋白域之融合蛋白質之一部分。CRISPR酶融合蛋白可包含任何額外蛋白質序列，且視情況包含在任何兩個域之間的連接序列。可與CRISPR酶融合之蛋白質域的實例包括但不限於表位標籤、報導基因序列及具有以下一或多種活性之蛋白質域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、轉錄活化活性、轉錄抑制活性、轉錄釋放因子活性、組蛋白修飾活性、RNA裂解活性及核酸結合活性。表位標籤之非限制性實例包括組胺酸(His)標籤、V5標籤、FLAG標籤、流感血球凝集素(HA)標籤、Myc標籤、VSV-G標籤及硫化還原蛋白(thioredoxin，Trx)標籤。報導基因之實例包括但不限於麩胱甘肽-5-轉移酶(GST)、辣根過氧化酶(HRP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT) β半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、螢光素酶、綠色螢光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、藍色螢光蛋白(CFP)、黃色螢光蛋白(YFP)及包括藍色螢光蛋白(BFP)之自發螢光蛋白。CRISPR酶可與編碼結合DNA分子或結合其他細胞分子之蛋白質或蛋白質片段的基因序列融合，該蛋白質或蛋白質片段包括但不限於麥芽糖結合蛋白(MBP)、S-標籤、Lex A DNA結合域(DBD)融合物、GAL4A DNA結合域融合物及單純疱疹病毒(HSV) BP16蛋白質融合物。可以形成包含CRISPR酶之融合蛋白之一部分的額外域描述於以引用的方式併入本文中之US 20110059502中。 d.     載體
治療性聚核苷酸、蛋白質、核糖核蛋白或肽可由組合物中之核酸分子編碼。在某些態樣中，核酸分子可呈核酸載體形式。
術語「載體」用於指一種載體核酸分子，異源核酸序列可以插入至該載體核酸分子中以引入細胞中，在該細胞中它可以被複製及表現。核酸序列可為「異源的」，此意味著它處於引入載體之細胞或併入之核酸外部的環境中，其包括與細胞或核酸中之序列同源，但位於宿主細胞或核酸內通常未發現的位置之序列。載體包括DNA、RNA、質體、黏質體、病毒(噬菌體、動物病毒及植物病毒)及人工染色體(例如，YAC)。熟習此項技術者將具備經由標準重組技術構築載體之能力(例如Sambrook等人, 2001; Ausubel等人, 1996，均以引用的方式併入本文中)。
術語「表現載體」係指含有編碼至少部分基因產物之核酸序列的載體，該基因產物能夠經轉錄或穩定整合至宿主細胞之基因體中且隨後經轉錄。在某些情況下，然後將核酸分子翻譯成蛋白質、多肽或肽。為了表現聚核苷酸、蛋白質、核糖核蛋白或肽，將編碼聚核苷酸、蛋白質、核糖核蛋白或肽之DNA插入表現載體中，使得基因區域與轉錄及翻譯「控制序列」有效連接。表現載體可以含有多種「控制序列」，其係指可操作地連接之編碼序列在特定宿主生物體中轉錄及可能翻譯所必需的核酸序列。除管控轉錄及翻譯之控制序列以外，載體及表現載體亦可含有發揮其他功能之核酸序列，且在本文描述。
通常，任何宿主細胞中使用的表現載體含有用於質體或病毒保持以及用於外源性核苷酸序列之選殖及表現之序列。此類序列，共同稱為「側接序列」，通常包括以下可操作地連接之核苷酸序列中之一或多者：啟動子、一或多個強化子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體及接受者剪接位點之完全內含子序列、編碼用於多肽分泌之前導序列之序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現之多肽的核酸之多連接子及可選標記物元件。此類序列及其使用方法為此項技術中熟知的。
「啟動子」為控制序列。啟動子通常為核酸序列中控制轉錄起始及速率之區域。其可含有調節蛋白及分子可結合之基因元件，諸如RNA聚合酶及其他轉錄因子。片語「可操作地定位」、「可操作地連接」、「在控制下」及「在轉錄控制下」意謂啟動子相對於核酸序列處於正確的功能位置及/或取向，以控制該序列之轉錄起始及表現。啟動子可或可不與「強化子」(其係指涉及核酸序列之轉錄活化的順式作用調節序列)結合使用。
咸信用於控制編碼肽或蛋白質之聚核苷酸表現的特定啟動子並非關鍵的，只要它能夠在靶細胞，較佳細菌細胞中表現該聚核苷酸。在靶向人類細胞的情況下，較佳將聚核苷酸編碼區定位於能夠在人類細胞中表現之啟動子附近且處於其控制下。一般言之，此類啟動子可包括細菌、人類或病毒啟動子。
亦可需要特定起始信號以高效翻譯編碼序列。此等信號包括ATG起始密碼子或相鄰序列。可能需要提供包括ATG起始密碼子之外源性翻譯控制信號。一般熟習此項技術者將容易地能夠判定此情形且提供必需信號。
載體可包括多選殖位點(MCS)，其為含有多個限制酶位點之核酸區域，其中任一者可與標準重組技術結合使用以消化載體。(參見Carbonelli等人, 1999，Levenson等人, 1998及Cocea, 1997，以引用的方式併入本文中。)
大多數經轉錄真核RNA分子將經歷RNA剪接以自初級轉錄物中移除內含子。含有基因體真核序列之載體可能需要供體及/或接受者剪接位點，以確保正確處理轉錄物從而表現蛋白質。(參見Chandler等人, 1997, 以引用的方式併入本文中。)
載體或構築體將一般包含至少一個終止信號。「終止信號」或「終止子」由涉及RNA聚合酶特異性終止RNA轉錄物之DNA序列構成。因此，在某些態樣中，考慮了終止RNA轉錄物產生之終止信號。活體內可能需要終止子以達成所需訊息物含量。在真核系統中，終止子區域亦可包含允許對新轉錄物進行位點特異性裂解以暴露聚腺苷酸化位點之特異性DNA序列。此向特定的內源聚合酶發出信號，將一段約200個腺苷酸殘基(polyA)添加至轉錄物之3'端。用此polyA尾巴修飾之RNA分子似乎更穩定，翻譯效率更高。因此，在涉及真核生物的其他態樣中，較佳的係終止子包含用於裂解RNA之信號，更佳的係終止子信號促進訊息物之聚腺苷酸化。在基因表現(尤其真核基因表現)中，吾人通常將包括聚腺苷酸化信號以實現轉錄物之適當聚腺苷酸化。
為了在宿主細胞中繁殖載體，載體亦可含有一或多個複製起點位點(通常稱為「ori」)，其未複製起始之特異性核酸序列。或者，若宿主細胞為酵母，則可採用自主複製序列(ARS)。
一些載體可使用允許載體在原核及真核細胞兩者中複製及/或表現的控制序列。熟習此項技術者將進一步瞭解培育所有上文所描述之宿主細胞以對其進行維持且允許複製載體的條件。亦瞭解且已知的為允許大規模生產載體以及生產由載體編碼之核酸及其同源多肽、蛋白質或肽的技術和條件。
電穿孔程序期間載體之濃度可為電穿孔腔室及/或樣品容器中載體之最終濃度。載體濃度可為，可為至少，或可為至多0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、75、100、150、200、250、300至約350、400、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000 μg/mL，或0.01 μg/mL至5000 μg/mL或其中可導出之範圍的任何值。在某些態樣中，載體之濃度為至少10 μg/mL。在其他態樣中，載體之濃度為至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275或300 μg/mL，或1 μg/mL至300 μg/mL或其中可導出之範圍的任何值。
經考慮表現標記物之表現載體可適用於本發明。在其他態樣中，標記物在mRNA上而非表現載體中編碼。
在某些特定態樣中，藉由電穿孔轉染至遞送媒劑中的組合物係非病毒的(即，不含有任何病毒組分)。經考慮非病毒方法可降低毒性及/或改進方法之安全性。 e.      標記物
在某些態樣中，已經用本發明之組合物轉染的細胞、細胞顆粒、脂質囊泡、脂質體、組織或其衍生物可以藉由在組合物中包括標記物而在活體外或活體內鑑別。此類標記物將賦予細胞可鑑別之變化，允許容易地鑑別用該組合物轉染之細胞。
一般而言，可選擇標記物為一種賦予允許選擇之特性的標記物。正向可選擇標記物為標記物之存在允許其選擇的標記物，而負向可選擇標記物為其存在阻止其選擇的標記物。在某些態樣中，在電穿孔之後，選擇已內化電穿孔組合物之遞送媒劑用於負向選擇。在其他態樣中，在電穿孔之後，選擇已內化電穿孔構築體之細胞用於正向選擇。
正向可選擇標記物的一個實例為藥物抗性標記物或抗生素抗性基因/標記物。通常，包括藥物選擇標記物有助於選殖及鑑別轉化體，例如賦予對新黴素、嘌呤黴素、潮黴素、DHFR、GPT、吉歐黴素(zeocin)、G418、腐草黴素(phleomycin)、殺稻瘟菌素(blasticidin)及組胺醇之抗性的基因係有用的可選擇標記物。
在一些態樣中，選擇涉及將細胞暴露於一定濃度的選擇劑，該選擇劑將損害在電穿孔期間不表現選擇抗性基因或吸收選擇抗性基因的細胞之生存力。在一些態樣中，選擇涉及將細胞暴露於條件致死濃度之選擇劑。在某些態樣中，選擇劑或化合物為抗生素。在其他態樣中，選擇劑為單獨或組合的G418(亦稱為遺傳黴素及G418硫酸鹽)、嘌呤黴素、吉歐黴素、潮黴素、腐草黴素或殺稻瘟菌素。在某些態樣中，選擇劑之濃度可為、可為至少或可為至多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500 μg/L、mg/L或g/L，或其中可導出之任何範圍或值。在某些態樣中，選擇劑之濃度在0.1 μg/L至0.5 μg/L、0.5 μg/L至1 μg/L、1 μg/L至2 μg/L、2 μg/L至5 μg/L、5 μg/L至10 μg/L、10 μg/L至100 μg/L、100 μg/L至500 μg/L、0.1 mg/L至0.5 mg/L、0.5 mg/L至1 mg/L、1 mg/L至2 mg/L、2 mg/L至5 mg/L、5 mg/L至10 mg/L、10 mg/L至100 mg/L、100 mg/L至500 mg/L、0.1 g/L至0.5 g/L、0.5 g/L至1 g/L、1 g/L至2 g/L、2 g/L至5 g/L、5 g/L至10 g/L、10 g/L至100 g/L或100 g/L至500 g/L範圍內，或0.1 μg/L至500 g/L或其中可導出之範圍的任何值。在某些態樣中，選擇劑之濃度為(y)g/L，其中『y』可為任何值，包括但不限於0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100，或0.01至100或其中可導出之範圍的任何值。在一些態樣中，選擇劑存在於培養基中之條件致死濃度為至少、至多或約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10 g/L，或0.1至10 g/L或其中可導出之範圍的任何值。
除了賦予允許基於條件之實施識別轉化子之表型的標記物之外，亦考慮其他類型之標記物，包括可篩選標記物，諸如GFP。在某些態樣中，標記物為螢光標記物、酶標記物、發光標記物、光活化標記物、光可轉換標記物或比色標記物。螢光標記物包括例如GFP及變異體，例如YFP、RFP等，以及其他螢光蛋白，例如DsRed、mPlum、mCherry、YPet、翡翠(Emerald)、CyPet、T-藍寶石(Sapphire)及Venus。光可活化標記物包括例如KFP、PA-mRFP及Dronpa。光可轉換標記物包括例如mEosFP、KikGR及PS-CFP2。發光蛋白包括例如Neptune、FP595及phialidin。或者，可採用酶，諸如單純疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)。熟習此項技術者亦會知道如何採用免疫學標記物，可能與FACS分析相結合。可選擇及可篩選標記物之其他實例為熟習此項技術者所熟知。
使用的標記物可以在RNA或DNA上編碼。在一些態樣中，標記物在RNA上編碼。 IV. 實例
包括以下實例以說明本發明之較佳態樣。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術表示由本發明人發現在本發明之實踐中運作良好之技術，且因此可視為構成其實踐之較佳模式。然而，根據本發明，熟習此項技術者應理解，在不偏離本發明之精神及範疇的情況下可對所揭示之特定態樣作出許多改變且仍獲得相同或類似結果。 A.         實例1-用mRNA重複電穿孔擴增之T細胞
圖 35示出了用兩種不同的GFP mRNA濃度(100 μg/mL及200 μg/mL)對擴增之淋巴球進行連續電穿孔之實驗設計。第0天，在用CD3/CD28珠粒擴增3天之後，將5×10 7個T細胞/毫升懸浮於電穿孔(EP)緩衝液中。電穿孔+/-綠色螢光蛋白(GFP) mRNA，且塗鋪細胞。在第1天或第2天，將表現GFP之細胞再懸浮於EP緩衝液中且用GFP第二次電穿孔，且塗鋪細胞。在第1-5天經由Nucleocounter量測細胞生存力，且在第3天及第4天經由流式細胞量測術分析GFP表現。
圖 36展示用GFP mRNA連續電穿孔擴增之淋巴球細胞後3天及4天的流式細胞量測術資料。所有mRNA轉染之細胞均＞95% GFP+。
圖 37A- 圖 37B展示淋巴球閘控及經受連續電穿孔之淋巴球的細胞生存力。如藉由淋巴球百分比及染料排除所評定，連續幾天有或沒有mRNA連續電穿孔對細胞適應性的影響最小。與第0天及第1天的單次EP或連續EP相比，將EP脈衝之間的間隔增加到48小時(第0天及第2天之連續電穿孔)導致細胞適應性略低。
圖 38A展示連續電穿孔之淋巴球之GFP表現且 圖 38B展示連續電穿孔淋巴球之GFP平均螢光強度(MFI)。與單次EP相比，mRNA之連續EP顯著增加了轉基因之表現量及持續時間。 B.          實例2-用mRNA重複電穿孔擴增之T細胞，電穿孔能量的影響
針對本文所述之實驗，術語「能量」係指在施加至樣品之電脈衝(或組合脈衝)期間產生的熱量，且它與電脈衝(或組合脈衝)期間施加至樣品之場強度與脈衝持續時間(或組合脈衝持續時間)兩者成比例。因此，為了向樣品施加「高能量」脈衝，需要修改包括場強度及脈衝持續時間(或組合脈衝持續時間)在內的變數比例，以便在電脈衝(或組合脈衝)期間產生與對樣品施加「中等能量」或「低能量」電脈衝(或組合脈衝)時相比更多的熱量，限制條件為緩衝液組成、處理總成及樣品體積保持不變。相反，為了向樣品施加「低能量」脈衝，需要修改包括場強度及脈衝持續時間(或組合脈衝持續時間)在內的變數比例，以便在電脈衝(或組合脈衝)期間產生與對樣品施加「高能量」或「中等能量」電脈衝(或組合脈衝)時相比更少的熱量，限制條件為緩衝液組成、處理總成及樣品體積保持不變。
圖 39A- 圖 39E示出了在不同EP能量下用兩種不同的GFP mRNA濃度(100 μg/mL及200 μg/mL)連續電穿孔擴增之淋巴球的實驗設計。在 圖 39A中，淋巴球在第0天經受第一次中等能量電脈衝，隨後在第1天經受第二次低能量電脈衝。第0天第一次中等能量電脈衝使用1.5 kV/cm之初始場強度，第1天第二次低能量電脈衝使用1.3 kV/cm之初始場強度。在 圖 39B中，淋巴球在第0天經受第一次中等能量電脈衝，隨後在第1天經受第二次高能量電脈衝。第0天第一次中等能量電脈衝使用1.5 kV/cm之初始場強度，第1天第二次高能量電脈衝使用1.88 kV/cm之初始場強度。在 圖 39C中，淋巴球在第0天經受第一次中等能量電脈衝，隨後在第1天經受第二次中等能量電脈衝。第0天第一次中等能量電脈衝使用1.5 kV/cm之初始場強度，第1天第二次中等能量電脈衝使用1.5 kV/cm之初始場強度。在 圖 39D中，淋巴球在第0天經受第一次高能量電脈衝，隨後在第1天經受第二次低能量電脈衝。第0天第一次高能量電脈衝使用1.88 kV/cm之初始場強度，第1天第二次低能量電脈衝使用1.3 kV/cm之初始場強度。在 圖 39E中，淋巴球在第0天經受第一次高能量電脈衝，隨後在第1天經受第二次中等能量電脈衝。第0天第一次高能量電脈衝使用1.88 kV/cm之初始場強度，第1天第二次中等能量電脈衝使用1.5 kV/cm之初始場強度。
圖 40A- 圖 40B展示在不同EP能量下用兩種不同GFP mRNA濃度(100 μg/mL及200 µg/mL)連續電穿孔擴增之淋巴球之後，在三個不同時間點(24 hr、48 hr及72 hr)表現GFP mRNA的淋巴球群體。
經受第一次中等能量電脈衝之淋巴球細胞群體展示於 圖 40A中(Ex-T細胞2)。淋巴球如 圖 39A所述及所示經受第一次中等能量電脈衝及第二次低能量電脈衝( 圖 40A，Ex-T細胞1)；如 圖 39B所述及所示經受第一次中等能量電脈衝及第二次高能量電脈衝( 圖 40A，Ex-T細胞3)；如 圖 39C所述及所示經受第一次中等能量電脈衝及第二次中等能量電脈衝( 圖 40A，Ex-T細胞2)。
經受第一次高能量電脈衝之淋巴球細胞群體展示於 圖 40B中(Ex-T細胞3)。淋巴球如 圖 39D所述及所示經受第一次高能量電脈衝及第二次低能量電脈衝( 圖 40B，Ex-T細胞1)；如 圖 39E所述及所示經受第一次高能量電脈衝及第二次中等能量電脈衝( 圖 40B，Ex-T細胞2)。
比較細胞經受第一次中等能量電脈衝或第一次高能量電脈衝及第二次低、中等或高能量電脈衝後之淋巴球群體資料，對於 圖 39A- 圖 39E所述及所示的所有五種能量組合，擴增之淋巴球在不同EP能量下連續電穿孔之後，淋巴球恢復係類似的。
圖 41A- 圖 41B展示，對於 圖 39A- 圖 39E所述及所示之所有五種EP能量組合，在不同EP能量下連續電穿孔擴增之淋巴球之後，淋巴球生存力係類似的。
圖 42A- 圖 42B展示在不同EP能量下用兩種不同的GFP mRNA濃度(100 μg/mL及200 μg/mL)連續電穿孔擴增之淋巴球之後，在三個不同時間點(24 hr、48 hr及72 hr)之淋巴球的GFP表現。
經受第一次中等能量電脈衝之淋巴球的GFP表現展示於 圖 42A中(Ex-T細胞2)。 圖 42A提供了經受第一次中等能量電脈衝及第二次低能量電脈衝之淋巴球的GFP表現(Ex-T細胞1)，如 圖 39A所述及所示。 圖 42A提供了經受第一次中等能量電脈衝及第二次高能量電脈衝之淋巴球的GFP表現(Ex-T細胞3)，如 圖 39B所述及所示。最後， 圖 42A提供了經受第一次中等能量電脈衝及第二次中等能量電脈衝之淋巴球的GFP表現(Ex-T細胞2)，如 圖 39C所述及所示。
經受第一次高能量電脈衝之淋巴球的GFP表現展示於 圖 42B中(Ex-T細胞3)。 圖 42B提供了經受第一次高能量電脈衝及第二次低能量電脈衝之淋巴球的GFP表現(Ex-T細胞1)，如 圖 39D所述及所示。 圖 42B亦提供經受第一次高能量電脈衝及第二次中等能量電脈衝之淋巴球的GFP表現(Ex-T細胞2)，如 圖 39E所述及所示。
比較細胞經受第一次中等能量電脈衝或第一次高能量電脈衝及第二次低、中等或高能量電脈衝後之淋巴球的GFP表現，對於 圖 39A- 圖 39E所述及所示的所有五種EP能量組合，擴增之淋巴球在不同EP能量下連續電穿孔之後，GFP表現係類似的。
圖 43A- 圖 43B展示在不同EP能量下用兩種不同GFP mRNA濃度(100 μg/mL及200 µg/mL)連續電穿孔擴增之淋巴球之後，在三個不同時間點(24 hr、48 hr及72 hr)淋巴球之GFP平均螢光強度(MFI)。
經受第一次中等能量電脈衝之淋巴球的GFP MFI展示於 圖 43A中(Ex-T細胞2)。 圖 43A提供經受第一次中等能量電脈衝及第二次低能量電脈衝之淋巴球的GFP MFI(Ex-T細胞1)，如 圖 39A所描述及所示。 圖 43A亦提供經受第一次中等能量電脈衝及第二次高能量電脈衝之淋巴球的GFP MFI(Ex-T細胞3)，如 圖 39B所描述及所示。最後， 圖 43A提供經受第一次中等能量電脈衝及第二次中等能量電脈衝之淋巴球的GFP MFI(Ex-T細胞2)，如 圖 39C所描述及所示。
經受第一次高能量電脈衝之淋巴球的GFP MFI展示於 圖 43B中(Ex-T細胞3)。 圖 43B亦提供經受第一次高能量電脈衝及第二次低能量電脈衝之淋巴球的GFP MFI(Ex-T細胞1)，如 圖 39D所描述及所示。 圖 43B亦提供經受第一次高能量電脈衝及第二次中等能量電脈衝之淋巴球的GFP MFI(Ex-T細胞2)，如 圖 39E所描述及所示。在經受第一次高能量電脈衝之淋巴球中觀察到更高MFI。
此等資料顯示，與單次電穿孔相比，連續幾天用mRNA重複電穿孔細胞導致顯著更高之轉基因表現。可以使用所描述之能量電脈衝排列連續電穿孔活化之T細胞，因為對於各種能量電脈衝排列，淋巴球群體、細胞生存力及GFP表現之間沒有重大差異。 C.         實例3-活化之T細胞之重複電穿孔及連續基因編輯
圖 44示出了用兩種不同核糖核蛋白(RNP)構築體連續電穿孔活化之T細胞以剔除TRAC及PD1之實驗設計。如 圖 44A及 44B中所示，將PBMC解凍，且在第0天藉由用100 IU/mL IL2、10 ng/mL IL-7及5 ng/mL IL-15以及1: 2.5細胞/珠粒之比率的抗CD3/CD28結合磁性珠粒培養2×10 6個細胞/mL兩天來活化T細胞。 圖 45展示在與細胞因子及CD3/CD28珠粒一起培育2天後，藉由螢光活化細胞分選(FACS)量測CD3 +及CD25 +染色之T細胞的活化。
在活化兩天後，在第2天，洗滌1x10 8個T細胞/mL，懸浮於電穿孔緩衝液中，50 μL總反應體積(5×10 6個細胞)，且用來自30.5 µM之TRAC核糖核蛋白(RNP)儲備液的2 µM TRAC RNP電穿孔，該儲備液包含藉由將61 µM野生型Cas9 (GENSCRIPT®)與122 µM TRAC sgRNA(SYNTHEGO®)混合製備之1:2 Cas9:sgRNA。第2天之第一次高能量電穿孔使用初始場強度為1.7 kV/cm之電脈衝(T細胞3方案)。電穿孔以剔除TRAC後，T細胞在37℃、5% CO 2下恢復20分鐘。然後，將2×10 6個電穿孔之T細胞/mL培養24小時，然後添加100 IU/mL IL2、10 ng/mL IL-7及5 ng/mL IL-15。亦測試無靜止條件，其中電穿孔以剔除TRAC後，細胞在37℃、5% CO 2下並非靜止20分鐘，取而代之立即轉移培養24小時。
第3天，洗滌4×10 7個T細胞/mL，懸浮於電穿孔緩衝液中，50 μL總反應體積(2×10 6個細胞)，且用來自30.5 µM之PD1核糖核蛋白(RNP)儲備液的2 µM PD1 RNP電穿孔，該儲備液包含藉由將61 µM野生型Cas9 (GENSCRIPT®)與122 µM PD1 sgRNA(SYNTHEGO®)混合製備之1:2 Cas9:sgRNA。第3天之第二次中等能量電穿孔使用初始場強度為1.5 kV/cm之電脈衝(T細胞2方案)。電穿孔以剔除PD1後，T細胞在37℃、5% CO 2下恢復20分鐘。隨後，將2×10 6個電穿孔之T細胞/毫升培養24小時，其後添加100 IU/mL IL2、10 ng/mL IL-7及5 ng/mL IL-15，且以1: 2.5細胞/珠粒之比率用CD3/CD28珠粒再刺激細胞。
實驗對照包括經活化但未進行電穿孔之T細胞及在第2天經受使用1.7 kV/cm初始場強度電脈衝(T細胞3方案)之第一次高能量電穿孔且沒有RNP或另一藥劑的活化之T細胞。
在第6天，電穿孔後四天進行TRAC剔除且電穿孔後三天進行PD1剔除，添加100 IU/mL IL2、10 ng/mL IL-7及5 ng/mL IL-15，且進行FACS以評定超過30000個收集事件之TRAC及PD1剔除效率。 圖 46A展示用於未染色T細胞之代表性閘控。 圖 46B展示用於TRAC+及PD1+T細胞之代表性閘控，該等實驗中T細胞沒有用RNP電穿孔以剔除TRAC及PD1。 圖 46C展示用於TRAC+及PD1+T細胞之代表性閘控，該等實驗中T細胞用RNP電穿孔以剔除TRAC及PD1。定量在第6天針對 圖 44A- 圖 44B中所描述的每種電穿孔條件獲得之FACS資料以展示 圖 46D中之T細胞群體相對於T細胞生存力及 圖 46E中之TRAC及PD1剔除效率。 如圖 46D所示，T細胞生存力受連續電穿孔以連續編輯細胞的影響最小，因為在第一次與第二次電穿孔事件後的細胞生存力與未進行電穿孔之對照相似。 如圖 46E所示，兩種不同RNP之連續電穿孔可以產生TRAC及PD1基因座之高剔除效率，在RNP電穿孔後TRAC與PD1表現均降低至不到5%。此外，如 圖 46F所示，與在電穿孔之後在37℃，5% CO 2下不靜止20分鐘取而代之立即轉移培養24小時的TRAC RNP-電穿孔之T細胞相比，允許TRAC RNP-電穿孔之T細胞在電穿孔之後在37℃，5% CO 2下靜止20分鐘然後培養24小時不增加TRAC剔除效率。
亦在第6天進行FACS，以量測來自30 μL所培養細胞之總細胞及淋巴球計數，以評定用RNP構築體電穿孔以剔除TRAC之後在37℃、5% CO 2下20分鐘細胞靜止期對細胞生存力的影響。未染色及活/死的7-胺基放線菌素D(7-AAD)染色之T細胞的閘控展示於 圖 47A中。如 圖 47B-47E中所示，淋巴球群體( 圖 47B)、淋巴細胞生存力( 圖 47C)、總細胞計數( 圖 47D)及總存活淋巴球計數( 圖 47E)亦受到最小影響，其中與T細胞在電穿孔之後在37℃、5% CO 2下靜止20分鐘相比，無靜止條件下之活淋巴球計數少約5%。 * * *
以上說明書及實例提供對說明性態樣之結構及用途的完整描述。儘管上面已經以某種程度之特殊性或參考一或多個單獨態樣描述了某些態樣，但是熟習此項技術者可以對所揭示之態樣進行許多改變而不脫離本發明之範疇。因此，方法及系統的各種說明性態樣不旨在限於所揭示之特定形式。相反，它們包括落入申請專利範圍之範疇的所有修改及替代方案，並且除了所示態樣之外的態樣可以包括所描繪態樣之一些或全部特徵。舉例而言，元件可經忽略或組合為單式結構及/或連接件可經取代。此外，在適當的情況下，上述任何實例之態樣可以與所描述之任何其他實例的態樣結合以形成具有類似或不同特性及/或功能且解決相同或不同問題之其他實例。類似地，應理解上述益處及優點可能係關於一個態樣或可能係關於若干態樣。
申請專利範圍不旨在包括，且不應解釋為包括，手段加-或步驟-加-功能限制，除非在給定的申請專利範圍中分別使用片語「手段用於」或「步驟用於」。
100:處理總成 102:殼體 104:蓋子 106:開口 108:腔室 109:連接件 110:鉸接連接件 111:連接件 112:波狀表面 120:電極匯流排 122:左把手 124:右把手 125:插銷 128:鍍金塑膠薄膜 130:成框墊圈/墊圈 140:裝置標記 141:寫入空間 144:負載裝置 160:托盤 162:槽 164:位置 166:支腳 170:墊圈 172:孔 200:多孔處理總成 202:殼體 204:蓋子 205:基座 206:開口 208:腔室 220:鋁電極匯流排 222:左把手 224:右把手 225:插銷 228:鍍金塑膠薄膜 260:托盤 261:托盤 262:托盤 270:蓋板或蓋子閉合件 280:多孔機架/機架 300:電穿孔系統 320:銜接台 322:蓋子 324:埠 326:電觸點 450:袋子 452:出口 453:連接器 460:袋子 462:下表面 464:連接器 466:出口 470:袋子 472:上部腔室 474:下部腔室 476:連接器 478:出口 800:控制器 804:儲存裝置/非暫時性電腦可讀取媒體 808:處理器 900:本發明方法的態樣 904:步驟 908:步驟 912:步驟 916:步驟
以下圖式形成本說明書之一部分且包括以進一步展現本發明之某些態樣。參考此等圖式中之一或多者，結合本文中呈現之特定態樣之詳細描述，可更好地理解本發明。
圖 1示出與本發明之態樣一致的處於閉合位置之電穿孔處理總成之左側、頂部透視圖；
圖 2示出與本發明之態樣一致的處於開啟位置之 圖 1之處理總成之左側、頂部透視圖；
圖 3示出與本發明之態樣一致的處於開啟位置之 圖 1之處理總成之背面、頂部、右側透視圖；
圖 4示出與本發明之態樣一致的處於開啟位置之 圖 1之處理總成之背面、頂部、右側透視圖；
圖 5示出與本發明之態樣一致的 圖 4之處理總成之分解透視圖；
圖 6示出與本發明之態樣一致的 圖 4之處理總成之分解透視圖；
圖 7示出與本發明之態樣一致的具有標記之 圖 1之處理總成之頂部、右側透視圖；
圖 8示出與本發明之態樣一致的具有標記之 圖 1之處理總成之頂部、左側透視圖；
圖 9示出與本發明之態樣一致的 圖 1之處理總成之頂部、右側透視圖，其中插入負載裝置；
圖 10示出了與本發明之態樣一致的 圖 9之處理總成之頂部、右側透視圖，其中自視圖中移除部分處理總成；
圖 11示出了與本發明之態樣一致的保持電穿孔處理總成之托盤之頂部右側透視圖；
圖 12示出了與本發明之態樣一致的保持電穿孔處理總成之托盤之正視圖；
圖 13示出了與本發明之態樣一致的保持電穿孔處理總成之托盤之頂部右側透視圖；
圖 14示出了與本發明之態樣一致的複數個墊圈的正視圖；
圖 15示出了與本發明之態樣一致的一批墊圈之俯視圖及一個墊圈之正視圖；
圖 16示出了與本發明之態樣一致的袋子及處理設備的正視圖；
圖 17示出了與本發明之態樣一致的墊圈之正視圖；
圖 18示出與本發明之態樣一致的處於閉合位置之另一電穿孔處理總成的右側、頂部透視圖；
圖 19示出與本發明之態樣一致的處於開啟位置之 圖 18之處理總成之右側、頂部透視圖；
圖 20示出與本發明之態樣一致的 圖 18之處理總成之分解透視圖；
圖 21示出了與本發明之態樣一致的保持複數個電穿孔處理總成之托盤；
圖 22示出了與本發明之態樣一致的電穿孔處理總成；
圖 23示出了與本發明之態樣一致的保持複數個電穿孔處理總成之托盤；
圖 24示出了與本發明之態樣一致的保持複數個電穿孔處理總成之托盤；
圖 25示出了與本發明之態樣一致的保持複數個電穿孔處理總成之機架；
圖 26示出了與本發明之態樣一致的保持複數個電穿孔處理總成之機架；
圖 27示出了與本發明之態樣一致的電穿孔系統；
圖 28示出了與本發明之態樣一致的處於開啟位置之銜接台，其中移除了電穿孔處理總成；
圖 29示出了與本發明之態樣一致的處於開啟位置之 圖 28之銜接台，其中插入處理總成；
圖 30示出了與本發明之態樣一致的處於閉合位置之 圖 28 之銜接台，其中插入處理總成；
圖 31示出了與本發明之態樣一致的處於開啟位置、閉合位置及連接至電穿孔系統的銜接台；
圖 32示出了與本發明之態樣一致的連接至電穿孔系統的銜接台；
圖 33示出了與本發明之態樣一致的電穿孔裝置、處理總成、銜接台、托盤及填充設備；
圖 34A- 圖 34C示出了與本發明之態樣一致的用於遞送至電穿孔系統之例示性容器。
圖 35示出了用兩種不同的GFP mRNA濃度(100 μg/mL及200 μg/mL)對擴增之淋巴球進行連續電穿孔之實驗設計。
圖 36展示用GFP mRNA連續電穿孔擴增之淋巴球後3天及4天的流式細胞量測術資料。
圖 37A- 圖 37B展示淋巴球閘控及經受連續電穿孔之淋巴球的生存力。
圖 38A- 圖 38B展示經連續電穿孔之淋巴球的GFP表現及GFP平均螢光強度(MFI)。
圖 39A- 圖 39E示出了在不同電穿孔能量下用兩種不同的GFP mRNA濃度(100 μg/mL及200 μg/mL)連續電穿孔擴增之淋巴球之實驗設計。
圖 40A- 圖 40B展示在不同電穿孔(EP)能量下用兩種不同GFP mRNA濃度(100 μg/mL及200 µg/mL)連續電穿孔擴增之淋巴球之後，在三個不同時間點(24 hr、48 hr及72 hr)表現GFP mRNA的淋巴球群體。
圖 41A- 圖 41B展示，對於 圖 39A- 圖 39E中所示之所有四種能量組合，在不同電穿孔(EP)能量下連續電穿孔擴增之淋巴球之後，淋巴球生存力係類似的。
圖 42A- 圖 42B展示在不同電穿孔(EP)能量下用兩種不同的GFP mRNA濃度(100 μg/mL及200 μg/mL)連續電穿孔擴增之淋巴球之後，在三個不同時間點(24 hr、48 hr及72 hr)之淋巴球的GFP表現。
圖 43A- 圖 43B展示在不同電穿孔(EP)能量下用兩種不同GFP mRNA濃度(100 μg/mL及200 µg/mL)連續電穿孔擴增之淋巴球之後，在三個不同時間點(24 hr、48 hr及72 hr)淋巴球之GFP平均螢光強度(MFI)。
圖 44A- 圖 44B示出了用兩種不同核糖核蛋白(RNP)構築體連續電穿孔活化之T細胞以剔除TRAC及PD1的實驗設計，包括細胞培養( 圖 44A)及電穿孔( 圖 44B)條件。
圖 45展示在與細胞介素一起培育2天後T細胞之活化。
圖 46A- 圖 46F展示量測淋巴球中TRAC及PD1剔除效率的FACS閘控策略。
圖 47A- 圖 47E展示在用RNP構築體電穿孔以剔除TRAC之後量測總細胞及淋巴球計數的FACS閘控策略。
圖 48為本發明電穿孔系統之一個態樣的示意圖。
圖 49描繪了用於使樣品經受兩次或更多次電脈衝之本發明方法之態樣，其可以使用 圖 48的電穿孔系統來實施。

Claims (172)

  1. 一種電穿孔方法，其包含： 使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；及 使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間； 其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
  2. 一種電穿孔方法，其包含： 使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間； 允許該樣品恢復至少24小時；及 使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間。
  3. 一種電穿孔方法，其包含： 使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間； 允許該樣品恢復至少24小時；及 使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間； 其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
  4. 一種連續編輯細胞基因之方法，其包含： 使包含一或多個完整細胞之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞負載第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間；及 使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞負載第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間； 其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
  5. 一種連續編輯細胞基因之方法，其包含： 使包含一或多個完整細胞之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞負載第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間； 允許該樣品恢復至少24小時；及 使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞負載第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間。
  6. 一種連續編輯細胞基因之方法，其包含： 使包含一或多個完整細胞之樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使該等細胞負載第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間； 允許該樣品恢復至少24小時；及 使該樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使該等細胞負載第二藥劑之第二場強度及第二脈衝持續時間； 其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該第一及第二藥劑為相同藥劑。
  8. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該第一及第二藥劑為不同藥劑。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該等第一及第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。
  10. 如請求項9之方法，其中該核酸為RNA，且其中該RNA為mRNA、miRNA、shRNA、siRNA或反義寡核苷酸。
  11. 如請求項9之方法，其中該核酸為DNA，且其中該DNA為反義寡核苷酸、載體或雙義線性DNA。
  12. 如請求項9之方法，其中該蛋白質為核糖核蛋白。
  13. 如請求項12之方法，其中該核糖核蛋白包含Cas9蛋白及引導RNA。
  14. 一種電穿孔方法，其包含： (a)    使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使細胞負載包含RNA之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間； (b)    允許該細胞樣品恢復至少24小時；及 (c)    使該細胞樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使細胞負載包含RNA之第二藥劑的第二場強度及第二脈衝持續時間； 其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
  15. 一種電穿孔方法，其包含： (a)    使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使細胞負載包含DNA之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間； (b)    允許該細胞樣品恢復至少24小時；及 (c)    使該細胞樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使細胞負載包含DNA之第二藥劑的第二場強度及第二脈衝持續時間； 其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
  16. 一種電穿孔方法，其包含： (a)    使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使細胞負載包含一或多種蛋白質之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間； (b)    允許該細胞樣品恢復至少24小時；及 (c)    使該細胞樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使細胞負載包含一或多種蛋白質之第二藥劑的第二場強度及第二脈衝持續時間； 其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
  17. 一種連續編輯細胞之方法，其包含： (a)    使包含一或多個完整細胞之細胞樣品經受第一電脈衝，該第一電脈衝具有足以根據第一方案使細胞負載包含核糖核蛋白之第一藥劑的第一場強度及第一脈衝持續時間； (b)    允許該細胞樣品恢復至少24小時；及 (c)    使該細胞樣品經受第二電脈衝，該第二電脈衝具有足以根據第二方案使細胞負載包含核糖核蛋白之第二藥劑的第二場強度及第二脈衝持續時間； 其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
  18. 如請求項14至17中任一項之方法，其中該第一及第二藥劑為相同藥劑。
  19. 如請求項14至17中任一項之方法，其中該第一及第二藥劑為不同藥劑。
  20. 如請求項14至19中任一項之方法，其中該等第一及第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。
  21. 如請求項20之方法，其中該核酸為RNA，且其中該RNA為mRNA、miRNA、shRNA、siRNA或反義寡核苷酸。
  22. 如請求項20之方法，其中該核酸為DNA，且其中該DNA為反義寡核苷酸、載體或雙義線性DNA。
  23. 如請求項20之方法，其中該蛋白質為核糖核蛋白。
  24. 如請求項23之方法，其中該核糖核蛋白包含Cas9蛋白及引導RNA。
  25. 如請求項1至24中任一項之方法，其進一步包含在該等第一及/或第二電脈衝之後的靜止步驟。
  26. 如請求項25之方法，其中該靜止步驟包含培育該樣品10-30分鐘。
  27. 如請求項25或請求項26之方法，其中該靜止步驟包含在25-50℃培育該樣品。
  28. 如請求項25至27中任一項之方法，其中該靜止步驟包含以3-8% CO 2培育該樣品。
  29. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該樣品在該等第一及/或第二電脈衝之後不經靜止步驟。
  30. 如請求項1至29中任一項之方法，其中該第一場強度等於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。
  31. 如請求項1至29中任一項之方法，其中該第一場強度等於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。
  32. 如請求項1至29中任一項之方法，其中該第一場強度小於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間等於該第二脈衝持續時間。
  33. 如請求項1至29中任一項之方法，其中該第一場強度大於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間等於該第二脈衝持續時間。
  34. 如請求項1至29中任一項之方法，其中該第一場強度小於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。
  35. 如請求項1至29中任一項之方法，其中該第一場強度大於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。
  36. 如請求項1至29中任一項之方法，其中該第一場強度小於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。
  37. 如請求項1至29中任一項之方法，其中該第一場強度大於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。
  38. 如請求項1至37中任一項之方法，其中該第一場強度及第一脈衝持續時間產生第一總施加電能且該第二場強度及第二脈衝持續時間產生第二總施加電能，且其中該第一總施加電能不同於該第二總施加電能。
  39. 如請求項38之方法，其中該第一總施加電能大於該第二總施加電能。
  40. 如請求項1至39中任一項之方法，其中該等第一及第二電脈衝之第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數。
  41. 如請求項40之方法，其中該等電脈衝之電壓量值係介於0.001伏與10,000伏、0.01伏與10,000伏、0.1伏與10,000伏、1伏與10,000伏、1伏與9,000伏、1伏與8,000伏、1伏與7,000伏、1伏與6,000伏、1伏與5,000伏、1伏與4,000伏、1伏與3,000伏、1伏與2,000伏之間，或1伏與1,000伏之間。
  42. 如請求項40或請求項41之方法，其中該等電脈衝之電壓量值係在100伏與900伏之間。
  43. 如請求項40至42中任一項之方法，其中該樣品之導電率為包含電穿孔緩衝液之離子組成、欲負載至該等細胞中的藥劑之濃度、細胞密度、溫度及壓力之參數的函數。
  44. 如請求項40至43中任一項之方法，其中該樣品之導電率係介於0.01西門子/公尺(Siemens/meter)與10西門子/公尺、0.01西門子/公尺與1西門子/公尺、0.1西門子/公尺與10西門子/公尺、0.1西門子/公尺與1西門子/公尺或1西門子/公尺與10西門子/公尺之間。
  45. 如請求項40至44中任一項之方法，其中該樣品之導電率係介於1.0西門子/公尺與3.0西門子/公尺之間。
  46. 如請求項40至45中任一項之方法，其中該等第一及第二場強度進一步為電穿孔腔室之幾何的函數。
  47. 如請求項46之方法，其中該電穿孔腔室包含介於0.001 cm與10 cm、0.001 cm與1 cm、0.01 cm與10 cm、0.01 cm與1 cm、0.1 cm與10 cm、0.1 cm與1 cm或1 cm與10 cm之間的電極間隙。
  48. 如請求項46或請求項47之方法，其中該電穿孔腔室包含介於0.01 cm與1 cm之間的電極間隙。
  49. 如請求項1至48中任一項之方法，其中該等第一及第二電脈衝之第一及第二場強度係介於0.01 kV/cm與10 kV/cm、0.01 kV/cm與1 kV/cm、0.1 kV/cm與10 kV/cm、0.1 kV/cm與1 kV/cm或1 kV/cm與10 kV/cm之間。
  50. 如請求項1至49中任一項之方法，其中該等第一及第二電脈衝之第一及第二場強度係介於0.3 kV/cm與3 kV/cm之間。
  51. 如請求項1至50中任一項之方法，其中該等第一及第二電脈衝之第一及第二脈衝持續時間係介於10 -6秒與10秒、10 -6秒與1秒、10 -3秒與10秒或10 -3秒與1秒之間。
  52. 如請求項1至51中任一項之方法，其中該等第一及第二電脈衝之第一及第二脈衝持續時間係介於1微秒與100毫秒之間。
  53. 如請求項1至52中任一項之方法，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵。
  54. 如請求項53之方法，其中該脈衝數目係介於1個脈衝與1000個脈衝、1個脈衝與900個脈衝、1個脈衝與800個脈衝、1個脈衝與700個脈衝、1個脈衝與600個脈衝、1個脈衝與500個脈衝、1個脈衝與400個脈衝、1個脈衝與300個脈衝、1個脈衝與200個脈衝、1個脈衝與100個脈衝、1個脈衝與90個脈衝、1個脈衝與80個脈衝、1個脈衝與70個脈衝、1個脈衝與60個脈衝、1個脈衝與50個脈衝、1個脈衝與40個脈衝、1個脈衝與30個脈衝、1個脈衝與20個脈衝或1個脈衝與10個脈衝之間。
  55. 如請求項53或請求項54之方法，其中該脈衝數目係介於1個脈衝與130個脈衝之間。
  56. 如請求項53至55中任一項之方法，其中該脈衝寬度為指數衰減速率之函數。
  57. 如請求項56之方法，其中該指數衰減速率為該樣品之電阻及用於實現電穿孔的電源之電容之函數。
  58. 如請求項57之方法，其中該樣品之電阻係介於1歐姆與10000歐姆、1歐姆與9000歐姆、1歐姆與8000歐姆、1歐姆與7000歐姆、1歐姆與6000歐姆、1歐姆與5000歐姆、1歐姆與4000歐姆、1歐姆與3000歐姆、1歐姆與2000歐姆、1歐姆與1000歐姆、1歐姆與900歐姆、1歐姆與800歐姆、1歐姆與700歐姆、1歐姆與600歐姆、1歐姆與500歐姆、1歐姆與400歐姆、1歐姆與300歐姆、1歐姆與200歐姆、1歐姆與100歐姆、1歐姆與90歐姆、1歐姆與80歐姆、1歐姆與70歐姆、1歐姆與60歐姆、1歐姆與50歐姆、1歐姆與40歐姆、1歐姆與30歐姆、1歐姆與20歐姆，或1歐姆與10歐姆之間。
  59. 如請求項57或請求項58之方法，其中該樣品之電阻係介於1歐姆與1000歐姆之間。
  60. 如請求項57至59中任一項之方法，其中該電源電容係介於1 μF與1,000,000 μF、1 μF與100,000 μF、1 μF與10,000 μF、1 μF與1,000 μF或1 μF與100 μF之間。
  61. 如請求項57至60中任一項之方法，其中該電源電容係介於1000 μF與5000 μF之間。
  62. 如請求項53至61中任一項之方法，其中該脈衝形狀為方波脈衝或指數衰減波脈衝。
  63. 如請求項53至62中任一項之方法，其中該脈衝模式包含對應於該第一脈衝或該第二脈衝之持續時間的單個脈衝。
  64. 如請求項53至62中任一項之方法，其中該脈衝模式包含多個脈衝，其中該多個脈衝之組合持續時間對應於該第一脈衝或該第二脈衝之持續時間。
  65. 如請求項53至64中任一項之方法，其中該等第一及第二電脈衝之極性為正或負。
  66. 如請求項1至65中任一項之方法，其中在該樣品經受該第一脈衝之後至少12小時至至少48小時該樣品經受該第二電脈衝。
  67. 如請求項66之方法，其中在該樣品經受該第一脈衝之後至少24小時該樣品經受該第二電脈衝。
  68. 如請求項1至67中任一項之方法，其中該方法係藉由電穿孔系統進行，該電穿孔系統具有包含指令之非暫時性電腦可讀取媒體，當該等指令由處理器執行時使得該處理器執行該等第一及第二方案以對該樣品進行電穿孔。
  69. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該電穿孔系統包含流動電穿孔設備，且其中在該樣品在該流動電穿孔設備內流動的同時，該樣品經受該等電脈衝。
  70. 如請求項1至69中任一項之方法，其中該等細胞為哺乳動物細胞。
  71. 如請求項70之方法，其中該等細胞為人類細胞、鼠類細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞或靈長類動物細胞。
  72. 如請求項70或請求項71之方法，其中該等細胞為初細胞(primary cells)。
  73. 如請求項70至72中任一項之方法，其中該等細胞為經培養細胞。
  74. 如請求項73之方法，其中該等經培養細胞為經培養細胞株。
  75. 如請求項74之方法，其中該等經培養細胞株包含3T3、697、10T½、1321N1、A549、AHR77、B-LCL、B16、B65、Ba/F3、BHK、C2C12、C6、CaCo-2、CAP、CaSki、ChaGo-K-1、CHO、COS、DG75、DLD-1、EL4、H1299、HaCaT、HAP1、HCT116、HEK、HeLa、HepG2、HL60、HOS、HT1080、HT29、Huh-7、HUVEC、INS-1/GRINCH、Jurkat、K46、K562、KG1、KHYG-1、L5278Y、L6、LNCaP、LS180、MCF7、MDA-MB-231、ME-180、MG-63、Min-6、MOLT4、Nalm6、ND7/23、Neuro2a、NK92、NS/0、P3U1、Panc-1、PC-3、PC12、PER.C6、PM1、Ramos、RAW 264.7、RBL、Renca、RLE、SH-SY5Y、SK-BR-3、SK-MES -1、SK-N-SH、SK-OV-3、SP2/0、SW403、THP-1、U2OS、U937、Vero、YB2/0，或其衍生物。
  76. 如請求項70至74中任一項之方法，其中該等細胞包含脂肪細胞、軟骨細胞、內皮細胞、上皮細胞、纖維母細胞、肝細胞、角質細胞、肌細胞、神經元、骨細胞、周邊血液單核細胞(PBMC)、脾細胞、幹細胞或胸腺細胞。
  77. 如請求項76之方法，其中該等PBMC為周邊血液淋巴球(PBL)。
  78. 如請求項77之方法，其中該等PBL為自然殺手(NK)細胞、T細胞或B細胞。
  79. 如請求項76之方法，其中該等PBMC為單核球。
  80. 如請求項79之方法，其中該等單核球為巨噬細胞或樹突狀細胞。
  81. 如請求項80之方法，其中該等巨噬細胞為微神經膠質細胞。
  82. 如請求項76之方法，其中該等幹細胞為脂肪幹細胞、胚胎幹細胞、造血幹細胞、誘導性富潛能幹細胞、間葉幹細胞或神經幹細胞。
  83. 如請求項1至82中任一項之方法，其中該藥劑之負載效率為至少50%、60%、70%、80%或90%。
  84. 如請求項1至83中任一項之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少50%。
  85. 如請求項1至84中任一項之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少60%。
  86. 如請求項1至85中任一項之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少70%。
  87. 如請求項1至86中任一項之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少80%。
  88. 如請求項1至87中任一項之方法，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少90%。
  89. 如請求項1至88中任一項之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至96小時為大約50%至90%存活。
  90. 如請求項89之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至72小時為大約50%至90%存活。
  91. 如請求項89之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至48小時為大約50%至90%存活。
  92. 如請求項89之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後24小時為大約50%至90%存活。
  93. 如請求項1至89中任一項之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至96小時為大約60%至90%存活。
  94. 如請求項93之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至72小時為大約60%至90%存活。
  95. 如請求項93之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12小時至48小時為大約60%至90%存活。
  96. 如請求項93之方法，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後24小時為大約60%至90%存活。
  97. 一種使用如請求項1至96中任一項之方法產生之電穿孔細胞、細胞顆粒或脂質囊泡。
  98. 一種電穿孔系統，其具有包含指令之非暫時性電腦可讀取媒體，當該等指令由處理器執行時使得該處理器： 選擇與具有第一場強度及第一脈衝持續時間之第一電脈衝相關的第一方案； 使包含一或多個完整細胞、細胞顆粒或脂質囊泡之樣品經受該第一方案所定義足以根據該第一方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載第一藥劑的該第一電脈衝； 選擇與具有第二場強度及第二脈衝持續時間之第二電脈衝相關的第二方案；及 使該樣品經受該第二方案所定義足以根據該第二方案使該等細胞、細胞顆粒或脂質囊泡負載第二藥劑的該第二電脈衝； 其中該第一場強度及/或該第一脈衝持續時間不同於該第二場強度及/或第二脈衝持續時間。
  99. 如請求項98之電穿孔系統，其中該第一場強度等於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。
  100. 如請求項98之電穿孔系統，其中該第一場強度等於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。
  101. 如請求項98之電穿孔系統，其中該第一場強度小於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間等於該第二脈衝持續時間。
  102. 如請求項98之電穿孔系統，其中該第一場強度大於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間等於該第二脈衝持續時間。
  103. 如請求項98之電穿孔系統，其中該第一場強度小於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。
  104. 如請求項98之電穿孔系統，其中該第一場強度大於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間長於該第二脈衝持續時間。
  105. 如請求項98之電穿孔系統，其中該第一場強度小於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。
  106. 如請求項98之電穿孔系統，其中該第一場強度大於該第二場強度，且其中該第一脈衝持續時間短於該第二脈衝持續時間。
  107. 如請求項98至106中任一項之電穿孔系統，其中該第一場強度及第一脈衝持續時間產生第一總施加電能且該第二場強度及第二脈衝持續時間產生第二總施加電能，且其中該第一總施加電能不同於該第二總施加電能。
  108. 如請求項107之電穿孔系統，其中該第一總施加電能大於該第二總施加電能。
  109. 如請求項98至108中任一項之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之該等第一及第二場強度為該等電脈衝之電壓量值、該等電脈衝之持續時間及該樣品之導電率的函數。
  110. 如請求項109之電穿孔系統，其中該等電脈衝之電壓量值係介於0.001伏與10,000伏、0.01伏與10,000伏、0.1伏與10,000伏、1伏與10,000伏、1伏與9,000伏、1伏與8,000伏、1伏與7,000伏、1伏與6,000伏、1伏與5,000伏、1伏與4,000伏、1伏與3,000伏、1伏與2,000伏之間，或1伏與1,000伏之間。
  111. 如請求項109或請求項110之電穿孔系統，其中該等電脈衝之電壓量值係在100伏與900伏之間。
  112. 如請求項109至111中任一項之電穿孔系統，其中該樣品之導電率為包含電穿孔緩衝液之離子組成、欲負載至該等細胞中的藥劑之濃度、細胞密度、溫度及壓力之參數的函數。
  113. 如請求項109至111中任一項之電穿孔系統，其中該樣品之導電率係介於0.01西門子/公尺與10西門子/公尺、0.01西門子/公尺與1西門子/公尺、0.1西門子/公尺與10西門子/公尺、0.1西門子/公尺與1西門子/公尺或1西門子/公尺與10西門子/公尺之間。
  114. 如請求項109至113中任一項之電穿孔系統，其中該樣品之導電率係介於1.0西門子/公尺與3.0西門子/公尺之間。
  115. 如請求項109至114中任一項之電穿孔系統，其中該等第一及第二場強度進一步為電穿孔腔室之幾何的函數。
  116. 如請求項115之電穿孔系統，其中該電穿孔腔室包含介於0.001 cm與10 cm、0.001 cm與1 cm、0.01 cm與10 cm、0.01 cm與1 cm、0.1 cm與10 cm、0.1 cm與1 cm或1 cm與10 cm之間的電極間隙。
  117. 如請求項115或請求項116之電穿孔系統，其中該電穿孔腔室包含介於0.01 cm與1 cm之間的電極間隙。
  118. 如請求項98至117中任一項之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之第一及第二場強度係介於0.01 kV/cm與10 kV/cm、0.01 kV/cm與1 kV/cm、0.1 kV/cm與10 kV/cm、0.1 kV/cm與1 kV/cm或1 kV/cm與10 kV/cm之間。
  119. 如請求項98至118中任一項之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之第一及第二場強度係介於0.3 kV/cm與3 kV/cm之間。
  120. 如請求項98至119中任一項之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之第一及第二脈衝持續時間係介於10 -6秒與10秒、10 -6秒與1秒、10 -3秒與10秒或10 -3秒與1秒之間。
  121. 如請求項98至120中任一項之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之第一及第二脈衝持續時間係介於1微秒與100毫秒之間。
  122. 如請求項98至121中任一項之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝進一步包含與脈衝數目、寬度、形狀、模式或極性相關之特徵。
  123. 如請求項122之電穿孔系統，其中該脈衝數目係介於1個脈衝與1000個脈衝、1個脈衝與900個脈衝、1個脈衝與800個脈衝、1個脈衝與700個脈衝、1個脈衝與600個脈衝、1個脈衝與500個脈衝、1個脈衝與400個脈衝、1個脈衝與300個脈衝、1個脈衝與200個脈衝、1個脈衝與100個脈衝、1個脈衝與90個脈衝、1個脈衝與80個脈衝、1個脈衝與70個脈衝、1個脈衝與60個脈衝、1個脈衝與50個脈衝、1個脈衝與40個脈衝、1個脈衝與30個脈衝、1個脈衝與20個脈衝或1個脈衝與10個脈衝之間。
  124. 如請求項122或請求項123之電穿孔系統，其中該脈衝數目係介於1個脈衝與130個脈衝之間。
  125. 如請求項122至124中任一項之電穿孔系統，其中該脈衝寬度為指數衰減速率之函數。
  126. 如請求項125之電穿孔系統，其中該指數衰減速率為該樣品之電阻及用於實現電穿孔之電源之電容的函數。
  127. 如請求項126之電穿孔系統，其中該樣品之電阻係介於1歐姆與10000歐姆、1歐姆與9000歐姆、1歐姆與8000歐姆、1歐姆與7000歐姆、1歐姆與6000歐姆、1歐姆與5000歐姆、1歐姆與4000歐姆、1歐姆與3000歐姆、1歐姆與2000歐姆、1歐姆與1000歐姆、1歐姆與900歐姆、1歐姆與800歐姆、1歐姆與700歐姆、1歐姆與600歐姆、1歐姆與500歐姆、1歐姆與400歐姆、1歐姆與300歐姆、1歐姆與200歐姆、1歐姆與100歐姆、1歐姆與90歐姆、1歐姆與80歐姆、1歐姆與70歐姆、1歐姆與60歐姆、1歐姆與50歐姆、1歐姆與40歐姆、1歐姆與30歐姆、1歐姆與20歐姆，或1歐姆與10歐姆之間。
  128. 如請求項125或請求項126之電穿孔系統，其中該樣品之電阻係介於1歐姆與1000歐姆之間。
  129. 如請求項126至128中任一項之電穿孔系統，其中該電源電容係介於1 μF與1,000,000 μF、1 μF與100,000 μF、1 μF與10,000 μF、1 μF與1,000 μF或1 μF與100 μF之間。
  130. 如請求項126至129中任一項之電穿孔系統，其中該電源電容係介於1000 μF與5000 μF之間。
  131. 如請求項122至130中任一項之電穿孔系統，其中該脈衝形狀為方波脈衝或指數衰減波脈衝。
  132. 如請求項122至131中任一項之電穿孔系統，其中該脈衝模式包含對應於該第一脈衝或該第二脈衝之持續時間的單個脈衝。
  133. 如請求項122至131中任一項之電穿孔系統，其中該脈衝模式包含多個脈衝，其中該多個脈衝之組合持續時間對應於該第一脈衝或該第二脈衝之持續時間。
  134. 如請求項122至133中任一項之電穿孔系統，其中該等第一及第二電脈衝之極性為正或負。
  135. 如請求項98至134中任一項之電穿孔系統，其中在該樣品經受該第一脈衝之後至少12小時至至少48小時該樣品經受該第二電脈衝。
  136. 如請求項135之電穿孔系統，其中在該樣品經受該第一脈衝之後至少24小時該樣品經受該第二電脈衝。
  137. 如請求項98至136中任一項之電穿孔系統，其中該電穿孔系統包含流動電穿孔設備，且其中在該樣品在該流動電穿孔設備內流動的同時，使該樣品經受該等電脈衝。
  138. 如請求項98至137中任一項之電穿孔系統，其中該等細胞為哺乳動物細胞。
  139. 如請求項138之電穿孔系統，其中該等細胞為人類細胞、鼠類細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞或靈長類動物細胞。
  140. 如請求項138或請求項139之電穿孔系統，其中該等細胞為初細胞。
  141. 如請求項138至140中任一項之電穿孔系統，其中該等細胞為經培養細胞。
  142. 如請求項141之電穿孔系統，其中該等經培養細胞為經培養細胞株。
  143. 如請求項142之電穿孔系統，其中該等經培養細胞株包含3T3、697、10T½、1321N1、A549、AHR77、B-LCL、B16、B65、Ba/F3、BHK、C2C12、C6、CaCo-2、CAP、CaSki、ChaGo-K-1、CHO、COS、DG75、DLD-1、EL4、H1299、HaCaT、HAP1、HCT116、HEK、HeLa、HepG2、HL60、HOS、HT1080、HT29、Huh-7、HUVEC、INS-1/GRINCH、Jurkat、K46、K562、KG1、KHYG-1、L5278Y、L6、LNCaP、LS180、MCF7、MDA-MB-231、ME-180、MG-63、Min-6、MOLT4、Nalm6、ND7/23、Neuro2a、NK92、NS/0、P3U1、Panc-1、PC-3、PC12、PER.C6、PM1、Ramos、RAW 264.7、RBL、Renca、RLE、SH-SY5Y、SK-BR-3、SK-MES -1、SK-N-SH、SK-OV-3、SP2/0、SW403、THP-1、U2OS、U937、Vero、YB2/0，或其衍生物。
  144. 如請求項138至142中任一項之電穿孔系統，其中該等細胞包含脂肪細胞、軟骨細胞、內皮細胞、上皮細胞、纖維母細胞、肝細胞、角質細胞、肌細胞、神經元、骨細胞、周邊血液單核細胞(PBMC)、脾細胞、幹細胞或胸腺細胞。
  145. 如請求項144之電穿孔系統，其中該等PBMC為周邊血液淋巴球(PBL)。
  146. 如請求項145之電穿孔系統，其中該等PBL為自然殺手(NK)細胞、T細胞或B細胞。
  147. 如請求項144之電穿孔系統，其中該等PBMC為單核球。
  148. 如請求項147之電穿孔系統，其中該等單核球為巨噬細胞或樹突狀細胞。
  149. 如請求項148之電穿孔系統，其中該等巨噬細胞為微神經膠質細胞。
  150. 如請求項144之電穿孔系統，其中該等幹細胞為脂肪幹細胞、胚胎幹細胞、造血幹細胞、誘導性富潛能幹細胞、間葉幹細胞或神經幹細胞。
  151. 如請求項98至150中任一項之電穿孔系統，其中該等第一及第二藥劑為相同藥劑。
  152. 如請求項98至150中任一項之電穿孔系統，其中該等第一及第二藥劑為不同藥劑。
  153. 如請求項98至152中任一項之電穿孔系統，其中該等第一及第二藥劑為核酸、多肽、蛋白質或小分子。
  154. 如請求項153之電穿孔系統，其中該核酸為RNA，且其中該RNA為mRNA、miRNA、shRNA或siRNA。
  155. 如請求項153之電穿孔系統，其中該核酸為DNA，且其中該DNA為反義寡核苷酸或載體。
  156. 如請求項153之電穿孔系統，其中該蛋白質為核糖核蛋白。
  157. 如請求項156之電穿孔系統，其中該核糖核蛋白包含Cas9蛋白及引導RNA。
  158. 如請求項98至157中任一項之電穿孔系統，其中該藥劑之負載效率為至少50%、60%、70%、80%或90%。
  159. 如請求項98至158中任一項之電穿孔系統，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少50%。
  160. 如請求項98至159中任一項之電穿孔系統，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少60%。
  161. 如請求項98至160中任一項之電穿孔系統，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少70%。
  162. 如請求項98至161中任一項之電穿孔系統，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少80%。
  163. 如請求項98至162中任一項之電穿孔系統，其中細胞生存力在該第二電脈衝之後12至96小時為至少90%。
  164. 如請求項98至163中任一項之電穿孔系統，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至96小時為大約50%至90%存活。
  165. 如請求項164之電穿孔系統，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至72小時為大約50%至90%存活。
  166. 如請求項164之電穿孔系統，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至48小時為大約50%至90%存活。
  167. 如請求項164之電穿孔系統，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後24小時為大約50%至90%存活。
  168. 如請求項98至164中任一項之電穿孔系統，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至96小時為大約60%至90%存活。
  169. 如請求項168之電穿孔系統，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至72小時為大約60%至90%存活。
  170. 如請求項168之電穿孔系統，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後12至48小時為大約60%至90%存活。
  171. 如請求項168之電穿孔系統，其中該等電穿孔細胞在該第二電脈衝之後24小時為大約60%至90%存活。
  172. 一種使用如請求項98至171中任一項之電穿孔系統產生之電穿孔細胞、細胞顆粒或脂質囊泡。
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