KR20220041101A - 전자 기계 전달을 위한 장치, 시스템 및 키트와 그 사용 방법 - Google Patents

전자 기계 전달을 위한 장치, 시스템 및 키트와 그 사용 방법 Download PDF

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KR20220041101A
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파울로 안드레스 가르시아
라미치 맥코맥
제시카 시도
제임스 헴필
해리슨 브랄로워
로스 비글리
컬렌 뷰이
베다니 그랜트
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카이토펜 코포레이션
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Abstract

세포 트랜스펙션을 위한 장치, 시스템 및 키트가 제공된다. 장치는 제1 전극, 제2 전극 및 유동 경로에서 적어도 세포 서브셋을 트랜스펙션하기 위해 제1 및 제2 전극들에 인가된 전위차가 전기천공 구역에서 전계를 생성하는 전기천공 구역을 포함한다. 본 발명의 장치, 시스템 및 키트를 사용하여 복수의 세포들의 적어도 일부 내로 조성물을 도입하는 방법이 또한 제공된다.

Description

전자 기계 전달을 위한 장치, 시스템 및 키트와 그 사용 방법
연방 지원 연구 성명서
본 발명은 NSF(National Science Foundation)의 1단계 SBIR 보조금 번호 제1747096호 및 2단계 SBIR 보조금 번호 제1853194호에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
면역요법은 현재 기초 과학 연구 및 약제학적으로 유도된 임상 적용의 최첨단에 있다. 이러한 경향은 부분적으로는 표적화된 유전자 변형에서의 최근의 진보 및 치료적 개발을 위한 CRISPR/Cas 복합체 편집의 확대된 사용으로 인한 것이다. 치료적 관심의 유전적 변형을 식별하기 위해, 연구 기관들은 종종 내인성 유전자의 변형 또는 조작된 유전자의 삽입을 포함할 수 있는 수천 개의 유전적 변이체를 스크리닝(screen)해야 한다. 이러한 약물 발견 프로세스는 실험실에서 상당한 수작업 인력이 필요하여, 적절한 고처리량 기술 부족으로 인해 산업 전반의 병목 현상을 일으킨다.
생명공학과 제약 연구 및 개발 활동들은 거의 모든 프로세스들의 단계들을 자동화하는 방향으로 전환되었다. 워크플로우는 고처리량 탐지(high throughput discovery)를 가능하게 하는 정교한 실험실 관리 소프트웨어로 구동되는 액체 처리 로봇들을 포함한다. 그러나, 트랜스펙션 단계들은 낮은 처리량, 열악한 효율 기술들, 및 자동화될 수 없는 사용자 집약적 시스템들로 제한된다. 트렌스펙션을 위한 자동화된 플랫폼은 프로세스 비용을 실질적으로 감소시킬 뿐만 아니라, 세포 생존 가능성 및 성공적으로 조작된 세포의 양을 증가시키면서, 모두 경쟁적 면역요법 공간에서 중요한 탐지 시간을 감소시킬 수 있는 가능성을 갖는다.
전기천공법(electroporation)에 의한 트랜스펙션의 독특한 강점은 RNA 전달이다. DNA를 전달하는 기존의 바이러스 기술은 전기천공법에 의한 트랜스펙션과 동등한 것으로 나타나지만, GMP-품질 비-레트로바이러스(non-retroviral) RNA 바이러스가 부족하다. 따라서, 전기천공법 플랫폼을 갖는 회사들은 mRNA를 세포 내로 전달하기 위한 목적으로 협업과 인수의 표적이 되어 왔다.
현재의 고처리량 유전자 전달 방법은 전형적으로 바이러스 입자가 세포를 감염시키고 관심 유전자 변형을 형질도입하는 바이러스 전달(예를 들어, 렌티바이러스(lentiviral) 벡터)의 사용을 필요로 한다. 바이러스 방법론이 고처리량 자동화 시스템에 적용될 수 있지만, 바이러스 벡터가 복제되고, 바이러스 생산 라인 내로 트랜스펙션된 다음, 바이러스 입자가 정제되어야 하는 식의 연구 노력의 타임라인을 연장하는 생산에는 한계가 있다. 이러한 프로세스는 연구 기관들이 수행하는 데 몇 개월이 소요될 수 있어 플랫폼 개발 일정에 큰 영향을 미치는 동시에 약물 발견 비용을 증가시킬 수 있다. 또한, 유전자 전달을 위한 바이러스 형질도입의 사용은 일부 세포(특정 면역 세포 서브세트와 같은)가 바이러스 감염에 내성이기 때문에, 모든 세포 유형에 대한 유전적 변형에 순응할 수 없다. 따라서, 생명광학 산업 내에서, 바이러스 전달 메커니즘에 의존하지 않는 유전자 전달을 위한 고처리량 자동화 시스템을 가질 필요가 없다.
일 양태에서, 본 발명은 액체(예를 들어, 장치를 통해 흐르는 액체)에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 장치를 특징으로 하며, 상기 장치는 제1 및 제2 전극 및 전기천공 구역을 포함한다. 제1 전극은 제1 유입구, 제1 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘(lumen)을 포함하고, 제2 전극은 제2 유입구, 제2 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함한다. 전기천공 구역은 제1 유출구와 제2 유입구 사이에 배치되고, 약 100 ㎛ 초과 (예를 들어, 100 ㎛ 내지 10 mm, 150 ㎛ 내지 15 mm, 200 ㎛ 내지 10 mm, 250 ㎛ 내지 5 mm, 500 ㎛ 내지 10 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 50 mm, 5 mm 내지 25 mm, 또는 20 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 5 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 또는 약 50 mm)인 최소 단면 치수를 가지며, 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 횡단면적을 갖는다. 제1 유출구, 전기천공 구역, 및 제2 유입구는 유체 연통된다.
다른 양태에서, 본 발명은 액체(예를 들어, 장치를 통해 흐르는 액체)에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 장치를 특징으로 하며, 상기 장치는 제1 및 제2 전극 및 전기천공 구역을 포함한다. 제1 전극은 제1 유입구, 제1 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘(lumen)을 포함하고, 제2 전극은 제2 유입구, 제2 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함한다. 전기천공 구역은 제1 유출구와 제2 유입구 사이에 배치되고, 약 100 ㎛ 초과 (예를 들어, 100 ㎛ 내지 10 mm, 150 ㎛ 내지 15 mm, 200 ㎛ 내지 10 mm, 250 ㎛ 내지 5 mm, 500 ㎛ 내지 10 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 50 mm, 5 mm 내지 25 mm, 또는 20 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 5 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 또는 약 50 mm)인 최소 단면 치수를 가지며, 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 횡단면적을 갖는다. 제1 유출구, 전기천공 구역, 및 제2 유입구는 유체 연통된다. 세포의 트랜스펙션은 정적 전기천공 시스템에서 전달 메커니즘과 구별되는 전기-기계적 전달 메커니즘을 통해 전기천공 구역 내에서 일어날 수 있다.
선행하는 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 횡단면은 원형, 디스크, 타원형, 규칙적인 다각형, 불규칙적인 다각형, 곡선형 형상, 별, 평행사변형, 사다리꼴, 및 불규칙적인 형상(예를 들어, 돌출 슬롯 또는 홈, 불규칙적인 다각형, 및/또는 곡선형 형상과 같은 돌출부들을 갖는 형상)으로 이루어진 군으로부터 선택된 형상이다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 단면은 전기천공 구역의 길이(즉, 길이방향 축 또는 유동 방향)를 따라 변한다. 일부 실시예들에서, 형상은 길이를 따라 일치하지만 전기천공 구역의 길이를 따라 중심 길이방향 축에 대해 위치가 변한다(예를 들어, 단면 형상은 전기천공 구역의 일 단부로부터 다른 단부, 예컨대 나선으로 중심 축을 중심으로 회전한다). 특정 실시예들에서, 전기천공 구역은 실질적으로 원형의 횡단면을 갖는다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 약 7,850 ㎛2 내지 약 2,000 mm2 (예를 들어, 약 8,000 ㎛2 내지 약 1 mm2, 약 8,000 ㎛2 내지 약 10 mm2, 약 8,000 ㎛2 내지 약 100 mm2, 약 9,000 ㎛2 내지 약 5 mm2, 약 1 mm2 내지 약 10 mm2, 약 1 mm2 내지 약 100 mm2, 약 3 mm2 내지 약 20 mm2, 약 10 mm2 내지 약 50 mm2, 약 25 mm2 내지 약 75 mm2, 약 50 mm2 내지 약 100 mm2, 약 75 mm2 내지 약 200 mm2, 약 100 mm2 내지 약 350 mm2, 약 150 mm2 내지 약 500 mm2, 약 300 mm2 내지 약 750 mm2, 약 500 mm2 내지 약 1,000 mm2, 약 750 mm2 내지 약 1,500 mm2, 또는 약 950 mm2 내지 2,000 mm2, 예를 들어, 약 8,000 ㎛2, 약 9,000 ㎛2, 약 1 mm2, 약 5 mm2, 약 10 mm2, 약 15 mm2, 약 20 mm2, 약 25 mm2, 약 50 mm2, 약 60 mm2, 약 75 mm2, 약 80 mm2, 약 100 mm2, 약 150 mm2, 약 200 mm2, 약 250 mm2, 약 300 mm2, 약 350 mm2, 약 400 mm2, 약 450 mm2, 약 500 mm2, 약 600 mm2, 약 700 mm2, 약 800 mm2, 약 900 mm2, 약 1,000 mm2, 약 1,100 mm2, 약 1,200 mm2, 약 1,300 mm2, 약 1,400 mm2, 약 1,500 mm2, 약 1,600 mm2, 약 1,700 mm2, 약 1,800 mm2, 약 1,900 mm2, 또는 약 2,000 mm2)의 횡단면적을 갖는다.
일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 0.005 mm 내지 50 mm (예를 들어, 0.005 mm 내지 0.05 mm, 0.005 mm 내지 0.5 mm, 0.005 mm 내지 25 mm, 0.01 mm 내지 1 mm, 0.05 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.1 mm 내지 50 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 0.5 mm 내지 25 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 15 mm, 3 mm 내지 50 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 50 mm, 15 mm 내지 25 mm, 20 mm 내지 30 mm, 25 mm 내지 40, 또는 30 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.01 mm, 약 0.05 mm, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 9 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 20 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 또는 약 50 mm)의 길이를 갖는다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 0.005 mm 내지 25 mm (예를 들어, 0.005 mm 내지 0.05 mm, 0.005 mm 내지 0.5 mm, 0.01 mm 내지 1 mm, 0.05 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 0.5 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 10 mm, 7 mm 내지 15 mm, 10 mm 내지 20 mm, 또는 15 mm 내지 25 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.01 mm, 약 0.05 mm, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 10 mm, 약 12 mm, 약 15 mm, 약 18 mm, 약 20 mm, 약 23 mm 또는 약 25 mm)의 길이를 갖는다.
일부 실시예들에서, 제1 전극 및/또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘은 0.01 mm 내지 500 mm (예를 들어, 0.01 mm 내지 0.1 mm, 0.01 mm 내지 0.5 mm, 0.01 mm 내지 10 mm, 0.05 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 0.5 mm 내지 50 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 15 mm, 3 mm 내지 50 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 100 mm, 15 mm 내지 30 mm, 20 mm 내지 40 mm, 20 mm 내지 200 mm, 30 mm 내지 50, 30 mm 내지 300 mm, 45 mm 내지 60 mm, 50 mm 내지 100 mm, 50 mm 내지 500 mm, 75 mm 내지 150 mm, 75 mm 내지 300 mm, 100 mm 내지 200 mm, 100 mm 내지 500 mm, 150 mm 내지 300 mm, 200 mm 내지 400 mm, 300 mm 내지 450 mm, 또는 350 mm 내지 500 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.01 mm, 약 0.05 mm, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 약 50 mm, 약 60 mm, 약 70 mm, 약 80 mm, 약 90 mm, 약 100 mm, 약 150 mm, 약 200 mm, 약 250 mm, 약 300 mm, 약 350 mm, 약 400 mm, 약 450 mm, 또는 약 500 mm)의 최소 단면 치수를 갖는다.
일부 실시예들에서, 제1 또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘의 최소 단면 치수 대 전기천공 구역의 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1 (예를 들어, 1:10 내지 1:5, 1:10 내지 1:2, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:5 내지 5:1, 1:2 내지 2:3, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 6:1, 2:3 내지 2:1, 2:3 내지 4:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 3:1, 1:1 내지 10:1, 3:2 내지 3:1, 3:2 내지 6:1, 2:1 내지 3:1, 2:1 내지 5:1, 5:2 내지 5:1, 3:1 내지 4:1, 7:2 내지 5:1, 7:2 내지 10:1, 4:1 내지 8:1, 5:1 내지 10:1, 또는 7:1 내지 10:1, 예를 들어, 약 1:10, 약 1:9, 약 1:8, 약 1:7, 약 1:6, 약 1:5, 약 1:2, 약 2:3, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 9:2, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 또는 약 10:1)이다.
일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 최소 단면 치수 대 전기천공 구역의 길이의 비는 1:100 내지 100:1 (예를 들어, 1:100 내지 1:50, 1:100 내지 1:25, 1:100 내지 1:10, 1:100 내지 1:1, 1:50 내지 1:5, 1:50 내지 1:2, 1:50 내지 2:1, 1:25 내지 1:10, 1:25 내지 1:5, 1:25 내지 1:1, 1:25 내지 10:1, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 5:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 100:1, 2:1 내지 5:1, 2:1 내지 20:1, 3:1 내지 10:1, 4:1 내지 25:1, 5:1 내지 50:1, 10:1 내지 50:1, 40:1 내지 80:1, 50:1 내지 100:1, 또는 75:1 내지 90:1, 예를 들어, 약 1:100, 약 1:75, 약 1:50, 약 1:25, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 5:1, 약 10:1, 약 20:1, 약 30:1, 약 40:1, 약 50:1, 약 60:1, 약 70:1, 약 80:1, 약 90:1 또는 약 100:1)이다.
일부 실시예들에서, 제1 전극 및/또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘의 횡단면적 대 전기천공 구역의 횡단면적의 비는 1:100 내지 100:1 (예를 들어, 1:100 내지 1:50, 1:100 내지 1:25, 1:100 내지 1:10, 1:100 내지 1:1, 1:50 내지 1:5, 1:50 내지 1:2, 1:50 내지 2:1, 1:25 내지 1:10, 1:25 내지 1:5, 1:25 내지 1:1, 1:25 내지 10:1, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 5:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 100:1, 2:1 내지 5:1, 2:1 내지 20:1, 3:1 내지 10:1, 4:1 내지 25:1, 5:1 내지 50:1, 10:1 내지 50:1, 40:1 내지 80:1, 50:1 내지 100:1, 또는 75:1 내지 90:1, 예를 들어, 약 1:100, 약 1:75, 약 1:50, 약 1:25, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 5:1, 약 10:1, 약 20:1, 약 30:1, 약 40:1, 약 50:1, 약 60:1, 약 70:1, 약 80:1, 약 90:1 또는 100:1)이다.
일부 실시예들에서, 장치는 제1 유입구와 유체 연통되는 제1 저장소(예를 들어, 샘플 백) 및/또는 제2 유출구와 유체 연통되는 제2 저장소(예를 들어, 수집 백, 예를 들어, 회수 백)를 더 포함한다. 추가로, 장치는 제1 루멘 또는 제2 루멘과 유체 연통된는 제3 저장소를 포함할 수 있다. 제3 저장소는 트랜스펙션을 위한 하나 이상의 시약들(예를 들어, 트랜스펙션을 위해 선택된 조성물을 갖는 시약들), 예를 들어, 세포들에 전달될 유전적 조성물과 같은 페이로드 현탁액을 함유할 수 있다. 일부 실시예들에서, 제3 저장소는 전기천공 또는 전기-기계적 프로세스 전 또는 중에 희석될 수 있는 비-액상 (예를 들어, 고체 염)의 조성물을 포함하는 완중액, 완중액 첨가제, 및/또는 페이로드 현탁액을 함유하도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나는 제3 저장소와 유체 연통하기 위한 추가 유입구 또는 유출구를 갖는다.
일부 실시예들에서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나는 다공성 또는 전도성 유체(예를 들어, 전도성 액체)일 수 있다.
전술한 실시예들 중 어느 하나의 장치는 제1 유입구와 유체 연통되는 전달 소스를 포함할 수 있다. 전달 소스는 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 전달하도록 구성될 수 있다. 전달 소스는 또한 전달 소스 및 제1 루멘과 유체 연결된 유체 변위 메커니즘(예를 들어, 단일 주사기 펌프 또는 다수의 주사기 펌프들)을 사용하여, (예를 들어, 트랜스펙션 시약 저장소로서) 세포들에 도입될 조성물(예를 들어, 유전자 조성물) 또는 추가 완중액 또는 완중액 첨가제와 같은, 기타 성분들을 전달하도록 구성될 수 있다.
일부 실시예들에서, 전달 소스는 전기천공 구역 이전에(예를 들어, 그의 업스트림) 또는 내에 성분들을 전달하도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 전달 소스는 유체 변위 메커니즘(예를 들어, 단일 주사기 펌프 또는 다수의 주사기 펌프들)이 하나의 완중액, 완중액 첨가제, 및/또는 페이로드 현탁액에 전용되고, 현탁액 내의 복수의 세포들과 유체 연통되도록 구성된다.
일부 실시예들에서, 장치는 하나 이상의 추가 전기천공 구역들(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 6개, 8개, 10개, 11개, 12개, 24개, 27개, 36개, 48개, 64개, 96개, 384개, 1536개, 또는 그 초과)을 더 포함하며, 이는 병렬로, 직렬로, 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 하나 이상의 추가 전기천공 구역들은 각각 실질적으로 균일한 횡단면적을 가질 수 있다.
전술한 실시예들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 장치는 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징을 더 포함할 수 있다. 하우징은 제1 전극에 동작가능하게 결합된 제1 전기 입력 및 제2 전극에 동작가능하게 결합된 제2 전기 입력을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 하우징은 복수의 세포들이 현탁된 장치 및/또는 액체의 온도를 증가시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함하며, 열 컨트롤러는 가열 블록, 액체 유동, 배터리 전원 히터, 및 박막 히터로 구성된 그룹으로부터 선택된 가열 요소이다. 일부 실시예들에서, 하우징은, 복수의 세포들이 현탁된 장치 및/또는 액체의 온도를 감소시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함하며, 열 컨트롤러는 액체 유동, 증발 냉각기, 및 펠티에(Peltier) 장치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 냉각 요소이다. 하우징은 장치와 일체형이거나 이에 탈착 가능하게 연결될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 장치를 포함하며, 상기 장치는 제1 유입구, 제1 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극; 제2 유입구, 제2 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 루멘과 유체 연통되고, 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 유입구와 제1 유출구 사이에서 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구; 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 루멘과 유체 연통되고, 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 유입구와 제2 유출구 사이에서 제2 전극과 교차하는, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구; 및 제1 유출구와 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역을 포함하며, 전기천공 구역은 약 100 ㎛ 초과 (예를 들어, 100 ㎛ 내지 10 mm, 150 ㎛ 내지 15 mm, 200 ㎛ 내지 10 mm, 250 ㎛ 내지 5 mm, 500 ㎛ 내지 10 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 50 mm, 5 mm 내지 25 mm, 또는 20 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 5 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 또는 약 50 mm)의 최소 단면 치수를 포함하며, 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 갖는다. 제1 유출구, 전기천공 구역, 및 제2 유입구는 유체 연통된다. 전기천공 구역의 횡단면은 원형, 디스크, 타원형, 규칙적인 다각형, 불규칙적인 다각형, 곡선형 형상, 별, 평행사변형, 사다리꼴, 및 불규칙적인 형상(예를 들어, 돌출 슬롯 또는 홈, 불규칙적인 다각형, 및/또는 곡선형 형상과 같은, 예를 들어 돌출부들을 갖는 형상)으로 이루어진 군으로부터 선택된 형상이다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 단면은 전기천공 구역의 길이(즉, 길이방향 축 또는 유동 방향)를 따라 변한다. 일부 실시예들에서, 형상은 길이를 따라 일치하지만 전기천공 구역의 길이를 따라 중심 길이방향 축에 대해 위치가 변한다(예를 들어, 단면 형상은 전기천공 구역의 일 단부로부터 다른 단부, 예컨대 나선으로 중심 축을 중심으로 회전한다). 특정 실시예들에서, 전기천공 구역은 실질적으로 원형의 횡단면을 갖는다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 약 7850 ㎛2 내지 약 2000 mm2 (예를 들어, 약 8,000 ㎛2 내지 약 1 mm2, 약 8,000 ㎛2 내지 약 10 mm2, 약 8,000 ㎛2 내지 약 100 mm2, 약 9,000 ㎛2 내지 약 5 mm2, 약 1 mm2 내지 약 10 mm2, 약 1 mm2 내지 약 100 mm2, 약 3 mm2 내지 약 20 mm2, 약 10 mm2 내지 약 50 mm2, 약 25 mm2 내지 약 75 mm2, 약 50 mm2 내지 약 100 mm2, 약 75 mm2 내지 약 200 mm2, 약 100 mm2 내지 약 350 mm2, 약 150 mm2 내지 약 500 mm2, 약 300 mm2 내지 약 750 mm2, 약 500 mm2 내지 약 1,000 mm2, 약 750 mm2 내지 약 1,500 mm2, 또는 약 950 mm2 내지 2,000 mm2, 예를 들어, 약 8,000 ㎛2, 약 9,000 ㎛2, 약 1 mm2, 약 5 mm2, 약 10 mm2, 약 15 mm2, 약 20 mm2, 약 25 mm2, 약 50 mm2, 약 60 mm2, 약 75 mm2, 약 80 mm2, 약 100 mm2, 약 150 mm2, 약 200 mm2, 약 250 mm2, 약 300 mm2, 약 350 mm2, 약 400 mm2, 약 450 mm2, 약 500 mm2, 약 600 mm2, 약 700 mm2, 약 800 mm2, 약 900 mm2, 약 1,000 mm2, 약 1,100 mm2, 약 1,200 mm2, 약 1,300 mm2, 약 1,400 mm2, 약 1,500 mm2, 약 1,600 mm2, 약 1,700 mm2, 약 1,800 mm2, 약 1,900 mm2, 또는 약 2,000 mm2)의 횡단면적을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 트랜스펙팅을 위한 장치를 포함하며, 상기 장치는 제1 유입구, 제1 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극; 제2 유입구, 제2 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 루멘과 유체 연통되고, 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 유입구와 제1 유출구 사이에서 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구; 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 루멘과 유체 연통되고, 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 유입구와 제2 유출구 사이에서 제2 전극과 교차하는, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구; 및 제1 유출구와 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역을 포함하며, 전기천공 구역은 약 100 ㎛ 초과 (예를 들어, 100 ㎛ 내지 10 mm, 150 ㎛ 내지 15 mm, 200 ㎛ 내지 10 mm, 250 ㎛ 내지 5 mm, 500 ㎛ 내지 10 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 50 mm, 5 mm 내지 25 mm, 또는 20 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 5 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 또는 약 50 mm)의 최소 단면 치수를 포함하며, 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 갖는다. 제1 유출구, 전기천공 구역, 및 제2 유입구는 유체 연통된다. 전기천공 구역의 횡단면은 원형, 디스크, 타원형, 규칙적인 다각형, 불규칙적인 다각형, 곡선형 형상, 별, 평행사변형, 사다리꼴, 및 불규칙적인 형상(예를 들어, 돌출 슬롯 또는 홈, 불규칙적인 다각형, 및/또는 곡선형 형상과 같은, 예를 들어 돌출부들을 갖는 형상)으로 이루어진 군으로부터 선택된 형상이다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 단면은 전기천공 구역의 길이(즉, 길이방향 축 또는 유동 방향)를 따라 변한다. 일부 실시예들에서, 형상은 길이를 따라 일치하지만 전기천공 구역의 길이를 따라 중심 길이방향 축에 대해 위치가 변한다(예를 들어, 단면 형상은 전기천공 구역의 일 단부로부터 다른 단부, 예컨대 나선으로 중심 축을 중심으로 회전한다). 특정 실시예들에서, 전기천공 구역은 실질적으로 원형의 횡단면을 갖는다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 약 7850 ㎛2 내지 약 2000 mm2 (예를 들어, 약 8,000 ㎛2 내지 약 1 mm2, 약 8,000 ㎛2 내지 약 10 mm2, 약 8,000 ㎛2 내지 약 100 mm2, 약 9,000 ㎛2 내지 약 5 mm2, 약 1 mm2 내지 약 10 mm2, 약 1 mm2 내지 약 100 mm2, 약 3 mm2 내지 약 20 mm2, 약 10 mm2 내지 약 50 mm2, 약 25 mm2 내지 약 75 mm2, 약 50 mm2 내지 약 100 mm2, 약 75 mm2 내지 약 200 mm2, 약 100 mm2 내지 약 350 mm2, 약 150 mm2 내지 약 500 mm2, 약 300 mm2 내지 약 750 mm2, 약 500 mm2 내지 약 1,000 mm2, 약 750 mm2 내지 약 1,500 mm2, 또는 약 950 mm2 내지 2,000 mm2, 예를 들어, 약 8,000 ㎛2, 약 9,000 ㎛2, 약 1 mm2, 약 5 mm2, 약 10 mm2, 약 15 mm2, 약 20 mm2, 약 25 mm2, 약 50 mm2, 약 60 mm2, 약 75 mm2, 약 80 mm2, 약 100 mm2, 약 150 mm2, 약 200 mm2, 약 250 mm2, 약 300 mm2, 약 350 mm2, 약 400 mm2, 약 450 mm2, 약 500 mm2, 약 600 mm2, 약 700 mm2, 약 800 mm2, 약 900 mm2, 약 1,000 mm2, 약 1,100 mm2, 약 1,200 mm2, 약 1,300 mm2, 약 1,400 mm2, 약 1,500 mm2, 약 1,600 mm2, 약 1,700 mm2, 약 1,800 mm2, 약 1,900 mm2, 또는 약 2,000 mm2)의 횡단면적을 갖는다.
선행하는 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 0.1 mm 내지 50 mm(예를 들어, 0.1 mm 내지 0.5 mm, 0.1 mm 내지 1 mm, 0.1 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 15 mm, 3 mm 내지 50 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 100 mm, 15 mm 내지 30 mm, 20 mm 내지 40 mm, 20 mm 내지 200 mm, 30 mm 내지 50, 45 mm 내지 60 mm, 50 mm 내지 100 mm, 75 mm 내지 150 mm, 100 mm 내지 200 mm, 150 mm 내지 300 mm, 200 mm 내지 400 mm, 300 mm 내지 450 mm, 또는 350 mm 및 500 mm, 예를 들어, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 또는 약 50 mm)의 최소 단면 치수를 갖는다.
전술한 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 0.005 mm 내지 50 mm (예를 들어, 0.005 mm 내지 0.05 mm, 0.005 mm 내지 0.5 mm, 0.005 mm 내지 25 mm, 0.01 mm 내지 1 mm, 0.05 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.1 mm 내지 50 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 0.5 mm 내지 25 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 15 mm, 3 mm 내지 50 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 50 mm, 15 mm 내지 25 mm, 20 mm 내지 30 mm, 25 mm 내지 40, 또는 30 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.01 mm, 약 0.05 mm, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 9 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 20 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 또는 약 50 mm)의 길이를 갖는다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 0.005 mm 내지 25 mm (예를 들어, 0.005 mm 내지 0.05 mm, 0.005 mm 내지 0.5 mm, 0.01 mm 내지 1 mm, 0.05 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 0.5 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 10 mm, 7 mm 내지 15 mm, 10 mm 내지 20 mm, 또는 15 mm 내지 25 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.01 mm, 약 0.05 mm, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 10 mm, 약 12 mm, 약 15 mm, 약 18 mm, 약 20 mm, 약 23 mm 또는 약 25 mm)의 길이를 갖는다.
전술한 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 제1 전극 및/또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘은 0.01 mm 내지 500 mm (예를 들어, 0.01 mm 내지 0.1 mm, 0.01 mm 내지 0.5 mm, 0.01 mm 내지 10 mm, 0.05 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 0.5 mm 내지 50 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 15 mm, 3 mm 내지 50 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 100 mm, 15 mm 내지 30 mm, 20 mm 내지 40 mm, 20 mm 내지 200 mm, 30 mm 내지 50, 30 mm 내지 300 mm, 45 mm 내지 60 mm, 50 mm 내지 100 mm, 50 mm 내지 500 mm, 75 mm 내지 150 mm, 75 mm 내지 300 mm, 100 mm 내지 200 mm, 100 mm 내지 500 mm, 150 mm 내지 300 mm, 200 mm 내지 400 mm, 300 mm 내지 450 mm, 또는 350 mm 내지 500 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.01 mm, 약 0.05 mm, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 약 50 mm, 약 60 mm, 약 70 mm, 약 80 mm, 약 90 mm, 약 100 mm, 약 150 mm, 약 200 mm, 약 250 mm, 약 300 mm, 약 350 mm, 약 400 mm, 약 450 mm, 또는 약 500 mm)의 최소 단면 치수를 갖는다. 일부 실시예들에서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘의 최소 단면 치수 대 전기천공 구역의 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1 (예를 들어, 1:10 내지 1:5, 1:10 내지 1:2, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:5 내지 5:1, 1:2 내지 2:3, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 6:1, 2:3 내지 2:1, 2:3 내지 4:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 3:1, 1:1 내지 10:1, 3:2 내지 3:1, 3:2 내지 6:1, 2:1 내지 3:1, 2:1 내지 5:1, 5:2 내지 5:1, 3:1 내지 4:1, 7:2 내지 5:1, 7:2 내지 10:1, 4:1 내지 8:1, 5:1 내지 10:1, 또는 7:1 내지 10:1, 예를 들어, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2, 약 2:3, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 9:2, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 또는 약 10:1)이다.
전술한 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 최소 단면 치수 대 전기천공 구역의 길이의 비는 1:100 내지 100:1 (예를 들어, 1:100 내지 1:50, 1:100 내지 1:25, 1:100 내지 1:10, 1:100 내지 1:1, 1:50 내지 1:5, 1:50 내지 1:2, 1:50 내지 2:1, 1:25 내지 1:10, 1:25 내지 1:5, 1:25 내지 1:1, 1:25 내지 10:1, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 5:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 100:1, 2:1 내지 5:1, 2:1 내지 20:1, 3:1 내지 10:1, 4:1 내지 25:1, 5:1 내지 50:1, 10:1 내지 50:1, 40:1 내지 80:1, 50:1 내지 100:1, 또는 75:1 내지 90:1, 예를 들어, 약 1:100, 약 1:75, 약 1:50, 약 1:25, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 5:1, 약 10:1, 약 20:1, 약 30:1, 약 40:1, 약 50:1, 약 60:1, 약 70:1, 약 80:1, 약 90:1 또는 약 100:1)이다. 일부 실시예들에서, 제1 전극 및/또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘의 횡단면적 대 전기천공 구역의 횡단면적의 비는 1:100 내지 100:1 (예를 들어, 1:100 내지 1:50, 1:100 내지 1:25, 1:100 내지 1:10, 1:100 내지 1:1, 1:50 내지 1:5, 1:50 내지 1:2, 1:50 내지 2:1, 1:25 내지 1:10, 1:25 내지 1:5, 1:25 내지 1:1, 1:25 내지 10:1, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 5:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 100:1, 2:1 내지 5:1, 2:1 내지 20:1, 3:1 내지 10:1, 4:1 내지 25:1, 5:1 내지 50:1, 10:1 내지 50:1, 40:1 내지 80:1, 50:1 내지 100:1, 또는 75:1 내지 90:1, 예를 들어, 약 1:100, 약 1:75, 약 1:50, 약 1:25, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 5:1, 약 10:1, 약 20:1, 약 30:1, 약 40:1, 약 50:1, 약 60:1, 약 70:1, 약 80:1, 약 90:1 또는 100:1)이다. 제1 또는 제2 전극 중 어느 하나 또는 둘 모두는 다공성 또는 전도성 유체(예를 들어, 액체)일 수 있다.
전술한 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 장치는 제1 유입구와 유체 연통되는 제1 저장소를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 제2 유출구와 유체 연통되는 제2 저장소를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 장치는 제3 유입구 및 제3 유출구와 유체 연통되는 제3 저장소를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 장치는 제4 유입구 및 제4 유출구와 유체 연통되는 제4 저장소를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 장치는 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘과 유체 연통되는 제5 저장소를 더 포함하며, 여기서 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나는 제5 저장소와 유체 연통하기 위한 적어도 하나의 추가 유입구를 갖는다. 일부 실시예들에서, 장치는 제1 유입구와 유체 연통되는 유체 전달 소스를 더 포함하며, 유체 전달 소스는 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 전달하도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 장치는 (예를 들어, 직렬로, 병렬로, 또는 이들의 조합으로 배열된) 복수의 전기천공 구역들을 더 포함한다. 복수의 전기천공 구역들 각각은 실질적으로 균일한 횡단면적을 가질 수 있다.
선행하는 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 장치는 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 적어도 하나의 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징(예를 들어, 카트리지)을 포함하는 하우징을 더 포함한다. 하우징은 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전기 입력 및 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전기 입력을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 하우징은 복수의 세포들이 현탁된 장치 및/또는 액체의 온도를 증가시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함하며, 열 컨트롤러는 가열 블록, 액체 유동, 배터리 전원 히터, 및 박막 히터로 구성된 그룹으로부터 선택된 가열 요소이다. 일부 실시예들에서, 하우징은, 복수의 세포들이 현탁된 장치 및/또는 액체의 온도를 감소시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함하며, 열 컨트롤러는 액체 유동, 증발 냉각기, 및 펠티에(Peltier) 장치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 냉각 요소이다. 일부 실시예들에서, 하우징은 장치와 일체형이거나 이에 탈착 가능하게 연결된다. 일부 실시예들에서, 하우징(예를 들어, 카트리지)은 임상 또는 병원 환경에서 환자들에게 세포 치료법을 전달하는 데 사용되는 자동화된 폐쇄 시스템과 함께 사용되도록 및/또는 그에 삽입되도록 구성된다.
일부 실시예들에서, 하우징은 시료의 전기천공 동안, 그 전, 및 그 후 세포 현탁액 및/또는 완중액 저장을 위한 냉각/가열 영역/인클로저를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 시스템(예를 들어, 장치 및 하우징)은 외부적으로 전력이 공급된다.
일부 실시예들에서, 본 발명의 장치들은 유량, 파형들, 인가된 전위, 트랜스펙션될 체적, 시간 지연, 냉각 특징들, 가열 특징들, 트랜스펙션 상태, 진행 및 트랜스펙션 프로토콜을 최적화하는데 사용되는 기타 파라미터들과 같은 파라미터들을 사용자가 선택하도록 하는 사용자 인터페이스 또는 기타 대안적인 사용자 인터페이스를 포함한다. 일부 실시예들에서, 사용자 인터페이스는 시스템의 자동화된 실행 및/또는 알려진 세포 유형의 주어진 샘플에 대한 트랜스펙션을 최적화하기 위한 알고리의 실행을 허용하는 프로그래밍에 연결될 수 있다. 일부 실시예들에서, 최적화 알고리즘들은 사용자가 이 기능을 선택하는 경우 독립적으로 또는 자율적으로 트랜스펙션 파라미터들을 조정하는 능력을 갖는다. 일부 실시예들에서, 최적화 알고리즘은 세포 유형, 세포 현탁액의 전도도, 세포 현탁액의 체적, 점도, 트랜스펙션 카트리지(들)의 수명, 현탁액의 물리적 상태, 또는 트랜스펙션 장치(들)의 상태에 따라 달라질 수 있는 트랜스펙션 프로세스에 사용되는 파라미터들의 연속적인 조정을 허용한다.
일부 실시예들에서, 최적화 알고리즘은 공지된 입력 세포-유형 파라미터들에 기초하여 예측 분석을 수행하고 그에 따라 트랜스펙션 파라미터들을 조정하는 능력을 갖는다. 일부 실시예들에서, 최적화 알고리즘은 본 발명의 장치들 중 어느 하나 내의 전기 신호들에 기초하여 트랜스펙션 파라미터들을 조정한다. 일부 실시예들에서, 최적화 알고리즘들은 고유 무차원 입력 파라미터들에 기초하여 트랜스펙션 파라미터들을 조정한다. 일부 실시예들에서, 최적화 알고리즘들은 높은 생존 가능성 결과들, 높은 효율성 결과들, 또는 매칭된 생존 가능성 및 효율성 결과들이 예측되는 파라미터들의 고유한 다변량 조합들에 기초하여 트랜스펙션 파라미터들을 조정하는 능력을 갖는다. 이러한 파라미터들의 고유한 다변량 조합들은 레이놀즈(Reynolds) 수와 같은 알려진 관계들일 수 있거나, 또는 전단 속도와 유체 속도 사이의 관계, 채널 직경과 유체 속도 사이의 관계, 전계와 유체 속도 사이의 관계 등과 같은 새로운 관계들일 수 있다. 일반적으로 말해서, 인가된 전기 펄스를 통해 전달되는 전기 에너지의 양과 유체 흐름을 통해 전달되는 기계적 에너지의 양 사이에는 균형이 있다. 원하는 결과, 예를 들어 높은 세포 수율 또는 높은 효율에 따라, 전기적 및 기계적 효과들의 최적의 조합이 존재한다. 주어진 전기 펄스 조건에서, 더 빠른 유체 흐름은 세포에 노출된 전기 에너지의 양을 감소시키고, 세포 생존 가능성 및 세포 수율을 증가시키는 경향이 있다. 그러나 이는 단지 어느 시점까지만 일어나며, 그 이상에서는 세포들이 효율적인 페이로드 전달을 위한 충분한 전기 에너지를 경험하지 못하기 때문에 세포 수율이 감소하기 시작한다.
다른 양태에서, 본 발명은 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 시스템을 포함하며, 여기서 시스템은 장치의 전술한 실시예들 중 어느 하나를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 시스템을 포함하며, 여기서 시스템은 장치의 전술한 실시예들 중 어느 하나를 포함한다(예를 들어, 전기천공은 전기-기계적 전달 메커니즘을 통해 일어난다).
또 다른 양태에서, 본 발명은 장치 및 전위 소스를 포함하는, 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전 제1 전극은 제1 유입구, 제1 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하고; 제2 전극은 제2 유입구, 제2 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함한다. 전기-기계적 전달을 위한 시스템을 포함한다. 장치는 제1 전극, 제2 전극 및 전기천공 구역을 포함한다. 전기천공 구역은 제1 유출구와 제2 유입구 사이에 배치되고, 약 100 ㎛ 초과 (예를 들어, 100 ㎛ 내지 10 mm, 150 ㎛ 내지 15 mm, 200 ㎛ 내지 10 mm, 250 ㎛ 내지 5 mm, 500 ㎛ 내지 10 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 50 mm, 5 mm 내지 25 mm, 또는 20 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 5 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 또는 약 50 mm)인 최소 단면 치수를 갖는다. 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 갖는다. 제1 유출구, 전기천공 구역, 및 제2 유입구는 유체 연통된다. 시스템은 전위 소스를 더 포함하며, 장치의 제1 전극 및 제2 전극은 전위 소스와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉된다. 일부 실시예들에서, 장치는 제1 유입구와 유체 연통되는 제1 저장소 및/또는 제2 유출구와 연통되는 제2 저장소를 더 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 장치 및 전위 소스를 포함하는, 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 시스템을 포함한다. 장치는 제1 전극, 제2 전극 및 전기천공 구역을 포함한다. 제1 전극은 제1 유입구, 제1 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하고; 제2 전극은 제2 유입구, 제2 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함한다. 전기천공 구역은 제1 유출구와 제2 유입구 사이에 배치되고, 약 100 ㎛ 초과 (예를 들어, 100 ㎛ 내지 10 mm, 150 ㎛ 내지 15 mm, 200 ㎛ 내지 10 mm, 250 ㎛ 내지 5 mm, 500 ㎛ 내지 10 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 50 mm, 5 mm 내지 25 mm, 또는 20 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 5 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 또는 약 50 mm)인 최소 단면 치수를 갖는다. 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 갖는다. 제1 유출구, 전기천공 구역, 및 제2 유입구는 유체 연통된다. 시스템은 전위 소스를 더 포함하며, 장치의 제1 전극 및 제2 전극은 전위 소스와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉된다. 일부 실시예들에서, 장치는 제1 유입구와 유체 연통되는 제1 저장소 및/또는 제2 유출구와 연통되는 제2 저장소를 더 포함한다.
선행하는 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 횡단면은 원형, 디스크, 타원형, 규칙적인 다각형, 불규칙적인 다각형, 곡선형 형상, 별, 평행사변형, 사다리꼴, 및 불규칙적인 형상으로 이루어진 군으로부터 선택된 형상이다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 실질적으로 원형의 횡단면을 갖는다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 0.1 mm 내지 50 mm(예를 들어, 0.1 mm 내지 0.5 mm, 0.1 mm 내지 1 mm, 0.1 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 15 mm, 3 mm 내지 50 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 100 mm, 15 mm 내지 30 mm, 20 mm 내지 40 mm, 20 mm 내지 200 mm, 30 mm 내지 50, 45 mm 내지 60 mm, 50 mm 내지 100 mm, 75 mm 내지 150 mm, 100 mm 내지 200 mm, 150 mm 내지 300 mm, 200 mm 내지 400 mm, 300 mm 내지 450 mm, 또는 350 mm 및 500 mm, 예를 들어, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 또는 약 50 mm)의 최소 단면 치수를 갖는다.
본 발명의 선행하는 시스템들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 약 7850 ㎛2 내지 약 2000 mm2 (예를 들어, 약 8,000 ㎛2 내지 약 1 mm2, 약 8,000 ㎛2 내지 약 10 mm2, 약 8,000 ㎛2 내지 약 100 mm2, 약 9,000 ㎛2 내지 약 5 mm2, 약 1 mm2 내지 약 10 mm2, 약 1 mm2 내지 약 100 mm2, 약 3 mm2 내지 약 20 mm2, 약 10 mm2 내지 약 50 mm2, 약 25 mm2 내지 약 75 mm2, 약 50 mm2 내지 약 100 mm2, 약 75 mm2 내지 약 200 mm2, 약 100 mm2 내지 약 350 mm2, 약 150 mm2 내지 약 500 mm2, 약 300 mm2 내지 약 750 mm2, 약 500 mm2 내지 약 1,000 mm2, 약 750 mm2 내지 약 1,500 mm2, 또는 약 950 mm2 내지 2,000 mm2, 예를 들어, 약 8,000 ㎛2, 약 9,000 ㎛2, 약 1 mm2, 약 5 mm2, 약 10 mm2, 약 15 mm2, 약 20 mm2, 약 25 mm2, 약 50 mm2, 약 60 mm2, 약 75 mm2, 약 80 mm2, 약 100 mm2, 약 150 mm2, 약 200 mm2, 약 250 mm2, 약 300 mm2, 약 350 mm2, 약 400 mm2, 약 450 mm2, 약 500 mm2, 약 600 mm2, 약 700 mm2, 약 800 mm2, 약 900 mm2, 약 1,000 mm2, 약 1,100 mm2, 약 1,200 mm2, 약 1,300 mm2, 약 1,400 mm2, 약 1,500 mm2, 약 1,600 mm2, 약 1,700 mm2, 약 1,800 mm2, 약 1,900 mm2, 또는 약 2,000 mm2)의 횡단면적을 갖는다.
선행하는 시스템들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 0.005 mm 내지 50 mm (예를 들어, 0.005 mm 내지 0.05 mm, 0.005 mm 내지 0.5 mm, 0.005 mm 내지 25 mm, 0.01 mm 내지 1 mm, 0.05 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.1 mm 내지 50 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 0.5 mm 내지 25 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 15 mm, 3 mm 내지 50 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 50 mm, 15 mm 내지 25 mm, 20 mm 내지 30 mm, 25 mm 내지 40, 또는 30 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.01 mm, 약 0.05 mm, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 9 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 20 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 또는 약 50 mm)의 길이를 갖는다. 시스템들의 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 25 mm (예를 들어, 0.005 mm 내지 0.05 mm, 0.005 mm 내지 0.5 mm, 0.01 mm 내지 1 mm, 0.05 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 0.5 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 10 mm, 7 mm 내지 15 mm, 10 mm 내지 20 mm, 또는 15 mm 내지 25 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.01 mm, 약 0.05 mm, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 10 mm, 약 12 mm, 약 15 mm, 약 18 mm, 약 20 mm, 약 23 mm 또는 약 25 mm)의 길이를 갖는다.
선행하는 시스템들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 제1 전극 및/또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘은 0.01 mm 내지 500 mm (예를 들어, 0.01 mm 내지 0.1 mm, 0.01 mm 내지 0.5 mm, 0.01 mm 내지 10 mm, 0.05 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 0.5 mm 내지 50 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 15 mm, 3 mm 내지 50 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 100 mm, 15 mm 내지 30 mm, 20 mm 내지 40 mm, 20 mm 내지 200 mm, 30 mm 내지 50, 30 mm 내지 300 mm, 45 mm 내지 60 mm, 50 mm 내지 100 mm, 50 mm 내지 500 mm, 75 mm 내지 150 mm, 75 mm 내지 300 mm, 100 mm 내지 200 mm, 100 mm 내지 500 mm, 150 mm 내지 300 mm, 200 mm 내지 400 mm, 300 mm 내지 450 mm, 또는 350 mm 내지 500 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.01 mm, 약 0.05 mm, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 약 50 mm, 약 60 mm, 약 70 mm, 약 80 mm, 약 90 mm, 약 100 mm, 약 150 mm, 약 200 mm, 약 250 mm, 약 300 mm, 약 350 mm, 약 400 mm, 약 450 mm, 또는 약 500 mm)의 최소 단면 치수를 갖는다.
본 발명의 시스템들의 일부 실시예들에서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘의 최소 단면 치수 대 전기천공 구역의 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1 (예를 들어, 1:10 내지 1:5, 1:10 내지 1:2, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:5 내지 5:1, 1:2 내지 2:3, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 6:1, 2:3 내지 2:1, 2:3 내지 4:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 3:1, 1:1 내지 10:1, 3:2 내지 3:1, 3:2 내지 6:1, 2:1 내지 3:1, 2:1 내지 5:1, 5:2 내지 5:1, 3:1 내지 4:1, 7:2 내지 5:1, 7:2 내지 10:1, 4:1 내지 8:1, 5:1 내지 10:1, 또는 7:1 내지 10:1, 예를 들어, 약 1:10, 약 1:9, 약 1:8, 약 1:7, 약 1:6, 약 1:5, 약 1:2, 약 2:3, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 9:2, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 또는 약 10:1)이다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 최소 단면 치수 대 전기천공 구역의 길이의 비는 1:100 내지 100:1 (예를 들어, 1:100 내지 1:50, 1:100 내지 1:25, 1:100 내지 1:10, 1:100 내지 1:1, 1:50 내지 1:5, 1:50 내지 1:2, 1:50 내지 2:1, 1:25 내지 1:10, 1:25 내지 1:5, 1:25 내지 1:1, 1:25 내지 10:1, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 5:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 100:1, 2:1 내지 5:1, 2:1 내지 20:1, 3:1 내지 10:1, 4:1 내지 25:1, 5:1 내지 50:1, 10:1 내지 50:1, 40:1 내지 80:1, 50:1 내지 100:1, 또는 75:1 내지 90:1, 예를 들어, 약 1:100, 약 1:75, 약 1:50, 약 1:25, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 5:1, 약 10:1, 약 20:1, 약 30:1, 약 40:1, 약 50:1, 약 60:1, 약 70:1, 약 80:1, 약 90:1 또는 약 100:1)이다.
일부 실시예들에서, 제1 전극 및/또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘의 횡단면적 대 전기천공 구역의 횡단면적의 비는 1:100 내지 100:1 (예를 들어, 1:100 내지 1:50, 1:100 내지 1:25, 1:100 내지 1:10, 1:100 내지 1:1, 1:50 내지 1:5, 1:50 내지 1:2, 1:50 내지 2:1, 1:25 내지 1:10, 1:25 내지 1:5, 1:25 내지 1:1, 1:25 내지 10:1, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:10 내지 10:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:5 내지 50:1, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 10:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 5:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 100:1, 2:1 내지 5:1, 2:1 내지 20:1, 2:1 내지 50:1, 3:1 내지 10:1, 3:1 내지 30:1, 4:1 내지 25:1, 5:1 내지 10:1, 5:1 내지 50:1, 10:1 내지 50:1, 10:1 내지 100:1, 40:1 내지 80:1, 50:1 내지 100:1, 또는 75:1 내지 90:1, 예를 들어, 약 1:100, 약 1:75, 약 1:50, 약 1:25, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 약 10:1, 약 15:1, 약 20:1, 약 25:1, 약 30:1, 약 40:1, 약 50:1, 약 60:1, 약 70:1, 약 80:1, 약 90:1 또는 약 100:1)이다. 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나 또는 둘 모두는 다공성 또는 전도성 유체(예를 들어, 액체)일 수 있다.
선행하는 시스템들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 시스템은 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘과 유체 연통되는 제3 저장소를 포함하며, 여기서 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나는 제3 저장소와 유체 연통하기 위한 추가 유입구를 갖는다. 일부 실시예들에서, 시스템은 제1 유입구와 유체 연통되는 유체 전달 소스를 더 포함하며, 유체 전달 소스는 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 전달하도록 구성된다.
일부 실시예들에서, 본 발명의 시스템은 전압 펄스들을 제1 전극 및 제2 전극에 전달하기 위해 전위 소스에 동작 가능하게 결합된 컨트롤러를 더 포함하며, 전압 펄스들은 제1 전극과 제2 전극 사이에 전위차를 생성하며, 이에 따라 전기천공 구역에서 전계를 생성한다. 일부 실시예들에서, 시스템은 (예를 들어, 본원에 제공된 장치들의 복수의 임의의 실시예(들)의 일부로서) 복수의 전기천공 구역들을 포함한다. 복수의 전기천공 구역들 각각은 실질적으로 균일하거나 불균일한 횡단면적을 가질 수 있다.
일부 실시예들에서, 시스템은 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 적어도 하나의 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징을 포함하는 외부 구조체를 더 포함한다(예를 들어, 외부 구조체는 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전기 입력 및 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전기 입력을 더 포함한다). 하우징은, 복수의 세포들이 현탁되어 있는 액체 및/또는 장치의 온도를 증가시키도록 구성된 열 컨트롤러를 포함할 수 있다. 열 컨트롤러는 가열 블록, 액체 흐름, 배터리 전력 히터, 및 박막 히터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 가열 요소일 수 있다. 추가로 또는 대안으로, 열 컨트롤러는, 복수의 세포들이 현탁된 장치 및/또는 액체의 온도를 감소시키도록 구성될 수 있으며, 열 컨트롤러는 액체 유동, 증발 냉각기, 및 펠티에 장치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 냉각 요소이다.
본 발명의 선행하는 시스템들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 전위 소스는 외부 구조체의 제1 및 제2 전기 입력들에 탈착 가능하게 연결된다. 제1 또는 제2 전기 입력들과 전위 소스 사이의 탈착 가능한 연결은 클램프, 클립, 스프링, 시스(sheath), 와이어 브러시, 기계적 연결, 유도성 연결, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 외부 구조체는 장치와 일체형이거나 이에 탈착 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시예들에서, 하우징(예를 들어, 카트리지)은 복수의 장치들을 병렬로, 직렬로, 또는 시간적으로 오프셋하여 통전하도록 구성되며, 하우징은 복수의 전기천공 장치들을 수용하는 트레이를 더 포함하고, 트레이는 2개의 그리드 전극들로 수정되며, 제1 그리드 전극은 제2 그리드 전극으로부터 전기적으로 격리되며, 복수의 장치들 각각의 제1 전극의 외부는 제1 스프링 로딩형 전극, 제1 기계적 연결 전극, 또는 제1 유도 연결 전극 중 어느 하나와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되고, 복수의 장치들 각각의 제2 전극의 외부는 제2 스프링 로딩형 전극, 제2 기계적 연결 전극, 또는 제2 유도 연결 전극 중 어느 하나와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되며, 복수의 장치들 각각은 그리드 전극들 내의 개구를 통해 하우징(예를 들어, 카트리지)에 탈착 가능하게 들어가며, 각 장치의 제1 스프링 로딩형 전극, 제1 기계적 연결 전극, 또는 제1 유도 연결 전극 중 어느 하나는 제1 그리드 전극과 동작 가능하게 접촉되고, 각 장치의 제2 스프링 로딩형 전극, 제2 기계적 연결 전극, 또는 제2 유도 연결 전극 중 어느 하나는 제2 그리드 전극과 동작 가능하게 접촉되며, 그리드 전극들은 전위 소스에 연결된다.
일부 실시예들에서, 하우징(예를 들어, 카트리지)은 연속 유동 전기천공법에 사용되는 하나 이상의 앞서 설명된 발명들 또는 하나 이상의 전기천공 장치들을 캡슐화한다. 일부 실시예들에서, 하우징(예를 들어, 카트리지)은 환자들에게 세포 치료법을 전달하는 자동화된 폐쇄 시스템과 함께 사용되도록 및/또는 그에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 하우징은 시료의 전기천공 동안, 그 전, 및 그 후 세포 현탁액 및/또는 완중액 저장을 위한 냉각/가열 영역/인클로저를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 시스템(예를 들어, 하나 이상의 장치들 및 하우징)은 외부적으로 전력이 공급된다.
일부 실시예들에서, 시스템은 또한 사용자가 이 기능을 선택하는 경우 독립적으로 또는 자율적으로 전기천공 파라미터들을 조정하는 능력을 갖는 최적화 알고리즘들을 포함한다. 이러한 최적화 알고리즘은 세포 유형, 전도도, 현탁액의 체적, 점도, 전기천공 카트리지의 수명, 현탁액의 물리적 상태 또는 전기천공 장치의 상태에 따라 달라질 수 있는 전기천공 프로세스에 사용되는 파라미터들의 연속적인 조정을 허용한다.
시스템의 선행하는 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 전위 소스는 전압 펄스들을 그리드 전극들에 전달하며, 제1 그리드 전극은 특정 인가된 전압에서 통전되는 반면, 제2 그리드 전극은 특정 인가된 전압에서 통전되며, 복수의 장치들 각각은 각 장치의 적어도 하나의 전기천공 구역들 각각 내에서 생성된 전계의 크기가 실질적으로 동일하도록 동일한 인가된 전압 펄스로 그리드 전극들에 의해 통전된다. 일부 실시예들에서, 전위 소스는 그리드 전극들로의 전압 펄스들의 전달을 변조하도록 구성된 추가 회로부 또는 프로그래밍을 포함하며, 복수의 장치들 각각은 그리드 전극들로부터 상이한 전압을 수신할 수 있고, 각 장치의 적어도 하나의 전기천공 구역들 각각 내에서 생성된 전계의 크기는 상이하다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 장치를 포함하는, 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 시스템을 제공하는 것으로, 상기 장치는, 제1 유입구, 제1 유출구 및 제1 루멘을 포함하는 제1 전극; 제2 유입구, 제2 유출구 및 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 루멘과 유체 연통되며, 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 유입구와 제1 유출구 사이에서 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구; 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 루멘과 유체 연통되며, 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 유입구와 제2 유출구 사이에서 제2 전극과 교차하는, 기 제4 유입구 및 제4 유출구; 및 제1 유출구와 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 전기천공 구역은 0.005 mm 내지 50 mm (예를 들어, 0.005 mm 내지 0.05 mm, 0.005 mm 내지 0.5 mm, 0.005 mm 내지 25 mm, 0.01 mm 내지 1 mm, 0.05 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.1 mm 내지 50 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 0.5 mm 내지 25 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 15 mm, 3 mm 내지 50 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 50 mm, 15 mm 내지 25 mm, 20 mm 내지 30 mm, 25 mm 내지 40, 또는 30 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.01 mm, 약 0.05 mm, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 9 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 20 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 또는 약 50 mm)의 길이를 가지며, 전기천공 구역의 횡단면적은 실질적으로 균일하며, 제1 루멘의 최소 단면 치수 대 전기천공 구역의 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1(예를 들어, 1:10 내지 1:5, 1:10 내지 1:2, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:5 내지 5:1, 1:2 내지 2:3, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 6:1, 2:3 내지 2:1, 2:3 내지 4:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 3:1, 1:1 내지 10:1, 3:2 내지 3:1, 3:2 내지 6:1, 2:1 내지 3:1, 2:1 내지 5:1, 5:2 내지 5:1, 3:1 내지 4:1, 7:2 내지 5:1, 7:2 내지 10:1, 4:1 내지 8:1, 5:1 내지 10:1, 또는 7:1 내지 10:1, 예를 들어, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2, 약 2:3, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 9:2, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 또는 10:1)이며, 제2 루멘의 최소 단면 치수 대 전기천공 구역의 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1 (예를 들어, 1:10 내지 1:5, 1:10 내지 1:2, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:5 내지 5:1, 1:2 내지 2:3, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 6:1, 2:3 내지 2:1, 2:3 내지 4:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 3:1, 1:1 내지 10:1, 3:2 내지 3:1, 3:2 내지 6:1, 2:1 내지 3:1, 2:1 내지 5:1, 5:2 내지 5:1, 3:1 내지 4:1, 7:2 내지 5:1, 7:2 내지 10:1, 4:1 내지 8:1, 5:1 내지 10:1, 또는 7:1 내지 10:1, 예를 들어, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2, 약 2:3, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 9:2, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 또는 약 10:1)이며, 제1 유출구, 전기천공 구역 및 제2 유입구는 유체 연통되는, 상기 전기천공 구역; 및 전위 소스로서, 장치의 제1 및 제2 전극들은 전위 소스와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되는, 상기 전위 소스를 포함한다. 전기천공 구역의 횡단면은 원형, 디스크, 타원형, 규칙적인 다각형, 불규칙적인 다각형, 곡선형 형상, 별, 평행사변형, 사다리꼴, 및 불규칙적인 형상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폐쇄 형상이다. 전기천공 구역은 실질적으로 원형의 횡단면을 가질 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 장치를 포함하는, 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 시스템을 제공하는 것으로, 상기 장치는, 제1 유입구, 제1 유출구 및 제1 루멘을 포함하는 제1 전극; 제2 유입구, 제2 유출구 및 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 루멘과 유체 연통되며, 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 유입구와 제1 유출구 사이에서 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구; 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 루멘과 유체 연통되며, 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 유입구와 제2 유출구 사이에서 제2 전극과 교차하는, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구; 및 제1 유출구와 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 전기천공 구역은 0.005 mm 내지 50 mm (예를 들어, 0.005 mm 내지 0.05 mm, 0.005 mm 내지 0.5 mm, 0.005 mm 내지 25 mm, 0.01 mm 내지 1 mm, 0.05 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.1 mm 내지 50 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 0.5 mm 내지 25 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 15 mm, 3 mm 내지 50 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 50 mm, 15 mm 내지 25 mm, 20 mm 내지 30 mm, 25 mm 내지 40, 또는 30 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.01 mm, 약 0.05 mm, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 9 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 20 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 또는 약 50 mm)의 길이를 가지며, 약 100 ㎛ 초과 (예를 들어, 100 ㎛ 내지 10 mm, 150 ㎛ 내지 15 mm, 200 ㎛ 내지 10 mm, 250 ㎛ 내지 5 mm, 500 ㎛ 내지 10 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 50 mm, 5 mm 내지 25 mm, 또는 20 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 5 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 또는 약 50 mm)인 최소 단면 치수를 포함하며, 전기천공 구역의 횡단면적은 실질적으로 균일하며, 약 100 ㎛ 초과(예를 들어, 100 ㎛ 내지 10 mm, 150 ㎛ 내지 15 mm, 200 ㎛ 내지 10 mm, 250 ㎛ 내지 5 mm, 500 ㎛ 내지 10 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 50 mm, 5 mm 내지 25 mm, 또는 20 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 5 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 또는 약 50 mm)인 최소 단면 치수를 포함하며, 제1 루멘의 최소 단면 치수 대 전기천공 구역의 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1(예를 들어, 1:10 내지 1:5, 1:10 내지 1:2, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:5 내지 5:1, 1:2 내지 2:3, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 6:1, 2:3 내지 2:1, 2:3 내지 4:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 3:1, 1:1 내지 10:1, 3:2 내지 3:1, 3:2 내지 6:1, 2:1 내지 3:1, 2:1 내지 5:1, 5:2 내지 5:1, 3:1 내지 4:1, 7:2 내지 5:1, 7:2 내지 10:1, 4:1 내지 8:1, 5:1 내지 10:1, 또는 7:1 내지 10:1, 예를 들어, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2, 약 2:3, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 9:2, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 또는 10:1)이며, 제2 루멘의 최소 단면 치수 대 전기천공 구역의 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1 (예를 들어, 1:10 내지 1:5, 1:10 내지 1:2, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:5 내지 5:1, 1:2 내지 2:3, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 6:1, 2:3 내지 2:1, 2:3 내지 4:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 3:1, 1:1 내지 10:1, 3:2 내지 3:1, 3:2 내지 6:1, 2:1 내지 3:1, 2:1 내지 5:1, 5:2 내지 5:1, 3:1 내지 4:1, 7:2 내지 5:1, 7:2 내지 10:1, 4:1 내지 8:1, 5:1 내지 10:1, 또는 7:1 내지 10:1, 예를 들어, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2, 약 2:3, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 9:2, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 또는 약 10:1)이며, 제1 유출구, 전기천공 구역 및 제2 유입구는 유체 연통되는, 상기 전기천공 구역; 및 전위 소스로서, 장치의 제1 및 제2 전극들은 전위 소스와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되는, 상기 전위 소스를 포함한다. 전기천공 구역의 횡단면은 원형, 디스크, 타원형, 규칙적인 다각형, 불규칙적인 다각형, 곡선형 형상, 별, 평행사변형, 사다리꼴, 및 불규칙적인 형상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폐쇄 형상이다. 전기천공 구역은 실질적으로 원형의 횡단면을 가질 수 있다.
선행하는 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 0.1 mm 내지 50 mm(예를 들어, 0.1 mm 내지 0.5 mm, 0.1 mm 내지 1 mm, 0.1 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 15 mm, 3 mm 내지 50 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 100 mm, 15 mm 내지 30 mm, 20 mm 내지 40 mm, 20 mm 내지 200 mm, 30 mm 내지 50, 45 mm 내지 60 mm, 50 mm 내지 100 mm, 75 mm 내지 150 mm, 100 mm 내지 200 mm, 150 mm 내지 300 mm, 200 mm 내지 400 mm, 300 mm 내지 450 mm, 또는 350 mm 및 500 mm, 예를 들어, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 또는 약 50 mm)의 최소 단면 치수를 갖는다.
일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 약 7,850 ㎛2 내지 약 2,000 mm2 (예를 들어, 약 8,000 ㎛2 내지 약 1 mm2, 약 8,000 ㎛2 내지 약 10 mm2, 약 8,000 ㎛2 내지 약 100 mm2, 약 9,000 ㎛2 내지 약 5 mm2, 약 1 mm2 내지 약 10 mm2, 약 1 mm2 내지 약 100 mm2, 약 3 mm2 내지 약 20 mm2, 약 10 mm2 내지 약 50 mm2, 약 25 mm2 내지 약 75 mm2, 약 50 mm2 내지 약 100 mm2, 약 75 mm2 내지 약 200 mm2, 약 100 mm2 내지 약 350 mm2, 약 150 mm2 내지 약 500 mm2, 약 300 mm2 내지 약 750 mm2, 약 500 mm2 내지 약 1,000 mm2, 약 750 mm2 내지 약 1,500 mm2, 또는 약 950 mm2 내지 2,000 mm2, 예를 들어, 약 8,000 ㎛2, 약 9,000 ㎛2, 약 1 mm2, 약 5 mm2, 약 10 mm2, 약 15 mm2, 약 20 mm2, 약 25 mm2, 약 50 mm2, 약 60 mm2, 약 75 mm2, 약 80 mm2, 약 100 mm2, 약 150 mm2, 약 200 mm2, 약 250 mm2, 약 300 mm2, 약 350 mm2, 약 400 mm2, 약 450 mm2, 약 500 mm2, 약 600 mm2, 약 700 mm2, 약 800 mm2, 약 900 mm2, 약 1,000 mm2, 약 1,100 mm2, 약 1,200 mm2, 약 1,300 mm2, 약 1,400 mm2, 약 1,500 mm2, 약 1,600 mm2, 약 1,700 mm2, 약 1,800 mm2, 약 1,900 mm2, 또는 약 2,000 mm2)의 횡단면적을 갖는다.
일부 실시예들에서, 전기천공 구역은 0.005 mm 내지 50 mm (예를 들어, 0.005 mm 내지 0.05 mm, 0.005 mm 내지 0.5 mm, 0.005 mm 내지 25 mm, 0.01 mm 내지 1 mm, 0.05 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.1 mm 내지 50 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 0.5 mm 내지 25 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 15 mm, 3 mm 내지 50 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 50 mm, 15 mm 내지 25 mm, 20 mm 내지 30 mm, 25 mm 내지 40, 또는 30 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.01 mm, 약 0.05 mm, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 9 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 20 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 또는 약 50 mm)의 길이를 갖는다. 본 발명의 시스템들의 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 25 mm (예를 들어, 0.005 mm 내지 0.05 mm, 0.005 mm 내지 0.5 mm, 0.01 mm 내지 1 mm, 0.05 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 0.5 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 10 mm, 7 mm 내지 15 mm, 10 mm 내지 20 mm, 또는 15 mm 내지 25 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.01 mm, 약 0.05 mm, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 10 mm, 약 12 mm, 약 15 mm, 약 18 mm, 약 20 mm, 약 23 mm 또는 약 25 mm)의 길이를 갖는다.
일부 실시예들에서, 장치 또는 시스템은 적어도 하나의 전기천공 구역과 유체 연통되고, 복수의 세포들이 유사하거나 상이한 전계 및 유사하거나 상이한 유동 속도(예를 들어, 변위 속도)를 겪는 세포 트랜스펙션을 위한 복수의 유체 구속 캐비티들을 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 전극들은 다수의 비-전도성 유체 구속 캐비티들에서 수축 및 지지 세포 전기천공을 유도하는 다수의 유입구들 및 유출구들을 갖는 모든 구성(예를 들어, 매니폴드)일 수 있다. 일부 실시예들에서, 세포 전기천공을 위한 복수의 유체 구속 캐비티들 각각은 개별 하우징 (예를 들어, 카트리지)을 포함하고, 독립적으로 동작할 수 있다. 일부 실시예들에서, 각 개별 하우징(예를 들어, 카트리지)은 유동 속도들(예를 들어, 변위 속도들), 전계, 또는 다른 파라미터들의 조합을 제어하는 동일하거나 상이한 동작 파라미터들에 노출되도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 각 하우징은 하나 이상의 컨트롤러 시스템들에 통합되도록 구성된다. 다른 실시예들에서, 하나 이상의 컨트롤러 시스템들은 하나 이상의 개별 하우징들을 수용하도록 구성된다.
일부 실시예들에서, 장치 또는 시스템은 적어도 하나의 전기천공 구역과 유체 연통되고, 복수의 세포들이 유사하거나 상이한 전계 및 유사하거나 상이한 유동 속도(예를 들어, 변위 속도)를 겪는 세포 전기천공을 위한 복수의 유체 구속 캐비티들을 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 전극들은 다수의 비-전도성 유체 구속 캐비티들에서 수축 및 지지 세포 전기천공을 유도하는 다수의 유입구들 및 유출구들을 갖는 모든 구성(예를 들어, 매니폴드)일 수 있다. 일부 실시예들에서, 세포 전기천공을 위한 복수의 유체 구속 캐비티들 각각은 개별 하우징 (예를 들어, 카트리지)을 포함하고, 독립적으로 동작할 수 있다. 일부 실시예들에서, 각 개별 하우징(예를 들어, 카트리지)은 유동 속도들(예를 들어, 변위 속도들), 전계, 또는 다른 파라미터들의 조합을 제어하는 동일하거나 상이한 동작 파라미터들에 노출되도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 각 하우징은 하나 이상의 컨트롤러 시스템들에 통합되도록 구성된다. 다른 실시예들에서, 하나 이상의 컨트롤러 시스템들은 하나 이상의 개별 하우징들을 수용하도록 구성된다.
일부 실시예들에서, 제1 전극 및/또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘은 0.01 mm 내지 500 mm (예를 들어, 0.01 mm 내지 0.1 mm, 0.01 mm 내지 0.5 mm, 0.01 mm 내지 10 mm, 0.05 mm 내지 5 mm, 0.1 mm 내지 10 mm, 0.5 mm 내지 5 mm, 0.5 mm 내지 50 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 15 mm, 3 mm 내지 50 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 100 mm, 15 mm 내지 30 mm, 20 mm 내지 40 mm, 20 mm 내지 200 mm, 30 mm 내지 50, 30 mm 내지 300 mm, 45 mm 내지 60 mm, 50 mm 내지 100 mm, 50 mm 내지 500 mm, 75 mm 내지 150 mm, 75 mm 내지 300 mm, 100 mm 내지 200 mm, 100 mm 내지 500 mm, 150 mm 내지 300 mm, 200 mm 내지 400 mm, 300 mm 내지 450 mm, 또는 350 mm 내지 500 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.01 mm, 약 0.05 mm, 약 0.1 mm, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 약 50 mm, 약 60 mm, 약 70 mm, 약 80 mm, 약 90 mm, 약 100 mm, 약 150 mm, 약 200 mm, 약 250 mm, 약 300 mm, 약 350 mm, 약 400 mm, 약 450 mm, 또는 약 500 mm)의 최소 단면 치수를 갖는다.
일부 실시예들에서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘의 최소 단면 치수 대 전기천공 구역의 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1 (예를 들어, 1:10 내지 1:5, 1:10 내지 1:2, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:5 내지 5:1, 1:2 내지 2:3, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 6:1, 2:3 내지 2:1, 2:3 내지 4:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 3:1, 1:1 내지 10:1, 3:2 내지 3:1, 3:2 내지 6:1, 2:1 내지 3:1, 2:1 내지 5:1, 5:2 내지 5:1, 3:1 내지 4:1, 7:2 내지 5:1, 7:2 내지 10:1, 4:1 내지 8:1, 5:1 내지 10:1, 또는 7:1 내지 10:1, 예를 들어, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2, 약 2:3, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 9:2, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 또는 약 10:1)이다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 최소 단면 치수 대 전기천공 구역의 길이의 비는 1:100 내지 100:1 (예를 들어, 1:100 내지 1:50, 1:100 내지 1:25, 1:100 내지 1:10, 1:100 내지 1:1, 1:50 내지 1:5, 1:50 내지 1:2, 1:50 내지 2:1, 1:25 내지 1:10, 1:25 내지 1:5, 1:25 내지 1:1, 1:25 내지 10:1, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:10 내지 10:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:5 내지 50:1, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 10:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 5:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 100:1, 2:1 내지 5:1, 2:1 내지 20:1, 2:1 내지 50:1, 3:1 내지 10:1, 3:1 내지 30:1, 4:1 내지 25:1, 5:1 내지 10:1, 5:1 내지 50:1, 10:1 내지 50:1, 10:1 내지 100:1, 40:1 내지 80:1, 50:1 내지 100:1, 또는 75:1 내지 90:1, 예를 들어, 약 1:100, 약 1:75, 약 1:50, 약 1:25, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 약 10:1, 약 15:1, 약 20:1, 약 25:1, 약 30:1, 약 40:1, 약 50:1, 약 60:1, 약 70:1, 약 80:1, 약 90:1 또는 약 100:1)이다. 일부 실시예들에서, 제1 전극 및/또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘의 횡단면적 대 전기천공 구역의 횡단면적의 비는 1:100 내지 100:1 (예를 들어, 1:100 내지 1:50, 1:100 내지 1:25, 1:100 내지 1:10, 1:100 내지 1:1, 1:50 내지 1:5, 1:50 내지 1:2, 1:50 내지 2:1, 1:25 내지 1:10, 1:25 내지 1:5, 1:25 내지 1:1, 1:25 내지 10:1, 1:10 내지 1:1, 1:10 내지 2:1, 1:10 내지 5:1, 1:10 내지 10:1, 1:5 내지 1:2, 1:5 내지 1:1, 1:5 내지 2:1, 1:5 내지 50:1, 1:2 내지 1:1, 1:2 내지 2:1, 1:2 내지 10:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 5:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 100:1, 2:1 내지 5:1, 2:1 내지 20:1, 2:1 내지 50:1, 3:1 내지 10:1, 3:1 내지 30:1, 4:1 내지 25:1, 5:1 내지 10:1, 5:1 내지 50:1, 10:1 내지 50:1, 10:1 내지 100:1, 40:1 내지 80:1, 50:1 내지 100:1, 또는 75:1 내지 90:1, 예를 들어, 약 1:100, 약 1:75, 약 1:50, 약 1:25, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:2, 약 1:1, 약 3:2, 약 2:1, 약 5:2, 약 3:1, 약 7:2, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1, 약 10:1, 약 15:1, 약 20:1, 약 25:1, 약 30:1, 약 40:1, 약 50:1, 약 60:1, 약 70:1, 약 80:1, 약 90:1 또는 약 100:1)이다.
일부 실시예들에서, 시스템은 제1 유입구와 유체 연통되는 제1 저장소, 제2 유출구와 유체 연통되는 제2 저장소, 제3 유입구 및 제3 유출구와 유체 연통되는 제3 저장소, 제4 유입구 및 제4 유출구와 유체 연통되는 제4 저장소, 및/또는 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 루멘과 유체 연통되는 제5 저장소를 더 포함하며, 예를 들어, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나는 제5 저장소와 유체 연통하기 위한 적어도 하나의 추가 유입구를 갖는다. 일부 실시예들에서, 시스템은 제1 유입구와 유체 연통되는 유체 전달 소스를 더 포함하며, 유체 전달 소스는 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 전달하도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 장치는 복수의 전기천공 구역들을 더 포함하며, 예를 들어, 복수의 전기천공 구역들 각각은 실질적으로 균일하거나 불균일한 횡단면적을 갖는다.
이전 양태들 중 어느 하나의 시스템은 전압 펄스들을 제1 및 제2 전극들에 전달하여 제1 전극과 제2 전극 사이에 전위차를 생성하기 위해 전위 소스에 동작 가능하게 결합된 컨트롤러를 추가로 포함하며, 이에 따라 전기천공 구역에서 전계를 생성한다.
일부 실시예들에서, 시스템은 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 적어도 하나의 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징을 포함하는 외부 구조체를 더 포함한다. 시스템은 제1 전극에 동작가능하게 결합된 제1 전기 입력 및 제2 전극에 동작가능하게 결합된 제2 전기 입력을 더 포함할 수 있다. 하우징은 복수의 세포들이 현탁된 장치 및/또는 액체의 온도를 증가시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함할 수 있으며, 열 컨트롤러는 가열 블록, 액체 유동, 배터리 전원 히터, 및 박막 히터로 구성된 그룹으로부터 선택된 가열 요소이다. 추가로 또는 대안으로, 하우징은, 복수의 세포들이 현탁된 장치 및/또는 액체의 온도를 감소시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함할 수 있으며, 열 컨트롤러는 액체 유동, 증발 냉각기, 및 펠티에(Peltier) 장치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 냉각 요소이다. 일부 실시예들에서, 전위 소스는 외부 구조체의 제1 및 제2 전기 입려들에 탈착 가능하게 연결되며, 예를 들어, 제1 또는 제2 전기 입력들과 전위 소스 사이의 탈착 가능한 연결은 클램프, 클립, 스프링, 시스, 와이어 브러시, 기계적 연결, 유도성 연결, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 외부 구조체 및/또는 하우징은 장치와 일체형이거나 이에 탈착 가능하게 연결될 수 있다.
일부 실시예들에서, 시스템은 예를 들어, 복수의 외부 구조체들을 갖는 복수의 장치들을 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 하우징은 복수의 장치들을 병렬로, 직렬로, 또는 시간적으로 오프셋하여 통전하도록 구성되며, 하우징은 복수의 전기천공 장치들을 수용하는 트레이를 더 포함하고, 트레이는 2개의 그리드 전극들로 수정되며, 제1 그리드 전극은 제2 그리드 전극으로부터 전기적으로 격리되며, 복수의 장치들 각각의 제1 전극의 외부는 제1 스프링 로딩형 전극, 제1 기계적 연결 전극, 또는 제1 유도 연결 전극 중 어느 하나와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되고, 복수의 장치들 각각의 제2 전극의 외부는 제2 스프링 로딩형 전극, 제2 기계적 연결 전극, 또는 제2 유도 연결 전극 중 어느 하나와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되며, 복수의 장치들 각각은 그리드 전극들 내의 개구를 통해 하우징에 탈착 가능하게 들어가며, 각 장치의 제1 스프링 로딩형 전극, 제1 기계적 연결 전극, 또는 제1 유도 연결 전극 중 어느 하나는 제1 그리드 전극과 동작 가능하게 접촉되고, 각 장치의 제2 스프링 로딩형 전극, 제2 기계적 연결 전극, 또는 제2 유도 연결 전극 중 어느 하나는 제2 그리드 전극과 동작 가능하게 접촉되며, 그리드 전극들은 전위 소스에 연결된다. 일부 실시예들에서, 전위 소스는 전압 펄스들을 그리드 전극들에 전달하며, 제1 그리드 전극은 특정 인가된 전압에서 통전되는 반면, 제2 그리드 전극은 특정 인가된 전압에서 통전되며, 복수의 장치들 각각은 각 장치의 적어도 하나의 전기천공 구역들 각각 내에서 생성된 전계의 크기가 실질적으로 동일하도록 동일한 인가된 전압 펄스로 그리드 전극들에 의해 통전된다. 일부 실시예들에서, 전위 소스는 그리드 전극들로의 전압 펄스들의 전달을 변조하도록 구성된 추가 회로부 또는 프로그래밍을 포함하며, 복수의 장치들 각각은 그리드 전극들로부터 상이한 전압을 수신할 수 있고, 각 장치의 적어도 하나의 전기천공 구역들 각각 내에서 생성된 전계의 크기는 상이할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 장치들 또는 시스템들 중 어느 하나를 사용하여 (예를 들어, 전기-기계적 전달에 의해) 유동 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 도입하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 방법은 장치를 제공하는 단계로서, 상기 장치는 제1 유출구, 제1 유입구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극; 제2 유출구, 제2 유입구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및 제1 유출구와 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 전기천공 구역은 약 100 ㎛ 초과 (예를 들어, 100 ㎛ 내지 10 mm, 150 ㎛ 내지 15 mm, 200 ㎛ 내지 10 mm, 250 ㎛ 내지 5 mm, 500 ㎛ 내지 10 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 50 mm, 5 mm 내지 25 mm, 또는 20 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 5 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 또는 약 50 mm)인 최소 단면 치수를 포함하며, 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 가지며, 제1 유출구, 전기천공 구역 및 제2 유입구는 유체 연통되는, 상기 전기천공 구역을 포함하는, 상기 제공하는 단계; 제1 및 제2 전극들 사이에 전위차를 인가하여, 전기천공 구역에서 전계를 발생시키는 단계; 및 전기천공 구역을 통해 복수의 세포들 및 조성물을 통과시켜, 복수의 세포들의 투과성을 향상시키고 조성물을 복수의 세포들 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 복수의 세포들을 통과시키는 단계는 유체 구동 양압을 인가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 제1 루멘, 제2 루멘, 또는 전기천공 구역 중 어느 것도 액체 내에 현탁된 다수의 세포들 중 어느 하나의 단면 치수가 일시적으로 압축되도록 하는 최소 단면 치수를 갖지 않는다. 전기천공은 실질적으로 비-열적 가역 전기천공, 실질적으로 비-열적 비가역 전기천공, 또는 실질적으로 열적 비가역 전기천공일 수 있다. 일부 실시예들에서, 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들의 유량은 0.001 mL/분 내지 1,000 mL/분(예를 들어, 0.001 mL/분 내지 0.05 mL/분, 0.001 mL/분 내지 0.1 mL/분, 0.001 mL/분 내지 1 mL/분, 0.05 mL/분 내지 0.5 mL/분, 0.05 mL/분 내지 5 mL/분, 0.1 mL/분 내지 1 mL/분, 0.5 mL/분 내지 2 mL/분, 1 mL/분 내지 5 mL/분, 1 mL/분 내지 10 mL/분, 1 mL/분 내지 100 mL/분, 5 mL/분 내지 25 mL/분, 5 mL/분 내지 150 mL/분, 10 mL/분 내지 100 mL/분, 15 mL/분 내지 150 mL/분, 25 mL/분 내지 100 mL/분, 25 mL/분 내지 200 mL/분, 50 mL/분 내지 150 mL/분, 50 mL/분 내지 250 mL/분, 75 mL/분 내지 200 mL/분, 75 mL/분 내지 350 mL/분, 100 mL/분 내지 250 mL/분, 100 mL/분 내지 400 mL/분, 150 mL/분 내지 450 mL/분, 200 mL/분 내지 500 mL/분, 250 mL/분 내지 700 mL/분, 300 mL/분 내지 1,000 mL/분, 400 mL/분 내지 750 mL/분, 500 mL/분 내지 1,000 mL/분, 또는 750 mL/분 내지 1,000 mL/분, 예를 들어, 약 0.001 mL/분, 약 0.01 mL/분, 약 0.05 mL/분, 약 0.1 mL/분, 약 0.5 mL/분, 약 1 mL/분, 약 5 mL/분, 약 10 mL/분, 약 15 mL/분, 약 20 mL/분, 약 30 mL/분, 약 40 mL/분, 약 50 mL/분, 약 60 mL/분,약 70 mL/분, 약 80 mL/분, 약 90 mL/분, 약 100 mL/분, 약 150 mL/분, 약 200 mL/분, 약 250 mL/분, 약 300 mL/분, 약 350 mL/분, 약 400 mL/분, 약 450 mL/분, 약 500 mL/분, 약 600 mL/분, 약 700 mL/분, 약 800 mL/분, 약 900 mL/분, 또는 약 1,000 mL/분)이며, 유체 전달 소스는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 전달하도록 구성된다.
이전의 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 전기천공 구역으로 전달되는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들의 레이놀즈 수는 0.04 내지 2.43 × 104 (예를 들어, 10 내지 2000, 100 내지 1600, 100 내지 1800, 또는 183 내지 1530)이며, 유체 전달 소스는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 전달하도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들의 최대 속도는 5 × 10-5 m/s 내지 32.7 m/s(예를 들어, 0.01 내지 10 m/s, 0.1 내지 5 m/s, 또는 0.26 내지 2.08 m/s)이며, 유체 전달 소스는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 전달하도록 구성된다. 일부 실시예들예에서, 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들의 전단율은 0.1 1/s 내지 2 × 106 1/s (예를 들어, 1 /s 내지 100,000 /s, 10 /s 내지 100,000 /s, 100 /s 내지 100,000 /s, 1,000 /s 내지 80,000 /s, 또는 2,600 내지 54,000)이며, 유체 전달 소스는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 전달하도록 구성된다. 일부 실시예들서, 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들의 피크 압력은 1 × 10-3 Pa 내지 9.5 × 104 Pa(예를 들어, 0.1 Pa 내지 10,000 Pa, 1 Pa 내지 5,000 Pa, 100 Pa 내지 3000 Pa, 또는 136 Pa 내지 1600 Pa)이며, 유체 전달 소스는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 전달하도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들의 평균 속도는 1.5 × 10-5 m/s 내지 15.9 m/s(예를 들어, 7.79 × 10-2 m/s 내지 7.81 × 10-1 m/s)이며, 유체 전달 소스는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 전달하도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들의 동적 점도(kinematic viscosity)는 1 × 10-6 m2/s 내지 15 × 10-4 m2/s (예를 들어, 1.3 × 10-6 m2/s 내지 5.6 × 10-4 m2/s)이며, 유체 전달 소스는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 전달하도록 구성된다.
이전 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들예에서, 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 어느 하나의 전기천공 구역에서의 체류 시간은 0.5 ms 내지 50 ms(예를 들어, 0.5 ms 내지 5 ms, 1 ms 내지 10 ms, 1 ms 내지 15 ms, 5 ms 내지 15 ms, 10 ms 내지 20 ms, 15 ms 내지 25 ms, 20 ms 내지 30 ms, 25 ms 내지 35 ms, 30 ms 내지 40 ms, 35 ms 내지 45 ms, 또는 40 ms 내지 50 ms, 예를 들어, 약 0.5 ms, 약 0.6 ms, 약 0.7 ms, 약 0.8 ms, 약 0.9 ms, 약 1 ms, 약 1.5 ms, 약 2 ms, 약 2.5 ms, 약 3 ms, 약 3.5 ms, 약 4 ms, 약 4.5 ms, 약 5 ms, 약 5.5 ms, 약 6 ms, 약 6.5 ms, 약 7 ms, 약 7.5 ms, 약 8 ms, 약 8.5 ms, 약 9 ms, 약 9.5 ms, 약 10 ms, 약 10.5 ms, 약 11 ms, 약 11.5 ms, 약 12 ms, 약 12.5 ms, 약 13 ms, 약 13.5 ms, 약 14 ms, 약 14.5 ms, 약 15 ms, 약 20 ms, 약 25 ms, 약 30 ms, 약 35 ms, 약 40 ms, 약 45 ms, 또는 약 50 ms)이다. 일부 실시예들에서, 체류 시간은 5 내지 20 ms(예를 들어, 6 내지 18 ms, 8 내지 15 ms, 또는 10 내지 14 ms)이다.
선행하는 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 복수의 세포들은 장치의 제2 유출구를 빠져나갈 때의 세포 표현형의 기준선 측정치에 대해 (예를 들어, 제2 유출구를 빠져나간 후 48시간 이내에, 예를 들어, 제2 유출구를 빠져나간 후 24시간 이내에, 예를 들어, 제2 유출구를 빠져나간 후 1분 내지 24시간, 5분 내지 24시간, 10분 내지 24시간, 30분 내지 24시간, 1시간 내지 24시간 또는 2시간 내지 24시간) 0% 내지 약 25%(예를 들어, 약 0% 내지 약 2.5%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 25%, 또는 약 20% 내지 약 25%, 예를 들어, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 또는 약 25%) 표현형 변화를 갖는다.
선행하는 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 복수의 세포들은 (예를 들어, 제2 유출구를 빠져나간 후 48시간 이내에, 예를 들어, 제2 유출구를 빠져나간 후 24시간 이내에, 예를 들어, 제2 유출구를 빠져나간 후 1분 내지 24시간, 5분 내지 24시간, 10분 내지 24시간, 30분 내지 24시간, 1시간 내지 24시간, 또는 2시간 내지 24시간) 장치의 제2 유출구를 빠져나갈 때의 세포 표현형의 기준선 측정치에 비해 표현형 변화가 없다.
선행하는 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 전계는 전압 펄스들에 의해 생성되며, 전압 펄스들은 특정 인가된 전압에서 제1 전극을 통전시키는 반면, 제2 전극은 특정 인가된 전압에서 통전되며, 이에 따라 제1 전극과 제2 전극 사이에 전위차를 인가하고, 전압 펄스들 각각은 -3 kV 내지 3 kV(예를 들어, -3 kV 내지 1 kV, -3 kV 내지 -1.5 kV, -2 kV 내지 2 kV, -1.5 kV 내지 1.5 kV, -1.5 kV 내지 2.5 kV, -1 kV 내지 1 kV, -1 kV 내지 2 kV, -0.5 kV 내지 0.5 kV, -0.5 kV 내지 1.5 kV, -0.5 kV 내지 3 kV, -0.01 kV 내지 2 kV, 0 kV 내지 1 kV 사이, 0 kV 내지 2 kV, 0 kV 내지 3 kV, 0.01 kV 내지 0.1 kV, 0.01 kV 내지 1 kV, 0.02 kV 내지 0.2 kV, 0.03 kV 내지 0.3 kV, 0.04 kV 내지 0.4 kV, 0.05 kV 내지 0.5 kV, 0.05 kV 내지 1.5 kV, 0.06 kV 내지 0.6 kV, 0.07 kV 내지 0.7 kV, 0.08 kV 내지 0.8 kV, 0.09 kV 내지 0.9 kV, 0.1 kV 내지 0.7 kV, 0.1 kV 내지 1 kV, 0.1 kV 내지 2 kV, 0.1 kV 내지 3 kV, 0.15 kV 내지 1.5 kV, 0.2 내지 0.6 kV, 0.2 kV 내지 2 kV, 0.25 kV 내지 2.5 kV, 0.3 kV 내지 3 kV, 0.5 kV 내지 1 kV, 0.5 kV 내지 3 kV, 0.6 kV 내지 1.5 kV, 0.7 kV 내지 1.8 kV, 0.8 kV 내지 2 kV, 0.9 kV 내지 3 kV, 1 kV 내지 2 kV, 1.5 kV 내지 2.5 kV, 또는 2 kV 내지 3 kV, 예를 들어, 약 -3 kV, 약 -2.5 kV, 약 -2 kV, 약 -1.5 kV, 약 -1 kV, 약 -0.5 kV, 약 -0.01 kV, 약 0 kV, 약 0.01 kV, 약 0.02 kV, 약 0.03 kV, 약 0.04 kV, 약 0.05 kV, 약 0.06 kV, 약 0.07 kV, 약 0.08 kV, 약 0.09 kV, 약 0.1 kV, 약 0.2 kV, 약 0.3 kV, 약 0.4 kV, 약 0.5 kV, 약 0.6 kV, 약 0.7 kV, 약 0.8 kV, 약 0.9 kV, 약 1 kV, 약 1.1 kV, 약 1.2 kV, 약 1.3 kV, 약 1.4 kV, 약 1.5 kV, 약 1.6 kV, 약 1.7 kV, 약 1.8 kV, 약 1.9 kV, 약 2 kV, 약 2.1 kV, 약 2.2 kV, 약 2.3 kV, 약 2.4 kV, 약 2.5 kV, 약 2.6 kV, 약 2.7 kV, 약 2.8 kV, 약 2.9 kV, 또는 약 3 kV)의 진폭을 갖는다. 일부 실시예들에서, 제1 전극은 제2 전극이 접지(예를 들어, 0 kV)에서 유지되는 동안 특정 인가 전압으로 통전되며, 이에 따라 제1 전극과 제2 전극 사이에 전위차를 인가한다. 일부 실시예들에서, 전압 펄스들은 0.01ms 내지 1,000ms(예를 들어, 0.01ms 내지 0.1ms, 0.01ms 내지 1ms, 0.01ms 내지 10ms, 0.05ms 내지 0.5ms, 0.05ms 내지 1ms, 0.1ms 내지 1ms, 0.1ms 내지 5ms, 0.1ms 내지 500ms, 0.5ms 내지 2ms, 1ms 내지 5ms, 1ms 내지 10ms, 1ms 내지 25ms, 1ms 내지 100ms, 1ms 내지 1,000ms, 5ms 내지 25ms, 5ms 내지 150ms, 10ms 내지 100ms, 15ms 내지 150ms, 25ms 내지 100ms, 25ms 내지 200ms, 50ms 내지 150ms, 50ms 내지 250ms, 75ms 내지 200ms, 75ms 내지 350ms, 100ms 내지 250ms, 100ms 내지 400ms, 150ms 내지 450ms, 200ms 내지 500ms, 250ms 내지 700ms, 300ms 내지 1,000ms, 400ms 내지 750ms, 500ms 내지 1,000ms, 또는 750ms 내지 1,000ms, 예를 들어, 약 0.01ms, 약 0.05ms, 약 0.1ms, 약 0.5ms, 약 1ms, 약 5ms, 약 10ms, 약 15ms, 약 20ms, 약 30ms, 약 40ms, 약 50ms, 약 60ms, 약 70ms, 약 80ms, 약 90ms, 약 100ms, 약 150ms, 약 200ms, 약 250ms, 약 300ms, 약 350ms, 약 400ms, 약 450ms, 약 500ms, 약 600ms, 약 700ms, 약 800ms, 약 900ms, 또는 약 1,000ms)의 지속시간을 갖는다. 일부 실시예들에서, 전압 펄스들은 1 Hz 내지 50,000 Hz(예를 들어, 1 Hz 내지 10 Hz, 1 Hz 내지 100 Hz, 1 Hz 내지 1,000 Hz, 5 Hz 내지 20 Hz, 5 Hz 내지 2,000 Hz, 10 Hz 내지 50 Hz, 10 Hz 내지 100 Hz, 10 Hz 내지 1,000 Hz, 10 Hz 내지 10,000 Hz, 20 Hz 내지 50 Hz, 20 Hz 내지 100 Hz, 20 Hz 내지 2,000 Hz, 20 Hz 내지 20,000 Hz, 50 Hz 내지 500 Hz, 50 Hz 내지 1,000 Hz, 50 Hz 내지 50,000 Hz, 100 Hz 내지 200 Hz, 100 Hz 내지 500Hz, 100 Hz 내지 1,000Hz, 100 Hz 내지 10,000 Hz, 100 Hz 내지 50,000 Hz, 200 Hz 내지 400Hz, 200 Hz 내지 750Hz, 200 Hz 내지 2,000 Hz, 500 Hz 내지 1,000 Hz, 750 Hz 내지 1,500Hz, 750 Hz 내지 10,000Hz, 1,000 Hz 내지 2,000 Hz, 1,000 Hz 내지 5,000 Hz, 1,000 Hz 내지 10, 000 Hz, 1,000 Hz 내지 50,000 Hz, 5,000 Hz 내지 10,000 Hz, 5,000 Hz 내지 20,000 Hz, 5,000 Hz 내지 50,000 Hz, 10,000 Hz 내지 15,000 Hz, 10,000 Hz 내지 25,000 Hz, 10,000 Hz 내지 50,000 Hz, 20,000 Hz 내지 30,000 Hz, 또는 20,000 Hz 내지 50,000 Hz, 예를 들어, 약 1 Hz, 약 5 Hz, 약 10 Hz, 약 20 Hz, 약 50 Hz, 약 75 Hz, 약 100 Hz, 약 150 Hz, 약 200 Hz, 약 300 Hz, 약 400 Hz, 약 500 Hz, 약 600 Hz, 약 700 Hz, 약 800 Hz, 약 900 Hz, 약 1,000 Hz, 약 2,000 Hz, 약 5,000 Hz, 약 10,000 Hz, 약 15,000 Hz, 약 20,000 Hz, 약 30,000 Hz, 약 40,000 Hz, 또는 약 50,000 Hz)의 주파수로 제1 및 제2 전극들에 인가된다.
일부 실시예들에서, 전압 펄스의 파형은 DC, 정사각형, 펄스, 바이폴라, 사인, 램프, 비대칭 바이폴라, 임의적, 및 이들의 임의의 중첩 또는 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, 전압 펄스들로부터 생성된 전계는 1 V/cm 내지 50,000 V/cm(예를 들어, 1 V/cm 내지 50 V/cm, 1 V/cm 내지 500 V/cm, 1 V/cm 내지 1,000 V/cm, 1 V/cm 내지 20,000 V/cm, 5 V/cm 내지 10,000 V/cm, 25 V/cm 내지 200 V/cm, 50 V/cm 내지 250 V/cm, 50 V/cm 내지 500 V/cm, 50 V/cm 내지 15,000 V/cm, 100 V/cm 내지 1,000 V/cm, 300 V/cm 내지 500 V/cm, 500 V/cm 내지 10,000 V/cm, 1000 V/cm 내지 25,000 V/cm, 5,000 V/cm 내지 25,000 V/cm, 10,000 V/cm 내지 20,000 V/cm, 10,000 V/cm 내지 50,000 V/cm, 예를 들어, 약 1 V/cm, 약 2 V/cm, 약 3 V/cm, 약 4 V/cm, 약 5 V/cm, 약 6 V/cm, 약 7 V/cm, 약 8 V/cm, 약 9 V/cm, 약 10 V/cm, 약 20 V/cm, 약 30 V/cm, 약 40 V/cm, 약 50 V/cm, 약 60 V/cm, 약 70 V/cm, 약 80 V/cm, 약 90 V/cm, 약 100 V/cm, 약 150 V/cm, 약 200 V/cm, 약 250 V/cm, 약 300 V/cm 약 350 V/cm, 약 400 V/cm, 약 450 V/cm, 약 500 V/cm, 약 550 V/cm, 약 600 V/cm, 약 650 V/cm, 약 700 V/cm, 약 750 V/cm, 약 800 V/cm, 약 900 V/cm, 약 1,000 V/cm, 약 2,000 V/cm, 약 3,000 V/cm, 약 4,000 V/cm, 약 5,000 V/cm, 약 6,000 V/cm, 약 7,000 V/cm, 약 8,000 V/cm, 약 9,000 V/cm, 약 10,000 V/cm, 약 15,000 V/cm, 약 20,000 V/cm, 약 25,000 V/cm, 약 30,000 V/cm, 약 35,000 V/cm, 약 40,000 V/cm, 약 45,000 V/cm, 또는 약 50,000 V/cm)의 크기를 갖는다.
일부 실시예들에서, 전압 펄스들의 듀티 사이클은 0.001% 내지 100%(예를 들어, 0.001% 내지 0.1%, 0.001% 내지 10%, 0.01% 내지 1%, 0.01% 내지 100%, 0.1% 내지 5%, 0.1% 내지 99%, 1% 내지 10%, 1% 내지 97%, 2.5% 내지 20%, 5% 내지 25%, 5% 내지 40%, 10% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 95%, 15% 내지 60%, 15% 내지 85%, 20% 내지 40%, 30% 내지 50%, 40% 내지 60%, 40% 내지 75%, 50% 내지 85%, 50% 내지 100%, 75% 내지 100%, 또는 90% 내지 100%, 예를 들어, 약 0.001%, 약 0.002%, 약 0.003%, 약 0.004%, 약 0.005%, 약 0.006%, 약 0.007%, 약 0.008%, 약 0.009%, 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 약 0.06%, 약 0.07%, 약 0.08%, 약 0.09%, 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100%)이다.
일부 실시예들에서, 액체는 0.001 mS/cm 내지 500 mS/cm(예를 들어, 0.001 mS/cm 내지 0.05 mS/cm, 0.001 mS/cm 내지 0.1 mS/cm, 0.001 mS/cm 내지 1 mS/cm, 0.05 mS/cm 내지 0.5 mS/cm, 0.05 mS/cm 내지 5 mS/cm, 0.1 mS/cm 내지 1 mS/cm, 0.1 mS/cm 내지 100 mS/cm, 0.5 mS/cm 내지 2 mS/cm, 1 mS/cm 내지 5 mS/cm, 1 mS/cm 내지 10 mS/cm, 1 mS/cm 내지 100 mS/cm, 1 mS/cm 내지 500 mS/cm, 5 mS/cm 내지 25 mS/cm, 5 mS/cm 내지 150 mS/cm, 10 mS/cm 내지 100 mS/cm, 10 mS/cm 내지 250 mS/cm, 15 mS/cm 내지 150 mS/cm, 25 mS/cm 내지 100 mS/cm, 25 mS/cm 내지 200 mS/cm, 50 mS/cm 내지 150 mS/cm, 50 mS/cm 내지 250 mS/cm, 50 mS/cm 내지 500 mS/cm, 75 mS/cm 내지 200 mS/cm, 75 mS/cm 내지 350 mS/cm, 100 mS/cm 내지 250 mS/cm, 100 mS/cm 내지 400 mS/cm, 100 mS/cm 내지 500 mS/cm, 150 mS/cm 내지 450 mS/cm, 200 mS/cm 내지 500 mS/cm, 300 mS/cm 내지 500 mS/cm, 예를 들어, 약 0.001 mS/cm, 약 0.01 mS/cm, 약 0.05 mS/cm, 약 0.1 mS/cm, 약 0.5 mS/cm, 약 1 mS/cm, 약 5 mS/cm, 약 10 mS/cm, 약 15 mS/cm, 약 20 mS/cm, 약 30 mS/cm, 약 40 mS/cm, 약 50 mS/cm, 약 60 mS/cm, 약 70 mS/cm, 약 80 mS/cm, 약 90 mS/cm, 100 mS/cm, 150 mS/cm, 200 mS/cm, 250 mS/cm, 300 mS/cm, 350 mS/cm, 400 mS/cm, 450 mS/cm, 또는 500 mS/cm)의 전도도를 갖는다.
일부 실시예들에서, 액체 내에 현탁된 복수의 세포들의 온도는 0℃ 내지 50℃(0℃ 내지 5℃, 2℃ 내지 15℃, 3℃ 내지 30℃, 4℃ 내지 10℃, 4℃ 내지 25℃, 5℃ 내지 30℃, 7℃ 내지 35℃, 10℃ 내지 25℃, 10℃ 내지 40℃, 15℃ 내지 50℃, 20℃ 내지 40℃, 25℃ 내지 50℃, 또는 35℃ 내지 45℃, 예를 들어, 약 0℃, 약 1℃, 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 또는 약 50℃)이다.
일부 실시예들에서, 상기 방법은 천공 후 액체에 현탁된 복수의 세포들을 회수 완중액에 저장하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 세포들은 0.1% 내지 99.9%(예를 들어, 0.1% 내지 5%, 1% 내지 10%, 2.5% 내지 20%, 5% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 60%, 10% 내지 90%, 25% 내지 40%, 25% 내지 85%, 30% 내지 50%, 30% 내지 80%, 40% 내지 65%, 50% 내지 75%, 50% 내지 99.9%, 60% 내지 80%, 75% 내지 99.9%, 또는 85% 내지 99.9%, 예를 들어, 약 0.1%, 약 0.15%, 약 0.2%, 약 0.25%, 약 0.3%, 약 0.35%, 약 0.4%, 약 0.45%, 약 0.5%, 약 0.55%, 약 0.6%, 약 0.65%, 약 0.7%, 약 0.75%, 약 0.8%, 약 0.85%, 약 0.9%, 약 0.95%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 또는 약 99.9%)의 조성물의 도입 후 생존 가능성을 갖는다.
일부 실시예들에서, 조성물은 0.1% 내지 99.9%(예를 들어, 0.1% 내지 5%, 1% 내지 10%, 2.5% 내지 20%, 5% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 60%, 10% 내지 90%, 25% 내지 40%, 25% 내지 85%, 30% 내지 50%, 30% 내지 80%, 40% 내지 65%, 50% 내지 75%, 50% 내지 99.9%, 60% 내지 80%, 75% 내지 99.9%, 또는 85% 내지 99.9%, 예를 들어, 약 0.1%, 약 0.15%, 약 0.2%, 약 0.25%, 약 0.3%, 약 0.35%, 약 0.4%, 약 0.45%,약 0.5%, 약 0.55%, 약 0.6%, 약 0.65%, 약 0.7%, 약 0.75%, 약 0.8%, 약 0.85%, 약 0.9%, 약 0.95%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 또는 약 99.9%)의 효율로 복수의 세포들에 도입된다.
일부 실시예들에서, 본 발명의 방법들 중 어느 하나는 104 세포 내지 1012 세포(예를 들어, 104 세포 내지 105 세포, 104 세포 내지 106 세포, 104 세포 내지 107 세포, 5x104 세포 내지 5x105 세포, 105 세포 내지 106 세포, 105 세포 내지 107 세포, 105 세포 내지 1010 세포, 2.5x105 세포 내지 106 세포, 5x105 세포 내지 5x106 세포, 106 세포 내지 107 세포, 106 세포 내지 108 세포, 106 세포 내지 1012 세포, 5x106 세포 내지 5x107 세포, 107 세포 내지 108 세포, 107 세포 내지 109 세포, 107 세포 및 1012 세포, 5x107 세포 및 5x108 세포, 108 세포 및 109 세포, 108 세포 및 1010 세포, 108 세포 및 1012 세포, 5x108 세포 및 5x109 세포, 109 세포 및 1010 세포, 109 세포 및 1011 세포, 1010 세포 및 1011 세포, 1010 세포 및 1012 세포, 또는 1011 세포 및 1012 세포, 예를 들어, 약 104 세포, 약 2.5x104 세포, 약 5x104 세포, 약 105 세포, 약 2.5x105 세포, 약 5x105 세포, 약 106 세포, 약 2.5x106 세포, 약 5x106 세포, 약 107 세포, 약 2.5x107 세포, 약 5x107 세포, 약 108 세포, 약 2.5x108 세포, 약 5x108 세포, 약 109 세포, 약 2.5x109 세포, 약 5x109 세포, 약 1010 세포, 약 5x1010 세포, 약 1011 세포, 또는 약 1012 세포)의 세포 회수 수를 생성한다.
일부 실시예들에서, 상기 방법은 0.1% 내지 100%(예를 들어, 0.1% 내지 5%, 1% 내지 10%, 2.5% 내지 20%, 5% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 60%, 10% 내지 90%, 25% 내지 40%, 25% 내지 85%, 30% 내지 50%, 30% 내지 80%, 40% 내지 65%, 50% 내지 75%, 50% 내지 100%, 60% 내지 80%, 75% 내지 100%, 85% 내지 100%, 예를 들어, 약 0.1%, 약 0.15%, 약 0.2%, 약 0.25%, 약 0.3%, 약 0.35%, 약 0.4%, 약 0.45%, 약 0.5%, 약 0.55%, 약 0.6%, 약 0.65%, 약 0.7%, 약 0.75%, 약 0.8%, 약 0.85%, 약 0.9%, 약 0.95%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100%)의 세포 회수율을 생성한다. 일부 실시예들에서, 상기 방법은 0.1% 내지 500%(예를 들어, 0.1% 내지 5%, 1% 내지 10%, 2.5% 내지 20%, 5% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 60%, 10% 내지 90%, 25% 내지 40%, 25% 내지 85%, 30% 내지 50%, 30% 내지 80%, 40% 내지 65%, 50% 내지 75%, 50% 내지 100%, 60% 내지 80%, 60% 내지 150%, 75% 내지 100%, 75% 내지 200%, 85% 내지 150%, 90% 내지 250%, 100% 내지 200%, 100% 내지 400%, 150% 내지 300%, 200% 내지 500%, 또는 300% 내지 500%, 예를 들어, 약 0.1%, 약 0.15%, 약 0.2%, 약 0.25%, 약 0.3%, 약 0.35%, 약 0.4%, 약 0.45%, 약 0.5%, 약 0.55%, 약 0.6%, 약 0.65%, 약 0.7%, 약 0.75%, 약 0.8%, 약 0.85%, 약 0.9%, 약 0.95%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 210%, 약 220%, 약 230%, 약 240%, 약 250%, 약 260%, 약 270%, 약 280%, 약 290%, 약 300%, 약 310%, 약 320%, 약 330%, 약 340%, 약 350%, 약 360%, 약 370%, 약 380%, 약 390%, 약 400%, 약 410%, 약 420%, 약 430%, 약 440%, 약 450%, 약 460%, 약 470%, 약 480%, 약 490%, 또는 약 500%)의 살아있는 조작된 세포 수율을 생성한다.
일부 실시예들에서, 복수의 세포들에 전달되는(예를 들어, 복수의 세포 내로 전기-기계적으로 전달되는) 조성물은 치료제, 비타민, 나노입자, 하전된 분자, 하전되지 않은 분자, 조작된 뉴클레아제, DNA, RNA, CRISPR-Cas 복합체, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 호밍 뉴클레아제, 메가뉴클레아제(mn), megaTALs, 효소, 트랜스포손, 펩티드, 단백질, 바이러스, 중합체, 리보핵단백질(RNP), 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함한다. 일부 실시예들에서, 조성물은 0.0001 ㎍/mL 내지 1,000 ㎍/mL (예를 들어, 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL, 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 0.005 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 2.5 ㎍/mL 내지 약 15 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 7.5 ㎍/mL 내지 약 75 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL 내지 약 250 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL 내지 약 250 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL 내지 약 750 ㎍/mL, 약 100 ㎍/mL 내지 약 300 ㎍/mL, 약 100 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 약 200 ㎍/mL 내지 약 400 ㎍/mL, 약 250 ㎍/mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 350 ㎍/mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 400 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 약 500 ㎍/mL 내지 약 750 ㎍/mL, 약 650 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 또는 약 800 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 예를 들어, 약 0.0001 ㎍/mL, 약 0.0005 ㎍/mL, 약 0.001 ㎍/mL, 약 0.005 ㎍/mL, 약 0.01 ㎍/mL, 약 0.02 ㎍/mL, 약 0.03 ㎍/mL, 약 0.04 ㎍/mL, 약 0.05 ㎍/mL, 약 0.06 ㎍/mL, 약 0.07 ㎍/mL, 약 0.08 ㎍/mL, 약 0.09 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL, 약 0.2 ㎍/mL, 약 0.3 ㎍/mL, 약 0.4 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL, 약 0.6 ㎍/mL, 약 0.7 ㎍/mL, 약 0.8 ㎍/mL, 약 0.9 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL, 약 1.5 ㎍/mL, 약 2 ㎍/mL, 약 2.5 ㎍/mL, 약 3 ㎍/mL, 약 3.5 ㎍/mL, 약 4 ㎍/mL, 약 4.5 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL, 약 5.5 ㎍/mL, 약 6 ㎍/mL, 약 6.5 ㎍/mL, 약 7 ㎍/mL, 약 7.5 ㎍/mL, 약 8 ㎍/mL, 약 8.5 ㎍/mL, 약 9 ㎍/mL, 약 9.5 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL, 약 15 ㎍/mL, 약 20 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL, 약 30 ㎍/mL, 약 35 ㎍/mL, 약 40 ㎍/mL, 약 45 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL, 약 55 ㎍/mL, 약 60 ㎍/mL, 약 65 ㎍/mL, 약 70 ㎍/mL, 약 75 ㎍/mL, 약 80 ㎍/mL, 약 85 ㎍/mL, 약 90 ㎍/mL, 약 95 ㎍/mL, 약 100 ㎍/mL, 약 200 ㎍/mL, 약 250 ㎍/mL, 약 300 ㎍/mL, 약 350 ㎍/mL, 약 400 ㎍/mL, 약 450 ㎍/mL, 약 500 ㎍/mL, 약 550 ㎍/mL, 약 600 ㎍/mL, 약 650 ㎍/mL, 약 700 ㎍/mL, 약 750 ㎍/mL, 약 800 ㎍/mL, 약 850 ㎍/mL, 약 900 ㎍/mL, 약 950 ㎍/mL, 또는 약 1,000 ㎍/mL)의 액체 중 농도를 갖는다.
상기 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 액체 내에 현탁된 복수의 세포들은 진핵 세포들(예를 들어, 동물 세포들, 예를 들어, 인간 세포들), 원핵 세포들(예를 들어, 박테리아 세포들), 식물 세포들, 및/또는 합성 세포들을 포함한다. 세포들은 일차 세포들(예를 들어, 일차 인간 세포들), 세포주(예를 들어, 인간 세포주)로부터의 세포들, 현탁액 중의 세포들, 부착 세포들, 줄기 세포들, 혈액 세포들(예를 들어, 말초 혈액 단핵구 세포들(PBMC들)), 및/또는 면역 세포들(예를 들어, 백혈구(예를 들어, 선천성 면역 세포들 또는 적응 면역 세포들))일 수 있다. 일부 실시예들에서, 세포들(예를 들어, 면역 세포들, 예를 들어, T 세포들, B 세포들, 자연 살해 세포들, 대식세포들, 단핵구들, 또는 항원-제시 세포들)은 자극되지 않은 세포들, 자극된 세포들, 또는 활성화된 세포들이다. 일부 실시예들에서, 세포들은 적응 면역 세포들 및/또는 선천성 면역 세포들이다. 일부 실시예들에서, 복수의 세포들은 항원 제시 세포들(APC들), 단핵구들, T-세포들, B-세포들, 수지상 세포들, 대식세포들, 호중구들, NK 세포들, Jurkat 세포들, THP-1 세포들, 인간 배아 신장(HEK-293) 세포들, 중국 햄스터 난소(예를 들어, CHO-K1) 세포들, 배아 줄기 세포들(ESC들), 중간엽 줄기 세포들(MSC들), 또는 조혈 줄기 세포들(HSC들)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 세포들은 일차 인간 T-세포들, 일차 인간 대식세포들, 일차 인간 단핵구들, 일차 인간 NK 세포들, 또는 일차 인간 유도 만능 줄기 세포들(iPSC들)일 수 있다. 본원에 설명된 방법들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 상기 방법은 천공 후 회수 완중액에 액체에 현탁된 복수의 세포들을 저장하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 설명된 장치들 또는 시스템들 중 어느 하나를 포함하는 키트를 제공한다. 예를 들어, 일 양태에서, 본 발명은 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기-기계적으로 전달하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 상기 키트는 복수의 장치들을 포함하고, 상기 복수의 장치들 각각은, 제1 유출구, 제1 유입구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극; 제2 유출구, 제2 유입구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및 제1 유출구와 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 전기천공 구역은 약 100 ㎛ 초과(예를 들어, 100 ㎛ 내지 10 mm, 150 ㎛ 내지 15 mm, 200 ㎛ 내지 10 mm, 250 ㎛ 내지 5 mm, 500 ㎛ 내지 10 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 50 mm, 5 mm 내지 25 mm, 또는 20 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm,약 2 mm, 약 5 mm, 약 7 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 또는 약 50 mm)의 최소 단면 치수를 포함하며, 전기천공 구역이 실질적으로 균일한 단면적을 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차의 인가는 전기천공 구역 내에 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역; 및 복수의 장치들을 둘러싸도록 구성된 복수의 외부 구조체들을 포함하며, 복수의 외부 구조체들 각각은 적어도 하나의 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징; 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전기 입력; 및 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전기 입력을 포함한다. 일부 실시예들에서, 복수의 외부 구조체들은 복수의 장치들에 통합된다. 일부 실시예들에서, 복수의 외부 구조체들은 복수의 장치들에 탈착 가능하게 연결된다. 일부 실시예들에서, 하우징은 적어도 하나의 장치의 온도를 증가시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함하며, 열 컨트롤러는 가열 블록, 액체 유동, 배터리-전력 히터, 및 박막 히터로 구성된 그룹으로부터 선택된 가열 요소이다. 일부 실시예들에서, 하우징은 적어도 하나의 장치의 온도를 감소시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함하며, 열 컨트롤러는 액체 유동, 증발 냉각기, 및 펠티에 장치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 냉각 요소이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 상기 키트는 복수의 장치들을 포함하고, 상기 복수의 장치들 각각은, 제1 유출구, 제1 유입구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극; 제2 유출구, 제2 유입구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및 제1 유출구와 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 전기천공 구역은 약 100 ㎛ 초과(예를 들어, 100 ㎛ 내지 10 mm, 150 ㎛ 내지 15 mm, 200 ㎛ 내지 10 mm, 250 ㎛ 내지 5 mm, 500 ㎛ 내지 10 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 50 mm, 5 mm 내지 25 mm, 또는 20 mm 내지 50 mm, 예를 들어, 약 0.5 mm, 약 1.0 mm, 약 1.5 mm,약 2 mm, 약 5 mm, 약 7 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 25 mm, 또는 약 50 mm)의 최소 단면 치수를 포함하며, 전기천공 구역이 실질적으로 균일한 단면적을 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차의 인가는 전기천공 구역 내에 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역; 및 복수의 장치들을 둘러싸도록 구성된 복수의 외부 구조체들을 포함하며, 복수의 외부 구조체들 각각은 적어도 하나의 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징; 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전기 입력; 및 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전기 입력을 포함한다. 일부 실시예들에서, 복수의 외부 구조체들은 복수의 장치들에 통합된다. 일부 실시예들에서, 복수의 외부 구조체들은 복수의 장치들에 탈착 가능하게 연결된다. 일부 실시예들에서, 하우징은 적어도 하나의 장치의 온도를 증가시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함하며, 열 컨트롤러는 가열 블록, 액체 유동, 배터리 전원 히터, 및 박막 히터로 구성된 그룹으로부터 선택된 가열 요소이다. 일부 실시예들에서, 하우징은 적어도 하나의 장치의 온도를 감소시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함하며, 열 컨트롤러는 액체 유동, 증발 냉각기 및 펠티에 장치로 구성된 그룹으로부터 선택된 냉각 요소이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기-기계적으로 전달하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는, 복수의 장치들로서, 복수의 장치들 각각은 전술한 실시예들의 장치를 포함하는, 복수의 장치들; 및 복수의 장치들을 둘러싸도록 구성된 복수의 외부 구조체들로서, 복수의 외부 구조체들 각각은, 적어도 하나의 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징; 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전기 입력; 및 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전기 입력을 포함하는, 복수의 외부 구조체들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 복수의 외부 구조체들은 복수의 장치들에 통합된다. 일부 실시예들에서, 복수의 외부 구조체들은 복수의 장치들에 탈착 가능하게 연결된다. 일부 실시예들에서, 하우징은 적어도 하나의 장치의 온도를 증가시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함하며, 열 컨트롤러는 가열 블록, 액체 유동, 배터리-전력 히터, 및 박막 히터로 구성된 그룹으로부터 선택된 가열 요소이다. 일부 실시예들에서, 하우징은 적어도 하나의 장치의 온도를 감소시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함하며, 열 컨트롤러는 액체 유동, 증발 냉각기, 및 펠티에 장치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 냉각 요소이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는, 복수의 장치들로서, 복수의 장치들 각각은 전술한 실시예들의 장치를 포함하는, 상기 복수의 장치들; 및 복수의 장치들을 둘러싸도록 구성된 복수의 외부 구조체들로서, 복수의 외부 구조체들 각각은, 적어도 하나의 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징; 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전기 입력부; 및 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전기 입력부를 포함하는, 상기 복수의 외부 구조체들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 복수의 외부 구조체들은 복수의 장치들에 통합된다. 일부 실시예들에서, 복수의 외부 구조체들은 복수의 장치들에 탈착 가능하게 연결된다. 일부 실시예들에서, 하우징은 적어도 하나의 장치의 온도를 증가시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함하며, 열 컨트롤러는 가열 블록, 액체 유동, 배터리 전원 히터, 및 박막 히터로 구성된 그룹으로부터 선택된 가열 요소이다. 일부 실시예들에서, 하우징은 적어도 하나의 장치의 온도를 감소시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함하며, 열 컨트롤러는 액체 유동, 증발 냉각기 및 펠티에 장치로 구성된 그룹으로부터 선택된 냉각 요소이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기-기계적으로 전달하기 위한 장치를 제공하며, 상기 장치는 제1 유입구 및 제1 유출구를 갖는 제1 전극으로서, 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 정의하는, 상기 제1 전극; 제2 유입구 및 제2 유출구를 갖는 제2 전극으로서, 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 정의하는, 상기 제2 전극; 및 전기천공 구역으로서, 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되고, 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차의 인가는 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함한다. 장치에서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들은 전기천공 구역에 들어갈 때 전기천공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 장치를 제공하며, 상기 장치는 제1 유입구 및 제1 유출구를 갖는 제1 전극으로서, 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 한정하는, 상기 제1 전극; 제2 유입구 및 제2 유출구를 갖는 제2 전극으로서, 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 한정하는, 상기 제2 전극; 및 전기천공 구역으로서, 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되고, 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차의 인가는 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함한다. 장치에서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들은 전기천공 구역에 들어갈 때 전기천공된다.
선행하는 방법들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 키트는 장치의 구역, 예를 들어 진입 구역 또는 회수 구역에 유체 연결된 하나 이상의 저장소들, 예를 들어 제1 저장소 및 제2 저장소를 더 포함한다. 예를 들어, 제1 저장소는 진입 구역에 유체 연결될 수 있고, 제2 저장소는 회수 구역에 유체 연결될 수 있다.
특정 실시예들에서, 전기천공 구역의 단면은 원통형, 타원형, 다각형, 별, 평행사변형, 사다리꼴 및 불규칙성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 경우에, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다. 예를 들어, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 약 0.01% 내지 약 1000%, 예를 들어 전기천공 구역의 단면 치수의 약 0.01% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 1000%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 750%, 또는 약 50% 내지 약 1000%일 수 있다. 대안으로, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 약 100% 내지 약 100,000%, 예를 들어, 전기천공 구역의 단면 치수의 약 100% 내지 약 1000%, 약 500% 내지 약 5,000%, 약 1,000% 내지 약 10,000%, 약 5,000% 내지 약 25,000%, 약 10,000% 내지 약 50,000%, 약 25,000% 내지 약 75,000%, 또는 약 50,000% 내지 약 100,000%일 수 있다.
일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 단면 치수는 0.005 mm 내지 50 mm이다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 50 mm이다. 특정 실시예들에서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 25 mm이다. 일부 실시예들에서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 단면 치수는 0.1 mm 내지 500 mm이다. 특정 실시예들에서, 진입 구역, 회수 구역 또는 전기천공 구역 중 어느 것도 유체 내에 현탁된 임의의 복수의 세포들 중 어느 하나의 단면 치수를 감소시키지 않으며, 예를 들어 세포들은 변형 없이 장치를 통과할 수 있다.
일부 실시예들에서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 세포 표현형의 기준선 측정치에 비해 0% 내지 약 25% 표현형 변화를 갖는다. 일부 실시예들에서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 표현형 변화를 갖지 않는다.
추가 실시예들에서, 장치는 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징을 갖는 외부 구조체를 포함한다. 일부 실시예들에서, 외부 구조체는 장치에 통합된다. 특정 실시예에서, 외부 구조체는 장치에 탈착 가능하게 연결된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기-기계적으로 전달하기 위한 장치를 제공하며, 상기 장치는 제1 유입구 및 제1 유출구를 갖는 제1 전극으로서, 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 정의하는, 상기 제1 전극; 제2 유입구 및 제2 유출구를 갖는 제2 전극으로서, 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 정의하는, 상기 제2 전극; 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 유입구와 제1 유출구 사이에서 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구; 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 유입구와 제2 유출구 사이에서 제2 전극과 교차하는, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구; 및 전기천공 구역으로서, 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되고, 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차의 인가는 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함한다. 장치에서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들은 전기천공 구역에 들어갈 때 트랜스펙션된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 장치를 제공하며, 상기 장치는 제1 유입구 및 제1 유출구를 갖는 제1 전극으로서, 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 한정하는, 상기 제1 전극; 제2 유입구 및 제2 유출구를 갖는 제2 전극으로서, 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 한정하는, 상기 제2 전극; 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 유입구와 제1 유출구 사이에서 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구; 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 유입구와 제2 유출구 사이에서 제2 전극과 교차하는, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구; 및 전기천공 구역으로서, 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되고, 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차의 인가는 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함한다. 장치에서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들은 전기천공 구역에 들어갈 때 트랜스펙션된다.
선행하는 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 장치는 장치의 구역, 예를 들어 진입 구역 또는 회수 구역에 유체 연결된 하나 이상의 저장소, 예를 들어 제1 저장소 및 제2 저장소를 더 포함한다. 예를 들어, 제1 저장소는 진입 구역에 유체 연결될 수 있고, 제2 저장소는 회수 구역에 유체 연결될 수 있다. 특정 실시예들에서, 장치는 제3 유입구 및 제3 유출구에 유체 연결된 제3 저장소 및 제4 유입구 및 제4 유출구에 유체 연결된 제4 저장소를 포함한다.
특정 실시예들에서, 전기천공 구역의 단면은 원통형, 타원형, 다각형, 별, 평행사변형, 사다리꼴 및 불규칙성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시예들에서, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다. 예를 들어, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 약 0.01% 내지 약 1,000%, 예를 들어 전기천공 구역의 단면 치수의 약 0.01% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 1,000%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 750%, 또는 약 50% 내지 약 100%일 수 있다. 대안으로, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 약 100% 내지 약 100,000%, 예를 들어, 전기천공 구역의 단면 치수의 약 100% 내지 약 1000%, 약 500% 내지 약 5,000%, 약 1,000% 내지 약 10,000%, 약 5,000% 내지 약 25,000%, 약 10,000% 내지 약 50,000%, 약 25,000% 내지 약 75,000%, 또는 약 50,000% 내지 약 100,000%일 수 있다.
일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 단면 치수는 0.005 mm 내지 50 mm이다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 50 mm이다. 특정 실시예들에서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 25 mm이다. 일부 실시예들에서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 단면 치수는 0.1 mm 내지 500 mm이다. 특정 실시예들에서, 진입 구역, 회수 구역 또는 전기천공 구역 중 어느 것도 유체 내에 현탁된 임의의 복수의 세포들 중 어느 하나의 단면 치수를 감소시키지 않으며, 예를 들어 세포들은 변형 없이 장치를 통과할 수 있다.
특정 실시예들에서, 제1 및/또는 제2 전극들은 다공성 또는 전도성 유체(예를 들어, 액체)이다.
일부 실시예들에서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 세포 표현형의 기준선 측정치에 비해 0% 내지 약 25% 표현형 변화를 갖는다. 일부 실시예들에서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 표현형 변화를 갖지 않는다.
추가 실시예들에서, 장치는 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징을 갖는 외부 구조체를 포함한다. 일부 실시예들에서, 외부 구조체는 장치에 통합된다. 특정 실시예에서, 외부 구조체는 장치에 탈착 가능하게 연결된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기-기계적 전달을 위한 시스템을 제공하며, 상기 시스템은 제1 유입구 및 제1 유출구를 갖는 제1 전극으로서, 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 정의하는, 상기 제1 전극; 제2 유입구 및 제2 유출구를 갖는 제2 전극으로서, 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 정의하는, 상기 제2 전극; 및 전기천공 구역으로서, 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되고, 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차의 인가는 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함한다. 시스템은 전위 소스를 더 포함하며, 장치의 제1 및 제2 전극들은 전위 소스에 탈착 가능하게 연결된다. 시스템에서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들은 전기천공 구역에 들어갈 때 전기천공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 시스템을 제공하며, 상기 시스템은 제1 유입구 및 제1 유출구를 갖는 제1 전극으로서, 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 한정하는, 상기 제1 전극; 제2 유입구 및 제2 유출구를 갖는 제2 전극으로서, 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 한정하는, 상기 제2 전극; 및 전기천공 구역으로서, 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되고, 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차의 인가는 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함한다. 시스템은 전위 소스를 더 포함하며, 장치의 제1 및 제2 전극들은 전위 소스에 탈착 가능하게 연결된다. 시스템에서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들은 전기천공 구역에 들어갈 때 전기천공된다.
일부 실시예들에서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 세포 표현형의 기준선 측정치에 비해 0% 내지 약 25% 표현형 변화를 갖는다. 일부 실시예들에서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 표현형 변화를 갖지 않는다.
추가 실시예들에서, 장치는 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징을 갖는 외부 구조체를 포함한다. 일부 시스템들에서, 외부 구조체는 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전기 입력 및 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전기 입력을 포함한다. 일부 실시예들에서, 제1 또는 제2 전기 입력들과 전위 소스 사이의 탈착 가능한 연결은 클램프, 클립, 스프링, 시스, 와이어 브러시, 기계적 연결, 유도성 연결, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시예들에서, 외부 구조체는 장치에 통합된다. 특정 실시예에서, 외부 구조체는 장치에 탈착 가능하게 연결된다.
일부 실시예들에서, 이전의 양태들 중 어느 하나의 장치들, 시스템들, 또는 방법들 중 어느 하나는 가역적 또는 비가역적 전기천공을 유도한다. 특정 실시예들에서, 전기천공은 실질적으로 비-열적 가역 전기천공, 실질적으로 비-열적 비가역 전기천공, 또는 실질적으로 열적 비가역 전기천공이다.
일부 실시예들에서, 장치와 전위 소스 사이의 탈착 가능한 연결은 클램프, 클립, 스프링, 시스, 와이어 브러시, 기계적 연결, 유도성 연결, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시예들에서, 장치와 전위 소스 사이의 탈착 가능한 연결은 스프링이다.
일부 실시예들에서, 장치는 장치의 구역, 예를 들어 진입 구역 또는 회수 구역에 유체 연결된 하나 이상의 저장소, 예를 들어 제1 저장소 및 제2 저장소를 더 포함한다. 예를 들어, 제1 저장소는 진입 구역에 유체 연결될 수 있고, 제2 저장소는 회수 구역에 유체 연결될 수 있다.
특정 실시예들에서, 전기천공 구역의 단면은 원통형, 타원형, 다각형, 별, 평행사변형, 사다리꼴 및 불규칙성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시예들에서, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다. 예를 들어, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 약 0.01% 내지 약 1,000%, 예를 들어 전기천공 구역의 단면 치수의 약 0.01% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 1,000%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 750%, 또는 약 50% 내지 약 100%일 수 있다. 대안으로, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 약 100% 내지 약 100,000%, 예를 들어, 전기천공 구역의 단면 치수의 약 100% 내지 약 1000%, 약 500% 내지 약 5,000%, 약 1,000% 내지 약 10,000%, 약 5,000% 내지 약 25,000%, 약 10,000% 내지 약 50,000%, 약 25,000% 내지 약 75,000%, 또는 약 50,000% 내지 약 100,000%일 수 있다.
일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 단면 치수는 0.005 mm 내지 50 mm이다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 50 mm이다. 특정 실시예들에서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 25 mm이다. 일부 실시예들에서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 단면 치수는 0.1 mm 내지 500 mm이다. 특정 실시예들에서, 진입 구역, 회수 구역 또는 전기천공 구역 중 어느 것도 유체 내에 현탁된 임의의 복수의 세포들 중 어느 하나의 단면 치수를 감소시키지 않으며, 예를 들어 세포들은 변형 없이 장치를 통과할 수 있다.
추가 실시예들에서, 시스템은 진입 구역에 유체 연결된 유체 전달 소스를 포함하며, 유체 전달 소스는 진입 구역을 통해 회수 구역으로 유체 내에 현탁된 복수의 세포들을 전달하도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 유체 전달 소스로부터의 전달 속도는 0.001 mL/분 내지 1,000 mL/분, 예를 들어 25 mL/분이다. 특정 실시예들에서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 중 어느 하나의 체류 시간은 0.5 ms 내지 50 ms이다. 일부 실시예들에서, 유체의 전도도는 0.001 mS/cm 내지 500 mS/cm, 예를 들어, 1 내지 20 mS/cm이다.
추가 실시예들에서, 시스템은 전압 펄스들을 제1 및 제2 전극들에 전달하여 제1 전극과 제2 전극 사이에 전위차를 생성하기 위해 전위 소스에 동작 가능하게 결합된 컨트롤러를 포함한다. 일부 실시예들에서, 전압 펄스들은 -3 kV 내지 3 kV, 예를 들어, 0.01 kV 내지 3 kV, 예를 들어, 0.2 내지 0.6 kV의 진폭을 갖는다. 일부 경우에, 전기천공법의 듀티 사이클은 0.001% 내지 100%, 예를 들어, 10% 내지 95%이다. 일부 실시예들에서, 전압 펄스들은 0.01 ms 내지 1,000 ms, 예를 들어, 1 내지 10 ms의 지속기간을 갖는다. 특정 실시예들에서, 전압 펄스들은 1 Hz 내지 50,000 Hz, 예를 들어, 100 내지 500 Hz의 주파수에서 제1 및 제2 전극들에 인가된다. 전압 펄스의 파형은 DC, 구형, 펄스, 바이폴라, 사인, 램프, 비대칭 바이폴라, 임의적, 또는 임의의 중첩 또는 이들의 조합일 수 있다. 특정 실시예들에서, 전압 펄스들로부터 생성된 전계는 1 V/cm 내지 50,000 V/cm, 예를 들어, 100 내지 1,000 V/cm의 크기를 갖는다.
추가의 실시예들에서, 시스템은 본원에 설명된 전기천공 장치를 수용하도록 구성된 하우징(예를 들어, 하우징 구조체)을 포함한다. 추가적인 예들에서, 하우징(예를 들어, 하우징 구조체)은 하우징 또는 그 시스템의 임의의 컴포넌트의 온도를 증가 또는 감소시키도록 구성된 열 컨트롤러를 포함한다. 일부 실시예들에서, 열 컨트롤러는 가열 요소, 예를 들어, 가열 블록, 액체 유동, 배터리 전력 히터, 또는 박막 히터이다. 다른 실시예들에서, 열 컨트롤러는 냉각 요소, 예를 들어 액체 유동, 증발 냉각기, 또는 열전, 예를 들어 펠티에 장치이다.
추가 실시예들에서, 시스템은 예를 들어, 직렬 또는 병렬로 복수의 세포 천공 장치들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 시스템은 복수의 세포 천공 장치들을 위한 복수의 외부 구조체들을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기-기계적 전달을 위한 시스템을 제공하며, 상기 시스템은 제1 유입구 및 제1 유출구를 갖는 제1 전극으로서, 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 정의하는, 상기 제1 전극; 제2 유입구 및 제2 유출구를 갖는 제2 전극으로서, 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 정의하는, 상기 제2 전극; 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 유입구와 제1 유출구 사이에서 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구; 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 유입구와 제2 유출구 사이에서 제2 전극과 교차하는, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구; 및 전기천공 구역으로서, 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되고, 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차의 인가는 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함한다. 장치에서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들은 전기천공 구역에 들어갈 때 트랜스펙션된다. 일부 실시예들에서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 세포 표현형의 기준선 측정치에 비해 0% 내지 약 25% 표현형 변화를 갖는다. 일부 실시예들에서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 표현형 변화를 갖지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 시스템을 제공하며, 상기 시스템은 제1 유입구 및 제1 유출구를 갖는 제1 전극으로서, 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 한정하는, 상기 제1 전극; 제2 유입구 및 제2 유출구를 갖는 제2 전극으로서, 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 한정하는, 상기 제2 전극; 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 유입구와 제1 유출구 사이에서 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구; 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 유입구와 제2 유출구 사이에서 제2 전극과 교차하는, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구; 및 전기천공 구역으로서, 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되고, 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차의 인가는 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함한다. 장치에서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들은 전기천공 구역에 들어갈 때 전기천공된다.
일부 실시예들에서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 세포 표현형의 기준선 측정치에 비해 0% 내지 약 25% 표현형 변화를 갖는다. 일부 실시예들에서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 표현형 변화를 갖지 않는다.
이전 양태들 중 어느 하나의 추가 실시예들에서, 장치는 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징(예를 들어, 하우징 구조체)을 포함하는 외부 구조체를 포함한다. 일부 시스템들에서, 외부 구조체는 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전기 입력 및 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전기 입력을 포함한다. 일부 실시예들에서, 제1 또는 제2 전기 입력들과 전위 소스 사이의 탈착 가능한 연결은 클램프, 클립, 스프링, 시스, 와이어 브러시, 기계적 연결, 유도성 연결, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시예들에서, 외부 구조체는 장치에 통합된다. 특정 실시예에서, 외부 구조체는 장치에 탈착 가능하게 연결된다.
일부 경우에, 시스템은 가역적 또는 비가역적 전기천공을 유도한다. 특정 실시예들에서, 전기천공은 실질적으로 비-열적 가역 전기천공, 실질적으로 비-열적 비가역 전기천공, 또는 실질적으로 열적 비가역 전기천공이다.
일부 실시예들에서, 장치와 전위 소스 사이의 탈착 가능한 연결은 클램프, 클립, 스프링, 시스, 와이어 브러시, 기계적 연결, 유도성 연결, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시예들에서, 장치와 전위 소스 사이의 탈착 가능한 연결은 스프링이다.
일부 실시예들에서, 장치는 장치의 구역, 예를 들어 진입 구역 또는 회수 구역에 유체 연결된 하나 이상의 저장소들, 예를 들어 제1 저장소 및 제2 저장소를 더 포함한다. 예를 들어, 제1 저장소는 진입 구역에 유체 연결될 수 있고, 제2 저장소는 회수 구역에 유체 연결될 수 있다.
특정 실시예들에서, 전기천공 구역의 단면은 원통형, 타원형, 다각형, 별, 평행사변형, 사다리꼴 및 불규칙성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시예들에서, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다. 예를 들어, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 약 0.01% 내지 약 1,000%, 예를 들어 전기천공 구역의 단면 치수의 약 0.01% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 1,000%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 750%, 또는 약 50% 내지 약 100%일 수 있다. 대안으로, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 약 100% 내지 약 100,000%, 예를 들어, 전기천공 구역의 단면 치수의 약 100% 내지 약 1000%, 약 500% 내지 약 5,000%, 약 1,000% 내지 약 10,000%, 약 5,000% 내지 약 25,000%, 약 10,000% 내지 약 50,000%, 약 25,000% 내지 약 75,000%, 또는 약 50,000% 내지 약 100,000%일 수 있다.
일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 단면 치수는 0.005 mm 내지 50 mm이다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 50 mm이다. 특정 실시예들에서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 25 mm이다. 일부 실시예들에서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 단면 치수는 0.01 mm 내지 500 mm이다. 특정 실시예들에서, 진입 구역, 회수 구역 또는 전기천공 구역 중 어느 것도 유체 내에 현탁된 임의의 복수의 세포들 중 어느 하나의 단면 치수를 감소시키지 않으며, 예를 들어 세포들은 변형 없이 장치를 통과할 수 있다.
추가 실시예들에서, 시스템은 진입 구역에 유체 연결된 유체 전달 소스를 포함하며, 유체 전달 소스는 진입 구역을 통해 회수 구역으로 유체 내에 현탁된 복수의 세포들을 전달하도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 유체 전달 소스로부터의 전달 속도는 0.001 mL/분 내지 1,000 mL/분, 예를 들어 25 mL/분이다. 특정 실시예들에서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 중 어느 하나의 체류 시간은 0.5ms 내지 50ms이다. 일부 실시예들에서, 유체의 전도도는 0.001 mS/cm 내지 500 mS/cm, 예를 들어, 1 mS/cm 내지 20 mS/cm이다.
추가 실시예들에서, 시스템은 전압 펄스들을 제1 및 제2 전극들에 전달하여 제1 전극과 제2 전극 사이에 전위차를 생성하기 위해 전위 소스에 동작 가능하게 결합된 컨트롤러를 포함한다. 일부 실시예들에서, 전압 펄스들은 -3 kV 내지 3 kV, 예를 들어, 0.01 kV 내지 3 kV, 예를 들어, 0.2 내지 0.6 kV의 진폭을 갖는다. 일부 경우에, 전기천공법의 듀티 사이클은 0.001% 내지 100%, 예를 들어, 10 내지 95%이다. 일부 실시예들에서, 전압 펄스들은 0.01ms 내지 1,000ms, 예를 들어, 1 내지 10ms의 지속기간을 갖는다. 특정 실시예들에서, 전압 펄스들은 1 Hz 내지 50,000 Hz, 예를 들어, 100 내지 500 Hz의 주파수에서 제1 및 제2 전극들에 인가된다. 전압 펄스의 파형은 DC, 구형, 펄스, 바이폴라, 사인, 램프, 비대칭 바이폴라, 임의적, 또는 임의의 중첩 또는 이들의 조합일 수 있다. 특정 실시예들에서, 전압 펄스들로부터 생성된 전계는 1 V/cm 내지 50,000 V/cm, 예를 들어, 100 V/cm 내지 1,000 V/cm의 크기를 갖는다.
추가의 실시예들에서, 시스템은 본원에 설명된 전기천공 장치를 수용하도록 구성된 하우징(예를 들어, 하우징 구조체)을 포함한다. 추가적인 예들에서, 하우징은 하우징 구조체 또는 그 시스템의 임의의 컴포넌트의 온도를 증가 또는 감소시키도록 구성된 열 컨트롤러를 포함한다. 일부 실시예들에서, 열 컨트롤러는 가열 요소, 예를 들어, 가열 블록, 액체 유동, 배터리 전력 히터, 또는 박막 히터이다. 다른 실시예들에서, 열 컨트롤러는 냉각 요소, 예를 들어 액체 유동, 증발 냉각기, 또는 열전, 예를 들어 펠티에 장치이다.
추가 실시예들에서, 시스템은 예를 들어, 직렬 또는 병렬로 복수의 세포 천공 장치들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 시스템은 복수의 세포 천공 장치들을 위한 복수의 외부 구조체들을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유체 내에 현탁된 복수의 세포들의 적어도 일부로 조성물을 도입하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, a. 제1 유입구 및 제1 유출구를 갖는 제1 전극으롯, 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 정의하는, 상기 제1 전극; 제2 유입구 및 제2 유출구를 갖는 제2 전극으로서, 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 정의하는, 제2 전극; 및 전기천공 구역으로서, 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유출구에 유체 연결되며, 제1 및 제2 전극들에 전위차의 인가는 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함하는 장치를 제공하는 단계; b. 제1 및 제2 전극들을 통전시켜 제1 및 제2 전극들 사이에 전위차를 생성하여, 전기천공 구역에서 전계를 생성하는 단계; 및 c. 장치의 전기천공 구역의 전계를 통해 조성물과 함께 유체에 현탁된 복수의 세포들을 통과시키는 단계를 포함한다. 상기 방법에서, 전기천공 구역에서 전계를 통한 조성물과 함께 유체에 현탁된 복수의 세포들의 유동은 복수의 세포들의 일시적 투과성을 증가시키고, 이에 의해 조성물을 복수의 세포들의 적어도 일부에 도입한다.
추가 실시예들에서, 상기 방법은 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 중 일부의 건강을 평가하는 단계를 포함한다. 특정 실시예들에서, 평가하는 단계는 유체 내에 현탁된 복수의 세포들의 일부의 생존 가능성을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 평가하는 단계는 유체 내에 현탁된 복수의 세포들의 일부의 트랜스펙션 효율을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 평가하는 단계는 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 중 일부의 세포 회수율을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시예들에서, 평가하는 단계는 세포 표면 마커 발현의 유세포측정 분석을 포함한다.
일부 실시예들에서, 복수의 세포들은 장치의 전기천공 구역을 빠져나갈 때 세포 표현형의 기준선 측정치에 비해 0% 내지 약 25% 표현형 변화를 갖는다. 일부 경우에, 복수의 세포들은 장치의 전기천공 구역을 빠져나갈 때 표현형 변화를 갖지 않는다.
일부 실시예들에서, 방법은 가역적 또는 비가역적 전기천공을 유도한다. 특정 실시예들에서, 전기천공은 실질적으로 비-열적 가역 전기천공, 실질적으로 비-열적 비가역 전기천공, 또는 실질적으로 열적 비가역 전기천공이다.
일부 실시예들에서, 조성물과 함께 유체에 현탁된 세포들은 양압, 예를 들어 펌프, 예를 들어 주사기 펌프 또는 연동 펌프의 인가에 의해 장치의 전기천공 구역 내의 전계를 통과한다.
특정 실시예들에서, 샘플 내의 복수의 세포들 내의 세포들은 포유동물 세포, 진핵생물, 인간 세포, 동물 세포, 식물 세포, 합성 세포, 일차 세포, 세포주, 현탁 세포, 부착 세포, 비자극된 세포, 자극된 세포, 활성화 세포, 면역 세포, 줄기 세포, 혈액 세포, 적혈 세포, T 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포, 항원 제시 세포(APC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 대식세포, 또는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC), 인간 배아 신장 세포, 예를 들어 HEK-293 세포, 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포일 수 있다. 특정 실시예들에서, 복수의 세포들은 Jurkat 세포들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 복수의 세포들은 일차 인간 T-세포들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 복수의 세포들은 THP-1 세포들을 포함한다. 특정 실시들에서, 복수의 세포들은 일차 인간 대식세포들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 복수의 세포들은 일차 인간 단핵구들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 복수의 세포들은 자연 살해(natural killer; NK) 세포들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 복수의 세포들은 중간 햄스터 난소 세포들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 복수의 세포들은 인간 배아 신장 세포들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 복수의 세포들은 B-세포들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 복수의 세포들은 일차 인간 T-세포들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 복수의 세포들은 일차 인간 단핵구들을 포함한다. 특정 실시들에서, 복수의 세포들은 일차 인간 대식세포들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 복수의 세포들은 배아 줄기 세포(ESC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 또는 조혈 줄기 세포(HSC)를 포함한다. 특정 실시예들에서, 복수의 세포들은 일차 인간 유도 만능 줄기 세포들(iPSC들)을 포함한다.
일부 실시예들에서, 조성물은 치료제, 비타민, 나노입자, 하전된 치료제, 나노입자, 하전된 분자, 예를 들어 용액 중의 이온, 하전되지 않은 분자, 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA, CRISPR-Cas 복합체, 단백질, 중합체, 리보뉴클레오티드 단백질(RNP), 조작된 뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 호밍 뉴클레아제, 메가뉴클레아제(MN), megaTAL, 효소, 펩티드, 트랜스포손, 또는 다당류, 예를 들어 덱스트란, 예를 들어 덱스트란 술페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함한다. 현탁액 중 세포들에 전달될 수 있는 조성물들은 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오티드, mRNA, 또는 DNA), 항체(또는 항체 단편, 예를 들어, 이중특이적 단편, 삼특이적 단편, Fab, F(ab')2, 또는 단일-쇄 가변 단편(scFv)), 아미노산, 폴리펩티드(예를 들어, 펩티드 또는 단백질), 세포, 박테리아, 유전자 치료제, 게놈 조작 치료제, 에피게놈 조작 치료제, 탄수화물, 화학 약물, 조영제, 자성 입자, 중합체 비드, 금속 나노입자, 금속 마이크로입자, 양자 점, 항산화제, 항생제, 호르몬, 핵단백질, 다당류, 당단백질, 지단백질, 스테로이드, 진통제, 국소 마취제, 항염증제, 항미생물제, 화학치료제, 엑소솜, 외막 소포, 백신, 바이러스, 박테리오파지, 보조제, 비타민, 미네랄, 소기관, 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시들에서, 조성물은 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오티드, mRNA 또는 DNA)이다. 특정 실시예들에서, 조성물은 항체이다. 특정 실시예들에서, 조성물은 폴리펩티드(예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다.
특정 실시예들에서, 조성물은 0.0001 ㎍/mL 내지 1,000 ㎍/mL (예를 들어, 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL, 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 0.005 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 1 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 2.5 ㎍/mL 내지 약 15 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 7.5 ㎍/mL 내지 약 75 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL 내지 약 250 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL 내지 약 250 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL 내지 약 750 ㎍/mL, 약 100 ㎍/mL 내지 약 300 ㎍/mL, 약 100 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 약 200 ㎍/mL 내지 약 400 ㎍/mL, 약 250 ㎍/mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 350 ㎍/mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 400 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 약 500 ㎍/mL 내지 약 750 ㎍/mL, 약 650 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 또는 약 800 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 예를 들어, 약 0.0001 ㎍/mL, 약 0.0005 ㎍/mL, 약 0.001 ㎍/mL, 약 0.005 ㎍/mL, 약 0.01 ㎍/mL, 약 0.02 ㎍/mL, 약 0.03 ㎍/mL, 약 0.04 ㎍/mL, 약 0.05 ㎍/mL, 약 0.06 ㎍/mL, 약 0.07 ㎍/mL, 약 0.08 ㎍/mL, 약 0.09 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL, 약 0.2 ㎍/mL, 약 0.3 ㎍/mL, 약 0.4 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL, 약 0.6 ㎍/mL, 약 0.7 ㎍/mL, 약 0.8 ㎍/mL, 약 0.9 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL, 약 1.5 ㎍/mL, 약 2 ㎍/mL, 약 2.5 ㎍/mL, 약 3 ㎍/mL, 약 3.5 ㎍/mL, 약 4 ㎍/mL, 약 4.5 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL, 약 5.5 ㎍/mL, 약 6 ㎍/mL, 약 6.5 ㎍/mL, 약 7 ㎍/mL, 약 7.5 ㎍/mL, 약 8 ㎍/mL, 약 8.5 ㎍/mL, 약 9 ㎍/mL, 약 9.5 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL, 약 15 ㎍/mL, 약 20 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL, 약 30 ㎍/mL, 약 35 ㎍/mL, 약 40 ㎍/mL, 약 45 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL, 약 55 ㎍/mL, 약 60 ㎍/mL, 약 65 ㎍/mL, 약 70 ㎍/mL, 약 75 ㎍/mL, 약 80 ㎍/mL, 약 85 ㎍/mL, 약 90 ㎍/mL, 약 95 ㎍/mL, 약 100 ㎍/mL, 약 200 ㎍/mL, 약 250 ㎍/mL, 약 300 ㎍/mL, 약 350 ㎍/mL, 약 400 ㎍/mL, 약 450 ㎍/mL, 약 500 ㎍/mL, 약 550 ㎍/mL, 약 600 ㎍/mL, 약 650 ㎍/mL, 약 700 ㎍/mL, 약 750 ㎍/mL, 약 800 ㎍/mL, 약 850 ㎍/mL, 약 900 ㎍/mL, 약 950 ㎍/mL, 또는 약 1,000 ㎍/mL)의 액체 중 농도를 갖는다.
일부 실시예들에서, 장치는 장치의 구역, 예를 들어 진입 구역 또는 회수 구역에 유체 연결된 하나 이상의 저장소들, 예를 들어 제1 저장소 및 제2 저장소를 더 포함한다. 예를 들어, 제1 저장소는 진입 구역에 유체 연결될 수 있고, 제2 저장소는 회수 구역에 유체 연결될 수 있다.
일부 실시예들에서, 장치의 전기천공 구역은 균일한 단면 치수를 갖는다. 다른 실시예들에서, 장치의 전기천공 구역은 불균일한 단면 치수를 갖는다. 추가 실시예들에서, 장치는 복수의 전기천공 구역들을 더 포함하며, 여기서 복수의 전기천공 구역들 각각은, 예를 들어 전기천공 구역은 균일한 단면 또는 불균일한 단면을 가질 수 있다. 특정 실시예들에서, 전기천공 구역의 단면은 원통형, 타원형, 다각형, 별, 평행사변형, 사다리꼴 및 불규칙성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시예들에서, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다. 예를 들어, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 약 0.01% 내지 약 100%, 예를 들어 전기천공 구역의 단면 치수의 약 0.01% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 75% 또는 약 50% 내지 약 100%일 수 있다. 대안으로, 진입 구역의 단면 치수 또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 약 100% 내지 약 100,000%, 예를 들어, 전기천공 구역의 단면 치수의 약 100% 내지 약 1000%, 약 500% 내지 약 5,000%, 약 1,000% 내지 약 10,000%, 약 5,000% 내지 약 25,000%, 약 10,000% 내지 약 50,000%, 약 25,000% 내지 약 75,000%, 또는 약 50,000% 내지 약 100,000%일 수 있다.
일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 단면 치수는 0.005 mm 내지 50 mm이다. 일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 50 mm이다. 특정 실시예들에서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 25 mm이다. 일부 실시예들에서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 단면 치수는 0.1 mm 내지 500 mm이다. 특정 실시예들에서, 진입 구역, 회수 구역 또는 전기천공 구역 중 어느 것도 유체 내에 현탁된 임의의 복수의 세포들 중 어느 하나의 단면 치수를 감소시키지 않으며, 예를 들어 세포들은 변형 없이 장치를 통과할 수 있다.
추가 실시예들에서, 장치는 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징을 갖는 외부 구조체를 포함한다. 일부 시스템들에서, 외부 구조체는 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전기 입력 및 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전기 입력을 포함한다. 일부 실시예들에서, 외부 구조체는 장치에 통합된다. 특정 실시예에서, 외부 구조체는 장치에 탈착 가능하게 연결된다.
일부 실시예들에서, 유체 전달 소스로부터의 전달 속도는 0.001 mL/분 내지 1,000 mL/분, 예를 들어 20 내지 30 mL/분, 예를 들어 25 mL/분이다. 특정 실시예들에서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 중 어느 하나의 체류 시간은 0.5 ms 내지 50 ms이다. 일부 실시예들에서, 유체의 전도도는 0.001 mS/cm 내지 500 mS/cm, 예를 들어, 1 내지 20 mS/cm이다.
추가 실시예들에서, 방법은 전압 펄스들을 제1 및 제2 전극들에 전달하여 제1 전극과 제2 전극 사이에 전위차를 생성하기 위해 전위 소스에 동작 가능하게 결합된 컨트롤러를 포함한다. 일부 실시예들에서, 전압 펄스들은 -3 kV 내지 3 kV, 예를 들어, 0.2 내지 0.6 kV의 진폭을 갖는다. 일부 경우에, 전기천공법의 듀티 사이클은 0.001% 내지 100%, 예를 들어, 10 내지 95%이다. 일부 실시예들에서, 전압 펄스들은 0.01 ms 내지 1,000 ms, 예를 들어, 1 내지 10 ms의 지속기간을 갖는다. 특정 실시예들에서, 전압 펄스들은 1 Hz 내지 50,000 Hz, 예를 들어, 100 내지 500 Hz의 주파수에서 제1 및 제2 전극들에 인가된다. 전압 펄스의 파형은 DC, 구형, 펄스, 바이폴라, 사인, 램프, 비대칭 바이폴라, 임의적, 또는 임의의 중첩 또는 이들의 조합일 수 있다. 특정 실시예들에서, 전압 펄스들로부터 생성된 전계는 1 V/cm 내지 50,000 V/cm, 예를 들어, 100 V/cm 내지 1,000 V/cm의 크기를 갖는다.
추가 실시예들에서, 방법은 본원에 설명된 전기천공 장치를 수용하도록 구성된 하우징 구조체를 포함한다. 추가적인 예들에서, 하우징은 하우징 또는 그 시스템의 임의의 컴포넌트의 온도를 증가 또는 감소시키도록 구성된 열 컨트롤러를 포함한다. 일부 실시예들에서, 열 컨트롤러는 가열 요소, 예를 들어, 가열 블록, 액체 유동, 배터리 전력 히터, 또는 박막 히터이다. 다른 실시예들에서, 열 컨트롤러는 냉각 요소, 예를 들어 액체 유동, 증발 냉각기, 또는 열전, 예를 들어 펠티에 장치이다. 특정 실시예들에서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들의 온도는 0℃ 내지 50℃이다.
추가 실시예들에서, 장치는 예를 들어, 직렬 또는 병렬로 복수의 세포 천공 장치들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 장치는 복수의 장치들을 위한 복수의 외부 구조체들을 포함한다.
일부 실시예들에서, 상기 방법은 천공 후 유체에 현탁된 복수의 세포들을 회수 완중액에 저장하는 단계를 더 포함한다. 특정 실시예들에서, 전기천공된 세포들은 0.1% 내지 99.9%, 예를 들어, 25% 내지 85%의 조성물의 도입 후 생존 가능성을 갖는다. 다른 실시예들에서, 세포들 내로의 조성물의 도입의 효율은 0.1 내지 99.9%, 예를 들어, 25% 내지 85%이다. 특정 실시예들에서, 세포 회수율은 0.1% 내지 100%이다. 특정 실시예들에서, 세포 회수 수율은 0.1% 내지 500%이다. 일부 실시예들에서, 회수된 세포들(예를 들어, 살아있는 세포들)의 수는 104 내지 1012이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 본원에 설명된 바와 같은 복수의 장치들, 본원에 설명된 바와 같은 복수의 외부 구조체들, 및 트랜스펙션 완중액을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공을 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 본원에 설명된 바와 같은 복수의 장치들, 본원에 설명된 바와 같은 복수의 외부 구조체들, 및 인스펙션 완중액을 포함한다.
선행하는 양태들 중 어느 하나의 일부 실시예들에서, 외부 구조체들은 복수의 세포 장치들에 통합된다. 특정 실시예들에서, 외부 구조체들은 복수의 장치들에 탈착 가능하게 연결된다.
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도 1a 내지 1c는 본 발명의 단일 전기천공 장치의 일 실시예의 개략도들이다. 도 1a는 본 발명의 장치의 동작의 개략도를 도시한다. 도 1b는 본 발명의 컴포넌트들의 개략도를 도시한다. 도 1c는 도 1b에 도시된 본 발명의 장치의 실시예의 사진을 도시한다.
도 2a 내지 2b는 본 발명의 전기천공 장치들의 실시예들에 대한 전기 에너지의 병렬 전달을 위한 하우징의 예시적인 개략도들이다. 도 2a는 본 발명의 96개의 전기천공 장치들을 병렬로 통전시키는 데 사용되는 전기 그리드 개념을 갖는 하우징의 등각도를 도시한다. 도 2b는 하우징의 전기 그리드에 대해 각 전기천공 장치의 제1 및 제2 전극을 안전하게 고정하기 위해 스프링 로딩형(spring loaded) 전극들을 사용하는 전기 그리드들을 갖는 하우징과 본 발명의 단일 전기천공 장치의 인터페이스의 확대도를 도시한다.
도 3a 내지 3b는 본 발명의 장치들을 사용하여 Jurkat 세포(1x107 세포/mL)의 전기천공에 대한 유체 유량(mL/min)의 최적화의 막대 그래프들이다. 회수된 세포들은 LSR II HTS(BD 생명과학)를 이용한 유세포분석기(flow cytometer) 분석 전 37℃에서 10% FBS로 RPMI에서 24시간 동안 배양되었다. 도 3a는 7-AAD 배제 염료를 사용하여 평가된 Jurkat 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 3b는 GFP 발현을 사용하여 평가된 Jurkat 세포들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 4a 내지 4d는 장치의 활성 구역에 따른 유량 시뮬레이션 예시들이다. 도 4a는 분당 10 mL의 액체 체적 유량(volumetric flow rate)을 나타내는 3D 모델이다. 도 4c는 분당 100 mL의 액체 체적 유량을 나타내는 3D 모델이다. 도 4b 및 4d는 각각 도 4a 및 4c에 대응되는 2D 모델들이다.
도 5a 내지 5b는 Jurkat 세포들의 전기천공을 위한 본 발명의 장치들의 전기천공 구역에서의 전계의 최적화에 대한 막대 그래프들이다. 회수된 세포들은 LSR II HTS(BD 생명과학)를 이용한 유세포분석기(flow cytometer) 분석 전 37℃에서 10% FBS로 RPMI에서 24시간 동안 배양되었다. 도 5a는 7-AAD 배제 염료를 사용하여 평가된 Jurkat 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 5b는 GFP 발현을 사용하여 평가된 Jurkat 세포들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 6a 내지 6b는 본 발명의 장치들을 사용하여 Jurkat 세포들의 트랜스펙션에 대한 온도의 영향들을 보여주는 막대 그래프들이다. 도면들에서 "RT"는 실내 온도를 나타낸다. 회수된 세포들은 LSR II HTS(BD 생명과학)를 이용한 유세포분석기(flow cytometer) 분석 전 37℃에서 10% FBS로 RPMI에서 24시간 동안 배양되었다. 도 6a는 7-AAD 배제 염료를 사용하여 평가된 Jurkat 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 6b는 GFP 발현을 사용하여 평가된 Jurkat 세포들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 7a 내지 7d는 본 발명의 장치의 활성 구역에 따른 전계 분포를 나타내는 시뮬레이션 예시들이다. 도 7a는 225 V의 인가 전압을 갖는 장치의 전계 분포 맵을 도시한다. 도 7b는 도 7a의 2D 모델 길이방향 단면이다. 도 7c는 275 V의 인가 전압을 갖는 장치의 전계 분포 맵을 도시한다. 도 7d는 도 7c의 2D 모델 길이방향 단면이다.
도 8a 내지 8d는 본 발명의 장치의 활성 구역에 따른 온도 분포의 영향을 나타내는 시뮬레이션 예시들이다. 도 8a는 시간 = 0ms에서의 장치의 활성 구역에서의 액체의 온도 분포 맵을 도시하고; 도 8b는 시간 = 100ms에서의 장치의 활성 구역에서의 액체의 온도 분포 맵을 도시하고; 도 8c는 시간 = 200ms에서의 장치의 활성 구역에서의 액체의 온도 분포 맵을 도시하고; 도 8d는 시간 = 300ms에서의 장치의 활성 구역에서의 액체의 온도 분포 맵을 도시한다.
도 9a 내지 9b는 본 발명의 장치들을 사용하여 Jurkat 세포들의 전기천공에 대한 전압 펄스 지속시간 및 펄스들의 수의 최적화를 보여주는 막대 그래프들이다. 회수된 세포들은 LSR II HTS(BD 생명과학)를 이용한 유세포분석기(flow cytometer) 분석 전 37℃에서 10% FBS로 RPMI에서 24시간 동안 배양되었다. 도 8a는 7-AAD 배제 염료를 사용하여 평가된 Jurkat 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 9b는 GFP 발현을 사용하여 평가된 Jurkat 세포들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 10a 내지 10b는 본 발명의 장치들을 사용하여 Jurkat 세포들의 전기천공에 대한 샘플 체적의 최적화를 보여주는 막대 그래프들이다. 회수된 세포들은 LSR II HTS(BD 생명과학)를 이용한 유세포분석기(flow cytometer) 분석 전 37℃에서 10% FBS로 RPMI에서 24시간 동안 배양되었다. 도 10a는 7-AAD 배제 염료를 사용하여 평가된 Jurkat 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 10b는 GFP 발현을 사용하여 평가된 Jurkat 세포들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 11a 내지 11b는 본 발명의 장치들을 사용하여 Jurkat 세포들의 전기천공에 대한 전기천공 구역의 직경의 최적화를 보여주는 막대 그래프들이다. 전기천공들은 상이한 채널 치수들에 걸쳐 총 세포 체류 시간을 실질적으로 일치시키기 위해 가변 유량들로 고정된 전압에서 수행되었다. 회수된 세포들은 LSR II HTS(BD 생명과학)를 이용한 유세포분석기(flow cytometer) 분석 전 37℃에서 10% FBS로 RPMI에서 24시간 동안 배양되었다. 도 11a는 7-AAD 배제 염료를 사용하여 평가된 Jurkat 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 11b는 GFP 발현을 사용하여 평가된 Jurkat 세포들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 12a 내지 12l은 본 발명의 장치들을 사용하여 Jurkat 세포들의 전기천공에 대한 선택 전압 펄스 파형의 효과를 나타내는 막대 그래프들 및 예시적인 파형 형상들을 도시한다. 회수된 세포들은 LSR II HTS(BD 생명과학)를 이용한 유세포분석기(flow cytometer) 분석 전 37℃에서 10% FBS로 RPMI에서 24시간 동안 배양되었다. 도 12a는 7-AAD 배제 염료를 사용하여 평가된 Jurkat 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 12b는 GFP 발현을 사용하여 평가된 Jurkat 세포들의 트랜스펙션 효율을 도시한다. 도 12c는 직류(DC) 상시 온 파형을 도시한다. 도 12d는 오프셋을 포함하는 50% 듀티 사이클을 갖는 구형파 파형을 도시한다. 도 12e는 75% 비대칭 램프 파형을 도시한다. 도 12f는 95% 듀티 사이클을 갖는 펄스 파형을 도시한다. 도 12g는 오프셋을 포함하는 75% 듀티 사이클을 갖는 구형파 파형을 도시한다. 도 12h는 사인 파형을 나타낸다. 도 12i는 25% 비대칭 램프 파형을 도시한다. 도 12j는 오프셋을 포함하는 25% 듀티 사이클을 갖는 구형파 파형을 도시한다. 도 12k는 오프셋이 없는 양극성 구형파 파형을 도시한다. 도 12l은 대칭 램프 파형을 도시한다.
도 13a 내지 13b는 본 발명의 장치 및 상업적으로 이용가능한 세포 트랜스펙션 기기를 사용하여 Jurkat 세포들에 대한 트랜스펙션 효율 및 결과적인 세포 생존 가능성을 비교하는 막대 그래프들이다. 7-AAD 배제 염료를 사용하여 Jurkat 세포들의 생존 가능성을 평가하고, GFP 발현을 사용하여 Jurkat 세포들의 트랜스펙션 효율을 평가하였다. 도 13a는 Jurkat 세포 트랜스펙션에 대해 공개된 파라미터들(100 μL 팁의 샘플; 3 펄스/10 ms/450 V/cm)를 사용하여 수행된 트랜스펙션 실험으로부터의 결과들을 도시한다. 도 13b는 Jurkat 세포 트랜스펙션에 대한 공개된 파라미터들과 비교하여 본 발명의 장치들에 대한 최적화된 파라미터들을 사용하여 수행된 실험에서 재현성을 도시하는 도 13a의 복제된 실험이다. 도 13c는 정제된 Cas9 단백질을 어닐링하여 배열된 Cas9 리보핵단백질 라이브러리를 형성하기 위해 상업적으로 입수가능한 단일 스트랜드 sgRNA 배열 라이브러리를 사용하는 Cas9 리보핵단백질 배열 라이브러리 스크린의 워크플로우 개략도를 도시한다. 본 발명의 장치를 사용하여, Cas9 리보핵단백질 배열 라이브러리 스크린은 플레이트 기반 분석을 사용하여 추후 면역치료 연구를 위한 유전자 타겟의 식별을 초래할 것이다. 추가로, Cas9 리보핵단백질 풀링된 라이브러리 스크리닝은 향후 치료를 위한 유전자 타겟을 식별하는 데 필요한 분석을 수행하는데 사용될 수 있다.
도 14a 내지 14b는 덱스트란(dextran) 전달을 위한 임의의 크기 제한을 평가하기 위해, 가변 분자량 덱스트란 중합체를 사용하여, 본 발명의 장치들을 사용하여 일차 인간 T-세포들로의 FITC 덱스트란의 전달의 생존 가능성 및 효율을 나타내는 막대 그래프들이다. 회수된 세포들은 LSR II HTS(BD 생명과학)를 이용한 유세포분석기(flow cytometer) 분석 전 37℃에서 10% FBS로 RPMI에서 24시간 동안 배양되었다. 도 14a는 7-AAD 배제 염료를 사용하여 평가된 일차 인간 T-세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 14b는 GFP 발현을 사용하여 평가된 일차 인간 T-세포들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 15a 내지 15b는 본 발명의 장치들을 사용하는 THP-1 단핵구 및 THP-1 단핵구에 대한 공개된 트랜스펙션 프로토콜들을 사용하는 상업적으로 입수가능한 세포 트랜스펙션 기기(NEON®)에서의 트랜스펙션 효율 및 생존 가능성을 비교하는 막대 그래프들이다. 회수된 세포들은 LSR II HTS(BD 생명과학)를 이용한 유세포분석기(flow cytometer) 분석 전 37
Figure pct00001
에서 10% FBS로 RPMI에서 24시간 동안 배양되었다. 도 15a는 7-AAD 배제 염료를 사용하여 평가된 THP-1 단핵구들의 생존 가능성을 도시한다. 도 15b는 GFP 발현을 사용하여 평가된 THP-1 단핵구들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 16a 내지 16b는 본 발명의 장치들을 이용한 일차 인간 단핵구들 및 일차 인간 단핵구들에 대한 공개된 트랜스펙션 프로토콜들을 이용한 상업적으로 입수가능한 세포 트랜스펙션 기기에서의 트랜스펙션 효율 및 생존 가능성을 비교하는 막대 그래프들이다. 일차 인간 단핵구들은 음성 선택을 이용하여 말초 혈액으로부터 분리되었다. 회수된 세포들은 LSR II HTS(BD 생명과학)를 이용한 유세포분석기(flow cytometer) 분석 전 37℃에서 10% FBS로 RPMI에서 24시간 동안 배양되었다. 도 16a는 7-AAD 배제 염료를 사용하여 평가된 일차 인간 단핵구들의 생존 가능성을 도시한다. 도 16b는 GFP 발현을 사용하여 평가된 일차 인간 단핵구들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 17a 내지 17b는 본 발명의 장치들을 사용하는 NK-92 세포주 및 NK-92 세포주에 대한 공개된 트랜스펙션 프로토콜들을 사용하는 상업적으로 입수가능한 세포 트랜스펙션 기기에서의 트랜스펙션 효율 및 생존 가능성을 비교하는 막대 그래프들이다. 본 발명의 장치들을 사용하거나 상업적으로 입수 가능한 기기를 사용하여 전기천공한 후, 세포들은 iQue(Intellicyt)를 사용하여 유세포분석기 분석 전에 37℃에서 완전한 aMEM(25% 혈청, 0.2 mM 이노시톨, 0.02 mM 엽산 0.1 mM 머캅토에탄올을 갖는 aMEM)에서 24시간 동안 배양되었다. 도 17a는 7-AAD 배제 염료를 사용하여 평가된 생존 가능성을 도시한다. 도 17b는 GFP 발현에 의해 평가된 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 18a 내지 18b는 본 발명의 장치들을 이용한 NK-92MI 세포주 및 NK-92MI 세포주에 대한 공개된 트랜스펙션 프로토콜들을 이용한 상업적으로 입수가능한 세포 트랜스펙션 기기에서의 트랜스펙션 효율 및 생존 가능성을 비교하는 막대 그래프들이다. 전기천공 후, 세포들은 iQue(Intellicyt)를 사용하여 유세포분석기 분석 전에 37℃에서 완전한 aMEM(25% 혈청, 0.2 mM 이노시톨, 0.02 mM 엽산 0.1 mM 머캅토에탄올을 갖는 aMEM)에서 24시간 동안 배양되었다. 도 18a는 7-AAD 배제 염료를 사용하여 평가된 생존 가능성을 도시한다. 도 18b는 GFP 발현에 의해 평가된 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 19a 내지 19f는 T 세포들(도 19a 내지 19c)을 전기천공되지 않은 세포들과 비교하여 본 발명의 장치들을 사용하여 전기천공되고 SIRP알파 커스텀 mRNA로 트랜스펙션된 일차 인간 단핵구들(도 19d 내지 19f)와 비교하는 막대 그래프들이다. 11일째 확장된 T 세포는 20㎍의 SIRP알파 mRNA로 트랜스펙션되었고 24 시간에서 과발현에 대해 평가되었다. A) 7-AAD 음성 세포로 측정된 생존 가능성, B) SIRP알파 양성 세포들로 측정된 트랜스펙션 효율, 및 C) 평균 형광 세기(mean fluorescent intensity; MFI)로 측정된 SIRP알파 발현에 대한 대표적인 그래프. PBMC들로부터 분리된 단핵구들은 20㎍의 SIRP알파 mRNA로 트랜스펙션되었고 24시간에 과발현에 대해 평가되였다. D) 7-AAD 음성 세포들로 측정된 생존 가능성, E) SIRP알파 양성 세포들로 측정된 트랜스펙션 효율, 및 F) 평균 형광 세기(MFI)로 측정된 SIRP알파 발현에 대한 대표적인 그래프. 그래프들은 평균±SEM이다.
도 20a 내지 20d는 인간 일차 비접촉 T 세포들(native T cells)에 GFP mRNA의 전달을 보여주는 막대 그래프들이다. 도 20a는 회수된 세포들을 도시하고, 도 20b는 비접촉 T 세포 효율을 도시하며, 도 20c는 비접촉 T 세포 생존 가능성을 도시하고, 도 20d는 총 수율을 도시한다. 비접촉 T 세포는 10㎍의 상업용 GFP mRNA로 트랜스펙션되었고 24 시간에서 과발현에 대해 평가되었다. 수, 생존 가능성, 효율 및 수율에 대한 대표적인 그래프들이 도시되어 있다. 그래프들은 평균±SEM이다.
도 21a 내지 21b는 전기천공이 표현형 인간 일차 비접촉 T 세포들을 변화시키지 않는다는 것을 보여주는 FACS 플롯들이다. 도 21a는 비처리된 세포들을 도시하고, 도 21b는 전기천공된 세포들을 도시한다. 비접촉 T 세포는 10 ㎍의 상업용 GFP mRNA로 트랜스펙션된 다음, 도트 플롯에 도시된 바와 같이 24시간에 CD45RA 및 CD45RO에 대해 염색되었다. CD45RA/CD45RO 표현형은 비처리된 T 세포와 FlowfectTM 전기천공된 비접촉 T 세포 간에 동등하다.
도 22는 비처리된 세포들과 비교하여 본 발명의 장치를 사용한 비접촉 T 세포 확장을 나타내는 동역학적 플롯이다. 전기천공은 인간 일차 비접촉 T 세포들의 확장을 변화시키지 않는다. 비접촉 T 세포는 10㎍의 상업용 GFP mRNA로 트랜스펙션된 다음 가용성 CD3/CD28 활성제들로 확장되었다. 세포 수는 활성화 후 1일, 4일, 및 6일에 측정되었다. 확장율은 비처리되고 전기천공된 비접촉 T 세포 간에 동등하다.
도 23a 내지 23f는 복수의 세포 샘플들을 동시에 통전 및 전기천공하도록 구성된 전자 방전 장치에 통합된 본 발명의 전기천공 장치들의 예시적인 실시예들을 도시한다. 도 23a는 전자 방전 장치의 상부 등측도를 도시한다. 도 23b는 포고 핀-스타일 전기 콘택들을 사용하여 시스템에서 전기 콘택이 이루어지는 방법을 보여주는 전자 방전 장치에 설치된 본 발명의 장치의 측면도를 도시한다. 도 23c는 전체 전자 방전 장치의 측면도를 도시한다. 도 23d는 전자 방전 장치의 대안적인 실시예의 상부 등측도를 도시한다. 도 23e는 가요성 스프링-스타일 전기 콘택들을 사용하여 시스템에서 전기 콘택이 이루어지는지는 방법을 보여주는 전자 방전 장치 내에 설치된 본 발명의 장치의 측면도이다. 도 23f는 복수의 세포 샘플들을 동시에 통전 및 전기천공하도록 구성된 전자 방전 장치의 부감도를 도시한다.
도 24a 내지 24b는 온도 제어를 위해 열적 액체를 사용하는 본 발명의 온도 제어식 전기천공 장치의 실시예들을 도시한다. 도 24a는 온도 제어식 전기천공 장치의 컴포넌트들의 개략도를 도시한다. 도 24b는 외부 프레임에서 장치를 보여주는 온도 제어식 전기천공 장치의 측면도를 도시한다.
도 25a 내지 25b는 샘플 도입을 위한 산업 표준 피펫 팁(pipette tip)들을 수용하도록 구성된 본 발명의 유체 칩 기반 전기천공 장치의 실시예들을 도시한다. 도 25a는 임베디드된 전극들 및 유체 채널들을 통합하는 유체 칩의 일 실시예를 도시한다. 도 25b는 유체 칩 기반 전기천공 장치의 컴포넌트들의 개략도를 도시한다.
도 26a 내지 26b는 본 발명의 연속 유동 전기천공 장치의 실시예들을 도시한다. 도 26a는 연속 유동 전기천공 장치의 컴포넌트들의 단면(cutaway) 개략도를 도시한다. 도 26b는 연속 유동 전기천공 장치의 컴포넌트들을 보여주기 위한 투명도를 가진 외측도를 도시한다.
도 27a 내지 27f는 나선형(helical) 전극의 일 실시예의 계산 모델링을 사용하여 생성된 시뮬레이션된 전계를 도시한다. 도 27a는 모든 3개의 데카르트 축을 따라 도시된 나선형 전극의 시뮬레이션된 전계를 도시한다. 도 27b는 Z축에 따른 단면으로부터 도시된 나선형 전극의 시뮬레이션된 전계를 도시한다. 도 27c 내지 27f는 Z축에 따른 4개의 상이한 위치들로부터 도시된 X-Y 축에 따른 나선형 전극의 시뮬레이션된 전계를 도시한다.
도 28a 내지 28c는 제조 확장성을 위해 구성된 본 발명의 2-파트 전기천공 장치의 실시예들을 도시한다. 도 28a는 본 발명의 2-파트 전기천공 장치의 일 실시예의 상부 등각 3D 렌더링을 도시한다. 도 28b는 두 컴포넌트들이 짝을 이루는 방법을 보여주는 도 28a에 도시된 실시예의 수직 단면을 도시한다. 도 28c는 장치의 치수(mm 단위)가 오버레이된 도 28b에 도시된 실시예의 동일한 도면을 도시한다.
도 29a 내지 29b는 액체 취급 캐뉼라를 위한 인터페이스를 갖는 임베디드된 전극들을 포함하는 본 발명의 2-파트 전기천공 장치의 일 실시예를 도시한다. 도 29a는 임베디드된 전극들을 갖는 본 발명의 2-파트 전기천공 장치의 일 실시예의 상부 등각 3D 렌더링을 도시한다. 도 29b는 본 발명의 장치의 전기천공 구역에 대한 임베디드된 전극들의 위치를 나타내는 도 29a에 도시된 실시예의 수직 단면을 도시한다.
도 29c는 본 기술의 처리량 및 병렬화를 향상시키는 다중 장치 접근법의 도면이다.
도 30a 내지 30b는 본 발명의 복수의 장치들, 액체 취급 컴포넌트들, 컨트롤러들 및 임의의 전기 컴포넌트들을 수용하도록 구성된 본 발명의 외부 하우징의 실시예들을 도시한다. 도 30a는 사용자 인터페이스를 갖는 본 발명의 외부 하우징의 일 실시예를 도시한다. 도 30b는 액체 분배 매니폴드 및 샘플 플레이트에 연결된 본 발명의 장치들의 일 실시예를 도시한다.
도 31은 세포 수, 생존 가능성, 트랜스펙션 효율 및 표면/세포내 마커의 검출을 위해 전통적인 유세포분석 게이팅 전략(상업적으로 입수가능한 Lonza NUCLEOFECTOR 4DTM 전기천공 시스템을 사용, 하부)과 채택된 유세포분석 게이팅 전력(본 발명의 장치들 및 시스템들을 사용, 상부) 사이의 비교를 나타낸다.
도 32a 내지 32b는 전기천공 후 24 시간에서 본 발명의 장치들을 사용하여 GFP-코딩 플라스미드 DNA을 CHO-K1 세포들로 전달하는 것으로부터의 생존 가능성 및 효율을 보여주는 막대 그래프들이다. 도 32a는 CHO-K1 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 32b는 GFP 발현을 사용하여 평가된 CHO-K1 세포들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 33a 내지 33d는 전기천공 후 24시간 및 48시간에 본 발명의 장치들을 사용하여 GFP-코딩 플라스미드 DNA를 HEK-293T 세포들로 전달하는 것으로부터의 생존 가능성 및 효율을 보여주는 막대 그래프들이다. 도 33a는 전기천공 후 24 시간에서 HEK-293T 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 33b는 전기천공 후 24 시간에서 GFP 발현을 사용하여 평가된 HEK-293T 세포들의 트랜스펙션 효율을 도시한다. 도 33c는 전기천공 후 48 시간에서 HEK-293T 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 33d는 전기천공 후 48 시간에서 GFP 발현을 사용하여 평가된 HEK-293T 세포들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 34a 내지 34b는 본 발명의 장치들 및 시스템을 사용하여 전기천공 전(도 34a) 및 후(도 34b) 중국 햄스터 난소(CHO-K1) 세포들의 수집된 GFP 형광 신호들을 도시한다. GFP 형광 이미지들은 10x 대물렌즈가 장착된 ECHO Revolve 현미경을 사용하여 캡처되었다.
도 35a 내지 35b는 본 발명의 장치들 및 시스템들을 사용하여 전기천공 전(도 35a) 및 후(도 35b) HEK-293T 세포들의 수집된 GFP 형광 신호들을 도시한다. GFP 형광 이미지들은 10x 대물렌즈가 장착된 ECHO Revolve 현미경을 사용하여 캡처되었다.
도 36a 내지 36d는 상업적으로 입수가능한 NEON® 트랜스펙션 시스템 및 본 발명의 장치들을 사용하여 40 kD FITC 덱스트란을 일차 인간 T-세포들로 전달하기 위한 전기천공 후 총 세포 수, 생존 가능성, 효율, 및 상대적 살아있는 양성으로 트랜스펙션된 세포들을 보여주는 막대 그래프들이다. 도 36a는 전기천공 후 총 세포 수를 도시한다. 도 36b는 일차 인간 T-세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 36c는 일차 인간 T-세포들 내로의 전달 효율을 도시한다. 도 36d는 상대적 살아있는 양성으로 트랜스렉션된 세포 집단을 도시한다.
도 37은 GFP 플라스미드를 일차 인간 T-세포들로 전달한 후, 상대적인 살아있는 양성으로 트랜스펙션된 세포 집단에 대한 NEON® 트랜스펙션 시스템과 본 발명의 장치들 간의 비교를 나타내는 막대 그래프이다.
도 38a 내지 38d는 9일째 때 mRNA을 일차 인간 T-세포들로의 전달에 대한 회수, 생존 가능성, 효율 및 수율을 보여주는 막대 그래프들이다. 전기천공은 2개의 상업적으로 입수가능한 트랜스펙션 시스템(Lonza NUCLEOFECTOR 4DTM 및 Thermo Fisher NEON®) 및 본 발명의 장치들을 사용하여 수행되었다. 1 백만(106 세포/mL) 또는 5 백만(5x106 세포/mL)는 EGFP를 인코딩하는 10 ㎍ mRNA와 함께 100 μl에서 전기천공되였다. 전기천공 후 24시간에 유세포 분석을 통한 분석이 수행되었다. 세포 수는 1 백만 세포 입력들으로 정규화되며, 수율은 본 발명의 장치들을 사용하여 수집된 결과들로 정규화된다. 도 38a는 두 세포 밀도에서의 회수를 도시한다. 도 38b는 두 세포 밀도에서의 생존 가능성을 도시한다. 도 38c는 두 세포 밀도에서의 효율을 도시한다. 도 38d는 두 세포 밀도에서의 수율을 도시한다.
도 39a 내지 39d는 본 발명의 장치들 및 시스템들을 사용하여 일차 인간 T-세포들에서 CXCR3을 타겟으로 하는 Cas9 리보핵단백질 복합체들(RNP들)의 전달에 대한 회수, 생존가능성, 효율 및 MFI를 보여주는 라인 플롯들이다. Cas9 RNP들은 상업적으로 입수가능한 Cas9 단백질 및 sgRNA의 2개의 상업용 소스들로 제형화되었다. 전기천공 후 24 내지 72시간에서 유세포분석을 통한 분석이 수행되었다. 도 39a는 세포 회수를 도시한다. 도 39b는 생존 가능성을 도시한다. 도 39c는 효율을 도시한다. 도 39d는 전기청공 후 72 시간까지 확장된 타겟 KO 세포들의 총 수율을 도시한다.
도 40a 내지 40b는 THP-1 세포들로부터의 GFP 발현 및 상업적으로 입수 가능한 NEON® 트랜스펙션 시스템 및 본 발명의 장치들을 사용한 전기천공을 위한 NK-92MI 세포들로의 FITC 라벨링된 덱스트란 전달에 대한 살아있는 세포 수를 보여주는 막대 그래프들이다. 도 40a는 THP-1 세포들에 대한 GFP 발현에 대한 살아있는 세포 수를 도시한다. 도 40b는 NK-92MI 세포들로의 FITC 라벨링된 덱스트란 전달에 대한 살아있는 세포 수를 도시한다.
도 41a 내지 41b는 상업용 NEON® 트랜스펙션 시스템 및 본 발명의 장치들을 사용하여 THP-1 단핵구들 내로의 GFP mRNA 전달에 대한 결과적인 생존 가능성과 효율의 비교를 보여주는 막대 그래프들이다. 도 41a는 트랜스펙션 후 24시간에 평가된 THP-1 단핵구들의 생존 가능성을 도시한다. 도 41b는 전기천공 후 24 시간에 GFP 발현을 사용하여 평가된 THP-1 단핵구들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 42a 내지 42c는 전기천공되지 않은 세포들의 대조 샘플과 함께 본 발명의 장치들을 사용하여 THP-1 단핵구들 내로의 GFP mRNA 전달에 대한 생존 가능성, 효율 및 수율을 보여주는 막대 그래프들이다. 도 42a는 전기천공 후 24 내지 72시간에 평가된 트랜스펙션된 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 42b는 전기천공 후 24 내지 72시간에 평가된 GFP mRNA의 흡수 효율을 도시한다. 도 42c는 전기천공 후 24 내지 72시간에 평가된 트랜스펙션된 세포들의 수율을 도시한다.
도 43a 내지 43b는 본 발명의 장치들을 사용하여 LPS-활성화된 THP-1 세포들로의 GFP mRNA 전달에 대한 생존 가능성 및 효율을 보여주는 막대 그래프들이이다. 도 43a는 트랜스펙션 후 24시간에 평가된 LPS-활성화된 THP-1 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 43b는 전기천공 후 24 시간에 GFP 발현을 사용하여 평가된 LPS-활성화된 THP-1 단핵구들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 44a 내지 44d는 본 발명의 장치들을 사용하여 40 kD FITC 덱스트란 및 GFP mRNA를 일차 말초 혈액 단핵구들 내로의 전달에 대한 생존 가능성 및 효율을 보여주는 막대 그래프들이다. 도 44a는 FITC 덱스트란으로 트랜스펙션된 일차 말초 혈액 단핵구들의 생존 가능성을 도시한다. 도 44b는 FITC 덱스트란으로 트랜스펙션된 일차 말초 혈액 단핵구들의 트랜스펙션 효율을 도시한다. 도 44c는 GFP mRNA로 트랜스펙션된 일차 말초 혈액 단핵구들의 생존 가능성을 도시한다. 도 44b는 GFP mRNA로 트랜스펙션된 일차 말초 혈액 단핵구들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 45a 내지 45b는 본 발명의 장치들을 사용하여 LPS 자극으로 GFP로 트랜스펙션된 일차 말초 혈액 단핵구들에서의 CD80 및 CD86의 발현을 보여주는 막대 그래프들이다. CD80 및 CD86의 발현은 전기천공 후 24시간 및 96시간에 측정되었다. 도 45a는 활성화 마커 CD80의 발현을 도시한다. 도 45b는 계통 마커(lineage marker) CD86의 발현을 도시한다.
도 46a 내지 46c는 4일 내지 8일에 걸쳐 대식세포로 분화되는 본 발명의 장치를 사용하여 GFP mRNA로 트랜스펙션된 일차 말초 혈액 단핵구들의 대식세포 표현형, 생존 가능성 및 GFP 발현을 나타내는 막대 그래프들이다. 도 46a는 FSC 및 SSC의 유세포측정 분석을 통해 평가된 대식세포 표현형을 도시한다. 도 46b는 트랜스펙션된 대식세포의 생존 가능성을 도시한다. 도 46c는 트랜스펙션된 대식세포의 GFP 발현 백분율을 도시한다.
도 47a 내지 47d는 본 발명의 장치들을 사용하여 40 kD FITC 덱스트란 및 GFP mRNA를 말초 혈액 분화된 대식세포들로의 전달에 대한 생존 가능성 및 효율을 보여주는 막대 그래프들이다. 도 47a는 FITC 덱스트란으로 트랜스펙션된 말초 혈액 분화된 대식세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 47b는 FITC 덱스트란으로 트랜스펙션된 말초 혈액 분화된 대식세포들의 트랜스펙션 효율을 도시한다. 도 47c는 GFP mRNA로 트랜스펙션된 말초 혈액 분화된 대식세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 47d는 GFP mRNA로 트랜스펙션된 말초 혈액 분화된 대식세포들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 48a 내지 48b는 본 발명의 장치들을 사용하여 GFP mRNA로 트랜스펙션한 후 말초 혈액 분화된 대식세포들이 M1 및 M2 대식세포들로 분극화하는 능력을 보여주는 막대 그래프들이다. 도 48a는 IFNg + LPS 자극에 의한 M1 분극이 상승된 CD86 발현에 의해 지시된 M1 분극된 대식세포들을 도시한다. 도 48b는 M2 분극, IL-4 자극dl CD206 발현에 의해 지시된 M2 분극 대식세포들을 도시한다.
도 49a 내지 49c는 상업용 NEON® 트랜스펙션 시스템 및 본 발명의 장치들을 사용하여 FITC 덱스트란으로 트랜스펙션된 일차 인간 단핵구들에 대한 생존 가능성, 효율 및 살아있는 세포 수를 보여주는 막대 그래프들이다. 도 49a는 일차 인간 단핵구들의 생존 가능성을 도시한다. 도 49b는 일차 인간 단핵구들 내로의 FITC 덱스트란의 전달에 대한 효율을 도시한다. 도 49c는 트랜스펙션된 일차 인간 단핵구들의 살아있는 세포 수를 도시한다.
도 50a 내지 50d는 본 발명의 단일 채널 및 연속 유동 장치들을 사용하여 다양한 세포 밀도의 Jurkat 세포들로의 DNA 트랜스펙션의 회수, 생존 가능성, 효율 및 수율을 비교하는 막대 그래프들이다. 도 50a는 트랜스펙션된 Jurkat 세포들의 회수를 도시한다. 도 50b는 트랜스펙션된 Jurkat 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 50c는 Jurkat 세포들 내로의 DNA 트랜스펙션의 효율을 도시한다. 도 50d는 트랜스펙션된 Jurkat 세포들의 수율을 도시한다.
도 51a 내지 51b는 본 발명의 단일 채널 및 연속 유동 장치들을 사용하여 트랜스펙션된 Jurkat 세포들의 GFP 및 FITC 수율을 비교하는 막대 그래프들이다. 도 51a는 트랜스펙션된 Jurkat 세포들에 대한 GFP 수율을 도시한다. 도 51b는 트랜스펙션된 Jurkat 세포들에 대한 FITC 수율을 도시한다.
도 52a 내지 52d는 본 발명의 연속 유동 장치들을 사용하여 고 세포 밀도 현탁액 내로 FITC 덱스트란의 전달을 나타내는 막대 그래프들이다. 전기천공 후 24시간에 유세포 분석을 통한 분석이 수행되었다. 도 52a는 1백만 개의 세포 입력들에 대한 총 회수된 세포 수를 도시한다. 도 52b는 트랜스펙션된 Jurkat 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 52c는 Jurkat 세포들 내로의 FITC 덱스트란 트랜스펙션의 효율을 도시한다. 도 52d는 트랜스펙션된 Jurkat 세포들의 FITC 수율을 도시한다.
도 53a 내지 53d는 본 발명의 연속 유동 장치들에서 다양한 양의 mRNA 및 다양한 세포 농도를 사용하여 100 백만 세포들의 세포 수에서 Jurkat 세포들로의 mRNA 트랜스펙션에 대한 회수, 생존 가능성, 효율 및 수율을 보여주는 막대 그래프들이다. 전기천공 후 24시간에 유세포 분석을 통한 분석이 수행되었다. 도 53a는 상이한 농도의 mRNA 및 세포 농도에서 회수된 Jurkat 세포들의 수를 도시한다. 도 53b는 상이한 농도의 mRNA 및 세포 농도에서 트랜스펙션된 Jurkat 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 53c는 상이한 농도의 mRNA 및 세포 농도에서 Jurkat 세포들 내로의 mRNA 트랜스펙션의 효율을 도시한다. 도 53d는 상이한 농도의 mRNA 및 세포 농도에서 트랜스펙션된 Jurkat 세포들의 수율을 도시한다.
도 54는 상업용 Lonza NUCLEOFECTOR 4DTM 트랜스펙션 시스템 및 본 발명의 장치들을 비교하는 비처리된 T-세포들 및 전기천공된 T-세포들의 유세포측정 분석을 도시한다. 상부 패널은 FSC/SSC 총 세포 플롯을 도시하고, 하부 패널은 생존 가능성 염색을 도시한다. 죽은 세포 집단은 적색 화살표 및 적색 상자로 표시된다. 또한 비처리된 세포들과 비교하여 24시간에 Lonza NUCLEOFECTOR 4DTM으로 트랜스펙션된 세포들의 모폴로지 이동이 있으며, 이는 Lonza 플랫폼과의 전기천공 동안 표현형 변화가 발생함을 나타낸다.
도 55는 상업용 Lonza LV 트랜스펙션 시스템 및 본 발명의 연속 유동 장치를 사용하여 FITC-덱스트란 또는 EGFP mRNA를 사용한 50 백만 일차 T 세포들의 전기천공으로부터 총 세포 수율의 막대 그래프를 도시한다.
도 56a 내지 56b는 전기천공 후 최대 72시간의 기간 동안 본 발명의 연속 유동 장치를 사용하여 10억 THP-1 세포들의 현탁액 내로 FITC 덱스트란의 전달에 대한 생존 가능성 및 효율을 나타내는 막대 그래프들이다. 도 56a는 THP-1 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 56b는 THP-1 세포들 내로의 FITC 덱스트란 전달에 대한 효율을 도시한다.
도 57은 본 발명의 연속 유동 장치들을 사용하여 10억 THP-1 세포들의 현탁액으로부터 출발하여 살아있는 회수 가능한 FITC 덱스트란 트랜스펙션된 세포들의 수율을 나타내는 막대 그래프이다. 수율은 전기천공 배양 후 최대 72시간의 기간 동안 추적되었고, 세포의 입력 수의 대략 50%를 나타낸다. 전기천공 후 4시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 유세포 분석법을 통한 분석이 수행되었다.
도 58a 내지 58d는 본 발명의 장치들을 사용하여 Jurkat 세포들로의 FITC 덱스트란 트랜스펙션에 대한 총 세포 수, 생존 가능성, 효율 및 수율에 대한 파형 형상과 파형 전압을 비교하는 막대 그래프들이다. 도 58a는 상이한 파형 형상 및 전압에서 회수된 Jurkat 세포들의 수를 도시한다. 도 58b는 상이한 파형 형상 및 전압에서 트랜스펙션된 Jurkat 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 58c는 다양한 파형 형상 및 전압에서 Jurkat 세포들 내로의 FITC 덱스트란 트랜스펙션의 효율을 도시한다. 도 58d는 다양한 파형 형상 및 전압에서 트랜스펙션된 Jurkat 세포들의 수율을 도시한다.
도 59a 내지 59d는 본 발명의 장치들을 사용하여 일차 T 세포들로의 FITC 덱스트란 트랜스펙션에 대한 총 세포 수, 생존 가능성, 효율 및 수율에 대한 파형 최대 전압과 듀티 사이클을 비교하는 막대 그래프들이다. 도 59a는 상이한 파형 최대 전압들 및 듀티 사이클들에서의 회수된 일차 T 세포들의 수를 도시한다. 도 59b는 상이한 파형 최대 전압들 및 듀티 사이클에서 트랜스펙션된 일차 T의 생존 가능성을 도시한다. 도 59c는 다양한 파형 최대 전압들 및 듀티 사이클들에서 일차 T 세포들 내로의 FITC 덱스트란 트랜스펙션의 효율을 도시한다. 도 59d는 다양한 파형 전압들 및 듀티 사이클들에서 트랜스펙션된 일차 T 세포들의 수율을 도시한다.
도 60a 내지 60d는 본 발명의 장치들을 사용하여 일차 T 세포들로의 mRNA 트랜스펙션에 대한 총 세포 수, 생존 가능성, 효율 및 수율에 대한 파형 최대 전압들과 듀티 사이클들을 비교하는 막대 그래프들이다. 도 60a는 상이한 파형 최대 전압들 및 듀티 사이클들에서의 회수된 일차 T 세포들의 수를 도시한다. 도 60b는 상이한 파형 최대 전압들 및 듀티 사이클에서 트랜스펙션된 일차 T의 생존 가능성을 도시한다. 도 60c는 다양한 파형 최대 전압들 및 듀티 사이클들에서 일차 T 세포들 내로의 mRNA 트랜스펙션의 효율을 도시한다. 도 60d는 다양한 파형 전압들 및 듀티 사이클들에서 트랜스펙션된 일차 T 세포들의 수율을 도시한다.
도 61은 본 발명의 장치들을 사용하여 1 백만 개의 일차 인간 T 세포의 현탁액으로의 CD3/CD28 Dynabeads의 전달에 대한 효율을 나타내는 막대 그래프이다. 전기천공은 Dynabeads를 사용하거나 사용하지 않고 수행되었고, Dynabead 통합은 5분 동안 또는 밤새 수행되었다. 전기천공 후 24시간에 유세포 분석을 통한 분석이 수행되었다.
도 62a 내지 62b는 본 발명의 장치들의 전극들을 둘러싸도록 구성된 외부 구조체의 일 실시예를 도시한다. 도 62a는 본 발명의 장치를 수용하기 위해 래치 및 클램쉘-타입 힌지로 구성된 외부 구조체를 도시한다. 도 62b는 본 발명의 장치가 외부 구조체의 대응하는 내부 리세스들 내에 놓여 있는 도 62a의 외부 구조체를 도시한다.
도 63a 내지 63b는 장치의 전극들을 덮는 외부 구조체가 있거나 없는 둘 다, 본 발명의 장치들을 사용하여 THP-1 단핵구들로의 FITC 덱스트란의 전달에 대한 생존 가능성 및 효율을 나타내는 막대 그래프들이다. 전기천공 후 24시간에 유세포 분석을 통한 분석이 수행되었다. 도 63a는 THP-1 단핵구들의 생존 가능성을 도시한다. 도 63b는 THP-1 단핵구들의 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 64a 내지 64b는 상이한 중합체 수지로부터 제조된 본 발명의 장치들을 사용하여 THP-1 단핵구들 내로의 FITC 덱스트란의 전달에 대한 생존 가능성 및 효율을 나타내는 막대 그래프들이다. 도 64a는 트랜스펙션된 THP-1 단핵구들의 생존 가능성을 도시한다. 도 64b는 THP-1 단핵구들 내로의 FITC 덱스트란의 트랜스펙션의 효율을 도시한다.
도 65a 내지 65b는 수동으로 또는 자동화된 유체 취급 플랫폼으로 동작되는 본 발명의 장치들을 사용하여 Jurkat 세포들 내로의 GFP를 코딩하는 DNA 및 mRNA 둘 다의 전달에 대한 생존 가능성 및 효율을 비교하는 막대 그래프들이다. 도 65a는 트랜스펙션된 Jurkat 세포들의 생존 가능성을 도시한다. 도 65b는 GFP를 암호화하는 DNA 및 mRNA을 Jurkat 세포로의 트랜스펙션에 대한 효율을 도시한다.
도 66a 내지 66e는 수동으로 또는 자동화된 유체 취급 플랫폼으로 동작되는 본 발명의 장치들을 사용하여 GFP 및 mCherry 둘 모두를 암호화하는 다수의 mRNA들을 병렬(동일한 날) 또는 직렬(2일 간격)로 T 세포들로 전달하는 것에 대한 생존 가능성 및 효율을 비교하는 막대 그래프들 및 도트 플롯들이다. 도 66a는 mCherry를 코딩하는 다수의 mRNA들의 전달에 대한 전기천공 후 24시간 T 세포 생존 가능성을 도시한다. 도 66b는 전기천공 후 24시간 GFP 효율을 도시한다. 도 66c는 전기천공 후 24시간 mCherry 효율을 도시한다. 도 66d는 전기천공 후 24시간 이중 GFP 및 mCherry 효율을 도시한다. 도 66e는 24시간에서의 GFP(x-축) 및 mCherry(y-축) 발현 둘 다의 도트 플롯들을 도시한다.
도 67a 내지 67b는 본 발명의 장치들을 사용하여 말초 혈액 단핵구 세포들(PBMC들) 내로의 mRNA의 전달에 대한 효율을 입증하는 막대 그래프들이다. 이들 실험은 GFP를 코딩하는 상업적으로 소싱된 mRNA로 수행되었으며, 이후 표면 수용체의 표현형 염색을 수행하여 특정 세포 집단을 식별하였다. 도 67a는 T 세포 서브집단에서의 효율을 도시하고, 도 67b는 PBMC로부터의 비-T 세포 집단에서의 효율을 도시한다. 전기천공 후 24시간에 유세포 분석을 통한 분석이 수행되었다.
도 68은 제1 유입구와 유체 연통되는 저장소(백(bag)) 및 제2 유출구와 유체 연통되는 저장소(백)를 갖는 본 발명의 시스템의 일 실시예의 사진이다.
도 69a는 본 발명의 장치들 대 비처리된 대조군들을 사용한 eGFP-mRNA 발현을 보여주는 현미경사진 세트이다. 도 69b 및 69c는 살아있는 세포 백분율(도 69b) 및 GFP+ 세포 백분율(도 69c)을 보여주는 막대 그래프들이다.
도 70a 내지 70d는 총 NK 세포 회수(도 70a), 생존 가능성(도 70b), 트랜스펙션 효율(도 70c) 및 GFP+ 세포 수율(도 70d)을 보여주는 막대 그래프들이다.
도 71a 및 71b는 "전기천공 없는" 대조군(좌측으로 첫 번째 막대), 본 발명의 장치(키토펜; 좌측으로 두 번째 막대), 및 두 개의 통상적인 플랫폼들 - Thermo(Neon 트랜스펙션 시스템) 및 Lonza 4D-Nucleofector(각각 세 번째 및 네 번째 막대) 사이의 교차-플랫폼 비교를 보여주는 막대 그래프들이다. 도 71a는 % 생존 가능성을 도시한다. 도 71b는 % 트랜스펙션 효율을 도시한다.
도 71c는 도 71a 및 71b에서 비교된 3개의 플랫폼들에 걸친 유전자 발현 차이를 보여주는 히트 맵이다. 어두운 음영은 처리되지 않은 세포들에 비해 더 큰 정도의 유전자 발현 차이에 대응된다.
도 72a 내지 72d는 트랜스펙션 후 24시간에서 반응당 상대적인 세포 수, 생존 가능성(7-AAD- 세포 퍼센트), 효율(살아있는 GFP+ 세포 퍼센트), 및 수율 세포 수(살아있는 GFP+ 세포 수)에 대한 히트맵이며, 이는 다양한 Vrms(y 축) 및 유량(x 축)의 함수로서 도시된다.
도 73a 내지 73d는 트랜스펙션 후 24시간에서 반응당 상대적인 세포 수, 생존 가능성(7-AAD- 세포 퍼센트), 효율(살아있는 GFP+ 세포 퍼센트), 및 수율 세포 수(살아있는 GFP+ 세포 수)에 대한 히트맵이며, 이는 다양한 Vrms(y 축) 및 유량(x 축)의 함수로서 도시된다.
도 74는 다양한 인가 에너지(Vrms 2/R) 및 유량에 걸친 살아있는 세포 수율을 나타내는 밀도 플롯이다.
값들이 범위들로서 설명되는 경우, 이러한 개시는 특정 수치 값 또는 특정 서브 범위가 명시적으로 명시되어 있는지 여부에 관계없이 이러한 범위 내의 모든 가능한 서브 범위들, 뿐만 아니라 이러한 범위들 내에 속하는 특정 수치 값들의 개시를 포함한다는 것이 이해될 것이다.
본원에 사용된 "약"이라는 용어는 인용된 값의 +/- 10%를 지칭한다.
본원에 사용된 "복수"라는 용어는 하나 이상을 지칭한다.
본원에 사용된 "실질적으로 균일한"은 +/- 5% 변동을 지칭한다.
본원에서 사용된 "최소 단면 치수"라는 용어는 루멘의 횡단면의 기하학적 중심을 통과하고 횡단면의 동일한 평면 상에서 루멘의 내벽과 2회 교차하는 직선의 최소 길이를 지칭한다.
"단면적"이라는 용어는, 달리 특정되지 않는 한, 횡단면적(예를 들어, 길이방향 축 또는 흐름 방향에 수직인 평면을 따름)을 지칭한다.
본원에 사용된 "유체 연결된" 용어는, 예를 들어, 유체가 개재 요소를 통과하지 않고 이러한 장치 요소들 사이에서 이동할 수 있게 하는, 적어도 2개의 장치 요소들, 예를 들어 전기천공 장치, 저장소 등 사이의 직접 연결을 지칭한다.
본원에 사용된 "유체 연통"이라는 용어는, 예를 들어, 개재 요소를 통해(예를 들어, 개재 튜빙, 개재 채널 등을 통해), 유체가 이러한 장치 요소들 사이에서 이동하도록 하는, 적어도 2개의 장치 요소들, 예를 들어, 전기천공 구역, 저장소 등 사이의 간접 연결을 지칭한다. 예를 들어, 유체가 제1 전극의 루멘으로부터 전기천공 구역을 통해 제2 전극의 루멘으로 유동하는 실시예들에서, 제1 전극은 제2 전극과 유체 연통된다.
본원에 사용된 "루멘"이라는 용어는 유체가 통과할 수 있게 하는 본 발명의 장치들의 전극의 내부 캐비티를 지칭한다. 전극의 루멘의 일부 또는 전부는 전도성 또는 비전도성일 수 있다. 예를 들어, 전극의 루멘은 루멘의 둘레를 완전히 둘러싸지 않는 C-형상 전도성 요소를 둘러쌀 수 있다. 다른 실시예들에서, 전극은 실질적으로 전체적으로 전류를 전달하는 전도성 재료로 구성된다. 본 발명의 장치들의 제1 및 제2 전극에 전위차가 인가될 때, 제1 또는 제2 전극들 중 어느 하나의 루멘에서 발생될 수 있는 전계는 상기 루멘 내에서 세포 전기천공이 발생하도록 하기에 충분히 높지 않다.
본원에 사용된 "진입 구역"이라는 용어는 본 발명의 장치들의 제1 전극들의 루멘을 포함하며, 상기 루멘을 통해 유체 및 유체 내에 현탁된 복수의 세포들이 전기천공 전에 통과할 수 있다. 진입 구역은 본 발명의 장치들의 제1 전극의 루멘과 유체 연통되는 추가 저장소를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 장치들의 제1 및 제2 전극들에 전위차가 인가될 때, 본 발명의 장치들의 진입 구역 내에서 생성될 수 있는 전계는 세포 전기천공이 일어나도록 하기에 충분히 높지 않다.
본원에 사용된 "회수 구역"이라는 용어는 본 발명의 장치들의 제2 전극의 루멘을 포함하며, 상기 루멘을 통해 유체 및 유체 내에 현탁된 복수의 세포들이 전기천공 후에 통과할 수 있다. 회수 구역은 본 발명의 장치들의 제2 전극의 루멘과 유체 연통되는 추가 저장소를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 장치들의 제1 및 제2 전극들에 전위차가 인가될 때, 본 발명의 장치들의 회수 구역 내에서 생성될 수 있는 전계는 세포 전기천공이 발생하도록 하기에 충분히 높지 않다.
본원에 사용된 "전기천공 구역"이라는 용어는 상류 전극의 유출구(예를 들어, 제1 유출구)와 하류 전극의 유입구(예를 들어, 제2 유입구) 사이에 배치되고 이들과 유체 연통되는 장치의 부분을 지칭한다. 전계는 전기천공 구역 내의 유체에 전달된다.
본원에 사용된 용어 "트랜스펙션"이라는 용어는 생물학적, 화학적, 전기적, 기계적 또는 물리적 방법들과 같은, 바이러스 전달 방법 이외의 수단을 이용하여 페이로드들이 세포들 내로 도입될 수 있는 프로세스를 지칭한다.
본원에 사용된 "전기천공"이라는 용어는 페이로드들이 세포들 내로 도입될 수 있는(예를 들어, 트랜스펙션의 방법으로서) 세포 막들 내에 작은 기공들을 생성하기 위해 인가된 전계를 이용하는 프로세스를 지칭한다.
본원에 사용된 "전기-기계적 전달"이라는 용어는 페이로드들이 인가된 전계 및/또는 기계적 천공 메카니즘의 임의의 조합을 이용하여 세포들에 도입될 수 있는 트랜스펙션 프로세스이다. 이러한 전달 방법은 전기천공 구역에서 세포들의 전체 전계 노출을 감소 및/또는 안정화시켜, 세포 생존 가능성 및/또는 트랜스펙션 효율, 또는 둘 모두를 향상시킬 수 있는 잠재력을 갖는다. 본 발명의 장치들은 전기천공에 의해서만이라기 보다는 전기-기계적 전달을 통하여 세포들을 트랜스펙션시키도록 구성된다.
본 발명은 종래의 큐벳 기반 전기천공 접근법 또는 상업적으로 입수 가능한 전기천공 기기와 비교하여 더 큰 체적, 더 높은 트랜스펙션 효율, 더 많은 처리량, 더 높은 회수율, 더 높은 수율 및 더 높은 세포 생존 가능성으로 전기천공에 의해 세포들, 예를 들어, 일차 T 세포들의 트랜스펙션을 위한 장치들, 시스템들 및 방법들을 제공한다. 특히, 처리량 및 세포 수를 향상시키기 위해 플로우-스루(flow-through) 방식, 연속 방식, 또는 본 발명의 복수의 전기천공 장치들을 사용하여 전기천공을 수행할 수 있는 시스템들 및 방법들이 제공된다.
장치
일반적으로, 본 발명의 장치들은 유체 내에 현탁된 세포들의 연속적인 전기천공을 제공하기 위해, 종래의 피펫 팁 로봇 또는 대규모 액체 취급 시스템과 같은, 기존의 액체 취급, 펌프 또는 유체 수송 장치와 인터페이스할 수 있는 장치들을 통해 유동하도록 구성된다. 본 발명의 장치는 정적 전기천공 시스템에서 전달 메커니즘과 구별되는 전기-기계적 전달 메커니즘을 통해 전기천공 구역 내에서 세포들의 트랜스펙션이 일어나도록 구성된다. 본 발명의 장치들은 일반적으로 3개의 별개의 영역들인, 제1 유입구 및 제1 유출구를 갖는 제1 전극으로서, 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 한정하는, 상기 제1 전극; 제2 유입구 및 제2 유출구를 갖는 제2 전극으로서, 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 한정하는, 상기 제2 전극; 및 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되는 전기천공 구역을 특징으로 한다. 본 발명의 장치의 일 실시예의 일 예가 도 1a에 도시되어 있으며, 제1 전극과 제2 전극은 그들 사이의 전기천공 구역에 의해 유체 연결된다. 제1 전극과 제2 전극에 전위차가 인가되면, 두 전극들 사이의 공간, 예를 들어 전기천공영역에서 국부적인 전계가 발생되고, 전계에 노출된 세포들이 전기천공된다. 본 발명의 개별 장치는 도 1a 내지 1c에 도시된 바와 같이 2개의 전극들을 포함할 수 있으며; 대안으로, 본 발명의 개별 장치들은 복수의 전기천공 구역들을 정의하는 3개 이상의 전극들을 포함할 수 있으며, 따라서 유체 내에 현탁된 세포들 상에 복수의 전기천공을 허용한다. 본 발명의 장치는 제1 전극과 제2 전극 사이에 복수의 전기천공 구역들을 포함할 수 있으며, 이는 세포들이 단일 장치 또는 복수의 장치들에 흐르면서, 예를 들어, 복수의 전기천공 구역들 각각의 서로 다른 기하학적 구조들에 의해 발달된 서로 다른 전계를 경험할 수 있게 한다.
일부 경우에, 제1 전극 및 제2 전극은 전기 전도성 와이어, 중공 실린더, 전기 전도성 박막, 금속 발포체, 메시 전극, 액체 확산성 막, 전도성 액체일 수 있거나, 또는 이들의 임의의 조합이 장치에 포함될 수 있다. 전극들은 장치의 유체 흐름의 축과 평행하게 정렬될 수 있거나, 또는 장치의 유체 흐름의 축과 직교하도록 정렬될 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 전극들은 전극들을 통해 유체가 흐르는 것과 같이, 도 1a 내지 1c의 장치에서와 같이 장치 내의 유체 흐름의 축과 평행하게 배열된 중공 원통형 전극들일 수도 있다. 대안적인 예에서, 제1 및/또는 제2 전극들은 장치의 유체 흐름의 축에 정렬되는 기공들을 갖는 다공성 전도체, 예를 들어, 금속 메쉬로 제조될 수 있다. 대안적인 예에서, 제1 및/또는 제2 전극들은 전도성 유체, 예를 들어 액체일 수 있다. 일부 경우에, 제1 및 제2 전극들은 전기천공 구역 주위에 고체 전도체, 예를 들어 와이어로 이루어진 나선형, 예를 들어 이중 나선으로 구성될 수 있다. 이러한 구성에서, 전기천공 구역의 단면 치수는 실질적으로 균일하게 유지되지만, 제1 및 제2 전극들은 전기천공 구역의 길이를 따라 위치가 변한다. 제1 및 제2 전극들은 전기천공 구역과 유체 연통되지만, 전위차가 전극들에 인가될 때 생성된 전계는 유체 내에 현탁된 세포들이 본 발명의 장치를 통해 이동함에 따라 회전한다. 특정 실시예들에서, 제1 및 제2 전극들은 본 발명의 장치 내로 임베디드되고, 현탁액 내의 세포들을 운반하는 유체가 전계가 전기천공 구역에서 생성된 채, 전극의 일부와 접촉하도록 전기천공 구역에 대한 유체 연결부에 또는 그 부근에 배치된 활성 영역을 갖는다.
중공 원통형 전극들으로 구성될 때, 전극의 직경은 약 0.1 mm 내지 약 5 mm, 예를 들어, 약 0.1 mm 내지 약 1 mm, 약 0.5 mm 내지 약 1.5 mm, 약 1 mm 내지 약 2 mm, 약 1.5 mm 내지 약 2.5 mm, 약 2 mm 내지 약 3 mm, 약 2.5 mm 내지 약 3.5 mm, 약 3 mm 내지 약 4 mm, 약 3.5 mm 내지 약 4.5 mm, 또는 약 4 mm 내지 약 5 mm, 예를 들어, 약 0.1 mm, 약 0.2 mm, 약 0.3 mm, 약 0.4 mm, 약 0.5 mm, 약 0.6 mm, 약 0.7 mm, 약 0.8 mm, 약 0.9 mm, 약 1 mm, 약 1.1 mm, 약 1.2 mm, 약 1.3 mm, 약 1.4 mm, 약 1.5 mm, 약 1.6 mm, 약 1.7 mm, 약 1.8 mm, 약 1.9 mm, 약 2 mm, 약 2.1 mm, 약 2.2 mm, 약 2.3 mm, 약 2.4 mm, 약 2.5 mm, 약 2.6 mm, 약 2.7 mm, 약 2.8 mm, 약 2.9 mm, 약 3 mm, 약 3.1 mm, 약 3.2 mm, 약 3.3 mm, 약 3.4 mm, 약 3.5 mm, 약 3.6 mm, 약 3.7 mm, 약 3.8 mm, 약 3.9 mm, 약 4 mm, 약 4.1 mm, 약 4.2 mm, 약 4.3 mm, 약 4.4 mm, 약 4.5 mm, 약 4.6 mm, 약 4.7 mm, 약 4.8 mm, 약 4.9 mm, 또는 약 5 mm일 수 있다. 예시적인 전극 외경은 1.3 mm이며, 16 게이지 전극에 대응한다.
일부 실시예들에서, 본 발명의 장치가 중공 원통형 전극들을 포함하도록 구성되는 경우, 전극, 예를 들어 제1 또는 제2 전극의 루멘은 전기천공 구역의 전계에 영향을 받지 않는 구역, 예를 들어 진입 구역 또는 회수 구역을 포함할 수 있다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 진입 구역은 세포들 내로 전달될 조성물과 함께 전기천공될 현탁액 내의 세포들이 위치되는 전기천공 구역으로의 입구 바로 전의 제1 전극의 루멘일 수 있다. 회수 구역은, 조성물이 전달된 세포들이 세포 막 내의 기공들이 폐쇄될 수 있도록 이동되어, 전달된 조성물이 세포 내부에 남아 있는 것을 보장하는 전기천공 구역으로의 출구 바로 후의 제2 전극의 루멘일 수 있다. 이러한 구성에서, 세포들이 제1 전극의 루멘을 통과하고 제2 전극의 루멘을 향할 때, 제1 전극은 통전되고 제2 전극은 접지에 유지되어, 전기천공 구역에서 국부화된 전계를 생성하고, 이에 따라 장치를 통과하는 세포들을 전기천공한다.
전기천공 구역은 본 발명의 장치들의 제1 및 제2 전극들을 유체 연결하며, 전극들이 통전될 때, 이들 사이에 국부화된 전계를 경험한다. 전기천공 구역의 단면 형상은 세포들이 전기천공 구역 및 전기천공 구역 내의 전계를 통과할 수 있도록 하는 임의의 적합한 형상일 수 있다. 단면 형상은, 예를 들어, 원형, 타원형, 또는 다각형, 예를 들어, 정사각형, 직사각형, 삼각형, n-곤(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 변들을 갖는 규칙적 또는 불규칙적 다각형), 별, 평행사변형, 사다리꼴, 또는 불규칙적, 예를 들어, 타원형, 또는 곡선형 형상일 수 있다. 일부 경우에, 전기천공 구역은 그의 길이를 따라 실질적으로 균일한 단면 치수를 갖는 채널이며, 예를 들어, 전기천공 구역은 원형 단면을 가질 수 있으며, 여기서 직경은 진입 구역으로의 유체 연결부로부터 회수 구역의 유체 연결부까지 일정하다. 이러한 구성에서, 결과적인 전계는 더 균일하며, 따라서 유체 내에 현탁된 세포들의 더 예측가능한 전계 노출을 허용한다. 대안으로, 전기천공 구역의 단면 치수는 길이를 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 전기천공 구역의 단면 치수는 그의 길이를 따라 증가 또는 감소할 수 있거나, 또는 그의 길이를 따라 하나 이상의 치수 변화를 가질 수 있으며, 예를 들어 단면 치수, 예를 들어 직경은 최소 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%, 또는 최대 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%만큼 증가 또는 감소할 수 있다. 이 구성에서, 전기천공 구역은 상부 개구로부터 하부 개구로 증가하거나 상부 개구로부터 하부 개구로 감소하는 직경을 갖는, 절두형 원뿔형 단면을 가질 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 장치들은 직렬로 유체 연결된 복수의 전기천공 구역들을 포함할 수 있으며, 각 전기천공 구역은 균일한 또는 불균일한 단면을 가지며, 각각은 서로 다른 단면 형상을 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 장치는 복수의 직렬 연결된 전기천공 구역들을 포함할 수 있으며, 복수의 전기천공 구역들 각각은 상이한 단면 치수의 원통형 단면을 가지며, 예를 들어, 각각은 상이한 직경을 갖는다.
일부 실시예들에서, 전기천공 구역의 단면 치수는 약 0.005 mm 내지 약 50 mm, 예를 들어 약 0.005 mm 내지 약 0.05 mm, 약 0.01 mm 내지 약 0.1 mm, 약 0.05 mm 내지 약 0.5 mm, 약 0.1 mm 내지 약 1 mm, 약 0.5 mm 내지 약 1 mm, 약 0.5 mm 내지 약 2 mm, 약 0.7 mm 내지 약 1.5 mm, 약 1 mm 내지 약 5 mm, 약 3 mm 내지 약 7 mm, 약 5 mm 내지 약 10 mm, 약 7 mm 내지 약 12 mm, 약 10 mm 내지 약 15 mm, 약 13 mm 내지 약 18 mm, 약 15 mm 내지 약 20 mm, 약 22 mm 내지 약 30 mm, 약 25 mm 내지 약 35 mm, 약 30 mm 내지 약 40 mm, 약 35 mm 내지 약 45 mm, 또는 약 40 mm 내지 약 50 mm, 예를 들어 약 0.005 mm, 약 0.006, 약 0.007 mm, 약 0.008 mm, 약 0.009 mm, 약 0.01 mm, 약 0.02 mm, 약 0.03 mm, 약 0.04 mm, 약 0.05 mm, 약 0.06 mm, 약 0.07 mm, 약 0.08 mm, 약 0.09 mm, 약 0.1 mm, 약 0.2 mm, 약 0.3 mm, 약 0.4 mm, 약 0.5 mm, 약 0.6 mm, 약 0.7 mm, 약 0.8 mm, 약 0.9 mm, 약 1 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 9 mm, 약 10 mm, 약 11 mm, 약 12 mm, 약 13 mm, 약 14 mm, 약 15 mm, 약 16 mm, 약 17 mm, 약 18 mm, 약 19 mm, 약 20 mm, 약 21 mm, 약 22 mm, 약 23 mm, 약 24 mm, 약 25 mm, 약 26 mm, 약 27 mm, 약 28 mm, 약 29 mm, 약 30 mm, 약 31 mm, 약 32 mm, 약 33 mm, 약 34 mm, 약 35 mm, 약 36 mm, 약 37 mm, 약 38 mm, 약 39 mm, 약 40 mm, 약 41 mm, 약 42 mm, 약 43 mm, 약 44 mm, 약 45 mm, 약 46 mm, 약 47 mm, 약 48 mm, 약 49 mm, 또는 약 50 mm일 수 있다. 일반적으로, 전기천공 구역의 직경은 세포들과 접촉하여 세포막을 채널 벽으로 변형시키는 수축성을 갖지 않도록, 예를 들어 세포의 천공은 세포 압착으로 인한 기계적 변형에 의해 유도되지 않도록, 예를 들어 세포들이 전기천공 구역을 자유롭게 통과할 수 있도록 사이징된다.
일부 경우에, 전기천공 구역의 길이는 약 0.005 mm 내지 약 50 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm 내지 약 0.05 mm, 약 0.01 mm 내지 약 0.1 mm, 약 0.05 mm 내지 약 0.5 mm, 약 0.1 mm 내지 약 1 mm, 약 0.5 mm 내지 약 2 mm, 약 1 mm 내지 약 5 mm, 약 3 mm 내지 약 7 mm, 약 4 mm 내지 약 8 mm, 약 5 mm 내지 약 10 mm, 약 7 mm 내지 약 12 mm, 약 10 mm 내지 약 15 mm, 약 13 mm 내지 약 18 mm, 약 15 mm 내지 약 20 mm, 약 22 mm 내지 약 30 mm, 약 25 mm 내지 약 35 mm, 약 30 mm 내지 약 40 mm, 약 35 mm 내지 약 45 mm, 또는 약 40 mm 내지 약 50 mm, 예를 들어, 약 0.005 mm, 약 0.006, 약 0.007 mm, 약 0.008 mm, 약 0.009 mm, 약 0.01 mm, 약 0.02 mm, 약 0.03 mm, 약 0.04 mm, 약 0.05 mm, 약 0.06 mm, 약 0.07 mm, 약 0.08 mm, 약 0.09 mm, 약 0.1 mm, 약 0.2 mm, 약 0.3 mm, 약 0.4 mm, 약 0.5 mm, 약 0.6 mm, 약 0.7 mm, 약 0.8 mm, 약 0.9 mm, 약 1 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 9 mm, 약 10 mm, 약 11 mm, 약 12 mm, 약 13 mm, 약 14 mm, 약 15 mm, 약 16 mm, 약 17 mm, 약 18 mm, 약 19 mm, 약 20 mm, 약 21 mm, 약 22 mm, 약 23 mm, 약 24 mm, 약 25 mm, 약 26 mm, 약 27 mm, 약 28 mm, 약 29 mm, 약 30 mm, 약 31 mm, 약 32 mm, 약 33 mm, 약 34 mm, 약 35 mm, 약 36 mm, 약 37 mm, 약 38 mm, 약 39 mm, 약 40 mm, 약 41 mm, 약 42 mm, 약 43 mm, 약 44 mm, 약 45 mm, 약 46 mm, 약 47 mm, 약 48 mm, 약 49 mm, 또는 약 50 mm일 수 있다.
진입 구역 및/또는 회수 구역의 단면 치수는 독립적으로 전기천공 구역의 단면 치수와 실질적으로 동일할 수 있다. 대안으로, 진입 구역 및/또는 회수 구역은 전기천공 구역의 단면 치수보다 독립적으로 더 작거나 더 클 수 있다. 예를 들어, 진입 구역 및/또는 회수 구역의 단면 치수가 전기천공 구역의 단면 치수보다 작도록 독립적으로 구성되는 경우, 진입 구역 및/또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 약 0.01% 내지 약 100%, 약 0.01% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 75%, 또는 약 50% 내지 약 100%, 예를 들어, 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 약 0.06%, 약 0.07%, 약 0.08%, 약 0.09%, 약 0.1%, 약 0.15%, 약 0.2%, 약 0.25%, 약 0.3%, 약 0.35%, 약 0.4%, 약 0.45%, 약 0.5%, 약 0.55%, 약 0.6%, 약 0.65%, 약 0.7%, 약 0.75%, 약 0.8%, 약 0.85%, 약 0.9%, 약 0.95%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100%일 수 있다.
대안으로, 진입 구역 및/또는 회수 구역의 단면 치수가 전기천공 구역의 단면 치수보다 더 크도록 독립적으로 구성되는 경우, 진입 구역 및/또는 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 약 100% 내지 약 100,000%, 예를 들어, 약 100% 내지 약 1000%, 약 100% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 500%, 약 250% 내지 약 750%, 약 500% 내지 약 1,000%, 약 500% 내지 약 5,000%, 약 1,000% 내지 약 10,000%, 약 5,000% 내지 약 25,000%, 약 10,000% 내지 약 50,000%, 약 25,000% 내지 약 75,000%, 또는 약 50,000% 내지 100,000%, 예를 들어, 약 100%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 225%, 약 250%, 약 300%, 약 250%, 약 400%, 약 450%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900%, 약 1,000%, 약 2,000%, 약 3,000%, 약 4,000%, 약 5,000%, 약 6,000%, 약 7,000%, 약 8,000%, 약 9,000%, 약 10,000%, 약 15,000%, 약 20,000%, 약 25,000%, 약 30,000%, 약 35,000%, 약 40,000%, 약 45,000%, 약 50,000%, 약 55,000%, 약 60,000%, 약 65,000%, 약 70,000%, 약 75,000%, 약 80,000%, 약 85,000%, 약 90,000%, 약 95,000%, 또는 약 100,000%일 수 있다.
본 발명의 장치들은 또한 유체 시약, 예를 들어, 완충 용액, 또는 샘플, 예를 들어, 세포들의 현탁액 및 세포들에 도입될 조성물을 위한 하나 이상의 저장소들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 장치들은 유체 내에 현탁된 세포들이 제1 전극 내에서 전기천공 구역 내로 유동하기 위한 저장소 및/또는 전기천공된 세포들을 보유하기 위한 저장소를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 제1 또는 제2 전극들과 교차하는 추가 유입구들과 같은, 장치의 추가 컴포넌트들에서 액체가 유동하기 위한 저장소가 존재할 수 있다. 단일 저장소는 또한 예를 들어, 동일한 액체가 병렬로 또는 직렬로 세포들을 전기천공하도록 구성된 본 발명의 2개 이상의 개별 장치들에 도입될 때, 본 발명의 다수의 장치들에 연결될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 장치들은 바이알, 튜브 또는 파우치와 같은 외부 저장소들일 수 있는 액체의 소스들과 짝을 이루도록 구성될 수 있다. 마찬가지로, 장치는 저장소들을 수용하는 별도의 컴포넌트와 짝을 이루도록 구성될 수 있다. 저장소는 예를 들어 10 mL 내지 5000 mL, 예를 들어 10 mL 내지 3000 mL, 25 mL 내지 100 mL, 100 mL 내지 1000 mL, 40 mL 내지 300 mL, 1 mL 내지 100 mL, 10 mL 내지 500 mL, 250 mL 내지 750 mL, 250 mL 내지 1000 mL, 또는 1000 mL 내지 5000 mL를 보유하기 위한 임의의 적절한 크기일 수 있다. 다수의 저장소들이 존재하는 경우, 각 저장소는 동일하거나 상이한 크기를 가질 수 있다.
위에서 논의된 컴포넌트들 외에, 본 발명의 장치들은 추가 컴포넌트들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 장치들의 제1 및 제2 전극들은 장치의 적절한 영역 내로 비-샘플 유체, 예를 들어, 완충 용액의 도입을 허용하기 위한 하나 이상의 추가 유체 유입구들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 장치의 회수 구역은 전기천공 프로세스로부터 세포막 내에 개방된 기공들의 폐쇄를 돕기 위해 회수 완중액을 순환시키기 위한 추가 유입구 및 유출구를 포함할 수 있다.
시스템 및 키트
본 발명의 하나 이상의 전기천공 장치들은 다양한 외부 컴포넌트들, 예를 들어, 전원 공급 장치, 펌프, 저장소(예를 들어, 백(bag)), 컨트롤러, 시약, 액체, 및/또는 시스템의 형태의 샘플과 조합될 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 시스템은 본 발명의 복수의 장치들, 및 본 발명의 장치(들)의 제1 및 제2 전극들에 탈착 가능하게 연결되는 전위 소스를 포함한다. 이러한 구성에서, 본 발명의 장치(들)는 전위 소스에 연결되며, 제1 전극은 통전되고 제2 전극은 접지에 유지된다. 이는 전기천공 구역에서 국부화된 전계를 생성하고, 따라서 장치(들)를 통과하는 세포들을 전기천공한다. 본 발명의 장치들을 포함하는 전기천공 시스템들은 본 발명의 장치 및 시스템을 통과하는 세포들에 가역적 또는 비가역적 전기천공을 유도할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 장치들 및 시스템들은 유체 내에 현탁된 세포들 상에 실질적으로 비-열적 가역 전기천공, 실질적으로 비-열적 비가역 전기천공, 또는 실질적으로 열적 비가역 전기천공을 유도할 수 있다.
일부 경우에, 제1 및 제2 전극들에 대한 탈착 가능한 연결은 전위 소스와 제1 및 제2 전극들 사이에 일관된 전기적 콘택을 유지할 수 있는 임의의 실제 전기-기계적 연결을 포함할 수 있다. 예시적인 전기 접속부는, 이에 제한되는 것은 아니나, 클램프, 클립, 예를 들어 악어입 클립, 스프링, 예를 들어 판 스프링, 외부 덮개 또는 슬리브, 와이어 브러시, 가요성 전도체, 포고 핀, 기계적 연결부, 유도성 연결부, 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 유형의 전기 연결들이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 스프링-타입 전극은 도 2a 내지 2b에 도시된 것과 같은 전도성 플랫폼에 통합될 수 있다. 도 2a 내지 2b에 도시된 실시예에서, 본 발명의 장치는 본 발명의 장치들을 수용하기 위한 개별 개구들을 포함하는 베이스 상에 서로 전기적으로 절연된 2개의 전도성 그리드들을 포함하는 하우징 내로 삽입된다. 본 발명의 장치는 장치의 제1 및 제2 전극들이 전도성 그리드와 콘택할 수 있도록 전도성 그리드의 개구 내에 설치될 수 있다. 특히, 전도성 그리드는 스프링 로딩형 전극들, 예를 들어 스프링에 연결된 전극들을 포함하여, 본 발명의 장치가 전도성 그리드의 개구에 설치될 때, 스프링 로딩형 전극들은 스프링을 변위시키고 압축하여(본 발명의 장치의 제1 및 제2 전극들에 대한 복원력을 더 제공함), 본 발명의 장치와 전위 소스 사이의 전기적 접촉을 보장한다.
전위 소스는 전극들 사이에 전위차를 제공하여 전기천공 구역에서 균일한 전계를 설정하기 위해 하나 이상의 전극에 인가된 전압을 전달하도록 구성된다. 일부 경우에, 2-전극 전기천공 회로에서와 같이, 인가된 전압은 제1 전극에 전달되고 제2 전극은 접지에 유지된다. 임의의 특정 이론에 얽매이기를 바라지 않고, 전극에 전달되는 인가된 전압은 특정 진폭, 특정 주파수, 특정 펄스 형상, 특정 지속기간, 인가된 펄스의 특정 수, 및 특정 듀티 사이클에서 전달된다. 전기천공 구역의 기하학적 구조에 결합된 이러한 파라미터들은 유체 내에 현탁된 세포들에 의해 경험될 전기천공 구역 내의 특정 전계를 전달할 것이다. 본원에 설명된 전기적 파라미터들은 특정 세포주 및/또는 특정 세포주에 전달되는 조성물에 대해 최적화될 수 있다. 본 발명의 장치(들)의 전극들에 대한 전위의 인가는 전위 소스에 동작 가능하게 결합된 컨트롤러, 예를 들어 프로그래밍을 갖는 컴퓨터에 의해 개시 및/또는 제어될 수 있다.
본원에 설명된 전위 파라미터들과 함께, 본 발명의 장치들의 기하학적 구조, 예를 들어 전기천공 구역의 단면의 형상 및 치수는 전기천공 구역 내의 결과적인 전계의 형상 및 세기를 제어한다. 전형적으로, 균일한 단면을 갖는 전기천공 구역을 갖는 장치는 그 길이를 따라 균일한 전계를 나타낼 것이다. 전기천공 구역에서 결과적인 전계를 변조하기 위해, 전기천공 구역은 그 그 길이를 따라 복수의 상이한 단면 치수들 및/또는 상이한 단면 형상들을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 장치는 복수의 직렬로 연결된 전기천공 구역들을 포함할 수 있으며, 복수의 전기천공 구역 각각은 상이한 단면 치수의 원형 단면을 가지며, 예를 들어, 각각은 상이한 직경을 갖는다. 이러한 구성에서, 전기천공 구역의 상이한 직경의 원형 단면들은 각각 독립적인 전기천공 구역의 역할을 하고, 각각은 동일한 인가된 전압, 예를 들어 일정한 DC 전압을 갖는 치수의 모든 변화에서 상이한 전계를 유도할 것이다.
일부 경우에, 본 발명의 장치들은 직렬로 유체 연결된 복수의 전기천공 구역들을 포함할 수 있으며, 각 전기천공 구역은 균일한 또는 불균일한 단면을 가지며, 각각은 서로 다른 단면 형상을 가질 수 있다. 대안으로, 본 발명의 시스템은 병렬 구성으로 본 발명의 복수의 장치들을 포함할 수 있으며, 각 장치는 전기천공의 전체 처리량을 증가시키기 위해 서로 독립적으로 동작한다.
일부 경우에, 인가된 전압의 진폭은 약 -3 kV 내지 3 kV, 예를 들어, 약 -3 kV 내지 약 -0.1 kV, 약 -2 kV 내지 약 -0.1 kV, 약 -1 kV 내지 약 -0.1 kV, 약 -0.1 kV 내지 약 -0.01 kV, 0.01 kV 내지 약 3 kV, 예를 들어, 약 0.01 kV 내지 약 0.1 kV, 약 0.02 kV 내지 약 0.2 kV, 약 0.03 kV 내지 약 0.3 kV, 약 0.04 kV 내지 약 0.4 kV, 약 0.05 kV 내지 약 0.5 kV, 약 0.06 kV 내지 약 0.6 kV, 약 0.07 kV 약 0.7 kV, 약 0.08 kV 내지 약 0.8 kV, 약 0.09 kV 내지 약 0.9 kV, 약 0.1 kV 내지 약 1 kV, 약 0.1 kV 내지 약 2.0 kV, 약 0.1 kV 내지 약 3 kV, 약 0.15 kV 내지 약 1.5 kV, 약 0.2 kV 내지 약 2 kV, 약 0.25 kV 내지 약 2.5 kV, 또는 약 0.3 kV 내지 약 3 kV, 예를 들어, 약 0.01 내지 약 1 kV, 약 0.1 kV 내지 약 0.7 kV, 또는 약 0.2 내지 약 0.6 kV, 예를 들어, 약 0.01 kV, 약 0.02 kV, 약 0.03 kV, 약 0.04 kV, 약 0.05 kV, 약 0.06 kV, 약 0.07 kV, 약 0.08 kV, 약 0.09 kV, 약 0.1 kV, 약 0.2 kV, 약 0.3 kV, 약 0.4 kV, 약 0.5 kV, 약 0.6 kV, 약 0.7 kV, 약 0.8 kV, 약 0.9 kV, 약 1 kV, 약 1.1 kV, 약 1.2 kV, 약 1.3 kV, 약 1.4 kV, 약 1.5 kV, 약 1.6 kV, 약 1.7 kV, 약 1.8 kV, 약 1.9 kV, 약 2 kV, 약 2.1 kV, 약 2.2 kV, 약 2.3 kV, 약 2.4 kV, 약 2.5 kV, 약 2.6 kV, 약 2.7 kV, 약 2.8 kV, 약 2.9 kV, 또는 약 3 kV이다.
일부 경우에, 인가된 전압의 주파수는 약 1 Hz 내지 약 50,000 Hz, 예를 들어, 약 1 Hz 내지 약 1,000 Hz, 약 1 Hz 내지 약 500 Hz, 약 100 Hz 내지 약 500 Hz, 약 100 Hz 내지 약 5,000 Hz, 약 500 Hz 내지 약 10,000 Hz, 약 1000 Hz 내지 약 25,000 Hz, 또는 약 5,000 Hz 내지 약 50,000 Hz, 예를 들어, 약 10 Hz 내지 약 1000 Hz, 약 10 Hz 내지 약 500 Hz, 약 500 Hz 내지 약 750 Hz, 또는 약 100 Hz 내지 약 500 Hz, 예를 들어, 약 1 Hz, 약 2 Hz, 약 3 Hz, 약 4 Hz, 약 5 Hz, 약 6 Hz, 약 7 Hz, 약 8 Hz, 약 9 Hz, 약 10 Hz, 약 20 Hz, 약 30 Hz, 약 40 Hz, 약 50 Hz, 약 60 Hz, 약 70 Hz, 약 80 Hz, 약 90 Hz, 약 100 Hz, 약 110 Hz, 약 120 Hz, 약 130 Hz, 약 140 Hz, 약 150 Hz, 약 160 Hz, 약 170 Hz, 약 180 Hz, 약 190 Hz, 약 200 Hz, 약 210 Hz, 약 220 Hz, 약 230 Hz, 약 240 Hz, 약 250 Hz, 약 260 Hz, 약 270 Hz, 약 270 Hz, 약 280 Hz, 약 290 Hz, 약 300 Hz, 약 310 Hz, 약 320 Hz, 약 330 Hz, 약 340 Hz, 약 350 Hz, 약 360 Hz, 약 370 Hz, 약 380 Hz, 약 390 Hz, 약 400 Hz, 약 410 Hz, 약 420 Hz, 약 430 Hz, 약 440 Hz, 약 450 Hz, 약 460 Hz, 약 470 Hz, 약 480 Hz, 약 490 Hz, 약 500 Hz, 약 510 Hz, 약 520 Hz, 약 530 Hz, 약 540 Hz, 약 550 Hz, 약 600 Hz, 약 700 Hz, 약 800 Hz, 약 900 Hz, 약 1,000 Hz, 약 2,000 Hz, 약 3,000 Hz, 약 4,000 Hz, 약 5,000 Hz, 약 6,000 Hz, 약 7,000 Hz, 약 8,000 Hz, 약 9,000 Hz, 약 10,000 Hz, 약 15,000 Hz, 약 20,000 Hz, 약 25,000 Hz, 약 30,000 Hz, 약 35,000 Hz, 약 40,000 Hz, 약 45,000 Hz, 또는 약 50,000 Hz이다.
일부 실시예들에서, 인가된 펄스의 형상, 예를 들어 파형은 구형파, 펄스, 바이폴라 파, 사인파, 램프(ramp), 비대칭 바이폴라 파, 또는 임의적일 수 있다. 기타 전압 파형들이 당업계에 알려져 있다. 선택된 파형은, 이에 제한되는 것은 아니나, 고전압-저전압, 저전압-고전압, 직류(DC), 교류(AC), 유니폴라, 양(+) 극성만, 음(-) 극성만, (+)/(-) 극성, (-)/(+) 극성, 또는 이들의 임의의 중첩 또는 조합을 포함하는 임의의 실제 전압 패턴으로 인가될 수 있다. 당업자는 이들 펄스 파라미터들이 세포로 전달되는 조성물의 임의의 전기적 특성들에 따라 달라질 것이라는 것을 이해할 수 있다.
인가된 전압 펄스들은 약 0.01 ms 내지 약 1,000 ms, 예를 들어, 약 0.01 ms 내지 약 1 ms, 약 0.1 ms 내지 약 10 ms, 약 0.1 ms 내지 약 15 ms, 약 1 ms 내지 약 10 ms, 약 1 ms 내지 약 50 ms, 약 10 ms 내지 약 100 ms, 약 25 ms 내지 약 200 ms, 약 50 ms 내지 약 400 ms, 약 100 ms 내지 약 600 ms, 약 300 ms 내지 약 800 ms, 또는 약 500 ms 내지 약 1,000 ms, 예를 들어, 약 0.01 ms 내지 100 ms, 약 0.1 ms 내지 약 50 ms, 또는 약 1 ms 내지 약 10 ms, 예를 들어, 약 0.01 ms, 약 0.02 ms, 약 0.03 ms, 약 0.04 ms, 약 0.05 ms, 약 0.06 ms, 약 0.07 ms, 약 0.08 ms, 약 0.09 ms, 약 0.1 ms, 약 0.2 ms, 약 0.3 ms, 약 0.4 ms, 약 0.5 ms, 약 0.6 ms, 약 0.7 ms, 약 0.8 ms, 약 0.9 ms, 약 1 ms, 약 2 ms, 약 3 ms, 약 4 ms, 약 5 ms, 약 6 ms, 약 7 ms, 약 8 ms, 약 9 ms, 약 10 ms, 약 11 ms, 약 12 ms, 약 13 ms, 약 14 ms, 약 15 ms, 약 20 ms, 약 30 ms, 약 40 ms, 약 50 ms, 약 60 ms, 약 70 ms, 약 80 ms, 약 90 ms, 약 100 ms, 약 150 ms, 약 200 ms, 약 250 ms, 약 300 ms, 약 350 ms, 약 400 ms, 약 450 ms, 약 500 ms, 약 550 ms, 약 600 ms, 약 650 ms, 약 700 ms, 약 750 ms, 약 800 ms, 약 850 ms, 약 900 ms, 약 950 ms, 또는 약 1,000 ms의 지속시간을 갖는 전기천공 구역으로 전달될 수 있다.
일부 경우에, 전달되는 인가된 전압 펄스의 수는 0 내지 약 1000, 또는 그 이상, 예를 들어, 1 또는 그 이상, 2 또는 그 이상, 3 또는 그 이상, 4 또는 그 이상, 5 또는 그 이상, 6 또는 그 이상, 7 또는 그 이상, 8 또는 그 이상, 9 또는 그 이상, 10 또는 그 이상, 또는 100 또는 그 이상, 예를 들어, 1 내지 4, 2 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 7, 5 내지 8, 6 내지 9, 7 내지 10, 8 내지 11, 7 내지 12, 또는 9 내지 13, 예를 들어, 약 0.01 내지 약 1,000, 예를 들어, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 50, 약 5 내지 약 10, 약 5 내지 15, 약 10 내지 약 100, 약 25 내지 약 200, 약 50 내지 약 400, 약 100 내지 약 600, 약 300 내지 약 800, 또는 약 500 내지 1,000, 예를 들어, 약 1 내지 100, 약 1 to 약 50, 또는 약 1 내지 약 10, 예를 들어, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 750, 약 800, 약 850, 약 900, 약 950, 또는 약 1,000일 수 있다.
일부 예들에서, 전달되는 인가된 전압 펄스들의 수는 1 내지 약 1,000,000일 수 있다. 예를 들어, 일부 예들에서, 전달되는 인가된 전압 펄스의 수는 1,000 내지 1,000,000, 예를 들어, 1,000 내지 10,000(예를 들어, 1,000 내지 2,000, 2,000 내지 3,000, 3,000 내지 4,000, 4,000 내지 5,000, 5,000 내지 6,000, 6,000 내지 7,000, 7,000 내지 8,000, 8,000 내지 9,000, 또는 9,000 내지 10,000, 예를 들어, 약 1,000, 약 2,000, 약 3,000, 약 4,000, 약 5,000, 약 6,000, 약 7,000, 약 8,000, 약 9,000, 또는 약 10,000), 10,000 내지 100,000(예를 들어, 10,000 내지 20,000, 20,000 내지 30,000, 30,000 내지 40,000, 40,000 내지 50,000, 50,000 내지 60,000, 60,000 내지 70,000, 70,000 내지 80,000, 80,000 내지 90,000, 또는 90,000 내지 10,000, 예를 들어, 약 10,000, 약 25,000, 약 30,000, 약 40,000, 약 50,000, 약 60,000, 약 70,000, 약 75,000, 약 80,000, 약 90,000, 또는 약 100,000), 또는 100,000 내지 1,000,000(예를 들어, 100,000 내지 200,000, 200,000 내지 300,000, 300,000 내지 400,000, 400,000 내지 500,000, 500,000 내지 600,000, 600,000 내지 700,000, 700,000 내지 800,000, 800,000 내지 900,000, 또는 900,000 내지 1,000,000, 예를 들어, 약 100,000, 약 200,000, 약 250,000, 약 300,000, 약 400,000, 약 500,000, 약 600,000, 약 700,000, 약 750,000, 약 800,000, 약 900,000, 또는 약 1,000,000)이다.
인가된 전압의 펄스들은, 일부 예들에서, 약 0.001% 내지 약 100%, 예를 들어, 약 0.001% 내지 약 0.1%, 약 0.01% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 10%, 약 2.5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 80%, 또는 약 50% 내지 약 100%, 예를 들어, 약 0.01% 내지 100%, 약 0.1% 내지 약 99%, 약 1% 내지 약 97%, 또는 약 10% 내지 약 95%, 예를 들어, 약 0.001%, 약 0.002%, 약 0.003%, 약 0.004%, 약 0.005%, 약 0.006%, 약 0.007%, 약 0.008%, 약 0.009%, 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 약 0.06%, 약 0.07%, 약 0.08%, 약 0.09%, 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100%의 듀티 사이클로 전달될 수 있다.
본 발명의 장치(들)는, 전극들이 전위 소스에 연결되고 통전될 때, 통과하는 세포들을 전기천공하는 전기천공 구역에서 국부화된 전계를 생성한다. 일부 경우에, 전기천공 구역에서 생성된 전계는 약 2 V/cm 내지 약 50,000 V/cm, 예를 들어, 약 2 V/cm 내지 약 1,000 V/cm, 약 100 V/cm 내지 약 1,000 V/cm, 약 100 V/cm 내지 약 5,000 V/cm, 약 500 V/cm 내지 약 10,000 V/cm, 약 1000 V/cm 내지 약 25,000 V/cm, 또는 약 5,000 V/cm 내지 약 50,000 V/cm, 예를 들어, 약 2 V/cm 내지 약 20,000 V/cm, 약 5 V/cm 내지 약 10,000 V/cm, 또는 약 100 V/cm 내지 약 1,000 V/cm, 예를 들어, 약 2 V/cm, 약 3 V/cm, 약 4 V/cm,약 5 V/cm, 약 6 V/cm, 약 7 V/cm, 약 8 V/cm, 약 9 V/cm, 약 10 V/cm, 약 20 V/cm, 약 30 V/cm, 약 40 V/cm, 약 50 V/cm, 약 60 V/cm, 약 70 V/cm, 약 80 V/cm, 약 90 V/cm, 약 100 V/cm, 약 200 V/cm, 약 300 V/cm, 약 400 V/cm, 약 500 V/cm, 약 600 V/cm, 약 700 V/cm, 약 800 V/cm, 약 900 V/cm, 약 1,000 V/cm, 약 2,000 V/cm, 약 3,000 V/cm, 약 4,000 V/cm, 약 5,000 V/cm, 약 6,000 V/cm, 약 7,000 V/cm, 약 8,000 V/cm, 약 9,000 V/cm, 약 10,000 V/cm, 약 15,000 V/cm, 약 20,000 V/cm, 약 25,000 V/cm, 약 30,000 V/cm, 약 35,000 V/cm, 약 40,000 V/cm, 약 45,000 V/cm, 또는 약 50,000 V/cm의 진폭을 갖는다.
본 발명의 시스템들은 전형적으로 제1 전극, 예를 들어 진입 구역을 통해 제2 전극, 예를 들어 회수 구역으로 유체 내에 현탁된 복수의 세포들을 전달하도록 구성된 유체 전달 소스를 포함한다. 유체 전달 소스들은 전형적으로, 이에 제한되는 것은 아니나, 주사기 펌프, 마이크로펌프, 또는 연동 펌프를 포함하는 펌프들을 포함한다. 대안으로, 유체들은 전달될 유체의 저장소에 대한 작동 유체의 변위에 의해 또는 공기 변위에 의해 전달될 수 있다. 기타 유체 전달 소스들이 당업계에 알려져 있다. 일부 경우에, 유체 전달 소스는 양압의 인가에 의해 유체 내에 현탁된 세포들을 유동시키도록 구성된다. 임의의 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 현탁액 내의 세포들이 본 발명의 장치들을 통해 흐르는 유량 및 본 발명의 장치들의 전기천공 구역의 특정 기하학적 구조는 전기천공 구역 내의 전계 내의 세포들의 체류 시간을 결정할 것이다.
일부 예들에서, 유체 전달 소스로부터 전달되는 유체의 체적 유량은 약 0.001 mL/분 내지 약 1,000 mL/분, 예를 들어, 약 0.001 mL/분 내지 약 0.1 mL/분, 약 0.01 mL/분 내지 약 1 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 10 mL/분, 약 1 mL/분 내지 약 50 mL/분, 약 10 mL/분 내지 약 100 mL/분, 약 25 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 50 mL/분 내지 약 400 mL/분, 약 100 mL/분 내지 약 600 mL/분, 약 300 mL/분 내지 약 800 mL/분, 또는 약 500 mL/분 내지 약 1,000 mL/분, 예를 들어, 약 0.001 mL/분, 약 0.002 mL/분, 약 0.003 mL/분, 약 0.004 mL/분, 약 0.005 mL/분, 약 0.006 mL/분, 약 0.007 mL/분, 약 0.008 mL/분, 약 0.009 mL/분, 약 0.01 mL/분, 약 0.02 mL/분, 약 0.03 mL/분, 약 0.04 mL/분, 약 0.05 mL/분, 약 0.06 mL/분, 약 0.07 mL/분, 약 0.08 mL/분, 약 0.09 mL/분, 약 0.1 mL/분, 약 0.2 mL/분, 약 0.3 mL/분, 약 0.4 mL/분, 약 0.5 mL/분, 약 0.6 mL/분, 약 0.7 mL/분, 약 0.8 mL/분, 약 0.9 mL/분, 약 1 mL/분, 약 2 mL/분, 약 3 mL/분, 약 4 mL/분, 약 5 mL/분, 약 6 mL/분, 약 7 mL/분, 약 8 mL/분, 약 9 mL/분, 약 10 mL/분, 약 15 mL/분, 약 20 mL/분, 약 25 mL/분, 약 30 mL/분, 약 35 mL/분, 약 40 mL/분, 약 45 mL/분, 약 50 mL/분, 약 55 mL/분, 약 60 mL/분, 약 65 mL/분, 약 70 mL/분, 약 75 mL/분, 약 80 mL/분, 약 85 mL/분, 약 90 mL/분, 약 95 mL/분, 약 100 mL/분, 약 150 mL/분, 약 200 mL/분, 약 250 mL/분, 약 300 mL/분, 약 350 mL/분, 약 400 mL/분, 약 450 mL/분, 약 500 mL/분, 약 550 mL/분, 약 600 mL/분, 약 650 mL/분, 약 700 mL/분, 약 750 mL/분, 약 800 mL/분, 약 850 mL/분, 약 900 mL/분, 약 950 mL/분, 또는 약 1,000 mL/분의 체적 유량을 갖는다. 특정 실시예들에서, 유량은 10 mL/분 내지 약 100 mL/분, 예를 들어, 약 10 mL/분, 20 mL/분, 30 mL/분, 40 mL/분, 50 mL/분, 60 mL/분, 70 mL/분, 80 mL/분, 90 mL/분, 또는 100 mL/분이다.
일부 예들에서, 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 전기천공 구역으로 전달되는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들의 레이놀즈(Reynolds) 수는 0.04 내지 2.43 × 104이고, 여기서 유체 전달 소스는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 전달하도록 구성된다. 일부 예들에서, 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 전기천공 구역으로 전달되는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들의 최대 속도는 5 × 10-5 m/s 내지 32.7 m/s이고, 여기서 유체 전달 소스는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 전달하도록 구성된다. 일부 예들에서, 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 전기천공 구역으로 전달되는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들의 전단율은 0.1 1/s 내지 2 × 106 1/s이고, 여기서 유체 전달 소스는 현탁액 내 액체 및/또는 복수의 세포들을 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 전달하도록 구성된다. 일부 예들에서, 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 전기천공 구역으로 전달되는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들의 피크 압력은 1 × 10-3 Pa 내지 9.5 × 104 Pa이고, 여기서 유체 전달 소스는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 전달하도록 구성된다. 일부 예들에서, 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 전기천공 구역으로 전달되는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들의 평균 속도는 1.5 × 10-5 m/s 내지 15.9 m/s이고, 여기서 유체 전달 소스는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 전달하도록 구성된다. 일부 예들에서, 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 전기천공 구역으로 전달되는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들의 동점도는 1 × 10-6 m2/s 내지 15 × 10-4 m2/s이고, 여기서 유체 전달 소스는 현탁액 내의 액체 및/또는 복수의 세포들을 제1 루멘을 통해 제2 유출구로 전달하도록 구성된다.
본 발명의 장치들의 전기천공 구역에서의 세포들의 체류 시간은 0.5 ms 내지 50 ms, 예를 들어, 약 0.5 ms 내지 약 5 ms, 약 1 ms 내지 약 10 ms, 약 5 ms 내지 약 15 ms, 약 10 ms 내지 약 20 ms, 약 15 ms 내지 약 25 ms, 약 20 ms 내지 약 30 ms, 약 25 ms 내지 약 35 ms, 약 30 ms 내지 약 40 ms, 약 35 ms 내지 약 45 ms, 또는 약 40 ms 내지 약 50 ms, 예를 들어, 약 0.5 ms, 약 0.6 ms, 약 0.7 ms, 약 0.8 ms, 약 0.9 ms, 약 1 ms, 약 1.5 ms, 약 2 ms, 약 2.5 ms, 약 3 ms, 약 3.5 ms, 약 4 ms, 약 4.5 ms, 약 5 ms, 약 5.5 ms, 약 6 ms, 약 6.5 ms, 약 7 ms, 약 7.5 ms, 약 8 ms, 약 8.5 ms, 약 9 ms, 약 9.5 ms, 약 10 ms, 약 10.5 ms, 약 11 ms, 약 11.5 ms, 약 12 ms, 약 12.5 ms, 약 13 ms, 약 13.5 ms, 약 14 ms, 약 14.5 ms, 약 15 ms, 약 20 ms, about 25 ms, 약 30 ms, 약 35 ms, 약 40 ms, 약 45 ms, 또는 약 50 ms일 수 있다. 일부 실시예들에서, 체류 시간은 5 내지 20 ms(예를 들어, 6 내지 18 ms, 8 내지 15 ms, 또는 5 내지 14 ms)이다.
본 발명의 시스템들은 전형적으로 본 발명의 장치(들) 및 임의의 필요한 전기 연결부, 예를 들어 전극 연결부를 포함하고 지지하는 하우징을 특징으로 한다. 하우징은 본 발명의 단일 장치를 고정하고 통전하도록 구성될 수 있거나, 대안으로, 본 발명의 복수의 장치들을 고정하고 동시에 통전하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 도 2a 내지 2b에 도시된 본 발명의 시스템의 실시예에서, 하우징은 병렬로 동작하는 본 발명의 96개의 개별 장치들을 수용하고 동시에 통전할 수 있는 랙(rack)으로서 구성된다. 하우징은 전기천공 동안, 본 발명의 장치들의 온도를 조절하거나 시스템의 컴포넌트, 예를 들어 유체, 예를 들어 세포들을 함유하는 완중액 또는 현탁액을 열적으로 조절할 수 있는 열 컨트롤러를 포함할 수 있다. 열 컨트롤러는 본 발명의 장치들 또는 그 시스템의 컴포넌트를 가열하거나, 본 발명의 장치들 또는 그 시스템의 컴포넌트를 냉각하거나, 또는 둘 모두의 동작들을 수행하도록 구성될 수 있다. 본 발명의 장치들 또는 그 시스템의 컴포넌트를 가열하도록 구성될 때, 적합한 열 컨트롤러는, 이에 제한되는 것은 아니나, 가열 블록 또는 맨틀, 액체 가열, 예를 들어 침지 또는 순환 유체 조, 배터리 작동 히터, 또는 저항성 히터, 예를 들어 박막 히터, 예를 들어 가열 테이프를 포함한다. 본 발명의 장치들 또는 그 시스템의 컴포넌트를 냉각하도록 구성될 때, 적합한 열 컨트롤러는, 이에 제한되는 것은 아니나, 액체 냉각, 예를 들어 침지 또는 순환 유체 조, 증발 냉각기, 또는 열전 냉각기, 예를 들어 펠티에 냉각기를 포함한다. 예를 들어, 액체 냉각으로 구현될 때, 본 발명의 장치 또는 본 발명의 장치들을 고정하도록 구성된 하우징은 냉각된 유체를 순환시키는 튜빙과 직접 접촉하거나 냉각된 유체를 순환시키는 튜빙을 포함하는 냉각 재킷 내에 둘러싸일 수 있다. 기타 가열 및 냉각 요소들이 당업계에 알려져 있다.
일부 실시예들에서, 하우징(예를 들어, 카트리지)은 임상 또는 병원 환경에서 환자들에게 세포 치료법을 전달하는 데 사용되는 자동화된 폐쇄 시스템과 함께 사용되도록 및/또는 그에 삽입되도록 구성된다.
일부 실시예들에서, 하우징(예를 들어, 카트리지)은 시료의 전기천공 동안, 그 전, 및 그 후 세포 현탁액 및/또는 완중액 저장을 위한 냉각/가열 영역/인클로저를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 시스템(예를 들어, 장치 및 하우징)은 외부적으로 전력이 공급된다.
일부 실시예들에서, 본 발명의 장치들은 유량, 파형들, 인가된 전위, 트랜스펙션될 체적, 시간 지연, 냉각 특징들, 가열 특징들, 전기천공 또는 트랜스펙션 상태, 진행 및 전기천공 또는 트랜스펙션 프로토콜을 최적화하는데 사용되는 기타 파라미터들을 사용자가 선택하도록 하는 사용자 인터페이스 또는 기타 대안적인 사용자 인터페이스(들)를 포함한다. 일부 실시예들에서, 사용자 인터페이스는 또한 사용자가 이전에 사용자에 의해 검증되거나 제조자들에 의해 추천된 특정 파라미터들 및 조건들에서 시스템을 동작시킬 수 있도록 하는 사전-공식화된 파라미터 선택들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 사용자 인터페이스는 시스템의 자동화된 실행 및/또는 알려진 세포 유형의 주어진 샘플에 대한 트랜스펙션을 최적화하기 위한 알고리의 실행을 허용하는 프로그래밍에 연결될 수 있다. 일부 실시예들에서, 최적화 알고리즘들은 사용자가 이 기능을 선택하는 경우 독립적으로 또는 자율적으로 전기-기계적 파라미터들을 조정하는 능력을 갖는다. 일부 실시예들에서, 최적화 알고리즘은 세포 유형, 세포 현탁액의 전도도, 세포 현탁액의 체적, 점도, 전기천공 카트리지(들)의 수명, 현탁액의 물리적 상태, 또는 트랜스펙션 장치(들)의 상태에 따라 달라질 수 있는 전기천공 또는 전기-기계적 프로세스 프로세스에 사용되는 파라미터들의 연속적인 조정을 허용한다.
일부 실시예들에서, 최적화 알고리즘은 공지된 입력 세포-유형 파라미터들에 기초하여 예측 분석을 수행하고 그에 따라 전기-기계적 파라미터들을 조정하는 능력을 갖는다. 일부 실시예들에서, 최적화 알고리즘은 본 발명의 장치들 중 어느 하나 내의 전기 신호들에 기초하여 전기-기계적 파라미터들을 조정한다. 일부 실시예들에서, 최적화 알고리즘은 본 발명의 장치들 중 어느 하나 내의 검출된 유동 파라미터들에 기초하여 전기-기계적 파라미터들을 조정한다. 일부 실시예들에서, 최적화 알고리즘들은 고유 무차원 입력 파라미터들에 기초하여 전기천공 파라미터들을 조정한다. 일부 실시예들에서, 최적화 알고리즘들은 높은 생존 가능성 결과들, 높은 효율성 결과들, 또는 매칭된 생존 가능성 및 효율성 결과들이 예측되는 파라미터들의 고유한 다변량 조합들에 기초하여 전기천공 파라미터들을 조정하는 능력을 갖는다.
본 발명의 시스템들은 예를 들어, 라이브 전기 연결부들에 대한 최종 사용자 노출을 감소시키기 위해, 본 발명의 하나 이상의 장치들의 전극들을 커버하도록 구성되는 하나 이상의 외부 구조체들을 포함할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장치(예를 들어, FLOWFECTTM 장치)는 그의 전극들 및 전기천공 구역을 덮는 하나의 외부 구조체를 포함할 것이다. 외부 구조체는 비전도성 물질, 예를 들어, 비전도성 중합체일 수 있으며, 이는 장치의 부분들, 예를 들어, 전극들 또는 전기천공 구역을 전기-기계적으로 결합하기 위한 구조적 특징들을 포함한다. 외부 구조체는 장치를 수용하기 위해 구조체 내에 하나 이상의 리세스, 컷아웃, 또는 유사한 개구들을 포함할 수 있다. 외부 구조체는 장치로부터 제거될 수 있는 컴포넌트가 되도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 외부 구조체는 힌지, 예를 들어 리빙 힌지(living hinge)에 의해 연결된 2개의 별개의 컴포넌트들을 포함할 수 있어서, 본 발명의 장치 위로 절첩될 수 있다. 대안으로, 외부 구조체는 단일 구조체를 형성하기 위해 적합한 정합 특징부들을 사용하여 함께 연결될 수 있는 하나 이상의 개별 피스들일 수 있다. 이들 실시예들에서, 외부 구조체는 외부 구조체에 통합되거나 외부 구조체에 외부적으로 연결될 수 있는 임의의 적합한 파스너, 예를 들어 스냅, 래치, 버튼 또는 클립을 사용하여 본 발명의 장치에 부착될 수 있다. 기타 적절한 파스너 타입이 당업계에 알려져 있다. 일부 실시예들에서, 외부 구조체는 외부 구조체의 하나 이상의 디스들의 정확한 정렬을 보장하는 하나 이상의 정렬 특징부들, 예를 들어 핀, 디봇, 홈 또는 탭을 포함한다. 일부 경우에, 외부 구조체는 본 발명의 장치들에 영구적으로 연결되도록 구성된다.
일부 실시예들에서, 하우징(예를 들어, 카트리지, 예를 들어, 외부 구조체)은 연속 유동 전기천공법에 사용되는 하나 이상의 앞서 설명된 발명들 또는 하나 이상의 전기천공 장치들을 캡슐화한다. 일부 실시예들에서, 하우징(예를 들어, 카트리지)은 환자들에게 세포 치료법을 전달하는 자동화된 폐쇄 시스템과 함께 사용되도록 및/또는 그에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 하우징은 시료의 전기천공 동안, 그 전, 및 그 후 세포 현탁액 및/또는 완중액 저장을 위한 냉각/가열 영역/인클로저를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 시스템(예를 들어, 하나 이상의 장치들 및 하우징)은 외부적으로 전력이 공급된다.
일부 실시예들에서, 시스템은 또한 사용자가 이 기능을 선택하는 경우 독립적으로 또는 자율적으로 전기-기계적 파라미터들을 조정하는 능력을 갖는 최적화 알고리즘들을 포함한다. 이러한 최적화 알고리즘은 세포 유형, 전도도, 현탁액의 체적, 점도, 전기천공 카트리지의 수명, 현탁액의 물리적 상태 또는 전기천공 장치의 상태에 따라 달라질 수 있는 전기천공 프로세스에 사용되는 파라미터들의 연속적인 조정을 허용한다.
본원에 설명된 외부 구조체의 실시예들 중 어느 하나에서, 외부 구조체는 전위의 외부 소스와 본 발명의 장치들의 전극들 사이의 전기적 연결을 제공한다. 예를 들어, 외부 구조체는 외부 구조체 내부의 본 발명의 장치들의 전극들과 전위 소스 사이의 전기적 연결을 용이하게 하는 전기적 연결부들, 예를 들어 스페이드, 바나나 플러그, 또는 베이오넷, 예를 들어 BNC 커넥터를 위한 하나 이상의 전기적 입력들을 포함할 수 있다.
본 발명의 장치들 및 외부 구조체들은 키트(kit) 내에서 시약, 예를 들어, 완중액, 예를 들어, 트랜스펙션 또는 회수 완중액, 및/또는 샘플과 같은 추가의 외부 컴포넌트들과 조합될 수 있다. 일부 경우에, 트랜스펙션 완중액은 세포 전기천공에 적합한 조성물을 포함한다. 일부 예들에서, 트랜스펙션 완중액은 0.1 내지 200 mM(예를 들어, 0.1 내지 1.0 mM, 1.0 mM 내지 10 mM, 또는 10 mM 내지 100 mM)의 농도에서, 하나 이상의 염(예를 들어, 염화칼륨, 염화나트륨, 인산칼륨, 인산이수소칼륨) 또는 당(예를 들어, 덱스트로스 또는 마이오-이노시톨), 또는 이들의 임의의 조합의 적합한 농도를 포함한다.
완중액 및 배지
본 발명의 장치들 및 시스템들은 트랜스펙션 완중액 또는 트랜스펙션을 지지하는 첨가제를 함유하는 세포 배양 성장 배지가 사용될 수 있다. 사용된 트랜스펠션 완중액 및/또는 세포 배양 서장 배지의 전도도를 제어하기 위해 KCl, MgCl2, NaCl, 글루코스, Na2HPO4, NaH2PO4, Ca(NO3)2, 만니톨, 숙시네이트, 덱스트로스, 하이드록시에틸 피페라진에탄설폰산(HEPES), 트레할로스, CaCl2, 디메틸 설폭사이드(DMSO), K2HPO4, KH2PO4, 에틸렌-비스(옥시에틸렌니트릴로)테트라아세트산(EGTA), KOH, NaOH, K2SO4, Na2SO4, 히스티딘 완충액, 시트레이트 완충액, 인산완충식염수(PBS), ATP-디소듐염 및 NaHCO3을 포함하는 특정 첨가제들이 첨가될 수 있다. 사용된 트랜스펙션 완충액 및/또는 세포 배양 성장 배지의 점도를 제어하기 위해 피콜, 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸셀룰로스(MethoCel), 콜라겐 I 및 매트리겔을 포함하는 특정 첨가제들이 첨가될 수 있다.
방법
본 발명은 본원에 설명된 전기천공 장치들을 사용하여, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들의 적어도 일부 내로 조성물, 예를 들어 트랜스펙션을 도입하는 방법을 특징으로 한다. 본원에 설명된 방법들은 종종 유전자-변형된 세포 요법의 유전 공학 및 치료학 분야의 연구 분야에서 병목인 것으로 간주되는, 세포 유형으로의 조성물의 전달의 처리량을 크게 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 특히, 본원에 설명된 방법들은 트랜스펙션의 전형적인 방법, 예를 들어 렌티바이러스 트랜스펙션, 또는 상업적으로 입수가능한 세포 트랜스펙션 기기, 예를 들어 NEON® 트랜스펙션 시스템(Thermo Fisher, Carlsbad, CA) 또는 4D-NUCLEOFECTOR(Lonza, Switzerland)보다 더 많은 세포 유형에 대한 적용으로 트랜스펙션 후 회수된 세포의 수, 트랜스펙션 효율 및 세포 생존 가능성이 상당히 증가하였다.
본원에 설명된 바와 같이, 본 발명의 장치, 예를 들어 전기천공 장치를 통해, 세포들 내로 도입될 조성물을 또한 함유하는, 현탁된 세포들과 함께 유체를 통과시킴으로써, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들의 적어도 일부 내로 조성물이 도입된다. 유체에 현탁된 조성물 및 세포들은 양압의 인가에 의해, 예를 들어, 유체 소스에 연결된 펌프로부터, 예를 들어, 연동 펌프, 디지털 피펫, 또는 자동화된 액체 취급 소스로부터 본 발명의 장치를 통해 전달될 수 있다. 조성물 및 유체 내에 현탁된 세포들은 예를 들어 진입 구역을 포함하는 제1 전극으로부터 제1 전극에 유체 연결된 전기천공 구역으로, 그런 다음 전기천공 구역에 유체 연결되는 회수 구역으로 통과한다. 유체 내에 현탁된 조성물 및 세포들이 제1 전극을 통해 전기천공 구역으로 유동함에 따라, 전위차가 제1 및 제2 전극들에 인가되어, 전기천공 구역 내의 전계를 생성하여 세포들을 노출시킨다. 생성된 전계에 세포들을 노출시키는 것은 복수의 세포들의 일시적 투과성을 향상시키고, 따라서 조성물을 복수의 세포들의 적어도 일부에 도입한다.
방법들의 일부 예들에서, 세포들의 표현형은 본 발명의 장치들의 전기천공 구역을 빠져나갈 때 세포 표현형의 기준선 측정에 비해 변경될 수 있거나 변경되지 않을 수 있다. 일부 경우에, 세포의 표현형은 본 발명의 장치들의 전기천공 구역을 빠져나갈 때 세포 표현형의 기준선 측정에 비해 0% 내지 약 25%, 예를 들어, 약 0% 내지 약 2.5%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 25%, 또는 약 20% 내지 약 25%, 예를 들어, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 또는 약 25% 변경된다. 특정 예들에서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 표현형 변화를 갖지 않는다. 예를 들어, 세포 표현형을 확립하기 위한 기준선 또는 대조군 측정은 본 발명의 장치들을 사용하여 트랜스펙션되지 않은 세포들 상의 세포 표면 마커의 발현의 측정일 수 있다. 본 발명의 장치들을 사용하여 트랜스펙션된 세포들 상의 동일한 세포 마커의 발현의 상응하는 동일한 측정은 세포 표현형의 변화를 평가하는 데 사용될 수 있다. 세포 표현형은 세포 표면 마커 발현의 유세포측정 분석을 통해 평가되어, 세포 표현형이 전기천공 후에 최소로 변화되거나 변화되지 않는 것을 보장한다. 평가할 세포 표면 마커의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, CD3, CD4, CD8, CD19, CD45RA, CD45RO, CD28, CD44, CD69, CD80, CD86, CD206, IL-2 수용체, CTLA4, OX40, PD-1, 및 TIM3을 포함한다. 세포 모폴로지는 전기천공 후 표현형 변화의 결여를 확인하기 위해 명시야 또는 형광 현미경을 사용하여 평가된다.
일부 예들에서, 조성물을 복수의 세포들의 적어도 일부에 도입한 후, 복수의 세포들은 회수 완충액에 저장된다. 회수 완충액은 복수의 세포들에 형성된 기공들의 최종 폐쇄를 촉진하도록 구성된다. 회수 완충액은 전형적으로 세포 영양분 및 성장을 위한 다른 성분들, 예를 들어 혈청, 미네랄 등을 포함할 수 있는 세포 배양 배지를 포함한다. 숙련된 기술자는 회수 완충액의 선택이 전기천공을 겪는 세포 유형에 따라 달라질 것임을 이해할 수 있다.
본원에 설명된 방법의 일부 실시예들에서, 현탁된 세포들을 갖는 유체의 체적(예를 들어, 변위 체적) 및 본 발명의 장치들의 전기천공 구역을 통해 유동되는 세포들에 도입될 조성물의 체적은 약 0.001 mL 내지 약 2000 mL, 약 0.001 mL 내지 약 1000 mL, 예를 들어, 0.001 mL 내지 약 1000 mL, 예를 들어, 약 0.001 mL 내지 약 0.1 mL, 약 0.01 mL 내지 약 1 mL, 약 0.01 mL 내지 약 750 mL, 약 0.01 mL 내지 약 1500 mL, 약 0.1 mL 내지 약 5 mL, 약 0.1 mL 내지 500 mL, 약 0.1 mL 내지 약 2000 mL, 약 1 mL 내지 약 10 mL, 약 1 mL 내지 약 1000 mL, 약 2 mL 내지 약 2000 mL, 약 2.5 mL 내지 약 20 mL, 약 5 mL 내지 약 40 mL, 약 10 mL 내지 약 60 mL, 약 10 mL 내지 약 1000 mL, 약 20 mL 내지 약 2000 mL, 약 30 mL 내지 약 80 mL, 약 50 mL 내지 약 200 mL, 약 100 mL 내지 약 500 mL, 또는 250 mL 내지 약 750 mL, 약 500 mL 내지 약 1000 mL, 약 500 mL 내지 2000 mL, 약 750 mL 내지 1500 mL, 또는 약 1000 mL 내지 2000 mL, 예를 들어, 약 0.01 mL 내지 100 mL, 약 0.1 mL 내지 약 99 mL, 약 1 mL 내지 약 97 mL, 또는 약 10 mL 내지 약 95 mL, 예를 들어, 약 0.0025 mL 내지 약 10 mL, 약 0.01 mL 내지 약 1 mL, 또는 약 0.025 mL 내지 약 0.1 mL, 예를 들어, 약 0.001 mL, 약 0.0025 mL, 약 0.005 mL, 약 0.0075 mL, 약 0.01 mL, 약 0.025 mL, 약 0.05 m, 약 0.75 mL, 약 0.1 mL, 약 0.25 mL, 약 0.5 mL, 약 0.75 mL, 약 1 mL, 약 2 mL, 약 3 mL, 약 4 mL, 약 5 mL, 약 6 mL, 약 7 mL, 약 8 mL, 약 9 mL, 약 10 mL, 약 15 mL, 약 20 mL, 약 25 mL, 약 30 mL, 약 35 mL, 약 40 mL, 약 45 mL, 약 50 mL, 약 55 mL, 약 60 mL, 약 65 mL, 약 70 mL, 약 75 mL, 약 80 mL, 약 85 mL, 약 90 mL, 약 95 mL, 약 100 mL, 약 150 mL, 약 200 mL, 약 250 mL, 약 300 mL, 약 350 mL, 약 400 mL, 약 450 mL, 약 500 mL, 약 550 mL, 약 600 mL, 약 650 mL, 약 700 mL, 약 750 mL, 약 800 mL, 약 850 mL, 약 900 mL, 약 950 mL, 약 1000 mL, 약 1050 mL, 약 1100 mL, 약 1150 mL, 약 1200 mL, 약 1250 mL, 약 1300 mL, 약 1350 mL, 약 1400 mL, 약 1450 mL, 약 1500 mL, 약 1550 mL, 약 1600 mL, 약 1650 mL, 약 1700 mL, 약 1750 mL, 약 1800 mL, 약 1850 mL, 약 1900 mL, 약 1950 mL, 또는 약 2000 mL이다.
일부 실시예들에서, 본 발명의 장치들의 전기천공 구역을 통해 유동되는 유체의 체적(예를 들어, 변위 체적), 변위 속도, 또는 다른 제어된 파라미터들은 복수의 세포들의 트랜스펙션 효율에 영향을 미치거나 미치지 않을 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 장치들은 100 μL 초과 내지 약 2000 mL 범위의 체적으로 축적할 수 있는 100 μL 미만의 체적으로 복수의 세포들을 처리할 수 있는 자동화된 유체 취급 플랫폼과 함께 사용하도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 자동화된 유체 취급 플랫폼은 본 발명의 장치들의 전기천공 구역을 통해 유동되는 유체의 체적을 전달하는 하나 이상의 유체 전달 소스들(예를 들어, 펌프들, 예를 들어, 주사기 펌프들, 마이크로펌프들, 또는 연동 펌프들)과 함께 사용하도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 장치들의 전기천공 구역을 통해 유동되는 유체의 체적은 전달될 유체의 저장소에 대한 작동 유체의 변위에 의해 또는 공기 변위에 의해 전달될 수 있다. 일부 실시예들에서, 유체 전달 소스는 양압의 인가에 의해 유체 내에 현탁된 세포들을 유동시키도록 구성된다.
특정 양태들에서, 세포들이 현탁되는 유체의 전기 전도도는 현탁액 내의 세포들의 전기천공, 및 그에 따른 세포들로의 조성물의 전달에 영향을 미칠 수 있다. 현탁된 세포들을 갖는 유체의 전도도는 약 0.001 mS 내지 약 500 mS, 예를 들어, 약 0.001 mS 내지 약 0.1 mS, 약 0.01 mS 내지 약 1 mS, 약 0.1 mS 내지 약 10 mS, 약 1 mS 내지 약 50 mS, 약 10 mS 내지 약 100 mS, 약 25 mS 내지 약 200 mS, 약 50 mS 내지 약 400 mS, 또는 약 100 mS 내지 약 500 mS, 예를 들어, 약 0.01 mS 내지 약 100 mS, 약 0.1 mS 내지 약 50 mS, 또는 약 1 내지 20 mS, 예를 들어, 약 0.001 mS, 약 0.002 mS, 약 0.003 mS, 약 0.004 mS, 약 0.005 mS, 약 0.006 mS, 약 0.007 mS, 약 0.008 mS, 약 0.009 mS, 약 0.01 mS, 약 0.02 mS, 약 0.03 mS, 약 0.04 mS, 약 0.05 mS, 약 0.06 mS, 약 0.07 mS, 약 0.08 mS, 약 0.09 mS, 약 0.1 mS, 약 0.2 mS, 약 0.3 mS, 약 0.4 mS, 약 0.5 mS, 약 0.6 mS, 약 0.7 mS, 약 0.8 mS, 약 0.9 mS, 약 1 mS, 약 2 mS, 약 3 mS, 약 4 mS, 약 5 mS, 약 6 mS, 약 7 mS, 약 8 mS, 약 9 mS, 약 10 mS, 약 15 mS, 약 20 mS, 약 25 mS, 약 30 mS, 약 35 mS, 약 40 mS, 약 45 mS, 약 50 mS, 약 55 mS, 약 60 mS, 약 65 mS, 약 70 mS, 약 75 mS, 약 80 mS, 약 85 mS, 약 90 mS, 약 95 mS, 약 100 mS, 약 150 mS, 약 200 mS, 약 250 mS, 약 300 mS, 약 350 mS, 약 400 mS, 약 450 mS, 또는 약 500 mS일 수 있다.
본 발명의 방법들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 포유동물 세포, 진핵생물, 원핵생물, 합성 세포, 인간 세포, 동물 세포, 식물 세포, 일차 세포, 세포주, 현탁 세포, 부착 세포, 비자극된 세포, 자극된 세포, 또는 활성화된 세포 면역 세포, 줄기 세포(예를 들어, 일차 인간 유도 만능 줄기 세포, 예를 들어, iPSC, 배아 줄기 세포, 예를 들어, ESC, 중간엽 줄기 세포, 예를 들어, MSC, 또는 조혈 줄기 세포, 예를 들어, HSC), 혈액 세포(예를 들어, 적혈 세포), T 세포(예를 들어, 일차 인간 T 세포), B 세포, 항원 제시 세포(APC), 자연 살해(NK) 세포(예를 들어, 일차 인간 NK 세포), 단핵구(예를 들어, 일차 인간 단핵구), 대식세포(예를 들어, 일차 인간 대식세포), 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 호중구, 수지상 세포, 인간 배아 신장(예를 들어, HEK-293) 세포 또는 중국 햄스터 난소(예를 들어, CHO-K1) 세포를 포함하는 다양한 세포 유형들에 조성물을 전달할 수 있다. 전기천공될 수 있는 전형적인 세포 수는 약 104 세포 내지 약 1012 세포, (예를 들어, 약 104 세포 내지 약 105 세포, 약 104 세포 내지 약 106 세포, 약 104 세포 내지 약 107 세포, 약 5x104 세포 내지 약 5x105 세포, 약 105 세포 내지 약 106 세포, 약 105 세포 내지 약 107 세포, 약 2.5x105 세포 내지 약 106 세포, 약 5x105 세포 내지 약 5x106 세포, 약 106 세포 내지 약 107 세포, 약 106 세포 내지 약 108 세포, 약 106 세포 내지 약 1012 세포, 약 5x106 세포 내지 약 5x107 세포, 약 107 세포 내지 약 108 세포, 약 107 세포 내지 약 109 세포,약 107 세포 내지 약 1012 세포, 약 5x107 세포 내지 약 5x108 세포, 약 108 세포 내지 약 109 세포, 약 108 세포 내지 약 1010 세포, 약 108 세포 내지 약 1012 세포, 약 5x108 세포 내지 약 5x109 세포, 약 109 세포 내지 약 1010 세포, 약 109 세포 내지 약 1011 세포, 약 1010 세포 내지 약 1011 세포, 약 1010 세포 내지 약 1012 세포, 또는 약 1011 세포 내지 약 1012 세포, 예를 들어, 약 104 세포, 약 2.5x104 세포, 약 5x10 4 세포, 약 105 세포, 약 2.5x105 세포, 약 5x105 세포, 약106 세포, 약 2.5x106 세포, 약 5x106 세포, 약 107 세포, 약 2.5x107 세포, 약 5x107 세포, 약 108 세포, 약 2.5x108 세포, 약 5x108 세포, 약 109 세포, 약 2.5x109 세포, 약 5x109 세포, 약 1010 세포, 약 5x1010 세포, 약 1011 세포, 또는 약 1012 세포)일 수 있다.
약 104 세포 내지 약 1012 세포의 세포 천공 수를 달성하기 위한 세포 농도, 즉 유체의 mL당 세포 수는 일반적으로 약 103 세포/mL 내지 약 1011개 세포/mL, 예를 들어 약 103 세포/mL 내지 약 104 세포/mL, 약 5x103 세포/mL 내지 약 5x104 세포/mL, 약 105 세포/mL 내지 약 105 세포/mL, 약 5x105 세포/mL 내지 약 5x106 세포/mL, 약 106 세포/mL 내지 약 107 세포/mL, 약 5x106 세포/mL 내지 약 5x107 세포/mL, 약 107 세포/mL 내지 약 108 세포/mL, 약 5x107 세포/mL 내지 약 5x108 세포/mL, 약 108 세포/mL 내지 약 109 세포/mL, 약 5x108 세포/mL 내지 약 5x109 세포/mL, 약 109 세포/mL 내지 약 109 세포/mL, 약 5x109 세포/mL 내지 약 5x1010 세포/mL, 또는 약 1010 세포/mL 내지 약 1011 세포/mL, 예를 들어, 약 103 세포/mL, 약 5x103 세포/mL, 약 104 세포/mL, 약 5x104 세포/mL, 약 105 세포/mL, 약 5x105 세포/mL, 약 106 세포/mL, 약 5x106 세포/mL, 약 107 세포/mL, 약 5x107 세포/mL, 약108 세포/mL, 약 5x108 세포/mL, 약 109 세포/mL, 약 5x109 세포/mL, 약 1010 세포/mL, 약 5x1010 세포/mL, 또는 약 1011 세포/mL의 범위에 있다.
본원에 설명된 본 발명의 방법들은 유체 내에 현탁된 세포들에 임의의 조성물을 전달할 수 있다. 세포들에 전달될 수 있는 조성물들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 치료제, 비타민, 나노입자, 하전된 분자, 예를 들어 용액 중의 이온, 하전되지 않은 분자, 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA, CRISPR-Cas 복합체, 단백질, 중합체, 리보핵단백질(RNP), 조작된 뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 호밍 뉴클레아제, 메가뉴클레아제(MN), megaTAL, 효소, 펩티드, 트랜스포손, 또는 다당류, 예를 들어 덱스트란, 예를 들어 덱스트란 술페이트를 포함한다. 현탁액 내의 세포들에 전달될 수 있는 예시적인 조성물들은 핵산, 올리고뉴클레오티드, 항체(또는 항체 단편, 예를 들어, 이중특이적 단편, 삼특이적 단편, Fab, F(ab')2, 또는 단일-쇄 가변 단편(scFv)), 아미노산, 펩티드, 단백질, 유전자 치료제, 게놈 조작 치료제, 에피게놈 조작 치료제, 탄수화물, 화학 약물, 조영제, 자성 입자, 중합체 비드, 금속 나노입자, 금속 마이크로입자, 양자 도트, 항산화제, 항생제, 호르몬, 뉴클레오단백질, 다당류, 당단백질, 지단백질, 스테로이드, 항염증제, 항미생물제, 화학치료제, 엑소솜, 외막 소포, 백신, 바이러스, 박테리오파지, 보조제, 미네랄, 및 이들의 조합들을 포함한다. 전달될 조성물은 단일 화합물, 예컨대 본원에 설명된 화합물을 포함할 수 있다. 대안으로, 전달될 조성물은 서로 다른 유전자를 타겟으로 하는 복수의 화합물들 또는 성분들을 포함할 수 있다.
유체 내의 조성물의 전형적인 농도는 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 1000 ㎍/mL, (예를 들어, 약 0.0001 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL, 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 0.005 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 0.1 ㎍/mL, 약 0.01㎍/mL 내지 약 1㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 1㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 2.5 ㎍/mL 내지 약 15 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 25 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 7.5 ㎍/mL 내지 약 75 ㎍/mL, 약 10 μ/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL 내지 약 250 ㎍/mL, 약 25 ㎍/ mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL 내지 약 250 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL 내지 약 750 ㎍/mL, 약 100 ㎍/mL 내지 약 300 ㎍/mL, 약 100 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 약 200 ㎍/mL 내지 약 400 ㎍/mL, 약 250 ㎍/mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 350 ㎍/mL 내지 약 500 ㎍/mL, 약 400 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 약 500 ㎍/mL 내지 약 750 ㎍/mL, 약 650 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 또는 약 800 ㎍/mL 내지 약 1,000 ㎍/mL, 예를 들어, 약 0.0001 ㎍/mL, 약 0.0005 ㎍/mL, 약 0.001 ㎍/mL, 약 0.005 ㎍/mL, 약 0.01 ㎍/mL, 약 0.02 ㎍/mL, 약 0.03 ㎍/mL, 약 0.04 ㎍/mL, 약 0.05 ㎍/mL, 약 0.06 ㎍/mL, 약 0.07 ㎍/mL, 약 0.08 ㎍/mL, 약 0.09 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL, 약 0.2㎍/mL, 약 0.3㎍/mL, 약 0.4㎍/mL, 약 0.5㎍/mL, 약 0.6㎍/mL, 약 0.7㎍/mL, 약 0.8㎍/mL, 약 0.9㎍/mL, 약 1㎍/mL, 약 1.5㎍/mL, 약 2㎍/mL, 약 2.5㎍/mL, 약 3㎍/mL, 약 3.5㎍/mL, 약 4㎍/mL, 약 4.5㎍/mL, 약 5㎍/mL, 약 5.5㎍/mL, 약 6㎍/mL, 약 6.5 ㎍/mL, 약 7 ㎍/mL, 약 7.5 ㎍/mL, 약 8 ㎍/mL, 약 8.5 ㎍/mL, 약 9 ㎍/mL, 약 9.5 ㎍/mL, 약 10 ㎍/mL, 약 15 ㎍/mL, 약 20 ㎍/mL, 약 25 ㎍/mL, 약 30 ㎍/mL, 약 35 ㎍/mL, 약 40 ㎍/mL, 약 45 ㎍/mL, 약 50 ㎍/mL, 약 55 ㎍/mL, 약 60 ㎍/mL, 약 65 ㎍/mL, 약 70 ㎍/mL, 약 75 ㎍/mL, 약 80 ㎍/mL, 약 85 ㎍/mL, 약 90㎍/mL, 약 95 ㎍/mL, 약 100 ㎍/mL, 약 200 ㎍/mL, 약 250 ㎍/mL, 약 300 ㎍/mL, 약 350 ㎍/mL, 약 400 ㎍/mL, 약 450 ㎍/mL, 약 500 ㎍/mL, 약 550 ㎍/mL, 약 600 ㎍/mL, 약 650 ㎍/mL, 약 700 ㎍/mL, 약 750 ㎍/mL, 약 800 ㎍/mL, 약 850 ㎍/mL, 약 900 ㎍/mL, 약 950 ㎍/mL, 또는 약 1,000 ㎍/mL)일 수 있다.
일부 경우에, 현탁된 세포들 및 조성물을 갖는 유체의 온도는 본 발명의 장치(들)를 지지하는 하우징 내에 통합되는 열 컨트롤러를 사용하여 제어된다. 유체의 온도는 너무 높은 온도가 전기천공 후 세포 생존 가능성을 손상시킬 수 있기 때문에, 전기천공 구역에서 생성된 전계로부터 비롯된 줄(Joule) 가열의 효과를 감소시키도록 제어된다. 유체의 온도는 약 0℃ 내지 약 50℃, 예를 들어, 약 0℃ 내지 약 10℃, 약 1℃ 내지 약 5℃, 약 2℃ 내지 약 15℃, 약 3℃ 내지 약 20℃, 약 4℃ 내지 약 25℃, 약 5℃ 내지 약 30℃, 약 7℃ 내지 약 35℃, 약 9℃ 내지 약 40℃, 약 10℃ 내지 약 43℃, 약 15℃ 내지 약 50℃, 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 25℃ 내지 약 50℃, 또는 약 35℃ 내지 약 45℃, 예를 들어, 약 0℃, 약 1℃, 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 또는 약 50℃일 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 트랜스펙션된 세포들은 트랜스펙션의 전형적인 방법, 예를 들어 렌티바이러스 트랜스펙션, 또는 상업적으로 입수가능한 세포 트랜스펙션 기기, 예를 들어 NEON®트랜스펙션 시스템 (Thermo Fisher, Carlsbad, CA) 또는 4D--NUCLEOFECTOR(Lonza, Switzerland)를 사용하는 것보다 더 효율적으로 트랜스펙션되고 더 높은 생존 가능성을 갖는다. 예를 들어, 본원에 설명된 방법에 대한 트랜스펙션 효율, 즉, 조성물을 세포에 성공적으로 전달하는 효율은 약 0.1% 내지 약 99.9%, 예를 들어, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 10%, 약 2.5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 80%, 또는 약 50% 내지 약 99.9%, 예를 들어, 약 10% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 85%, 예를 들어, 약 0.1%, 약 0.15%, 약 0.2%, 약 0.25%, 약 0.3%, 약 0.35%, 약 0.4%, 약 0.45%, 약 0.5%, 약 0.55%, 약 0.6%, 약 0.65%, 약 0.7%, 약 0.75%, 약 0.8%, 약 0.85%, 약 0.9%, 약 0.95%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99.9%일 수 있다.
본원에 설명된 본 발명의 방법을 사용하여 도입된 조성물을 갖는 후 유체 내에 현탁된 세포들의 세포 생존 가능성, 즉 전기천공에 생존한 세포들의 수 또는 백분율은 약 0.1% 내지 약 99.9%, 예를 들어, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 10%, 약 2.5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 80%, 또는 약 50% 내지 약 99.9%, 예를 들어, 약 10% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 85%, 예를 들어, 약 0.1%, 약 0.15%, 약 0.2%, 약 0.25%, 약 0.3%, 약 0.35%, 약 0.4%, 약 0.45%, 약 0.5%, 약 0.55%, 약 0.6%, 약 0.65%, 약 0.7%, 약 0.75%, 약 0.8%, 약 0.85%, 약 0.9%, 약 0.95%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99.9%일 수 있다.
회수된 세포들의 수, 즉 전기천공 후 수집된 살아있는 세포들의 수는 약 104 세포 내지 약 1012 세포, 예를 들어, 약 104 세포 내지 약 105 세포, 약 104 세포 내지 약 106 세포, 약 104 세포 내지 약 107 세포, 약 5x104 세포 내지 약 5x105 세포, 약 105 세포 내지 약 106 세포, 약 105 세포 내지 약 107 세포, 약 2.5x105 세포 내지 약 106 세포, 약 5x105 세포 내지 약 5x106 세포, 약 106 세포 내지 약 107 세포, 약 106 세포 내지 약 108 세포, 약 106 세포 내지 약 1012 세포, 약 5x106 세포 내지 약 5x107 세포, 약 107 세포 내지 약 108 세포, 약 107 세포 내지 약 109 세포,약 107 세포 내지 약 1012 세포, 약 5x107 세포 내지 약 5x108 세포, 약 108 세포 내지 약 109 세포, 약 108 세포 내지 약 1010 세포, 약 108 세포 내지 약 1012 세포, 약 5x108 세포 내지 약 5x109 세포, 약 109 세포 내지 약 1010 세포, 약 109 세포 내지 약 1011 세포, 약 1010 세포 내지 약 1011 세포, 약 1010 세포 내지 약 1012 세포, 또는 약 1011 세포 내지 약 1012 세포, 예를 들어, 약 104 세포, 약 2.5x104 세포, 약 5x10 4 세포, 약 105 세포, 약 2.5x105 세포, 약 5x105 세포, 약106 세포, 약 2.5x106 세포, 약 5x106 세포, 약 107 세포, 약 2.5x107 세포, 약 5x107 세포, 약 108 세포, 약 2.5x108 세포, 약 5x108 세포, 약 109 세포, 약 2.5x109 세포, 약 5x109 세포, 약 1010 세포, 약 5x1010 세포, 약 1011 세포, 또는 약 1012 세포일 수 있다.
회수 수율, 즉, 전기천공 후 수집된 살아있는 조작된 세포들의 백분율은 약 0.1% 내지 약 500%, 예를 들어, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 10%, 약 2.5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 99.9%, 약 75% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 300%, 약 250% 내지 약 350%, 약 300% 내지 약 400%, 약 350% 내지 약 450%, 또는 약 400% 내지 약 500%, 예를 들어, 약 0.1%, 약 0.15%, 약 0.2%, 약 0.25%, 약 0.3%, 약 0.35%, 약 0.4%, 약 0.45%, 약 0.5%, 약 0.55%, 약 0.6%, 약 0.65%, 약 0.7%, 약 0.75%, 약 0.8%, 약 0.85%, 약 0.9%, 약 0.95%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99.9%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약t 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190%, 약 200%, 약 210%, 약 220%, 약 230%, 약 240%, 약 250%, 약 260%, 약 270%, 약 280%, 약 290%, 약 300%, 약 310%, 약 320%, 약 330%, 약 340%, 약 350%, 약 360%, 약 370%, 약 380%, 약 390%, 약 400%, 약 410%, 약 420%, 약 430%, 약 440%, 약 450%, 약 460%, 약 470%, 약 480%, 약 490%, 또는 약 500%일 수 있다.
당업자는 최적의 조건들이 세포 타입 또는 다른 요인들에 따라 변할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 각각의 새로운 세포 유형에 대해, 다음의 파라미터가 필요에 따라 조정될 수 있다: 파형, 전계, 펄스 지속기간, 완충액 노출 시간, 완충액 온도, 및 전기천공 후 조건.
실시예시들
실시예 1 - 장치 및 시스템
고정 시간 윈도우에서 발생하는 세포 전기천공 이벤트들의 수를 향상 또는 최대화하여, 세포 조작의 처리량을 향상 또는 최대화하고 및/또는 생물학적 발견을 가속화하기 위해 복수의 장치들이 병렬로 사용될 수 있도록 연속 유 전기천공 장치 및 관련 시스템이 설계 및 제작되었다. 전기천공 장치는 현재의 자동화된 유체 취급 시스템, 예를 들어 피펫 팁-기반 분배기, 로봇 유체 펌프 등과 호환 가능하도록 구성된다.
도 1a는 이 구성에서 피펫 팁으로서 도시된 전기천공 장치의 예시적인 실시예의 개략도를 도시한다. 도 1a는 전기천공 구역을 포함하는 장치의 활성 영역의 확대도를 도시한다. 이 장치는 액체 취급 로봇과의 통합을 통해 쉽게 자동화될 수 있는 플랫폼에서 진핵 세포 및 원핵 세포 둘 다의 연속적인 흐름 유전자 조작을 제공한다. 도 1a 내지 1c의 장치에서, 장치의 활성 영역은 3개의 별개의 구역들, 즉 진입 구역, 전기천공 구역, 및 회수 구역을 포함한다. 도 1a 내지 1c에 도시된 실시예에서, 세포들 내로 도입될 조성물 및 트랜스펙션될 세포들이 진입 구역에 위치된다. 세포들 및 조성물이 전기천공 구역을 통과하고, 트랜스펙션된 세포들을 회수 구역에 저장하기 위한 완충액에 분배한다. 따라서, 진입 및 회수 구역들 사이의 공간이 전기천공 구역이고, 3개의 모든 구역들은 유체 연통(예를 들어, 유체 연결)되어, 장치를 통한 하나의 유동 경로가 존재한다.
도 1a에 도시된 실시예에서, 진입 구역 및 회수 구역은 적절한 재료, 예를 들어 스테인리스 강으로 제조된 중공 전극들로부터 제조되고, 진입 구역 전극은 통전된 전극으로서 작용하고 회수 구역 전극은 접지된 전극으로서 작용하여, 회로를 완성하면서 (세포들 및 조성물을 운반하는 유체의 전도도와 조합하여) 2개의 전극들 사이에서 전계가 발생하도록 한다.
본 발명의 전기천공 장치는 사출 및 인서트 성형 제조 기술의 요건을 충족시키도록 설계되었으며, 이들 둘 모두는 사실상 확장 가능하고, 도 1b 및 1c에 도시되어 있다. 도 1b 및 1c에서, 장치 본체는 전기천공 구역과 통합되며, 이는 전계가 활성인 상업용 스테인레스-강 전극들 사이에 위치된다. 전기천공 구역 기하학적 구조는 실질적으로 균일한 단면을 나타내도록 수정되어, 전기천공 샘플의 체류 시간 동안 보다 예측가능한 전계 노출을 초래하였다. 현재의 생산 방법, 예를 들어 3D 프린팅을 사용하여, 하루에 약 100개의 장치들이 제조될 수 있으며; 이는 보다 강력한 대규모 생산 방법, 예를 들어 사출 및 인서트 몰딩을 사용하여 하루에 10,000개 이상의 장치로 확장 가능하다.
하우징은 각 전기천공 장치 내의 전계가 동일하도록 동일한 인가된 전압 펄스로 동시에 모든 전기천공 장치들을 통전시키기 위해, 그리드 전극들을 갖는 산업 표준 96-웰 피펫 팁 트레이에서 병렬로 복수의 전기천공 장치들, 예를 들어 96개의 전기천공 장치들을 통전시키도록 구성될 수 있다. 단일 전원 공급 장치가 전기 에너지를 전달하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 각 전기천공 장치에 전력을 분배하기 위한 메커니즘이 필요할 수 있다. 이를 구현하기 위한 하나의 방법이 도 2a에 도시되어 있으며, 도 2b의 분해도를 갖는다. 이러한 설계는 96개의 개별 전기천공 장치들이 하우징으로 들어가는 스프링 로드형 전극들을 특징으로 하며, 여기서 각 전기천공 장치의 제1 및 제2 전극들은 하우징의 전기 그리드들과 물리적으로 접촉한다. 스프링 로드형 전극들은 하우징의 전기 그리드들에 각각 병렬로 연결되며, 이는 차례로 단일 리드(lead) 세트에 의해 전원 공급 장치에 연결된다. 하우징은 일단 전원 공급 장치에 연결되면 최대 96개의 개별 샘플들의 유전자 변형을 동시에 용이하게 할 수 있도록 재사용될 수 있다. 전원 공급 장치는 본 발명의 각 개별 장치, 예를 들어 96개의 개별 장치들이 상이한 전압 또는 상이한 파형을 수신하도록 펄스 전달을 변조하도록 구성된 추가 회로부 또는 프로그래밍을 포함할 수 있다.
실시예 2 - 최적 전달을 위한 실험 파라미터들의 초기 개발
본 발명의 장치들을 사용하여 Jurkat 불멸화 T 세포주의 전기천공에 영향을 미치는 물리적 및 생물학적 파라미터들을 연구하기 위해 실험이 수행되었다. 산업 표준 유세포 분석법을 사용하여, 조작된 Jurkat 세포들의 세포 생존 가능성(7-AAD 염료 배제에 의해 측정됨) 및 트랜스펙션 효율(GFP 발현에 의해 측정됨) 둘 모두를 본 발명의 장치들을 사용하여 평가하였으며, 이들 둘 모두는 유전자 전달 분야에서 전기천공 성공의 일반적인 척도이다.
달리 명시되지 않는 한, 하기에 나타낸 실험 결과는 5 ㎍의 플라스미드(예를 들어, GFP 발현 플라스미드)를 갖는 100 μL의 완충액 내의 1x106 세포들의 농도에서 Jurkat 세포의 집단을 전기천공함으로써 생성되었다. 전기천공 실험은 100 Hz에서 구형 파형 및 9.5 ms의 펄스 지속시간을 사용하여 수행하였다. 24-시간 인큐베이션 후, 세포들을 7-AAD 염색제로 염색하고, 유세포 분석을 통해 분석하여 생존가능한 세포들 및 살아있는 GFP 발현 세포들을 측정하였다. 실험은 평균(SEM)의 표준 오차를 나타내는 오차 막대를 사용하여 세 번 수행하였다. 하기 표 1은 본 발명의 장치들을 사용하여 트랜스펙션을 위해 사용되는 파라미터들의 요약을 나타낸다. 표 1에 나열된 대부분의 파라미터들은 두 개의 개별 그룹들에 속하는 주목할만한 예외를 제외하고 서로 독립적이다. 제1 종속 파라미터 그룹은 레이놀즈 수, 속도, 평균 속도, 전단율, 및 피크 압력과 같은 물리적 채널 치수들 및 프로세스 파라미터들에 따라 변하는 것들이다. 당업자는 레이놀즈 수가 평균 속도, 동점도, 및 채널 직경의 함수임을 인식할 것이다. 속도(이는 채널 내에서 국부적으로 변할 수 있음), 평균 속도, 전단율, 및 피크 압력은 유량 및 채널 치수의 함수이다. 제2 종속 파라미터 그룹은 입력 세포들로부터의 회수된 셀들, 셀 생존 가능성, 트랜스펙션 효율 및 수율을 포함하는, 트랜스펙션의 생물학적 결과와 관련된 것들이다. 이들 파라미터들은 트랜스펙션되는 세포 유형 및 표 1에 나타낸 물리적 파라미터들의 조합을 포함하는 다수의 인자들에 따라 달라진다.
본원에 사용된 실험 파라미터들
파라미터 [단위] 최소값 동작값 최대값
병렬 샘플 1,4,8,12,24,48 96 384,1536
직렬 샘플 1 8 12
전극 수 1 2 3+
전극 게이지 6 16 34
채널 지름 [mm] 0.005 0.5 - 1.0 50
채널 길이[mm] 0.005 4.0-8.0 50
유량 [mL/분] 0.001 5-50 1,000
주파수 [Hz] 1 100-500 50,000
듀티 사이클 [%] 0.001 10-95 100
펄스 수 1 10 1,000,000
펄스 지속 시간[ms] 0.01 1-10 1,000
전계 [V/cm] 2.0 100-1,000 50,000
인가 전압 [V] 10 200-600 3,000
전기 전도도 [mS/cm] 0.001 1-20 500
샘플 온도 [
Figure pct00002
] 		1.0 4.0-37 50
샘플 체적[mL] 0.001 0.025-0.10 2,000,000
세포 수 1.0E4 21E5 - 10E6 100.0E10
EP 이후 회수된 세포 1.0E4 1.0E6 - 10E6 100.0E10
세포 농도 [세포/mL] 1.0E3 1.0E7 1.0E11
페이로드 농도 [㎍/mL] 0.01 1-10 1,000
회수된 세포들 [%] 0.1 50 99.9
세포 생존 가능성 [%] 0.1 50 99.9
트랜스펙션 효율 [%] 0.1 50 99.9
입력 세포들로부터의 수율 [%] 0.1 99.9 500
레이놀즈 수 [1] * 0.04 183-1530 2.43E4
속도 [m/s] * 5E-5 0.26-2.08 32.7
전단율 [s -1 ] * 0.1 2.6E3 - 5.4E4 2E6
피크 압력 [Pa] * 1E-3 136-1600 9.5E4
평균 속도 [m/s] * 1.5E-5 7.79E-2 - 7.81E-1 15.9
동점도 [m 2 /s] ** 1E-6 1.3E-6 - 5.6E-4 15E-4
파형/펄스 형상 구형, 펄스, 바이폴라, 사인, 램프, 비대칭 바이폴라, 고전압 - 저전압, 저전압 - 고전압, 직류(DC), 단극성, (+) 극성만, (-) 극성만, (+)/(-) 극성, (-)/(+) 극성
페이로드 하전된 분자, 하전되지 않은 분자, DNA, RNA, CRISPR-Cas9, 단백질, 중합체, 리보핵단백질(RNP), 덱스트란
전극 재료 304 스테인레스 스틸, 316 스테인레스 스틸, 금, 백금, 탄소, 전도성 액체, 전도성 용액
*시뮬레이션으로부터 계산된 값
**완충액 제제에 잠재적으로 사용되는 재료로부터 근사된 값
실시예 3 - 본 발명의 장치들을 사용한 트랜스펙션 데이터
본 발명의 장치들은 전기천공 채널을 통해 유량이 최대화될 때에 피크 트랜스펙션 성능을 나타낸다(도 3a 및 3b). 원하는 유량은 제어된 분배 속도 피펫을 이용하여 달성되어 생존 가능성 및 효율 둘 다를 증가시켰으며, 이는 전계 내에서 세포 샘플의 ~6.5 ms 체류 시간에 상응한다. 54%의 피크 세포 생존 가능성이 달성되었고, 65%의 트랜스펙션 효율이 달성되었으며, 이는 본 발명의 장치들로 인간 면역 세포들의 트랜스펙션에서 상당한 진전을 입증한다.
도 4a 내지 4d는 장치의 예시적인 활성 구역을 따른(즉, 제1 전극 루멘으로부터, 전기천공 구역을 통해, 그리고 제2 전극 루멘으로의) 유량 시뮬레이션을 예시한다. 이 실시예에서, 배지는 유동하는 생물학적 세포들을 함유한다. 10 mL/분 내지 100 mL/분에서의 시뮬레이션된 유체 유동으로부터, 전기천공 구역을 통과하는 샘플들의 평균 선속도가 결정된다. 10 mL/분의 더 낮은 유속은 324 mm/s의 평균 선속도를 초래한다. 100 mL/분의 더 높은 유속은 2,990 mm/s의 평균 선속도를 초래한다. 2개의 선속도는 각각 12.35 ms 및 1.34 ms의 추정된 체류 시간(τres)에 상관될 수 있다. 이들 장치들은 분당 16 mL의 유량을 제공하였다. 특히, 동등한 트랜스펙션 효율을 초래하는 상업용 시스템들의 경우, 유사한 전계 노출 하에서 약 30ms 이상의 노출들이 요구된다. 이는 높은 유량 및 전계의 조합이 본 발명의 장치들을 사용하여 생물학적 세포들 내로 개선된 유전 물질의 전달을 가져온다는 것을 보여준다.
본 발명의 장치들을 사용하는 트랜스펙션 효율은 전계 강도에 의해 영향을 받는다. 도 5a 및 5b는 각각 다양한 전계 강도로 인한 세포 생존 가능성 및 트랜스펙션 효율을 도시한다. 86%의 트랜스펙션 효율과 77%의 생존 가능성이 달성되었다.
본 발명의 장치들은 전기천공 동안 증가된 온도로 인해 세포 생존 가능성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 잠재적인 유해한 열 효과를 최소화하기 위해 얼음 상에서 샘플을 냉각시킴으로써 세포 생존 가능성 및 트랜스펙션 효율 둘 모두에서 ~20% 이하의 증가를 나타내었다(도 6a 및 6b). 전계, 유체 흐름, 및 열 효과를 결합하는 COMSOL Multiphysics에서의 수치 모델링은 또한 본 모델에서 225 V 또는 275 V의 인가된 전압을 사용하여 본 발명의 장치에서 샘플 온도의 영향을 더 잘 이해하기 위해 개발되었다. 도 7a 내지 7d에 도시된 결과들은 전기천공 구역에서 실질적으로 균일한 전계를 도시한다. 도 8a 내지 8d는 시간에 따른 장치 내의 온도 분포를 도시한다.
본 발명의 장치들을 이용한 전기천공은 정합된 주파수들을 갖는 펄스 지속시간의 범위에 걸쳐 전기천공이 수행되었을 때 성능에 있어 큰 변화를 보이지 않았다(도 9a 및 9b). 1 내지 5의 9.5ms 지속시간 내에 펄스들의 수를 변화시킴으로써, 생존 가능성 또는 효율에서 어떠한 현저한 변화들도 관찰되지 않았으며, 이는 본 발명의 장치들을 사용한 전기천공에 대한 파형 유연성을 입증한다. 이 실험에서, 83%의 피크 세포 생존 가능성이 달성되었고, 88%의 트랜스펙션 효율이 달성되었다.
본 발명의 장치들을 이용한 전기천공은 다양한 범위의 체적 및 세포 밀도에 걸쳐 전기천공법을 수행했을 때 성능에 있어 큰 변화는 보이지 않았다(도 10a 및 10b). 25 내지 100 μL의 범위의 체적에 걸쳐 세포들의 수를 변화시킴으로써, 생존 가능성 또는 효율에서 큰 변화는 관찰되지 않았으며, 이는 본 발명의 장치들을 사용한 전기천공에 대한 물리적 반응 유연성을 입증한다. 이 실험에서, 83%의 피크 세포 생존 가능성이 달성되었고, 86%의 트랜스펙션 효율이 달성되었다.
본 발명의 장치들을 이용한 전기천공은 전기천공 구역의 단면 치수 범위에 걸쳐 전기천공이 수행되었을 때 성능에 있어 큰 변화를 보이지 않았다(도 11a 및 11b). 전기천공 구역의 단면 치수를 500 내지 900 μm로 변화시킴으로써, 유사한 생존 가능성이 관찰되었으며, 전기천공 구역 내의 총 체류 시간에 부합하도록 유량이 수정되었을 때 효율에 있어서 큰 변화는 없었으며, 이는 본 발명의 장치들을 사용한 전기천공에 대한 단면 치수 유연성을 입증한다. 이 실험에서, 51%의 피크 세포 생존 가능성이 달성되었고, 67%의 트랜스펙션 효율이 달성되었다.
도 12a 및 12b에 도시된 바와 같이, 전압 펄스 파형 형상들에 따라 생존 가능성 및 효율이 달라진다. 파형의 형상을 변화시킴으로써, 각 Jurkat 세포가 노출되는 전류의 시간 및 세기가 조절되었으며, 이로써 생존 가능성 또는 효율을 변화시켰다. 이 실험에서, 높은 세포 생존 가능성은 구형, 사인, 및 램프 파형 형상들을 사용하여 높은 트랜스펙션 효율(50% 초과)과 조합하여 관찰되었다. 본 발명의 장치들에 유용한 예시적인 파형들이 도 12c 내지 12l에 도시된다.
도 13a 및 13b는 냉각 조건하에서 400 내지 700 V/cm의 전계를 갖는 분당 10 내지 25 mL의 유량을 이용하는 본 발명의 장치들의 생존 가능성 및 효율을 도시한다. 수행된 모든 최적화는 다수의 독립적인 실험에서 최신 상업적으로 입수가능한 NEON®트랜스펙션 시스템에 비해 더 높은 효율로 핵산의 전달을 가능하게 한다(도 13a 및 13b).
실시예 4 - 본 발명의 장치들을 유전 공학에 적용
일차 인간 T-세포의 치료적 적용은 암 투병에서 효과적이도록 환자의 면역 시스템을 표적화함으로써 면역 종양학 분야에서 상당한 진보를 보여주었다. 키메라 항원 수용체 및 조작된 T-세포 수용체를 포함하는 수많은 기술들이 최근 임상적 성공을 보여주었다. 그러나, 환자의 면역계를 유전적으로 변형시키는 적용은 고형 종양의 종양 미세환경이 종양 부위에서의 T-세포 기능을 억제하기 때문에 혈액암 치료에 다소 제한적이다. 종양 미세환경 억제의 생물학적 난제들 중 일부를 극복하기 위해, T-세포 표면 상에 조절 리간드들을 발현하는 유전자들을 녹아웃(knocking-out)함으로써 T-세포가 더 효과적이도록 더 변형시키고자 하는 욕구가 있다. 이들 유전자의 확인은 종종 CRISPR 스크린을 통해 달성되며, 여기서 Cas9 및 가이드 RNA 라이브러리는 특정 종양에 대한 기능적 향상을 달성하기 위해 광범위한 내인성 유전자를 녹아웃하기 위해 T-세포 내로 전달된다. 그러나, 이러한 라이브러리의 전달은 일차 T-세포 및 자연 살해 세포와 같은 "트랜스펙션시키기 어려운" 세포 유형들에서 유전자의 식별을 위한 장애물로 남아있다. 전형적으로, 이러한 예들에서, CRISPR 라이브러리는 세포를 감염시키고 Cas9/가이드 RNA 서열을 세포 게놈으로 형진변환시키는 렌티바이러스 입자로서 전달되고, 그러면 이는 서열-특이적 방식으로 관심 유전자를 녹아웃시킬 것이다. 이러한 라이브러리들은 생산하는데 매우 힘들고, 바이러스 발현 플라스미드의 클로닝(cloning) 및 전달을 위한 바이러스 입자들의 정제를 필요로 한다. 추가로, 이 방법론은 다른 기능성 유전자를 방해할 수 있는 무작위 게놈 삽입 부위에 유전적으로 혼입된 Cas9/가이드 RNA 서열의 원치 않는 "수하물"을 남긴다. Cas9 리보핵단백질 복합체에 대한 비-바이러스 전달의 사용은 이러한 장애물을 극복하는 매력적인 방법으로서, 연구자들이 가이드 RNA 분자와 복합된 Cas9 단백질의 일시적인 전달을 사용하여 바이러스 혼입의 부재하에 다수의 녹-아웃을 스크리닝할 수 있게 한다.
도 13c는 본 발명의 장치들을 사용하여 Cas9 리보핵단백질 복합체를 세포들에 전달하는 방법의 흐름도이다. 전기천공과 함께 세포로의 Cas9 리보핵단백질 복합체의 전달은 매우 효율적인 방식으로 타겟이 되는 CRISPR 녹아웃의 고-처리량 분석을 가능하게 하여, 치료적 적용을 위한 신규한 유전자 타겟의 발견 프로세스를 변형시킨다. 연구는 T-세포 생존 및 지속성의 종양 미세환경 억제를 억제하는 유전자를 확인하기 위해 상업적으로 입수가능한 세포 표면 수용체 라이브러리로부터의 200 내지 1,000 이상의 유전자 서브셋, 예를 들어 25,000개를 이용한다.
실시예 5 - 인간 세포의 전기천공
도 14a 및 14b는 700 V/cm의 전계 강도에서 2개의 상이한 분자량의 형광 덱스트란 분자들을 사용하여 일차 인간 T-세포들의 전기천공에 대한 생존 가능성 및 효율 데이터를 도시한다. 이 실험에서, 30%의 피크 세포 생존능이 달성되었고, 67%의 트랜스펙션 효율이 달성되었으며, 이는 본 발명의 장치를 사용하여 일차 인간 면역 세포의 트랜스펙션에서 상당한 진전을 입증한다.
관련 실험에서, 본 발명의 장치들을 사용한 전기천공은 공개된 NEON® 트랜스펙션 시스템 단핵구 전기천공 프로토콜을 사용한 THP-1 단핵구 세포주(ATCC 번호 TIB-202)에서 NEON®에 비해 상당히 증가된 성능을 보여준다(도 15a 및 15b). 이 실험에서, 트랜스펙션 효율이 6%로 유지되는 동안, NEON® 트랜스펙션 시스템의 23.4%에 비해, 본 발명의 장치들을 사용하여 56.4%의 증가된 세포 생존 가능성이 관찰되었다.
본 발명의 장치들을 사용한 전기천공은 공개된 NEON® 트랜스펙션 시스템 단핵구 전기천공 프로토콜을 사용하는 일차 인간 단핵구에서 NEON® 트랜스펙션 시스템에 비해 증가된 성능을 나타내었다(도 16a 및 16b). 이 실험에서, NEON® 트랜스펙션 시스템에서 관찰된 16.6%와 비교하여, 본 발명의 장치들을 사용하여 22.3%의 증가된 세포 생존 가능성이 관찰되었고, NEON® 트랜스펙션 시스템에서 관찰된 4.7%와 비교하여, 본 발명의 장치들을 사용하여 21.6%의 증가된 트랜스펙션 효율이 관찰되었다.
본 발명의 장치들을 이용한 전기천공은 독립적인 실험에서 NEON® 트랜스펙션 시스템과 비교하여 그리고 40 kDa 덱스트란 분자를 NK-92(ATCC)(도 17a 및 17b) 및 NK-92MI(ATCC)(도 18a 및 18b) 계통의 자연 살해 세포주로 성공적으로 전달하기 위해 증가된 성능을 나타내었다. 이러한 결과들은 비확장성 상업적으로 입수 가능한 플랫폼들에 필적할만한 세포 생존 가능성 및 개선된 트랜스펙션 효율로 핵산 공간 외부로 분자를 전달하는 본 발명의 장치의 능력을 확인하게 한다.
일차 단핵구들로의 SIRP알파 mRNA 전달
또 다른 연구에서, 일차 인간 단핵구에서 SIRP알파의 일시적인 발현은 본 발명의 장치들을 사용하여 달성되었다(도 19a 내지 19f). 일차 인간 단핵구에서 비-GFP mRNA의 이러한 전달은 이러한 역사적으로 "트랜스펙션이 어려운" 면역 세포 집단에서 기능하는 이러한 트랜스펙션 플랫폼의 장치의 능력을 추가로 나타낸다. 이러한 과발현 시연에 대한 대조군으로서, 주로 SIRP알파 음성인 일차 T 세포들이 사용되었다(살아있는 T 세포의 단지 3.4%만이 표면 마커에 대해 양성이었다; 도 19b). 트랜스펙션 후, 살아있는 T 세포들의 86.9%가 SIRP알파 표면 마커에 대해 양성이었다(도 19b). 높은 기준선(표면 마커에 대해 86.5% 양성(도 19a))을 갖는 일차 단핵구에서, 평균 형광 세기(MFI)가 정량화되어, 수용체 발현 밀도가 트랜스펙션 후에 증가하였는지를 결정하였다. SIRP알파 발현에서 대조군 세포 기준선에 비해 1.8배 증가가 mRNA의 전달 후 24시간 관찰되었다(도 19f).
일차 대식세포로의 CXCR4-타겟팅 Cas9-RNP 전달
eGFP 라벨링된 Cas9-RNP는 또한 본 발명의 장치들을 사용하여 단핵구-유도 인간 대식세포에 성공적으로 전달되었다. 핵으로의 eGFP 라벨링된 Cas9-RNP의 전달이 현미경 및 유세포 분석법을 통해 확인되었다. eGFP 발현은 트랜스펙션 후 24시간 분화된 대식세포의 최대 21.4%에서 관찰되었으며, 이는 5일 이내에 5.1%로 감소하였다. 24시간 시점에서는 유전자 편집이 관찰되지 않았지만, 48시간까지, 13.9% KO 효율이 관찰되었다. 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이, 넉아웃 효율은 5일째에 16.5%로 증가하였다.
mRNA의 전달을 이용한 비접촉 T 세포 조작
분리된 비접촉 T 세포(CD45RA+/CD45RO-)는 본 발명의 장치를 사용하여 GFP를 코딩하는 mRNA로 전기천공되었다. 24시간 후, 세포들이 생존 가능성 및 효율 메트릭에 대해 분석되었다. 전기천공된 세포에 대한 비접촉 세포 수 및 생존 가능성은 비처리된 세포들과 동등하였고, 40% 전달 효율이 관찰되었다(도 20a 내지 20d). 추가로, 세포는 비접촉 T 세포 마커 CD45RA 및 CD45RO에 대해 염색되었다. 이러한 염색은 전기천공된 세포들에 대한 표현형의 변화가 없고, 세포들이 그들의 "비접촉" CD45RA+/CD45RO-상태를 유지한다는 것을 입증하였다(도 21a 및 21b). 마지막으로, 비접촉 T 세포들은 CD3/CD28 활성화 시약으로 확장되었다. 본 실험에서, 전기천공된 세포의 성장 속도는 활성화 후 6일 후에 처리되지 않은 세포와 동등하였다(도 22).
실시예 6 - 본 발명의 복수의 장치들을 통전시키기 위한 장치
도 23a 내지 23f는 본 발명의 장치들을 통전시키고 자동화된 액체 취급 플랫폼 상에서 전기천공 프로세스를 완료하기 위해 액체 취급 시스템에 추가로 통합될 수 있는 외부 장치에 통합된 본 발명의 전기천공 장치들의 예시적인 실시예들을 도시한다. 전기천공 프로세스 동안, EDM(electronics discharge machine)이라 불리는 외부 장치가 본 발명의 장치들을 통전시키는 데 사용된다. 도 23b, 23c 및 23e에 도시된 장치들에서, 23.1은 지지 레일과 통합되는 평행 빔이다. 이들 빔들은 상호 교환 가능하며, 전기 접촉 스타일/메커니즘의 변경을 허용한다. 추가로, 빔은 전기 콘택들의 최종 포지셔닝을 허용한다. 23.2는 기계적으로 수축가능한 전기 콘택들이다. 전극들은 스프링과 같은 메커니즘을 사용하여 전기천공 장치의 본체와의 콘택을 유지하면서 장치의 상이한 영역들이 EDM을 통해 슬라이딩될 수 있게 한다. 이 요소는 더 가요성인 다른 전기 콘택들, 예를 들어, 도 23e에 도시된 것들과 같은 판 스프링 또는 와이어 브러시 유형 전극들에 대해 스위칭될 수 있다. 23.3은 본 발명의 전기천공 장치의 저장소이다. 23.4는 필요한 경우 전극의 추가적인 편향을 허용하는 스윙 지지 레일이다. 이러한 레일 특징부는 전기천공 장치가 조작자 또는 자동화된 시스템, 예를 들어 로봇 아암에 의해 제 위치에 배치되는 동안 회전하고 전기 콘택의 더 많은 편향을 허용하기 위해 스프링-형 메커니즘을 사용한다. 23.5는 23.6에 도시된 샘플 플레이트와 같은 샘플 홀딩 플레이트의 선형 병진이동을 허용하는 슬라이딩 레일이다. 23.7은 샘플 플레이트 위에 적절한 전기천공 장치 포지셔닝을 제공하는 정렬 시스템이다. 정렬 시스템은 자동화된 정렬 특징부들이 없을 때, 예를 들어, EDM에 적용된 로봇 제어가 없을 때 시각적 표시자로서 사용된다. 선형 변환 장치의 일부 형태의 적용으로, 시스템은 임의의 어레이 포맷으로 하나 이상의 샘플들을 완성하는 능력을 갖는다. 23.8은 본 발명의 장치들의 전기천공 구역이고, 진입 구역 23.9 및 회수 구역 23.10 둘 모두에 유체 연결된다. 23.11은 기계적으로 수축가능한 전기 콘택들(23.2)을 지지하는 지지 레일이다. 지지 레일(23.11)은, 모든 기계적으로 수축가능한 전기 콘택들(23.2)이 동시 전기천공 실험을 위해 통전될 수 있도록 전기 전도성일 수 있다. 대안으로, 지지 레일(23.11)은 개별 전기천공 실험들이 수행될 수 있도록 기계적으로 수축가능한 전기 콘택들(23.2)을 절연시키는 비전도성 재료일 수 있다.
자동화된 시스템으로서 구성될 때, 관심 시료의 샘플은 본 발명의 장치들에 의해 액체 취급 플랫폼 상의 또 다른 위치에서 흡인된다. 그런 다음, 샘플이 EDM으로 이송되고, 여기서 전극 콘택들은 샘플 플레이트의 표면 위에 현수된다. 그런 다음, 본 발명의 장치들은 EDM의 전극 콘택들과 콘택을 확립하기 위해 장치 내로 하강된다. 도 23a 내지 23c에 도시된 메커니즘은 포고 핀 연결부를 사용하여 회로를 폐쇄하는 반면 도 23d 내지 23f의 실시예는 가요성 스프링, 예를 들아 판 스프링, 전극들을 사용하여 회로를 폐쇄한다. 회로들을 연결하는 대안적인 방법들은 전도성 유체들 또는 전해질들, 콘택을 이루도록 확장되는 전도성 다이어프램들, 또는 삽입 프로세스 동안 편향되기에 충분한 스프링 상수를 갖는 다른 전도성 가요성 재료들의 사용을 포함한다. 이는 EDM이 본 발명의 다양한 상이한 크기의 장치들의 사용에 순응할 수 있게 한다. 시스템은 실험 목적에 따라 독립적으로 또는 동시에 하나 이상의 샘플들을 전기천공하는 데 사용될 수 있다. 이 기술은 전체적으로 증가하도록 스케일 업될 수 있다. 예를 들어, EDM은 본 발명의 복수의 전기천공 장치들와 함께, 또는 대안으로는, 2개의 선형 병진이동 메카니즘의 추가에 의한 단일 샘플 실험 또는 다중-샘플 실험에서 본 발명의 단일 장치와 함께 사용될 수 있다.
도 24a 및 24b는 온도-제어 방식으로 본 발명의 전도성 장치들을 통전하도록 구성된 하우징의 예시적인 실시예들을 제공한다. 도 24a의 장치에서, 24.1은 액체 취급 매니폴드에 연결되도록 구성된 중공 전극들이다. 전극들은 액체 취급 매니폴드로의 연결에 의해 발생된 마찰에 의해 유도된 전극 재료 상의 응력을 감소시키기 위해 상호작용 칼라(collar)를 추가로 포함할 수 있다. 24.2는 중공 전극들에 유체 연결되고 전극들을 통전시킬 때 생성된 전계를 증폭하도록 구성된 연결 채널이다. 연결 채널은 추가로 샘플이 겪는 전기 펄스를 증가시키고 제어하기 위해 유체 유동을 제한하는 장벽으로 작용한다. 24.3은 연결 채널(24.2)에 연결되는 전도성 베이스 전극이다. 24.4는 중공 전극(24.1), 연결 채널(24.2), 및 전도성 베이스 전극(24.3)을 고정하도록 구성된 지지 베이스이다. 24.5는 중공 전극(24.1), 연결 채널(24.2), 전도성 베이스 전극(24.3) 및 지지 베이스(24.4)를 지지하고 전도성 베이스 전극(24.3)에 전기적으로 연결되어 전기천공 회로를 완성하는 전도성 베이스이다. 전도성 베이스(24.5)는 전기천공 프로세스의 온도를 조절하기 위해 전도성 베이스(24.5)를 통해 가열 또는 냉각 유체를 유동시키기 위한 유체 연결부(24.6)를 포함한다. 도 24b에서, 24.7은 다른 컴포넌트들을 지지하는 외부 프레임이다.
상기 장치에서, 도 24a 및 24b는, 유체가 중공 전극(24.1)으로부터 유동함에 따라, 샘플 유체의 전도성은 베이스 전극(24.3)의 표면과의 상호작용 후에 폐회로를 형성한다. 베이스 전극들(24.3)은 세포들이 전기천공을 유도하는 체계적이고 제어가능한 전계 노출을 허용하는 임의의 형상일 수 있다. 중공 전극들(24.1)의 위치는 전계에 대한 세포 노출을 제한하기 위해 지지 베이스(24.4)로부터 Z-좌표로 조작될 수 있다. 이 구성에서, 베이스 전극(24.3)은 지지 베이스(24.4)의 바닥으로부터 특정 체적 수집 한계 위에 위치하는 위치로 상승된다. 전기천공된 세포는 샘플 전체에 걸쳐 유한 전계를 경험할 것이다(전기천공 회로를 폐쇄하는 것을 제외하고). 이러한 설계는 샘플 세포들에 대한 전단 효과를 감소시키고, 전기천공이 발생하는 영역에서 흐름의 균일성을 증가시킨다. 추가로, 안정된 전계를 생성하거나 전계를 더 조작하기 위해, 연결 채널(24.2)이 중공 전극(24.1)의 단부에 추가되어, 작업자가 전기 펄스, 및 그에 따라 시료에 의해 경험되는 전계를 증폭 및 제어할 수 있게 한다. 추가로, 이 시스템에서의 전극 구성은 캐뉼라가 원형이고 유동하는 시료의 축들에 평행하지만, 베이스 전극의 24.3 표면은 캐뉼라의 축에 대해 0도보다 큰 소정 각도에 있는 평행하지 않은 전극 구성을 사용한다. 이러한 설계의 변형은 웰 플레이트 위에서 호버링하는 현수된 전극의 사용이다. 샘플이 베이스 전극(24.3)의 표면에 걸쳐 흐르고 전기천공됨에 따라, 샘플은 웰 내로 낙하한다. 이 구성에서, 전극들은 웰 플레이트에 물리적으로 부착되지 않는다.
실시예 7 - 유체 칩 기반 전기천공 장치
도 25a 내지 25b는 샘플을 장치에 도입하기 위해 산업 표준 1 내지 5,000 μL의 통상적인 피펫 팁을 수용하도록 구성된 유체 칩-기반 전기천공 장치의 예시적인 실시예들을 도시한다. 도 25a의 장치에서, 25.1 및 25.2는 전기천공 구역에 의해 유체적으로 및 전기적으로 연결된 전극들이다. 25.3은 전기천공 구역에 유체 연결된 피펫 팁 삽입 영역이고, 25.4는 수집 저장소이다. 유체 칩 기반 전기천공 장치의 전극(25.1 및 25.2)은 외부 전원 공급 장치에 의해 통전된다. 도 25b의 분해도에서, 25.5는 피펫 팁이고, 25.6은 도 25a의 유체 칩-기반 전기천공 장치이며, 25.7은 전기천공 후 종(species)을 보유하는 수집 플레이트를 나타낸다.
피펫 팁(25.5)은 유체 칩 기반 전기천공 장치(25.6)의 표면 위로 호버한다. 유체 칩-기반 전기천공 장치는 두 개의 컴포넌트들, 즉 전극들의 캡슐화된 배열을 포함하는 전기천공 플레이트 및 사용자가 세포들로 전달되는 전계의 펄스를 변조할 수 있게 하는 마이크로유체 채널들을 내장한 커버 플레이트를 포함한다. 전기천공 플레이트는 원하는 경우 동시에 또는 개별적으로 다수의 샘플들의 전기천공을 통한 유동을 가능하게 한다. 전기천공 플레이트에서 시료의 전기천공이 발생한 후, 샘플은 수집 플레이트(25.7)의 바닥을 향해 흐른다. 이 시스템은 산업 표준 액체 취급 컴포넌트, 예를 들어 1 내지 5,000 μL 피펫 팁을 사용하여, 산업 표준 액체 취급 매니폴드로의 통합을 용이하게 한다.
실시예 8 - 대용량(확장 가능한) 연속 유동 전기천공 장치
도 26a 내지 26b는 대용량 세포 제조와 함께 사용하기 위해 설계된 연속 유동 전기천공 장치의 예시적인 실시예들을 도시한다. 도 26a에 도시된 실시예에서, 26.1 및 26.2는 각각 유체, 예를 들어 완충 용액을 순환시키기 위한 유입구 및 유출구이다. 26.3은 전기천공 장치를 고정하는 외부 하우징이다. 26.4는 전기천공 구역이고, 유체 유입구(26.5) 및 유체 유출구(26.9)에 유체 연결된다. 유입구(26.5) 이후 및 유출구(26.9) 이전에는 그 표면 상에 기공들(26.6)을 갖는 원통형 전극들(26.7 및 26.8)이 있다. 26.10은 유체를 담기 위한 저장소, 예를 들어 성장 배지이다.
이 실시예에서 원통형 전극들(26.7 및 26.8)은 유체가 그 기공들(26.6)을 통해 장치의 캐비티 내로 이동할 수 있게 하는 전도성 다공성 재료로 제조된다. 원통형 전극(26.7, 26.8) 내의 기공들(26.6)은 완충 용액이 원통형 전극들(26.7, 26.8)의 표면 상의 화학 반응을 안정화시키고 전기천공 프로세스 동안 전위의 인가로 인해 관찰되는 pH 전이를 최소화하도록 한다. 다공성 원통형 전극(26.7, 26.8)에 의해 도입된 완충액은 원통형 전극들(26.7, 26.8)의 내부 표면 상에 "윤활" 또는 쉬스(sheath) 유동을 생성하도록 또는 전기천공될 때 전기천공 프로세스(세포들이 있는 현탁액의 회전과 같은)으로 다른 유체 역학 요소들을 유도하도록 유체 유동의 변화를 허용한다. pH 전이의 감소는 전기천공 동안 사용된 현탁된 시료의 pH에서 높은 변이의 부정적인 효과를 감소시킨다. 원통형 전극들(26.7 및 26.8)은 외부 회로 요건을 완성하고 시스템이 외부 전원 공급 장치를 사용하여 통전될 수 있게 한다. 대안적인 실시예에서, 전기천공 장치의 유출구(26.2)는 고전도성 완충액, 예를 들어 성장 배지 또는 PBS를 제거하는 데 사용될 수 있고, 유입구(26.1)는 전기천공 구역(26.4)을 통해 유동할 때 액체 샘플의 가열을 최소화하기 위해 낮은 전기 전도성 완충액을 도입하는 데 사용될 수 있다. 이러한 완충액 교환은 궁극적으로 더 많은 수의 성공적으로 조작된 세포들을 생성할 더 높은 세포 생존 가능성 및 더 높은 트랜스펙션 효율을 초래할 것이다. 그런 다음, 저전도성 완충액은 전기천공 구역 이후의 유출구에서 추출될 수 있고, 전기천공 구역 이후의 유입구와 접촉시 성장 배지로 보충될 수 있다.
실시예 9 - 신규한 나선형 전극에서의 전계 모델링
유동 셀의 형질전환/트랜스펙션 효율을 증가시키는 것을 돕는 특정 전극 구성을 갖는 Flowfect 장치가 설계되고 계산적으로 모델링되었다. 도 27a는 세포들이 전기천공 영역을 통해 유동함에 따라 전계를 회전시키는 것을 담당하는 전극 구성의 나선형 특성을 나타낸다. 이론에 구속됨이 없이, 이러한 구성은 세포 표면의 더 큰 부분이 전기천공될 수 있게 하고, 이에 의해 동등한 효과를 달성하기 위해 더 낮은 전계를 필요로 한다. 도 27b 내지 27f는 다른 축에서 바라본, 전기천공 영역의 단면적을 도시한다. 통전 및 접지된 전극들은, 예를 들어, 도 1a 내지 1c에서와 같이, 평행한 방향과는 대조적으로, 유동 방향에 수직이다. 이러한 설계는 더 낮은 샘플 체적 및 감소된 인가 전압을 허용하며, 이는 예를 들어, 세포 수가 제한되는 일차 인간 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 줄기 세포) 전기천공과 같은 응용에서 바람직하다. 다른 실시예에서, 나선형 전극들은 전기천공 구역과 유체 접촉하지 않으며; 고주파 펄스들의 사용은 전기천공 구역의 내부에 전계를 (예를 들어, 중간 매체를 통해) 유도하여 세포들 내로 조성물을 전달할 수 있다.
실시예 10 - 제조 확장성을 위한 본 발명의 2-파트 장치
도 28a 내지 28c는 상업적으로 입수가능한 액체 취급 시스템과 함께 사용될 수 있는 완전한 장치를 형성하기 위해 함께 짝을 이루는 2개의 별개의 컴포넌트들로 제조되도록 구성된 본 발명의 장치의 일 실시예를 도시한다. 그런 다음, 이 구성에서, 도 28a 내지 28b의 2개의 컴포넌트들의 접합부 근처에서 작은 도트(dot)들로서 도시된 인서트 몰딩된 전극들은 확립된 산업 공정들(예를 들어, 스핀 용접, 음파, 예를 들어, 초음파, 열 용접, 예를 들어, 핫 플레이트 또는 레이저)를 통해 함께 용접된다. 이러한 설계에서, 장치를 통한 샘플, 예를 들어, 세포-DNA 샘플의 유체 유동은 전기천공에 필요한 전계 노출로부터 결합 해제된다.
도 29a 및 29b는 예를 들어, 700 ㎛ 직경의 전기천공 구역 위 및 아래의 인서트 성형된 전극들 사이의 거리가 4 mm인 동일한 내부 치수들와 같은, 도 28a 내지 28c에 도시된 장치를 도시한다. 본 발명의 장치의 이 실시예와 도 28a 내지 28c에 도시된 실시예 사이의 차이점은 이 개념에서 유체 유동 제어가 전계 노출과 결합된다는 점이다. 구체적으로, 캐뉼라(도 29a 내지 29b의 장치의 상부에 도시됨)는 본 발명의 액체 취급 시스템과 전기천공 장치 사이의 인터페이스이다. 본 발명의 전기천공 장치가 캐뉼러로 인터로킹되면, 임베이드된 전극들(도 29a 및 29b의 장치에서 적색으로 도시됨)은 전압 펄스 전달을 위한 전원 공급 장치와 전기적으로 연결될 것이다. 도 29a 내지 29b에 도시된 실시예에서, 단일 캐뉼러가 도시되어 있지만, 본 발명의 복수의 전기천공 장치들, 예를 들어 유체 내에 현탁된 세포들을 병렬로 전기천공하도록 구성된 본 발명의 4개(도 29c), 8개, 12개, 24개, 36개, 64개, 96개 또는 384개 전기천공 장치들을 포함하는 시스템에서 확장될 수 있다. 도 29c는 복수의 카트리지들 또는 복수의 컨트롤러들을 사용하여 발생하는 동시 또는 순차적 변환의 수를 증가시킬 수 있는 이러한 방법/장치를 예시한다. 특히, 유사한/상이한 전기 신호들 및 유사한/상이한 변위 속도들이 노출되는 다수의 유체 구속 경계들/수축들을 조합하여/개별적으로 사용하여 셀들을 수정하기 위해 다수의 유입구들을 통합한다. 대안으로, 세포 변형을 위한 캐비티들은 하나/다수의 컨트롤러 시스템들에 통합되는 독립적인 카트리지이거나, 또는 컨트롤러 시스템은 하나/다수의 카트리지들을 수용할 수 있다.
예 11 - 하우징 및 인터페이스의 예
도 30a 및 30b는 사용자 인터페이스(도 30a) 및 액체 분배 매니폴드 및 샘플 플레이트(도 30b)에 유체 연결된 본 발명의 복수의 장치들을 포함하는 외부 하우징을 도시하는 본 발명의 장치들의 예시적인 실시예들을 제공한다.
도 30a는 연속 유동 트랜스펙션/형질전환 시스템의 일 실시예이다. 3D 모델은 터치스크린 사용자 인터페이스(30.1) 또는 사용자가 유량, 파형, 인가된 전위, 전기천공될 체적, 시간 지연, 냉각 특징부, 가열 특징부, 전기천공 상태, 진행 및 전기천공 프로토콜을 최적화하는데 사용되는 기타 파라미터와 같은 파라미터들을 선택할 수 있게 하는 또 다른 대안적인 사용자 인터페이스(들)를 포함하는 독립형 전기천공 시스템을 도시한다. 인터페이스는 또한 사용자가 이전에 사용자에 의해 검증되거나 제조자들에 의해 추천된 표준 조건들에서 시스템을 동작시킬 수 있도록 하는 사전-공식화된 파라미터 선택들을 포함한다. 인터페이스는 시스템의 자동화된 실행 및/또는 알려진 세포 유형의 주어진 샘플에 대한 트랜스펙션을 최적화하기 위한 알고리의 실행을 허용하는 프로그래밍에 연결될 수 있다. 장치는 연속 흐름 전기천공에 사용되는 하나 이상의 앞서 설명된 발명들 또는 또 다른 전기천공 장치들을 캡슐화하는 카트리지(30.2)를 포함한다. 장치는 또한 시료의 전기천공 동안, 그 이전 및 그 이후에 세포/완중액 저장을 위한 냉각/가열 영역/인클로저(30.3)를 포함한다. 시스템은 외부에서 전원이 공급된다. 시스템은 또한 사용자가 이 기능을 선택하는 경우 독립적으로/자율적으로 파라미터들을 조정하는 능력을 갖는 알고리즘을 포함한다. 이는 세포 유형, 전도도, 현탁액의 체적, 점도, 전기천공 카트리지의 수명, 현탁액의 물리적 상태 또는 전기천공 장치의 상태에 따라 달라질 수 있는 전기천공 프로세스에 사용되는 파라미터들의 연속적인 조정을 허용한다.
도 30b는 본 문서에서 이전에 설명된 전기천공 장치 어레이를 도시한다. 30.4는 액체 취급 플랫폼에 걸쳐 본 발명을 운반하고 장치가 유체를 흡입할 수 있게 하는 액 취급 매니폴드이다. 30.5는 도 1a 내지 1c에 도시된 장치이다. 30.6은 시료 이송 전, 이송 도중, 및/또는 이송 후에 샘플을 저장하는데 사용되는 웰 플레이트이다.
실시예 12 - 전기천공 파라미터들을 최적화하기 위한 유세포 분석법을 위한 게이팅 전략
도 31은 2개의 게이팅 전략을 비교하는 예를 제공한다. 역사적으로, 전기천공 기술의 개발자들은 변화된 형태를 갖거나 세포사멸을 겪는 것들과 같은, "림프구" 집단 내에 있지 않은 세포들을 무시하는 정규의 "림프구" 프리-게이트를 사용하였다. 도 31에 도시된 바와 같이, 이는 분석을 위한 세포들의 특정 하위집단을 선택함으로써 인위적으로 생존 가능성 메트릭을 증가시킨다. "총 세포" 프리 게이팅은 전기천공에 의한 실험 결과의 보다 정확한 묘사이다. 따라서, 아래 표에 나타낸 보고된 생존 가능성은 필드에서 예상된 것보다 낮게 나타날 수 있지만, 데이터는 모든 입력 세포들에 대한 본 발명의 전기천공 장치들의 영향을 묘사하는 성능 메트릭에 집중하도록 처리되었다. 도 31에서, FSC는 전방 산란을 나타내고, SSC는 측면 산란이며, 이는 세포 모포로지 데이터가 유세포 분석 동안 수집되는지 방법을 나타낸다.
본원에 설명된 게이팅 전략을 사용하여, Jurkat 세포, 활성화된 일차 인간 T-세포, THP-1 단핵구, 일차 인간 단핵구, 및 분화된 일차 인간 대식세포에 대한 성능 데이터가 하기 표 2에 보여진다. 표 2에서, 수율은 생존 가능하고 관심 페이로드를 발현한 세포들의 수 대 프로세스에 들어간 세포들의 입력 수의 비를 나타낸다. 예를 들어, 0.5배의 수율은 입력 세포들의 절반이 생존가능하고 분석 시에 원하는 페이로드를 발현한다는 것을 의미한다. 관점에서 볼 때, 바이러스 전달 수율이 수확 시점에 약 0.1배보다 큰 경우 세포 치료 제제가 환자에게 투여된다.
매우 광범위한 페이로드를 갖는 상이한 일차 세포들 및 세포주에서 본 발명의 장치들로 달성된 대표적인 성능 메트릭들
입력 피크 성능 메트릭
셀 유형 페이로드 생존 가능성 효율 수율
Jurkat 세포주 덱스트란 75-80% 55-60% 0.3배
pDNA 70-75% 55-60% 0.2배
mRNA 75-80% 90-95% 0.6배
일차 인간 T-세포 (활성화) 덱스트란 75-80% 85-90% 0.5배
mRNA 75-80% 90-95% 0.6배
THP-1 덱스트란 65-70% 85-90% 0.5배
Figure pct00003
일차 인간 단핵구 덱스트란 45-50% 85-90% 0.3배
Figure pct00004
mRNA 55-60% 80-85% 0.4배
Figure pct00005
일차 인간 대식세포 (분화됨) 덱스트란 70-75% 70-75% 0.4배
Figure pct00006
mRNA 45-50% 75-80% 0.2배
Figure pct00007
Figure pct00008
비처리된 비-전기천공 대조군 수를 기반으로 한 수율을 나타냄
실시예 13 - 중국 햄스터 난소(CHO-K1) 세포 및 인간 배아 신장(HEK-293T) 세포에 대한 전기천공
CHO-K1(중국 햄스터 난소 세포) 및 HEK-293T(인간 배아 신장 세포) 세포주의 전기천공이 수행되었다. 본 발명의 장치는 전기천공 완충액에 들어올려지고 재현탁된 부착 세포의 전기천공에 사용될 수 있다. CHO-K1(도 32a 및 32b) 및 HEK-293T(도 33a 내지 33d) 세포들은 본 발명의 장치들을 사용하여 GFP 플라스미드 DNA로 성공적으로 트랜스펙션될 수 있다. HEK-293T 세포들에서 피크 트랜스펙션 효율은 전기천공 후 48시간 배양 후에 관찰되었다. 이론에 얽매이지 않고, 감소된 세포 생존 가능성은 유세포 분석기를 통한 분석을 위해 부착 세포들을 들어올리고 이들을 현탁액에 넣기 때문일 수 있는 반면, 현미경 방법은 정상적인 모폴로지를 갖는 건강한 GFP+ 세포들을 나타내었다(도 34a, 34b, 35a 및 35b).
실시예 14 - 일차 T-세포들의 트랜스펙션
일차 T-세포의 연구가 수행되었다. 전기천공 효율 분석에 일차적으로 활용되는 형광 리포터는 형광 소분자(예를 들어, FITC-라벨링된 덱스트란), 플라스미드 DNA로부터 발현되는 유전자(예, GFP), 및 mRNA로부터 발현되는 유전자(예, GFP)를 포함한다. 이러한 리포터들의 전달 및 발현은 유동 유세포 분석을 사용하여 결정되며, 여기서 살아있는 세포들은 단일-세포 기반에서 형광 검출을 결정하기 위해 본원에 설명된 바와 같은 게이팅 전략을 사용하여 사전-게이팅된다. 이러한 분석은 형광 리포터의 세포간 검출, 및 일부 경우에, 직접 핵 전달을 입증한다. 본 발명의 장치들로 수행된 전기천공들의 완만한 특성으로 인해, 상업적 시스템들, 예를 들어 Lonza 4D-NUCLEOFECTOR 또는 NEON® 트랜스펙션 시스템(Thermo Fisher, Carlsbad, CA)에 비해 트랜스펙션 후에 더 높은 세포 수가 달성된다.
a. 확장된 T셀 데모
형광 라벨링된(FITC) 덱스트란 분자(40 kDa)를 일차 인간 T-세포(106의 세포 밀도/실험 조건에서 시작)로 전달하기 위해 본 발명의 장치들을 사용한 트랜스펙션이 수행되었으며, 상업적으로 입수가능한 벤치-탑(bench-top) 전기천공 장치(예를 들어, Thermo Fisher NEON® 트랜스펙션 시스템)에 대한 4개의 메트릭의 분석이 수행되었다: 총 세포 수(EP 후), 세포 생존 가능성, 트랜스펙션 효율, 및 살아있는 트랜스펙션된 세포들의 총 수. 결과들이 도 36a 내지 36d에 도시된다. 형광 라벨링된 분자를 사용한 도 36a 내지 36d에 도시된 데이터에 외에, 일차 인간 T-세포 내로의 GFP(3.5 kB)를 코딩하는 플라스미드 DNA의 전달(106 세포의 세포 밀도/실험 조건에서)은 본 발명의 장치들을 사용하여 테스트되었다. 이러한 실험은 다시 도 37에 도시된 24시간 인큐베이션 후 GFP 발현 T-세포들의 총 수로서 나타낸 NEON®트랜스펙션 시스템에 대한 우수성을 입증하였다. 중요하게는, DNA 플라스미드로부터 GFP의 발현은 또한 핵 내로의 유전 정보(즉, 핵산)의 효과적인 전달을 입증하였으며, 여기서 DNA는 최종 GFP 단백질로의 변환 전에 RNA로 전사된다.
b. 플랫폼 비교를 통한 mRNA의 전달
세포로의 mRNA의 전달은 또한 본 발명의 장치들을 사용하여 입증되었다. 이러한 실험은 2개의 동작 세포 밀도에서 상업적으로 소싱된 mRNA로 수행되었다. 그런 다음, 실험은 두 개의 상업적으로 입수 가능한 시스템들에 도 38a 내지 38d에 도시된 바와 같이 비교를 위해 본 발명의 장치들 2개의 상업적으로 입수가능한 시스템(Lonza 4D-NUCLEOFECTOR 및 Thermo Fisher NEON® 트랜스펙션 시스템) 및 도 38a 내지 38d에 도시된 바와 같은 비교를 위한 본 발명의 장치들)에서 완료되었다. 본 발명의 장치들은 생존 가능성, 효율, 및 수율의 관점에서 상업적으로 이용가능한 시스템들을 능가하였다. 추가로, 본 발명의 장치들의 성능은 도 38a 내지 38d에 도시된 실험 결과들에 나타난 바와 같이, 상업적으로 입수 가능한 시스템들과 달리, 세포 농도와는 무관하였다.
실시예 15 - 비일시적 페이로드의 전달
실시예 13 및 예 14에 설명된 페이로드들 각각은 전달 시에 일시적이다. 시약의 안정한 게놈 변형(즉, CRISPR 유전자 녹아웃)의 전달을 입증하기 위해, 일차 세포들에서 CRISPR 녹아웃에 대한 Cas9 리보핵단백질 복합체(RNP)를 사용하여 실험들이 수행되었다. 도 39a 내지 39d에 도시된 바와 같이, 단일 세포 기반으로 표면 수용체 염색을 통해 확인된 바와 같이 일차 T-세포에서 본 발명의 장치들을 사용한 내인성 유전자의 녹-아웃은 성공적이었고, 유세포 분석법을 사용하여 확인되었다. 본 발명의 장치들은 또한 Cas9 RNP의 전기천공을 통한 안정한 게놈 통합을 입증하기 위해 외인성 유전자의 동시 CRISPR 통합을 위해 사용될 수 있다.
실시예 16 - 단핵구(THP-1) 및 자연 살해(NK-92MI) 세포주 트랜스펙션
도 40a 및 40b는 본 발명의 장치들 및 상업용 NEON®트랜스펙션 시스템을 사용하여 THP-1 및 NK-92MI 세포로의 GFP 플라스미드 및 FITC 라벨링된 덱스트란의 전달을 각각 비교하는 막대 그래프를 도시한다. 도 40a 및 40b에서 알 수 있는 바와 같이. 본 발명의 장치들을 이용한 전기천공은 어느 하나의 페이로드를 갖는 어느 한 유형의 생존가능한 트랜스펙션된 세포들을 생산하기 위해 NEON®을 일관되게 능가한다. 추가적인 비교예로서, 도 41a 및 41b는 THP-1 단핵구를 함유하는 샘플에서 증가된 세포 생존 가능성 및 트랜스펙션 효율을 도시하며, 여기서 GFP mRNA는 NEON®트랜스펙션 시스템과 비교하여 본 발명의 장치들을 사용하여 전달되었다.
불명성 단핵구 세포주인 THP-1은 단핵구 및 대식세포 둘 다와의 비교 연구에 추가로 사용되었다. LPS(리포폴리사카라이드) 내독소에 의한 THP-1 세포의 활성화는 대식세포-유사 THP1-Mac 불멸성 세포들을 유도한다. 도 42a 내지 42c에 도시된 바와 같이, THP-1(도 42a 내지 42c) 및 THP1-Mac(도 43a 및 43b) 세포들 둘 다는 본 발명의 장치들을 사용한 GFP mRNA로 성공적으로 트랜스펙션되었다.
실시예 17 - 일차 단핵구 및 분화된 대식세포 트랜스펙션
통상적인 수단을 통해 트랜스펙션하기 위한 도전적 세포 유형인 일차 인간 단핵구 세포들은 본 발명의 장치들을 사용하여 성공적으로 트랜스펙션되었다. 도 44a 내지 44d에 도시된 바와 같이, 말초 혈액으로부터 분리된 일차 인간 단핵구는 본 발명의 장치들을 사용한 FITC 라벨링된 덱스트란 분자 및 GFP mRNA로 성공적으로 트랜스펙션되었다.
도 45a 및 45b는 본 발명의 장치들을 사용하여 GFP mRNA로 트랜스펙션된 일차 말초 혈액 단핵구에서의 특이적 마커의 발현을 도시한다. 도 45a 및 45b에 도시된 바와 같이, LPS 자극 후 CD86+ 단핵구(생존가능한 GFP+ 세포 상에서 게이팅됨)가 활성화되는(본원에서는 CD80 발현으로 나타낸) 능력은 96시간까지 유지되었으며, 이는 전기천공이 활성화 마커 CD80(도 45a) 또는 계통 마커 CD86(도 45b)의 발현에 부정적인 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
또한, 본 발명의 장치들을 사용하여 전기천공된 일차 단핵구는 도 46a 내지 46c에 나타낸 바와 같이 대식세포로 분화하는 능력을 유지하였으며, 이는 전기천공 후에 세포들이 그들의 기능을 유지함을 나타낸다. 도 47a 내지 47d에 도시된 바와 같이, 분화된 인간 대식세포들은 본 발명의 장치들을 사용하여 FITC 라벨링된 덱스트란 분자(도 47a 내지 47b) 및 GFP mRNA(도 47c 내지 47d)로 성공적으로 트랜스펙션되었다. 본 발명의 장치들을 사용하여 전기천공된 대식세포들은 M1 또는 M2 표현형(도 48a 내지 48b에 도시됨)으로 분극되어, 본 발명의 장치들을 사용하여 전기천공 후에 세포 건강 및 기능이 유지됨을 제시한다. 전기천공된 대식세포는 M1(도 48a) 또는 M2(도 48b) 표현형으로 분극되었으며, 본 발명의 장치들을 사용하여 전기천공후 72시간까지 GFP mRNA 발현을 유지시켰다.
본 발명의 장치들은 일차 단핵구의 전기천공을 위한 상업적 트랜스펙션 시스템을 능가할 수 있다. 도 49a 내지 49c에 도시된 바와 같이, 본 발명의 장치들을 사용하여 일차 단핵구 내로의 FITC 라벨링된 덱스트란의 전달은, 성공적으로 트랜스펙션된 살아있는 출력 생세포의 총 수의 현저한 증가와 함께, 일차 인간 세포들에 대한 NEON®트랜스펙션 시스템의 성능을 초과한다.
실시예 18 - 본 발명의 연속 유동 장치: 대용량 및 많은 세포 수 세포 제조
본 발명의 장치들은 진정한 연속 유동 방식으로 대용량 및 많은 세포 수의 현탁액의 전기천공을 위해 사용될 수 있다. 샘플들을 그들의 NUCLEOCUVETTETM 카트리지 또는 처리 어셈블리 내로 각각 로딩하기 위한 Lonza 4D-NUCLEOFECTORTM LV 유닛 및 Maxcyte Scalable Transfection Systems(STX, VLX, 또는 GT)와 같은 기존 기술은 유체 유동에 의존한다. 그러나, 전기 펄스 전달 동안, 세포 및 페이로드 현탁액은 정지되어 있다. 상업적으로 입수가능한 전기천공 시스템은 정적 또는 정지 세포 현탁액을 처리하며, 이는 본 발명의 장치들과 중요한 차이점이다. 본 발명의 장치들은 전계에 노출되는 동안 세포 및 페이로드 현탁액의 연속 유동을 허용한다. 구체적으로, 급속하게 유동하는 세포들은 세포막을 파괴하고 관심있는 유전적 페이로드를 내재화하기에 충분한 전계에 노출되지만, 세포 회수를 위해 그들의 성장 배지 내로 즉시 분배된다. 추가로, 전기천공 프로세스 동안 발생되는 임의의 열은, 직접적으로 회수 배지로 유동하는 샘플에 의해 촉진되는 대류 열 전달로 인해 소산된다. 이 연구는 세포 유형 및 전기천공들의 규모 둘 다에서 생성된 데이터에 대해 상당히 확장된다.
a. Jurkat 세포에서 초기 데모
본 발명의 장치들을 사용하는 단일 장치 플랫폼에 대한 연속 유동 플랫폼의 확장성을 입증하기 위해, 세포 밀도 및 전기천공 체적의 범위가 사용되었다. 이러한 실험에서, 본 발명의 확장가능한 플랫폼은 도 50a 내지 50d에 도시된 바와 같이 광범위한 Jurkat 세포 밀도에 걸쳐 동작한다는 것이 입증된다.
b. 본 발명의 플랫폼 간 비교 연구
Jurkat 및 일차 T 세포 모두에 대해 동일한 전달 조건을 사용하여 본 발명의 장치의 전기천공 성능과 본 발명의 연속 유동 전기천공 플랫폼을 비교하기 위해 후속 실험이 수행되었다. 이러한 비교 실험에서, 5백만 개의 세포들이 연속 유동 플랫폼을 통해 처리되었으며, 이는 도 51a 및 51b에 도시된 바와 같이, Jurkat 세포 및 일차 T 세포에 대한 본 발명의 단일 채널 장치들에 필적하는 결과들을 나타내었다.
c. T 세포 전기천공의 증가된 규모
전기천공이 세포 밀도에 따라 달라지는지 여부를 테스트하기 위해, 도 51a 및 51b에 설명된 전기천공 실험은 최대 1억개까지의 일차 T 세포들을 함유하는 세포 현탁액으로 확장되었다. 제1 실험에서, T 세포의 증가량은 동일한 세포 밀도에서 처리되어, 규모를 5 백만(도 51b에 도시됨)에서 최대 1억개의 T 세포들(도 52a 내지 52d)까지 증가시켰다. 그런 다음, 원하는 세포 밀도가 평가되었으며, 도 53a 내지 53d에 도시되는 바와 같이 T 세포들이 최대 100x106 세포/mL로 본 발명의 확장 가능한 플랫폼을 통해 처리될 수 있음을 나타내었다. 중요하게는, 1억개의 T 세포들의 처리는 가장 낮은 세포 밀도에서 처리된 T 세포들에 비해 5배 더 낮은 mRNA 양으로 성공적이었으며, 이는 높은 세포 밀도에서 전달되는 페이로드에 대한 잠재적인 상품 절감의 비용을 입증한다. 이 실험에서 1억개의 T 세포들에 대한 총 처리 시간은 2.4 내지 24초 범위였다.
d. Lonza 대용량(LV) 시스템과의 비교 연구
본 발명자들은 FITC-덱스트란 및 EGFP mRNA 페이로드를 갖는 일차 T 세포들을 사용하여 본 발명의 확장가능한 플랫폼과 Lonza 4D LV 시스템의 비교를 수행하였다. 실험은 5000만 개의 T 세포들로 수행되었다. 24시간에서, 세포 염색은 Lonza 처리된 세포들의 모폴로지 및 표현형이 비-처리된 세포들과 크게 상이함을 나타내었다(도 54의 유세포 분석 플롯에서 나타냄). 추가로, Lonza LV 처리된 세포들에서 관찰된 상당한 사멸 세포 집단이 있었다. 이러한 결과들은 본 발명의 연속 유동 플랫폼으로 전기천공된 T 세포들에서 발생하지 않았는데, 이는 본 발명의 연속 유동 플랫폼이 전기천공 프로세스를 통해 T 세포 모폴로지를 유지하였음을 나타낸다. 도 55에 도시된 바와 같이, 본 발명의 연속 유동 플랫폼을 사용한 총 세포 수율은 전달되는 페이로드, 예를 들어 FITC 라벨링된 덱스트란 또는 GFP mRNA에 관계없이 Lonza 4D LV 시스템보다 높다.
본 발명의 연속 유동 플랫폼은 매우 높은 밀도, 예를 들어, 10억-세포 현탁액 내로의 페이로드의 성공적인 전기천공을 나타내었다. 도 56a 및 56b에 도시된 바와 같이, 10 mL의 체적(100Х106 세포/mL의 농도) 중 10억 THP-1 세포들은 본 발명의 연속 유동 플랫폼을 사용하여 40 kDa FITC 라벨링된 덱스트란 분자로 성공적으로 트랜스펙션되었다. 도 57은 전기천공 후 최대 72시간까지 측정된, 도 56a 및 56b에 나타낸 실험에 대한, 살아있는 FITC 세포 수로서 나타낸 수율을 도시한다. 이 시점에서, FITC 양성 세포들의 수는 10억의 입력 세포 수로 인해 대략 5억이었으며, 이는 72시간에 매 2개의 입력 세포 중 1개를 변형된 세포 생성물로서 전달하는 본 발명의 연속 유동 플랫폼의 능력을 나타낸다.
예 19 - 펄스 파형, DC 전압, 고전압 - 저전압 조합 및 이들의 조합
본 발명의 장치들은 도 58a 내지 58d에 도시된 바와 같이 펄스 및 직류(DC) 전원으로 테스트되었다. 테스트된 더 높은 전압에서, 두 전원 공급 장치 모두 Jurkat 세포에서 FITC-덱스트란의 유사한 전달 효율을 나타내었다. 추가로, 고전압 및 저전압 조합들을 갖는 초기 전기천공들이 동일한 시스템에 대해 테스트되었다. 도 59a 내지 59d에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 초기에 FITC-덱스트란으로 일차 인간 T 세포 전달의 최적화를 위해 고전압 및 저전압 조합을 갖는 본 발명의 장치들을 사용하여 전기천공의 강화를 위한 변형된 파형의 사용을 분석하였다. 도 59a 내지 59d의 실험은 도 60a 내지 60d에 도시된, eGFP 형광 리포터 단백질을 코딩하는 상업적으로 입수가능한 mRNA 페이로드의 전달을 위해 반복하였다.
실시예 20 - Dynabead 전기천공
특정 T 세포 확장 프로토콜과 본 발명의 장치들의 호환성을 입증하기 위해, CD3/CD28 Dynabead로 확장된 T 세포들은 본 발명의 장치들을 사용하여 전기천공되었다. Dynabead-확장된 샘플들의 전기천공은 1 백만 개의 일차 인간 T 세포들의 현탁액에 즉시 비드 첨가(전기천공 전에 5분)로 또는 하룻밤(OVN) 처리 후에 수행되었으며, 두 시간 주기 모두 자기 비드가 존재할 때 비드가 존재하지 않을 때까지의 동등한 효율 결과를 나타내었다(도 61).
실시예 21 - 본 발명의 장치들을 통전하기 위한 외부 구조체
본 발명은 본 발명의 장치들에 끼워지고 고정되며, 본 발명의 장치들에 의한 전기천공 동안 사용 용이성, 효율 및 안전성을 향상시키도록 설계된 외부 구조체를 제공한다. 외부 구조체는 사용자들을 고전압 노출로부터 보호하고 전기천공 워크플로우 동안 사용자에게 전기 충격의 위험을 최소화하는 외부 표면들 상의 비전도성 중합체로 제조된다. 외부 구조체는 본 발명의 장치들의 현재 설계를 수용하고, 본 발명의 장치들의 장래의 설계 변형을 수용하도록 수정될 수 있다. 외부 구조체는 전원 공급 장치 또는 고전압 증폭기로부터 공급된 전기 신호를 수용하고, 외부 구조체 내에 장치를 캡슐화함으로써 본 발명의 장치들의 전극들에 신호를 재분배한다. 본 발명의 장치들의 전극의 캡슐화는 노출되는 고전압 표면들을 최소화함으로써 장치들의 사용자에게 더 안전한 작업 환경을 생성한다. 외부 구조체도 전기적 연결을 제거하지 않고도 반복적으로 실험하는 것을 쉽게 만든다. 클램쉘-스타일 힌지 및 걸쇠를 특징으로 하는 본 발명의 외부 구조체의 실시예가 도 62a 및 62b에 도시되어 있다. 도 62a에서, 62.1은 전원 공급 장치으로의 연결을 위한 양극/음극 관통 홀이다.
62.2는 전원 공급 장치와의 연결들을 위한 제2 양극/음극 관통홀이다. 62.3은 클램쉘-스타일 힌지이다. 예를 들어, 힌지는 리빙 힌지일 수 있고, 따라서 외부 구조체가 그 자체 상에 폐쇄되고 잠금 메커니즘과 체결할 수 있게 한다. 이러한 인클로저 메커니즘은 외부 구조체가 본 발명의 장치의 전극들을 에워싸도록 하여, 양 장치들 사이의 전기적 콘택을 보장한다. 62.4는 전기천공 동안 외부 구조체의 인클로져를 보장하기 위해 사용되는 래치 또는 다른 기계적 파스너이다. 이러한 설계는 또한 래칭 메커니즘을 일시적으로 체결하게 함으로써 외부 구조체가 재사용될 수 있게 한다. 62.5는 외부 구조체와 본 발명의 장치들 사이의 전극 연결들을 왜곡하는 임의의 오프셋을 최소화하기 위해 외부 구조체들이 정확한 정렬로 접히는 것을 보장하는 정렬 핀이다. 62.6은 본 발명의 장치의 전극을 위한 리세스이다. 62.7 및 62.8은 각각 본 발명의 장치의 본체 및 본 발명의 장치의 전기천공 구역을 정의하는 제1 및 제2 전극이다.
사용시, 본 발명의 장치들에 연결된 외부 구조체는 외부 구조체 없이 본 발명의 장치들을 사용하여 전기천공을 수행할 때 트랜스펙션 효율 또는 생존 가능성에서 상당한 손실을 보이지 않았다. 도 63a 내지 63b에 도시된 바와 같이, FITC 라벨링된 덱스트란으로 트랜스펙션된 THP-1 단핵구의 생존 가능성 및 효율은 장치의 전극들 위에 외부 구조쳬를 갖거나 갖지 않는 본 발명의 장치들을 사용하여 대략 동일하였다.
실시예 22 - 일회용 장치용 제조 재료
본 발명의 장치는 Formlabs(Somerville, MA USA)에 의해 제조되고 판매되는 수지 제형으로 구성된다. 특히, 본 발명의 장치들은 "Clear 수지" 또는 "Formlabs"로 시판되는 "Durable 수지"로 제조된다. Durable 수지와 Clear 수지 간의 주요 차이점은 기계적 특성들이다. Clear 수지는 기계적 거동의 측면에서 더 취성이며, Durable 수지는 기계적 성능이 종래의 피펫 팁이 제조되는 재료인 폴리프로필렌의 그것과 더 유사할 정도로 더 큰 연성을 갖는다.
본 발명의 장치들은 프로토타이핑 목적을 위해 스테레오리소그래피 기술을 사용하여 3D 인쇄된다. 사출 성형과 같은 대규모 처리를 위해, 본 발명의 장치는 폴리프로필렌의 기계적 특성을 밀접하게 시뮬레이션하는 Durable 수지와 같은 다른 수지로부터 제조될 것이다. 수지가 전기천공에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위해, 도 64a 및 64b는 Formlabs' Clear 수지 및 Durable 수지로 제조된 본 발명의 장치들을 사용하여 THP-1 단핵구 내로의 FITC 라벨링된 덱스트란의 전달을 도시한다. 재료의 선택은 본 발명의 장치들의 성능에 있어서 상당한 변화를 초래하지 않았다.
실시예 23 - 자동화된 트랜스펙션 대 수동 (전자) 샘플 구동
본 발명의 장치들은 인간 세포들의 신속하고, 높은 처리량, 및 자동화된 조작을 가능하게 하였다. 이 기술의 응용은 세포 생리학에서의 근본적인 연구로부터 세포 요법을 위한 새로운 타겟의 발견에 이르기까지 광범위하다. 세포 치료에서의 응용은 단독으로 성장하는 수십억 달러 산업에 기여할 수 있다. 연구 규모에서의 유전자 조작에서의 현재 기술의 상태는 수동으로 집중적이고 자동화된 액체 취급 시스템과 통합하기 어렵다. 본 발명의 장치들은 액체 취급 플랫폼의 다양한 어레이에 용이하게 통합될 수 있다. 이러한 통합은 학계와 산업 연구자들이 유전학과 관련된 다양한 질문들을 빠르게 탐색할 수 있게 해줄 것이다. 본 발명의 장치들은 현재 기술 상태보다 수천 배 더 빠르게 연구-규모 세포 공학을 용이하게 하는 잠재력을 가지며, 이는 건강 관리 및 기초 생물학적 과학에서 생명 변화 발견으로 이어진다.
본원에서 설명된 T-세포에 대한 실험은 본래 본 발명의 일회용 장치들로 수행되었다. 본 발명의 장치들을 통합하는 자동화된 시스템에 의해, 트랜스펙션은 능률화되고 고-처리량 방식으로 구성될 수 있다. 8개의 독립적으로 제어된 주사기는 본 발명의 단일 사용 장치들 내로 세포 현탁액을 구동하도록 프로그래밍되었다. 100 μL 샘플은 각 장치의 전기천공 구역 위로 흡인되었고, 회수 성장 배지 내로의 활성 분배 동안 통전되었다. 샘플들을 구동하기 위해 공기-변위(수동 전자 피펫) 또는 유체-변위(자동화 시스템)를 사용한 트랜스펙션의 3가지 자동화된 방법을 비교하였다. 결과적인 생존 가능성은 평가된 3개의 시스템에 대한 림프구 게이트 방법론을 사용할 때 높은 레벨(>90%)으로 유지되었다(도 65a 및 65b에 도시됨). 그러나, 트랜스펙션 효율을 살펴보면, 유량을 정밀하게 제어하기 위해 유체 변위 기술을 적용한 자동화 시스템이 매뉴얼보다 우수하다는 것은 분명하다.
실시예 24 - 일차 T 세포 내로의 mRNA 시약의 공동 전달
T 세포 내로의 2개의 mRNA 유형의 공동-전달은 본 발명의 장치들을 사용하여 평가되었다. 이러한 실험은 GFP 또는 mCherry를 코딩하는 2개의 상업적으로 소싱된 mRNA로 수행되였다. 실험은 병렬(동일 일) 또는 직렬(2일 간격)로 완료되었다. 본 발명의 장치들은 도 66a 내지 66e에서 관찰된 GFP 및 mCherry 발현에 의해 입증된 바와 같이 mRNA 둘 다를 성공적으로 전달할 수 있었다.
실시예 25 - 혼합 집단 말초 혈액 단핵구 세포의 트랜스펙션
일차 인간 혼합 세포 집단(즉, PBMC) 내로의 mRNA 전달은 또한 본 발명의 장치들을 사용하여 입증되었다. 이러한 실험은 GFP를 코딩하는 상업적으로 소싱된 mRNA로 수행된 후, 표면 수용체의 표현형 염색을 수행하여 특정 세포 집단을 식별하였다. 도 67A에 도시된 바와 같이, 비접촉(CD45RA+) 및 기억(CD45RO+) T 세포들 둘 다로의 mRNA의 전달이 달성되었다. 추가로, 도 67b에 도시된 바와 같이, 혼합 집단으로부터 B 세포(CD19+) 및 자연 살해 NK 세포(CD56+)로의 mRNA의 전달이 달성되었다.
실시예 26 - 일차 부착성 iPSC의 mRNA 트랜스펙션
유도만능줄기세포(iPSCs)는 본 발명의 장치(FLOWFECTTM)를 이용하여 현탁액에서 eGFP-mRNA로 절개되었다. 형광 현미경을 사용하여 양성 트랜스펙션의 표시에 대해 트랜스펙션 후 24시간에 세포가 평가되었다. 이미지들은 GFP 및 eGFP-mRNA의 부착, 세포 모폴로지, 및 발현을 포착하기 위한 명시장의 오버레이 이미지로서 묘사된다(10x 배율로 나타낸 대표적인 이미지들; 도 69a). 세포들은 또한 생존가능한 (7AAD-) 및 양성으로 트랜스펙션된 (GFP+7AAD-) 세포들의 비율에 대해 유세포 분석기를 통해 트랜스펙션 후 96시간에 평가되었다(대표적인 데이터는 평균 ± SEM으로 도시됨; 도 69b 및 69c).
실시예 27 - 일차 인간 자연 살해 세포의 mRNA 트랜스펙션
분리된 자연 살해 세포(CD56+)는 GFP를 코딩하는 mRNA로 전기천공되었다. 24시간 후, 세포들은 생존 가능성 및 효율에 대해 분석되었다. NK 수 및 생존 가능성은 도 70a 내지 70b에 도시된다. 본 발명의 장치들은 도 70c에서 관찰된 ~95% GFP 발현에 의해 입증된 바와 같이 mRNA를 성공적으로 전달될 수 있었다. 24시간에 살아있는 비처리된 세포들과 비교하여 살아있는 GFP+세포의 총 수율은 도 70d에 도시된 바와 같이 ~57%였다.
실시예 28 - 플랫폼 간 비교
본 발명의 장치, ThermoFisher's Neon 트랜스펙션 플랫폼(2100V/1 펄스/20ms), 또는 Lonza 4D-Nucleofector(프로그램: EO115)를 사용하여, 열거된 바와 같은 제조자 추천 설정을 사용하여 인간 일차 T 세포들이 리포터 분자로 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 후 24시간에 생존 가능성 및 트랜스펙션 효율이 도 71a 및 71b에 도시된다. 동일한 설정을 사용하여, 인간 일차 T 세포들을 페이로드 없이 처리되었으며, 처리 후 6시간 유전자 조절장애에 대해 평가되었다(도 71c).
실시예 29 - 전압 - 유량 프로파일
인간 일차 T 세포들은 다중 유량 및 적용된 에너지 조합을 사용하여 GFP 리포터 mRNA로 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 후 24시간에서 반응 당 상대적인 세포 수, 생존 가능성(7AAD- 세포 퍼센트), 효율(살아있는 GFP+ 세포 퍼센트), 및 수율 세포 수(살아있는 GFP+ 세포 수)에 대한 히트맵이 도 72a 내지 72d 및 도 73a 내지 73d에 도시되며, 이는 다양한 Vrms(y 축) 및 유량(x 축)의 함수로서 나타낸다.
도 74는 다양한 인가된 에너지(Vrms2/R) 및 유량에 걸친 살아있는 세포 수율을 도시한다. 인간 일차 T 세포를 다중 유량(FR) 및 인가된 에너지 조합(VV)을 사용하여 FITC 덱스트란으로 트랜스펙션되었다. 상이한 유량에서 동일한 인가된 에너지가 상이한 수율 수(살아있는 FITC+ 세포 수)를 초래함을 보여주는 밀도 플롯이 도시된다.
수많은 실시예들
본원에 설명된 기술의 일부 실시예들은 다음의 번호가 부여된 문단들 중 어느 하나에 따라 정의될 수 있다:
1. 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 장치에 있어서, 상기 장치는,
(a) 제1 유입구, 제1 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
(b) 제2 유입구, 제2 유출구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및
(c) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 갖는, 상기 전기천공 구역을 포함하며,
상기 제1 유출구, 상기 전기천공 구역 및 상기 제2 유입구는 유체 연통되고, 상기 조성물은 상기 전기천공 구역에 진입할 때 상기 유체 내에 현탁된 상기 복수의 세포들로 전달된다.
2. 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 장치에 있어서,
(a) 제1 유입구 및 제1 유출구를 포함하는 제1 전극으로서, 상기 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 포함하는, 상기 제1 전극;
(b) 제2 유입구 및 제2 유출구를 포함하는 제2 전극으로서, 상기 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 포함하는, 상기 제2 전극; 및
(c) 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차를 인가하는 것은 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함하며,
유체 내에 현탁된 복수의 세포들은 전기천공 구역에 들어갈 때 전기천공된다.
3. 문단 1 또는 문단 2의 장치에 있어서, 진입 구역에 유체 연결되는 제1 저장소를 더 포함한다.
4. 문단 1 또는 문단 2의 장치에 있어서, 회수 구역에 유체 연결된 제2 저장소를 더 포함한다.
5. 문단 1 또는 문단 2의 장치에 있어서, 전기천공 구역의 단면은 원형, 원통형, 타원형, 다각형, 별, 평행사변형, 사다리꼴 및 불규칙성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
6. 문단 1 또는 문단2의 장치에 있어서, 진입 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다.
7. 문단 1 또는 문단 2의 장치에 있어서, 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 최대 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다.
8. 문단 1 또는 문단 2의 장치에 있어서, 전기천공 구역의 단면 치수는 0.005 mm 내지 50 mm이다.
9. 문단 1 또는 문단 2의 장치에 있어서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 50 mm이다.
10. 문단 1 또는 문단 2의 장치에 있어서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 단면 치수는 0.01 mm 내지 500 mm이다.
11. 문단 1 또는 문단 2의 장치에 있어서, 진입 구역, 회수 구역 또는 전기천공 구역 중 어느 것도 유체 내에 현탁된 임의의 복수의 세포들 중 어느 하나의 단면 치수를 감소시키지 않는다.
12. 문단 1 또는 문단 2의 장치에 있어서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 세포 표현형의 기준선 측정치에 비해 0% 내지 약 25% 표현형 변화를 갖는다.
13. 문단 1 또는 문단 2의 장치에 있어서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 표현형 변화를 갖지 않는다.
14. 문단 1 또는 문단 2의 장치에 있어서, 장치는 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징을 갖는 외부 구조체를 더 포함한다.
15. 문단 14의 장치에 있어서, 외부 구조체는 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전기 입력 및 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전기 입력을 포함한다.
16. 문단 14 또는 문단 15의 장치에 있어서, 외부 구조체는 장치에 통합된다.
17. 문단 14 또는 문단 15의 장치에 있어서, 외부 구조체는 장치에 탈착 가능하게 연결된다.
18. 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 장치에 있어서,
(a) 제1 유입구 및 제1 유출구를 포함하는 제1 전극으로서, 상기 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 포함하는, 상기 제1 전극;
(b) 제2 유입구 및 제2 유출구를 포함하는 제2 전극으로서, 상기 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 포함하는, 상기 제2 전극;
(c) 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 유입구와 제1 유출구 사이에서 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구;
(d) 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 유입구와 제2 유출구 사이에서 제2 전극과 교차하는, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구;
(e) 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 진입 구역의 제1 유출구 및 회수 구역의 제2 유입구에 유체 연결되며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차를 인가하는 것은 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함하며,
조성물은 전기천공 구역에 들어갈 때 유체 내에 현탁된 복수의 세포들로 전달된다.
19. 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 장치에 있어서,
(a) 제1 유입구 및 제1 유출구를 포함하는 제1 전극으로서, 상기 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 포함하는, 상기 제1 전극;
(b) 제2 유입구 및 제2 유출구를 포함하는 제2 전극으로서, 상기 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 포함하는, 상기 제2 전극;
(c) 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 유입구와 제1 유출구 사이에서 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구;
(d) 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 유입구와 제2 유출구 사이에서 제2 전극과 교차하는, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구;
(e) 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 진입 구역의 제1 유출구 및 회수 구역의 제2 유입구에 유체 연결되며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들 사이에 전위차를 인가하는 것은 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함하며,
유체 내에 현탁된 복수의 세포들은 전기천공 구역에 들어갈 때 전기천공된다.
20. 문단 18 또는 문단 19의 장치에 있어서, 진입 구역에 유체 연결되는 제1 저장소를 더 포함한다.
21. 문단 18 또는 문단 19의 장치에 있어서, 회수 구역에 유체 연결된 제2 저장소를 더 포함한다.
22. 문단 18 또는 문단 19의 장치에 있어서, 제3 유입구 및 제3 유출구에 유체 연결된 제3 저장소를 더 포함한다.
23. 문단 18 또는 문단 19의 장치에 있어서, 제4 유입구 및 제4 유출구에 유체 연결된 제4 저장소를 더 포함한다.
24. 문단 18 또는 문단 19의 장치에 있어서, 전기천공 구역의 단면은 원형, 타원형, 다각형(예를 들어, 규칙적인 다각형, 불규칙적인 다각형), 별, 평행사변형, 사다리꼴 및 불규칙성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
25. 문단 18 또는 문단19의 장치에 있어서, 진입 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다.
26. 문단 18 또는 문단 19의 장치에 있어서, 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다.
27. 문단 18 또는 문단 19의 장치에 있어서, 전기천공 구역의 단면 치수는 0.005 mm 내지 50 mm이다.
28. 문단 18 또는 문단 19의 장치에 있어서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 50 mm이다.
29. 문단 18 또는 문단 19의 장치에 있어서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 단면 치수는 0.1 mm 내지 5 mm이다.
30. 문단 18 또는 문단 19의 장치에 있어서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나는 다공성이다.
31. 문단 18 또는 문단 19의 장치에 있어서, 진입 구역, 회수 구역 또는 전기천공 구역 중 어느 것도 유체 내에 현탁된 임의의 복수의 세포들 중 어느 하나의 단면 치수를 감소시키지 않는다.
32. 문단 18 또는 문단 19의 장치에 있어서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 세포 표현형의 기준선 측정치에 비해 0% 내지 약 25% 표현형 변화를 갖는다.
33. 문단 18 또는 문단 19의 장치에 있어서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 표현형 변화를 갖지 않는다.
34. 문단 18 또는 문단 19의 장치에 있어서, 장치는 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징을 갖는 외부 구조체를 더 포함한다.
35. 문단 34의 장치에 있어서, 외부 구조체는 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전기 입력 및 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전기 입력을 포함한다.
36. 문단 34 또는 문단 35의 장치에 있어서, 외부 구조체는 장치에 통합된다.
37. 문단 34 또는 문단 35의 장치에 있어서, 외부 구조체는 장치에 탈착 가능하게 연결된다.
38. 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 시스템에 있어서,
(a) 장치로서,
(i) 제1 유입구 및 제1 유출구를 포함하는 제1 전극으로서, 상기 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 포함하는, 상기 제1 전극;
(ii) 제2 유입구 및 제2 유출구를 포함하는 제2 전극으로서, 상기 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 포함하는, 상기 제2 전극; 및
(iii) 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차를 인가하는 것은 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함하는, 상기 장치;
(b) 전위 소스로서, 상기 장치의 제1 및 제2 전극들은 전위 소스와 탈착 가능하게 연결되는, 상기 전위 소스를 포함하며,
조성물은 전기천공 구역에 들어갈 때 유체 내에 현탁된 복수의 세포들로 전달된다.
39. 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 시스템에 있어서,
(a) 장치로서,
(i) 제1 유입구 및 제1 유출구를 포함하는 제1 전극으로서, 상기 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 포함하는, 상기 제1 전극;
(ii) 제2 유입구 및 제2 유출구를 포함하는 제2 전극으로서, 상기 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 포함하는, 상기 제2 전극; 및
(iii) 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차를 인가하는 것은 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함하는, 장치;
(b) 전위 소스로서, 상기 장치의 제1 및 제2 전극들은 전위 소스와 탈착 가능하게 연결되는, 상기 전위 소스를 포함하며,
유체 내에 현탁된 복수의 세포들은 전기천공 구역에 들어갈 때 전기천공된다.
40. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 세포 표현형의 기준선 측정치에 비해 0% 내지 약 25% 표현형 변화를 갖는다.
41. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 표현형 변화를 갖지 않는다.
42. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 장치는 상기 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징을 갖는 외부 구조체를 더 포함한다.
43. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 외부 구조체는 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전기 입력 및 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전기 입력을 포함한다.
44. 문단 43의 시스템에 있어서, 전위 소스는 외부 구조체의 제1 및 제2 전기 입력들에 탈착 가능하게 연결된다.
45. 문단 44의 시스템에 있어서, 제1 또는 제2 전기 입력들과 전위 소스 사이의 탈착 가능한 연결은 클램프, 클립, 스프링, 시스, 와이어 브러시 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
46. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 외부 구조체는 장치에 통합된다.
47. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 외부 구조체는 장치에 탈착 가능하게 연결된다.
48. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 전기천공은 실질적으로 비-열적 가역 전기천공이다.
49. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 전기천공은 실질적으로 비-열적 비가역 전기천공이다.
50. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 전기천공은 실질적으로 열적 비가역 전기천공이다.
51. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 장치와 전위 소스 사이의 탈착 가능한 연결은 클램프, 클립, 스프링, 시스, 와이어 브러시 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
52. 문단 51의 시스템에 있어서, 장치와 전위 소스 사이의 탈착 가능한 연결은 스프링이다.
53. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 진입 구역에 유체 연결되는 제1 저장소를 더 포함한다.
54. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 회수 구역에 유체 연결된 제2 저장소를 더 포함한다.
55. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 전기천공 구역의 단면은 원형, 타원형, 다각형, 별, 평행사변형, 사다리꼴 및 불규칙성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
56. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 진입 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다.
57. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다.
58. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 진입 구역, 회수 구역 또는 전기천공 구역 중 어느 것도 유체 내에 현탁된 임의의 복수의 세포들 중 어느 하나의 단면 치수를 감소시키지 않는다.
59. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 전기천공법의 듀티 사이클은 0.001% 내지 100%이다.
60. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 전기천공 구역의 단면 치수는 0.005 mm 내지 50 mm이다.
61. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 50 mm이다.
62. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 단면 치수는 0.1 mm 내지 5 mm이다.
63. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 진입 구역에 유체 연결된 유체 전달 소스를 더 포함하며, 유체 전달 소스는 진입 구역을 통해 회수 구역으로 유체 내에 현탁된 복수의 세포들을 전달하도록 구성된다.
64. 문단 63의 시스템에 있어서, 유체 전달 소스로부터의 전달 속도는 0.001 mL/분 내지 1,000 mL/분이다.
65. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 중 어느 하나의 체류 시간은 0.5 ms 내지 50 ms이다.
66. 문단 38 또는 문단 39의 시스템에 있어서, 전압 펄스들을 제1 및 제2 전극들에 전달하여 제1 전극과 제2 전극 사이에 전위차를 생성하기 위해 전위 소스에 동작 가능하게 결합된 컨트롤러를 더 포함한다.
67. 문단 66의 시스템에 있어서, 전압 펄스들은 0.01 kV 내지 3 kV의 진폭을 갖는다.
68. 문단 66의 시스템에 있어서, 전압 펄스들은 0.01 ms 내지 1,000 ms의 지속시간을 갖는다.
69. 문단 66의 시스템에 있어서, 전압 펄스들은 1 Hz 내지 50,000 Hz의 주파수에서 제1 및 제2 전극들에 인가된다.
70. 문단 66의 시스템에서, 전압 펄스의 파형은 DC, 정사각형, 펄스, 바이폴라, 사인, 램프, 비대칭 바이폴라, 임의적, 및 이들의 임의의 중첩 또는 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
71. 문단 66의 시스템에 있어서, 전압 펄스들로부터 생성된 전계는 1 V/cm 내지 50,000 V/cm의 크기를 갖는다.
72. 문단 38 내지 71 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 액체는 0.001 mS/cm 내지 500 mS/cm의 전도도를 갖는다.
73. 문단 36 내지 68 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 장치를 수용하도록 구성된 하우징을 더 포함한다.
74. 문단 73의 시스템에 있어서, 하우징은 하우징의 온도를 증가 또는 감소시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함한다.
75. 문단 74의 시스템에 있어서, 열 컨트롤러는 가열 블록, 액체 흐름, 배터리 전력 히터, 및 박막 히터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 가열 요소이다.
76. 문단 74의 시스템에 있어서, 열 컨트롤러는 액체 유동, 증발 냉각기, 및 펠티에 장치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 냉각 요소이다.
77. 문단 38 내지 76 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 복수의 세포 천공 장치들을 더 포함한다.
78. 문단 77의 시스템에 있어서, 복수의 외부 구조체들을 더 포함한다.
79. 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 시스템에 있어서,
(a) 장치로서,
(i) 제1 유입구 및 제1 유출구를 포함하는 제1 전극으로서, 상기 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 포함하는, 상기 제1 전극;
(ii) 제2 유입구 및 제2 유출구를 포함하는 제2 전극으로서, 상기 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 포함하는, 상기 제2 전극;
(iii) 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 유입구와 제1 유출구 사이에서 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구;
(iv) 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 유입구와 제2 유출구 사이에서 제2 전극과 교차하는, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구;
(v) 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 진입 구역의 제1 유출구 및 회수 구역의 제2 유입구에 유체 연결되며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차를 인가하는 것은 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함하는, 상기 장치; 및
(b) 전위 소스로서, 상기 장치의 제1 및 제2 전극들은 전위 소스와 탈착 가능하게 연결되는, 상기 전위 소스를 포함하며,
조성물은 전기천공 구역에 들어갈 때 유체 내에 현탁된 복수의 세포들로 전달된다.
80. 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 시스템에 있어서,
(a) 장치로서,
(i) 제1 유입구 및 제1 유출구를 포함하는 제1 전극으로서, 상기 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 포함하는, 상기 제1 전극;
(ii) 제2 유입구 및 제2 유출구를 포함하는 제2 전극으로서, 상기 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 포함하는, 상기 제2 전극;
(iii) 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구는 제1 유입구와 제1 유출구 사이에서 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구;
(iv) 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구는 제2 유입구와 제2 유출구 사이에서 제2 전극과 교차하는, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구;
(v) 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 진입 구역의 제1 유출구 및 회수 구역의 제2 유입구에 유체 연결되며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차를 인가하는 것은 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함는, 상기 장치; 및
(b) 전위 소스로서, 상기 장치의 제1 및 제2 전극들은 전위 소스와 탈착 가능하게 연결되는, 상기 전위 소스를 포함하며,
유체 내에 현탁된 복수의 세포들은 전기천공 구역에 들어갈 때 전기천공된다.
81. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 세포 표현형의 기준선 측정치에 비해 0% 내지 약 25% 표현형 변화를 갖는다.
82. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 표현형 변화를 갖지 않는다.
83. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 장치는 상기 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징을 갖는 외부 구조체를 더 포함한다.
84. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 외부 구조체는 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전기 입력 및 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전기 입력을 포함한다.
85. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 전위 소스는 외부 구조체의 제1 및 제2 전기 입력들에 탈착 가능하게 연결된다.
86. 문단 85의 시스템에 있어서, 제1 또는 제2 전기 입력들과 전위 소스 사이의 탈착 가능한 연결은 클램프, 클립, 스프링, 시스, 와이어 브러시 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
87. 문단 83의 시스템에 있어서, 외부 구조체는 장치에 통합된다.
88. 문단 83의 시스템에 있어서, 외부 구조체는 장치에 탈착 가능하게 연결된다.
89. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 전기천공은 실질적으로 비-열적 가역 전기천공이다.
90. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 전기천공은 실질적으로 비-열적 비가역 전기천공이다.
91. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 전기천공은 실질적으로 열적 비가역 전기천공이다.
92. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 진입 구역에 유체 연결되는 제1 저장소를 더 포함한다.
93. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 회수 구역에 유체 연결된 제2 저장소를 더 포함한다.
94. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 제3 유입구 및 제3 유출구에 유체 연결된 제3 저장소를 더 포함한다.
95. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 제4 유입구 및 제4 유출구에 유체 연결된 제4 저장소를 더 포함한다.
96. 문단 79 또는 문단 80의 장치에 있어서, 전기천공 구역의 단면은 원형, 타원형, 다각형, 별, 평행사변형, 사다리꼴 및 불규칙성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
97. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 진입 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다.
98. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다.
99. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 진입 구역, 회수 구역 또는 전기천공 구역 중 어느 것도 유체 내에 현탁된 임의의 복수의 세포들 중 어느 하나의 단면 치수를 감소시키지 않는다.
100. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 전기천공법의 듀티 사이클은 0.001% 내지 100%이다.
101. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 전기천공 구역의 단면 치수는 0.005 mm 내지 50 mm이다.
102. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 50 mm이다.
103. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 단면 치수는 0.1 mm 내지 5 mm이다.
104. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 진입 구역에 유체 연결된 유체 전달 소스를 더 포함하며, 유체 전달 소스는 진입 구역을 통해 회수 구역으로 유체 내에 현탁된 복수의 세포들을 전달하도록 구성된다.
105. 문단 104의 시스템에 있어서, 유체 전달 소스로부터의 전달 속도는 0.001 mL/분 내지 1,000 mL/분이다.
106. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 중 어느 하나의 체류 시간은 0.5ms 내지 50ms이다.
107. 문단 79 또는 문단 80의 시스템에 있어서, 전압 펄스들을 제1 및 제2 전극들에 전달하여 제1 전극과 제2 전극 사이에 전위차를 생성하기 위해 전위 소스에 동작 가능하게 결합된 컨트롤러를 더 포함한다.
108. 문단 107의 시스템에 있어서, 전압 펄스들은 0.01 kV 내지 3 kV의 진폭을 갖는다.
109. 문단 107의 시스템에 있어서, 전압 펄스들은 0.01ms 내지 1,000ms의 지속시간을 갖는다.
110. 문단 107의 시스템에 있어서, 전압 펄스들은 1 Hz 내지 50,000 Hz의 주파수에서 제1 및 제2 전극들에 인가된다.
111. 문단 107의 시스템에서, 전압 펄스의 파형은 DC, 정사각형, 펄스, 바이폴라, 사인, 램프, 비대칭 바이폴라, 임의적, 및 이들의 임의의 중첩 또는 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
112. 문단 107의 시스템에 있어서, 전압 펄스들로부터 생성된 전계는 1 V/cm 내지 50,000 V/cm의 크기를 갖는다.
113. 문단 79 내지 문단 80의 시스템에 있어서, 액체는 0.001 mS/cm 내지 500 mS/cm의 전도도를 갖는다.
114. 문단 79 내지 113 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 복수의 세포 천공 장치들을 더 포함한다.
115. 문단 114의 시스템에 있어서, 복수의 외부 구조체들을 더 포함한다.
116. 유체에 현탁된 복수의 세포들 중 적어도 일부 내로의 조성물의 전기-기계적 전달 방법에 있어서, 상기 방법은,
(a) 장치를 제공하는 단계로서, 상기 장치는,
(i) 제1 유입구 및 제1 유출구를 포함하는 제1 전극으로서, 상기 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 포함하는, 상기 제1 전극;
(ii) 제2 유입구 및 제2 유출구를 포함하는 제2 전극으로서, 상기 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 포함하는, 상기 제2 전극; 및
(iii) 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되며, 제1 및 제2 전극들에 전위차를 인가하는 것은 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함하는, 상기 제공하는 단계;
(b) 제1 및 제2 전극들을 통전시켜 제1 및 제2 전극들 사이에 전위차를 생성하여, 전기천공 구역에서 전계를 생성하는 단계; 및
(c) 장치의 전기천공 구역의 전계를 통해 조성물과 함께 유체에 현탁된 복수의 세포들을 통과시키는 단계를 포함하며,
전기천공 구역에서 전계를 통한 조성물과 함께 유체에 현탁된 복수의 세포들의 유동은 복수의 세포들의 일시적 투과성을 증가시키고, 이에 의해 조성물을 복수의 세포들의 적어도 일부에 도입한다.
117. 유체에 현탁된 복수의 세포들 중 적어도 일부 내로 조성물을 전기천공하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은,
(a) 장치를 제공하는 단계로서, 상기 장치는,
(i) 제1 유입구 및 제1 유출구를 포함하는 제1 전극으로서, 상기 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 포함하는, 상기 제1 전극;
(ii) 제2 유입구 및 제2 유출구를 포함하는 제2 전극으로서, 상기 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 포함하는, 상기 제2 전극; 및
(iii) 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되며, 제1 및 제2 전극들에 전위차를 인가하는 것은 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함하는, 상기 제공하는 단계;
(b) 제1 및 제2 전극들을 통전시켜 제1 및 제2 전극들 사이에 전위차를 생성하여, 전기천공 구역에서 전계를 생성하는 단계; 및
(c) 장치의 전기천공 구역의 전계를 통해 조성물과 함께 유체에 현탁된 복수의 세포들을 통과시키는 단계를 포함하며,
전기천공 구역에서 전계를 통한 조성물과 함께 유체에 현탁된 복수의 세포들의 유동은 복수의 세포들의 일시적 투과성을 증가시키고, 이에 의해 복수의 세포들 중 적어도 일부 내로 조성물을 전기천공한다.
118. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 중 일부의 건강을 평가하는 단계를 더 포함한다.
119. 문단 118의 방법에 있어서, 평가하는 단계는 유체 내에 현탁된 복수의 세포들의 일부의 생존 가능성을 측정하는 단계를 포함한다.
120. 문단 118의 방법에 있어서, 평가하는 단계는 유체 내에 현탁된 복수의 세포들의 일부의 트랜스펙션 효율을 측정하는 단계를 포함한다.
121. 문단 118의 방법에 있어서, 평가하는 단계는 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 중 일부의 세포 회수율을 측정하는 단계를 포함한다.
122. 문단 118의 방법에 있어서, 평가하는 단계는 세포 표면 마커 발현의 유세포측정 분석을 포함한다.
123. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 복수의 세포들은 전기천공 구역을 빠져나갈 때 세포 표현형의 기준선 측정치에 비해 0% 내지 약 25% 표현형 변화를 갖는다.
124. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 복수의 세포들은 장치의 전기천공 구역을 빠져나갈 때 표현형 변화를 갖지 않는다.
125. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 전기천공은 실질적으로 비-열적 가역 전기천공이다.
126. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 전기천공은 실질적으로 비-열적 비가역 전기천공이다.
127. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 전기천공은 실질적으로 열적 비가역 전기천공이다.
128. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 장치의 전기천공 구역은 균일한 단면 치수를 갖는다.
129. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 장치의 전기천공 구역은 불균일한 단면 치수를 갖는다.
130. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 장치는 복수의 전기천공 구역들을 더 포함한다.
131. 문단 130의 방법에 있어서, 복수의 전기천공 구역들 각각은 균일한 단면을 갖는다.
132. 문단 130의 방법에 있어서, 복수의 전기천공 구역들 각각은 균일하지 않은 단면을 갖는다.
133. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 부분 c)는 양압의 인가에 의해 일어난다.
134. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 샘플 내의 복수의 세포들의 세포들은 포유동물 세포, 진핵생물, 합성 세포, 인간 세포, 동물 세포, 식물 세포, 일차 세포, 세포주, 현탁 세포, 부착 세포, 면역 세포, 줄기 세포, 혈액 세포, 적혈구, T 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포, 항원 제시 세포(APC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 대식세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 인간 배아 신장(HEK-293) 세포, 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
135. 문단 134의 방법에 있어서, 세포들은 Jurkat 세포들을 포함한다.
136. 문단 134의 방법에 있어서, 세포들은 일차 인간 T-세포들을 포함한다.
137. 문단 134의 방법에 있어서, 세포들은 THP-1 세포들을 포함한다.
138. 문단 134의 방법에 있어서, 세포들은 일차 인간 대식세포들을 포함한다.
139. 문단 134의 방법에 있어서, 세포들은 일차 인간 단핵구들을 포함한다.
140. 문단 134의 방법에 있어서, 세포들은 자연 살해 세포들을 포함한다.
141. 문단 134의 방법에 있어서, 세포들은 인간 배아 신장 세포들을 포함한다.
142. 문단 134의 방법에 있어서, 세포들은 B-세포들을 포함한다.
143. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 조성물은 치료제, 비타민, 나노입자, 하전 분자, 비하전 분자, DNA, RNA, CRISPR-Cas 복합체, 단백질, 바이러스, 중합체, 리보핵단백질(RNP) 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함한다.
144. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 조성물은 0.0001 ㎍/mL 내지 1000 ㎍/mL의 액체 내의 농도를 갖는다.
145. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 진입 구역에 유체 연결되는 제1 저장소를 더 포함한다.
146. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 회수 구역에 유체 연결된 제2 저장소를 더 포함한다.
147. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 전기천공 구역의 단면은 원형, 타원형, 다각형, 별, 평행사변형, 사다리꼴 및 불규칙성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
148. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 진입 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다.
149. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 회수 구역의 단면 치수는 전기천공 구역의 단면 치수의 0.01% 내지 100,000%이다.
151. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 진입 구역, 회수 구역 또는 전기천공 구역 중 어느 것도 유체 내에 현탁된 임의의 복수의 세포들 중 어느 하나의 단면 치수를 감소시키지 않는다.
151. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 전기천공법의 듀티 사이클은 0.001% 내지 100%이다.
152. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 전기천공 구역의 단면 치수는 0.005 mm 내지 50 mm이다.
153. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 전기천공 구역의 길이는 0.005 mm 내지 50 mm이다.
154. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 제1 전극 또는 제2 전극 중 어느 하나의 단면 치수는 0.1 mm 내지 5 mm이다.
155. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 장치는 상기 장치의 제1 전극, 제2 전극, 및 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징을 갖는 외부 구조체를 더 포함한다.
156. 문단 155의 방법에 있어서, 외부 구조체는 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전기 입력 및 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전기 입력을 포함한다.
157. 문단 155의 방법에 있어서, 외부 구조체는 장치에 통합된다.
158. 문단 155의 방법에 있어서, 외부 구조체는 장치에 탈착 가능하게 연결된다.
159. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 단계 c)의 0.001 mL/분 내지 1,000 mL/분이다.
160. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 중 어느 하나의 체류 시간은 0.5 ms 내지 50 ms이다.
161. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 전압 펄스들을 제1 및 제2 전극들에 전달하여 제1 전극과 제2 전극 사이에 전위차를 생성하기 위해 전위 소스에 동작 가능하게 결합된 컨트롤러를 더 포함한다.
162. 문단 161의 방법에 있어서, 전압 펄스들은 0.01 kV 내지 3 kV의 진폭을 갖는다.
163. 문단 161의 방법에 있어서, 전압 펄스들은 0.01 ms 내지 1,000 ms의 지속시간을 갖는다.
164. 문단 161의 방법에 있어서, 전압 펄스들은 1 Hz 내지 50,000 Hz의 주파수에서 제1 및 제2 전극들에 인가된다.
165. 문단 161의 방법에서, 전압 펄스의 파형은 DC, 정사각형, 펄스, 바이폴라, 사인, 램프, 비대칭 바이폴라, 임의적, 및 이들의 임의의 중첩 및 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
166. 문단 161의 방법에 있어서, 전압 펄스들로부터 생성된 전계는 1 V/cm 내지 50,000 V/cm의 크기를 갖는다.
167. 문단 116 내지 문단 117의 방법에 있어서, 액체는 0.001 mS/cm 내지 500 mS/cm의 전도도를 갖는다.
168. 문단 116 또는 문단 117의 방법에 있어서, 장치를 수용하도록 구성된 하우징을 더 포함한다.
169. 문단 168의 방법에 있어서, 하우징은 하우징의 온도를 증가 또는 감소시키도록 구성된 열 컨트롤러를 더 포함한다.
170. 문단 169의 방법에 있어서, 열 컨트롤러는 가열 블록, 액체 흐름, 배터리 전력 히터, 및 박막 히터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 가열 요소이다.
171. 문단 169의 방법에 있어서, 열 컨트롤러는 액체 유동, 증발 냉각기, 및 펠티에 장치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 냉각 요소이다.
172. 문단 118 내지 171 중 어느 하나의 방법에 있어서, 유체 내에 현탁된 복수의 세포들의 온도는 0℃ 내지 50℃이다.
173. 문단 116 내지 172 중 어느 하나의 방법에 있어서, 장치는 복수의 세포 천공 장치들을 포함한다.
174. 문단 173의 방법에 있어서, 장치는 복수의 외부 구조체들을 포함한다.
175. 문단 116 내지 174 중 어느 하나의 방법에 있어서, 천공 후 유체에 현탁된 복수의 세포들을 회수 완충액에 저장하는 단계를 더 포함한다.
176. 문단 116 내지 175 중 어느 하나의 방법에 있어서, 전기천공된 세포들은 0.1% 내지 99.9%의 조성물의 도입 후 생존 가능성을 갖는다.
177. 문단 116 내지 176 중 어느 하나의 방법에 있어서, 세포들 내로의 조성물의 도입의 효율은 0.1 내지 99.9%이다.
178. 문단 116 내지 177 중 어느 하나의 방법에 있어서, 회수된 세포들의 수는 104 세포 내지 1012 세포이다.
179. 문단 116 내지 178 중 어느 하나의 방법에 있어서, 살아있는 조작된 세포 수율은 0.1 내지 500%이다.
180. 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 키트에 있어서,
(a) 복수의 장치들로서, 상기 복수의 장치들 각각은,
(i) 제1 유입구 및 제1 유출구를 포함하는 제1 전극으로서, 상기 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 포함하는, 상기 제1 전극;
(ii) 제2 유입구 및 제2 유출구를 포함하는 제2 전극으로서, 상기 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 포함하는, 상기 제2 전극; 및
(iii) 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차를 인가하는 것은 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함하는, 장치;
(b) 상기 복수의 장치들을 둘러싸도록 구성된 복수의 외부 구조체로서, 상기 복수의 외부 구조체들 각각은,
(i) 적어도 하나의 장치의 제1 전극, 제2 전극 및 전기천공 구역에 전기-기계적으로 체결하도록 구성된 하우징;
(ii) 상기 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전극; 및
(iii) 상기 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전극을 포함하는, 상기 복수의 외부 구조체들; 및
(c) 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 트랜스펙션 완충액을 포함한다.
181. 유체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물을 전기천공하기 위한 키트에 있어서,
(a) 복수의 장치들로서, 상기 복수의 장치들 각각은,
(i) 제1 유입구 및 제1 유출구를 포함하는 제1 전극으로서, 상기 제1 전극의 루멘은 진입 구역을 포함하는, 상기 제1 전극;
(ii) 제2 유입구 및 제2 유출구를 포함하는 제2 전극으로서, 상기 제2 전극의 루멘은 회수 구역을 포함하는, 상기 제2 전극; 및
(iii) 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 제1 전극의 제1 유출구 및 제2 전극의 제2 유입구에 유체 연결되며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면 치수를 가지며, 제1 및 제2 전극들에 전위차를 인가하는 것은 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 전기천공 구역을 포함하는, 상기 장치;
(b) 상기 복수의 장치들을 둘러싸도록 구성된 복수의 외부 구조체로서, 상기 복수의 외부 구조체들 각각은,
(i) 적어도 하나의 장치의 제1 전극, 제2 전극 및 전기천공 구역을 전기 기계적으로 체결하도록 구성된 하우징;
(ii) 상기 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전극; 및
(iii) 상기 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전극을 포함하는, 상기 복수의 외부 구조체들; 및
(c) 유체 내에 현탁된 복수의 세포들을 전기천공하기 위한 트랜스펙션 완충액을 포함한다.
182. 문단 180 또는 문단 181의 키트에 있어서, 외부 구조체들은 복수의 장치들에 통합된다.
183. 문단 180 또는 문단 181의 키트에 있어서, 회부 구조체들은 복수의 장치들에 탈착 가능하게 연결된다.
본원에 설명된 기술의 기타 실시예들은 다음의 번호가 부여된 문단들 중 어느 하나에 따라 정의될 수 있다:
1. 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물울 전기천공하기 위한 장치에 있어서, 상기 장치는,
(a) 제1 유입구, 제1 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
(b) 제2 유입구, 제2 유출구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및
(c) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 갖는, 상기 전기천공 구역을 포함하며,
상기 제1 유출구, 상기 전기천공 구역 및 상기 제2 유입구는 유체 연통된다.
2. 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 장치에 있어서, 상기 장치는,
(a) 제1 유입구, 제1 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
(b) 제2 유입구, 제2 유출구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및
(c) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 갖는, 상기 전기천공 구역을 포함하며,
상기 제1 유출구, 상기 전기천공 구역 및 상기 제2 유입구는 유체 연통된다.
3. 문단 1 또는 문단 2의 장치에 있어서, 상기 전기천공 구역의 횡단면은 원형, 디스크, 타원형, 규칙적인 다각형, 불규칙적인 다각형, 곡선형 형상, 별, 평행사변형, 사다리꼴, 및 불규칙적인 형상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형상이다.
4. 문단 1 내지 3 중 어느 하나의 장치에 있어서, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 원형 횡단면을 갖는다.
5. 문단 1 내지 4 중 어느 하나의 장치에 있어서, 상기 전기천공 구역은 0.1 mm 내지 50 mm의 최소 단면 치수를 갖는다.
6. 문단 1 내지 5 중 어느 하나의 장치에 있어서, 상기 전기천공 구역은 약 7850 ㎛2 내지 약 2000 mm2의 횡단면적을 갖는다.
7. 문단 1 내지 6 중 어느 하나의 장치에 있어서, 상기 전기천공 구역은 0.1 mm 내지 50 mm의 길이를 갖는다.
8. 문단 1 내지 7 중 어느 하나의 장치에 있어서, 상기 제1 전극 및/또는 상기 제2 전극의 루멘은 0.01 mm 내지 500 mm의 최소 단면 치수를 갖는다.
9. 문단 1 내지 8 중 어느 하나의 장치에 있어서, 상기 제1 또는 제2 전극의 루멘의 상기 최소 단면 치수 대 상기 전기천공 구역의 상기 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1이다.
10. 문단 1 내지 9 중 어느 하나의 장치에 있어서, 상기 전기천공 구역의 상기 최소 단면 치수 대 상기 전기천공 구역의 상기 길이의 비는 1:100 내지 100:1이다.
11. 문단 1 내지 10 중 어느 하나의 장치에 있어서, 상기 제1 전극 및/또는 상기 제2 전극 중 어느 하나의 루멘의 횡단면적 대 상기 전기천공 구역의 상기 횡단면적의 비는 1:10 내지 10:1이다.
12. 문단 1 내지 11 중 어느 하나의 장치에 있어서, 상기 제1 유입구와 연통되는 제1 저장소 및/또는 상기 제2 유출구와 연통되는 제2 저장소를 더 포함한다.
13. 문단 1 내지 12 중 어느 하나의 장치에 있어서, 상기 제1 루멘 또는 상기 제2 루멘과 유체 연통되는 제3 저장소를 더 포함한다.
14. 문단 13의 장치에 있어서, 상기 제1 전극 또는 상기 제2 전극 중 어느 하나는 상기 제3 저장소와 유체 연통하기 위한 추가 유입구 또는 유출구를 갖는다.
15. 문단 1 내지 14 중 어느 하나의 장치에 있어서, 상기 장치는 하나 이상의 추가 전기천공 구역들을 더 포함한다.
16. 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물울 전기천공하기 위한 시스템에 있어서,
(a) 장치로서,
(i) 제1 유입구, 제1 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
(ii) 제2 유입구, 제2 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및
(iii) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 가지며;
상기 제1 유출구, 상기 전기천공 구역 및 상기 제2 유입구는 유체 연통되는, 상기 전기천공 구역을 포함하는, 상기 장치; 및
(b) 전위 소스로서, 상기 장치의 상기 제1 전극 및 상기 제2 전극은 상기 전위 소스와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되는, 상기 전위 소스를 포함한다.
17. 액체 내에 현탁된 복수의 셀들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 시스템에 있어서,
(a) 장치로서,
(i) 제1 유입구, 제1 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
(ii) 제2 유입구, 제2 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및
(iii) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 가지며;
상기 제1 유출구, 상기 전기천공 구역 및 상기 제2 유입구는 유체 연통되는, 상기 전기천공 구역을 포함하는, 상기 장치; 및
(b) 전위 소스로서, 상기 장치의 상기 제1 전극 및 상기 제2 전극은 상기 전위 소스와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되는, 상기 전위 소스를 포함한다.
18. 문단 16 또는 문단 17의 시스템에 있어서, 상기 제1 유입구와 유체 연통되는 제1 저장소를 더 포함한다.
19. 문단 16 내지 18 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 상기 제2 유출구와 유체 연통되는 제2 저장소를 더 포함한다.
20. 문단 16 내지 19 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 상기 제1 전극 또는 상기 제2 전극 중 어느 하나의 루멘과 유체 연통되는 제3 저장소를 더 포함하며, 상기 제1 전극 또는 상기 제2 전극 중 어느 하나는 상기 제3 저장소와 유체 연통하기 위한 추가 유입구를 갖는다.
21. 문단 16 내지 20 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 상기 제1 유입구와 유체 연통되는 유체 전달 소스를 더 포함하며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성된다.
22. 문단 16 내지 21 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 상기 제1 전극 및 상기 제2 전극에 전압 펄스들을 전달하기 위해 상기 전위 소스에 동작 가능하게 결합된 컨트롤러를 더 포함하며, 상기 전압 펄스들은 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 전위차를 생성하여, 상기 전기천공 구역에서 전계를 생성한다.
23. 문단 16 내지 22 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 상기 장치는 하나 이상의 추가 전기천공 구역들을 더 포함한다.
24. 문단 23의 시스템항에 있어서, 상기 전기천공 구역들을 병렬로, 직렬로 또는 시간 오프셋으로 통전하도록 구성된 하우징을 더 포함하며, 상기 하우징은 복수의 전기천공 장치들을 수용하는 트레이를 더 포함하고, 상기 트레이는 두 개의 그리드 전극들로 수정되며, 제1 그리드 전극은 제2 그리드 전극으로부터 전기적으로 절연되고, 상기 복수의 장치들 각각의 상기 제1 전극의 외부는 제1 스프링 로딩형 전극, 제1 기계적으로 연결된 전극 또는 제1 유도 연결 전극 중 어느 하나와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되고, 상기 복수의 장치들 각각의 상기 제2 전극의 외부는 제2 스프링 로딩형 전극, 제2 기계적으로 연결된 전극 또는 제2 유도 결합 전극 중 어느 하나와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되며, 상기 복수의 장치들 각각은 상기 그리드 전극들의 개구를 통해 상기 하우징에 들어가고, 각 장치의 상기 스프링 로딩형 전극, 제1 전기적으로 연결된 전극 또는 제1 유도 연결 전극 중 어느 하나는 상기 제1 그리드 전극과 동작 가능하게 접촉되고 각 장치의 상기 제2 스프링 로딩형 전극, 제2 기계적으로 연결된 전극 또는 제2 유도 연결 전극 중 어느 하나는 상기 제2 그리드 전극과 동작 가능하게 접촉되며, 상기 그리드 전극들은 상기 전위 소스에 연결된다.
25. 문단 24의 시스템에 있어서, 상기 전위 소스는 상기 그리드 전극들에 전압 펄스들을 전달하며, 상기 제1 그리드 전극은 특정 인가된 전압에서 통전되는 반면 상기 제2 그리드 전극은 특정 인가된 전압에서 통전되며, 상기 복수의 장치들 각각은 각 장치의 적어도 하나의 전기천공 구역들 각각 내에서 생성된 전계의 크기가 실질적으로 동일하도록 동일한 인가된 전극 펄스로 상기 그리드 전극들에 의해 통전된다.
26. 문단 25의 시스템에 있어서, 상기 전위 소스는 상기 그리드 전극들에 전압 펄스들의 상기 전달을 변조하도록 구성된 추가 회로부 또는 프로그래밍을 포함하며, 상기 복수의 장치들 각각은 상기 그리드 전극들로부터 상이한 전압을 수신하고, 각 장치의 상기 적어도 하나의 전기천공 구역들 각각 내에서 생성된 전계의 크기는 상이하다.
27. 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물울 전기천공하기 위한 시스템에 있어서,
(a) 장치로서,
(i) 제1 유입구, 제1 유출구 및 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
(ii) 제2 유입구, 제2 유출구 및 제2 루멘을 포함하는 제2 전극;
(iii) 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 상기 제3 유입구 및 상기 제3 유출구는 상기 제1 루멘과 유체 연통되고, 상기 제3 유입구 및 상기 제3 유출구는 상기 제1 유입구와 상기 제1 유출구 사이에서 상기 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구;
(iv) 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 상기 제4 유입구 및 상기 제4 유출구는 상기 제2 유입구와 상기 제2 유출구 사이에서 상기 제2 전극을 교차하는, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구; 및
(v) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 0.1 mm 내지 50 mm의 길이를 가지며, 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역의 횡단면적은 실질적으로 균일한, 상기 전기천공 구역을 포함하며;
상기 루멘의 최소 단면 치수 대 상기 전기천공 구역의 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1이고, 상기 제2 루멘의 최소 단면 치수 대 상기 전기천공 구역의 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1이며, 상기 제1 유출구, 상기 전기천공 구역 및 상기 제2 유입구는 유체 연통되는, 상기 장치; 및
(b) 전위 소스로서, 상기 장치의 상기 제1 및 제2 전극들은 상기 전위 소스와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되는, 상기 전위 소스를 포함한다.
28. 액체 내에 현탁된 복수의 셀들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 시스템에 있어서,
(a) 장치로서,
(i) 제1 유입구, 제1 유출구 및 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
(ii) 제2 유입구, 제2 유출구 및 제2 루멘을 포함하는 제2 전극;
(iii) 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 상기 제3 유입구 및 상기 제3 유출구는 상기 제1 루멘과 유체 연통되고, 상기 제3 유입구 및 상기 제3 유출구는 상기 제1 유입구와 상기 제1 유출구 사이에서 상기 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구;
(iv) 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 상기 제4 유입구 및 상기 제4 유출구는 상기 제2 유입구와 상기 제2 유출구 사이에서 상기 제2 전극을 교차하는, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구; 및
(v) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 0.1 mm 내지 50 mm의 길이를 가지며, 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역의 횡단면적은 실질적으로 균일한, 상기 전기천공 구역을 포함하며;
상기 루멘의 최소 단면 치수 대 상기 전기천공 구역의 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1이고, 상기 제2 루멘의 최소 단면 치수 대 상기 전기천공 구역의 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1이며, 상기 제1 유출구, 상기 전기천공 구역 및 상기 제2 유입구는 유체 연통되는, 상기 장치; 및
(b) 전위 소스로서, 상기 장치의 상기 제1 및 제2 전극들은 상기 전위 소스와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되는, 상기 전위 소스를 포함한다.
29. 유동 액체에 현탁된 복수의 셀들 내로의 조성물의 전기천공 방법에 있어서, 상기 방법은,
(a) 장치를 제공하는 단계로서, 상기 장치는,
(i) 제1 유출구, 제1 유입구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
(ii) 제2 유출구, 제2 유입구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및
(iii) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 갖는, 상기 전기천공 구역을 포함하며;
상기 제1 유출구, 상기 전기천공 구역 및 상기 제2 유입구는 유체 연통되는, 상기 제공하는 단계;
(b) 상기 제1 및 제2 전극들 사이의 전위차를 인가하여, 상기 전기천공 구역에서 전계를 생성하는 단계; 및
(c) 상기 전기천공 구역을 통해 상기 복수의 세포들 및 상기 조성물을 통과시켜, 상기 복수의 세포들의 투과성을 향상시키고 상기 복수의 세포들 내로 상기 조성물을 도입하는 단계를 포함한다.
30. 유동 액체에 현탁된 복수의 셀들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달 방법에 있어서, 상기 방법은,
(a) 장치를 제공하는 단계로서, 상기 장치는,
(i) 제1 유출구, 제1 유입구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
(ii) 제2 유출구, 제2 유입구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및
(iii) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유출구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 갖는, 상기 전기천공 구역을 포함하며;
상기 제1 유출구, 상기 전기천공 구역 및 상기 제2 유입구는 유체 연통되는, 상기 제공하는 단계;
(b) 상기 제1 및 제2 전극들 사이의 전위차를 인가하여, 상기 전기천공 구역에서 전계를 생성하는 단계; 및
(c) 상기 전기천공 구역을 통해 상기 복수의 세포들 및 상기 조성물을 통과시켜, 상기 복수의 세포들의 투과성을 향상시키고 상기 복수의 세포들 내로 상기 조성물을 도입하는 단계를 포함한다.
31. 문단 29 또는 문단 30의 방법에 있어서, 상기 복수의 세포들은 단계 (b) 이전의 상기 조성물과 별개의 액체 내에 있다.
32. 문단 30 또는 31의 방법에 있어서, 단계 (b)는 액체 구동 양압을 가하는 단계를 포함한다.
33. 문단 30 내지 32 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 제1 루멘, 제2 루멘 또는 전기천공 구역 중 어느 것도 상기 액체 내에 현탁된 상기 복수의 세포들 중 어느 하나의 단면 치수가 일시적으로 압축되도록 하는 최소 단면 치수를 갖지 않는다.
34. 문단 30 내지 33 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 상기 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 상기 복수의 세포들의 유량은 0.001 mL/분 내지 1,000 mL/분이며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성된다.
35. 문단 30 내지 34 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 상기 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 상기 복수의 세포들의 레이놀즈 수는 0.04 내지 2.43 Х 104이며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성된다.
36. 문단 30 내지 35 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 상기 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 상기 복수의 세포들의 최대 속도는 5 × 10-5 m/s 내지 32.7 m/s이며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성된다.
37. 문단 30 내지 36 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 상기 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 상기 복수의 세포들의 전단율은 0.1 1/s 내지 2 × 106 1/s이며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성된다.
38. 문단 30 내지 37 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 상기 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 상기 복수의 세포들의 피크 압력은 1 × 10-3 Pa 내지 9.5 × 104 Pa이며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성된다.
39. 문단 30 내지 38 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 상기 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 상기 복수의 세포들의 평균 속도는 1.5 × 10-5 m/s 내지 15.9 m/s이며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성된다.
40. 문단 30 내지 39 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 상기 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 상기 복수의 세포들의 동점도는 1 × 10-6 m2/s 내지 15 × 10-4 m2/s이며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성된다.
41. 문단 30 내지 40 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 액체 내에 현탁된 상기 복수의 세포들의 상기 전기천공 구역에서의 체류 시간은 0.5 ms 내지 50 ms이다.
42. 문단 30 내지 41 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 복수의 세포들 및 상기 조성물을 상기 전기천공 구역을 통해 통과시키는 단계는 상기 유동 액체에 기계적 응력을 유도함으로써 상기 복수의 세포들의 투과성을 더 향상시키고 상기 복수의 세포들 내로 상기 조성물을 도입하는 단계를 포함한다.
43. 문단 30 내지 41 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 전계는 전압 펄스들에 의해 생성된다.
44. 문단 43의 방법에 있어서, 상기 전압 펄스들은 제1 인가 전압에서 상기 제1 전극을 통전시키고 상기 제2 전극은 제2 인가 전압에서 통전시켜, 상기 제1 및 제2 전극들 사이에 전위차를 인가한다.
45. 문단 43 또는 44의 방법에 있어서, 상기 전압 펄스는 -3 kV 내지 3 kV의 진폭을 각각 갖는다.
46. 문단 43 내지 45 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 전압 펄스들은 0.01ms 내지 1,000ms의 지속시간을 갖는다.
47. 문단 43 내지 46 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 전압 펄스들은 1 Hz 내지 50,000 Hz의 주파수에서 상기 제1 및 제2 전극들에 인가된다.
48. 문단 43 내지 47 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 전압 펄스는 DC, 구형, 펄스, 바이폴라, 사인, 램프, 비대칭 바이폴라, 임의적 및 이들의 임의의 중첩 또는 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 파형을 포함한다.
49. 문단 43 내지 48 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 전압 펄스들로부터 생성된 상기 전계는 1 V/cm 내지 50,000 V/cm의 크기를 갖는다.
50. 문단 43 내지 49 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 전압 펄스들의 듀티 사이클은 0.001% 내지 100%이다.
51. 문단 30 내지 50 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 액체는 0.001 mS/cm 내지 500 mS/cm의 전도도를 갖는다.
52. 문단 30 내지 51 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 액체의 온도는 0℃ 내지 50℃이다.
53. 문단 30 내지 52 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 복수의 세포들을 상기 조성물의 전기-기계적 전달 후 회수 완충액에 저장하는 단계를 더 포함한다.
54. 문단 30 내지 53 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 조성물은 치료제, 비타민, 나노입자, 하전된 분자, 하전되지 않은 분자, DNA, RNA, CRISPR-Cas 복합체, 단백질, 효소, 펩티드, 바이러스, 중합체, 리보핵단백질, 다당류, 조작된 뉴클레아제, 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 호밍 뉴클레아제, 메가뉴클레아제(MN), 메가탈 및 트랜스포존으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함한다.
55. 문단 30 내지 54 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 조성물은 0.0001 ㎍/mL 내지 1000 ㎍/mL의 상기 액체 내의 농도를 갖는다.
56. 문단 30 내지 55 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 복수의 세포들은 진핵 세포, 식물 세포, 원핵 세포, 또는 합성 세포를 포함한다.
57. 문단 56의 방법에 있어서, 상기 복수의 세포들은 인간 세포 또는 동물 세포를 포함한다.
58. 문단 30 내지 57 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 복수의 세포들은 일차 세포, 세포주로부터의 세포, 부착 세포, 자극되지 않은 세포, 자극된 세포, 활성화 세포, 줄기 세포, 혈액 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 면역 세포, 적혈구 또는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 포함한다.
59. 문단 58의 방법에 있어서, 상기 복수의 세포들은 적응 면역 세포 및/또는 선천 면역 세포를 포함한다.
60. 문단 30 내지 58 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 복수의 세포들은 항원 제시 세포(APC), 단핵구, T-세포, B-세포, 수지상 세포, 대식세포, 호중구, 자연 살해(NK) 세포, Jurkat 세포, THP-1 세포, 인간 배아 신장(HEK -293) 세포, 또는 배아 줄기 세포(ESC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 또는 조혈 줄기 세포(HSC)를 포함한다.
61. 문단 30 내지 58 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 복수의 세포들은 일차 인간 NK 세포, 일차 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 일차 인간 대식세포 또는 일차 인간 단핵구를 포함한다.
62. 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물울 전기천공하기 위한 키트에 있어서,
(a) 복수의 장치들로서, 상기 복수의 장치들 각각은,
(i) 제1 유출구, 제1 유입구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
(ii) 제2 유출구, 제2 유입구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및
(iii) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 갖는, 상기 전기천공 구역을 포함하며;
상기 제1 및 제2 전극들에 전위차의 인가는 상기 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 복수의 장치들; 및
(b) 상기 복수의 장치들을 둘러싸도록 구성된 복수의 외부 구조체들로서, 상기 복수의 외부 구조체들 각각은,
(i) 상기 적어도 하나의 장치의 상기 제1 전극, 제2 전극 및 상기 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징;
(ii) 상기 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전극; 및
(iii) 상기 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전극을 포함하는, 상기 복수의 외부 구조체들을 포함한다.
63. 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 키트에 있어서,
(a) 복수의 장치들로서, 상기 복수의 장치들 각각은,
(i) 제1 유출구, 제1 유입구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
(ii) 제2 유출구, 제2 유입구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및
(iii) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 갖는, 상기 전기천공 구역을 포함하며;
상기 제1 및 제2 전극들에 전위차의 인가는 상기 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 복수의 장치들; 및
(b) 상기 복수의 장치들을 둘러싸도록 구성된 복수의 외부 구조체들로서, 상기 복수의 외부 구조체들 각각은,
(i) 상기 적어도 하나의 장치의 상기 제1 전극, 제2 전극 및 상기 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징;
(ii) 상기 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전극; 및
(iii) 상기 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전극을 포함하는, 상기 복수의 외부 구조체들을 포함한다.
64. 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로 조성물울 전기천공하기 위한 키트에 있어서,
(a) 복수의 장치들로서, 문단 1 내지 15 중 어느 하나의 상기 복수의 장치들 각각; 및
(b) 상기 복수의 장치들을 둘러싸도록 구성된 복수의 외부 구조체들로서, 상기 복수의 외부 구조체들 각각은,
(i) 상기 적어도 하나의 장치의 상기 제1 전극, 제2 전극 및 상기 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징;
(ii) 상기 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전극; 및
(vi) 상기 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전극을 포함하는, 상기 복수의 외부 구조체들을 포함한다.
65. 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 키트에 있어서,
(a) 복수의 장치들로서, 문단 1 내지 15 중 어느 하나의 상기 복수의 장치들 각각; 및
(b) 상기 복수의 장치들을 둘러싸도록 구성된 복수의 외부 구조체들로서, 상기 복수의 외부 구조체들 각각은,
(i) 상기 적어도 하나의 장치의 상기 제1 전극, 제2 전극 및 상기 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징;
(ii) 상기 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전극; 및
(vi) 상기 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전극을 포함하는, 상기 복수의 외부 구조체들을 포함한다.
기타 실시예들
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 그 전체가 참조로서 본원에 통합되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로, 그 전체가 참조로서 통합된다. 이와 본원에 통합된 참조 사이에 상충하는 정의가 있는 경우, 본원에 제공된 정의가 적용된다.
본 개시가 그의 특정 실시예들과 관련하여 설명되었지만, 이는 추가적인 수정들이 가능하며, 본 출원은 일반적으로 본 개시가 속하는 기술 내에서 공지되거나 관례적인 관행 내에 있고 본 명세서에 설명된 본질적인 특징들에 적용될 수 있고 청구항들의 범위 내에서 따르는 본 개시로부터의 이러한 분리들을 포함하고 본 개시의 원리들을 따르는 본 개시의 임의의 변형들, 사용들 또는 적응들을 커버하도록 의도된다는 것이 이해될 것이다.
기타 실시예들은 청구범위 내에 있다.

Claims (59)

  1. 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 장치에 있어서, 상기 장치는,
    (a) 제1 유입구, 제1 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
    (b) 제2 유입구, 제2 유출구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및
    (c) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 갖는, 상기 전기천공 구역을 포함하며,
    상기 제1 유출구, 상기 전기천공 구역 및 상기 제2 유입구는 유체 연통되는, 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전기천공 구역의 횡단면은 원형, 디스크, 타원형, 규칙적인 다각형, 불규칙적인 다각형, 곡선형 형상, 별, 평행사변형, 사다리꼴, 및 불규칙적인 형상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형상인, 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 원형 횡단면을 갖는, 장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기천공 구역은 0.1 mm 내지 50 mm의 최소 단면 치수를 갖는, 장치.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기천공 구역은 약 7850 ㎛2 내지 약 2000 mm2의 횡단면적을 갖는, 장치.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기천공 구역은 0.1 mm 내지 50 mm의 길이를 갖는, 장치.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 전극 및/또는 상기 제2 전극의 루멘은 0.01 mm 내지 500 mm의 최소 단면 치수를 갖는, 장치.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 전극의 루멘의 상기 최소 단면 치수 대 상기 전기천공 구역의 상기 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1인, 장치.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기천공 구역의 상기 최소 단면 치수 대 상기 전기천공 구역의 상기 길이의 비는 1:100 내지 100:1인, 장치.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 전극 및/또는 상기 제2 전극 중 어느 하나의 루멘의 횡단면적 대 상기 전기천공 구역의 상기 횡단면적의 비는 1:10 내지 10:1인, 장치.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유입구와 연통되는 제1 저장소 및/또는 상기 제2 유출구와 연통되는 제2 저장소를 더 포함하는, 장치.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 루멘 또는 상기 제2 루멘과 유체 연통되는 제3 저장소를 더 포함하는, 장치.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제1 전극 또는 상기 제2 전극 중 어느 하나는 상기 제3 저장소와 유체 연통하기 위한 추가 유입구 또는 유출구를 갖는, 장치.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 하나 이상의 추가 전기천공 구역들을 더 포함하는, 장치.
  15. 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 시스템에 있어서,
    (a) 장치로서,
    (i) 제1 유입구, 제1 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
    (ii) 제2 유입구, 제2 유출구, 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및
    (iii) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 가지며; 상기 제1 유출구, 상기 전기천공 구역 및 상기 제2 유입구는 유체 연통되는, 상기 전기천공 구역을 포함하는, 상기 장치; 및
    (b) 전위 소스로서, 상기 장치의 상기 제1 전극 및 상기 제2 전극은 상기 전위 소스와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되는, 상기 전위 소스를 포함하는, 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제1 유입구와 유체 연통되는 제1 저장소를 더 포함하는, 시스템.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 제2 유출구와 유체 연통되는 제2 저장소를 더 포함하는, 시스템.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 전극 또는 상기 제2 전극 중 어느 하나의 루멘과 유체 연통되는 제3 저장소를 더 포함하며, 상기 제1 전극 또는 상기 제2 전극 중 어느 하나는 상기 제3 저장소와 유체 연통하기 위한 추가 유입구를 갖는, 시스템.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유입구와 유체 연통되는 유체 전달 소스를 더 포함하며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성되는, 시스템.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 전극 및 상기 제2 전극에 전압 펄스들을 전달하기 위해 상기 전위 소스에 동작 가능하게 결합된 컨트롤러를 더 포함하며, 상기 전압 펄스들은 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 전위차를 생성하여, 상기 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 시스템.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 하나 이상의 추가 전기천공 구역들을 더 포함하는, 시스템.
  22. 제21항에 있어서, 상기 전기천공 구역들을 병렬로, 직렬로 또는 시간 오프셋으로 통전하도록 구성된 하우징을 더 포함하며, 상기 하우징은 복수의 전기천공 장치들을 수용하는 트레이를 더 포함하고, 상기 트레이는 두 개의 그리드 전극들로 수정되며, 제1 그리드 전극은 제2 그리드 전극으로부터 전기적으로 절연되고, 상기 복수의 장치들 각각의 상기 제1 전극의 외부는 제1 스프링 로딩형 전극, 제1 기계적으로 연결된 전극 또는 제1 유도 연결 전극 중 어느 하나와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되고, 상기 복수의 장치들 각각의 상기 제2 전극의 외부는 제2 스프링 로딩형 전극, 제2 기계적으로 연결된 전극 또는 제2 유도 결합 전극 중 어느 하나와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되며, 상기 복수의 장치들 각각은 상기 그리드 전극들의 개구를 통해 상기 하우징에 들어가고, 각 장치의 상기 스프링 로딩형 전극, 제1 전기적으로 연결된 전극 또는 제1 유도 연결 전극 중 어느 하나는 상기 제1 그리드 전극과 동작 가능하게 접촉되고 각 장치의 상기 제2 스프링 로딩형 전극, 제2 기계적으로 연결된 전극 또는 제2 유도 연결 전극 중 어느 하나는 상기 제2 그리드 전극과 동작 가능하게 접촉되며, 상기 그리드 전극들은 상기 전위 소스에 연결되는, 시스템.
  23. 제22항에 있어서, 상기 전위 소스는 상기 그리드 전극들에 전압 펄스들을 전달하며, 상기 제1 그리드 전극은 특정 인가된 전압에서 통전되는 반면 상기 제2 그리드 전극은 특정 인가된 전압에서 통전되며, 상기 복수의 장치들 각각은 각 장치의 적어도 하나의 전기천공 구역들 각각 내에서 생성된 전계의 크기가 실질적으로 동일하도록 동일한 인가된 전극 펄스로 상기 그리드 전극들에 의해 통전되는, 시스템.
  24. 제23항에 있어서, 상기 전위 소스는 상기 그리드 전극들에 전압 펄스들의 상기 전달을 변조하도록 구성된 추가 회로부 또는 프로그래밍을 포함하며, 상기 복수의 장치들 각각은 상기 그리드 전극들로부터 상이한 전압을 수신하고, 각 장치의 상기 적어도 하나의 전기천공 구역들 각각 내에서 생성된 전계의 크기는 상이한, 시스템.
  25. 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 시스템에 있어서,
    (a) 장치로서,
    (i) 제1 유입구, 제1 유출구 및 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
    (ii) 제2 유입구, 제2 유출구 및 제2 루멘을 포함하는 제2 전극;
    (iii) 제3 유입구 및 제3 유출구로서, 상기 제3 유입구 및 상기 제3 유출구는 상기 제1 루멘과 유체 연통되고, 상기 제3 유입구 및 상기 제3 유출구는 상기 제1 유입구와 상기 제1 유출구 사이에서 상기 제1 전극과 교차하는, 상기 제3 유입구 및 제3 유출구;
    (iv) 제4 유입구 및 제4 유출구로서, 상기 제4 유입구 및 상기 제4 유출구는 상기 제2 유입구와 상기 제2 유출구 사이에서 상기 제2 전극과 교차하는, 상기 제4 유입구 및 제4 유출구; 및
    (v) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 0.1 mm 내지 50 mm의 길이를 가지며, 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역의 횡단면적은 실질적으로 균일한, 상기 전기천공 구역을 포함하며;
    상기 루멘의 최소 단면 치수 대 상기 전기천공 구역의 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1이고, 상기 제2 루멘의 최소 단면 치수 대 상기 전기천공 구역의 최소 단면 치수의 비는 1:10 내지 10:1이며, 상기 제1 유출구, 상기 전기천공 구역 및 상기 제2 유입구는 유체 연통되는, 상기 장치; 및
    (b) 전위 소스로서, 상기 장치의 상기 제1 및 제2 전극들은 상기 전위 소스와 탈착 가능하게 동작 가능하게 접촉되는, 상기 전위 소스를 포함하는, 시스템.
  26. 유동 액체에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달 방법에 있어서, 상기 방법은,
    (a) 장치를 제공하는 단계로서, 상기 장치는,
    (i) 제1 유출구, 제1 유입구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
    (ii) 제2 유출구, 제2 유입구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및
    (iii) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 갖는, 상기 전기천공 구역을 포함하며;
    상기 제1 유출구, 상기 전기천공 구역 및 상기 제2 유입구는 유체 연통되는, 상기 제공하는 단계;
    (b) 상기 제1 및 제2 전극들 사이의 전위차를 인가하여, 상기 전기천공 구역에서 전계를 생성하는 단계; 및
    (c) 상기 전기천공 구역을 통해 상기 복수의 세포들 및 상기 조성물을 통과시켜, 상기 복수의 세포들의 투과성을 향상시키고 상기 복수의 세포들 내로 상기 조성물을 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 복수의 세포들은 단계 (b) 이전의 상기 조성물과 별개의 액체 내에 있는, 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 단계 (b)는 액체 구동 양압을 가하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 루멘, 제2 루멘 또는 전기천공 구역 중 어느 것도 상기 액체 내에 현탁된 상기 복수의 세포들 중 어느 하나의 단면 치수가 일시적으로 압축되도록 하는 최소 단면 치수를 갖지 않는, 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 상기 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 상기 복수의 세포들의 유량은 0.001 mL/분 내지 1,000 mL/분이며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성되는, 방법.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 상기 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 상기 복수의 세포들의 레이놀즈 수는 0.04 내지 2.43 Х 104이며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성되는, 방법.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 상기 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 상기 복수의 세포들의 최대 속도는 5 Х 10-5 m/s 내지 32.7 m/s이며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성되는, 방법.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 상기 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 상기 복수의 세포들의 전단율은 0.1 s-1 내지 2 Х 106 s-1이며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성되는, 방법.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 상기 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 상기 복수의 세포들의 피크 압력은 1 Х 10-3 Pa 내지 9.5 Х 104 Pa이며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성되는, 방법.
  35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 상기 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 상기 복수의 세포들의 평균 속도는 1.5 Х 10-5 m/s 내지 15.9 m/s이며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성되는, 방법.
  36. 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 루멘의 유체 전달 소스로부터 상기 전기천공 구역으로 전달된 현탁액 내의 액체 및/또는 상기 복수의 세포들의 동점도는 1 Х 10-6 m2/s 내지 15 Х 10-4 m2/s이며, 상기 유체 전달 소스는 현탁액 내의 상기 액체 및/또는 상기 복수의 세포들을 상기 제1 루멘을 통해 상기 제2 유출구로 전달하도록 구성되는, 방법.
  37. 제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 내에 현탁된 상기 복수의 세포들의 상기 전기천공 구역에서의 체류 시간은 0.5 ms 내지 50 ms인, 방법.
  38. 제26항에 있어서, 상기 복수의 세포들 및 상기 조성물을 상기 전기천공 구역을 통해 통과시키는 단계는 상기 유동 액체에 기계적 응력을 유도함으로써 상기 복수의 세포들의 투과성을 더 향상시키고 상기 복수의 세포들 내로 상기 조성물을 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전계는 전압 펄스들에 의해 생성되는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 전압 펄스들은 제1 인가 전압에서 상기 제1 전극을 통전시키고 상기 제2 전극은 제2 인가 전압에서 통전시켜, 상기 제1 및 제2 전극들 사이에 전위차를 인가하는, 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 전압 펄스는 -3 kV 내지 3 kV의 진폭을 각각 갖는, 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전압 펄스들은 0.01 ms 내지 1,000 ms의 지속시간을 갖는, 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전압 펄스들은 1 Hz 내지 50,000 Hz의 주파수에서 상기 제1 및 제2 전극들에 인가되는, 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전압 펄스는 DC, 구형, 펄스, 바이폴라, 사인, 램프, 비대칭 바이폴라, 임의적 및 이들의 임의의 중첩 또는 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 파형을 포함하는, 방법.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전압 펄스들로부터 생성된 상기 전계는 1 V/cm 내지 50,000 V/cm의 크기를 갖는, 방법.
  46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전압 펄스들의 듀티 사이클은 0.001% 내지 100%인, 방법.
  47. 제26항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체는 0.001 mS/cm 내지 500 mS/cm의 전도도를 갖는, 방법.
  48. 제26항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체의 온도는 0℃ 내지 50℃인, 방법.
  49. 제26항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포들을 상기 조성물의 전기-기계적 전달 후 회수 완충액에 저장하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  50. 제26항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 치료제, 비타민, 나노입자, 하전된 분자, 하전되지 않은 분자, DNA, RNA, CRISPR-Cas 복합체, 단백질, 효소, 펩티드, 바이러스, 중합체, 리보핵단백질, 다당류, 조작된 뉴클레아제, 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 호밍 뉴클레아제, 메가뉴클레아제(MN), 메가탈 및 트랜스포존으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함하는, 방법.
  51. 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 0.0001 ㎍/mL 내지 1000 ㎍/mL의 상기 액체 내의 농도를 갖는, 방법.
  52. 제26항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포들은 진핵 세포, 식물 세포, 원핵 세포, 또는 합성 세포를 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 복수의 세포들은 인간 세포 또는 동물 세포를 포함하는, 방법.
  54. 제26항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포들은 일차 세포, 세포주로부터의 세포, 부착 세포, 자극되지 않은 세포, 자극된 세포, 활성화 세포, 줄기 세포, 혈액 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 면역 세포, 적혈구 또는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 복수의 세포들은 적응 면역 세포 및/또는 선천 면역 세포를 포함하는, 방법.
  56. 제26항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포들은 항원 제시 세포(APC), 단핵구, T-세포, B-세포, 수지상 세포, 대식세포, 호중구, 자연 살해(NK) 세포, Jurkat 세포, THP-1 세포, 인간 배아 신장(HEK -293) 세포, 또는 배아 줄기 세포(ESC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 또는 조혈 줄기 세포(HSC)를 포함하는, 방법.
  57. 제26항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포들은 일차 인간 NK 세포, 일차 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 일차 인간 대식세포 또는 일차 인간 단핵구를 포함하는, 방법.
  58. 액체 내 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 키트에 있어서,
    (a) 복수의 장치들로서, 상기 복수의 장치들 각각은,
    (i) 제1 유출구, 제1 유입구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제1 루멘을 포함하는 제1 전극;
    (ii) 제2 유출구, 제2 유입구 및 최소 단면 치수를 포함하는 제2 루멘을 포함하는 제2 전극; 및
    (iii) 상기 제1 유출구와 상기 제2 유입구 사이에 배치된 전기천공 구역으로서, 상기 전기천공 구역은 약 100 ㎛보다 큰 최소 단면 치수를 포함하며, 상기 전기천공 구역은 실질적으로 균일한 단면적을 갖는, 상기 전기천공 구역을 포함하며;
    상기 제1 및 제2 전극들에 전위차의 인가는 상기 전기천공 구역에서 전계를 생성하는, 상기 복수의 장치들; 및
    (b) 상기 복수의 장치들을 둘러싸도록 구성된 복수의 외부 구조체들로서, 상기 복수의 외부 구조체들 각각은,
    (i) 상기 적어도 하나의 장치의 상기 제1 전극, 제2 전극 및 상기 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징;
    (ii) 상기 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전극; 및
    (iii) 상기 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전극을 포함하는, 상기 복수의 외부 구조체들을 포함하는, 키트.
  59. 액체 내에 현탁된 복수의 세포들 내로의 조성물의 전기-기계적 전달을 위한 키트에 있어서,
    (a) 복수의 장치들로서, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 상기 복수의 장치들 각각; 및
    (b) 상기 복수의 장치들을 둘러싸도록 구성된 복수의 외부 구조체들로서, 상기 복수의 외부 구조체들 각각은,
    (i) 상기 적어도 하나의 장치의 상기 제1 전극, 제2 전극 및 상기 전기천공 구역을 둘러싸도록 구성된 하우징;
    (ii) 상기 제1 전극에 동작 가능하게 결합된 제1 전극; 및
    (vi) 상기 제2 전극에 동작 가능하게 결합된 제2 전극을 포함하는, 상기 복수의 외부 구조체들을 포함하는, 키트.
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