JP4369241B2 - 少なくとも1つの電極をもつ容器 - Google Patents
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- Secondary Cells (AREA)
- Containers Having Bodies Formed In One Piece (AREA)
Description
例えば、DNA、RNA又はタンパク質などの生理活性分子を生存細胞中に移すことは、これらの分子の生理的機能の分析のための重要な手段である。エレクトロポレーションは、外来分子を細胞中に移すのに好ましい方法であり、化学的方法とは対照的に、標的とする細胞の生物学的な構造や機能に不所望な変化を起こすことが少ない。エレクトロポレーションの間、外来分子は、短時間の電流の流れ、すなわちの放電コンデンサーのパルスにより、水溶液、好ましくは細胞に適合された緩衝液又は細胞培地から細胞中に導入され、それにより、細胞膜は、短い電気的パルスの影響で外来分子が透過できるようになる。溶液及び細胞懸濁液は、それぞれ、通常はいわゆるキュベット、すなわち頂部が開放しており、底部付近の側壁に配置され電圧を施用するのに役立つ向かい合って平行に配列された2つの電極を含んでいる、小さい容器中に提供される。一時的に現れる細胞膜中の「穴」を通して、生理活性分子ははじめに細胞質に到達し、そこで分子は、最終的には早くも、分析すべきそれらの機能を発揮する。一定の条件では、分子は続いて同様に細胞の核に入る。特定的には、DNAの動物細胞中への導入、いわゆるトランスフェクションに関して、トランスフェクションの効率は重要なパラメータとして細胞の生存率の影響を受けることから、これらの細胞の脆弱性のため、エレクトロポレーションの間に具体的な問題が生じることが多い。
これまでに説明したような容器は既知であり、主として、金属製の電極が挿入されたキュベットの形態でエレクトロポレーション又はエレクトロフュージョンに使用されている。この目的のために使用される容器は、主として、底部で閉鎖され頂部で開放されている小さい容器であり、その内部空間は平行かつ向かい合って配列された二対の側壁により造られている。この内部空間は、細胞懸濁液、すなわち、通常は、処理すべき細胞を懸濁した水性緩衝液又は細胞培地を受容するのに役立つ。このようなキュベットは主として、向かい合って配列された一対の側壁の底部付近に配置された、電圧を施用するための一対の電極を含む。放電の間、電流が両方の電極の間の細胞懸濁液を通って流れ、それにより核酸又は他の分子を細胞中に導入することが可能となり、あるいは選択した条件に依存して、細胞の融合につながる。これら電極は、主として金属で作られており、アルミニウムがしばしば使用される。しかし、放電の間に金属イオンが緩衝液中に放出され、それにより、低濃度で細胞の不所望な刺激を引き起こし、また高濃度では、細胞に対して毒性の作用をすることは、これらの既知の商業的に入手可能なキュベットの不都合な点である。例えば、アルミニウム製のキュベットを用いると、Al3+イオンの放出によるマイナスの効果が実証されるであろう(Loomis-Husselbeeetal.,BiochemJ1991,277(Pt3),883-885)。そのうえ、金属製電極を有するキュベットを用いると、不所望な沈殿が発生することがあり、このことは、電極からの金属イオンの放出によっても同様に発生する。この沈殿は、金属の水酸化物、又は金属イオンと緩衝溶液からの生物学的巨大分子との錯体である場合がある(Stapulionis,BioelectrochemBioenerg1999,48(1),249-254)。最終的に、おそらく、高い抵抗の酸化されたアルミニウムの層が電流の流れにより電極から放出されるという理由で、キュベットの抵抗が放電の間に低くなることは、アルミニウム製キュベットの別の不都合な点である。更に、金属製電極を有するキュベットは、製造するのが困難であり、非常に費用がかかる。
したがって、本発明の目的は、現存する欠点を克服するため、簡単かつ高い費用効果で製造することができ、電流を使用して、細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び/又は小胞の効率的な処理を可能とする、これまでに説明したような容器を創造することである。
本発明の好ましい態様においては、この容器は同じ材料で作られている少なくとも2つの電極を含む。殆どの用途は、容器及びキュベットを使用し、それらはそれぞれ、同じ材料からなる、向かい合って配列された平行な2つの電極を有する。これら2つの電極は、適する様式で接触しており、それにより、それぞれの要求に適合された電圧源と接続している。しかし、特別な場合においては、少なくとも2つの電極が異なる材料で作られていることも有利であり得る。これらの場合、アノード又はカソードは、ドーピングされた合成材料からなってもよく、それぞれの対電極は別の材料、例えば、ステンレス鋼又は本質的に導電性である合成材料からなってもよい。
都合のよいことには、本発明にしたがった容器又は容器配列は、電流による細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び/又は小胞の処理のための方法における使用に特に適する。その際、細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び/又は小胞は、少なくとも1つの容器又は容器配列のうちの少なくとも1つの容器の内部チャンバー中に移され、ここで、前記容器は、ドーピングされた合成材料で作られている少なくとも1つの電極と、少なくとも1つの更なる電極とを含み、そしてここで、次いで電圧が前記電極に施用され、前記容器の内部チャンバー中に電流が発生する。この方法において、電流は、120A/cm2まで、好ましくは80A/cm2までの電流密度に到達してもよく、細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び/又は小胞は、懸濁液で、又は付着されたか、さもなければ固定された状態で提供されてもよい。
図1は、それぞれ、本発明を実証し、本発明にしたがった容器を試験するための実験アセンブリ1の透視図を示す。この実験アセンブリ1は、本発明にしたがった容器の構成と等しいものであり、スペーサー板2及びスペーサー板2の両側に対してプレスされた2つの電極3,4を含む。スペーサー板2は、2mmの厚さを有するテフロン(登録商標)製の板であり、U字状に形成されたくぼみ5を有する。電極3,4は、少なくとも1種の導電性物質がドーピングされた合成材料からなる。この合成材料は、例えば、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリフェニレンスルフィド、又はこれらのポリマーの混合物、及び/又は本質的に導電性である合成材料であってもよい。スペーサー板2及び両方の電極3,4を含む3つの層は、ともに両側でサンドイッチのように銅板6,7によりプレスされる。この目的のため、銅板6,7を、万力のような装置(示さず)のねじ込み部8,9により他方に向かって動かす。上で述べた層をともにプレスすると、次いでくぼみ5の範囲において内部空間10が形成され、この内部空間はそれぞれ溶液及び細胞を受容する能力を有する。図示したモデルにおいて、内部空間10は、100mlの体積を受容することができる。内部空間10は、更に、スペーサー板2の内部エッジ11により底部及び両方の側部において、そして電極3,5により2つの残りの側部において形成される。銅板6,7は、慣用的なエレクトロポレーション装置、すなわち電圧源のばね接点に2つの線を介して電気的に接触される。電極3,4自体は、それらの全体の外部表面を介して銅板に直接接触しているので、最良の電気的接触が保証される。したがって、示すような例示的なアセンブリ1を用いて、電圧パルスを銅板6,7に施用すると、溶液と細胞懸濁液がそれぞれ充填された内部空間10を通って電極3,4の間を電流が流れる。
異なるパルスパラメータを使用する(合成材料:1000V,100μs及びUstart=102V,75mC及びアルミニウム:800V,100μs及びUstart=90V,75mC)。このアプローチにおいても、本発明にしたがったポリマー電極の使用により、トランスフェクション効率をわずかに高くすることができ、死亡率をわずかに低くすることができた。
Aアンペア
Cクーロン
CHOチャイニーズハムスター卵巣
cmセンチメートル
DNAデオキシリボ核酸
Gew.−%重量パーセント
h時間
HL−60ヒトリンパ腫60
HUVECヒト臍帯静脈内皮細胞
kVキロボルト
mCミリクーロン
mMミリモル
msミリ秒
PAポリアミド
PBMC末梢血単核細胞
PBS食塩加リン酸緩衝液
pH水素イオン濃度の負の対数
PJヨウ化プロビジウム
RNAリボ核酸
RPMIローズウェルパークメモリアルインスティテュート
μgマイクログラム
μlマイクロリットル
μsマイクロ秒
U電圧
UAnfang電圧初期
Vボルト
2スペーサー板
3電極
4電極
5くぼみ
6銅板
7銅板
8ねじ込み部
9ねじ込み部
10内部空間
11内部エッジ
12実験アセンブリ
13銅線
14銅線
20容器
21外部リミット
22内部チャンバー
23側壁
24側壁
25電極
26電極
27射出成形チャネル
28射出成形チャネル
30容器
31外部リミット
32内部チャンバー
33電極
34電極
35側壁
36側壁
37射出成形チャネル
38射出成形チャネル
39傾斜部
Claims (25)
- 水溶液、並びに特に細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び/又は小胞を受容するための容器(20,30)であって、前記溶液を受容するための内部チャンバー(22,32)を形成する外部リミット(21)により少なくとも部分的に形成され、電圧を施用しその後放電が起こるときに電極として作用する少なくとも1つの領域(25,26,33,34)を含んでおり、その際、少なくとも1つの電極(25,26,33,34)が、少なくとも1種の導電性物質でドーピングされたプラスチック材料を少なくともベースとする導電性合成材料で作られており、前記プラスチック材料中の前記ドーピングしている導電性物質の全濃度が20〜80%w/wである前記容器。
- 前記ドーピングしている導電性物質が、炭素繊維、グラファイト、すす及び/又はカーボンナノチューブからなる、請求項1記載の容器。
- 前記プラスチック材料中の前記ドーピングしている導電性物質の全濃度が、20〜60%w/wである、請求項1又は2に記載の容器。
- 前記プラスチック材料中の前記ドーピングしている導電性物質の全濃度が、40〜80%w/wである、請求項1又は2に記載の容器。
- 前記プラスチック材料が、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリフェニレンスルフィド、若しくはこれらのポリマーの混合物であるか、又はこれらのポリマーの1種又は複数種を少なくともベースとする、及び/又は前記プラスチック材料が、本質的に導電性である合成材料である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の容器。
- 前記本質的に導電性である合成材料が、ポリアニリン、ポリアセチレン、ポリ−パラ−フェニレン、ポリ−パラ−フェニレンスルフィド、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリプロピレンなどであるか、又はこれらのポリマーの1種又は複数種を少なくともベースとする、請求項5記載の容器。
- 前記外部リミット(21,31)が、合成材料で作られている、請求項1〜6のいずれかに記載の容器。
- 前記外部リミット(21,31)が、前記少なくとも1つの電極(25,26,33,34)がベースとするプラスチック材料と同じプラスチック材料で作られている、請求項7記載の容器。
- 前記少なくとも1つの電極(25,26,33,34)が、前記外部リミット(21,31)に一体化されている、請求項1〜8のいずれかに記載の容器。
- 同じ材料で作られている少なくとも2つの電極(25,26,33,34)を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の容器。
- 少なくとも2つの電極(25,26,33,34)が異なる材料で作られている、請求項1〜10のいずれかに記載の容器。
- 少なくとも1つの電極(25,26,33,34)が、25〜45%w/wの炭素繊維と、15〜35%w/wのグラファイトとでドーピングされたポリアミドで作られている、請求項1〜11のいずれかに記載の容器。
- 少なくとも1つの電極(25,26,33,34)が、30〜50%w/wの炭素繊維と、25〜45%w/wのグラファイトとでドーピングされたポリアミドで作られている、請求項1〜11のいずれかに記載の容器。
- 少なくとも1つの電極(25,26,33,34)が、15〜40%w/wの炭素繊維と、1〜40%w/wのグラファイトとでドーピングされたポリカーボネートで作られている、請求項1〜11のいずれかに記載の容器。
- 少なくとも1つの電極(25,26,33,34)が、30〜50%w/wの炭素繊維でドーピングされたポリエーテルエーテルケトンで作られている、請求項1〜11のいずれかに記載の容器。
- 少なくとも1つの電極(25,26,33,34)が、20〜40%w/wの炭素繊維でドーピングされたポリアミドで作られている、請求項1〜11のいずれかに記載の容器。
- 少なくとも1つの電極(25,26,33,34)が、20%w/wの炭素繊維でドーピングされたポリプロピレンで作られている、請求項1〜11のいずれかに記載の容器。
- 少なくとも1つの電極(25,26,33,34)が、30〜50%w/wの炭素繊維でドーピングされたポリフェニレンスルフィドで作られている、請求項1〜11のいずれかに記載の容器。
- 前記外部リミット(21,31)が、前記溶液を供給するための少なくとも1つの開口部と、前記溶液を排出するための少なくとも1つの開口部とを含む、請求項1〜18のいずれかに記載の容器。
- 1つのユニットを造るようにつながれた請求項1〜18のいずれかに記載の容器(20,30)を少なくとも2つ含む、容器。
- 請求項1〜20のいずれか1項に記載の容器を製造するための方法であって、前記容器(20,30)が二材射出成形により製造され、その際、はじめに外部リミット(21,31)が射出成形されて、1つのくぼんだ窓が形成され、続いて、ドーピングされたプラスチックで作られている導電性合成材料が前記少なくとも1つの窓の中に射出成形されるか、又ははじめに前記少なくとも1つの電極(25,26,33,34)が、前記ドーピングされたプラスチック材料から射出成形され、続いて、前記外部リミット(21,31)が前記少なくとも1つの電極(25,26,33,34)の周りに射出成形される前記方法。
- 電流により、細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び/又は小胞を処理するための方法であって:
a)前記細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び/又は小胞を、請求項1〜20記載の容器の少なくとも1つの容器の内部チャンバー(22,32)中に移し、その際、前記容器(20,30)は、ドーピングされた合成材料で作られている少なくとも1つの電極(25,26,33,34)と、少なくとも1つの更なる電極(25,26,33,34)とを含み、そして
b)電圧を前記電極(25,26,33,34)に施用し、前記容器(20,30)の前記内部チャンバー(22,32)中に電流の流れを発生させることを含む、前記方法。 - 前記電流が、120A/cm2までの電流密度に到達する、請求項22記載の方法。
- 生理活性分子が前記溶液中に溶解され、前記生理活性分子の生存細胞への移動が、場の強さが2〜10kV*cm-1であり継続時間が10〜200μsである電圧パルスにより達成される、請求項22又は23に記載の方法。
- 前記生理活性分子の前記細胞への前記移動が、前記電圧パルスの後に間断なく流れ、電流密度が2〜14A*cm-2であり、継続時間が1〜100msである電流の流れにより達成される、請求項22又は23に記載の方法。
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