JP6893647B6 - 容量型電位測定デバイスによる細胞内電位の測定方法 - Google Patents
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Description
従来から細胞の膜電位の変動、それに伴うイオンチャネルを通した膜電流の測定をすることで細胞の状態変化や細胞の薬物などへの応答を観察することが行われてきた。特に創薬スクリーニングの際に、培養した心筋細胞、神経細胞などに対して創薬候補薬物を暴露し、膜電位の変化を計測して心毒性、神経毒性などを評価することが広く行われている。
パッチクランプ法は細胞全体に発現するイオンチャネルの動態を測定するWhole cell modeと、パッチピペットの内径内の細胞膜にのみ含まれるイオンチャネルの動態(single channel活性)を測定する方法(on cell mode)、そしてその微小細胞膜を細胞から単離して測定を行う方法(inside patch, outside patch mode)がある。
Whole cell modeでは、ガラスピペットと接着した電極の内径にある細胞膜を突き破ることにより、細胞内電位変化、細胞全体でのイオンチャネルを通過する電流(イオンチャネルの活性)の動態を測定する。上記の手技は顕微鏡下で個々の細胞に直接電極を用いて行う記録法のため高度に熟練した技術、そして高い専門知識が必要である。
パッチクランプ方法にはマニュアル(手動式)パッチクランプ法とオートパッチ法があり、マニュアルパッチクランプ法は電気生理学的測定におけるデーターの信頼性が高い。
しかしながら、術者が顕微鏡を用いて、マニピュレーターを操作して実験を行うなどの手技が複雑で豊富な専門知識を必要とすることから非常に効率が悪い。このことは、医学生物学研究、特に創薬分野では大きなハードルになっている。
一方、オートパッチ法はオートメーション化された電気生理学的測定機であり、近年著しく性能を向上させているものの、データーの信頼性においてマニュアルパッチクランプ法を置き換えるほどの信頼性は勝ち得ていない。その上、オートパッチクランプ試験機器は大変高価なため、その使用は一部の大製薬企業に限られている。
また、近年細胞内電位を測定するために電極を細胞膜に貫通させる方法として、パッチクランプ法に代えて細胞に高電圧をかけて電気的に穿孔する方法(非特許文献3)が開発され、ラットの心筋細胞の細胞内電位が記録できたことが報告されている。しかしながらその手法では、穿孔破壊された細胞膜が直ぐに修復されてしまうために、電極の細胞内へのアクセスがなくなってしまうため、実用的な手法とはいえない。
in vitro 多点平面電極(MultiElectrode Array, MEA)システムの応用として、培養神経細胞の可塑性の研究や、ヒトiPS 細胞由来の神経細胞、心筋細胞を用いた薬物安全性試験などに使われ始めている。
MEAに基づく方法で細胞内記録を試みた報告として、きのこ様の形をした電極の上に細胞を播種し、そこに高電圧を与える事により、細胞膜を破ることに成功した例があるが、細胞内電位の記録条件を保てる時間は短く、記録方法としての有効性は示されていない(非特許文献1)。
本発明者らは、近年、金ナノ粒子が、免疫学的診断用キットのみならず、ヒト細胞を含めた哺乳動物細胞に対する核酸や各種薬剤などのデリバリー用のvehicleとして広く用いられていること、細胞への負荷の少ない細胞内導入法も開発が進んでいること(非特許文献2)に加え、金ナノ粒子の特性として細胞毒性が極めて低く電気伝導性であること着目し、細胞内に導入した金ナノ粒子をガラス微小電極の代わりに用いることを発想した。
本発明者らは、鋭意研究の結果、金コーティングされた磁性ナノ粒子を用い、導電性のガラスプレートを介して強い磁石で細胞内の金ナノ粒子を引きつけて細胞膜を貫通させ、細胞内と導電性ガラスとの接点となるように工夫した。具体的には、表面導電性のガラスプレート表面に接着させた培養動物細胞内に予めにポリエチレンイミンなどの薬剤と共に金コーティング磁性ナノ粒子を導入しておき、導電性ガラスプレートの真下のネオジウム磁石で金ナノ粒子を引きつけて細胞膜を貫通させて、細胞外の一端を導電性ガラスと接触させた後、導電性ガラスと細胞外電極(アース)との電位差をアンプにより増幅することで、従来の細胞内ガラス微小電極を用いた場合と同様に細胞内電位を測定できることが確認できた。
このように、磁場により細胞内に予め導入した導電性ナノ粒子を引き寄せ、細胞膜を貫通させることで細胞へのダメージを極力抑えて細胞内外の電極同士を繋ぐことができた。
さらに、細胞外から導電性ナノ粒子を細胞内に導入する工程なしに細胞膜に貫通させるという、より細胞へのダメージの少ない細胞内電位記録方法も開発した。具体的には、導電性ナノ粒子を磁石電極表面に吸着させ、細胞の上方から細胞表面に押し付けて、細胞の下方に設けられた金属板に引き付けられることによって細胞膜を貫通させることができ、磁石電極と細胞内記録電極を構築できることを確認した。
これらの手法で構築された細胞内記録電極は、細胞外液中に設けられた細胞外電極(アース)と繋ぎ、両電極間の電位差をアンプで増幅することで細胞内電位を測定することができる(同日付で特許出願している)。
本発明では、従来の測定方法とは全く発想の異なる、チャージアンプの原理を利用した容量型細胞内電位の測定方法を提供するものである。
オームの法則によると大きなインピーダンスを持つ直列回路の両端では大きな電位差が生じる。そして、コンデンサーは容量が小さければ小さいほどインピーダンス(容量リアクタンス)が大きいことが知られている(例えば、http://www.fluke.com/fluke/uses/comunidad/fluke-news-plus/articlecategories/electrical/capacitivevoltage))。
以上のことから、コンデンサーの両端の電位差を測定する場合、容量の小さいコンデンサーを用いることで、その間の抵抗インピーダンスが大きくなり細胞膜電位のような微細な電位変化の記録が可能となる。この場合電圧増幅器(Voltage Amplifier)は「チャージアンプ」として作用する。すなわち、細胞膜を通して細胞内へ流れ込んだイオンの流れは細胞膜を貫通している導電性ナノ粒子を通して電荷信号として認識され、それがコンデンサーを通して電圧信号変化に変換され(電荷−電圧コンバータ)膜電位の変化として電圧増幅器により測定される。
すなわち、本発明において「容量型電位測定デバイス」とは、直流電位(電圧)測定(実験例では細胞内膜電位)を測定回路内にアースを設ける事無く行うことを可能にした技術である。特徴としては非常に高いインピーダンスとピコファラッドの容量をもつコンデンサーを用いる。導電性ナノ粒子電極に結合したコンデンサーの一端に起こる電位変化(帯電したイオンの細胞への出入り)は高インピーダンスコンデンサーが電荷-電圧変換器(チャージアンプ)として働くため、電圧として検知される。このデバイスの特徴はコンデンサーの両端にアンプのプラス極とマイナス極をつなげて直接電位変化を測定することにあり、デバイス内のマイナス極が測定回路のアースとして働くためにopen circuitとならず安定した測定を可能にする。また、本発明において「チャージアンプの原理を利用する方法」というとき、「細胞膜を通した陽イオン、陰イオンの出入りによる細胞内のイオン濃度の変化を、細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子と接する導電性プレートなどの導電体を通して電荷の変化として感受し、それを電圧変化として測定する方法」を意味する。
〔1〕 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を記録可能な容量型電位測定デバイスであって、
対象細胞の細胞膜を貫通している導電性ナノ粒子の細胞外に露出した一端と細胞外で接触している導電性プレートを含み、当該導電性プレートの下面に接触して設けられた導電板の下方に磁石が設置されていることを特徴とする、容量型電位測定デバイス。
ここで、導電性プレートとしては、導電性ガラス(FTO(フッ素トープ酸化スズ)付きガラス、ITO(インジウムトープ酸化スズ)付きガラス)の他、チタンプレートなどが用いられる。導電板としては、アルミ箔、銀板又は白金板が用いられる。以下同様。
〔2〕 導電性プレートが、表面の少なくとも一部にコラーゲン塗布領域を有している導電性ガラスであることを特徴とする、前記〔1〕に記載の容量型電位測定デバイス。
〔3〕 導電性プレート上面が電気信号増幅器のプラス極に接続され、
導電性プレートの下面に接触する導電板が電気信号増幅器のマイナス電極に接続されて、導電性プレート上面と導電板とにより容量型電位記録回路を形成していることを特徴とする、前記〔1〕又は〔2〕に記載の容量型電位測定デバイス。
〔4〕 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を記録可能な容量型電位測定デバイスであって、
対象細胞の細胞膜を貫通している導電性ナノ粒子の細胞外に露出した一端と細胞外で接触している磁石電極を含み、当該磁石電極は対象細胞と接触する下面以外は絶縁体で覆われて垂直に固定され、絶縁体を介した上面にさらに磁性体又は磁石吸引性金属板を有しており、前記細胞と接着する容器底面の下方には磁石吸引性の金属板が設けられていることを特徴とする、容量型電位測定デバイス。
ここで、絶縁体としては、パラフィルム、シリコン、ワックスなどが用いられる。シリコンチューブが好ましい。磁性体は磁石電極と同一素材であってもよく、また磁石吸引性金属板は、典型的には鉄板である。以下同様。
〔5〕 前記磁石電極の対象細胞と接触する下面以外を覆う絶縁体が、対象細胞が接着している下方の基板表面には接触しておらず、磁石電極の下面に接触する対象細胞が細胞外液より隔離されていないことを特徴とする、前記〔4〕に記載の容量型電位測定デバイス。
〔6〕 細胞膜を貫通する導電性ナノ粒子は、予め磁石電極表面に吸着した導電性ナノ粒子が、対象細胞の上方から当該磁石電極により細胞表面に押し付けられ、細胞の下方に設けた金属板に引き付けられて細胞膜を貫通したものである、前記〔4〕又は〔5〕に記載の容量型電位測定デバイス。
〔7〕 導電性ナノ粒子を予め磁石電極表面に吸着させる際に、トランスフェクション試薬と混合された状態で磁石電極表面に吸着させることを特徴とする、前記〔6〕に記載の容量型電位測定デバイス。
〔8〕 磁石電極が電気信号増幅器のプラス極に接続され、
磁石電極上面に絶縁体を介して設けられた磁性体又は磁石吸引性金属板が電気信号増幅器のマイナス電極に接続されて、磁石電極と磁性体又は磁石吸引性金属板とにより容量型電位記録回路を形成していることを特徴とする、前記〔4〕〜〔7〕のいずれかに記載の容量型電位測定デバイス。
〔9〕 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定するための方法であって、下記の工程(1)〜(3)を含むことを特徴とする、方法;
(1)導電性プレート上に接着している対象細胞内に導電性ナノ粒子を導入する工程、
ここで、導電性プレート下面には接触して導電板が設けられており、当該導電板の下方に磁石が設置されている、
(2)対象細胞内の導電性ナノ粒子を、導電性プレート下方の磁石に由来する磁力により細胞接着面側に引き寄せ、細胞接着面の少なくとも一部の細胞膜で導電性ナノ粒子を貫通させ、その細胞外に露出させた一端と前記導電性プレートとを接触させる工程、
(3)前記導電性プレート上面を電気信号増幅器のプラス極に接続し、前記導電板を電気信号増幅器のマイナス電極に接続して電位記録回路を形成する工程。
〔10〕 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定するための方法であって、下記の工程(1)〜(4)を含むことを特徴とする、方法;
(1)容器底面に接着している対象細胞内に導電性ナノ粒子を導入する工程、
(2)対象細胞の上面に磁石電極を接着させる工程、
ここで、前記磁石電極は対象細胞との接着面以外は絶縁体で覆われており、当該磁石電極の上面には絶縁体を介して磁性体又は磁石吸引性の金属板が設けられている、
(3)前記細胞と接着する容器底面の下方に磁石吸引性の金属板を設け、前記磁石電極と下方の金属板との間に生じる磁力により導電性ナノ粒子を磁石電極との接着面側に引き寄せて細胞膜を貫通させ、細胞外に露出させた一端を前記磁石電極に接触させる工程、
(4)前記磁石電極を電気信号増幅器のプラス極に接続し、上方の前記磁性体又は磁石吸引性の金属板を電気信号増幅器のマイナス電極に接続して電位記録回路を形成する工程。
〔11〕 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定するための方法であって、下記の工程(1)〜(4)を含むことを特徴とする、方法;
(1)磁石電極の絶縁体で覆われていない表面に導電性ナノ粒子を吸着させる工程、
(2)導電性ナノ粒子を吸着させた磁石電極表面を対象細胞の上方から細胞表面に接着させ押し付ける工程、
ここで、磁石電極の上面には絶縁体を介して磁性体又は磁石吸引性金属板が設けられている、
(3)前記細胞と接着する容器底面の下方に磁石吸引性の金属板を設け、前記磁石電極と下方の金属板との間に生じる磁力により磁石電極表面の導電性ナノ粒子を前記細胞の内側方向に引き寄せ、磁石電極に接触する細胞外の一端を残して細胞膜を貫通させる工程、
(4)前記磁石電極を電気信号増幅器のプラス極に接続し、磁石電極上方に設けられた前記磁性体又は磁石吸引性金属板を電気信号増幅器のマイナス電極に接続して電位記録回路を形成する工程。
〔12〕 対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、下記の(1)〜(6)を含むことを特徴とする、方法;
(1)導電性プレート上に接着している対象細胞内に導電性ナノ粒子を導入する工程、
ここで、導電性プレート下面には接触して導電板が設けられており、当該導電板の下方に磁石が設置されている、
(2)対象細胞内の導電性ナノ粒子を、導電性プレート下方の磁石に由来する磁力により細胞接着面側に引き寄せ、細胞接着面の少なくとも一部の細胞膜で導電性ナノ粒子を貫通させ、その細胞外に露出させた一端と前記導電性プレートとを接触させる工程、
(3)前記導電性プレート上面を電気信号増幅器のプラス極に接続し、前記導電板を電気信号増幅器のマイナス電極に接続して電位記録回路を形成し、両電極間の電圧を測定する工程、
(4)対象細胞に対し、被検物質試料を投与する工程、
(5)工程(4)で被検物質試料が投与された対象細胞について、工程(3)と同様に、両電極間の電圧を測定する工程、
(6)工程(5)での測定結果を、工程(3)での測定結果と比較して、両者の測定値に有意な差異がある場合に、被検物質試料が対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質であると評価する工程。
〔13〕 対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、下記の(1)〜(7)を含むことを特徴とする、方法;
(1)セルカルチャーインサートの多孔質膜上に接着している対象細胞内に導電性ナノ粒子を導入する工程、
ここで、セルカルチャーインサートとしては、市販のセルカルチャーインサート(Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts, Thermo Scientific)が好ましく、底面にはPolycarbonateの多孔質膜を有する。0.1〜1.0mμのポアサイズの膜を有するものが好ましい。
また、細胞下面から溶液の還流を行うために、セルカルチャーインサートの多孔質膜上で細胞を培養し、それをスペーサーの上に設置する。
(2)対象細胞の上面に磁石電極を接着させる工程、
ここで、前記磁石電極は対象細胞との接着面以外は絶縁体で覆われており、当該磁石電極の上面に絶縁体を介して磁性体又は磁石吸引性金属板が設けられている、
(3)前記細胞と接着するセルカルチャーインサート底面の多孔質膜の下方に磁石吸引性の金属板を設け、前記磁石電極と下方の金属板との間に生じる磁力により導電性ナノ粒子を磁石電極との接着面側に引き寄せて細胞膜を貫通させ、細胞外に露出させた一端を前記磁石電極に接触させる工程、
(4)前記磁石電極を電気信号増幅器のプラス極に接続し、上方の前記磁性体又は磁石吸引性金属板を電気信号増幅器のマイナス電極に接続して電位記録回路を形成し、両電極間の電圧を測定する工程、
(5)対象細胞に対し、透過性のあるセルカルチャーインサート底面の多孔質膜を介して被検物質試料を投与する工程、
(6)工程(5)で被検物質試料が投与された対象細胞について、工程(4)と同様に、両電極間の電圧を測定する工程、
(7)工程(6)での測定結果を、工程(4)での測定結果と比較して、両者の測定値に有意な差異がある場合に、被検物質試料が対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質であると評価する工程。
〔14〕 対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、下記の(1)〜(7)を含むことを特徴とする、方法;
(1)磁石電極の絶縁体で覆われていない表面に導電性ナノ粒子を吸着させる工程、
(2)導電性ナノ粒子を吸着させた磁石電極表面を対象細胞の上方から細胞表面に接着させ押し付ける工程、
ここで、磁石電極の上面には絶縁体を介して磁性体又は磁石吸引性金属板が設けられている、
(3)前記細胞と接着するセルカルチャーインサート底面の多孔質膜の下方に磁石吸引性の金属板を設け、前記磁石電極と金属板との間に生じる磁力により磁石電極表面の導電性ナノ粒子を前記細胞の内側方向に引き寄せ、磁石電極に接触する細胞外の一端を残して細胞膜を貫通させる工程、
(4)前記磁石電極を電気信号増幅器のプラス極に接続し、前記磁性体又は磁石吸引性金属板を電気信号増幅器のマイナス電極に接続して電位記録回路を形成し、両電極間の電圧を測定する工程、
(5)対象細胞に対し、透過性のあるセルカルチャーインサート底面の多孔質膜を介して被検物質試料を投与する工程、
(6)工程(5)で被検物質試料が投与された対象細胞について、工程(4)と同様に、両電極間の電圧を測定する工程、
(7)工程(6)での測定結果を、工程(4)での測定結果と比較して、両者の測定値に有意な差異がある場合に、被検物質試料が対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質であると評価する工程。
〔15〕 対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、下記の(1)〜(6)を含むことを特徴とする、方法;
(1)基板上に接着している対象細胞内に導電性ナノ粒子を導入し、対象細胞上面に磁石電極を接着させる工程;
ここで、前記磁石電極は対象細胞との接着面以外は絶縁体で覆われており、当該磁石電極の上面に絶縁体を介して磁性体又は磁石吸引性金属板が設けられている、
(2)前記細胞の下面に接着する基板の下方に磁石吸引性の金属板を設け、前記磁石電極と下方の金属板との間に生じる磁力により導電性ナノ粒子を磁石電極との接着面側に引き寄せて細胞膜を貫通させ、細胞外に露出させた一端を前記磁石電極に接触させる工程、
(3)前記磁石電極を電気信号増幅器のプラス極に接続し、上方の前記磁性体又は磁石吸引性金属板を電気信号増幅器のマイナス電極に接続して電位記録回路を形成し、両電極間の電圧を測定する工程、
(4)細胞外液に被検物質試料を投与し、対象細胞と被検物質試料とを接触させる工程;
ここで、前記磁石電極を覆う絶縁体は、対象細胞が接着している下方の基板表面には接触しておらず、磁石電極の下面に接触する対象細胞が細胞外液より隔離されていない、
(5)工程(4)で被検物質試料と接触した対象細胞について、工程(3)と同様に、両電極間の電圧を測定する工程、
(6)工程(5)での測定結果を、工程(3)での測定結果と比較して、両者の測定値に有意な差異がある場合に、被検物質試料が対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質であると評価する工程。
〔16〕 対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、下記の(1)〜(7)を含むことを特徴とする、方法;
(1)磁石電極の絶縁体で覆われていない表面に導電性ナノ粒子を吸着させる工程、
(2)導電性ナノ粒子を吸着させた磁石電極表面を対象細胞の上方から細胞表面に接着させ押し付ける工程、
ここで、磁石電極の上面には絶縁体を介して磁性体又は磁石吸引性金属板が設けられている、
(3)前記細胞の下面に接着する基板の下方に磁石吸引性の金属板を設け、前記磁石電極と金属板との間に生じる磁力により磁石電極表面の導電性ナノ粒子を前記細胞の内側方向に引き寄せ、磁石電極に接触する細胞外の一端を残して細胞膜を貫通させる工程、
(4)前記磁石電極を電気信号増幅器のプラス極に接続し、前記磁性体又は磁石吸引性金属板を電気信号増幅器のマイナス電極に接続して電位記録回路を形成し、両電極間の電圧を測定する工程、
(5)細胞外液に被検物質試料を投与し、対象細胞と被検物質試料とを接触させる工程;
ここで、前記磁石電極を覆う絶縁体は、対象細胞が接着している下方の基板表面には接触しておらず、磁石電極の下面に接触する対象細胞が細胞外液より隔離されていない、
(6)工程(5)で被検物質試料が投与された対象細胞について、工程(4)と同様に、両電極間の電圧を測定する工程、
(7)工程(6)での測定結果を、工程(4)での測定結果と比較して、両者の測定値に有意な差異がある場合に、被検物質試料が対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質であると評価する工程。
また、本発明の測定方法は、増幅器のプラス極、マイナス極の間に起こる電位変化を直接測定するのではなく、細胞を播種するコンデンサー(導電性プレート)をセンサーとして電荷−電圧変換を行い、細胞内電位変化として記録する方法である。そのため、細胞外液にアースを設定する必要がない。そして、センサーとなる導電性プレートが細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子を介して細胞内の電荷(チャージ)変化を感受できればよいから、導電性プレートは細胞に覆われていない部分で細胞外液と接触していてもよい。
つまり、本発明の測定方法では、細胞群に適用する場合もシート状に培養する必要はなく、単一細胞に適用した場合でも、簡便に細胞の活動電位又はその変化を正確に測定することができる。
特に、シート状に培養できない細胞、典型的には培養神経細胞などにおいても、細胞内で発生した活動電位又はその変化を記録できることとなるから、今後、in vitroにおける(培養)神経細胞の電気生理学的研究に飛躍的な貢献をする事が予測される。
他に、各種イオンチャネル、薬剤トランスポーターなどを発現する形質転換細胞又は細胞群に適用することで、各種薬剤添加による細胞内電位の変動を観測し、薬効又は細胞毒性のスクリーニング用のツールとすることができる。
本発明で「導電性ナノ粒子」というとき、導電性と共に磁性を併せ持つナノサイズ(25〜100nm)の微粒子である。一般には「導電性材料でコーティングされたナノ磁性粒子」の意味で用いられるが、細胞膜を貫通して電極として働く機能を有していればよく、その形状は球形には限られず、線状など他の形状であってもよい。また、材質も、磁性と共に導電性で細胞毒性の少ないナノ粒子であればよく、導電性ポリマー、導電性ペプチドなども用いることもできる。
その際のコーティングに適した材質としては、例えば、金、プラチナなどの導電性金属(Yamada et al.(2015) WIREs Nanomed Nanobiotechnol 2015, 7:428-445. doi: 10.1002/wnan.1322)の他、導電性のペプチドやタンパク質、又は各種導電性ポリマーなどが挙げられるが、これらには限られない。本明細書の実施例又は参考例ではクエン酸又はPEG金コーティング磁性ナノ粒子(nanoimmunotech社製、NITmagold Cit又は PEG50nm)を使用しており、本発明を説明する際にも、主として典型的な金コーティングナノ粒子について述べるが、これに限る意味ではない。
具体的には、導電性ポリマー、導電性ペプチド類としては、「poly(anthranilic acid) with magnetite nanoparticles magnetic properties, and AC and DC conductivity)」として、「Ramesan and Jayakrishnan (2017)Polymer/magnetite nanocomposites with electrical and magnetic conductivity. Plastic Research On line 10.2417/spepro.006898」に列記された導電性のポリマー類、ペプチド類を用いることができる。また、従来から生体イメージングの染色に用いられていたQuantum dot(Qdot)粒子(O.O. Otelaja, D.-H. Ha, T. Ly, H. Zhang, and R.D. Robinson, “Highly Conductive Cu2-xS Nanoparticle Films through Room Temperature Processing, and an Order of Magnitude Enhancement of Conductivity via Electrophoretic Deposition,” ACS Applied Materials and Interfaces 6, 18911-18920 (2014).)なども導電性ナノ粒子として用いることができる。
なお、本発明の導電性ナノ粒子は、細胞膜を貫通して電極として働く機能を有していれば球形以外の線状、円筒状、円錐状など他の形状の場合があるが、その場合、粒子の最大長が25〜100nm、好ましくは30〜80nm、より好ましくは35〜70nm、さらに好ましくは40〜60nmの数値範囲であることが好ましい。
(2−1)対象となる細胞、細胞集団(細胞群)
本発明の測定対象となる細胞としては、生検で採取された細胞などの生体由来の細胞でも、培養された細胞でも良い。主としてヒトなどの哺乳動物細胞を対象とするが、鳥類、魚類、昆虫細胞の他、酵母などの真核微生物や大腸菌などの原核微生物であってもよい。
特に、ヒトiPS細胞などヒト幹細胞から分化誘導された心筋細胞、神経細胞、血管上皮細胞、肝臓細胞など、またはその細胞集団が好ましい。
また、形質転換宿主として一般的なHEK, CHO細胞など哺乳動物細胞に、各種イオンチャネル遺伝子や各種トランスポーター遺伝子などを導入した形質転換培養細胞も、各種イオンチャネルやトランスポーターから取り込まれる薬剤の毒性試験における評価系として用いることができるため、本発明における好ましい対象細胞である。
本発明において「細胞集団」というとき、接着培養用の培養ディッシュ(プレート、ウエル)表面に形成されるシート状細胞の場合と共に、iPS細胞など幹細胞に由来する心筋細胞、神経細胞などにより形成される細胞塊の場合も含む。
また、本発明の対象細胞としては、近年モデル細胞として広く用いられるようになった巨大リポソームを含む人工細胞(Moscho et al. (1996) P.N.A.S. 93: 11443-11447;Schlesinger Saito (2006), Cell Death and Differentiation 13, 1403 - 1408;Aimon et al. (2011) PLoS ONE 6(10): e25529. doi: 10.1371/journal.pone.0025529など)も含める。
例えば、イオンチャネルを発現させた細胞から分離したイオンチャネルを含む細胞膜片を巨大リポソームと融合させる方法や、大腸菌などで発現させた組換えイオンチャネルタンパクを取り込ませた小さなリポソームと巨大リポソームとを融合させる方法などにより調製した人工細胞を用いることができる。
心筋細胞モデルとしては、ヒトiPS細胞などの幹細胞から分化誘導された心筋細胞、又はSCN5A(Nav1.5), CACNα1C(Cav1.2), KCNH2(hERG), KCNQ1/KCNE1 (LQT1), KCNJ2(Kir2.1)遺伝子などを培養動物細胞(HEK293、BHK、又はCHO細胞)に導入し、細胞膜に上記イオンチャネルを発現させた細胞などを用いることが好ましい。そのような細胞として、例えば、WO2014/192312に記載の心筋モデル細胞を用いることができる。
また、形質転換細胞に代えて、iPS細胞などの幹細胞から分化誘導された培養心筋細胞試料を用いることもできる(US9663764B2;Generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells)。心筋様のiPS細胞(iCell Cardiomyocyte)はCDI社などにより市販もされている。
生体由来の組織切片試料を用いることもでき、その際、組織切片としては、哺乳動物細胞由来の心房又は心室を形成する心筋切片を用い、心房細動、不整脈を引き起こす原因の究明を行う。病変組織から生検で摘出した組織片などを用いることができる。
なお、神経細胞のように、心筋細胞とは異なり導電ガラス全面を細胞で覆うことができない細胞であっても、本発明の容量型電位測定デバイスを用いる方法により細胞内電位の記録が可能である。
本発明では導電性プレートを用いる場合であっても、導電性プレート領域が培養容器底面の全面を覆う必要がないため、導電性プレート領域上に細胞内電位測定に十分な程度の細胞数が存在していればよい。例えば、0.1〜2.0×105個/cm2、好ましくは、0.5〜1.2×105個/cm2播種することが好ましい。単一細胞における細胞内電位を測定することも可能である。
磁石電極を用いる場合は、導電性プレート領域は不要であり、通常の培養容器又はカバーガラスを用いることができる。これらに代え、Polycarbonateセルカルチャーインサート(ポアサイズ0.4μm, Thermo Scientific)を用いてもよい。そして、播種される細胞数にも制限はないが、細胞群を用いて生物電位を測定する場合は、同様に0.1〜2.0×105個/cm2、好ましくは、0.5〜1.2×105個/cm2播種することが好ましい。磁石電極の対象細胞への接着面以外の領域が絶縁され、細胞外溶液と直接接触しなければ、単独細胞における細胞内電位を測定することも可能である。
(3−1)細胞膜を貫通させる前の対象細胞内への導電性ナノ粒子の導入方法
本発明においては、対象細胞の細胞膜に導電性ナノ粒子を貫通させるに先立ち、予め細胞内に導電性ナノ粒子を導入しておき、その細胞内の導電性ナノ粒子を磁力により引き付けて貫通させる場合と、細胞外の導電性ナノ粒子を磁力により貫通させる場合の2種類の方法があるが、この項では前者の場合に用いられる、予め細胞内に導電性ナノ粒子を導入する方法について述べる。後者の場合については、(4−3)で詳細に述べる。
本発明の導電性ナノ粒子の細胞内への導入方法としては、既知の細胞内へのナノ粒子導入方法についてのレビュー文献である「Levy et al. (2010) Gold nanoparticles delivery in mammalian live cells: a critical review. Nano Reviews , 1: 4889 - DOI: 10.3402/nano.v1i0.4889)」に示されるいずれの方法でも良いが、導入対象となる細胞へのダメージができるだけ少ない方法が好ましい。本明細書の参考例1などではトランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン溶液(P3143 Sigma-Aldrich Mn 〜60,000)、及び細胞膜へのポア形成性タンパク質毒素としてストレプトリジンOを用いて行っているが、当該方法には限られない。
典型的な導入方法としては、例えば以下の方法を用いることができるが、これらには限られない。
標的細胞の膜に穴(Membrane pore)を形成する病原因子としてのタンパク質毒素は古くから知られており、これらタンパク質毒素に対し、標的細胞への毒性を制御しながら、可逆的な穴を開け、非選択的なイオンチャネル(ポア)のように働かせる技術も開発されている(Walev et al.,PNAS 98:(6) 3185-3190(2001);T.Tomita.,Bio.Soci.Japan General Incorporated Association, Vol.34, No.6 (1994) p.6-11など)。
そのような毒素としては、A型溶血性連鎖球菌のストレプトリジンO(Streptolysin O)やリポソームに結合させたブドウ球菌のα毒素などが好ましく用いられ、本発明の実施例又は参考例ではStreptolysin Oを用いた例を示すが、これらには限られない。
トランスフェクション試薬としては、ポリエチレンイミン(polyethylineimine)の他、Superfect(Qiagen社)を用いることができる。Superfectもpolyethylineimineと同様に dendrimerで ポアを作る事が知られている。分子量の大きいポリエチレンイミンは大きなポアを形成するため、ポリエチレンイミンの方が有効である。
なお、トランスフェクション試薬は、予め細胞内に導電性ナノ粒子を導入する際の典型的な試薬として用いられるが、下記(5)の導電性ナノ粒子を細胞外から細胞膜に貫通させる方法においても有効に働く。
この方法の難点は導電性ナノ粒子が標的細胞内に取り込まれた後に、エンドゾームの膜から細胞質に移動するステップが必要になる。
そのためには、例えば導電性ナノ粒子に、TAT、TAT-HAなどのCell penetrating peptide (CPP)を導電性ナノ粒子に付加する事によりエンドゾーム膜から細胞質に移行させるなどの工夫をすることが好ましい。
この方法には、導電性ナノ粒子を細胞内に導入してから、標的細胞を播種する方法と、標的細胞を播種後に導電性ナノ粒子を挿入する方法、の2種類がある。
いずれの方法を用いてもよいが、前者の場合は市販の機器(HeliosR Gene Gun System、Bio-Rad)を使用できるメリットがあるため、特に大量の細胞及び導電性ナノ粒子を対象とする場合に適している。
(4−1)本発明で用いる細胞膜貫通導電性ナノ粒子についての基本原理(予め細胞内に導入されている導電性ナノ粒子が細胞膜を貫通する場合)
本発明においては、対象細胞内に予め導電性ナノ粒子を導入しておき、当該導電性ナノ粒子を細胞外からの磁場により引き付けて貫通させる場合と、細胞外の細胞表面に接着させた導電性ナノ粒子を細胞外の磁場により貫通させる場合の2種類の方法がある。
いずれの場合も本発明の基本原理は、細胞内に予め導入した導電性ナノ粒子が細胞外の磁場に引き付けられて細胞膜を貫通することで、導電性ナノ粒子が細胞膜をはさんで、一端は細胞内にそして、他の一端が細胞外に露出することにより、細胞内での電荷(チャージ)の変化を感受し、導電性ナノ粒子の細胞外に露出した一端が接する導電性プレート電極又は磁石電極をコンデンサーとして働かせて電圧に変換することで、細胞内電位を細胞外で測定、記録可能とすることにある。その際、導電性ナノ粒子と共に細胞内電位記録電極を構成し、導電性ナノ粒子の細胞外露出部分を増幅器につなげるコネクターとしての機能を果たす導電性物質が必要である。そのような導電性物質による電極の1つは、細胞を播種する細胞電位測定容器(通常、細胞培養容器を兼ねる。)の底面の少なくとも一部が導電性を有するプレートであって、細胞接着面と反対側に磁石が設置されている「導電性プレート」であり、他の1つは、導電性コーティングをされた「磁石電極」(典型的にはネオジウム磁石)である。
以下、まず導電性プレートを用いる場合についての一般的方法を説明し、次いで磁石電極を用いる場合について説明する。
ここでは、細胞集団(細胞シート)に適用する場合の一態様について述べるが、本発明の方法はこれには限られない。
(工程1)少なくとも表面が導電性を有する培養ディッシュ又はプレート(以下、単に導電性プレートという。)へ被検細胞を播種するか、又は組織切片を導電性プレート表面に密着させる。
なお、本発明においては、「導電性プレート」は、培養容器の底面全部を構成する必要はなく、導電性表面が細胞外液に露出していてもよい。また、導電性材料を用いて培養ディッシュのガラス表面において、細胞接着面のみ導電コーティングすることで形成することもできる。導電性プレート領域を形成するための導電性材料としては、FTO(フッ素ドープ酸化スズ)などが好ましく用いられるが、同等の条件を満たしていればこれに限るものでない。
ここで、細胞を播種する導電性プレートとして、透明性基板、例えば導電性ガラスを用いると、顕微鏡により細胞の播種状態が簡便かつ正確に確認できるため好ましい。本明細書中の実施例又は参考例では、導電性ガラス(ケニス株式会社製)を使用したが、これには限られない。
また、導電性プレートとしては、骨芽細胞の培養などに用いられているチタンプレート(Rosa and Beloti (2003) Effect of cpTi Surface Roughness on Human Bone Marrow Cell Attachment, Proliferation, and Differentiation. Braz Dent J 14(1): 16-21)なども好ましい。チタンプレートは細胞毒性がほとんどなく、光が透過しない欠点はあるが、導電性ガラスよりも導電性に優れ、導電性ガラス(20〜40オームの電気抵抗がある)のような直列抵抗による誤差が発生しないため、特に正確な測定値が求められる場合は、チタンプレート、又は毒性のない導電金属が好ましい。
(4−2)に示した導電性プレートを用いる場合の本発明方法を、本発明における典型的な導電性ナノ粒子である金コーティング磁性ナノ粒子を単一細胞に適用した場合を概念図(図1、図2)で説明すると下記の手順となる。
(1)金コーティング磁性ナノ粒子を細胞内に導入する(図1A−C)。
(2)細胞の接着している導電性ガラスの反対側に設置された磁石により、金コーティング磁性ナノ粒子を導電性ガラス面に引き寄せる(図1D)。
(3)磁石でガラス面に引き寄せられた金コーティング磁性ナノ粒子が、細胞のガラス接着部分の細胞膜を貫通する。
(4)細胞膜を貫通した金コーティング磁性ナノ粒子により細胞内と電極がつながり、磁性ナノ粒子の回りの金コーティングを通して細胞内の電位、電流の測定が可能となる。
(5)(図2)に示すように配置された記録電極、アース、増幅アンプにより、細胞内電位を測定する。
実際の実験で培養細胞などに応用する場合、通常、細胞は複数個存在する。その際、細胞間の結合が密でないと電極となるガラス面とアースが直接細胞外液(イオン化したイオンが存在する)を通して繋がってしまうため、金コーティング磁性ナノ粒子によって確立された細胞内電位と細胞外溶液が短絡されてしまうので、金コーティング磁性ナノ粒子を通した記録は不可能になる。そのためには、導電性プレート(電極)全面に隙間無く細胞を敷き詰める必要がある。電極の面積は、できる限り狭めることが好ましい(図3)。培養ディッシュ表面に導電性材料をパターン状に描いて導電性プレート領域を形成する場合は、導電性プレート領域は、少なくとも細胞との接着面内に収まるように形成されている。
導電性材料(例えばニッケル、アルミニウムなどの導電性金属)でコーティングされた磁石は、磁力と共に導電性も有するため「磁石電極(MagEle)」として用いることができ、典型的なものはネオジウム磁石である。
ネオジウム磁石は、永久磁石のうち最も磁力の高い磁石であるが、錆やすいため、通常ニッケルめっきが施されている。市販の直径1mm円柱ネオジウム磁石(ネオマグ株式会社)もNi-Cu-Niでコーティングされているため、強力な磁力と共に高い導電性を持っており、磁石電極(MagEle)として用いることができる。他に、アルミニウムコーティングされている場合も磁石電極(MagEle)として用いることができる。また、磁石本体も、引力に対抗して細胞内の導電性ナノ粒子を上方に引き付けることができる程度の磁場を発生できる磁石であればよく、ネオジウム磁石には限られないが、以下、典型的なネオジウム磁石を用いた例で説明する。なお、細胞内に導入したナノ粒子を細胞に接触した磁石電極に引き付けるという条件を満たせば、磁石を細胞の上に乗せても、細胞を磁石の上に乗せてもよい。
ここで、ネオジウム磁石表面のうち細胞との接触部分以外は細胞外溶液から完全に遮断される必要があるため、細胞との接触部分以外は、あらかじめシリコンゴム、シリコンチューブなどによる絶縁コートを施しておく。
このように、ネオジウム磁石を磁石電極(MagEle)として使用する方法は、細胞を導電ガラス上に載置する必要はなく、通常の培養ディッシュをそのまま使用できる。そのため、培養ディッシュで培養した細胞をそのまま使用して、ナノ磁石粒子を導入した後、直接細胞内電位の変化を記録できる利点がある。
また、培養細胞又は培養細胞群は、その上方に配置した磁石電極(MagEle)との十分な接触面積が確保できれば他の部分に細胞が存在する必要はないため、ディッシュ底面全体が細胞群で覆われる必要はない。
本発明では、磁石電極自体をコンデンサーとして作用させるために、磁石の細胞接着面と反対の細胞外液から露出している部分に(絶縁膜で覆われている)アンプのマイナス極をつなげる。磁石電極はコーディングのため導電性を持つので、これをアンプのプラスにつなげると絶縁膜を介してチャージアンプの原理を利用した記録方法と同じ位置関係が成立する。そのため、この記録方法では上記した導電性プレートを用いる場合と同様に、細胞外液にアースは必要としない。
この方法は、上述の方法とは異なり、導電性ナノ粒子を予め細胞内に導入せずに、細胞表面に接着させた導電性ナノ粒子を細胞外から貫通させる方法であって、磁石電極表面に直接磁気で固定されている導電性ナノ粒子を細胞に押し付けて、反対側に設置された金属板の吸引力で細胞膜に挿入、貫通させる方法である。
具体的には、導電ナノ粒子を、まず磁石電極表面に磁力により固定する。この際、導電ナノ粒子を、PEI(Polyethyleneimine)に代表されるトランスフェクション試薬と混合した状態で用いてもよい。続いて磁石電極を標的細胞表面に押し付け、細胞の下方に設けた金属板との間に発生した磁力により磁石電極を自立固定する。磁石電極が細く磁力が弱い場合は下方の金属板との磁力に依存せずともマニピュレーターなどにより固定してもよい。磁石電極により細胞に接着固定されたナノ粒子が細胞膜を貫通することにより、一端が細胞質内に到達した導電性ナノ粒子と磁石電極とにより細胞内電位記録電極を形成する。
その際、PEIなどトランスフェクション試薬と混合した状態で用いることで、より導入効率が高まる。細胞膜脂質と同様の性質を有しているPEIなどがナノ粒子に付着して細胞膜貫通を補助している可能性が高い。本方法は、導電ナノ粒子を細胞質の内部に導入する必要がないため、極めて非侵襲的な手法である。
当該方法も、導電性プレートを用いた場合などと同様にアースを細胞外液に設置する必要がないために、培養神経細胞のように播種培養された細胞がお互いに接触するように密である必要がない点でも優れている。
PEIと混合したPEG又はクエン酸金コーティング磁性ナノ粒子を磁石電極に添加し、側面を絶縁体でコーティングした磁石電極に、ナノ粒子を磁気により吸着させる。
ここで、絶縁体としては、パラフィルム、シリコン、ワックスなどを用いることができ、磁石電極のナノ粒子と接触させる部分以外の細胞外液に接触するすべての部分が覆われることが望ましい。シリコンの場合、磁石とぴったりサイズのあうシリコンチューブを用いることもできる。
約30分後に磁石電極の導電性ナノ粒子を吸着させた面を下に向け、培養容器内の細胞の上方から近づけ、細胞に直接接触させる。ここで、培養容器は鉄板など磁石が引き付けられる材料上に配置しておく。磁石電極はこの鉄板に吸引されることにより細胞の上に固定され、導電性ナノ粒子は、PEIを介して細胞膜を貫通するが、一方を磁石で固定されているため、細胞膜内にとどまり、細胞内電位記録を可能にする。すなわち、事前にナノ粒子を細胞に導入しなくても細胞内電位記録を行うことは可能である。ただし、この方法では磁石が弱すぎると磁石電極を他にマニピュレーターなどで保持することが必要となるため、細胞の種類、培養条件により、磁石の強さ、大きさなどの適正化が必要である。
(5−1)チャージアンプの測定原理
上述のように、本発明で「チャージアンプ」というとき、「電荷増幅器」としての「チャージアンプ」自体を用いるわけではなく、「チャージアンプ」内で行われているメカニズムである電荷信号を電圧信号変化に変換するための電荷−電圧コンバータとしての働き方を「チャージアンプの原理」として利用するものである。「チャージアンプの原理を利用する」とは、「細胞内のイオン濃度の変化を細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子と接する導電性プレートを通して、電荷の変化として感受し、それを電圧変化に変換して測定する」ことをいう。
細胞内で生じる活動電位などの細胞内電位の変化は荷電(Charge)したイオン(Na+, K+,Ca2+, Cl-)の細胞内外への動きによって生じるため、この荷電したイオン濃度の変化を、細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子を通して電荷の変化ととらえれば、チャージアンプの原理を応用することで電圧信号として測定できる。
ここで、本発明で用いているアンプを、説明のために「チャージアンプ」ということがあるが、実際に用いているアンプは通常のパッチクランプアンプを使用している。通常のアンプを導電ガラスによって構成されるコンデンサーの上下に接続することで、導電ガラスの上に播種された細胞へのイオンの出入りがあった場合に、イオンがプラス又はマイナスに帯電しているため、チャージの動きとして感受でき、それを電圧として測定することができる。そのメカニズムがあたかも電荷―電圧変換機(チャージアンプ)として作用していることから、本発明では、「チャージアンプ(電荷−電圧変換機)の原理」と称している。
通常の増幅器はそのプラスとマイナス極(アース)の間に流れる電流、又は加えられた電圧の変化(電極間で起こる変化)を測定する。光センサー(フォトダイオート)の場合はフォトダイオートが測定回路外の現象(光の強さ)をフォトン(光粒子)のエネルギーとして感受しそれを電気(電圧、又は電流)変化として増幅する。
本発明では導電性ナノ粒子を通し、細胞内へ流入、又は細胞から流出する荷電したイオン(例、Na+, K+,, Ca2+, Cl-)の濃度の変化を電荷量の変化として導電プレートという電荷センサーを通して感受し、それを電圧変化として測定する方法である。すなわち、フォトダイオートが感受したフォトンを電気変化に変換したように、本発明では荷電したイオンを感受し、電気変化に変換する。
そのため、細胞外液にアースを設定する必要がないことが大きな特徴のひとつとして挙げられる。このことは、センサーである導電性プレートが細胞に覆われていない部分で細胞外溶液に直接接触していても、細胞内膜電位変化を電荷(チャージ)の変化とし測定できることを意味する。この特性によって、神経細胞のように、心筋細胞と異なりシート様に培養できない細胞でも細胞内記録を行えることとなる。
具体的には、例えば細胞の播種された導電性ガラス上面を容量型電位測定デバイスのインプット(プラス極)へ、そして、導電性ガラス(厚さ2mm)下面と磁石の間にアルミ箔をマイナス電極としてアースに接続する(電気回路を短絡しないため、アルミ箔と磁石の間に絶縁テープなどを配置する)。ここで、ガラス板を導電ガラス表面とアルミ箔という導電板が挟み込むこととなり、コンデンサーを形成する。導電ガラスは、前記1.(1−1)などに記載されるチタンプレートなどの他の導電性プレートであってもよく、アルミ箔の導電板は、アルミ箔に代えて、銀板、白金板などを用いることもできる。
導電ガラス表面に置かれた細胞内で発生した活動電位が、チャージ(電荷)として働き、コンデンサーの上下で認識された電位差を、電圧として測定できる。
なお、対象細胞内の細胞内電位を制御するための電気刺激を行うためには、容量型電位測定デバイスとは別にアースを有する電気刺激回路を設けるか、Channelrhodopsineなどを発現させ、刺激を行う必要がある。
前記(4−5)で詳細に述べた従来型の記録方法においても、MagEle(磁石電極)を対象細胞の上方に固定し、導電性ナノ粒子の細胞膜貫通と共に、細胞内電位測定時の(+)極として働かせていたが、その場合にはアース(−)極は外液中に設けられているため、MagEle側面に設けられた絶縁体は、外液から隔離するため隙間なく基板(培養ディッシュ、培養プレートなど)に固着されていた(図9)。
なお、本発明で「基板」というとき、対象細胞を培養、測定などのために接着させる器具すべてを含む。例えば、培養ディッシュ、培養プレート、導電性プレートなどを指す。
そして、その際、対象細胞に面するMagEle下面は細胞外液より隔離されている必要はない。MagEl側面に設けられた絶縁体は、従来通り完全に隙間なく基板と固着させてもよい(図16A)が、基板に対しては完全に固着せず、MagEleとその下の細胞とを外液から完全に隔離せず、外液が拡散流入できるようにすることもできる(図19)。
MagEleを用いる場合、細胞播種密度は中程度であることが望ましい。特に回りが隔離されている場合には、細胞外液の組成が細胞の電気的活動により、影響を受ける可能性があるので、細胞の播種密度はシートを形成するより低い必要がある。例えば、活動電位が発生する際、細胞にナトリウムイオンが流入し、カリウムイオンが細胞から流出した場合Magele下の細胞が、外液から隔離されていると活動電位の発生に必要な細胞外液のナトリウムが不十分になり、活動電位の発生に負の影響を及ぼす。
この細胞外液の隙間からの流入を積極的に起こさせる最も効率の良い方法として、「Polycarbonateセルカルチャーインサート法」(図16B)がある。
「Polycarbonateセルカルチャーインサート法」では、細胞を接着させる基板が、ポアサイズが0.4μm(Thermo Scientific)のPolycarbonate透過膜」である点で、インサートの下方の隙間からの外液の流入がスムーズであるため、投与する薬剤による細胞内電位変化の観察の効率が良い。
(6−1)細胞内電位測定用容器
本発明では、対象細胞の播種、培養に用いられる培養容器として、磁石電極を用いる場合であれば、汎用の培養ディッシュ、培養プレートなどをそのまま用いることができる。
また、導電性プレートを用いる場合も、培養容器底面の少なくとも一部に導電性プレート領域を設けた状態で、直接培養できるから、培養容器として用いることができる。したがって、いずれの場合も、対象細胞の播種、培養に用いた培養容器をそのまま細胞内電位測定用容器として用いることができる。そして、必要に応じ、培養に用いた容器から、より測定しやすい別の細胞内電位測定用容器に移植することも可能である。
培養容器をそのまま細胞内電位測定用容器として用いる場合は、培養容器内で対象細胞に導電性ナノ粒子を導入後、培養液を生理食塩水で複数回洗浄して生理食塩水に置換し、直ちに磁場により細胞内の導電性ナノ粒子を磁石電極又は導電性プレート側に引き寄せて細胞膜を貫通させることで、細胞内電位又は電位変化を測定、記録することができる。
チャージアンプの原理を用いた方法では導電性ガラスを用いた場合も磁石電極の場合もシート状に底面を覆う必要はない。なお、実験の目的により生理食塩水に代えて、浸透圧、pHが保たれていれば、イオン組成の異なる緩衝液を用いることができる。
本発明においては、細胞内の自発的な電位や、誘発された電位を、細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子を介して細胞内電位を反映する導電性プレート電極又は磁石電極が感知して細胞外で記録する。その際に生じる電位変化は微弱なため、細胞内電位の記録を行うためには、電圧増幅器(増幅アンプ)を備えた機器が必須となる。
そのような機器として、細胞又は細胞群の細胞内電位もしくは細胞外電位を測定するために従来から用いられていた機器は、いずれも用いることができる。
具体的には、パッチクランプ増幅器細胞内記録用増幅器であれば、入力抵抗が最低106〜108オーム以上ある増幅器を用いることができる。例えば、パッチクランプアンプ(Axopatch 200A, Axon instruments)などを用いることができる。
また、MEAシステムであれば、交流信号ではなく、直流信号が測定できる機器であれば使用することができる。
(7−1)創薬スクリーニング
本発明は、創薬スクリーニングに特に有用である。
本発明の細胞内電位測定法は、細胞の活動電位、及び静止膜電位の測定を、従来のパッチクランプ法又はオートパッチ法に代替してチャージアンプの原理を利用した測定法を使用して記録することができる。
創薬スクリーニングに際しては、前述のモデル心筋細胞や、モデル神経細胞を用いることで、被検物質の細胞機能への影響、電気刺激による収縮活性、電気生理学的特性変化の解析などを迅速かつ正確に行うことができるため、速やかに被検物質の細胞毒性や、薬効を評価し、被検物質の評価に有効である。
本発明のうち、磁石電極を用いた容量型電位測定デバイスをスクリーニング方法に適用した例として、リガンド受容体活性型イオンチャネル発現細胞を用いて当該細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質をスクリーニングする場合の手順を以下に示すが、下記の手順に限定するものではない。
具体的には、以下の(1)〜(6)を含む手順で行う。
(1)多孔質膜(セルカルチャーインサート)上に接着している対象細胞内に導電性ナノ粒子を導入する工程、
多孔質膜としては、市販のセルカルチャーインサート(Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts, Thermo Scientific)を用いることができ、0.1〜1.0μmのポアサイズ、特に好ましくは0.4μmのポアサイズのPolycarbonateの多孔質膜を有するものが好ましく用いられる。他に、ミリセル(Millicell)インサート(Merkmillipore)、Fisher scientific、Corning製のセルカルチャーインサートを使うこともできる。
また、実際には細胞下面から溶液の還流を行うために、多孔質膜上で細胞を培養し、それをスペーサーの上に設置する工程が必要となる。
(2)対象細胞の上面に磁石電極を接着させる工程、
ここで、前記磁石電極は対象細胞との接着面以外は絶縁体で覆われており、その上面に絶縁体を介して磁性体又は磁石吸引性金属板を有している、
(3)前記細胞と接着するセルカルチャーインサート底面の多孔質膜の下方に磁石吸引性の金属板を設け、前記磁石電極と下方の金属板との間に生じる磁力により導電性ナノ粒子を磁石電極との接着面側に引き寄せて細胞膜を貫通させ、細胞外に露出させた一端を前記磁石電極に接触させる工程、
なお、セルカルチャーインサート底面と磁石吸引性の金属板の間に約3mm程度の隙間があるがその隙間の実験への影響は少なく考慮する必要はない。
(4)前記磁石電極を電気信号増幅器のプラス極に接続し、上方の前記磁性体又は磁石吸引性金属板を電気信号増幅器のマイナス電極に接続して電位記録回路を形成し、両電極間の電圧を測定する工程、
(5)対象細胞に対し、透過性のあるセルカルチャーインサート底面の多孔質膜(Polycarbonate膜、ポアサイズ0.4μm)を介して被検物質試料を投与する工程、
(6)工程(5)で被検物質試料が投与された対象細胞について、工程(4)と同様に、両電極間の電圧を測定する工程、
(7)工程(6)での測定結果を、工程(4)での測定結果と比較して、両者の測定値に有意な差異がある場合に、被検物質試料が対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質であると評価する工程。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
本参考例では、細胞外記録を行う機器として通常のパッチクランプアンプ(Axopatch 200A, Axon instruments)を用い、本発明の細胞内電位記録方法により、光受容体チャネル(Channelrhodopsin:ChRWR)を発現するCHO細胞における細胞内電位の測定を行う。
光受容体チャネル(ChRWR)は、7回膜貫通型のロドプシン様構造を有するとされ、480nm青色光刺激に対して上向きに応答する(脱分極)ことが知られている。
Wangらの八尾教授のグループは、ChR1とChR2からキメラ遺伝子のChannelrhodopsin (ChR)-wide receiver (ChRWR)を構築し、当該ChRWR遺伝子を用いてPC12培養細胞及び大脳皮質神経細胞の細胞膜でChR2(チャネルオプシン2)を高発現させ、パッチクランプ法による光刺激による細胞内電位の応答を計測して、神経細胞に光感受性を付与できることを報告している(Wang et al., 2009, J. of Biol. Chem. 284(9): 5685-5696.、特開2006−217866号公報)。
本参考例では、八尾教授より分与されたChRWR遺伝子(1073bp)を用い、下記プライマーによりPhusion DNA polymeraseを用いてPCRで増幅した。
sense primer: CACTATAGGGAAGCTaccatggctcggagaccctggct(配列番号1)
antisense primer: ATAGAATAGGAAGCTCTActtgcctgtccctttgttga(配列番号2)
得られたPCR産物を、InFusion HD Cloning kit (TakaraBio)を用いてpD603(puromycin、DNA2.0)ベクターへ導入しhChRWR発現ベクターを構築した。このhChRWR発現ベクターをCHO細胞(JCRB細胞バンク)に導入し(Superfect, Qiagen)、hChRWR遺伝子を安定発現するCHO細胞(hChRWR-CHO安定発現細胞株)を作成した。
金コーティング磁性ナノ粒子を電極として利用するため、細胞内に導入された金コーティング磁性ナノ粒子を下方より磁石により牽引し、細胞膜を貫通させる。このことにより金コーティング磁性ナノ粒子は細胞膜を介してその一部を細胞内、細胞外に同時に露出する事になる。細胞は細胞外記録用電極の上に播種されているため、金コーティング磁性ナノ粒子の細胞膜の貫通に伴い、細胞内記録電極として作動する(図1)。
その際、金コーティング磁性ナノ粒子のCHO細胞内への導入はPolyethyleneimine(PEI, P3143 Sigma-Aldrich)を用い、下記URLを基にして改良したプロトコールで行った。(https://labs.fccc.edu/yen/docs/PEI%20preparation.pdf)
具体的には、あらかじめ10mg/ml PEI溶液(pH7)を0.2μm filter(Minisart, Sartorius stedim)を用いて調整後、-80℃で保管しておき、使用分のみを使用直前にddH2Oで100倍希釈した。5μlのPEI希釈溶液を80μl金コーティング磁性ナノ粒子と20μlの 5×HBPS(24mMHEPES+126mM NaCl, 4mM KCl, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 10mM Glucose)混合液に加え、15分間室温でインキュベーションした。
そして、(1−1)で作成した培養hChRWR-CHO細胞を、血清の含まれていないDMEM(Sigma-Aldrich社製)、又はOptiMEM I(Invitrogen社製)含有緩衝液(PBS)で洗い、上記の金コーティング磁性ナノ粒子溶液と置換し、15分37℃の培養器でインキュベーションした。
導電性ガラス上の細胞の細胞内電位は、(図2)のように配置された記録電極、アース、増幅アンプで構成される装置により計測されるが、その際、電極となるガラス面とアースが直接細胞外液と短絡しないように、ガラス面の狭い領域(直径1.5-2mmの円形領域)に培養細胞を隙間無く引き詰めるように培養を行った。
(1−2)で構築した細胞内記録電極を含む培養細胞に対して、青色光を照射して、その刺激応答量の測定を行った(図4)。
図中、青色光(12秒間照射)を25秒ごとに行い、青色光の出力強度を4段階に増強した(Max 1.2A , LED Driver M00290257, 470nm M470F1, Thorlabs)。
青色光の出力を左から右に向けて増強させると上向きの電位応答(脱分極)も大きくなった。
この結果から、細胞外記録用電極の上に播種した細胞内に導入した金コーティング磁性ナノ粒子が細胞膜を貫通し、電極と繋がることができ、細胞内膜電位を、細胞外記録機器であるパッチクランプアンプ(Current-clamp mode, Axopatch 200A, Axon instruments)により測定可能となることが確認できた。
また、本発明では、従来の細胞非侵襲的な細胞内電位測定法とは異なり、少なくとも30分以上に亘って減衰することなく安定した電気応答を記録することができた。
この参考例では、自発的に活動電位を発生させるNav1.5/Kir2.1を安定発現するHEK細胞を用いて細胞内電位の測定を行う。
Nav1.5/Kir2.1遺伝子をベクターを用いてHEK細胞(JCRB細胞バンク)を形質転換し、Nav1.5/Kir2.1を安定発現するHEK細胞を作成した。
具体的には、まずヒトNa+チャネル(Nav1.5)のαサブユニット(SCNA5, BC140813:SourceBioscience社)から、Nav1.5遺伝子を切り出し、pcDNA3.1(-) hygromycin (Invitrogen)に挿入した。
BC140813はEmbryonic type のNav1.5遺伝子なので、human heart cDNA(Zymogen)を用いたPCR法などにより、ヒト成人心筋で発現するNav1.5遺伝子に置換した。
Kir2.1(NM_000891、KCNJ2)遺伝子(1284bp)は、iPS細胞由来の心筋細胞(CDI, Cellular Dynamics International)から抽出したtotal RNA に下記プライマーによるNesting PCR法を適用した。
Kir2.1 1st sense:CCAAAGCAGAAGCACTGGAG (配列番号3)
Kir2.1 1st A/S:CTTTGAAACCATTGTGCTTGCC (配列番号4)
上記のprimerを用いたFirst round PCRではPCR産物が確認できなかったため、100倍希釈して更にPCRを行い、Kir2.1遺伝子を取得した。
Kir2.1 ICR HindIII sense: CACTATAGGGAAGCTACC atgggcagtgtgcgaaccaac (配列番号5)
Kir2.1 ICR HindIII A/S: ATAGAATAGGAAGCT tcatatctccgactctcgccg(配列番号6)
得られたKir2.1 PCR産物を、pD608(blastcidin、DNA2.0)のHindIII siteへ挿入した。
前記Nav1.5遺伝子(50ug/ml hygromycin)と共に、Kir2.1遺伝子(Kir2.1 2ug/ml blastcidin)をHEK293細胞(培養液, DMEM、Sigma-Aldrich, 10% FBS)に導入し、Nav1.5/Kir2.1の安定発現細胞株を作成した。
次いで、HEK細胞を培養(DMEM、Sigma-Aldrich, 10% FBS)し、(参考例1)と同様に、ガラス面のほぼ全面が覆われたところで、PEI希釈溶液中の金コーティング磁性ナノ粒子を当該HEK細胞内に導入し、測定用ガラス面上で37℃15分インキュベートし、測定用ガラスの下面から磁石を作用させて、金コーティング磁性ナノ粒子による細胞内記録電極を構築した。
細胞内電位の記録を行った結果、活動電位を60mVから、80mVの膜電位の変化として安定して記録できた(図5)。
同様に、電流パルスを与える事によって活動電位を誘導しても、細胞内電位を記録できた(図6)。
本参考例では、(参考例2)で使用したNav1.5/Kir2.1を安定発現するHEK細胞を用いて、パッチクランプ法に適用し、電気生理学的評価を行い、本件発明の方法を検証した。
用いた細胞外液及び細胞内液の組成は以下の通りである。
細胞外液: 126mM NaCl, 4mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1mM MgCl2, 24mM HEPES, 10mM Glucose(pH7.4 NaOH)
細胞内液: 130mM KCl, 5mM MgCl2, 5mM EGTA, 4mM Tris-ATP, 10mM HEPES (pH7.2 KOH)
(参考例2)で使用したNav1.5/Kir2.1を安定発現するHEK細胞に対して、Current injectionにより細胞を刺激し、細胞内の活動電位様の膜電位変化を記録した(図7A)。図中、上部(Vm)のトレースは膜電位の変化、下部(I)のトレースは作用させた電流量を示す。作用電流量を段階的に大きくすると受動的であった膜電位応答に加えてNav1.5活性による全か無の法則に従う、自己再生的電位(活動電位)が発生した。 Nav1.5活性は直後に不活性化が起こる。Nav1.5が不活性化状態(不応期)から回復するまでNav1.5活性が減少する。黒矢印(arrow head)で示すように最初の電流刺激に対する応答に比べ、二度目の電量刺激に対する応答が著しく減少している。このことから自己再生的(活動)電位がNav1.5を介した電位応答である事が強く示唆される(図7A)。
<Nav1.5 電流(図7B)>
膜電位を-80mV(Holding potential)に固定し、その膜電位からステップ上に-40mVから 40mVへ10mV間隔で電位を変化させた。それに伴いNav1.5活性による一過性の内向きのナトリウム電流を記録した(図7B)。
<KCNJ2(Kir2.1)電流(図7C)>
Nav1.5 電流(図7B)測定と同様に、膜電位を-80mVに固定し、Kir2.1電流が測定しやすいように-20mVに膜電位を変更し(直後に一過性のNav1.5 電流が確認できる)、そこから、-40mVから-120mVへ10mVずつ膜電位を過分極する事によりKir2.1電流の存在を確認した。続いて膜電位を-20mVに移す事によりNav1.5 電流の膜電位依存性の不活性化過程も観察できた。
本参考例では、Streptolysin Oを用いるWalevらの方法(PNAS 98:(6) 3185-3190(2001))を基に改良した以下の方法により、金コーティング磁性ナノ粒子を培養細胞内に導入した。
まず、Streptolysin O (SLO)(和光純薬社製)を、DTTを用いて還元し、活性化させて、SLO濃度を約5U/μlに調製した。
次いで、2.5×106のCHO又はHEK細胞を金コーティング磁性ナノ粒子40μl及び金コーティング磁性ナノ粒子導入溶液(20μl 5×HBPS(1mM Ca2+, 1mM Mg2+)、80μl ddH2O)に混ぜ合わせ、SLOと共に10分間37℃でインキュベートすることで、SLOにより細胞膜へのポア形成を行うと同時に、当該ポアを通して金コーティング磁性ナノ粒子を細胞内に導入した。
SLOポアの不活性化(閉口)は細胞含有溶液の500-1000μlのDMEM 10%FBSと混合し、20分以上37℃でインキュベートする事により完了し、金コーティング磁性ナノ粒子が細胞内に多数導入されているのを顕微鏡下で確認した。
以上のことから、タンパク質毒素を用いる方法でも、細胞内に導電性ナノ粒子を導入できることが確認できた。
(5−1)細胞内の導電性ナノ粒子を上方の磁石電極で引き付け細胞膜を貫通させる方法 本参考例では、Ni-Cu-Niでコーティングされた直径1mm円柱ネオジウム磁石(ネオマグ株式会社)を、ネオジウム磁石電極(MagEle)として用いて細胞内記録電極を構築する。
(参考例2)で作成した「Nav1.5/Kir2.1の安定発現HEK細胞」を用い、細胞の上方のネオジウム磁石電極(MagEle)により、細胞内に導入した金コーティング磁性ナノ粒子を磁石電極に引き付け、細胞膜を貫通させて細胞内記録電極を構築し、細胞内電位変化を記録する(図8)。
(参考例1)と同様、PEI希釈溶液を用いて金コーティング磁性ナノ粒子を細胞内に導入した。なお、ナノ粒子導入は、(参考例4)と同様にSLOを用いてもよい。細胞の上方に配置したネオジウム磁石電極(MagEle)により、細胞内に導入した金コーティング磁性ナノ粒子を引き付け、細胞膜を貫通させて細胞内記録電極を構築し、細胞内電位変化を記録した(図10)。
PEIと混合した金コーティング磁性ナノ粒子(nanoimmunotech社製、NITmagold Cit)を、側面が絶縁体でコーティングされた磁石電極表面に添加し、当該ナノ粒子を磁石電極に約30分かけて吸着させた。
鉄板上に設置した培養ディッシュ内でNav1.5/Kir2.1 HEK細胞、及び培養心筋様細胞(iCell cardiomyocyte)の上方から、前記磁石電極を、導電性ナノ粒子の吸着面を下に向けた状態で直接接触させた。磁石電極は培養ディッシュ下方の鉄板に吸引されて細胞上方に固定され、導電性ナノ粒子は、PEIを介して細胞膜を貫通し、かつ磁石からの磁力により細胞膜内にとどまることが観察された(図9)。
さらに、いずれの細胞においても、得られた細胞内記録電極により、(5−1)の場合と同様に細胞内電位変化が記録できた。
すなわち、あらかじめ導電性ナノ粒子を細胞内に導入する工程がなくても、導電性ナノ粒子とPEIとの混合物を磁石電極に吸着させて細胞に押し付ける工程による、非常に侵襲性の少ない方法により細胞内記録電極が構築でき、細胞内電位変化の記録も可能であることを確認した。
CHO細胞など通常の動物細胞は導電ガラス表面に効率よく接着するが、心筋細胞やHEK細胞など細胞によっては導電ガラス表面への接着効率が著しく低い細胞もある。そのような細胞を直接導電ガラス表面に播種した場合、培養容器の底面を形成する導電ガラス表面の全体を覆うようにまで細胞を培養することは極めて困難である。
そこで、あらかじめ導電ガラス表面にコラーゲン(Collagen)を格子状に塗布しておき、その上から細胞の播種を行い、全面を覆うまで培養する。コラーゲン塗膜の無い箇所では、細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子の導電性ガラスとの直接接触が可能となる。
コラーゲンは導電性が低いが、細胞接着性も導電ガラスへの接着性も高いため、コラーゲン塗膜箇所での細胞接着率を向上させることができる。このような物質としては、他にfibronectin, Poly-L-lycineなどがあり、コラーゲンに代えて使用することができる。
本参考例は、導電性プレート電極を細胞内の導電性ナノ粒子と共に構築した細胞内記録電極を用いることで、細胞内電位と同様に細胞内に発生する細胞膜電流も測定できることを確認した実験である。
CHO細胞を培養(Minimum Essential Medium Eagle Sigma-Aldrich, 10% FBS BioWest, 40mM L-グルタミン 和光純薬)し、Streptolysin O (SLO)(和光純薬社製)を、DTTを用いて還元し、活性化させて、SLO濃度を約5U/μlに調製した。
金コーティング磁性ナノ粒子20μl及び金コーティング磁性ナノ粒子導入溶液(5μl 5×HBPS(1mM Ca2+, 1mM Mg2+))を5×105のCHO細胞に導入し、導電ガラス上に播種した。ガラス面の全面が覆われたところで、金コーティング磁性ナノ粒子による細胞膜電流の記録を膜電位固定法を用いて行なった。実験前にCHO培養液(Minimum Essential Medium Eagle Sigma-Aldrich, 10% FBS BioWest, 40mM L-グルタミン 和光純薬)は細胞外溶液(24mMHEPES+126mM NaCl, 4mM KCl, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 10mM Glucose)に置換した。膜電位固定法はAxopatch 1D(Axon Instruments)に人工脂質膜の実験に用いるheadstage (CV-4)を用いて行った。その理由は導電性ガラス上に数百にのぼる細胞が培養されている。膜電位固定法では膜電位を変換するためにまず細胞膜の脂質膜に由来する容量をチャージする必要がある。そのためには瞬時に大量の電流を流す事のできるVoltage clamp Amplifierが必要なためである。
膜電位固定法実験では膜電位を-80mVに固定し、膜電位をステップ様に-60, -50, -30, -10, 10, 30, 50, 60mVと1.4秒の長さの電位パルスを与えた(図11A下方)。その膜電位の刺激に応答して外向き電流が観察された(図11A上方)。図11A上で矢印で示したTransient, Sustainedの各々のポイントで電流の大きさを測り、図11Bで、電流(縦軸, pA)−電圧(横軸, mV)の関係をグラフで示した。
膜電流(細胞膜に存在するイオンチャネルを流れる電流)を測定するためにはパッチクランプアンプを用いる。その際、細胞膜電位を記録した場合のCurrent clamp modeではなく、Voltage clamp modeを使用する。単一細胞ではなく、多数の細胞の膜電位を同時に制御する場合、全体の細胞膜(脂質二重膜)の膜容量が細胞数×一細胞あたりの脂質二重膜に由来する容量であるために、非常に大きくなる。そのため参考例1などの場合と異なり、大容量の電流を流すことのできるAxopatch-1D Patch-clamp amplifier(Axon Instruments)を用いる。
今まで使用してきたAxopatch 200A(Voltage clamp)は通常の単一細胞の膜電位を制御する実験の場合に特に適している。多数の細胞に用いる場合は、合計の細胞膜-脂質二重膜の面積が大きいため、大量の膜電位を制御する必要があるので、人工脂質二重膜実験測定用のCV-4 Head stageが使用できるAxopatch-1Dを用いた。人工脂質二重膜実験測定用のHead stageは大きな電流を流すことができるため、多数の細胞の脂質二重膜をすばやくチャージできるという利点がある。なおAxopatch-1D Patch-clamp amplifierに代えてBilayer Clamp Amplifier (BC-535) (Warner Instruments)などを使用してもよい。
(1−1)チャージアンプの原理応用のための予備実験
この実験は、チャージアンプを細胞内に導入したナノ粒子との組み合わせにより、生物電位の測定を行うに当たり、その測定系が有効である事を示すための実験である(図12)。
回路Aは、記録に用いたCurrent-clamp modeのパッチクランプアンプAxoptch 200AにModel cell(細胞等価回路:500MΩ抵抗と33pFコンデンサーを並列につなげた回路に、矩形電流パルス(20ms, 120pA)を加え、その等価回路を通した電位変化を測定した(図12回路A)。
それに続き、等価回路と増幅器のマイナス入力の間にチャージアンプのセンサーとなる導電ガラスを接続した。この導電ガラスをコンデンサーとして作用させるために導電コーティングの施されていないガラスの下方にアルミ箔を配置した(図12回路B)。
導電ガラスーアルミ箔コンデンサー挿入による電圧出力への影響を回路AとBとの差を計算し評価した。別々に行った同様の実験から、波形振幅に対しては3.3%、5.7%減少するという誤差が認められたが、それ以外、波形自体にはフィルター効果などの影響は認められないことがわかった。
このことから導電ガラス−アルミ箔コンデンサーはチャージアンプのセンサーとして有効であり、導電ガラス上に培養した細胞の電気的活動(細胞内外の荷電イオンの動き)の測定に応用できると判断した。
図12の回路Cでは実際の細胞を使用した場合の配置回路を示した。サンプルとして、前記(参考例2)で用いたと同様の細胞(Nav1.5/Kir2.1 HEK細胞)を用い、チャージアンプを使用して細胞の自発性活動電位を測定し、細胞内膜電位を、チャージアンプの原理を応用して細胞外記録機器で測定可能であることを確認した(図12回路C)。
本実施例では、心筋様細胞を用い、細胞内の活動電位などによって起こる細胞内膜電位の変化を、導電性ナノ粒子を通して電荷の変化ととらえ、この電荷信号変化(活動電位発生に伴う荷電したイオン(Na+, K+,Ca2+, Cl-)の細胞内外への動き)をチャージアンプの原理を応用して電圧信号として測定する(図13)。
具体的には、心筋様細胞(iCell Cardiomyocyte:CDI社)を、導電ガラスの(厚さ2mm)上に播種し、培養液として「iCell Cardiomyocytes Maintenance Medium」を用いて培養した。金コーティング磁性ナノ粒子を、以下の方法によりStreptolysin O(SLO,和光純薬)を用いて心筋様細胞内に導入した。
すなわち、PBS8-(-)で一度洗い、ナノ粒子-SLOミックス(20ul PEG-Gold coated magnetic nanoparticle, 5μl 5×HBPS, 1μl(1U)の活性化したSLO)で置換し、培養器(37℃)にて、15分保持する。続いて、溶液をiCell Cardiomyocytes Maintenance Mediumに置換し(血清によるSLOの不活性化)、翌日以降に実験を行った。
このように、本願発明においてはじめてチャージアンプの原理を利用して導電性ナノ粒子により細胞の自発性活動電位が測定できることを実証できた。
本実施例では、導電ガラス表面への接着効率低い細胞として典型的な心筋様細胞(iCell Cardiomyocyte2)を用い、(参考例6)の方法で調製した導電ガラス表面で培養後、金コーティング磁性ナノ粒子を導入し、磁場により細胞膜を貫通させた後に、Veratridineのようなナトリウムチャネルのオープナーの作用について活動電位を誘発記録した。本実験は室温で行った。
具体的には、まずゲル状に調整したコラーゲン(アテロコラーゲン、(株)高研)を導電ガラス表面中心部の直径約5mm円内に線状に塗布後、先端を溶かした微小電極を使って格子状に引き伸ばし、約0.5μm間隔の格子状コラーゲン塗膜を形成させた。
次いで、当該導電性ガラス表面に心筋様細胞(iCell Cardiomyocyte2)を播種し、心筋様細胞専用培地(iCell Cardiomyocytes Maintenance Medium)で約6日培養して心筋細胞シートを形成させた。
しかしながら、この標本は自発性活動電位が観察できなかったため(data not shown)、生理食塩水内にナトリウムチャネルオープナーとして働くVeratridine(Sigma-Aldrich)を最終濃度100μMとなるように投与し、活動電位を誘発記録した。Veratridine投与から40秒後にゆっくりした脱分極が観察され、それと続いて自発性活動電位が記録された(図15)。
本実施例は、(参考例2)の方法に従って細胞膜に金コーティング磁性ナノ粒子を貫通させた培養神経細胞で、容量型電位測定機能を付加した磁石電極を用いた測定方法により細胞内電位が測定できることを確認する。
(3−1)培養神経細胞の調製
培養神経細胞として、NG108-15細胞(neuroblastoma-glioma hybrid cells)を用い、DMEM (Sigma-Aldrich)、HAT supplement (Thermofisher)及び10%FBS (Biowest)を含む培養液で培養した。0.1% Polyethyleneimine (pH8.4, 150mM Sodium Tetra-Borate (Wako))でコーティングをしたカバーガラスにNG108-15を播種し、培養液は上記の培養液のFBSを 5%とし、それに500μM Ibuprofen (Wako)を添加することにより神経誘導を行った。 神経誘導5日後に以下の実験を行った。
PEI-PEG-金コーティング磁性ナノ粒子を混合し、3時間放置した。ネオジウム磁石の細胞接着面にこの混合液を移動させ、更に15分放置し、金ナノ粒子を磁気によりネオジウム磁石電極に結合させる。
この電極を鉄板の上に設置した培養細胞上に置いた。細胞下方の鉄板と磁石電極は磁力により引き合うので、磁石電極は細胞の上で自立固定され、磁石電極表面の金ナノ粒子はPEIの作用で一端が細胞内に露出するように貫通した。
磁石電極は、磁力220ミリテスラ、直径6mmのネオジウム磁石を用いた。細胞接触面以外をパラフィルムで覆った磁石電極をプラス極に接続し、マイナス極はパラフィルムの上から吸着させた強磁性体からなる容量型電位測定デバイスとして働かせる磁石電極(MagEle)である。この際、強磁性体と磁石電極との間のパラフィルムは厚くし、完全に絶縁されていることを確認した(図16A)。
ここで、容量型電位測定デバイス機能を付加した磁石電極(C-M electrode)を用いて記録を行った。
ここでは、(3−1)で用いたカバーガラスに代えて、Polycarbonateセルカルチャーインサート(ポアサイズ0.4μm, Thermo Scientific)内に培養神経細胞(NG108-15細胞)を播種、培養した他は、(3−1)及び(3−2)と同様の方法により調製し、次いで導電性ナノ粒子(金ナノ粒子)を細胞壁に貫通させた(図16B)。
セルカルチャーインサートを用いることの利点はポアサイズが0.4μm(Thermo Scientific)のPolycarbonate透過膜の上に細胞を培養しているため、細胞の上表面が磁石に覆われても、インサートの下方の隙間から、異なる溶液での置換が可能になる。薬物の作用を観察したり、Agonist を投与し、ligand gated channelの活性の測定を行うことにも適用可能である。
NG108-15細胞を5日神経分化誘導を行った後、培養液を細胞外液(生理食塩水)に置換し、活動電位記録の実験を行った。C-M electrodeをカバーガラスに播種した細胞上に配置することにより自発性の活動電位を記録した。この方法は細胞の自発性活性に強く依存するため、神経分化の程度が実験の成功に大きく影響する(図17A)。
自発性の活動電位に加え、神経伝達物質であるグルタミン酸による神経の活性が記録できるかを確認するために次の実験を行った。NG108-15細胞を2日神経分化誘導を行い実験を行った。上記の実験同様C-M electrodeを細胞上に配置し、実験記録を行った。細胞外液にグルタミン酸を投与し(最終外液濃度800μM)、グルタミン酸受容体を介した応答を記録した。グルタミン酸により、内在性のグルタミン酸受容体が活性化され、それが膜電位の脱分極(上向きの変化)応答として記録された。グルタミン酸により誘発された膜電位変化は脱感作のため、ゆっくり減衰し、約90秒後にベースラインに戻った。図上のベースラインとグルタミン酸応答のartifactは取り除いた(図17B)。
CHO培養細胞に、イオンチャネル遺伝子であるSCN5A(Nav1.5)遺伝子、CACNα1C(Cav1.2)遺伝子、及びKCNH2遺伝子と共に、ChRWR(Channelrhodopsin)遺伝子(八尾教授より分与)を導入し、これらイオンチャネルと光受容体チャネル(ChRWR)を一過性に発現させ、心筋活動電位モデル細胞を作製した。
次に、(実施例2)と同様に、SLOを用いて金コーティング磁性ナノ粒子を導入し、磁場により当該ナノ粒子を細胞膜に貫通させた後に、青色LEDを照射し(手動照射時間約0.5秒)、光受容体チャネル(ChRWR)を活性化させて活動電位を誘発した。活動電位の記録は、(実施例2)で用いたチャージアンプモード(CHargeAmpLifier(CHAMPL)mode)(図13)を用いて行った。
その際のチャージアンプモードでは、(+)電極を細胞播種面の導電ガラスに、(−)電極を導電ガラス下方に設置した短冊状アルミホイルに接続する。なお、アルミホイルは記録する細胞の真下に設置する事が必須であり、記録細胞から離れた部分に設置すると電気信号は検知できない。
さらに10mMのLidocaine投与によりナトリウムチャネルを抑制すると、全ての活動電位は消失し、光受容体チャネルによる応答のみなった(図18;図中oマークはLED照射を示す。)。
本実験では、(実施例3)で用いた培養神経細胞(NG108-15細胞)を下記の分化条件で神経誘導し、(実施例3)と同様の方法でMagEle(磁石電極)を対象細胞の上方に固定し、MagEleの細胞接着面に金コーティング磁性ナノ粒子を細胞貫通させた後、(+)極のMagEleと、MagEle上面を完全に覆う絶縁体(パラフィルム膜)上にアースとして設けた強磁性体(MagEle)により細胞内電位を測定した。その際、絶縁体は、(+)極のMagEleの上面及び側面回りは完全に覆ったが、細胞が接着している基板のカバーガラスには固着させず、細胞は外液から隔離しなかった(図19)。
NG108-15細胞の分化条件は、Forskolin(10μM)を加えた2%FBSを含むDMEM/HAT培地で3週間培養して行った。
このことは、細胞外に投与した試薬がMagEleによる記録中のNG0108-15細胞の活動に作用したことを示している。
この実験例では、活動電位の大きさが他の実験例より小さく観測された。このような現象は電極抵抗が非常に高い場合に起こる現象である。これは、記録対象となる細胞で導電性ナノ粒子の膜貫通効率が低い場合に起こる現象と考えられ、この点は容量型電位測定法の利点としても作用する。すなわち、チャージは、Q=VC (チャージ=電圧×膜容量)という電圧と膜容量の積で表現されるから、電圧変化が高電極抵抗の影響で小さい場合でも、細胞が十分大きければチャージ(Q)の変化として検知する事が出来る事が示唆される。
また、(図20)の結果では、ベースラインの揺らぎ様の動きが極めて小さい。このことは、MagEleに、若干ではあるがACフィルター作用があることが示唆される。このような現象は、MagEleとClip onするGroundとの間の距離が近すぎるために、コンデンサー値が低かったことで生じると考えられる。ACフィルター作用を防ぐにはパラフィルムのみでなく(図12)で用いた(導電)ガラス(無限大抵抗)などの抵抗値の高い1mm程度の厚さのある素材を組み合わせて十分なコンデンサー容量値を確保することが望ましい。
また、本発明は基本原理が簡単なため、比較的安価に供給が可能であり、電気生理学の学生実習、基礎研究などへの応用が期待できる。
Claims (18)
- 電圧増幅器及びコンデンサーを形成する第1及び第2の導電体を含み、第1の導電体を前記電圧増幅器のプラス極に、第2の導電体をマイナス極に接続して電位記録回路を形成する、対象細胞の細胞内電位又は電位変化を記録可能な容量型電位測定デバイスであって、前記第1の導電体が、
(1)対象細胞を上表面に接着させた導電性プレートであり、かつ、その上表面において対象細胞下面の細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子の一端と接しており、前記導電性ナノ粒子の他の一端は細胞質内に存在している、導電性プレートであるか、又は
(2)対象細胞の上方から当該細胞を接触させた磁石電極であり、かつ、その下表面において対象細胞上面の細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子の一端と接しており、前記導電性ナノ粒子の他の一端は細胞質内に存在している、磁石電極である、
容量型電位測定デバイス。 - 前記第1の導電体が、
(1)対象細胞を上表面に接着させた導電性プレートの真下の磁石により、当該細胞内の導電性ナノ粒子を引き付けることにより、前記導電性ナノ粒子が対象細胞の細胞膜を貫通し、当該導電性ナノ粒子の一端が接している導電性プレートであるか、
(2)対象細胞の上方向から当該細胞を接触させた磁石電極により、当該細胞内の導電性ナノ粒子を引き付けることにより、前記導電性ナノ粒子が対象細胞の細胞膜を貫通し、当該導電性ナノ粒子の一端が接している磁石電極であるか、又は
(3)導電性ナノ粒子を表面に吸着させた磁石電極を対象細胞表面に押し付け、当該細胞の反対側に設置された金属板の吸引力によって磁石電極を固定し、当該磁石電極と前記金属板との間に生じる磁力によって、前記導電性ナノ粒子を前記細胞の内側方向に引き寄せることにより、前記導電性ナノ粒子が対象細胞の細胞膜を貫通し、当該導電性ナノ粒子の一端が接している磁石電極である、
請求項1に記載の容量型電位測定デバイス。 - コンデンサーを形成している第1の導電体が対象細胞を上表面に接着させた導電性プレートであって、当該導電性プレート上面は対象細胞下面の細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子の一端と接しており、第2の導電体が導電性プレートの下面に接触して設けられた導電板である請求項1又は2に記載の容量型電位測定デバイス。
- コンデンサーを形成している第1の導電体が対象細胞の上方から当該細胞を接触させた磁石電極であって、当該磁石電極下面には対象細胞上面の細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子の一端が接し、当該磁石電極の上面及び側面周りは絶縁体で覆われており、第2の導電体が磁石電極の上面に絶縁体を介して設けられた磁性体もしくは磁石吸引性金属板である、請求項1又は2に記載の容量型電位測定デバイス。
- 前記磁石電極の側面周りに設けられた絶縁体は、培養容器底面とは固着されておらず、磁石電極下面に接触する対象細胞は細胞外液から完全には隔離されていないことを特徴とする、請求項4に記載の容量型電位測定デバイス。
- 前記磁石電極下面に接触する対象細胞は培養容器底面上方にある多孔質膜上に接着しており、細胞外液が前記培養容器底面と多孔質膜との間から拡散流入可能である、請求項5に記載の容量型電位測定デバイス。
- 対象細胞が接着する多孔質膜が、セルカルチャーインサート底面の多孔質膜であり、前記対象細胞が接着しているセルカルチャーインサート底面と前記培養容器底面との間には、細胞外液が還流していることを特徴とする、請求項6に記載の容量型電位測定デバイス。
- 容量型電位測定デバイスを用いて対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定する方法であって、
容量型電位測定デバイスは電圧増幅器及びコンデンサーを形成する二つの導電体を含み、ここで、二つの導電体は対象細胞の細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子の一端が接しており、前記導電性ナノ粒子の他の一端は細胞質内に存在している第1の導電体と、他方の第2の導電体とからなり、
第1の導電体を電圧増幅器のプラス極に接続し、第2の導電体をマイナス極に接続して電位記録回路を形成する工程、及び
コンデンサーを形成する二つの導電体の間の電圧変化を記録する工程、
を含むことを特徴とする、方法。 - コンデンサーを形成している第1の導電体が対象細胞を上表面に接着させた導電性プレートであって、当該導電性プレートの上面は対象細胞下面の細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子の一端と接しており、第2の導電体が導電性プレートの下面に接触して設けられた導電板である、請求項8に記載の方法。
- コンデンサーを形成している第1の導電体が対象細胞の上方から当該細胞を接触させた磁石電極であって、対象細胞が接触する磁石電極の下面で細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子の一端と接しており、当該磁石電極の細胞との接触面以外の上面及び側面周りは絶縁体で覆われ細胞外液に接触しておらず、第2の導電体が磁石電極の上面に絶縁体を介して設けられた磁性体もしくは磁石吸引性金属板である、請求項8に記載の方法。
- 前記磁石電極の側面周りに設けられた絶縁体は、培養容器底面と固着されておらず、磁石電極下面に接触する対象細胞は細胞外液から隔離されていないことを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記磁石電極下面に接触する対象細胞は前記培養容器底面上方の多孔質膜上に接着しており、当該多孔質膜下面から細胞外液を拡散流入させる工程を含むことを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 対象細胞が接着する多孔質膜が、セルカルチャーインサート底面の多孔質膜であり、当該多孔質膜下面と前記培養容器底面との間を、細胞外液を還流させる工程を含むことを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 容量型電位測定デバイスを用いて、対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、
ここで、容量型電位測定デバイスは電圧増幅器及びコンデンサーを形成する二つの導電体を含み、
(1)コンデンサーを形成する二つの導電体のうち、対象細胞の細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子の一端が接しており、前記導電性ナノ粒子の他の一端は細胞質内に存在している第1の導電体を電圧増幅器のプラス極に、第2の導電体をマイナス極に接続して電位記録回路を形成する工程、
(2)両電極間の電圧又は電圧変化を測定する工程、
(3)対象細胞に対し、被検物質試料を投与する工程、
(4)工程(3)で被検物質試料が投与された対象細胞について、工程(2)と同様に両電極間の電圧又は電圧変化を測定する工程、
(5)工程(4)での測定結果を、工程(2)での測定結果と比較して、両者の測定値に有意な差異がある場合に、被検物質試料が対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質であると評価する工程、
を含む、スクリーニング方法。 - 前記工程(3)の対象細胞に対し被検物質試料を投与する工程が、細胞外液に被検物質試料を投与する工程である、請求項14に記載のスクリーニング方法。
- 前記工程(1)のコンデンサーを形成する第1の導電体が、対象細胞を上表面に接着させた導電性プレートであって、当該導電性プレート上面は対象細胞下面の細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子の一端と接しており、第2の導電体が導電性プレートの下面に接触して設けられた導電板である、請求項14又は15に記載のスクリーニング方法。
- 前記工程(1)のコンデンサーを形成している第1の導電体が、対象細胞の上方から当該細胞を接触させた磁石電極であって、対象細胞が接触する磁石電極の下面で細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子の一端と接しており、当該磁石電極の細胞との接触面以外の上面及び側面周りは絶縁体で覆われ細胞外液に接触しておらず、第2の導電体が磁石電極の上面に絶縁体を介して設けられた磁性体もしくは磁石吸引性金属板である、請求項14又は15に記載のスクリーニング方法。
- 前記対象細胞は培養容器底面上方のセルカルチャーインサート底面の多孔質膜上に接着しており、
前記工程(1)は、セルカルチャーインサート底面の多孔質膜と培養容器底面との間を、細胞外液を還流させる工程を含むものであり、
前記工程(3)における対象細胞に対し被検物質試料を投与する工程が、還流させる細胞外液中に被検物質試料を投与することで、多孔質膜を介して対象細胞に投与する工程であることを特徴とする、請求項17に記載のスクリーニング方法。
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