CN112041425B - 通过电容型电位测量装置测量细胞内电位的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供通过对细胞的侵入性小且不需要熟练技术的简便方法来准确地测量和控制细胞内电位的方法。本发明通过预先导入有导电性纳米粒子的目标细胞的细胞表面上粘附的磁铁电极或者与导电性板电极接触的磁铁而来的磁力，将细胞内的导电性纳米粒子吸引到与上述电极的粘附面侧，贯通细胞膜而使细胞外的一端与磁铁电极或导电性板电极接触，或者使吸附在磁铁电极表面的导电性纳米粒子粘附在目标细胞的上方并被设置在细胞下方的铁板吸引而贯通细胞膜，由此留下与磁铁电极接触的细胞外的一端。与该导电性纳米粒子接触的导电性板与导电板(铝箔)一起形成电容器，或者在磁铁电极的上方隔着绝缘体设置磁性体而形成电容器，通过该电容器作为传感器感应目标细胞内的电荷变化，并转换为电压变化，从而能够测量细胞内电位。此外，可以观察向外液中给予的受检试剂对细胞的影响。

Description

通过电容型电位测量装置测量细胞内电位的方法
技术领域
本发明涉及使用电容型电位测量装置(Capacitive potential detectiondevice)、利用电荷放大器(チャージアンプ)原理来测量细胞内膜电位(细胞内电位)的方法。
背景技术
所有细胞在细胞内和细胞外具有不同的离子组成，通过保持其离子分布差异及其离子组成差异的转运蛋白(例如钠泵)来保持细胞内电位(膜电位)。在静息状态下，膜电位虽稳定(静息膜电位)，但由于膜表面的离子通道被活化并打开，因膜内外的离子浓度差，离子一下子放出或流入，整个细胞内的电位发生变化(发生去极化或超极化)，导致细胞内电位发生变化。其结果是，在心肌和神经中引起动作电位的产生/传递，引起激素和神经递质的释放等信息传递，在心肌和骨骼肌细胞中引起收缩。
一直以来，通过测量细胞的膜电位变动、与此相伴的通过离子通道的膜电流，可对细胞的状态变化和细胞对药物等的响应进行观察。特别是在药物发现筛选(創薬スクリーニング)时，将培养的心肌细胞、神经细胞等暴露于药物发现候选药物，测量膜电位的变化而对心脏毒性、神经毒性等进行评价正在广泛进行。
为了测量细胞内电位，以往在细胞内插入金属制电极或充满电解液的微玻璃电极，测量与细胞外的电极的电流或电压。最近，建立了基于膜片钳(Patch Clamp)法的测量法，并已成为主流。膜片钳法是指通过使充满细胞内电解液的玻璃移液管(ピペット)和细胞膜紧密粘附，使玻璃移液管和细胞电一体化，精确测量、控制细胞内电位变化的方法。
膜片钳法包括测量在整个细胞中表达的离子通道的动态的全细胞模式；测量仅在膜片移液管内径内的细胞膜中含有的离子通道的动态(单通道活性)的方法(细胞贴附(oncell)模式)；还有从细胞中分离出其微细胞膜进行测量的方法(内膜片(inside patch)、外膜片(outside patch)模式)。
在全细胞模式中，通过刺破与玻璃移液管粘附的电极的内径上的细胞膜，测量细胞内电位变化、通过整个细胞中的离子通道的电流(离子通道的活性)的动态。由于上述技术是在显微镜下对单个细胞直接使用电极进行的记录法，因此需要高度熟练的技术以及较高的专业知识。
这些细胞内记录法(电压钳、电流钳)以膜片钳法(全细胞膜片)为代表，能够观察通过细胞膜中表达(存在)的离子通道的离子的动态。在电压钳模式中，通过包含在膜片钳放大器中的反馈功能可以有效地控制细胞内的电位，并且可以将由离子通道开闭引起的快速(以毫秒为单位的)现象记录为离子电流变化。在电流钳模式中，可以将因离子通道的活动对细胞的作用记录为(膜)电位变化。
膜片钳方法中包括手动(手动式)膜片钳法和自动膜片钳法，手动膜片钳法在电生理学测量中的数据可靠性高。
然而，由于操作人员使用显微镜、操作操纵器(マニピュレーター)进行实验等的手法复杂且需要丰富的专业知识，因此效率非常差。这在医学生物学研究，特别是在药物发现领域中已经成为一大障碍。
另一方面，自动膜片钳法是自动化的电生理学测量仪器，近年来虽然性能显著提高，但在数据可靠性方面，还没有获得能够取代手动膜片钳法的程度的可靠性。此外，由于自动膜片钳试验仪器非常昂贵，其使用仅限于一些大制药企业。
此外，近年来，作为为了测量细胞内电位而使电极贯通细胞膜的方法，代替膜片钳法，开发了对细胞施加高电压进行电穿孔的方法(非专利文献3)，据报道能够记录大鼠心肌细胞的细胞内电位。然而，在该方法中，由于被穿孔破坏的细胞膜被立即修复，电极进入细胞内的通路(アクセス)消失，因此不能说是实用的方法。
相对于这样的细胞内记录法，近年来，在细胞外记录电变化的细胞外记录法的开发也有所进步并已广泛利用。细胞外记录法是以体外多点平面电极(多电极阵列)系统为代表，通过在细胞外与细胞接触放置的电极在细胞外记录电变化的方法(专利文献1～专利文献4)。
作为体外多点平面电极(多电极阵列，MEA)系统的应用，已开始用于培养神经细胞的可塑性研究和使用人iPS细胞来源的神经细胞、心肌细胞的药物安全性试验等。
然而，MEA由于是细胞外记录而容易进行细胞操作，但只能记录交流样的变化(膜电位的单位时间变化、微分波形)，因此无法测量细胞内发生的缓慢的膜电位变化。因此，通过测量获得的信息有限，其应用有限。
作为用基于MEA的方法尝试细胞内记录的报道，虽然有通过在蘑菇形状的电极上接种细胞并对其施加高电压而成功破坏细胞膜的例子，但保持细胞内电位的记录条件的时间短，没有显示出作为记录方法的有效性(非专利文献1)。
由以上可知，尽管有MEA这样容易操作且稳定的细胞外记录法，但是仍期望提供一种能够以与手动膜片钳法同等或其以上的高精度进行膜电位的测量、并且不仅在细胞群中而且在培养神经细胞等这样的单细胞的状态下也能够测量细胞内电位的方法(非专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2012/043820
专利文献2：WO2013/061849
专利文献3：WO2014/098182
专利文献4：日本特表2005-505761号公报
非专利文献
非专利文献1：Anna Fendyur等，Frontiers in Neuroengineering，Dec.2011，Vol.4，Article14，p.1-14
非专利文献2：Raphael Levy等，NanoReviews 2010，1：4889-DOI：10.3402/nano.v1i0.4889
非专利文献3：Micha E.Spira等，Nature Nanotechnology Vol.8(Feb.2013)p.83-94/DOI:10.1038/NNANO.2012.265
非专利文献4：Khudhair D.等，(2017)Emerging Trends in Neuro Engineeringand Neural Computation.pp.41-59
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明的目的在于提供通过对细胞的侵入性小且不需要熟练技术的简便方法来准确地测量单个细胞单元或细胞群(片状(シート状)细胞或细胞团)的细胞内电位的方法。特别是，本发明的目的在于提供能够在不能以片状方式培养的细胞(典型地是培养神经细胞)等中记录在细胞内产生的动作电位或其变化的方法。
解决技术问题的技术手段
在想要准确地测量细胞内电位的情况下，将玻璃微电极插入细胞内，通过放大器(アンプ)放大与细胞外电极(接地电极(アース))的电位差，并用监测器进行观察。
近年来，金纳米粒子不仅作为免疫学诊断用试剂盒、还作为针对包括人细胞的哺乳动物细胞的核酸和各种药剂等的递送用载体而广泛使用，对细胞的负荷少的细胞内导入法的开发也在进行中(非专利文献2)，除此之外，本发明人等还关注于金纳米粒子的细胞毒性极低且有导电性的特性，提出了用导入细胞内的金纳米粒子代替玻璃微电极的设想。
本发明人等进行深入研究的结果是，使用金涂覆磁性纳米粒子，隔着导电性玻璃板(ガラスプレート)用强磁铁吸引细胞内的金纳米粒子，使其贯通细胞膜，设法成为细胞内和导电性玻璃的接点。具体而言，在粘附于表面导电性的玻璃板表面上的培养动物细胞内预先与聚乙烯亚胺等药剂一起导入金涂覆磁性纳米粒子，用导电性玻璃板正下方的钕磁铁吸引金纳米粒子使其贯通细胞膜，使细胞外的一端与导电性玻璃接触后，通过放大器放大导电性玻璃与细胞外电极(接地电极)的电位差，由此可确认能够与使用以往的细胞内玻璃微电极的情况同样地测量细胞内电位。
此外，作为另一种方法，确认通过从细胞的上方使涂覆有导电性金属的钕磁铁粘附而在细胞上方产生磁场，细胞内的导电性纳米粒子(金涂覆磁性纳米粒子)也可以贯通细胞膜并与磁铁电极(MagEle)一起构建细胞内记录电极，也可以测量细胞内电位。
由此，通过利用磁场吸引预先导入细胞内的导电性纳米粒子并使其贯通细胞膜，能够尽可能抑制对细胞的损伤并使细胞内外的电极彼此连接。
此外，还开发了一种贯通细胞膜而无需将导电性纳米粒子从细胞外导入细胞内的工序、对细胞的损伤更少的细胞内电位记录方法。具体而言，确认了能够通过使导电性纳米粒子吸附于磁铁电极表面，从细胞的上方压在细胞表面上，并被设置在细胞下方的金属板吸引，从而贯通细胞膜，能够构建磁铁电极和细胞内记录电极。
通过这些方法构建的细胞内记录电极能够通过与设置在细胞外液中的细胞外电极(接地电极)连接并利用放大器放大两个电极之间的电位差来测量细胞内电位(同日提交的专利申请)。
本发明人等完成的上述方法由于采用了通过磁场使导电性纳米粒子贯通细胞膜的方法，因此能够简便地进行，能够尽可能抑制对细胞的损伤，因此是具有能够在使细胞长期持续在正常状态下生存的同时观测细胞内电位的变动这样的巨大优点的划时代的技术。然而，如果作为细胞内电位的测量方法来看，则是旨在将与设置在细胞外液中的细胞外电极的电位差的变化作为细胞内电位的变化进行测量的方法，在这一点上与以往通过微玻璃电极的测量方法没有太大差异。
本发明中提供了与以往的测量方法完全不同的利用电荷放大器原理的电容型细胞内电位的测量方法。
本发明的电容型电位测量装置在形成电容器的两个导电体之一上使用导电性纳米粒子(导电性纳米粒子、导电性肽等)贯通细胞膜。这是一种将电容器的导电体与电压放大器的正极连接，并且将细胞不接触的电容器面与负极连接，记录形成电容器的两个导电体之间的电压变化的方法。由于在电容型电位测量装置中使用的电容器的电容小(＜50pF)，因此电容器的阻抗(电阻)值非常高。
根据欧姆定律，在具有大阻抗的串联电路的两端产生大电位差。并且，已知电容器的电容越小阻抗(电容电抗(容量リアクタンス))越大(例如，http://www.fluke.com/fluke/uses/comunidad/fluke-news-plus/articlecategories/electrical/capacitivevoltage)。
由以上内容可知，在测量电容器两端的电位差时，通过使用电容小的电容器，其间的电阻阻抗变大，可以记录细胞膜电位这样的细微的电位变化。在这种情况下，电压放大器(Voltage Amplifier)起到“电荷放大器”的作用。即，通过细胞膜流入细胞内的离子流通过贯通细胞膜的导电性纳米粒子而被识别为电荷信号，其通过电容器变换为电压信号变化(电荷-电压转换器)，作为膜电位的变化通过电压放大器进行测量。
在细胞内产生的动作电位等的细胞内电位的变化是由荷电(Charge)离子(Na+、K+、Ca2+、Cl-)向细胞内外的运动而产生的，因此，如果通过贯通细胞膜的导电性纳米粒子将该荷电离子浓度的变化捕捉为电荷的变化，则可以通过使用电容型电位测量装置，利用电荷放大器原理将其作为电压信号来测量。
即，在本发明中，“电容型电位测量装置”是指能够在测量电路内不设置接地电极而进行直流电位(电压)测量(实验例中为细胞内膜电位)的技术。作为特征，使用具有非常高阻抗和皮法(ピコファラッド)级电容的电容器。由于高阻抗电容器作为电荷-电压转换器(电荷放大器)起作用，因此将在耦合到导电性纳米粒子电极的电容器的一端发生的电位变化(荷电离子对于细胞的进出)检测为电压。该装置的特征是在电容器的两端连接放大器的正极和负极而直接测量电位变化，由于装置内的负极作为测量电路的接地电极工作，因此不会成为开路(open circuit)，可以进行稳定测量。此外，在本发明中，在提及“利用电荷放大器原理的方法”时，是指“通过与贯通细胞膜的导电性纳米粒子接触的导电性板等导电体将通过细胞膜的阳离子、阴离子的出入引起的细胞内离子浓度的变化作为电荷的变化而感应，并将其作为电压变化进行测量的方法”。
本发明的测量方法与现有的细胞内或细胞外电位测量方法大不相同，不是直接测量放大器的正极(细胞内)、放置在细胞外液中的负极之间发生的电位变化，而是将接种细胞的电容器(导电性板)作为传感器进行电荷-电压转换，作为细胞内电位变化记录，因此不需要在细胞外液中设定接地电极。作为传感器的导电性板能够通过贯通细胞膜的导电性纳米粒子感应细胞内的电荷(charge)变化即可，所以导电性板也可以在没有被细胞覆盖的部分直接接触细胞外溶液。因此，特别适合于不能形成片状的培养神经细胞等单细胞中的细胞内电位的测量。
即，本发明包括以下发明。
[1]一种电容型电位测量装置，所述电容型电位测量装置为能够记录目标细胞的细胞内电位或电位变化的电容型电位测量装置，其特征在于，所述电容型电位测量装置包含与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触的导电性板(導電性プレート)，在设置成与所述导电性板的下面接触的导电板(導電板)的下方设置有磁铁。
在此，作为导电性板，除了导电性玻璃(带FTO(氟掺杂氧化锡)的玻璃、带ITO(铟掺杂氧化锡)的玻璃)之外，还可以使用钛板等。作为导电板，可以使用铝箔、银板或铂板。以下相同。
[2]如上述[1]所述的电容型电位测量装置，其特征在于，导电性板是在表面的至少一部分具有胶原涂布区域的导电性玻璃。
[3]如上述[1]或[2]所述的电容型电位测量装置，其特征在于，导电性板上面与电信号放大器的正极连接，与导电性板下面接触的导电板与电信号放大器的负电极连接，由导电性板上面和导电板形成电容型电位记录电路。
[4]一种电容型电位测量装置，所述电容型电位测量装置为能够记录目标细胞的细胞内电位或电位变化的电容型电位测量装置，其特征在于，所述电容型电位测量装置包含与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触的磁铁电极，所述磁铁电极除了与目标细胞接触的下面以外都被绝缘体覆盖并垂直固定，隔着绝缘体在上面还具有磁性体或磁铁吸引性金属板，在与所述细胞粘附的容器底面的下方设置有磁铁吸引性金属板。
在此，作为绝缘体，可以使用封口膜(パラフィルム)、硅、蜡等。硅管是优选的。磁性体可以是与磁铁电极相同的材料；此外，磁铁吸引性金属板典型地是铁板。以下相同。
[5]如上述[4]所述的电容型电位测量装置，其特征在于，覆盖所述磁铁电极与目标细胞接触的下面以外的绝缘体不与目标细胞所粘附的下方的基板表面接触，与磁铁电极的下面接触的目标细胞不与细胞外液隔离。
[6]如上述[4]或[5]所述的电容型电位测量装置，其中，贯通细胞膜的导电性纳米粒子是预先吸附在磁铁电极表面的导电性纳米粒子被所述磁铁电极从目标细胞上方压在细胞表面上，并被设置在细胞下方的金属板吸引而贯通细胞膜的导电性纳米粒子。
[7]如上述[6]所述的电容型电位测量装置，其特征在于，在预先吸附在磁铁电极表面时，使导电性纳米粒子在与转染试剂混合的状态下吸附在磁铁电极表面。
[8]如上述[4]～[7]中任一项所述的电容型电位测量装置，其特征在于，磁铁电极与电信号放大器的正极连接，在磁铁电极上面隔着绝缘体设置的磁性体或磁铁吸引性金属板与电信号放大器的负电极连接，由磁铁电极和磁性体或磁铁吸引性金属板形成电容型电位记录电路。
[9]一种用于测量目标细胞的细胞内电位或电位变化的方法，其特征在于，所述方法包括以下工序(1)～工序(3)：
(1)向粘附在导电性板上的目标细胞内导入导电性纳米粒子的工序，
在此，将导电板设置成与导电性板下面接触，所述导电板的下方设置有磁铁；
(2)通过来自于导电性板下方的磁铁的磁力将目标细胞内的导电性纳米粒子吸引至细胞粘附面侧，使导电性纳米粒子贯通细胞粘附面的至少一部分的细胞膜，使其暴露于细胞外的一端与所述导电性板接触的工序；
(3)将所述导电性板上面连接到电信号放大器的正极并将所述导电板连接到电信号放大器的负电极以形成电位记录电路的工序。
[10]一种用于测量目标细胞的细胞内电位或电位变化的方法，其特征在于，所述方法包括以下工序(1)～工序(4)：
(1)向粘附在容器底面的目标细胞内导入导电性纳米粒子的工序；
(2)将磁铁电极粘附在目标细胞的上面的工序，
在此，所述磁铁电极除了与目标细胞的粘附面以外都被绝缘体覆盖，在所述磁铁电极的上面隔着绝缘体设置有磁性体或磁铁吸引性金属板；
(3)在与所述细胞粘附的容器底面的下方设置磁铁吸引性金属板，通过在所述磁铁电极和下方的金属板之间产生的磁力将导电性纳米粒子吸引至与磁铁电极的粘附面侧并贯通细胞膜，使暴露于细胞外的一端与所述磁铁电极接触的工序；
(4)将所述磁铁电极连接到电信号放大器的正极并将上方的所述磁性体或磁铁吸引性金属板连接到电信号放大器的负电极以形成电位记录电路的工序。
[11]一种用于测量目标细胞的细胞内电位或电位变化的方法，其特征在于，所述方法包括以下工序(1)～工序(4)：
(1)将导电性纳米粒子吸附在磁铁电极未被绝缘体覆盖的表面的工序；
(2)将吸附有导电性纳米粒子的磁铁电极表面从目标细胞上方粘附并压在细胞表面的工序，
在此，磁铁电极的上面隔着绝缘体设置有磁性体或磁铁吸引性金属板；
(3)在与所述细胞粘附的容器底面的下方设置磁铁吸引性金属板，通过在所述磁铁电极和下方的金属板之间产生的磁力将磁铁电极表面的导电性纳米粒子吸引至所述细胞的内侧方向，留下与磁铁电极接触的细胞外的一端而贯通细胞膜的工序；
(4)将所述磁铁电极连接到电信号放大器的正极并将设置在磁铁电极上方的所述磁性体或磁铁吸引性金属板连接到电信号放大器的负电极以形成电位记录电路的工序。
[12]一种筛选对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的方法，其特征在于，所述方法包括以下(1)～(6)：
(1)向粘附在导电性板上的目标细胞内导入导电性纳米粒子的工序，
在此，将导电板设置成与导电性板下面接触，所述导电板的下方设置有磁铁；
(2)通过来自于导电性板下方的磁铁的磁力将目标细胞内的导电性纳米粒子吸引至细胞粘附面侧，使导电性纳米粒子贯通细胞粘附面的至少一部分的细胞膜，使其暴露于细胞外的一端与所述导电性板接触的工序；
(3)将所述导电性板上面连接到电信号放大器的正极并将所述导电板连接到电信号放大器的负电极以形成电位记录电路，测量两个电极之间的电压的工序；
(4)对目标细胞给予受检物质样品的工序；
(5)对于在工序(4)中给予受检物质样品的目标细胞，与工序(3)同样地测量两个电极之间的电压的工序；
(6)将工序(5)中的测量结果与工序(3)中的测量结果进行比较，在两者的测量值有显著差异的情况下，评价受检物质样品是对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的工序。
[13]一种筛选对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的方法，其特征在于，所述方法包括以下(1)～(7)：
(1)向粘附在插入式细胞培养器(セルカルチャーインサート)的多孔膜上的目标细胞内导入导电性纳米粒子的工序，
在此，作为插入式细胞培养器，优选市售的插入式细胞培养器(Nunc聚碳酸酯插入式细胞培养器，Thermo Scientific)，在底面具有聚碳酸酯多孔膜；优选具有0.1μm～1.0μm孔径的膜的插入式细胞培养器，
此外，为了从细胞下面进行溶液的回流(還流)，在插入式细胞培养器的多孔膜上培养细胞，并将其设置在垫片(スペーサー)上；
(2)将磁铁电极粘附在目标细胞的上面的工序，
在此，所述磁铁电极除了与目标细胞的粘附面以外都被绝缘体覆盖，在所述磁铁电极的上面隔着绝缘体设置有磁性体或磁铁吸引性金属板；
(3)在与所述细胞粘附的插入式细胞培养器底面的多孔膜的下方设置磁铁吸引性金属板，通过在所述磁铁电极和下方的金属板之间产生的磁力将导电性纳米粒子吸引至与磁铁电极的粘附面侧并贯通细胞膜，使暴露于细胞外的一端与所述磁铁电极接触的工序；
(4)将所述磁铁电极连接到电信号放大器的正极并将上方的所述磁性体或磁铁吸引性金属板连接到电信号放大器的负电极以形成电位记录电路，测量两个电极之间的电压的工序；
(5)经由具有透过性的插入式细胞培养器底面的多孔膜对目标细胞给予受检物质样品的工序；
(6)对于在工序(5)中给予受检物质样品的目标细胞，与工序(4)同样地测量两个电极之间的电压的工序；
(7)将工序(6)中的测量结果与工序(4)中的测量结果进行比较，在两者的测量值有显著差异的情况下，评价受检物质样品是对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的工序。
[14]一种筛选对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的方法，其特征在于，所述方法包括以下(1)～(7)：
(1)将导电性纳米粒子吸附在磁铁电极未被绝缘体覆盖的表面的工序；
(2)将吸附有导电性纳米粒子的磁铁电极表面从目标细胞上方粘附并压在细胞表面的工序，
在此，磁铁电极的上面隔着绝缘体设置有磁性体或磁铁吸引性金属板；
(3)在与所述细胞粘附的插入式细胞培养器底面的多孔膜的下方设置磁铁吸引性金属板，通过在所述磁铁电极和金属板之间产生的磁力将磁铁电极表面的导电性纳米粒子吸引至所述细胞的内侧方向，留下与磁铁电极接触的细胞外的一端而贯通细胞膜的工序；
(4)将所述磁铁电极连接到电信号放大器的正极并将所述磁性体或磁铁吸引性金属板连接到电信号放大器的负电极以形成电位记录电路，测量两个电极之间的电压的工序；
(5)经由具有透过性的插入式细胞培养器底面的多孔膜对目标细胞给予受检物质样品的工序；
(6)对于在工序(5)中给予受检物质样品的目标细胞，与工序(4)同样地测量两个电极之间的电压的工序；
(7)将工序(6)中的测量结果与工序(4)中的测量结果进行比较，在两者的测量值有显著差异的情况下，评价受检物质样品是对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的工序。
[15]一种筛选对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的方法，其特征在于，所述方法包括以下(1)～(6)：
(1)向粘附在基板上的目标细胞内导入导电性纳米粒子，使磁铁电极粘附在目标细胞上面的工序，
在此，所述磁铁电极除了与目标细胞的粘附面以外都被绝缘体覆盖，在所述磁铁电极的上面隔着绝缘体设置有磁性体或磁铁吸引性金属板；
(2)在粘附在所述细胞下面的基板的下方设置磁铁吸引性金属板，通过在所述磁铁电极和下方的金属板之间产生的磁力将导电性纳米粒子吸引至与磁铁电极的粘附面侧并贯通细胞膜，使暴露于细胞外的一端与所述磁铁电极接触的工序；
(3)将所述磁铁电极连接到电信号放大器的正极并将上方的所述磁性体或磁铁吸引性金属板连接到电信号放大器的负电极以形成电位记录电路，测量两个电极之间的电压的工序；
(4)向细胞外液给予受检物质样品，使目标细胞与受检物质样品接触的工序，
在此，覆盖所述磁铁电极的绝缘体不与目标细胞所粘附的下方的基板表面接触，与磁铁电极的下面接触的目标细胞不与细胞外液隔离；
(5)对于在工序(4)中与受检物质样品接触的目标细胞，与工序(3)同样地测量两个电极之间的电压的工序；
(6)将工序(5)中的测量结果与工序(3)中的测量结果进行比较，在两者的测量值有显著差异的情况下，评价受检物质样品是对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的工序。
[16]一种筛选对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的方法，其特征在于，所述方法包括以下(1)～(7)：
(1)将导电性纳米粒子吸附在磁铁电极未被绝缘体覆盖的表面的工序；
(2)将吸附有导电性纳米粒子的磁铁电极表面从目标细胞上方粘附并压在细胞表面的工序，
在此，磁铁电极的上面隔着绝缘体设置有磁性体或磁铁吸引性金属板；
(3)在粘附在所述细胞下面的基板的下方设置磁铁吸引性金属板，通过在所述磁铁电极和金属板之间产生的磁力将磁铁电极表面的导电性纳米粒子吸引至所述细胞的内侧方向，留下与磁铁电极接触的细胞外的一端而贯通细胞膜的工序；
(4)将所述磁铁电极连接到电信号放大器的正极并将所述磁性体或磁铁吸引性金属板连接到电信号放大器的负电极以形成电位记录电路，测量两个电极之间的电压的工序；
(5)向细胞外液给予受检物质样品，使目标细胞与受检物质样品接触的工序，
在此，覆盖所述磁铁电极的绝缘体不与目标细胞所粘附的下方的基板表面接触，与磁铁电极的下面接触的目标细胞不与细胞外液隔离；
(6)对于在工序(5)中与受检物质样品接触的目标细胞，与工序(4)同样地测量两个电极之间的电压的工序；
(7)将工序(6)中的测量结果与工序(4)中的测量结果进行比较，在两者的测量值有显著差异的情况下，评价受检物质样品是对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的工序。
有益效果
在本发明中，采用了通过磁场吸引利用已知方法导入细胞内的导电性纳米粒子或与转染试剂混合的细胞表面的导电性纳米粒子来贯通细胞膜的手段，因此能够尽可能抑制对细胞的损伤，使得能够在长期持续在正常状态下生存的同时观测细胞内电位的变动。
此外，本发明的测量方法不是直接测量放大器的正极、负极之间发生的电位变化，而是将接种细胞的电容器(导电性板)作为传感器进行电荷-电压转换，作为细胞内电位变化记录的方法。因此，不需要在细胞外液中设定接地电极。而且，作为传感器的导电性板能够通过贯通细胞膜的导电性纳米粒子感应细胞内的电荷(charge)变化即可，所以导电性板也可以在没有被细胞覆盖的部分与细胞外液接触。
也就是说，在本发明的测量方法中，即使在应用于细胞群的情况下也不需要以片状方式培养；即使在应用于单个细胞的情况下，也能够简单地准确地测量细胞的动作电位或其变化。
特别是在不能以片状方式培养的细胞(典型地是培养神经细胞)等中，也能够记录在细胞内发生的动作电位或其变化，因此预计今后将对体外(培养)神经细胞的电生理学研究做出飞跃性贡献。
此外，通过应用于表达各种离子通道、药剂转运蛋白等的转化细胞或细胞群，观测各种药剂添加引起的细胞内电位的变动，可以作为药效或细胞毒性筛选用的工具。
附图说明
[图1]参考：(A)～(C)：示出了向细胞内导入金涂覆磁性纳米粒子的步骤的概念图；(D)：示出了细胞内的金涂覆磁性纳米粒子被导电性玻璃面下的磁铁吸引的步骤的概念图。
[图2]参考：示出了利用细胞外装置(记录电极、接地电极、放大用的放大器)测量细胞内电位的概念图。
[图3]参考：应用于接种在导电性板表面上的细胞群时的概念图。
[图4]参考：具有金涂覆磁性纳米粒子电极的hChRWR表达CHO培养细胞中对蓝光刺激的电位响应。
[图5]参考：具有金涂覆磁性纳米粒子电极的Nav1.5/Kir2.1表达HEK培养细胞中的细胞内动作电位的测量(通过膜电位变化诱导动作电位)。
[图6]参考：具有金涂覆磁性纳米粒子电极的Nav1.5/Kir2.1表达HEK培养细胞中的细胞内动作电位的测量(通过电流脉冲诱导动作电位)。
[图7]参考：(参考例2)中测量的动作电位的记录是由于Nav1.5/Kir2.1的表达的证实：(A)通过电流钳验证；(B、C)通过电压钳验证。
[图8]参考：示出了使用钕磁铁作为磁铁电极，使金涂覆磁性纳米粒子贯通细胞膜来测量细胞内电位的概念图。另外，实际上磁铁比细胞大，磁铁下面粘附了多个细胞表面。
[图9]参考：示出了使用钕磁铁在未将金涂覆磁性纳米粒子导入细胞内的情况下贯通细胞膜的概念图。
[图10]参考：具有钕磁铁电极的Nav1.5/Kir2.1表达HEK培养细胞中的细胞内动作电位的测量(通过膜电位变化诱导动作电位)。
[图11]参考：通过贯通在导电性板电极上培养的CHO细胞的细胞膜的导电性纳米粒子测量CHO细胞的内源性外向电流(内在性外向き電流)(通过膜电位固定法)。
[图12]用于根据电荷放大器原理测量细胞内电位的准备实验。
[图13]示出了通过根据电荷变化测量电压变化(电荷放大器)的原理来测量细胞内电位的概念图。
[图14]从导入有金涂覆磁性纳米粒子电极的iPS细胞衍生的心肌样细胞使用电荷放大器原理测量自发性动作电位。
[图15]对于被胶原格子状涂覆的导电性玻璃表面的心肌样细胞，通过利用导电性板感应细胞内的离子浓度变化作为电荷变化并将其作为电压变化进行测量的方法来测量由钠离子通道开放剂诱发的动作电位。
[图16A]使用磁铁电极使导电性纳米粒子不导入细胞内而贯通细胞膜，利用电荷放大器原理记录细胞内电位的方法的概念图(使用了盖玻片(カバーグラス)的情况)。
[图16B]使用磁铁电极使导电性纳米粒子不导入细胞内而贯通细胞膜，利用电荷放大器原理记录细胞内电位的方法的概念图(使用了插入式细胞培养器的情况)。
[图17A]对培养神经细胞(NG108-15细胞)进行5天神经分化诱导来进行实验。通过将M-C电极配置在接种在盖玻片上的细胞上来记录自发性动作电位。
[图17B]对培养神经细胞(NG108-15细胞)进行2天神经分化诱导来进行实验。向细胞外液给予谷氨酸(最终外液浓度800μM)，记录谷氨酸受体介导的响应。另外，去除了图上的基线和谷氨酸响应假象(artifact)。
[图18]瞬时性离子通道表达细胞中细胞内电位的测量。
[图19]在将MagEle(磁铁电极)固定在目标细胞上方的电容型记录法中，外液从侧面的绝缘体和基板之间流入时的概念图。
[图20]分化的培养神经细胞(NG108-15细胞)的细胞内电位测量。
具体实施方式
1.本发明中使用的导电性纳米粒子
本发明提及的“导电性纳米粒子”是同时具有导电性和磁性的纳米尺寸(25nm～100nm)的微粒。通常指“涂覆有导电性材料的纳米磁性粒子”，但只要具有贯通细胞膜而作为电极工作的功能即可，其形状不限于球形，也可以是线状等其它形状。此外，材料只要是同时具有磁性和导电性且细胞毒性小的纳米粒子即可，也可以使用导电性聚合物、导电性肽等。
作为本发明中使用的导电性纳米粒子，一般使用表面被具有导电性且几乎没有细胞毒性的材料涂覆的磁性纳米粒子。
作为适合此时涂覆的材料，例如，除了金、铂等导电性金属(Yamada等(2015)WIREsNanomed Nanobiotechnol 2015，7:428-445.doi：10.1002/wnan.1322)之外，还举出导电性肽、蛋白质或各种导电性聚合物等，但并不限于这些。在本说明书的实施例或参考例中，使用柠檬酸或PEG金涂覆磁性纳米粒子(nanoimmunotech公司制造，NITmagold Cit或PEG50nm)，在对本发明进行说明时也主要对典型的金涂覆纳米粒子进行了描述，但并不意味着限定于此。
此外，作为充当核的磁性纳米粒子，只要是具有磁性的粒子，则可以是任意粒子，即使不是涂覆的粒子，只要是同时具有磁性和导电性且细胞毒性小的纳米粒子，也可以同样地作为导电性纳米粒子使用。
具体而言，作为导电性聚合物、导电性肽类，作为“具有磁铁矿纳米粒子磁性以及AC和DC导电性的聚(邻氨基苯甲酸)”，可以使用“Ramesan和Jayakrishnan(2017)Polymer/magnetite nanocomposites with electrical and magnetic conductivity.PlasticResearch On line 10.2417/spepro.006898”中列举的导电性聚合物类、肽类。此外，一直以来用于生物成像染色的量子点(Qdot)粒子(O.O.Otelaja，D.-H.Ha，T.Ly，H.Zhang和R.D.Robinson，“Highly Conductive Cu2-xS Nanoparticle Films through RoomTemperature Processing,and an Order of Magnitude Enhancement of Conductivityvia Electrophoretic Deposition”，ACS Applied Materials and Interfaces 6，18911-18920(2014))等也可以作为导电性纳米粒子使用。
由于需要穿透细胞膜，本发明中使用的导电性纳米粒子的直径(50nm)需要比细胞膜厚度(约20nm)长，但为了将对细胞的损伤限制在最小限度，尽可能其直径越短越好。即，为25nm～100nm、优选为30nm～80nm、较优选为35nm～70nm、进一步优选为40nm～60nm的数值范围。也可以使用市售金涂覆磁性纳米粒子(Absolute MagTM金涂覆磁性粒子，柠檬酸盐，直径50nm，Creative Diagnostics公司制造)(WHM-GC01)等。
另外，本发明的导电性纳米粒子只要具有贯通细胞膜而作为电极工作的功能即可，除球形以外有时也可为线状、圆筒状、圆锥状等其它形状，在此情况下，粒子的最大长度优选为25nm～100nm、优选为30nm～80nm、较优选为35nm～70nm、进一步优选为40nm～60nm的数值范围。
2.充当测量目标的细胞和细胞的接种
(2-1)充当目标的细胞、细胞群(细胞群)
作为充当本发明的测量目标的细胞，可以是通过活检采集的细胞等来自生物体的细胞，也可以是培养的细胞。尽管主要以人等哺乳动物细胞为目标，但除了鸟类、鱼类、昆虫细胞以外，还可以是酵母等真核微生物和大肠杆菌等原核微生物。
特别优选从人iPS细胞等人干细胞分化诱导的心肌细胞、神经细胞、血管上皮细胞、肝细胞等或它们的细胞群。
此外，就在作为转化宿主的普通的HEK、CHO细胞等哺乳动物细胞中导入了各种离子通道基因和各种转运蛋白基因等的转化培养细胞而言，由于可以作为从各种离子通道和转运蛋白摄取的药剂的毒性试验中的评价体系使用，因此是本发明中优选的目标细胞。
本发明的测量目标细胞虽然可以是单个细胞，但一般以细胞培养后增殖或培养中形成的细胞群为目标。
在本发明中，当提及“细胞群”时，包括在贴壁培养(接着培養)用的培养皿(板、孔)表面形成的片状细胞的情况，同时也包括由来自iPS细胞等干细胞的心肌细胞、神经细胞等形成的细胞团的情况。
此外，作为本发明的目标细胞，也包括近年来作为模型细胞已被广泛使用的含有巨大脂质体的人工细胞(Moscho等(1996)P.N.A.S.93：11443-11447；Schlesinger Saito(2006)，Cell Death and Differentiation 13，1403-1408；Aimon等(2011)PLoS ONE 6(10)：e25529.doi：10.1371/journal.pone.0025529等)。
例如，可以使用通过如下方法等制备的人工细胞：将从表达离子通道的细胞分离的包含离子通道的细胞膜片与巨大脂质体融合的方法；以及将摄取有在大肠杆菌等中表达的重组离子通道蛋白的小脂质体与巨大脂质体融合的方法。
本发明在使用模型心肌细胞或神经细胞等的药物发现筛选中特别有用。
作为心肌细胞模型，优选使用由人iPS细胞等干细胞分化诱导的心肌细胞或者将SCN5A(Nav1.5)、CACNα1C(Cav1.2)、KCNH2(hERG)、KCNQ1/KCNE1(LQT1)、KCNJ2(Kir2.1)基因等导入培养动物细胞(HEK293、BHK或CHO细胞)并在细胞膜上表达上述离子通道的细胞等。作为这样的细胞，例如可以使用WO2014/192312中记载的心肌模型细胞。
此外，也可以使用由iPS细胞等干细胞分化诱导的培养心肌细胞样品(US9663764B2；由人多能干细胞生成心肌细胞)来代替转化细胞。心肌样iPS细胞(iCellCardiomyocyte)也由CDI公司等市售。
也可以使用来自生物体的组织切片样品，此时，作为组织切片，使用来自哺乳动物细胞的形成心房或心室的心肌切片，对引起心房颤动(心房細動)、心律不齐(不整脈)的原因进行调查。可以使用从病变组织通过活检摘出的组织片等。
此外，作为神经细胞模型，可以使用将光受体通道(光受容体チャネル)基因导入至PC12细胞和大脑皮质细胞或者由iPS细胞等分化诱导的神经细胞中的光受体通道表达细胞，通过观察添加受检物质后对光刺激的电位响应，可以对神经细胞进行细胞毒性和药效评价。作为光敏感性模型神经细胞，也可以使用日本特开2006-217866号公报记载的表达通道视蛋白2(チャネルオプシン2)的大脑皮质神经细胞等。
另外，即使是像神经细胞那样与心肌细胞不同的不能用细胞覆盖导电玻璃整个表面的细胞，也可以通过使用本发明的电容型电位测量装置的方法来进行细胞内电位的记录。
(2-2)细胞的接种方法：
在本发明中，即使在使用导电性板的情况下，导电性板区域也不需要覆盖整个培养容器底面，因此只要在导电性板区域上存在对于细胞内电位测量而言足够程度的细胞数即可。例如，优选接种0.1×105个/cm2～2.0×105个/cm2，优选为0.5×105个/cm2～1.2×105个/cm2。还可以测量单个细胞中的细胞内电位。
在使用磁铁电极的情况下，不需要导电性板区域，能够使用通常的培养容器或盖玻片。代替这些，也可以使用聚碳酸酯插入式细胞培养器(孔径0.4μm，ThermoScientific)。而且，接种的细胞数也不受限制，在使用细胞群测量生物电位时，同样优选接种0.1×105个/cm2～2.0×105个/cm2，优选为0.5×105个/cm2～1.2×105个/cm2。如果磁铁电极的与目标细胞的粘附面以外的区域是绝缘的，并且不与细胞外溶液直接接触，则也可以测量单独细胞中的细胞内电位。
3.向细胞内导入导电性纳米粒子的方法
(3-1)贯通细胞膜前向目标细胞内导入导电性纳米粒子的方法
在本发明中，有在使导电性纳米粒子贯通目标细胞的细胞膜之前预先向细胞内导入导电性纳米粒子，通过磁力吸引该细胞内的导电性纳米粒子使其贯通的情况和通过磁力使细胞外的导电性纳米粒子贯通的情况这两种方法，在该项中，对在前者的情况下使用的预先向细胞内导入导电性纳米粒子的方法进行叙述。关于后者的情况，在(4-6)中详细叙述。
作为本发明的向细胞内导入导电性纳米粒子的方法，就已知的向细胞内导入纳米粒子的方法而言，作为综述文献的“Levy等(2010)Gold nanoparticles delivery inmammalian live cells：a critical review.Nano Reviews，1：4889-DOI：10.3402/nano.v1i0.4889”中示出的任何方法都可以，但优选对作为导入目标的细胞的损伤尽可能少的方法。在本说明书的参考例1等中，虽然作为转染试剂使用了聚乙烯亚胺溶液(P3143Sigma-Aldrich Mn～60,000)以及作为细胞膜的成孔蛋白质毒素使用了链球菌溶血素O来进行，但不限于该方法。
作为典型的导入方法，例如可以使用以下方法，但不限于这些。
(3-2)通过在靶细胞的细胞膜上可逆地形成孔(筒状地贯通膜的路径)的蛋白质毒素(链球菌溶血素O等)进行的方法：
作为在靶细胞的膜中形成孔洞(膜孔)的致病因子的蛋白质毒素早已为人所知，对于这些蛋白质毒素，还开发了在控制对靶细胞的毒性的同时打开可逆性孔洞，使其像非选择性离子通道(孔)那样起作用的技术(Walev等，PNAS 98：(6)3185-3190(2001)；T.Tomita.，Bio.Soci.Japan General Incorporated Association，Vol.34，No.6(1994)p.6-11等)。
作为这样的毒素，优选使用A型溶血性链球菌的链球菌溶血素O(Streptolysin O)和与脂质体结合的葡萄球菌的α毒素等，在本发明的实施例或参考例中虽示出了使用链球菌溶血素O的例子，但不限于这些。
(3-3)使用转染试剂的方法：
作为转染试剂，除了聚乙烯亚胺(polyethylineimine)以外，还可以使用Superfect(Qiagen公司)。已知Superfect也和聚乙烯亚胺一样，利用树形分子(dendrimer)形成孔。由于分子量大的聚乙烯亚胺形成大的孔，因此聚乙烯亚胺更有效。
另外，转染试剂虽作为预先向细胞内导入导电性纳米粒子时的典型试剂而使用，但在以下(4-6)的使导电性纳米粒子从细胞外贯通细胞膜的方法中也有效地起作用。
(3-4)利用内吞作用引起的细胞内摄取的方法：
该方法的难点在于在导电性纳米粒子被摄取到靶细胞内之后，需要从核内体的膜转移到细胞质中的步骤。
为此，例如在导电性纳米粒子中，通过将TAT、TAT-HA等细胞穿膜肽(Cellpenetrating peptide，CPP)附加在导电性纳米粒子上，使其从核内体膜转移到细胞质中等的方法是优选的。
(3-5)使用鸟枪(shotgun)(基因枪)等机械插入的方法：
该方法包括如下两种类型：将导电性纳米粒子导入细胞内然后接种靶细胞的方法；以及在接种靶细胞后插入导电性纳米粒子的方法。
可以使用任一种方法，但在前者的情况下，由于具有可以使用市售装置(HeliosRGene Gun System，Bio-Rad)的优点，因此特别适用于以大量细胞和导电性纳米粒子为目标的情况。
4.用于使导电性纳米粒子贯通目标细胞的细胞膜的方法
(4-1)关于本发明中使用的细胞膜贯通导电性纳米粒子的基本原理(预先导入细胞内的导电性纳米粒子贯通细胞膜的情况)
在本发明中，在预先向目标细胞内导入导电性纳米粒子时，有利用来自细胞外的磁场吸引该导电性纳米粒子使其贯通的情况和利用细胞外的磁场使粘附在细胞外的细胞表面的导电性纳米粒子贯通的情况这两种方法。
无论哪种情况，本发明的基本原理都是通过使预先导入细胞内的导电性纳米粒子被细胞外的磁场吸引而贯通细胞膜，导电性纳米粒子夹着细胞膜，一端在细胞内，另一端暴露于细胞外，由此通过感应细胞内的电荷(charge)变化，将导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端接触的导电性板电极或磁铁电极作为电容器工作而转换为电压，从而可以在细胞外测量、记录细胞内电位。此时，需要与导电性纳米粒子一起构成细胞内电位记录电极、发挥作为将导电性纳米粒子的细胞外暴露部分与放大器连接的连接器的功能的导电性物质。由这样的导电性物质而来的电极之一是“导电性板”，该导电性板是在接种细胞的细胞电位测量容器(通常兼任细胞培养容器)的底面的至少一部分具有导电性的板，并在与细胞粘附面相对的一侧设置有磁铁；而另一电极为进行导电性涂覆的“磁铁电极”(典型地为钕磁铁)。
以下，首先说明使用导电性板的情况下的一般方法，接着说明使用磁铁电极的情况。
(4-2)使用导电性板的情况
在此，对适用于细胞群(细胞片)的情况的一个方式进行描述，但本发明的方法不限于此。
(工序1)对至少表面具有导电性的培养皿或板(以下简称为导电性板)接种受检细胞，或使组织切片与导电性板表面紧密接触。
另外，在本发明中，“导电性板”不需要构成培养容器的整个底面，导电性表面也可以暴露于细胞外液中。此外，也可以通过使用导电性材料在培养皿的玻璃表面上仅对细胞粘附面进行导电涂覆来形成。作为用于形成导电性板区域的导电性材料，虽优选使用FTO(氟掺杂氧化锡)等，但只要满足同等的条件就不限于此。
在此，作为接种细胞的导电性板，如果使用透明性基板(例如导电性玻璃)，则能够通过显微镜简便且准确地确认细胞的接种状态，因此优选。在本说明书中的实施例或参考例中，虽使用了导电性玻璃(KENIS(ケニス)株式会社制造)，但不限于此。
此外，作为导电性板，用于成骨细胞的培养等的钛板(Rosa和Beloti(2003)Effectof cpTi Surface Roughness on Human Bone Marrow Cell Attachment，Proliferation，and Differentiation.Braz Dent J 14(1)：16-21)等也是优选的。钛板几乎没有细胞毒性，虽然存在光不能透过的缺点，但导电性优于导电性玻璃，并且由于不会产生导电性玻璃(具有20欧姆～40欧姆的电阻)那样的串联电阻引起的误差，因此特别是在要求准确的测量值的情况下，钛板或无毒性的导电金属是优选的。
(工序2)将涂覆有导电性材料的纳米磁性粒子(粒径25nm～100nm)导入细胞内。另外，“涂覆有导电性材料的纳米磁性粒子”也简称为“导电性纳米粒子”。
(工序3)用设置在培养皿下方的磁铁(钕磁铁、导电磁铁等)吸引进入细胞内的导电性纳米粒子，贯通细胞下方的细胞膜。
(4-3)参考：将金涂覆磁性纳米粒子应用于单个细胞构建细胞内记录电极时的步骤(概念图)
将使用(4-2)所示的导电性板时的本发明方法以将本发明中作为典型的导电性纳米粒子的金涂覆磁性纳米粒子应用于单个细胞的情况通过概念图(图1、图2)来说明时，为以下步骤。
(1)将金涂覆磁性纳米粒子导入细胞内(图1A-图1C)。
(2)通过设置在粘附细胞的导电性玻璃的相对侧上的磁铁将金涂覆磁性纳米粒子吸引到导电性玻璃面上(图1D)。
(3)被磁铁吸引到玻璃面上的金涂覆磁性纳米粒子贯通细胞的玻璃粘附部分的细胞膜。
(4)通过贯通细胞膜的金涂覆磁性纳米粒子连接细胞内和电极，通过磁性纳米粒子周围的金涂层，能够测量细胞内的电位、电流。
(5)通过如(图2)所示的那样配置的记录电极、接地电极、放大用的放大器，测量细胞内电位。
(4-4)参考：应用于培养的细胞群构建细胞内记录电极时的概念图
在实际实验中应用于培养细胞等时，通常存在多个细胞。此时，如果细胞间结合不紧密，充当电极的玻璃表面与接地电极直接通过细胞外液(存在离子化离子)而连接，因此通过金涂覆磁性纳米粒子建立的细胞内电位和细胞外溶液短路，因此不可能通过金涂覆磁性纳米粒子来进行记录。为此，需要在导电性板(电极)整个面上无间隙地铺满细胞。电极面积优选尽可能窄(图3)。当在培养皿表面将导电性材料绘制成图案(パターン)状而形成导电性板区域的情况下，导电性板区域以至少容纳在与细胞的粘附面内的方式形成。
(4-5)使用磁铁电极(MagEle)的方法
涂覆有导电性材料(例如镍、铝等导电性金属)的磁铁由于同时具有磁力和导电性，因此可以作为“磁铁电极(MagEle)”使用，典型的磁铁电极为钕磁铁。
钕磁铁是永磁铁中磁力最高的磁铁，但由于容易生锈，因此通常实施镀镍。市售的直径1mm圆柱钕磁铁(NeoMag(ネオマグ)株式会社)也涂覆有Ni-Cu-Ni，因此同时具有强大的磁力和高导电性，可以用作磁铁电极(MagEle)。另外，在涂覆铝的情况下，也可以用作磁铁电极(MagEle)。此外，磁铁主体只要是能够产生克服引力而能够将细胞内的导电性纳米粒子向上方吸引的程度的磁场的磁铁即可，虽不限于钕磁铁，以下利用使用典型的钕磁铁的例子来进行说明。另外，只要满足将导入细胞内的纳米粒子吸引到与细胞接触的磁铁电极的条件，就可以将磁铁安置在细胞上，也可以将细胞安置在磁铁上。
具体而言，在向细胞内导入导电性纳米粒子后，通过使钕磁铁从溶液中的细胞的上方而不是从培养皿侧与细胞膜接触，将细胞内的导电性纳米粒子吸引到细胞的上侧而贯通细胞膜。在(参考图8)中图示出了构建细胞内记录电极的情况。
在此，由于需要将钕磁铁表面中与细胞接触的部分以外的部分与细胞外溶液完全阻断，因此在与细胞接触的部分以外的部分上预先通过硅橡胶、硅管等施加绝缘涂层。
以这样的方式，使用钕磁铁作为磁铁电极(MagEle)的方法不需要将细胞安置在导电玻璃上，可以直接使用通常的培养皿。因此，具有如下优点：可以直接使用在培养皿中培养的细胞，并在导入磁性纳米粒子后直接记录细胞内电位的变化。
此外，培养细胞或培养细胞群只要能够确保与配置在其上方的磁铁电极(MagEle)的接触面积足够，就不需要在其它部分存在细胞，因此，不需要整个皿底面被细胞群覆盖。
在到此为止的方法中，可以应用与将磁铁电极与导电性纳米粒子一起构建细胞内记录电极并与细胞外电极(接地电极)测量细胞内电位的情况相同的步骤。
在本发明中，为了使磁铁电极本身作为电容器起作用，将磁铁的与细胞粘附面相对的从细胞外液中暴露出来的部分(用绝缘膜覆盖)与放大器的负极连接。由于磁铁电极因其涂层而具有导电性，因此如果将其连接到放大器的正极，则经由绝缘膜与利用电荷放大器原理的记录方法相同的位置关系成立。因此，在该记录方法中，与上述使用导电性板的情况一样，细胞外液不需要接地电极。
(4-6)使导电性纳米粒子从细胞外贯通细胞膜的方法：
该方法与上述方法不同，是不预先将导电性纳米粒子导入细胞内，而是使粘附在细胞表面的导电性纳米粒子从细胞外贯通的方法，是将直接利用磁性固定在磁铁电极表面上的导电性纳米粒子压在细胞上，并利用设置在相对侧的金属板的吸引力使其插入、贯通细胞膜的方法。
具体而言，首先利用磁力将导电性纳米粒子固定于磁铁电极表面。此时，也可以将导电性纳米粒子在与以PEI(聚乙烯亚胺)为代表的转染试剂混合的状态下使用。接着，将磁铁电极压在靶细胞表面上，利用与设置在细胞下方的金属板之间产生的磁力将磁铁电极自立固定(自立固定)。在磁铁电极细且磁力弱的情况下，也可以不依赖于与下方的金属板的磁力而通过操纵器等进行固定。通过磁铁电极而粘附固定在细胞上的纳米粒子贯通细胞膜，由此，通过一端到达细胞质内的导电性纳米粒子和磁铁电极形成细胞内电位记录电极。
此时，通过在与PEI等转染试剂混合的状态下使用，导入效率进一步提高。具有与细胞膜脂质同样性质的PEI等附着于纳米粒子而辅助细胞膜贯通的可能性高。因为不需要将导电性纳米粒子导入细胞质的内部，该方法是一种非常无侵入性的方法。
该方法也与使用导电性板的情况等相同，因为不需要在细胞外液中设置接地电极，所以不需要使像培养神经细胞那样接种培养的细胞十分致密从而相互接触，这一点也很优异。
以下，将具体说明使用PEI的情况，但也可以使用其它转染试剂或者也可以不使用转染试剂。
将与PEI混合的PEG或柠檬酸金涂覆磁性纳米粒子加入到磁铁电极，通过磁性将纳米粒子吸附到侧面包被有绝缘体的磁铁电极上。
在此，作为绝缘体，可以使用封口膜、硅、蜡等，期望磁铁电极的与纳米粒子接触的部分以外的与细胞外液接触的所有部分被覆盖。在硅的情况下，也可以使用与磁铁尺寸正好匹配的硅管。
约30分钟后，使磁铁电极吸附有导电性纳米粒子的面朝下，从培养容器内的细胞的上方靠近，并与细胞直接接触。在此，培养容器配置在铁板等吸引磁铁的材料上。磁铁电极通过被该铁板吸引而被固定在细胞上，导电性纳米粒子经由PEI而贯通细胞膜，但由于其中一方被磁铁固定，因此留在细胞膜内，使细胞内电位记录成为可能。即，即使不预先将纳米粒子导入细胞，也可以进行细胞内电位记录。然而，在该方法中，如果磁铁过弱，则需要利用其它操纵器等来保持磁铁电极，因此，根据细胞种类、培养条件，需要对磁铁的强度、大小等进行优化。
5.本发明的测量方法
(5-1)电荷放大器的测量原理
如上所述，在本发明中提及“电荷放大器”时，不是将“电荷放大器”本身用作“电荷放大器”，而是将作为在“电荷放大器”内进行的机制的用于将电荷信号转换为电压信号变化的作为电荷-电压转换器的工作方式用作“电荷放大器原理”。“利用电荷放大器原理”是指“通过与贯通细胞膜的导电性纳米粒子接触的导电性板将细胞内离子浓度的变化作为电荷的变化而感应，并将其转换为电压变化进行测量”。
在细胞内产生的动作电位等的细胞内电位的变化是由荷电(Charge)离子(Na+、K+、Ca2+、Cl-)向细胞内外的运动而产生的，因此，如果通过贯通细胞膜的导电性纳米粒子将该荷电离子浓度的变化捕捉为电荷的变化，则可以通过应用电荷放大器原理将其作为电压信号进行测量。
在此，本发明中使用的放大器有时虽出于说明目的而称为“电荷放大器”，但就实际使用的放大器而言使用的是通常的膜片钳放大器。通过将通常的放大器连接到由导电玻璃构成的电容器的上下部，在有离子出入接种在导电玻璃上的细胞的情况下，由于离子带正电或负电，因此可以作为电荷的运动来感应，可以将其作为电压进行测量。由于该机制如同作为电荷-电压转换器(电荷放大器)起作用，所以在本发明中称为“电荷放大器(电荷-电压转换器)原理”。
该测量原理类似于使用光电二极管的光粒子的光学测量法电路。
通常的放大器测量在其正极和负极(接地电极)之间流动的电流或施加电压的变化(在电极之间发生的变化)。在光传感器(光电二极管)的情况下，光电二极管将测量电路外的现象(光强度)作为光子(光粒子)的能量来感应，并将其作为电(电压或电流)变化而放大。
本发明是一种通过导电性纳米粒子将流入细胞内或从细胞流出的荷电离子(例如Na+、K+、Ca2+、Cl-)的浓度变化通过导电性板这样的电荷传感器作为电荷量变化来感应，并将其作为电压变化进行测量的方法。即，如将光电二极管所感应的光子转换成电变化一样，在本发明中感应荷电离子并将其转换成电变化。
本发明中的该测量方法与迄今现有的细胞内或细胞外电位测量方法大不相同的地方在于，不是测量放大器的正极、负极之间发生的电位变化，而是将接种细胞的电容器(导电性板)作为传感器，进行电荷-电压转换，测量膜电位变化。
因此，不需要在细胞外液中设定接地电极是其主要特征之一。这意味着即使作为传感器的导电性板在没有被细胞覆盖的部分直接接触细胞外溶液，也能够将细胞内膜电位变化作为电荷(charge)的变化进行测量。根据这种特性，即使是像神经细胞那样与心肌细胞不同的不能以片状方式培养的细胞也能进行细胞内记录。
(5-2)本发明中通过电容型电位测量装置利用电荷放大器原理借助导电性纳米粒子测量细胞内电位的方法
具体而言，例如将接种细胞的导电性玻璃上面连接到电容型电位测量装置的输入端(正极)，并将导电性玻璃(厚度2mm)下面和磁铁之间的铝箔连接到作为负电极的接地电极(为使电路不短路，在铝箔和磁铁之间配置绝缘胶带等)。在此，玻璃板夹装在导电玻璃表面和铝箔这样的导电板之间，形成电容器。导电玻璃也可以是上述(4-2)等中记载的钛板等其它导电性板，铝箔的导电板也可以使用银板、铂板等代替铝箔。
在安置在导电玻璃表面的细胞内产生的动作电位作为电荷(電荷)起作用，能够将电容器上下部所识别的电位差作为电压进行测量。
另外，为了进行用于控制目标细胞内的细胞内电位的电刺激，需要设置与电容型电位测量装置不同的具有接地电极的电刺激电路，或者使视紫红质通道蛋白(Channelrhodopsine)等表达，从而进行刺激。
(5-3)将MagEle(磁铁电极)固定在目标细胞上方时的电容型记录法
在上述(4-5)中详细描述的传统记录方法中，也将MagEle(磁铁电极)固定在目标细胞的上方，与导电性纳米粒子的细胞膜贯通一起，作为细胞内电位测量时的(+)极而工作，在这种情况下，接地电极(-)极设置在外液中，因此，为了与外液隔离，将设置在MagEle侧面的绝缘体没有间隙地固定在基板(培养皿、培养板等)上(图9)。
另外，在本发明中提及“基板”时，包括为了粘附目标细胞以进行培养、测量等的所有器具。例如，指培养皿、培养板、导电性板等。
另一方面，在本发明的电容型记录法中，在将MagEle(磁铁电极)固定在目标细胞上方时，作为(+)极工作的MagEle除了与细胞的接触面以外，即上面和侧面周围都被绝缘体(封口膜等)完全覆盖，并将充当接地电极(-)极的磁性体或磁铁吸引性金属板隔着绝缘膜配置并固定在MagEle上方(接地夹(Clip on Ground))。在本发明的接地夹中，MagEle和覆盖其上面的绝缘体膜将作为电容器的电容起作用。在此，如果使用对磁铁具有吸引力的铁板或含铁合金作为金属电极，则可以将(+)电极和(-)电极集成在一起。
而且，此时，面向目标细胞的MagEle下面不需要与细胞外液隔离。设置在MagEle侧面的绝缘体可以像以往的那样完全没有间隙地固定到基板(图16A)，但是也可以相对于基板不完全固定，MagEle及其下面的细胞不与外液完全隔离，使得外液能够扩散流入(图19)。
在使用MagEle时，期望细胞接种密度为中等程度。特别是在周围被隔离的情况下，细胞外液的组成可能会因细胞的电活动而受到影响，所以细胞的接种密度需要比形成片的密度低。例如，当产生动作电位时，在钠离子流入细胞内、钾离子从细胞流出的情况下，如果MagEle下面的细胞与外液隔离，则产生动作电位所需的细胞外液中的钠变得不足，对动作电位的产生造成负面影响。
在MagEle及其下面的细胞不与外液隔离的后一种情况下，由于MagEle检测通过细胞膜中存在的离子通道引起的细胞内的电荷变化，因此，除非发生了对细胞周边的离子浓度产生影响的程度的细胞内外的离子交换，否则与细胞外液直接接触部分的MagEle不会受到外液的影响，可以通过贯通细胞膜的导电性纳米粒子只检测细胞膜上的离子通道引起的细胞内电位变化。也就是说，向外液中给予的药物也会发生扩散流入，可以记录在药剂作用于细胞的情况下的细胞内电位变化。
作为积极引起该细胞外液从间隙流入的最有效的方法，有“聚碳酸酯插入式细胞培养器法”(图16B)。
在“聚碳酸酯插入式细胞培养器法”中，粘附细胞的基板是孔径为0.4μm(ThermoScientific)的聚碳酸酯透过膜，从而，由于外液从插入物下方的间隙的流入顺畅，因此对由给予的药剂引起的细胞内电位变化进行观察的效率良好。
6.本发明的用于测量细胞内电位或其变化的装置(传统型)
(6-1)细胞内电位测量用容器
在本发明中，作为用于目标细胞的接种、培养的培养容器，如果在使用磁铁电极的情况下，可以直接使用通用的培养皿、培养板等。
此外，在使用导电性板的情况下，由于也能够在培养容器底面的至少一部分上设置有导电性板区域的状态下直接培养，因此能够用作培养容器。因此，无论在哪种情况下，都可以将用于目标细胞的接种、培养的培养容器直接用作细胞内电位测量用容器。而且，根据需要，也可以从用于培养的容器移植到更容易进行测量的其它细胞内电位测量用容器中。
在将培养容器直接作为细胞内电位测量用容器使用的情况下，在将导电性纳米粒子导入培养容器内的目标细胞后，用生理盐水多次清洗培养液以替换为生理盐水，并立即通过磁场将细胞内的导电性纳米粒子吸引到磁铁电极或导电性板侧而贯通细胞膜，由此可以测量、记录细胞内电位或电位变化。
在使用电荷放大器原理的方法中，无论是使用导电性玻璃时还是使用磁铁电极时，都不需要像片状那样覆盖底面。另外，可以根据实验目的使用离子组成不同的缓冲液代替生理盐水，只要保持渗透压、pH即可。
(6-2)用于测量细胞内电位的装置(传统型)的使用
在本发明中，通过贯通细胞膜的导电性纳米粒子反映细胞内电位的导电性板电极或磁铁电极感应细胞内的自发电位和诱发电位，并在细胞外进行记录。由于此时产生的电位变化微弱，因此为了进行细胞内电位的记录，需要具备电压放大器(放大用的放大器)的装置。
作为这样的装置，可以使用以往用于测量细胞或细胞群的细胞内电位或细胞外电位的装置中的任一种。
具体而言，如果是膜片钳放大器细胞内记录用放大器，则可以使用输入电阻最低为106欧姆～108欧姆以上的放大器。例如，可以使用膜片钳放大器(Axopatch 200A，Axoninstruments)等。
此外，如果是MEA系统，只要是能够测量直流信号而不是交流信号的装置，就可以使用。
7.本发明的用途
(7-1)药物发现筛选
本发明在药物发现筛选中特别有用。
本发明的细胞内电位测量法可以使用利用电荷放大器原理的测量法代替以往的膜片钳法或自动膜片钳法来记录细胞的动作电位以及静息膜电位的测量。
在药物发现筛选时，通过使用上述模型心肌细胞和模型神经细胞，由于能够迅速且准确地进行对受检物质对细胞功能的影响、电刺激引起的收缩活性、电生理学特性变化的分析等，因此能够迅速地评价受检物质的细胞毒性和药效，对于受检物质的评价是有效的。
(7-2)配体受体活性型离子通道的记录方法
在本发明中，作为将使用磁铁电极的电容型电位测量装置应用于筛选方法的例子，以下示出了使用配体受体活性型离子通道表达细胞筛选对该细胞具有毒性作用或活性作用的物质时的步骤，但不限于以下步骤。
具体而言，按照包括以下(1)～(6)的步骤进行。
(1)向粘附在多孔膜(插入式细胞培养器)上的目标细胞内导入导电性纳米粒子的工序，
作为多孔膜，可以使用市售的插入式细胞培养器(Nunc聚碳酸酯插入式细胞培养器，Thermo Scientific)，优选地使用具有0.1μm～1.0μm孔径、特别优选具有0.4μm孔径的聚碳酸酯多孔膜的插入式细胞培养器；此外，还可以使用ミリセル(Millicell)插入物(Merkmillipore)、Fisher scientific、Corning制造的插入式细胞培养器，
此外，实际上，为了从细胞下面进行溶液的回流，需要在多孔膜上培养细胞，并将其设置在垫片上的工序；
(2)将磁铁电极粘附在目标细胞的上面的工序，
在此，所述磁铁电极除了与目标细胞的粘附面以外都被绝缘体覆盖，在其上面隔着绝缘体具有磁性体或磁铁吸引性金属板；
(3)在与所述细胞粘附的插入式细胞培养器底面的多孔膜的下方设置磁铁吸引性金属板，通过在所述磁铁电极和下方的金属板之间产生的磁力将导电性纳米粒子吸引至与磁铁电极的粘附面侧并贯通细胞膜，使暴露于细胞外的一端与所述磁铁电极接触的工序，
另外，在插入式细胞培养器底面和磁铁吸引性金属板之间有约3mm左右的间隙，但是该间隙对实验的影响很小，不需要考虑；
(4)将所述磁铁电极连接到电信号放大器的正极并将上方的所述磁性体或所述磁铁吸引性金属板连接到电信号放大器的负电极以形成电位记录电路，测量两个电极之间的电压的工序；
(5)通过具有透过性的插入式细胞培养器底面的多孔膜(聚碳酸酯膜，孔径0.4μm)对目标细胞给予受检物质样品的工序；
(6)对于在工序(5)中给予受检物质样品的目标细胞，与工序(4)同样地测量两个电极之间的电压的工序；
(7)将工序(6)中的测量结果与工序(4)中的测量结果进行比较，在两者的测量值有显著差异的情况下，评价受检物质样品是对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的工序。
实施例
以下示出实施例具体说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
本发明中的其它术语和概念基于本领域中惯常使用的术语的含义；特别是除了明示其出处的技术以外，就用于实施本发明而使用的各种技术而言，本领域技术人员能够基于公知文献等容易且可靠地实施。此外，各种分析等应用所使用的分析仪器或试剂、试剂盒的使用说明书、商品目录等中记载的方法进行。
另外，将本说明书中引用的技术文献、专利公报以及专利申请说明书中的记载内容作为本发明的记载内容来参照。
(参考例1)稳定表达光受体通道(ChRWR)的CHO细胞中的细胞内电位的测量
在本参考例中，使用通常的膜片钳放大器(Axopatch 200A，Axon instruments)作为进行细胞外记录的装置，通过本发明的细胞内电位记录方法，进行表达光受体通道(视紫红质通道蛋白(Channelrhodopsin)：ChRWR)的CHO细胞中的细胞内电位的测量。
(1-1)hChRWR-CHO稳定表达细胞系的制作
已知光受体通道(ChRWR)具有7次跨膜型的视紫红质样结构，并且对480nm蓝光刺激具有向上的响应(上向きに応答する)(去极化)。
Wang等人的八尾教授的小组报道了从ChR1和ChR2构建嵌合基因视紫红质通道蛋白(ChR)-wide receiver(ChRWR)，使用该ChRWR基因使ChR2(通道视蛋白2)在PC12培养细胞及大脑皮质神经细胞的细胞膜中高表达，通过膜片钳法测量光刺激引起的细胞内电位的响应，可以对神经细胞赋予光敏感性(Wang等，2009，J.of Biol.Chem.284(9)：5685-5696；日本特开2006-217866号公报)。
在本参考例中，使用由八尾教授分配的ChRWR基因(1073bp)，利用下述引物，使用Phusion DNA聚合酶，通过PCR进行扩增。
正义引物：CACTATAGGGAAGCTaccatggctcggagaccctggct(序列编号1)反义引物：ATAGAATAGGAAGCTCTActtgcctgtccctttgttga(序列编号2)
使用InFusion HD克隆试剂盒(TakaraBio)将得到的PCR产物导入pD603(嘌呤霉素，DNA2.0)载体，构建hChRWR表达载体。将该hChRWR表达载体导入CHO细胞(JCRB细胞库)(Superfect，Qiagen)，制作了稳定表达hChRWR基因的CHO细胞(hChRWR-CHO稳定表达细胞系)。
(1-2)利用金涂覆磁性纳米粒子构建细胞内记录电极
为了利用金涂覆磁性纳米粒子作为电极，从下方通过磁铁牵引导入细胞内的金涂覆磁性纳米粒子，贯通细胞膜。由此，金涂覆磁性纳米粒子经由细胞膜而使其一部分同时暴露于细胞内、细胞外。由于细胞接种在细胞外记录用电极上，因此伴随金涂覆磁性纳米粒子贯通细胞膜，作为细胞内记录电极起作用(图1)。
此时，金涂覆磁性纳米粒子向CHO细胞内的导入使用聚乙烯亚胺(PEI，P3143Sigma-Aldrich)，以下述URL为基础，按照改良的方案进行(https://labs.fccc.edu/yen/docs/PEI％20preparation.pdf)。
具体而言，预先使用0.2μm过滤器(Minisart，Sartorius stedim)调整10mg/mLPEI溶液(pH7)后，在-80℃下储存，仅将使用的部份在即将使用前用ddH2O稀释100倍。将5μLPEI稀释溶液加入80μL金涂覆磁性纳米粒子和20μL 5×HBPS(24mM HEPES+126mM NaCl、4mMKCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM葡萄糖)混合液中，在室温下孵育15分钟。
然后，用含有不含血清的DMEM(Sigma-Aldrich公司制造)或者OptiMEM I(Invitrogen公司制造)的缓冲液(PBS)洗涤在(1-1)中制作的培养hChRWR-CHO细胞，与上述金涂覆磁性纳米粒子溶液置换，在37℃培养箱中孵育15分钟。
然后，使磁铁从上述培养细胞粘附的导电性玻璃的下方起作用而使细胞膜贯通，从而成为能够记录细胞内电位的状态，构建细胞内记录电极。
导电性玻璃上的细胞的细胞内电位通过如(图2)那样配置的由记录电极、接地电极、放大用的放大器构成的装置来测量，此时，为了不使充当电极的玻璃面和接地电极直接与细胞外液短路，在玻璃面的狭窄区域(直径1.5mm-2mm的圆形区域)中无间隙地填充培养细胞来进行培养。
(1-3)利用金涂覆磁性纳米粒子电极测量细胞内电位
对在(1-2)中构建的含有细胞内记录电极的培养细胞照射蓝光，进行其刺激响应量的测量(图4)。
图中，每25秒进行蓝光照射(12秒照射)，将蓝光的输出强度以4级增强(Max 1.2A，LED Driver M00290257，470nm M470F1，Thorlabs)。
当蓝光的输出从左向右增强时，向上的电位响应(去极化)也变大。
根据该结果，确认了导入接种在细胞外记录用电极上的细胞内的金涂覆磁性纳米粒子能够贯通细胞膜，与电极连接，可以通过作为细胞外记录装置的膜片钳放大器(电流钳模式，Axopatch 200A，Axon instruments)来测量细胞内膜电位。
此外，在本发明中，与以往的细胞非侵入性细胞内电位测量法不同，能够在至少30分钟以上不衰减地持续记录稳定的电响应。
(参考例2)稳定表达Nav1.5/Kir2.1的HEK细胞中细胞内电位的测量
在该参考例中，使用自发产生动作电位的稳定表达Nav1.5/Kir2.1的HEK细胞进行细胞内电位的测量。
(2-1)Nav1.5/Kir2.1的稳定表达HEK细胞的制作
使用载体将Nav1.5/Kir2.1基因转化HEK细胞(JCRB细胞库)，制作稳定表达Nav1.5/Kir2.1的HEK细胞。
具体而言，首先从人Na+通道(Nav1.5)的α亚基(SCNA5，BC140813：SourceBioscience公司)切出Nav1.5基因，插入pcDNA3.1(-)潮霉素(hygromycin)(Invitrogen)中。
BC140813是胚胎型Nav1.5基因，因此使用人心脏cDNA(Zymogen)通过PCR法等替换成在人成人心肌中表达的Nav1.5基因。
对于Kir2.1(NM_000891，KCNJ2)基因(1284bp)，在从来自iPS细胞的心肌细胞(CDI，Cellular Dynamics International)中提取的总RNA中，利用下述引物应用了巢式PCR法。
Kir2.1 1st正义：CCAAAGCAGAAGCACTGGAG(序列编号3)
Kir2.1 1st A/S：CTTTGAAACCATTGTGCTTGCC(序列编号4)
在使用上述引物的第一轮PCR中不能确认PCR产物，因此稀释100倍再进行PCR，取得Kir2.1基因。
Kir2.1 ICR HindIII正义：CACTATAGGGAAGCTACC atgggcagtgtcgaaccaac(序列编号5)
Kir2.1 ICR HindIII A/S：ATAGAATAGGAAGCT tcatatctccgactctcgccg(序列编号6)
将得到的Kir2.1 PCR产物插入pD608(灭瘟素，DNA2.0)的HindIII位点中。
将Kir2.1基因(Kir2.1 2μg/mL灭瘟素)与上述Nav1.5基因(50μg/mL潮霉素)一起导入HEK293细胞(培养液，DMEM，Sigma-Aldrich，10％FBS)，制作Nav1.5/Kir2.1的稳定表达细胞系。
(2-2)细胞内电位的测量
接着，培养HEK细胞(DMEM，Sigma-Aldrich，10％FBS)，与(参考例1)同样地，在玻璃面几乎整个面被覆盖时，将PEI稀释溶液中的金涂覆磁性纳米粒子导入该HEK细胞内，在测量用玻璃面上在37℃下孵育15分钟，使磁铁从测量用玻璃的下面起作用，利用金涂覆磁性纳米粒子构建细胞内记录电极。
进行细胞内电位记录的结果是，能够稳定地将动作电位记录为从60mV到80mV的膜电位的变化(图5)。
同样地，通过施加电流脉冲来诱导动作电位，也能够记录细胞内电位(图6)。
(参考例3)Nav1.5/Kir2.1 HEK细胞的电生理学评价
在本参考例中，使用(参考例2)中使用的稳定表达Nav1.5/Kir2.1的HEK细胞，应用于膜片钳法，进行电生理学评价，验证了本发明的方法。
使用的细胞外液和细胞内液的组成如下。
细胞外液：126mM NaCl、4mM KCl、1.8mM CaCl2、1mM MgCl2、24mM HEPES、10mM葡萄糖(pH7.4 NaOH)
细胞内液：130mM KCl、5mM MgCl2、5mM EGTA、4mM Tris-ATP、10mM HEPES(pH7.2KOH)
(3-1)使用电流钳验证
对于(参考例2)中使用的稳定表达Nav1.5/Kir2.1的HEK细胞，通过电流注入(Current injection)刺激细胞，记录细胞内动作电位样的膜电位变化(图7A)。图中，上部(Vm)的轨迹表示膜电位的变化，下部(I)的轨迹表示作用的电流量。若阶段性地增大作用电流量，则在被动膜电位响应的基础上，还根据基于Nav1.5活性的全或无法则产生自再生电位(动作电位)。Nav1.5活性立即发生失活。直到Nav1.5从失活状态(不应期)恢复，Nav1.5活性降低。如黑色箭头(arrow head)所示，与对最初的电流刺激的响应相比，对第二次电量刺激的响应显著降低。这强烈表明自再生(动作)电位是Nav1.5介导的电位响应(图7A)。
(3-2)使用电压钳验证
<Nav1.5电流(图7B)>
将膜电位固定在-80mV(保持电位(Holding potential))，从该膜电位逐步以10mV的间隔使电位从-40mV变化为40mV。与此相伴，记录了由Nav1.5活性引起的瞬时内向(一過性の内向き)钠电流(图7B)。
<KCNJ2(Kir2.1)电流(图7C)>
与Nav1.5电流(图7B)测量同样地，将膜电位固定在-80mV；为了容易地测量Kir2.1电流，将膜电位变更为-20mV(此后立即能够确认瞬时Nav1.5电流)；之后，通过以每10mV从-40mV至-120mV将膜电位超极化，确认了Kir2.1电流的存在。接着，通过将膜电位移到-20mV，还可以观察到Nav1.5电流的膜电位依赖性的失活过程。
通过以上利用膜片钳法进行的验证，可以确认(参考例2)中使用的细胞是能够稳定表达Nav1.5和Kir2.1的细胞，(参考例2)中的测量值是基于Nav1.5/Kir2.1表达的动作电位的测量值。这表明，与以往的膜片钳法相比，通过本发明允许以更简单的操作进行同样的细胞内电位测量。
(参考例4)利用通过蛋白质毒素在细胞膜上开孔洞的方法导入导电性纳米粒子的方法
在本参考例中，基于使用链球菌溶血素O的Walev等的方法(PNAS 98：(6)3185-3190(2001))，通过经改良的以下方法将金涂覆磁性纳米粒子导入培养细胞内。
首先，使用DTT将链球菌溶血素O(SLO)(和光纯药公司制造)还原，使其活化，将SLO浓度调制成约5U/μL。
接着，将2.5×106个CHO或HEK细胞与金涂覆磁性纳米粒子40μL和金涂覆磁性纳米粒子导入溶液(20μL 5×HBPS(1mM Ca2+、1mM Mg2+)，80μL ddH2O)混合，与SLO一起在37℃下孵育10分钟，由此在通过SLO在细胞膜上形成孔的同时，通过该孔将金涂覆磁性纳米粒子导入细胞内。
SLO孔的失活(闭合)通过与含有细胞的溶液的500μL-1000μL的DMEM 10％FBS混合，在37℃下孵育20分钟以上来完成，在显微镜下确认了大量金涂覆磁性纳米粒子被导入细胞内。
由以上可以确认，利用使用蛋白质毒素的方法，也能够向细胞内导入导电性纳米粒子。
(参考例5)利用钕磁铁的高导电性的使用磁铁电极(MagEle)的方法
(5-1)用上方的磁铁电极吸引细胞内的导电性纳米粒子而贯通细胞膜的方法
在本参考例中，将涂覆有Ni-Cu-Ni的直径1mm的圆柱钕磁铁(NeoMag株式会社)作为钕磁铁电极(MagEle)使用，构建细胞内记录电极。
使用(参考例2)中制作的“Nav1.5/Kir2.1的稳定表达HEK细胞”，通过细胞上方的钕磁铁电极(MagEle)将导入细胞内的金涂覆磁性纳米粒子吸引至磁铁电极，贯通细胞膜，构建细胞内记录电极，记录细胞内电位变化(图8)。
具体而言，将(参考例2)中制作的“Nav1.5/Kir2.1的稳定表达HEK细胞”在通常的培养皿中进行培养(DMEM，Sigma-Aldrich，10％FBS)。
与(参考例1)同样地，使用PEI稀释溶液将金涂覆磁性纳米粒子导入细胞内。另外，纳米粒子导入也可以与(参考例4)同样地使用SLO进行。通过配置在细胞上方的钕磁铁电极(MagEle)吸引导入细胞内的金涂覆磁性纳米粒子，贯通细胞膜，构建细胞内记录电极，记录细胞内电位变化(图10)。
(5-2)使吸附在磁铁电极上的导电性纳米粒子贯通细胞膜的方法
将与PEI混合的金涂覆磁性纳米粒子(nanoimmunotech公司制造，NITmagold Cit)添加到侧面包被有绝缘体的磁铁电极表面上，并在约30分钟内将该纳米粒子吸附到磁铁电极上。
在设置于铁板上的培养皿内，从Nav1.5/Kir2.1 HEK细胞和培养心肌样细胞(iCell cardiomyocyte)的上方使上述磁铁电极在导电性纳米粒子的吸附面向下的状态下直接接触。磁铁电极被培养皿下方的铁板吸引而固定在细胞上方，观察到导电性纳米粒子经由PEI贯通细胞膜，并且由于来自磁铁的磁力而留在细胞膜内(图9)。
进而，在任何细胞中，都可以利用得到的细胞内记录电极，与(5-1)的情况同样地记录细胞内电位变化。
即，确认了即使没有预先将导电性纳米粒子导入细胞内的工序，通过使导电性纳米粒子和PEI的混合物吸附于磁铁电极并压在细胞上的工序，可以通过侵入性非常小的方法构建细胞内记录电极，也可以记录细胞内电位变化。
(参考例6)对导电玻璃表面的粘附力弱的细胞的细胞接种方法
虽然CHO细胞等通常的动物细胞有效地粘附在导电玻璃表面，但也有心肌细胞和HEK细胞等细胞是对导电玻璃表面的粘附效率显著低的细胞。在将这样的细胞直接接种于导电玻璃表面的情况下，将细胞培养至覆盖形成培养容器底面的导电玻璃的整个表面是极其困难的。
因此，预先在导电玻璃表面上格子状地涂布胶原，从其上进行细胞的接种，培养至覆盖整面。在没有胶原涂膜的部位，贯通细胞膜的导电性纳米粒子能够与导电性玻璃直接接触。
胶原导电性低，但由于细胞粘附性和对导电玻璃的粘附性都高，因此可以提高胶原涂膜部位的细胞粘附率。作为这样的物质，还有纤连蛋白、聚-L-赖氨酸等，可以代替胶原使用。
(参考例7)使用膜电位固定法，通过贯通培养在导电性板电极上的CHO细胞的细胞膜的导电性纳米粒子测量CHO细胞的内源性外向电流
本参考例是用于确认通过使用导电性板电极与细胞内的导电性纳米粒子共同构建的细胞内记录电极也能够与细胞内电位同样地测量细胞内产生的细胞膜电流的实验。
培养CHO细胞(Eagle最低必需培养基，Sigma-Aldrich；10％FBS，BioWest；40mM L-谷氨酰胺，和光纯药)，用DTT还原链球菌溶血素O(SLO)(和光纯药公司制造)，使其活化，将SLO浓度调制成约5U/μL。
在金涂覆磁性纳米粒子20μL和金涂覆磁性纳米粒子导入溶液(5μL 5×HBPS(1mMCa2+、1mM Mg2+))中导入5×105个CHO细胞，接种在导电玻璃上。在玻璃面的整面被覆盖时，利用金涂覆磁性纳米粒子使用膜电位固定法进行细胞膜电流的记录。实验前将CHO培养液(Eagle最低必需培养基，Sigma-Aldrich；10％FBS，BioWest；40mM L-谷氨酰胺，和光纯药)替换为细胞外溶液(24mM HEPES+126mM NaCl、4mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM葡萄糖)。膜电位固定法使用在Axopatch 1D(Axon Instruments)中用于人工脂质膜实验的前级探头(headstage)(CV-4)进行。其原因是在导电性玻璃上培养了多达数百个细胞。在膜电位固定法中，为了转换膜电位，首先需要对来自细胞膜的脂质膜的电容进行充电。这是因为需要能够瞬时流过大量电流的电压钳放大器。
在膜电位固定法实验中，将膜电位固定在-80mV，将膜电位阶梯式地施加-60mV、-50mV、-30mV、-10mV、10mV、30mV、50mV、60mV和1.4秒长度的电位脉冲(图11A下方)。响应于该膜电位的刺激，观察到外向电流(图11A上方)。在图11A上用箭头指出的瞬时(Transient)、持续(Sustained)的各个点处测量电流大小，并在图11B中用图示出电流(纵轴，nA)-电压(横轴，mV)的关系。
对用于本实验的膜电流的测量方法及为此使用的装置进行补充说明。
为了测量膜电流(流过细胞膜中存在的离子通道的电流)，使用膜片钳放大器。此时，使用电压钳模式而不是记录细胞膜电位时的电流钳模式。在同时控制多个细胞的膜电位而不是单个细胞的情况下，由于全部细胞膜(脂质双层膜)的膜电容是细胞数×每一细胞的脂质双层膜产生的电容，所以变得非常大。因此，与参考例1等的情况不同，使用能够流通大电容电流的Axopatch-1D膜片钳放大器(Axon Instruments)。
到此为止使用的Axopatch 200A(电压钳)特别适用于控制通常的单个细胞的膜电位的实验的情况。在用于大量细胞的情况下，由于细胞膜-脂质双层膜的合计面积大，因此需要控制大量膜电位，因此，使用可以使用人工脂质双层膜实验测量用的CV-4前级探头的Axopatch-1D。人工脂质双层膜实验测量用的前级探头由于能够流过大电流，因此具有能够对大量细胞的脂质双层膜进行快速充电这样的优点。另外，也可以使用双层钳放大器(Bilayer Clamp Amplifier)(BC-535)(Warner Instruments)等代替Axopatch-1D膜片钳放大器。
(实施例1)应用电荷放大器原理进行测量的方法
(1-1)用于电荷放大器原理应用的准备实验
该实验是为了表明以下内容的实验：在进行生物电位的测量时，通过将电荷放大器与导入细胞内的纳米粒子组合，该测量系统有效(图12)。
电路A是在用于记录的电流钳模式的膜片钳放大器Axopatch 200A中将模型细胞(细胞等效电路：500MΩ电阻和33pF电容器)并联连接的电路中施加矩形电流脉冲(20ms，120pA)，测量通过该等效电路的电位变化(图12电路A)。
接着，在等效电路和放大器的负输入之间连接充当电荷放大器的传感器的导电玻璃。为了使该导电玻璃作为电容器起作用，在未施用导电涂层的玻璃下方配置铝箔(图12电路B)。
计算电路A与电路B之间的差并评价导电玻璃-铝箔电容器插入对电压输出的影响。从分别进行的同样的实验可知，发现对波形振幅有3.3％、5.7％减少这样的误差，但除此之外，发现波形本身不受滤波效应等影响。
由此判断出，导电玻璃-铝箔电容器作为电荷放大器的传感器是有效的，可以应用于在导电玻璃上培养的细胞的电活动(细胞内外的荷电离子的运动)的测量。
图12的电路C示出了使用实际细胞时的配置电路。作为样品，使用与上述(参考例2)中使用的相同的细胞(Nav1.5/Kir2.1 HEK细胞)，使用电荷放大器测量细胞的自发性动作电位，并确认了可以应用电荷放大器原理利用细胞外记录装置测量细胞内膜电位(图12电路C)。
(1-2)使用电荷放大器的心肌样细胞
在本实施例中，使用心肌样细胞，通过导电性纳米粒子将由细胞内的动作电位等引起的细胞内膜电位的变化捕捉为电荷的变化，将该电荷信号变化(与动作电位产生相伴的荷电离子(Na+、K+、Ca2+、Cl-)向细胞内外的运动)应用电荷放大器原理作为电压信号进行测量(图13)。
具体而言，将心肌样细胞(iCell Cardiomyocyte：CDI公司)接种在导电玻璃(厚度2mm)上，作为培养液使用“iCell Cardiomyocytes Maintenance Medium”进行培养。通过以下方法，使用链球菌溶血素O(SLO，和光纯药)将金涂覆磁性纳米粒子导入心肌样细胞内。
即，用PBS8-(-)清洗一次，用纳米粒子-SLO混合物(20μL PEG-金涂覆磁性纳米粒子，5μL 5×HBPS，1μL(1U)活性化的SLO)进行置换，在培养器(37℃)中保持15分钟。接着，将溶液置换成iCell Cardiomyocytes Maintenance Medium(由血清引起SLO失活)，在第二天以后进行实验。
与上述(1-1)的电路C一样，将导入了金涂覆磁性纳米粒子的心肌样细胞覆盖的导电玻璃上面连接到放大器的输入端，并且将配置在玻璃下面的铝箔连接到接地电极。通过具有导电性的玻璃的上面和下面的铝箔形成电容器，测量在上面培养的细胞的电活动(细胞内外的荷电离子的运动)(图14)。
以这样的方式，在本发明中得以首次证明了可以利用电荷放大器原理通过导电性纳米粒子测量细胞的自发性动作电位。
(实施例2)粘附力弱的细胞的电荷放大器模式(CHargeAmpLifier(CHAMPL)模式)记录
在本实施例中，使用典型的心肌样细胞(iCell Cardiomyocyte2)作为对导电玻璃表面的粘附效率低的细胞，在通过(参考例6)的方法制备的导电玻璃表面培养后，导入金涂覆磁性纳米粒子，通过磁场贯通细胞膜后，针对藜芦定(veratridine)那样的钠通道开放剂的作用而诱发记录了动作电位。本实验在室温下进行。
具体而言，首先将调整成凝胶状的胶原(去端胶原(アテロコラーゲン)，(株)高研)在导电玻璃表面中心部的直径约5mm的圆内以线状进行涂布后，使用尖端熔化的微电极拉伸成格子状，形成约0.5μm间隔的格子状胶原涂膜。
接着，在该导电性玻璃表面接种心肌样细胞(iCell Cardiomyocyte2)，在心肌样细胞专用培养基(iCell Cardiomyocytes Maintenance Medium)中培养约6天，形成心肌细胞片(心筋細胞シート)。
接着，使用SLO导入金涂覆磁性纳米粒子，在导电性玻璃下部磁铁的磁场作用下，该纳米粒子贯通细胞膜作为导电性玻璃电极，将覆盖细胞的培养液置换成生理盐水，2天后使用电荷放大器模式(CHargeAmpLifier(CHAMPL)模式)在室温下进行细胞动作电位的记录(图14)。
然而，由于该样本中无法观察到自发性动作电位(数据未示出)，因此在生理盐水内将作为钠通道开放剂工作的藜芦定(Sigma-Aldrich)以最终浓度100μM的方式给予，以诱发记录动作电位。在给予藜芦定40秒后观察到缓慢的去极化，接着记录了自发性动作电位(图15)。
(实施例3)培养神经细胞中细胞内电位的测量
在本实施例中，确认了就根据(参考例2)的方法在细胞膜中贯通有金涂覆磁性纳米粒子的培养神经细胞而言，通过使用附加了电容型电位测量功能的磁铁电极的测量方法可以测量细胞内电位。
(3-1)培养神经细胞的制备
作为培养神经细胞，使用NG108-15细胞(成神经细胞瘤-神经胶质瘤杂交细胞)，用包含DMEM(Sigma-Aldrich)、HAT补充剂(Thermofisher)和10％FBS(Biowest)的培养液进行培养。在包被有0.1％聚乙烯亚胺(pH8.4，150mM四硼酸钠(Wako))的盖玻片上接种NG108-15，培养液是将上述培养液的FBS设为5％，向其中添加500μM布洛芬(Ibuprofen，Wako)，由此进行神经诱导。神经诱导5天后进行以下实验。
(3-2)通过磁铁电极法进行金涂覆磁性纳米粒子的细胞膜贯通
将PEI-PEG-金涂覆磁性纳米粒子混合并放置3小时。将该混合液移至钕磁铁的细胞粘附面上，再放置15分钟，通过磁性将金纳米粒子结合到钕磁铁电极上。
把这个电极放置于设置在铁板上的培养细胞上。由于细胞下方的铁板和磁铁电极通过磁力互相吸引，所以磁铁电极在细胞上自立固定，磁铁电极表面的金纳米粒子在PEI作用下以一端暴露于细胞内的方式贯通。
磁铁电极使用磁力220毫特斯拉、直径6mm的钕磁铁。将除细胞接触面以外被封口膜覆盖的磁铁电极连接到正极，负极是由从封口膜上吸附的强磁性体构成的作为电容型电位测量装置起作用的磁铁电极(MagEle)。此时，强磁性体和磁铁电极之间的封口膜加厚，确认完全绝缘(图16A)。
在此，使用附加了电容型电位测量装置功能的磁铁电极(C-M电极)进行记录。
(3-3)使用聚碳酸酯插入式细胞培养器制备细胞
在此，除了代替(3-1)中使用的盖玻片而在聚碳酸酯插入式细胞培养器(孔径0.4μm，Thermo Scientific)内对培养神经细胞(NG108-15细胞)进行接种、培养之外，通过与(3-1)和(3-2)相同的方法制备，然后使导电性纳米粒子(金纳米粒子)贯通细胞膜(图16B)。
使用插入式细胞培养器的优点在于，由于在孔径为0.4μm(Thermo Scientific)的聚碳酸酯透过膜上培养细胞，因此即使细胞的上表面被磁铁覆盖，也可以从插入物下方的间隙用不同的溶液进行置换。这也可以用于观察药物的作用，给予激动剂，进行配体门控通道活性的测量。
(3-4)培养神经细胞的细胞内电位的记录
对NG108-15细胞进行5天神经分化诱导后，将培养液置换成细胞外液(生理盐水)，进行动作电位记录的实验。通过将C-M电极配置于接种在盖玻片上的细胞上来记录自发性动作电位。该方法强烈依赖于细胞的自发性活性，因此神经分化程度对实验的成功有很大影响(图17A)。
除了自发性动作电位之外，为了确认是否能够记录由作为神经递质的谷氨酸引起的神经活性而进行以下实验。对NG108-15细胞进行2天神经分化诱导来进行实验。与上述实验一样，将C-M电极配置在细胞上，进行实验记录。向细胞外液中给予谷氨酸(最终外液浓度800μM)，记录谷氨酸受体介导的响应。通过谷氨酸激活了内源性谷氨酸受体，并将其记录为膜电位的去极化(向上变化(上向きの変化))响应。由谷氨酸诱发的膜电位变化由于脱敏作用而慢慢衰减，约90秒后回到基线。去除了图上的基线和谷氨酸响应假象(图17B)。
由于能够记录持续数秒的缓慢的膜电位变化，因此也能够用该方法记录由神经递质活化的离子通道引起的膜电位变化、G蛋白介导的离子通道的活性等。
(实施例4)瞬时性离子通道表达细胞中细胞内电位的测量
在CHO培养细胞中，与作为离子通道基因的SCN5A(Nav1.5)基因、CACNα1C(Cav1.2)基因以及KCNH2基因一起导入ChRWR(视紫红质通道蛋白)基因(由八尾教授分配)，使这些离子通道和光受体通道(ChRWR)瞬时性表达，制作心肌动作电位模型细胞。
接着，与(实施例2)同样地，使用SLO导入金涂覆磁性纳米粒子，通过磁场使该纳米粒子贯通细胞膜后，照射蓝色LED(手动照射时间约0.5秒)，激活光受体通道(ChRWR)，诱发动作电位。使用(实施例2)中使用的电荷放大器模式(CHargeAmpLifier(CHAMPL)模式)(图13)进行动作电位的记录。
在此时的电荷放大器模式中，将(+)电极连接到细胞接种面的导电玻璃，并将(-)电极连接到设置在导电玻璃下方的条状铝箔。另外，铝箔必须设置在所记录的细胞的正下方，如果设置在远离记录细胞的位置处，则无法检测电信号。
其结果是，通过给予500nM硝苯地平(Nifedipine)，钙通道被抑制，引起动作电位振幅减小。
此外，当通过给予10mM利多卡因(Lidocaine)抑制钠通道时，所有动作电位都消失，仅由光受体通道响应(图18；图中o标志表示LED照射)。
(实施例5)分化的培养神经细胞中细胞内电位的变化的测量
在本实验中，在以下分化条件下对(实施例3)中使用的培养神经细胞(NG108-15细胞)进行神经诱导，通过与(实施例3)相同的方法将MagEle(磁铁电极)固定在目标细胞的上方，在MagEle的细胞粘附面上使金涂覆磁性纳米粒子贯通细胞后，通过(+)极的MagEle以及在完全覆盖MagEle上面的绝缘体(封口膜)上作为接地电极设置的强磁性体(MagEle)来测量细胞内电位。此时，绝缘体完全覆盖(+)极的MagEle的上面及侧面周围，但不固定在细胞所粘附的基板的盖玻片上，细胞不与外液隔离(图19)。
就NG108-15细胞的分化条件而言，在添加毛喉素(Forskolin，10μM)的含有2％FBS的DMEM/HAT培养基中培养3周来进行。
其结果是，通过20μM藜芦定诱导了自发性动作电位，并通过给予钠通道阻断剂3mM利多卡因抑制了自发性动作电位(图20)。
这表明在细胞外给予的试剂对由MagEle进行的记录中的NG108-15细胞的活动起到了作用。
在该实验例中，观测到动作电位的大小比其它实验例小。这种现象是在电极电阻非常高的情况下发生的现象。认为这是在作为记录对象的细胞中导电性纳米粒子的膜贯通效率低的情况下发生的现象，这一点也作为电容型电位测量法的优点发挥作用。即，表明由于电荷由Q＝VC(电荷＝电压×膜电容)这样的电压与膜电容的乘积来表示，因此即使在电压变化因高电极电阻的影响而较小的情况下，只要细胞足够大，就可以作为电荷(Q)的变化来检测。
此外，在(图20)的结果中，基线的波动样浮动极小。这表明MagEle具有轻微的AC滤波效应(フィルター作用)。认为这种现象是由于MagEle和接地夹(Clip onするGround)之间的距离过近，导致电容器值较低而产生的。为了防止AC滤波效应，期望不仅是封口膜，还组合(图12)中使用的(导电)玻璃(无限大电阻)等电阻值高的具有1mm左右的厚度的材料，以确保充分的电容器电容值。
工业实用性
由于本发明能够简便且准确地测量细胞内电位，因此在药物发现筛选中特别有用。预期不仅在培养心肌细胞中而且在培养神经细胞等中会对体外电生理学研究做出重大贡献。
此外，本发明由于基本原理简单，可较廉价地供应，可以期待将其应用于电生理学的学生实习、基础研究等中。
序列表
<110> Ion Chat Research Corporation
Saito, Mitsuyoshi
<120> 电容型膜电位测量装置
<130> SJW9971013WO
<150> 2018-087689
<151> 2018-04-27
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ChRWR正义引物
<400> 1
cactataggg aagctaccat ggctcggaga ccctggct 38
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ChRWR反义引物
<400> 2
atagaatagg aagctctact tgcctgtccc tttgttga 38
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KIR2.1 1st正义引物
<400> 3
ccaaagcaga agcactggag 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KIR2.1 1st A/S
<400> 4
ctttgaaacc attgtgcttg cc 22
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KIR2.1 ICR HindIII正义
<400> 5
cactataggg aagctaccat gggcagtgtg cgaaccaac 39
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KIR2.1 ICR HindIII A/S
<400> 6
atagaatagg aagcttcata tctccgactc tcgccg 36

Claims (54)

1.一种电容型电位测量装置，所述电容型电位测量装置为能够记录目标细胞的细胞内电位或电位变化的电容型电位测量装置，其中，
所述电容型电位测量装置包含形成电容器的第1导电体和第2导电体，与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子的一端接触的第1导电体与电压放大器的正极连接，第2导电体与负极连接，形成电位记录电路，
（i）所述第1导电体是位于目标细胞下方的导电性板，所述导电性板与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触；或者
（ii）所述第1导电体是位于目标细胞上方的磁铁电极，所述磁铁电极与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触，所述磁铁电极除了与目标细胞接触的下面以外都被绝缘体覆盖。
2.如权利要求1所述的电容型电位测量装置，其中，形成电容器的第1导电体是位于目标细胞下方的导电性板，所述导电性板与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触；第2导电体是设置成与导电性板下面接触的导电板。
3.如权利要求2所述的电容型电位测量装置，其中，所述导电性板与电压放大器的正极连接，与导电性板下面接触的所述导电板与电压放大器的负电极连接，由导电性板和导电板形成电容型电位记录电路。
4.如权利要求1所述的电容型电位测量装置，其中，所述导电性板是导电性玻璃或钛板，所述导电性玻璃任选地在表面的至少一部分具有胶原涂布区域。
5.如权利要求2所述的电容型电位测量装置，其中，所述导电板是铝箔或铂板。
6.如权利要求2所述的电容型电位测量装置，其中，所述导电板的下方设置有磁铁。
7.如权利要求1所述的电容型电位测量装置，其中，形成电容器的第1导电体是位于目标细胞上方的磁铁电极，所述磁铁电极与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触，所述磁铁电极除了与目标细胞接触的下面以外都被绝缘体覆盖；第2导电体是在磁铁电极上面隔着所述绝缘体设置的磁性体或磁铁吸引性金属板。
8.如权利要求7所述的电容型电位测量装置，其中，所述磁铁电极与电压放大器的正极连接，在磁铁电极上面隔着绝缘体设置的所述磁性体或所述磁铁吸引性金属板与电压放大器的负电极连接，由磁铁电极和磁性体或磁铁吸引性金属板形成电容型电位记录电路。
9.如权利要求1所述的电容型电位测量装置，其中，所述磁铁电极是钕磁铁。
10.如权利要求1所述的电容型电位测量装置，其中，所述绝缘体是封口膜、硅或蜡。
11.如权利要求7所述的电容型电位测量装置，其中，所述磁性体与所述磁铁电极是相同或不同的材料；所述磁铁吸引性金属板是铁板。
12.如权利要求1所述的电容型电位测量装置，其中，设置在所述磁铁电极侧面周围的绝缘体未固定到基板，与磁铁电极下面接触的目标细胞不与细胞外液完全隔离。
13.如权利要求12所述的电容型电位测量装置，其中，与所述磁铁电极下面接触的目标细胞粘附在位于基板上方的多孔膜上，细胞外液能够从基板和多孔膜之间扩散流入。
14.如权利要求13所述的电容型电位测量装置，其中，目标细胞所粘附的所述多孔膜是插入式细胞培养器底面的多孔膜，细胞外液在所述目标细胞所粘附的插入式细胞培养器底面和基板之间回流。
15.如权利要求12~14中任一项所述的电容型电位测量装置，其中，在所述基板的下方设置有磁铁吸引性金属板。
16.如权利要求15所述的电容型电位测量装置，其中，所述贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子是预先吸附在磁铁电极表面的导电性纳米粒子被所述磁铁电极从目标细胞上方压在目标细胞表面上，并被设置在基板下方的磁铁吸引性金属板吸引而贯通细胞膜的导电性纳米粒子。
17.如权利要求16所述的电容型电位测量装置，其中，在预先吸附在磁铁电极表面时，使导电性纳米粒子在与转染试剂混合的状态下吸附在磁铁电极表面。
18.一种使用电容型电位测量装置测量目标细胞的细胞内电位或电位变化的方法，其特征在于，
所述电容型电位测量装置包含电压放大器和形成电容器的两个导电体，其中，两个导电体由与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子的一端接触的第1导电体和另外的第2导电体构成，
所述方法包括将第1导电体连接到电压放大器的正极并将第2导电体连接到负极以形成电位记录电路的工序以及记录形成电容器的两个导电体之间的电压变化的工序，
其中，
（i）所述第1导电体是位于目标细胞下方的导电性板，所述导电性板与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触；或者
（ii）所述第1导电体是位于目标细胞上方的磁铁电极，所述磁铁电极与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触，所述磁铁电极除了与目标细胞接触的下面以外都被绝缘体覆盖。
19.如权利要求18所述的方法，其中，形成电容器的第1导电体是位于目标细胞下方的导电性板，所述导电性板上面与贯通目标细胞下面的细胞膜的导电性纳米粒子的一端接触；第2导电体是设置成与导电性板下面接触的导电板。
20.如权利要求18所述的方法，其中，所述导电性板是导电性玻璃或钛板，所述导电性玻璃任选地在表面的至少一部分具有胶原涂布区域。
21.如权利要求19所述的方法，其中，所述导电板是铝箔或铂板。
22.如权利要求19所述的方法，其中，所述导电板的下方设置有磁铁。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述方法包括以下工序（1）～工序（4）：
（1）向粘附在导电性板上的目标细胞内导入导电性纳米粒子的工序；
（2）通过来自于导电板下方的磁铁的磁力将目标细胞内的导电性纳米粒子吸引至细胞粘附面侧，使导电性纳米粒子贯通细胞粘附面的至少一部分的细胞膜，使其暴露于细胞外的一端与所述导电性板接触的工序；
（3）将所述导电性板上面连接到电压放大器的正极并将所述导电板连接到电压放大器的负电极以形成电位记录电路的工序；
（4）记录形成电容器的两个导电体之间的电压变化的工序。
24.如权利要求18所述的方法，其中，形成电容器的第1导电体是位于目标细胞上方的磁铁电极，所述磁铁电极与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触，所述磁铁电极除了与目标细胞接触的下面以外都被绝缘体覆盖而不与细胞外液接触；第2导电体是在磁铁电极上面隔着所述绝缘体设置的磁性体或磁铁吸引性金属板。
25.如权利要求18所述的方法，其中，所述磁铁电极是钕磁铁。
26.如权利要求18所述的方法，其中，所述绝缘体是封口膜、硅或蜡。
27.如权利要求24所述的方法，其中，所述磁性体与所述磁铁电极是相同或不同的材料；所述磁铁吸引性金属板是铁板。
28.如权利要求18所述的方法，其中，覆盖所述磁铁电极的绝缘体的侧面部分未固定到基板，与磁铁电极下面接触的目标细胞不与细胞外液隔离。
29.如权利要求28所述的方法，其中，与所述磁铁电极下面接触的目标细胞粘附在位于基板上方的多孔膜上，所述方法包括使细胞外液从所述多孔膜下面扩散流入的工序。
30.如权利要求29所述的方法，其中，目标细胞所粘附的所述多孔膜是插入式细胞培养器底面的多孔膜，所述方法包括使细胞外液在所述多孔膜下面和基板之间回流的工序。
31.如权利要求28~30中任一项所述的方法，其中，在所述基板的下方设置有磁铁吸引性金属板。
32.如权利要求31所述的方法，其中，贯通细胞膜的导电性纳米粒子是预先吸附在磁铁电极表面的导电性纳米粒子被所述磁铁电极从目标细胞上方压在目标细胞表面上，并被设置在基板下方的磁铁吸引性金属板吸引而贯通细胞膜的导电性纳米粒子。
33.如权利要求32所述的方法，其中，在预先吸附在磁铁电极表面时，使导电性纳米粒子在与转染试剂混合的状态下吸附在磁铁电极表面。
34.如权利要求24所述的方法，其中，所述方法包括以下工序（1）～工序（5）：
（1）向粘附在基板上方的多孔膜上的目标细胞内导入导电性纳米粒子的工序；
（2）将磁铁电极粘附在目标细胞的上面的工序；
（3）通过在所述磁铁电极和基板下方的磁铁吸引性金属板之间产生的磁力将导电性纳米粒子吸引至与磁铁电极的粘附面侧并贯通细胞膜，使暴露于细胞外的一端与所述磁铁电极接触的工序；
（4）将所述磁铁电极连接到电压放大器的正极并将在磁铁电极上面隔着绝缘体设置的所述磁性体或磁铁吸引性金属板连接到电压放大器的负电极以形成电位记录电路的工序；
（5）记录形成电容器的两个导电体之间的电压变化的工序。
35.如权利要求24所述的方法，其中，所述方法包括以下工序（1）～工序（5）：
（1）将导电性纳米粒子吸附在磁铁电极未被绝缘体覆盖的表面的工序；
（2）将吸附有导电性纳米粒子的磁铁电极表面从目标细胞上方粘附并压在细胞表面的工序；
（3）通过在所述磁铁电极和基板下方的磁铁吸引性金属板之间产生的磁力将磁铁电极表面的导电性纳米粒子吸引至所述细胞的内侧方向，留下与磁铁电极接触的细胞外的一端而贯通细胞膜的工序；
（4）将所述磁铁电极连接到电压放大器的正极并将在磁铁电极上面隔着绝缘体设置的所述磁性体或磁铁吸引性金属板连接到电压放大器的负电极以形成电位记录电路的工序；
（5）记录形成电容器的两个导电体之间的电压变化的工序。
36.一种使用电容型电位测量装置筛选对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的筛选方法，其中，所述电容型电位测量装置包含电压放大器和形成电容器的两个导电体，所述筛选方法包括：
（1）在形成电容器的两个导电体中，将与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子的一端接触的第1导电体连接到电压放大器的正极并将第2导电体连接到负极以形成电位记录电路的工序，其中，
（i）所述第1导电体是位于目标细胞下方的导电性板，所述导电性板与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触；或者
（ii）所述第1导电体是位于目标细胞上方的磁铁电极，所述磁铁电极与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触，所述磁铁电极除了与目标细胞接触的下面以外都被绝缘体覆盖；
（2）测量两个电极之间的电压或电压变化的工序；
（3）对目标细胞给予受检物质样品的工序；
（4）对于在工序（3）中与受检物质样品接触的目标细胞，与工序（2）同样地测量两个电极之间的电压或电压变化的工序；
（5）将工序（4）中的测量结果与工序（2）中的测量结果进行比较，在两者的测量值有显著差异的情况下，评价受检物质样品是对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的工序。
37.如权利要求36所述的筛选方法，其中，工序（3）中的对目标细胞给予受检物质样品的工序是向细胞外液给予受检物质样品的工序。
38.如权利要求36或37所述的筛选方法，其中，工序（1）中的形成电容器的第1导电体是位于目标细胞下方的导电性板，所述导电性板上面与贯通目标细胞下面的细胞膜的导电性纳米粒子的一端接触；第2导电体是设置成与导电性板下面接触的导电板。
39.如权利要求36或37所述的筛选方法，其中，所述导电性板是导电性玻璃或钛板，所述导电性玻璃任选地在表面的至少一部分具有胶原涂布区域。
40.如权利要求38所述的筛选方法，其中，所述导电板是铝箔或铂板。
41.如权利要求38所述的筛选方法，其中，所述导电板的下方设置有磁铁。
42.如权利要求41所述的筛选方法，其中，所述筛选方法包括以下工序（1）～工序（6）：
（1）向粘附在导电性板上的目标细胞内导入导电性纳米粒子的工序；
（2）通过来自于导电板下方的磁铁的磁力将目标细胞内的导电性纳米粒子吸引至细胞粘附面侧，使导电性纳米粒子贯通细胞粘附面的至少一部分的细胞膜，使其暴露于细胞外的一端与所述导电性板接触的工序；
（3）将所述导电性板上面连接到电压放大器的正极并将所述导电板连接到电压放大器的负电极以形成电位记录电路，测量两个电极之间的电压或电压变化的工序；
（4）对目标细胞给予受检物质样品的工序；
（5）对于在工序（4）中与受检物质样品接触的目标细胞，与工序（3）同样地测量两个电极之间的电压或电压变化的工序；
（6）将工序（5）中的测量结果与工序（3）中的测量结果进行比较，在两者的测量值有显著差异的情况下，评价受检物质样品是对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的工序。
43.如权利要求36或37所述的筛选方法，其中，工序（1）中的形成电容器的第1导电体是位于目标细胞上方的磁铁电极，所述磁铁电极与贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子暴露于细胞外的一端在细胞外接触，所述磁铁电极除了与目标细胞接触的下面以外都被绝缘体覆盖而不与细胞外液接触；第2导电体是在磁铁电极上面隔着所述绝缘体设置的磁性体或磁铁吸引性金属板。
44.如权利要求36或37所述的筛选方法，其中，所述磁铁电极是钕磁铁。
45.如权利要求36或37所述的筛选方法，其中，所述绝缘体是封口膜、硅或蜡。
46.如权利要求43所述的筛选方法，其中，所述磁性体与所述磁铁电极是相同或不同的材料；所述磁铁吸引性金属板是铁板。
47.如权利要求43所述的筛选方法，其中，所述目标细胞粘附在基板上方的插入式细胞培养器底面的多孔膜上，
工序（1）包括使细胞外液在插入式细胞培养器底面的多孔膜和基板之间回流的工序；
工序（3）中的对目标细胞给予受检物质样品的工序是通过向回流的细胞外液中给予受检物质样品而经由多孔膜对目标细胞进行给予的工序。
48.如权利要求47所述的筛选方法，其中，在所述基板的下方设置有磁铁吸引性金属板。
49.如权利要求48所述的筛选方法，其中，所述贯通目标细胞的细胞膜的导电性纳米粒子是预先吸附在磁铁电极表面的导电性纳米粒子被所述磁铁电极从目标细胞上方压在目标细胞表面上，并被设置在基板下方的磁铁吸引性金属板吸引而贯通细胞膜的导电性纳米粒子。
50.如权利要求49所述的筛选方法，其中，在预先吸附在磁铁电极表面时，使导电性纳米粒子在与转染试剂混合的状态下吸附在磁铁电极表面。
51.如权利要求48所述的筛选方法，其中，所述筛选方法包括以下工序（1）～工序（7）：
（1）向粘附在插入式细胞培养器的多孔膜上的目标细胞内导入导电性纳米粒子的工序；
（2）将磁铁电极粘附在目标细胞的上面的工序；
（3）通过在所述磁铁电极和基板下方的磁铁吸引性金属板之间产生的磁力将导电性纳米粒子吸引至与磁铁电极的粘附面侧并贯通细胞膜，使暴露于细胞外的一端与所述磁铁电极接触的工序；
（4）将所述磁铁电极连接到电压放大器的正极并将在磁铁电极上面隔着绝缘体设置的所述磁性体或磁铁吸引性金属板连接到电压放大器的负电极以形成电位记录电路，测量两个电极之间的电压或电压变化的工序；
（5）经由具有透过性的插入式细胞培养器底面的多孔膜对目标细胞给予受检物质样品的工序；
（6）对于在工序（5）中与受检物质样品接触的目标细胞，与工序（4）同样地测量两个电极之间的电压或电压变化的工序；
（7）将工序（6）中的测量结果与工序（4）中的测量结果进行比较，在两者的测量值有显著差异的情况下，评价受检物质样品是对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的工序。
52.如权利要求48所述的筛选方法，其中，所述筛选方法包括以下工序（1）～工序（7）：
（1）将导电性纳米粒子吸附在磁铁电极未被绝缘体覆盖的表面的工序；
（2）将吸附有导电性纳米粒子的磁铁电极表面从目标细胞上方粘附并压在细胞表面的工序；
（3）通过在所述磁铁电极和基板下方的磁铁吸引性金属板之间产生的磁力将磁铁电极表面的导电性纳米粒子吸引至所述细胞的内侧方向，留下与磁铁电极接触的细胞外的一端而贯通细胞膜的工序；
（4）将所述磁铁电极连接到电压放大器的正极并将在磁铁电极上面隔着绝缘体设置的所述磁性体或磁铁吸引性金属板连接到电压放大器的负电极以形成电位记录电路，测量两个电极之间的电压或电压变化的工序；
（5）经由具有透过性的插入式细胞培养器底面的多孔膜对目标细胞给予受检物质样品的工序；
（6）对于在工序（5）中与受检物质样品接触的目标细胞，与工序（4）同样地测量两个电极之间的电压或电压变化的工序；
（7）将工序（6）中的测量结果与工序（4）中的测量结果进行比较，在两者的测量值有显著差异的情况下，评价受检物质样品是对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的工序。
53.如权利要求48所述的筛选方法，其中，所述筛选方法包括以下工序（1）～工序（6）：
（1）向粘附在基板上的目标细胞内导入导电性纳米粒子，使磁铁电极粘附在目标细胞上面的工序；
（2）通过在所述磁铁电极和基板下方的磁铁吸引性金属板之间产生的磁力将导电性纳米粒子吸引至与磁铁电极的粘附面侧并贯通细胞膜，使暴露于细胞外的一端与所述磁铁电极接触的工序；
（3）将所述磁铁电极连接到电压放大器的正极并将在磁铁电极上面隔着绝缘体设置的所述磁性体或磁铁吸引性金属板连接到电压放大器的负电极以形成电位记录电路，测量两个电极之间的电压或电压变化的工序；
（4）向细胞外液给予受检物质样品，使目标细胞与受检物质样品接触的工序；
（5）对于在工序（4）中与受检物质样品接触的目标细胞，与工序（3）同样地测量两个电极之间的电压或电压变化的工序；
（6）将工序（5）中的测量结果与工序（3）中的测量结果进行比较，在两者的测量值有显著差异的情况下，评价受检物质样品是对目标细胞具有毒性作用或活性作用的物质的工序。
54.如权利要求48所述的筛选方法，其中，所述筛选方法包括以下工序（1）～工序（7）：
（1）将导电性纳米粒子吸附在磁铁电极未被绝缘体覆盖的表面的工序；
（2）将吸附有导电性纳米粒子的磁铁电极表面从目标细胞上方粘附并压在细胞表面的工序；
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