JP6893645B6 - 細胞の膜電位/膜電流の測定方法 - Google Patents
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Description
従来から細胞の膜電位の変動、それに伴うイオンチャネルを通した膜電流の測定をすることで細胞の状態変化や細胞の薬物などへの応答を観察することが行われてきた。特に創薬スクリーニングの際に、培養した心筋細胞、神経細胞などに対して創薬候補薬物を暴露し、膜電位の変化を計測して心毒性、神経毒性などを評価することが広く行われている。
パッチクランプ法は細胞全体に発現するイオンチャネルの動態を測定するWhole cell modeと、パッチピペットの内径内の細胞膜にのみ含まれるイオンチャネルの動態(single channel活性)を測定する方法(on cell mode)、そしてその微小細胞膜を細胞から単離して測定を行う方法(inside patch, outside patch mode)がある。
Whole cell modeでは、ガラスピペットと接着した電極の内径にある細胞膜を突き破ることにより、細胞内電位変化、細胞全体でのイオンチャネルを通過する電流(イオンチャネルの活性)の動態を測定する。上記の手技は顕微鏡下で個々の細胞に直接電極を用いて行う記録法のため高度に熟練した技術、そして高い専門知識が必要である。
パッチクランプ方法にはマニュアル(手動式)パッチクランプ法とオートパッチ法があり、マニュアルパッチクランプ法は電気生理学的測定におけるデーターの信頼性が高い。しかしながら、術者が顕微鏡を用いて、マニピュレーターを操作して実験を行うなどの手技が複雑で豊富な専門知識を必要とすることから非常に効率が悪い。このことは、医学生物学研究、特に創薬分野では大きなハードルになっている。
一方、オートパッチ法はオートメーション化された電気生理学的測定機であり、近年著しく性能を向上させているものの、データーの信頼性においてマニュアルパッチクランプ法を置き換えるほどの信頼性は勝ち得ていない。その上、オートパッチクランプ試験機器は大変高価なため、その使用は一部の大製薬企業に限られている。
また、近年細胞内電位を測定するために電極を細胞膜に貫通させる方法として、パッチクランプ法に代えて細胞に高電圧をかけて電気的に穿孔する方法(非特許文献3)が開発され、ラットの心筋細胞の細胞内電位が記録できたことが報告されている。しかしながらその手法では、穿孔破壊された細胞膜が直ぐに修復されてしまうために、電極の細胞内へのアクセスがなくなってしまう。電気応答の観察可能な時間は最大でも10分程度であり、実用的な手法とはいえない。
in vitro 多点平面電極(MultiElectrode Array, MEA)システムの応用として、培養神経細胞の可塑性の研究や、ヒトiPS 細胞由来の神経細胞、心筋細胞を用いた薬物安全性試験などに使われ始めている。
MEAに基づく方法で細胞内記録を試みた報告として、きのこ様の形をした電極の上に細胞を播種し、そこに高電圧を与える事により、細胞膜を破ることに成功した例がある(非特許文献1)が、細胞内電位の記録条件を保てる時間は3分以内と極めて短く、記録方法としての有効性は示されていない。
本発明者らは、近年、金ナノ粒子が、免疫学的診断用キットのみならず、ヒト細胞を含めた哺乳動物細胞に対する核酸や各種薬剤などのデリバリー用のvehicleとして広く用いられていること、細胞への負荷の少ない細胞内導入法も開発が進んでいること(非特許文献2)に加え、金ナノ粒子の特性として細胞毒性が極めて低く電気伝導性であること着目し、細胞内に導入した金ナノ粒子をガラス微小電極の代わりに用いることを発想した。
本発明者らは、鋭意研究の結果、金コーティングされた磁性ナノ粒子を用い、導電性のガラスプレートを介して強い磁石で細胞内の金ナノ粒子を引きつけて細胞膜を貫通させ、細胞内と導電性ガラスとの接点となるように工夫した。具体的には、表面導電性のガラスプレート表面に接着させた培養動物細胞内に予めにポリエチレンイミンなどの薬剤と共に金コーティング磁性ナノ粒子を導入しておき、導電性ガラスプレートの真下のネオジウム磁石で金ナノ粒子を引きつけて細胞膜を貫通させて、細胞外の一端を導電性ガラスと接触させた後、導電性ガラスと細胞外電極(アース)との電位差をアンプにより増幅し、モニターで観察した。
このことは、磁場により細胞内の導電性ナノ粒子である金コーティング磁性ナノ粒子を引き寄せ、細胞膜を貫通させることで細胞へのダメージを極力抑えて細胞内外の電極同士を繋ぎ、細胞外に細胞内記録電極を構築できたことである。そして、このことは、細胞外の測定装置によって生存細胞における細胞内電位の変動を長時間に亘り観測できるようになったことを意味する。
また、金コーティングでなくても、細胞毒性が少なく導電性を有する材料、例えば、プラチナなどの導電性金属の他、導電性のペプチド、タンパク質、ポリマーなどでコーティングされたナノ粒子、又は従来から生体イメージングの染色に用いられていたQdot粒子を用いても同等の効果が得られることが期待できる。
以上の実験結果が得られたことで本発明を完成した。
さらに、導電性金属でコーティングをされたネオジウム磁石を細胞の上方向から接着させて細胞上方に磁場を発生させることによっても、細胞内の導電性ナノ粒子が細胞膜を貫通して磁石電極(MagEle)と共に細胞内記録電極を構築でき、細胞内電位が測定できることを確認した。
〔1〕 対象細胞の細胞膜を貫通している導電性ナノ粒子であって、
その一端は細胞内に露出しており、他の一端は細胞外に露出していることを特徴とする、導電性ナノ粒子。
〔2〕 細胞外に露出している一端が、導電性プレート電極又は磁石電極と接触していることを特徴とする、前記〔1〕に記載の導電性ナノ粒子。
〔3〕 導電性ナノ粒子が、導電性材料でコーティングされた磁性ナノ粒子であることを特徴とする、前記〔1〕又は〔2〕に記載の導電性ナノ粒子。
〔4〕 細胞膜の少なくとも一部領域において細胞膜を貫通する複数の導電性ナノ粒子を保持している細胞。
〔5〕 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を記録可能な細胞内記録電極であって、
対象細胞の細胞膜を貫通している導電性ナノ粒子、及び当該ナノ粒子の細胞外に露出した一端と細胞外で接触している導電性プレート電極又は磁石電極とを含む、細胞内記録電極。
〔6〕 細胞外に露出している導電性ナノ粒子の一端と接触している導電性プレート電極が、細胞接触面の反対側に設置された磁石を有していることを特徴とする、前記〔5〕に記載の細胞内記録電極。
〔7〕 導電性プレート電極が、表面の少なくとも一部にコラーゲンが塗布されている導電性ガラス電極であることを特徴とする、前記〔6〕に記載の細胞内記録電極。
なお、コラーゲン塗布膜は格子状に設けられることが好ましい。この手法はHEK細胞,培養心筋細胞など導電性ガラスに接着性が弱い細胞の場合に有効である。CHO細胞などの線維芽細胞は導電性ガラス上でも接着するので、上記の表面処理は必要ない。
〔8〕 細胞外に露出している導電性ナノ粒子の一端と接触している磁石電極が、導電性物質でコーティングされており、かつ前記導電性ナノ粒子との接触面以外の外液に接するすべての面がさらに絶縁体でコーティングされていることを特徴とする、前記〔5〕に記載の細胞内記録電極。
〔9〕 細胞膜を貫通する導電性ナノ粒子は、予め細胞内に導入された導電性ナノ粒子が、導電性プレート電極の細胞接着面の反対側に設置された磁石に由来する磁力、又は磁石電極の磁力により引き付けられて細胞膜を貫通し、細胞外に露出した一端が前記導電性プレート電極又は磁石電極と接触していることを特徴とする、前記〔5〕〜〔8〕のいずれかに記載の細胞内記録電極。
〔10〕 細胞膜を貫通する導電性ナノ粒子は、対象細胞の上方に固定された磁石電極と前記細胞との接着面において、磁石電極と接触する細胞外に露出する一端と、細胞内に露出する一端とを有しており、かつ、前記細胞と接着する容器底面の下方には磁石吸引性の金属板が設けられていることを特徴としている、前記〔5〕又は〔8〕に記載の細胞内記録電極。
〔11〕 細胞膜を貫通する導電性ナノ粒子は、磁石電極表面に吸着させた導電性ナノ粒子が、対象細胞の上方から当該磁石電極により細胞表面に押し付けられ、細胞の下方に設けた金属板により引き付けられて細胞膜を貫通したものである、前記〔10〕に記載の細胞内記録電極。
〔12〕 磁石電極表面に導電性ナノ粒子を吸着させる際に、導電性ナノ粒子をトランスフェクション試薬と混合した状態で用いることを特徴とする、前記〔11〕に記載の細胞内記録電極。
ここで、トランスフェクション試薬として代表的なものは、ポリエチレンイミン(PEI)であるが、他にSuperfect(Qiagen社)などを用いてもよい。
〔13〕 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定及び/又は制御するための装置であって、
前記〔5〕〜〔12〕のいずれかに記載の細胞内記録電極が測定器のプラス極に接続され、かつ細胞内電位記録容器の細胞外溶液内に配置されたアース電極が測定器のマイナス極に接続されて電位記録回路を形成している、装置。
〔14〕 対象細胞の細胞内電位を測定及び/又は制御するための装置であって、少なくとも
(a)生理食塩水を内包する容器、
(b)前記〔5〕〜〔12〕のいずれかに記載の細胞内記録電極、
(c)容器内の生理食塩水内に設けられた細胞外電極、
(d)電気信号測定及び/又は発生装置、及び
(e)電気信号増幅器
を備えていることを特徴とする、装置。
〔15〕 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定及び/又は制御する方法であって、
対象細胞内には予め導電性ナノ粒子を導入しておき、
細胞表面に接着させた磁石電極又は導電性プレート電極に接する磁石に由来する磁力により、細胞内の導電性ナノ粒子を細胞と前記電極との接着面側に引き寄せて細胞膜を貫通させ、その細胞外に露出している一端と前記電極とを接触させ、細胞内記録電極を形成する工程を含むことを特徴とする、方法。
〔16〕 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定及び/又は制御する方法であって、下記の工程(1)〜(5)を含むことを特徴とする、前記〔15〕に記載の方法;
(1)容器底面に接着している対象細胞内に導電性ナノ粒子を導入する工程、
(2)容器底面の少なくとも1部を形成する導電性プレート電極上に接着する対象細胞内の導電性ナノ粒子を、導電性プレート電極の細胞接着面の反対側に設けられた磁石に由来する磁力により引き寄せて細胞膜を貫通させ、その細胞外に露出している一端を導電性プレート電極に接触させる工程、
(3)細胞内に露出している一端を有する導電性ナノ粒子と、当該ナノ粒子の細胞外に露出している一端と接触する導電性プレート電極とにより、細胞内記録電極を形成する工程、
(4)細胞外電極を、容器内の生理食塩水中で細胞に接触しない位置に設ける工程、
(5)細胞内記録電極及び細胞外電極を、電気信号増幅器を介して電気信号測定器に接続し、両電極間の電流又は電圧を測定する工程。
〔17〕 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定及び/又は制御する方法であって、下記の工程(1)〜(6)を含むことを特徴とする、前記〔15〕に記載の方法;
(1)容器底面に接着している対象細胞内に導電性ナノ粒子を導入する工程、
(2)磁石電極を対象細胞の容器との接着表面以外の表面に接着させる工程、
(3)対象細胞内の導電性ナノ粒子を、磁石電極側に引き寄せて導電性ナノ粒子を貫通させ、その細胞外に露出している一端と磁石電極に接触させる工程、
(4)細胞内に露出している一端を有する導電性ナノ粒子と、当該ナノ粒子の細胞外に露出している一端と接触する磁石電極とにより、細胞内記録電極を形成する工程、
(5)細胞外電極を、容器内の生理食塩水中で細胞に接触しない位置に設ける工程、
(6)細胞内記録電極及び細胞外電極を、電気信号増幅器を介して電気信号測定器に接続し、両電極間の電流又は電圧を測定する工程。
〔18〕 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定及び/又は制御する方法であって、
予め導電性ナノ粒子を磁石電極表面に磁力により固定し、続いて磁石電極を対象細胞表面に押し付け、細胞の下方に設けた金属板に引き寄せて細胞膜を貫通させ、その一端を細胞質内に到達させた導電性ナノ粒子と、磁石電極とにより細胞内記録電極を形成する工程を含むことを特徴とする、方法。
ここで、細胞表面の導電性ナノ粒子は、単独で用いてもよいが、トランスフェクション試薬と混合した状態で磁石電極表面に固定する方が細胞膜を貫通させる効率が高い。
〔19〕 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定及び/又は制御する方法であって、下記の工程(1)〜(7)を含むことを特徴とする、方法;
(1)対象細胞を、磁石吸引性の金属板の上に設置された容器内で培養する工程、
(2)導電性ナノ粒子を磁石電極表面に吸着させる工程、
(3)磁石電極の導電性ナノ粒子を吸着させた面を、容器内の対象細胞の容器との接着表面以外の表面に直接接触させる工程、
(4)導電性ナノ粒子が、当該細胞が接着する容器底面下方の磁石吸引性の金属板に吸引されて細胞膜を貫通し、細胞内に露出する一端を形成させる工程、
(5)細胞内に露出した一端を有する導電性ナノ粒子と、当該ナノ粒子の細胞外に露出している一端と接触している磁石電極とにより、細胞内記録電極を形成する工程、
(6)細胞外電極を、容器内の生理食塩水中で細胞に接触しない位置に設ける工程、
(7)細胞内記録電極及び細胞外電極を、電気信号増幅器を介して電気信号測定器に接続し、両電極間の電流又は電圧を測定する工程。
ここで、工程(2)では、導電性ナノ粒子をトランスフェクション試薬と混合した状態で磁石電極表面に吸着させることで細胞膜貫通効率が高まる。その際のトランスフェクション試薬の代表的なものはポリエチレンイミン(PEI)であり、工程(4)での磁力による導電性ナノ粒子の細胞膜貫通を助けると考えられる。
〔20〕 細胞内記録電極と細胞外電極とを接続した電気信号増幅器を電気信号発生装置として作用させ、対象細胞に電流を流すか又は電圧をかけることで、対象細胞内の細胞内電位を制御する工程をさらに含むことを特徴とする、前記〔15〕〜〔19〕のいずれかに記載の方法。
〔21〕 対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、下記の(1)〜(6)を含むことを特徴とする、方法;
(1)容器底面に接着している対象細胞内に導電性ナノ粒子を導入する工程、
(2)細胞表面に接着させた磁石電極又は導電性プレート電極に接する磁石に由来する磁力により、細胞内の導電性ナノ粒子を電極との接着面側に引き寄せ細胞膜を貫通させ、磁石電極又は導電性プレート電極と接触させる工程、
(3)培養容器内の生理食塩水内の細胞と接触しない位置に細胞外電極を設け、工程(2)の細胞内記録電極との間の電流又は電圧を測定する工程、
(4)対象細胞に対し、被検物質試料を投与する工程、
(5)工程(4)で被検物質試料が投与された対象細胞について、工程(3)と同様に、両電極間の電流又は電圧を測定する工程、
(6)工程(5)での測定結果を、工程(3)での測定結果と比較して、両者の測定値に有意な差異がある場合に、被検物質試料が対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質であると評価する工程。
〔22〕 対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、下記の(1)〜(9)を含むことを特徴とする、方法;
(1)対象細胞を、磁石吸引性の金属板の上に設置された容器内で培養する工程、
(2)導電性ナノ粒子を磁石電極表面に吸着させる工程、
(3)磁石電極の導電性ナノ粒子を吸着させた面を、容器内の対象細胞の上方表面に直接接触させる工程、
(4)導電性ナノ粒子が、当該細胞が接着する容器底面下方の磁石吸引性の金属板に吸引されて細胞膜を貫通し、細胞内に露出する一端を形成させる工程、
(5)細胞内に露出した一端を有する導電性ナノ粒子と、当該ナノ粒子の細胞外に露出している一端と接触している磁石電極とにより、細胞内記録電極を形成する工程、
(6)培養容器内の生理食塩水内の細胞と接触しない位置に細胞外電極を設け、工程(5)の細胞内記録電極との間の電流又は電圧を測定する工程、
(7)対象細胞に対し、被検物質試料を投与する工程、
(8)工程(7)で被検物質試料が投与された対象細胞について、工程(6)と同様に、両電極間の電流又は電圧を測定する工程、
(9)工程(8)での測定結果を、工程(6)での測定結果と比較して、両者の測定値に有意な差異がある場合に、被検物質試料が対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質であると評価する工程。
ここで、工程(2)では導電性ナノ粒子は単独でもよいが、トランスフェクション試薬(典型的にはポリエチレンイミン(PEI))と混合した状態で用いることで、工程(4)での磁力による導電性ナノ粒子の細胞膜貫通が助けられる。
また、本発明によれば、個々の細胞における細胞内電位も、細胞シートなど細胞の集合体における細胞内電位も測定可能である。
例えば各種イオンチャネル、薬剤トランスポーターなどを発現する形質転換細胞又は細胞群に適用することで、各種薬剤添加による細胞内電位の変動を観測し、薬効又は細胞毒性のスクリーニング用のツールとすることができる。
(1−1)本発明の基本原理
本発明の基本原理は、細胞内に予め導入した導電性ナノ粒子が細胞外の磁場に引き付けられて細胞膜を貫通することで、導電性ナノ粒子が細胞膜をはさんで、一方は細胞内にそして、その他の一方が細胞外に露出することにより、細胞内電極として働き、細胞内電位(又は膜電流)を細胞外で測定、記録可能とすることにある。その際、導電性ナノ粒子と共に細胞内記録電極を構成し、導電性ナノ粒子の細胞外露出部分を増幅器につなげるコネクターとしての機能を果たす導電性物質が必要である。そのような導電性物質による電極の1つは、細胞を播種する細胞電位測定容器(通常、細胞培養容器を兼ねる。)の底面の少なくとも一部が導電性を有するプレートであって、細胞接着面と反対側に磁石が設置されている「導電性プレート電極」であり、他の1つは、導電性コーティングをされた「磁石電極」(典型的にはネオジウム磁石)である。いずれの場合も、細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子と接することで、細胞内記録電極の一部として働き、細胞内電位記録を可能にする。細胞電位測定容器内のイオン性物質含有溶液(通常は、生理食塩水)内に設けた細胞外電極(アース電極)と共に、それぞれ電気信号増幅器を介して電気信号測定器に接続し、電位記録回路を形成し、細胞内の活動電位を測定、記録する。そして、必要に応じて細胞外電極に外部からの電気信号により、細胞内電位を制御、調節する。
なお、磁石電極を用いる場合は、導電性ナノ粒子を予め細胞内に導入しなくても、磁石電極に吸着させた導電性ナノ粒子を細胞表面に押し付け、細胞の反対側から磁石吸引性金属板で吸引することによっても細胞膜を貫通させることができ、より細胞非侵襲的に細胞内電位記録電極を形成できる。
以下、まず細胞内記録電極(導電性ナノ粒子のアダプター)の一部として導電性プレート電極を用いる場合についての一般的方法を説明し、次いで磁石電極(導電性ナノ粒子のアダプター)を用いる場合について説明する。
ここでは、細胞集団(細胞シート)に適用する場合の一態様について述べるが、本発明の方法はこれには限られない。
(工程1)少なくとも表面が導電性を有する培養ディッシュ又はプレート(以下、単に導電性プレートという。)へ被検細胞を播種し、導電性プレート表面を細胞が密に接着して覆い尽くすまで培養するか、又は組織切片を導電性プレート表面に密着させる。
なお、「導電性プレート」は、培養容器の底面全部を構成する必要はなく、底面の一部領域を構成していればよい。例えば、導電性材料を用いて培養ディッシュのガラス表面において、細胞接着面のみ導電コーティングすることで形成することもできる。導電性プレート領域を形成するための導電性材料としては、FTO(フッ素ドープ酸化スズ)などが好ましく用いられるが、同等の条件を満たしていればこれに限るものでない。
測定に際しては、被検細胞に覆われた導電性プレートが十分な量の生理食塩水により満たされており、かつ導電性表面が細胞外液に露出していないことを確認する。
ここで、細胞を播種する導電性プレートとして、透明性基板、例えば導電性ガラスを用いると、顕微鏡により細胞の播種状態が簡便かつ正確に確認できるため好ましい。本明細書中の実施例では、導電性ガラス(ケニス株式会社製)を使用したが、これには限られない。
また、導電性プレートとしては、骨芽細胞の培養などに用いられているチタンプレート(Rosa and Beloti (2003) Effect of cpTi Surface Roughness on Human Bone Marrow Cell Attachment, Proliferation, and Differentiation. Braz Dent J 14(1): 16-21)なども好ましい。チタンプレートは細胞毒性がほとんどなく、光が透過しない欠点はあるが、導電性ガラスよりも導電性に優れ、導電性ガラス(20〜40オームの電気抵抗がある)のような直列抵抗による誤差が発生しないため、特に正確な測定値が求められる場合は、チタンプレート、又は毒性のない導電金属が好ましい。
ここで、本発明で用いられる典型的な導電性材料は、金又はプラチナなど導電性金属であるが、下記2.で述べるようにコーティング可能な導電性材料であれば代替可能である。
(1−2)に示した導電性プレートを用いる場合の本発明方法を、本発明における典型的な導電性ナノ粒子である金コーティング磁性ナノ粒子を単一細胞に適用した場合を概念図(図1、図2)で説明すると下記の手順となる。
(1)金コーティング磁性ナノ粒子を細胞内に導入する(図1A−C)。
(2)細胞の接着している導電性ガラスの反対側に設置された磁石により、金コーティング磁性ナノ粒子を導電性ガラス面に引き寄せる(図1D)。
(3)磁石でガラス面に引き寄せられた金コーティング磁性ナノ粒子が、細胞のガラス接着部分の細胞膜を貫通する。
(4)細胞膜を貫通した金コーティング磁性ナノ粒子により細胞内と電極がつながり、磁性ナノ粒子の回りの金コーティングを通して細胞内の電位、電流の測定が可能となる。
(5)(図2)に示すように配置された記録電極、アース、増幅アンプにより、細胞内電位を測定する。
実際の実験で培養細胞などに応用する場合、通常、細胞は複数個存在する。その際、細胞間の結合が密でないと電極となるガラス面とアースが直接細胞外液(イオン化したイオンが存在する)を通して繋がってしまうため、金コーティング磁性ナノ粒子によって確立された細胞内電位と細胞外溶液が短絡されてしまうので、金コーティング磁性ナノ粒子を通した記録は不可能になる。そのためには、導電性プレート(電極)全面に隙間無く細胞を敷き詰める必要がある。電極の面積は、できる限り狭めることが好ましい(図3)。培養ディッシュ表面に導電性材料をパターン状に描いて導電性プレート領域を形成する場合は、導電性プレート領域は、少なくとも細胞との接着面内に収まるように形成されている。
導電性材料(例えばニッケル、アルミニウムなどの導電性金属)でコーティングされた磁石は、磁力と共に導電性も有するため「磁石電極(MagEle)」として用いることができ、典型的なものはネオジウム磁石である。
ネオジウム磁石は、永久磁石のうち最も磁力の高い磁石であるが、錆やすいため、通常ニッケルめっきが施されている。市販の直径1mm円柱ネオジウム磁石(ネオマグ株式会社)もNi-Cu-Niでコーティングされているため、強力な磁力と共に高い導電性を持っており、磁石電極(MagEle)として用いることができる。他に、アルミニウムコーティングされている場合も磁石電極(MagEle)として用いることができる。また、磁石本体も、引力に対抗して細胞内の導電性ナノ粒子を上方に引き付けることができる程度の磁場を発生できる磁石であればよく、ネオジウム磁石には限られないが、以下、典型的なネオジウム磁石を用いた例で説明する。なお、細胞内に導入したナノ粒子を細胞に接触した磁石電極に引き付けるという条件を満たせば、磁石を細胞の上に乗せても、細胞を磁石の上に乗せてもよい。
ここで、ネオジウム磁石表面のうち細胞との接触部分以外は細胞外溶液から完全に遮断される必要があるため、細胞との接触部分以外は、あらかじめシリコンゴム、シリコンチューブなどによる絶縁コートを施しておく。
このように、ネオジウム磁石を磁石電極(MagEle)として使用する方法は、細胞を導電ガラス上に載置する必要はなく、通常の培養ディッシュをそのまま使用できる。そのため、培養ディッシュで培養した細胞をそのまま使用して、ナノ磁石粒子を導入した後、直接細胞内電位の変化を記録できる利点がある。
また、培養細胞又は培養細胞群は、その上方に配置した磁石電極(MagEle)との十分な接触面積が確保できれば他の部分に細胞が存在する必要はないため、前記した導電性プレート電極を用いる方法とは異なり、ディッシュ底面全体が細胞群で覆われる必要はない。
本発明で「導電性ナノ粒子」というとき、導電性と共に磁性を併せ持つナノサイズ(25〜100nm)の微粒子である。一般には「導電性材料でコーティングされたナノ磁性粒子」を指す。
本発明で用いる導電性ナノ粒子は、表面を導電性で、かつ細胞毒性がほとんど無い材質によりコーティングされている磁性ナノ粒子を用いることが一般的である。
その際のコーティングに適した材質としては、例えば、金、プラチナなどの導電性金属(Yamada et al.(2015) WIREs Nanomed Nanobiotechnol 2015, 7:428-445. doi: 10.1002/wnan.1322)の他、導電性のペプチドやタンパク質、又は各種導電性ポリマーなどが挙げられるが、これらには限られない。本明細書の実施例ではクエン酸又はPEG金コーティング磁性ナノ粒子(nanoimmunotech社製、NITmagold Cit又は PEG50nm)を使用しており、本発明を説明する際にも、主として典型的な金コーティングナノ粒子について述べるが、これに限る意味ではない。
具体的には、導電性ポリマー、ペプチド類としては、「poly(anthranilic acid) with magnetite nanoparticles magnetic properties, and AC and DC conductivity)」として、「Ramesan and Jayakrishnan (2017)Polymer/magnetite nanocomposites with electrical and magnetic conductivity. Plastic Research On line 10.2417/spepro.006898」に列記された導電性のポリマー類、ペプチド類を用いることができる。また、従来から生体イメージングの染色に用いられていたQuantum dot(Qdot)粒子(O.O. Otelaja, D.-H. Ha, T. Ly, H. Zhang, and R.D. Robinson, “Highly Conductive Cu2-xS Nanoparticle Films through Room Temperature Processing, and an Order of Magnitude Enhancement of Conductivity via Electrophoretic Deposition,” ACS Applied Materials and Interfaces 6, 18911-18920 (2014).)なども導電性ナノ粒子として用いることができる。
なお、本発明の導電性ナノ粒子は、細胞膜を貫通して電極として働く機能を有していればよく、その形状は球形には限られず、線状など他の形状であってもよい。その場合、粒子の最大長が25〜100nm、好ましくは30〜80nm、より好ましくは35〜70nm、さらに好ましくは40〜60nmの数値範囲であることが好ましい。
本発明の導電性ナノ粒子の細胞内への導入方法としては、既知の細胞内へのナノ粒子導入方法は、レビュー文献である「Levy et al. (2010) Gold nanoparticles delivery in mammalian live cells: a critical review. Nano Reviews , 1: 4889 - DOI: 10.3402/nano.v1i0.4889)」に示されるいずれの方法でも良いが、導入対象となる細胞へのダメージができるだけ少ない方法が好ましい。本明細書の実施例1などではトランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン溶液(P3143 Sigma-Aldrich Mn 〜60,000)、及び細胞膜へのポア形成性タンパク質毒素としてストレプトリジンOを用いて行っているが、当該方法には限られない。
具体的には、例えば以下の方法を用いることができる。
標的細胞の膜に穴(Membrane pore)を形成する病原因子としてのタンパク質毒素は古くから知られており、これらタンパク質毒素に対し、標的細胞への毒性を制御しながら、可逆的な穴を開け、非選択的なイオンチャネル(ポア)のように働かせる技術も開発されている(Walev et al.,PNAS 98:(6) 3185-3190(2001);T.Tomita.,Bio.Soci.Japan General Incorporated Association, Vol.34, No.6 (1994) p.6-11など)。
そのような毒素としては、A型溶血性連鎖球菌のストレプトリジンO(Streptolysin O)やリポソームに結合させたブドウ球菌のα毒素などが好ましく用いられ、本発明の実施例ではStreptolysin Oを用いた例を示すが、これらには限られない。
トランスフェクション試薬としては、ポリエチレンイミン(polyethylineimine)の他、Superfect(Qiagen社)を用いることができる。Superfectもpolyethylineimineと同様に dendrimerで ポアを作る事が知られている。分子量の大きいポリエチレンイミンは大きなポアを形成するため、ポリエチレンイミンの方が有効である。
なお、トランスフェクション試薬は、予め細胞内に導電性ナノ粒子を導入する際の典型的な試薬として用いられるが、下記(5)の導電性ナノ粒子を細胞外から細胞膜に貫通させる方法においても有効に働く。
この方法の難点は導電性ナノ粒子が標的細胞内に取り込まれた後に、エンドゾームの膜から細胞質に移動するステップが必要になる。
そのためには、例えば導電性ナノ粒子に、TAT、TAT-HAなどのCell penetrating peptide (CPP)を導電性ナノ粒子に付加する事によりエンドゾーム膜から細胞質に移行させるなどの工夫をすることが好ましい。
この方法には、導電性ナノ粒子を細胞内に導入してから、標的細胞を播種する方法と、標的細胞を播種後に導電性ナノ粒子を挿入する方法、の2種類がある。
いずれの方法を用いてもよいが、前者の場合は市販の機器(HeliosR Gene Gun System、Bio-Rad)を使用できるメリットがあるため、特に大量の細胞及び導電性ナノ粒子を対象とする場合に適している。
この方法は、磁石電極に直接磁気で固定されている導電性ナノ粒子を細胞に押し付けて、反対側に設置された金属板の吸引力で細胞膜に挿入、貫通させる方法:
具体的には、導電ナノ粒子を、まず磁石電極表面に磁力により固定する。この際、導電ナノ粒子をPEI (Polyethyleneimine)に代表されるトランスフェクション試薬と混合した物を使用してもよい。続いて磁石電極を標的細胞表面に押し付け、細胞の下方に設けた金属板との間に発生した磁力により磁石電極を自立固定する。磁石電極が細く磁力が弱い場合は下方の金属板との磁力に依存せずともマニピュレーターなどにより固定してもよい。磁石電極により細胞に接着固定されたナノ粒子が細胞膜を貫通することにより、一端が細胞質内に到達した導電性ナノ粒子と磁石電極とにより細胞内記録電極を形成する。その際、PEIなどトランスフェクション試薬と混合した状態で用いることで、より導入効率が高まる。本方法は、導電性ナノ粒子を細胞質の内部に導入する必要がないため、極めて非侵襲的な手法である。
以下、PEIを用いた場合について具体的に説明するが、他のトランスフェクション試薬を用いてもよい。
ここで、絶縁体としては、パラフィルム、シリコン、ワックスなどを用いることができ、磁石電極のナノ粒子と接触させる部分以外の細胞外液に接触するすべての部分が覆われることが望ましい。シリコンの場合、磁石とぴったりサイズのあうシリコンチューブを用いることもできる。
約30分後に磁石電極の導電性ナノ粒子を吸着させた面を下に向け、培養容器内の細胞の上方から近づけ、細胞に直接接触させる。ここで、培養容器は鉄板など磁石が引き付けられる材料上に配置しておく。磁石電極はこの鉄板に吸引されることにより細胞の上に固定され、導電性ナノ粒子は、PEIを介して細胞膜を貫通するが、一方を磁石で固定されているため、細胞膜内にとどまり、細胞内記録を可能にする。すなわち、事前にナノ粒子を細胞に導入しなくても細胞内記録を行うことは可能である。ただし、この方法では磁石が弱すぎると磁石電極を他にマニピュレーターなどで保持することが必要となるため、細胞の種類、培養条件により、磁石の強さ、大きさなどの適正化が必要である。
(4−1)細胞内電位測定用容器
本発明では、対象細胞の播種、培養に用いられる培養容器として、磁石電極を用いる場合であれば、汎用の培養ディッシュ、培養プレートなどをそのまま用いることができる。また、導電性プレート電極を用いる場合も、培養容器底面の少なくとも一部に導電性プレート領域を設けた状態で、直接培養できるから、培養容器として用いることができる。したがって、いずれの場合も、対象細胞の播種、培養に用いた培養容器をそのまま細胞内電位測定用容器として用いることができる。そして、必要に応じ、培養に用いた容器から、より測定しやすい別の細胞内電位測定用容器に移植することも可能である。
導電性プレート電極を用いる場合に、記録に使用されるディッシュ面の約80%を覆う細胞を播種し、細胞が増殖し、一面を覆った状態を形成させた後、培養液を生理食塩水で複数回洗浄して生理食塩水に置換し、培養容器内で対象細胞に導電性ナノ粒子を導入する。PEI, SLOによるナノ粒子導入による細胞への影響の回復後、磁場により細胞内の導電性ナノ粒子を磁石電極又は導電性プレート電極側に引き寄せて細胞膜を貫通させることで、細胞内電位又は電位変化を測定、記録することができる。
ここで、細胞分裂をする細胞の場合は、導入したナノ粒子数が分裂に伴い細胞あたりのナノ粒子数が減少することになるので、導入後(SLOなどによるナノ粒子導入による細胞膜へのダメージ回復後)は速やかに磁場をかけることが好ましい。しかし、ナノ粒子の導入方法(細胞が導電ガラスに接着した後に細胞上部より導入する方法、細胞播種前に浮遊細胞の状態で導入する方法)により、磁場を作用させるタイミングは使用する細胞種により適宜調整する必要がある。磁石電極の場合はシート状に底面を覆う必要はないので、より好ましい。なお、実験の目的により生理食塩水に代えて、浸透圧、pHが保たれていれば、イオン組成の異なる緩衝液を用いることができる。
本発明においては、細胞内の自発的な電位、電流や、誘発された電位、電流を、細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子を介して細胞内電位を反映する導電性プレート電極又は磁石電極が、細胞外液内に設けられたアース電極との間に流れる電流を感知して細胞外で記録する。その際に生じる電流、電位は極めて微弱なため、細胞外で細胞内電位の記録を行うためには、電流、電圧などの増幅器(増幅アンプ)を備えた機器が必須となる。
そのような機器として、細胞又は細胞群の細胞内電位もしくは細胞外電位を測定するために従来から用いられていた機器は、いずれも用いることができる。
具体的には、パッチクランプ増幅器細胞内記録用増幅器であれば、入力抵抗が最低106〜108オーム以上ある増幅器を用いることができる。例えば、パッチクランプアンプ(Axopatch 200A, Axon instruments)などを用いることができる。
また、MEAシステムであれば、交流信号ではなく、直流信号が測定できる機器であれば使用することができる。
膜電流(細胞膜に存在するイオンチャネルを流れる電流)を測定するためにはパッチクランプアンプを用いるが、複数の人工脂質二重膜を用いる実験ではトータルの膜容量が大きくなるため(4−2)の場合と異なり、Axopatch-1D Patch-clamp amplifier(Axon Instruments)を用いる。そして、細胞膜電位を記録した場合のCurrent clamp modeではなく、Voltage clamp modeを使用する。
今まで使用してきたAxopatch 200A(Voltage clamp)は通常の単一細胞の膜電位を制御する実験の場合に特に適している。多数の細胞に用いる場合は、合計の細胞膜-脂質二重膜の面積が大きいため、大量の膜電位を制御する必要があるので、人工脂質二重膜実験測定用のCV-4 Head stageが使用できるAxopatch-1Dを用いた。人工脂質二重膜実験測定用のHead stageは大きな電流を流すことができるため、多数の細胞の脂質二重膜をすばやくチャージできるという利点がある。なおAxopatch-1D Patch-clamp amplifierに代えてBilayer Clamp Amplifier (BC-535) (Warner Instruments)などを使用してもよい。
(5−1)対象となる細胞、細胞集団(細胞群)
本発明の測定対象となる細胞としては、生検で採取された細胞などの生体由来の細胞でも、培養された細胞でも良い。主としてヒトなどの哺乳動物細胞を対象とするが、鳥類、魚類、昆虫細胞の他、酵母などの真核微生物や大腸菌などの原核微生物であってもよい。
特に、ヒトiPS細胞などヒト幹細胞から分化誘導された心筋細胞、神経細胞、血管上皮細胞、肝臓細胞など、またはその細胞集団が好ましい。
また、形質転換宿主として一般的なHEK, CHO細胞など哺乳動物細胞に、各種イオンチャネル遺伝子や各種トランスポーター遺伝子などを導入した形質転換培養細胞も、各種イオンチャネルやトランスポーターから取り込まれる薬剤の毒性試験における評価系として用いることができるため、本発明における好ましい対象細胞である。
本発明において「細胞集団」というとき、接着培養用の培養ディッシュ(プレート、ウエル)表面に形成されるシート状細胞の場合と共に、iPS細胞など幹細胞に由来する心筋細胞、神経細胞などにより形成される細胞塊の場合も含む。
また、本発明の対象細胞としては、近年モデル細胞として広く用いられるようになった巨大リポソームを含む人工細胞(Moscho et al. (1996) P.N.A.S. 93: 11443-11447;Schlesinger Saito (2006), Cell Death and Differentiation 13, 1403 - 1408;Aimon et al. (2011) PLoS ONE 6(10): e25529. doi: 10.1371/journal.pone.0025529など)も含める。
例えば、イオンチャネルを発現させた細胞から分離したイオンチャネルを含む細胞膜片を巨大リポソームと融合させる方法や、大腸菌などで発現させた組換えイオンチャネルタンパクを取り込ませた小さなリポソームと巨大リポソームとを融合させる方法などにより調製した人工細胞を用いることができる。
心筋細胞モデルとしては、ヒトiPS細胞などの幹細胞から分化誘導された心筋細胞、又はSCN5A(Nav1.5), CACNα1C(Cav1.2), KCNH2(hERG), KCNQ1/KCNE1 (LQT1), KCNJ2(Kir2.1)遺伝子などを培養動物細胞(HEK293、BHK、又はCHO細胞)に導入し、細胞膜に上記イオンチャネルを発現させた細胞などを用いることが好ましい。そのような細胞として、例えば、WO2014/192312に記載の心筋モデル細胞を用いることができる。
また、形質転換細胞に代えて、iPS細胞などの幹細胞から分化誘導された培養心筋細胞試料を用いることもできる(WO2014/098182)。心筋様のiPS細胞(iCell Cardiomyocyte)はCDI社などにより市販もされている。
生体由来の組織切片試料を用いることもでき、その際、組織切片としては、哺乳動物細胞由来の心房又は心室を形成する心筋切片を用い、心房細動、不整脈を引き起こす原因の究明を行う。病変組織から生検で摘出した組織片などを用いることができる。
磁石電極(MagEle)を用いる場合は、通常の培養用ディッシュで培養でき、底面全体を細胞で覆う必要もないため、導電性ナノ粒子導入後に安定的に増殖していることが確認できれば十分であるが、細胞が接触する培養容器底面の全てが導電性プレート(導電性ガラス)で形成され、当該導電性ガラスを電極とし、細胞外液にアースを配置し、測定回路を形成する場合は、細胞が導電性ガラス表面を覆うように播種する必要がある。
後者の場合、播種細胞数を単に多くすると細胞同士が密になりすぎ、細胞が十分に導電性ガラスに接着するスペースを確保出来ない。逆に細胞播種密度が低いと細胞同士が丁度よく接触し、シートを作るのに時間がかかりそれをコントロールすることが難しい。
例えば、HEK細胞など動物細胞の場合、0.1〜2.0×105個/cm2、好ましくは、0.5〜1.2×105個/cm2を導電性ガラスに対して播種する。
培養細胞の播種状態が実験の成功に大きく関与するので、細胞と接触する導電性ガラス(電極)面は、できる限り小さくする。例えば0.001〜10mm2、好ましくは0.001〜1mm2 (円形であれば、直径2mm以下、好ましくは、0.01〜1.0mm2)を電極面として使用する。
導電性ガラスの細胞と接触する面を狭くするために、導電性ガラス表面にコラーゲンを格子状に設けてもよい。特に、HEK細胞,培養心筋細胞など導電性ガラスに接着性が弱い細胞の場合に有効である。CHO細胞などの線維芽細胞は導電性ガラス上でも接着するので、上記の表面処理は必要ない。これら線維芽細胞は培養すると平らに大きく広がり、接着面が大きいためと考えられる。
多電極アレイに使われるプローブのように複数の電極を使用した場合、電極が多数存在するので、培養細胞により隙間無く覆われる電極の確率が高くなる事が予想される。そのため、MEA(マルチチャネル記録アンプ)を記録装置として使用した場合、全ての電極が細胞に覆われなくても一部の電極が完全に細胞に覆われる可能性が高くなるので、実験の成功率、再現性が向上すると考えられる。
なお、細胞内記録電極に磁石電極を用いる場合は、上述のように培養容器底面に導電性プレート領域は不要であり、播種される細胞数にも制限はないが、細胞群を用いて生物電位を測定する場合は、同様に0.1〜2.0×105個/cm2、好ましくは、0.5〜1.2×105個/cm2播種することが好ましい。磁石電極の対象細胞への接着面以外の領域が絶縁され、細胞外溶液と直接接触しなければ、単独細胞における細胞内電位を測定することも可能である。
(6−1)本発明により提供される細胞
本発明においては、細胞膜の少なくとも一部において細胞膜を貫通する複数の導電性ナノ粒子を保持する細胞を、単一細胞として、又は細胞群として提供する。
導電性ナノ粒子としては、金、プラチナなど導電性金属でコーティングされた磁性ナノ粒子が好ましく、典型的には、金コーティング磁性ナノ粒子(nanoimmunotech社製、NITmagold Cit又は PEG50nm)が用いられる。
本発明で提供される細胞は、測定可能な細胞内活動電位を発生する細胞であって、細胞膜の一部において細胞膜を貫通する複数の導電性ナノ粒子を保持し、当該ナノ粒子を介して磁石電極又は磁石上面に位置する導電プレート電極と接触して細胞内電極を形成した状態の細胞として提供することもできる。
測定可能な細胞内活動電位を発生する細胞としては、典型的には既知の心筋細胞モデル細胞又は神経細胞モデル細胞となる細胞である。心筋細胞モデル細胞としては、Nav1.5/Kir2.1など心筋細胞で働く各種イオンチャネルを安定発現するHEK細胞、CHO細胞など哺乳動物細胞の他、iPS細胞など幹細胞に由来する心筋様細胞、例えば市販のiCell Cardiomyocyte(CDI社)を含む市販のCardiomyocyteなどが応用できる。
本発明において提供される、細胞膜の少なくとも一部において細胞膜を貫通する導電性ナノ粒子を保持する細胞は、通常の培養容器内ではもちろんのこと、導電性プレートを底面の少なくとも一部に有する培養容器内であっても少なくとも一回は継代可能であるため、当該細胞を導電性プレート電極又は磁石電極などと組み合わせたキットとしても、流通可能である。ここでいう細胞としては、既に遺伝子導入により確立された細胞株、又は培養心筋様細胞株、神経様細胞株などのPrimary cellに対してナノ粒子を導入した細胞のいずれをも含む。
具体的には、本発明の細胞又は細胞群を、細胞表面の一部に接する磁石電極又は磁石上面に接して設けられた導電性プレート電極との接着面の少なくとも一部の領域で細胞膜を貫通した複数の導電性ナノ粒子と接触している細胞内記録電極と、必要に応じ細胞外溶液中に設置可能なアース電極と組み合わせたキットとすることができる。
さらに、本発明の細胞又は細胞群を、細胞内記録電極、アース電極、及び細胞が生理食塩水溶液内に埋没できる水深が確保できる細胞内電位測定用容器(培養容器)を組み合わせたキット、さらに電圧増幅器、電位又は電圧測定器も組み合わせることができる。
本発明は、創薬スクリーニングに特に有用である。
本発明の細胞内電位測定法は、細胞の活動電位、及び静止膜電位の測定を、従来のパッチクランプ法又はオートパッチ法に代替して記録することができる。
創薬スクリーニングに際しては、前述のモデル心筋細胞や、モデル神経細胞を用いることで、被検物質の細胞機能への影響、電気刺激による収縮活性、電気生理学的特性変化の解析などを迅速かつ正確に行うことができるため、速やかに被検物質の細胞毒性や、薬効を評価し、被検物質の評価に有効である。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
本実施例では、細胞外記録を行う機器として通常のパッチクランプアンプ(Axopatch 200A, Axon instruments)を用い、本発明の細胞内電位記録方法により、光受容体チャネル(Channelrhodopsin:ChRWR)を発現するCHO細胞における細胞内電位の測定を行う。
光受容体チャネル(ChRWR)は、7回膜貫通型のロドプシン様構造を有するとされ、480nm青色光刺激に対して上向きに応答する(脱分極)ことが知られている。
Wangらの八尾教授のグループは、ChR1とChR2からキメラ遺伝子のChannelrhodopsin (ChR)-wide receiver (ChRWR)を構築し、当該ChRWR遺伝子を用いてPC12培養細胞及び大脳皮質神経細胞の細胞膜でChR2(チャネルオプシン2)を高発現させ、パッチクランプ法による光刺激による細胞内電位の応答を計測して、神経細胞に光感受性を付与できることを報告している(Wang et al., 2009, J. of Biol. Chem. 284(9): 5685-5696.、特開2006−217866号公報)。
本実施例では、八尾教授より分与されたChRWR遺伝子(1073bp)を用い、下記プライマーによりPhusion DNA polymeraseを用いてPCRで増幅した。
sense primer: CACTATAGGGAAGCTaccatggctcggagaccctggct(配列番号1)
antisense primer: ATAGAATAGGAAGCTCTActtgcctgtccctttgttga(配列番号2)
得られたPCR産物を、InFusion HD Cloning kit (TakaraBio)を用いてpD603(puromycin、DNA2.0)ベクターへ導入しhChRWR発現ベクターを構築した。このhChRWR発現ベクターをCHO細胞(JCRB細胞バンク)に導入し(Superfect, Qiagen)、hChRWR遺伝子を安定発現するCHO細胞(hChRWR-CHO安定発現細胞株)を作成した。
金コーティング磁性ナノ粒子を電極として利用するため、細胞内に導入された金コーティング磁性ナノ粒子を下方より磁石により牽引し、細胞膜を貫通させる。このことにより金コーティング磁性ナノ粒子は細胞膜を介してその一部を細胞内、細胞外に同時に露出する事になる。細胞は細胞外記録用電極の上に播種されているため、金コーティング磁性ナノ粒子の細胞膜の貫通に伴い、細胞内記録電極として作動する(図1)。
その際、金コーティング磁性ナノ粒子のCHO細胞内への導入はPolyethyleneimine(PEI, P3143 Sigma-Aldrich)を用い、下記URLを基にして改良したプロトコールで行った。(https://labs.fccc.edu/yen/docs/PEI%20preparation.pdf)
具体的には、あらかじめ10mg/ml PEI溶液(pH7)を0.2μm filter(Minisart, Sartorius stedim)を用いて調整後、-80℃で保管しておき、使用分のみを使用直前にddH2Oで100倍希釈した。5μlのPEI希釈溶液を80μl金コーティング磁性ナノ粒子と20μlの 5×HBPS(24mMHEPES+126mM NaCl, 4mM KCl, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 10mM Glucose)混合液に加え、15分間室温でインキュベーションした。
そして、(1−1)で作成した培養hChRWR-CHO細胞を、血清の含まれていないDMEM(Sigma-Aldrich社製)、又はOptiMEM I(Invitrogen社製)含有緩衝液(PBS)で洗い、上記の金コーティング磁性ナノ粒子溶液と置換し、15分37℃の培養器でインキュベーションした。
導電性ガラス上の細胞の細胞内電位は、(図2)のように配置された記録電極、アース、増幅アンプで構成される装置により計測されるが、その際、電極となるガラス面とアースが直接細胞外液と短絡しないように、ガラス面の狭い領域(直径1.5-2mmの円形領域)に培養細胞を隙間無く引き詰めるように培養を行った。
(1−2)で構築した細胞内記録電極を含む培養細胞に対して、青色光を照射して、その刺激応答量の測定を行った(図4)。
図中、青色光(12秒間照射)を25秒ごとに行い、青色光の出力強度を4段階に増強した(Max 1.2A , LED Driver M00290257, 470nm M470F1, Thorlabs)。
青色光の出力を左から右に向けて増強させると上向きの電位応答(脱分極)も大きくなった。
この結果から、導電性ガラスの上に播種した細胞内に導入した金コーティング磁性ナノ粒子が細胞膜を貫通し、導電性ガラスと繋がることができ、細胞内膜電位を、細胞内記録機器であるパッチクランプアンプ(Current-clamp mode, Axopatch 200A, Axon instruments)により測定可能となることが確認できた。
また、本発明では、従来の細胞非侵襲的な細胞内電位測定法とは異なり、少なくとも30分以上に亘って減衰することなく安定した電気応答を記録することができた。
この実施例では、自発的に活動電位を発生させるNav1.5/Kir2.1を安定発現するHEK細胞を用いて細胞内電位の測定を行う。
Nav1.5/Kir2.1遺伝子をベクターを用いてHEK細胞(JCRB細胞バンク)を形質転換し、Nav1.5/Kir2.1を安定発現するHEK細胞を作成した。
具体的には、まずヒトNa+チャネル(Nav1.5)のαサブユニット(SCNA5, BC140813:SourceBioscience社)から、Nav1.5遺伝子を切り出し、pcDNA3.1(-) hygromycin (Invitrogen)に挿入した。
BC140813はEmbryonic type のNav1.5遺伝子なので、human heart cDNA(Zymogen)を用いたPCR法などにより、ヒト成人心筋で発現するNav1.5遺伝子に置換した。
Kir2.1(NM_000891、KCNJ2)遺伝子(1284bp)は、iPS細胞由来の心筋細胞(CDI, Cellular Dynamics International)から抽出したtotal RNA に下記プライマーによるNesting PCR法を適用した。
Kir2.1 1st sense:CCAAAGCAGAAGCACTGGAG (配列番号3)
Kir2.1 1st A/S:CTTTGAAACCATTGTGCTTGCC (配列番号4)
上記のprimerを用いたFirst round PCRではPCR産物が確認できなかったため、100倍希釈して更にPCRを行い、Kir2.1遺伝子を取得した。
Kir2.1 ICR HindIII sense: CACTATAGGGAAGCTACC atgggcagtgtgcgaaccaac (配列番号5)
Kir2.1 ICR HindIII A/S: ATAGAATAGGAAGCT tcatatctccgactctcgccg(配列番号6)
得られたKir2.1 PCR産物を、pD608(blastcidin、DNA2.0)のHindIII siteへ挿入した。
前記Nav1.5遺伝子(50ug/ml hygromycin)と共に、Kir2.1遺伝子(Kir2.1 2ug/ml blastcidin)をHEK293細胞(培養液, DMEM、Sigma-Aldrich, 10% FBS)に導入し、Nav1.5/Kir2.1の安定発現細胞株を作成した。
次いで、HEK細胞を培養(DMEM、Sigma-Aldrich, 10% FBS)し、(実施例1)と同様に、ガラス面のほぼ全面が覆われたところで、PEI希釈溶液中の金コーティング磁性ナノ粒子を当該HEK細胞内に導入し、測定用ガラス面上で37℃15分インキュベートし、測定用ガラスの下面から磁石を作用させて、金コーティング磁性ナノ粒子による細胞内記録電極を構築した。
細胞内電位の記録を行った結果、活動電位を60mVから、80mVの膜電位の変化として安定して記録できた(図5)。
同様に、電流パルスを与える事によって活動電位を誘導しても、細胞内電位を記録できた(図6)。
この実施例では、(実施例2)で使用したNav1.5/Kir2.1を安定発現するHEK細胞を用いて、パッチクランプ法に適用し、電気生理学的評価を行い、本件発明の方法を検証した。
用いた細胞外液及び細胞内液の組成は以下の通りである。
細胞外液: 126mM NaCl, 4mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1mM MgCl2, 24mM HEPES, 10mM Glucose(pH7.4 NaOH)
細胞内液: 130mM KCl, 5mM MgCl2, 5mM EGTA, 4mM Tris-ATP, 10mM HEPES (pH7.2 KOH)
(実施例2)で使用したNav1.5/Kir2.1を安定発現するHEK細胞に対して、Current injectionにより細胞を刺激し、細胞内の活動電位様の膜電位変化を記録した(図7A)。図中、上部(Vm)のトレースは膜電位の変化、下部(I)のトレースは作用させた電流量を示す。作用電流量を段階的に大きくすると受動的であった膜電位応答に加えてNav1.5活性による全か無の法則に従う、自己再生的電位(活動電位)が発生した。 Nav1.5活性は直後に不活性化が起こる。Nav1.5が不活性化状態(不応期)から回復するまでNav1.5活性が減少する。黒矢印(arrow head)で示すように最初の電流刺激に対する応答に比べ、二度目の電量刺激に対する応答が著しく減少している。このことから自己再生的(活動)電位がNav1.5を介した電位応答である事が強く示唆される(図7A)。
<Nav1.5 電流(図7B)>
膜電位を-80mV(Holding potential)に固定し、その膜電位からステップ上に-40mVから 40mVへ10mV間隔で電位を変化させた。それに伴いNav1.5活性による一過性の内向きのナトリウム電流を記録した(図7B)。
<KCNJ2(Kir2.1)電流(図7C)>
Nav1.5 電流(図7B)測定と同様に、膜電位を-80mVに固定し、Kir2.1電流が測定しやすいように-20mVに膜電位を変更し(直後に一過性のNav1.5 電流が確認できる)、そこから、-40mVから-120mVへ10mVずつ膜電位を過分極する事によりKir2.1電流の存在を確認した。続いて膜電位を-20mVに移す事によりNav1.5 電流の膜電位依存性の不活性化過程も観察できた。
本実施例では、Streptolysin Oを用いるWalevらの方法(PNAS 98:(6) 3185-3190(2001))を基に改良した以下の方法により、金コーティング磁性ナノ粒子を培養細胞内に導入した。
まず、Streptolysin O (SLO)(和光純薬社製)を、DTTを用いて還元し、活性化させて、SLO濃度を約5U/μlに調製した。
次いで、2.5×106のCHO又はHEK細胞を金コーティング磁性ナノ粒子40μl及び金コーティング磁性ナノ粒子導入溶液(20μl 5×HBPS(1mM Ca2+, 1mM Mg2+)、80μl ddH2O)に混ぜ合わせ、SLOと共に10分間37℃でインキュベートすることで、SLOにより細胞膜へのポア形成を行うと同時に、当該ポアを通して金コーティング磁性ナノ粒子を細胞内に導入した。
SLOポアの不活性化(閉口)は細胞含有溶液の500-1000μlのDMEM 10%FBSと混合し、20分以上37℃でインキュベートする事により完了し、金コーティング磁性ナノ粒子が細胞内に多数導入されているのを顕微鏡下で確認した。
以上のことから、タンパク質毒素を用いる方法でも、細胞内に導電性ナノ粒子を導入できることが確認できた。
(5−1)細胞内の導電性ナノ粒子を上方の磁石電極で引き付け細胞膜を貫通させる方法
本実施例では、Ni-Cu-Niでコーティングされた直径1mm円柱ネオジウム磁石(ネオマグ株式会社)を、ネオジウム磁石電極(MagEle)として用いて細胞内記録電極を構築する。実施例2で作成した「Nav1.5/Kir2.1の安定発現HEK細胞」を用い、細胞の上方のネオジウム磁石電極(MagEle)により、細胞内に導入した金コーティング磁性ナノ粒子を磁石電極に引き付け、細胞膜を貫通させて細胞内記録電極を構築し、細胞内電位変化を記録する(図8)。
(実施例1)と同様、PEI希釈溶液を用いて金コーティング磁性ナノ粒子を細胞内に導入した。なお、ナノ粒子導入は、(実施例4)と同様にSLOを用いてもよい。細胞の上方に配置したネオジウム磁石電極(MagEle)により、細胞内に導入した金コーティング磁性ナノ粒子を引き付け、細胞膜を貫通させて細胞内記録電極を構築し、細胞内電位変化を記録した(図10)。
PEIと混合した金コーティング磁性ナノ粒子(nanoimmunotech社製、NITmagold Cit)を、側面が絶縁体でコーティングされた磁石電極表面に添加し、当該ナノ粒子を磁石電極に約30分かけて吸着させた。
鉄板上に設置した培養ディッシュ内でNav1.5/Kir2.1 HEK細胞、及び培養心筋様細胞(iCell cardiomyocyte)の上方から、前記磁石電極を、導電性ナノ粒子の吸着面を下に向けた状態で直接接触させた。磁石電極は培養ディッシュ下方の鉄板に吸引されて細胞上方に固定され、導電性ナノ粒子は、PEIを介して細胞膜を貫通し、かつ磁石からの磁力により細胞膜内にとどまることが観察された(図9)。
さらに、いずれの細胞においても、得られた細胞内記録電極により、(5−1)の場合と同様に細胞内電位変化が記録できた(図10)。
すなわち、あらかじめ導電性ナノ粒子を細胞内に導入する工程がなくても、導電性ナノ粒子とPEIとの混合物を磁石電極に吸着させて細胞に押し付ける工程による、非常に侵襲性の少ない方法により細胞内記録電極が構築でき、細胞内電位変化の記録も可能であることを確認した。
その結果、PEIと混合して用いた場合と比較して細胞膜を貫通する粒子数が少なく、測定された細胞内電位変化量は小さかったものの、十分に識別可能な程度の記録が可能であったことが確認できた(data not shown)。
CHO細胞など通常の動物細胞は導電ガラス表面に効率よく接着するが、心筋細胞やHEK細胞など細胞によっては導電ガラス表面への接着効率が著しく低い細胞もある。そのような細胞を直接導電ガラス表面に播種した場合、培養容器の底面を形成する導電ガラス表面の全体を覆うようにまで細胞を培養することは極めて困難である。
そこで、あらかじめ導電ガラス表面にコラーゲン(Collagen)を格子状に塗布しておき、その上から細胞の播種を行い、全面を覆うまで培養する。コラーゲン塗膜の無い箇所では、細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子の導電性ガラスとの直接接触が可能となる。
コラーゲンは導電性が低いが、細胞接着性も導電ガラスへの接着性も高いため、コラーゲン塗膜箇所での細胞接着率を向上させることができる。このような物質としては、他にfibronectin, Poly-L-lycineなどがあり、コラーゲンに代えて使用することができる。
その後、実施例1,2又は実施例4などと同様の手法で、細胞内に導電性ナノ粒子を導入して細胞膜を貫通させて細胞内記録電極を構築することができるから、同様の手順で細胞内電位の測定が可能である。
本実施例は、本発明の細胞内記録電極を用いることで、細胞内電位と同様に細胞内に発生する細胞膜電流も測定できることを確認するための実験である。
CHO細胞を培養(Minimum Essential Medium Eagle Sigma-Aldrich, 10% FBS BioWest, 40mM L-グルタミン 和光純薬)し、Streptolysin O (SLO)(和光純薬社製)を、DTTを用いて還元し、活性化させて、SLO濃度を約5U/μlに調製した。
金コーティング磁性ナノ粒子20μl及び金コーティング磁性ナノ粒子導入溶液(5μl 5×HBPS(1mM Ca2+, 1mM Mg2+))を5×105のCHO細胞に導入し、導電ガラス上に播種した。ガラス面の全面が覆われたところで、金コーティング磁性ナノ粒子による細胞膜電流の記録を膜電位固定法を用いて行なった。実験前にCHO培養液(Minimum Essential Medium Eagle Sigma-Aldrich, 10% FBS BioWest, 40mM L-グルタミン 和光純薬)は細胞外溶液(24mMHEPES+126mM NaCl, 4mM KCl, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 10mM Glucose)に置換した。膜電位固定法はAxopatch 1D(Axon Instruments)に人工脂質膜の実験に用いるheadstage (CV-4)を用いて行った。その理由は導電性ガラス上に数百にのぼる細胞が培養されている。膜電位固定法では膜電位を変換するためにまず細胞膜の脂質膜に由来する容量をチャージする必要がある。そのためには瞬時に大量の電流を流す事のできるVoltage clamp Amplifierが必要なためである。
膜電位固定法実験では膜電位を-80mVに固定し、膜電位をステップ様に-60, -50, -30, -10, 10, 30, 50, 60mVと1.4秒の長さの電位パルスを与え、続いて-40mV, 400ms電位パルスを与えた(図11A下方)。その膜電位の刺激に応答して外向き電流が観察された(図11A上方)。図11A上で矢印で示したTransient, Sustainedの各々のポイントで電流の大きさを測り、図11Bで、電流(縦軸, pA)−電圧(横軸, mV)の関係をグラフで示した。
また、本発明は基本原理が簡単なため、比較的安価に供給が可能であり、電気生理学の学生実習、基礎研究などへの応用が期待できる。
Claims (15)
- 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を記録可能な細胞内記録電極であって、
対象細胞の細胞膜を貫通している導電性ナノ粒子、及び当該ナノ粒子の細胞外に露出した一端と細胞外で接触している導電性プレート電極又は磁石電極とを含む、細胞内記録電極。 - 細胞外に露出している導電性ナノ粒子の一端と接触している導電性プレート電極が、細胞接触面の反対側に設置された磁石を有していることを特徴とする、請求項1に記載の細胞内記録電極。
- 導電性プレート電極が、表面の少なくとも一部にコラーゲンが塗布されている導電性ガラス電極であることを特徴とする、請求項2に記載の細胞内記録電極。
- 細胞外に露出している導電性ナノ粒子の一端と接触している磁石電極が、導電性物質でコーティングされており、かつ前記導電性ナノ粒子との接触面以外の磁石電極の外液に接するすべての面がさらに絶縁体でコーティングされていることを特徴とする、請求項1に記載の細胞内記録電極。
- 細胞膜を貫通する導電性ナノ粒子は、対象細胞の上方に固定された磁石電極と前記細胞との接着面において、磁石電極と接触する細胞外に露出する一端と、細胞内に露出する一端とを有しており、かつ、前記細胞と接着する容器底面の下方には磁石吸引性の金属板が設けられていることを特徴とする、請求項1又は4に記載の細胞内記録電極。
- 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定及び/又は制御するための装置であって、
請求項1〜5のいずれかに記載の細胞内記録電極が測定器のプラス極に接続され、かつ細胞内電位記録容器の細胞外溶液内に配置されたアース電極が測定器のマイナス極に接続されて電位記録回路を形成している、装置。 - 対象細胞の細胞内電位を測定及び/又は制御するための装置であって、少なくとも
(a)生理食塩水を内包する容器、
(b)請求項1〜5のいずれかに記載の細胞内記録電極、
(c)容器内の生理食塩水内に設けられた細胞外電極、
(d)電気信号測定及び/又は発生装置、及び
(e)電気信号増幅器
を備えていることを特徴とする、装置。 - 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定及び/又は制御する方法であって、
対象細胞内には予め導電性ナノ粒子を導入しておき、
細胞表面に接着させた磁石電極又は導電性プレート電極に接する磁石に由来する磁力により、細胞内の導電性ナノ粒子を細胞と前記電極との接着面側に引き寄せて細胞膜を貫通させ、その細胞外に露出している一端と前記電極とを接触させ、細胞内記録電極を形成する工程を含むことを特徴とする、方法。 - 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定及び/又は制御する方法であって、下記の工程(1)〜(5)を含むことを特徴とする、請求項8に記載の方法;
(1)容器底面に接着している対象細胞内に導電性ナノ粒子を導入する工程、
(2)容器底面の少なくとも1部を形成する導電性プレート電極上に接着する対象細胞内の導電性ナノ粒子を、導電性プレート電極の細胞接着面の反対側に設けられた磁石に由来する磁力により引き寄せて細胞膜を貫通させ、その細胞外に露出している一端を導電性プレート電極に接触させる工程、
(3)細胞内に露出している一端を有する導電性ナノ粒子と、当該ナノ粒子の細胞外に露出している一端と接触する導電性プレート電極とにより、細胞内記録電極を形成する工程、
(4)細胞外電極を、容器内の生理食塩水中で細胞に接触しない位置に設ける工程、
(5)細胞内記録電極及び細胞外電極を、電気信号増幅器を介して電気信号測定器に接続し、両電極間の電流又は電圧を測定する工程。 - 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定及び/又は制御する方法であって、下記の工程(1)〜(6)を含むことを特徴とする、請求項8に記載の方法;
(1)容器底面に接着している対象細胞内に導電性ナノ粒子を導入する工程、
(2)磁石電極を対象細胞の容器との接着表面以外の表面に接着させる工程、
(3)対象細胞内の導電性ナノ粒子を、磁石電極側に引き寄せて導電性ナノ粒子を貫通させ、その細胞外に露出している一端と磁石電極に接触させる工程、
(4)細胞内に露出している一端を有する導電性ナノ粒子と、当該ナノ粒子の細胞外に露出している一端と接触する磁石電極とにより、細胞内記録電極を形成する工程、
(5)細胞外電極を、容器内の生理食塩水中で細胞に接触しない位置に設ける工程、
(6)細胞内記録電極及び細胞外電極を、電気信号増幅器を介して電気信号測定器に接続し、両電極間の電流又は電圧を測定する工程。 - 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定及び/又は制御する方法であって、
予め導電性ナノ粒子を磁石電極表面に磁力により固定し、続いて磁石電極を対象細胞表面に押し付け、細胞の下方に設けた金属板に引き寄せて細胞膜を貫通させ、その一端を細胞質内に到達させた導電性ナノ粒子と磁石電極とにより細胞内記録電極を形成する工程を含むことを特徴とする、方法。 - 対象細胞の細胞内電位又は電位変化を測定及び/又は制御する方法であって、下記の工程(1)〜(7)を含むことを特徴とする、方法;
(1)対象細胞を、磁石吸引性の金属板の上に設置された容器内で培養する工程、
(2)導電性ナノ粒子を磁石電極表面に吸着させる工程、
(3)磁石電極の導電性ナノ粒子を吸着させた面を、容器内の対象細胞の上方表面に直接接触させる工程、
(4)導電性ナノ粒子が、当該細胞が接着する容器底面下方の磁石吸引性の金属板に吸引されて細胞膜を貫通し、細胞内に露出する一端を形成させる工程、
(5)細胞内に露出した一端を有する導電性ナノ粒子と、当該ナノ粒子の細胞外に露出している一端と接触している磁石電極とにより、細胞内記録電極を形成する工程、
(6)細胞外電極を、容器内の生理食塩水中で細胞に接触しない位置に設ける工程、
(7)細胞内記録電極及び細胞外電極を、電気信号増幅器を介して電気信号測定器に接続し、両電極間の電流又は電圧を測定する工程。 - 細胞内記録電極と細胞外電極とを接続した電気信号増幅器を電気信号発生装置として作用させ、対象細胞に電流を流すか又は電圧をかけることで、対象細胞内の細胞内電位を制御する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項8〜12のいずれかに記載の方法。
- 対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、下記の(1)〜(6)を含むことを特徴とする、方法;
(1)容器底面に接着している対象細胞内に導電性ナノ粒子を導入する工程、
(2)細胞表面に接着させた磁石電極又は導電性プレート電極に接する磁石に由来する磁力により、細胞内の導電性ナノ粒子を電極との接着面側に引き寄せ細胞膜を貫通させ、磁石電極又は導電性プレート電極と接触させる工程、
(3)培養容器内の生理食塩水内の細胞と接触しない位置に細胞外電極を設け、工程(2)の細胞内記録電極との間の電流又は電圧を測定する工程、
(4)対象細胞に対し、被検物質試料を投与する工程、
(5)工程(4)で被検物質試料が投与された対象細胞について、工程(3)と同様に、両電極間の電流又は電圧を測定する工程、
(6)工程(5)での測定結果を、工程(3)での測定結果と比較して、両者の測定値に有意な差異がある場合に、被検物質試料が対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質であると評価する工程。 - 対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、下記の(1)〜(9)を含むことを特徴とする、方法;
(1)対象細胞を、磁石吸引性の金属板の上に設置された容器内で培養する工程、
(2)導電性ナノ粒子を磁石電極表面に吸着させる工程、
(3)磁石電極の導電性ナノ粒子を吸着させた面を、容器内の対象細胞の容器との接着表面以外の表面に直接接触させる工程、
(4)導電性ナノ粒子が、当該細胞が接着する容器底面下方の磁石吸引性の金属板に吸引されて細胞膜を貫通し、細胞内に露出する一端を形成させる工程、
(5)細胞内に露出した一端を有する導電性ナノ粒子と、当該ナノ粒子の細胞外に露出している一端と接触している磁石電極とにより、細胞内記録電極を形成する工程、
(6)培養容器内の生理食塩水内の細胞と接触しない位置に細胞外電極を設け、工程(5)の細胞内記録電極との間の電流又は電圧を測定する工程、
(7)対象細胞に対し、被検物質試料を投与する工程、
(8)工程(7)で被検物質試料が投与された対象細胞について、工程(6)と同様に、両電極間の電流又は電圧を測定する工程、
(9)工程(8)での測定結果を、工程(6)での測定結果と比較して、両者の測定値に有意な差異がある場合に、被検物質試料が対象細胞に対し毒性作用又は活性作用を有する物質であると評価する工程。
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