CN1761743A - 细胞培养方法和细胞片 - Google Patents
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Abstract
将未摄入磁性微粒的表皮角质细胞和摄入有磁性微粒的表皮角质细胞接种于24孔超低粘附孔板，在孔的底面外侧设置钕磁体，培养1天。结果未摄入磁性微粒的对照表皮角质细胞未与孔的底面粘附，未形成未分化细胞片。而摄入有磁性微粒的表皮角质细胞通过磁力被吸引到底面，并形成多层细胞片。拆除设置于孔的底面外侧的钕磁体后，将附着有亲水性膜的磁体由上方接近培养液，经由该膜，细胞片被吸引到磁体上，提起，即可容易地回收细胞片。
Description
技术领域
本发明涉及培养粘附依赖性细胞的培养方法以及由此得到的细胞片(cell sheet)。
背景技术
近年来，体外培养细胞，制备用作移植或实验用组织的培养组织，这项技术受到瞩目。八十年代初，Howaed Green等人将灭活的小鼠3T3细胞作为饲养细胞，培养出了人表皮细胞。利用该项技术制备表皮细胞片时，培养表皮细胞形成片后，片附着于培养容器的底面，因此要进行通过分解酶等酶处理将表皮细胞片从培养容器得底面剥离的步骤。但是，酶处理是分解细胞表面的粘附蛋白，因此有可能对细胞有不良影响。
为消除该可能性，人们提出了各种方案。例如日本特公平6-104061号公报中公开了以下技术：不实施酶处理，通过改变环境温度来使繁殖的细胞由支撑体表面剥离、回收。并描述了具体的实施例：将聚苯乙烯制的培养皿的表面用N-异丙基丙烯酰胺聚合物或N，N-二乙基丙烯酰胺包覆，用电子射线照射，使其聚合，然后以含有20％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)作为培养基，将牛的大动脉血管内皮细胞在5％CO2中、在37℃培养，使其充分繁殖，然后冷却至4℃放置，无需进行酶处理等，即可使贴壁培养细胞剥离。并阐明该结果是由于将温度由37℃下降至4℃，培养皿的表面由疏水性转变为亲水性。
所述应用温度感应性聚合物作为培养组织的剥离方法的一种方法正在被人们认识，但仍需要为无需实施酶处理即可使培养组织剥离的方法提供更多的选择，这是技术发展所必须的。另外，使用温度感应性聚合物的方法可以通过使单层片重叠来构建多层组织，但将单层片一片片地层叠这很麻烦。
发明内容
本发明鉴于以上课题而设，其目的之一在于：提供无需实施酶处理即可由培养容器获取培养后的细胞的细胞培养方法。另一目的在于：提供无需使环境温度发生大的改变即可由培养容器获取培养后的细胞的细胞培养方法。还有一个目的在于：提供可容易地获得多层化组织的细胞培养方法。又一个目的在于提供新型的细胞片。
为了实现至少上述一个目的，本发明采用了以下的方法。即，本发明涉及细胞培养方法，该方法包含以下步骤：
通过在粘附依赖性细胞中保有磁性微粒，使该细胞磁化的磁化步骤；
在具有细胞非粘附性底面的培养容器中接种上述磁化的细胞的接种步骤；
上述接种步骤后，通过磁力将上述磁化细胞吸引到上述培养容器的底面的吸引步骤；
以通过磁力将上述磁化的细胞吸引到上述培养容器的底面的状态培养细胞至规定状态的培养步骤；以及
上述磁化的细胞达到上述规定状态之后，去除上述磁力，将上述达到了规定状态的细胞从上述培养容器的底面释放的释放步骤。
该细胞培养方法中，在具有细胞非粘附性底面的培养容器中接种磁化的细胞，然后通过磁力将该磁化的细胞吸引到培养容器的底面，以该状态培养至规定状态，达到规定状态之后，除去上述磁力，将达到了规定状态的细胞从细胞非粘附性底面释放。也就是说，通过磁力，粘附依赖性细胞被吸引到培养容器的底面，这只是近似黏附，因此，如果除去磁力，则很容易从培养容器的底面释放。因而，无需实施酶处理即可由培养容器获取培养后的细胞。另外，与使用温度感应性聚合物的方法相比，环境温度无需有较大改变即可由培养容器获取培养后的细胞。
本发明的磁化步骤中使用的粘附依赖性细胞(是指直接或间接与培养面粘附，然后其粘附面积扩大，进而所述细胞分裂的细胞，也称为贴壁依赖性细胞)例如有由人类、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、鸡、兔、猪、羊、牛、马、狗、猫、猴等温血动物采集的各种细胞。这些温血动物的细胞例如是角质细胞、脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、肾小球系膜细胞、Langerhans细胞、表皮细胞、上皮细胞(包含角膜上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、羊膜上皮细胞、视网膜色素上皮细胞等)、内皮细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞或间质细胞、或着这些细胞的前体细胞，除此之外还有胚胎干细胞(ESC)或间充质干细胞(MSC)等干细胞或粘附依赖性癌细胞。细胞非粘附性底面只要是具有细胞粘附依赖性的细胞不粘附或难以粘附的性质的底面即可，可以是任何材料，有聚苯乙烯、聚丙烯、氟树脂、聚四氟乙烯(PTEE)、聚碳酸酯、聚酯等材质的培养容器底面(可以是膜)，用琼脂糖、琼脂、明胶、胶原、纤维蛋白等涂层的培养容器的底面(可以是膜)，或带正电荷的培养容器的底面等。具有细胞非粘附性底面的容器例如有Corning公司的超低粘附性孔板(商品名)等。具有难以粘附的性质的底面是指具有除去磁力时，只需轻轻摇晃容器，磁化的细胞即可从底面剥离这样程度的粘附性的底面。
本发明的磁化步骤中使用的磁性微粒只要细胞保有，同时通过保有，赋予细胞磁性的物质即可，可以是任何材料，例如可以是构成以下脂质体的磁性微粒：包入磁性微粒的正电荷脂质体(MPCL)，其通过脂质体包入磁铁矿等磁性微粒；或者是包入磁性微粒的脂质体(AML)，其通过固定有抗体的脂质体包入磁铁矿等磁性微粒；也可以是第一化学制品公司制造的MACS(磁性细胞拣选和生物分子的分离)内的磁性微珠或VERITAS公司制造的磁性纳米颗粒(商品名EasySep)等。这些磁性微粒中，象MPCL、AML这样的含有脂质体的磁性微粒是通过脂质体的存在而被摄入细胞内的，因此，一个细胞可摄入很多磁性微粒，可容易地获得通过磁力将细胞吸引至培养容器的底面这样程度的磁性，因而优选。
如图1的一个例子所示，MPCL具有以下结构：通过脂质体包入磁铁矿等磁性微粒，脂质体之间具备正电荷脂质。很多细胞具有负电荷，因此容易与具有正电荷的MPCL结合，另外MPCL具有脂质体，因此容易被摄入细胞内。因此本发明中，如果采用MPCL作为磁性微粒，则可适合各种细胞培养。MPCL例如可参照Jpn.J.Cancer Res.第87卷第1179-1183页(1996年)中记载的包入磁铁矿的正电荷脂质体(MCL)的制备方法制备。磁化步骤中，采用MPCL时，优选1个细胞使用1-150pg、特别优选使用20-150pg MPCL作为磁性微粒，磁化步骤中，含优选使要培养的细胞与MPCL接触，经过0.5-8小时后、特别优选3-5小时后进入下一步骤。
如图2的一个例子所示，AML具有以下结构：通过脂质体包入磁铁矿等磁性微粒，脂质体之间具备抗体。作为抗体，选择与要培养的特定的细胞特异性结合的抗体。具有与抗体特异性结合的部位的细胞容易与AML的抗体结合，另外由于AML具有脂质体，因此容易被摄入细胞内。AML例如可参照Chem.Eng.Jpn.第34卷第66-72页(2001年)中记载的方法制备。磁化步骤中，采用AML时，优选1个细胞使用1-150pg、特别优选使用20-150pg AML作为磁性微粒，磁化步骤中，还优选使要培养的细胞与MPCL接触，经过0.5-8小时后、特别优选3-5小时后进入下一步骤。
本发明的接种步骤中，可根据细胞种类、目标培养组织的大小等设定适宜的接种密度等，但通常以1×103-1×106个/cm2的范围设定接种密度。
本发明的吸引步骤中，只要施加可以将磁化的细胞吸引至培养容器的底面的磁力即可。例如通过设置于培养容器底面外侧的磁体将磁化的细胞吸引至培养容器的底面，此时可根据磁性微粒的种类、摄入细胞中的磁性微粒的量、培养容器底面的材质、其底面的厚度等适当确定磁力。
本发明的培养步骤中，可根据培养对象细胞的种类适当选定液体培养基的种类。例如可以选定周知的DMEM或α-MEM、M199培养基等。还可以适当添加EGF、FGF所代表的生长因子等添加因子。该培养步骤中，将细胞培养至规定状态，规定状态可根据目的适当选定。例如，可以通过培养细胞培养至形成细胞片，此时细胞片可以是单层细胞片，也可以是多层细胞片。或者用于继代培养时，考虑到继代培养操作的容易程度，可以选择各细胞分散的状态。
本发明的释放步骤中，除去磁力时，只要使磁力达到使磁化的细胞不被吸引到培养容器的底面的程度即可。例如，在通过设置于培养容器底面外侧的磁体将磁化的细胞吸引至培养容器的底面的情况下，可根据磁性微粒的种类、磁性微粒被摄入细胞的量、培养容器底面的材质、其底面的厚度等，确定该磁体从培养容器底面离开的距离。
本发明的细胞培养方法中，还可以包含回收步骤：在释放步骤后，通过磁力将达到规定状态的细胞回收。该回收步骤中，可以将悬挂式支撑膜放入培养容器，利用磁力使达到规定状态的细胞附着于该支撑膜上，提起，回收。这里，悬挂式支撑膜只要是可以将达到固定状态的细胞几乎原样地悬挂的材料即可，可以是任何材料，编织物、纺布、无纺布、纸、树脂片等。例如有：无菌纱布、无菌日本纸、无菌滤纸、无菌无纺布、除此之外，还有PVDF膜(聚氟乙烯膜)、PTFE膜(聚四氟乙烯膜)等亲水性膜(包括表面实施了亲水处理的膜)，有机硅橡胶等具有柔软性的高分子材料，聚乙二醇酸酯、聚乳酸等生物降解性聚合物，琼脂培养基，将胶原凝胶、明胶凝胶等水凝胶制成片状的物质等。磁力可以使用可通过通电、断电来控制磁化·消磁的电磁体所产生的磁力。这样，不仅可以容易地使回收达到规定状态的细胞的操作实现自动化，也可以使之后的转移细胞、包装等作业容易地实现自动化，因此很便利。
根据本发明的细胞培养方法制备的细胞片不会直接粘附培养容器，而是通过磁力吸引并培养，因此多层细胞层层积时，全部或大多数细胞层为未分化细胞层。由这样的未分化细胞层丰富的细胞片是迄今尚未被发现的，因此，例如在移植到创伤部位时有望得到高的愈伤效果。
附图简述
图1是包入磁性微粒的正电荷脂质体(MPCL)的一个例子的模式图。
图2是固定了抗体的包入磁性微粒的脂质体(AML)的一个例子的模式图。
图3是细胞片的截面照片。
图4是表示培养时间与磁铁矿摄入量的关系的图。
图5是表示培养时间与存活细胞数的关系的图。
图6是由苏木精和曙红染色的RPE(视网膜色素上皮)细胞片的截面的照片。
图7是表示转移RPE细胞片的情形说明图，(a)表示片附着于金属丝上之前的情形，(b)表示片附着于金属丝上时的情形，(c)表示片从金属丝上脱落时的情形。
实施发明的最佳方式
[实施例1]
实施例1中，对表皮细胞(角质细胞)进行培养，制备培养表皮片的情形进行说明。
(1)使用细胞
正常人表皮角质细胞采用市售的Kurabo公司制造的细胞作为研究用。关于表皮角质细胞的培养基，使用无血清培养基HuMedia-KG2(Kurabo公司制造)作为生长培养基；向HuMedia-KG2中添加氯化钙、总钙浓度调节为1.0mM的培养基作为分化诱导培养基。
(2)包入磁铁矿的正电荷脂质体(MCL)的制备
MCL根据Jpn.J.Cancer Res.第87卷第1179-1183页(1996年)中记载的方法制备。具体来说，首先制备以摩尔比1∶2∶2含有3种磷脂、即N-(α-三甲基铵基乙酰基)-双十二烷基-D-谷氨酸盐氯化物(SOGO药工公司制)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(Sigma Chemicals公司制造)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(Sigma Chemicals公司制造)的脂质体膜，接着，添加1mL的胶态磁铁矿(磁铁矿的量为20mg，磁铁矿由户田工业公司制造)，通过周知的旋转法制备MCL。磁铁矿浓度用硫氰酸钾法测定，为18mg/ml。
(3)MCL向表皮角质细胞中的摄入
将表皮角质细胞悬浮于生长培养基，调节细胞悬浮液，接种于组织培养皿(Asahi Techno Glass制造)，浓度为1×104个/cm2。静置，直至细胞粘附于细胞培养皿的底面，然后加入生长培养基，在CO2培养箱内培养。培养在37℃、在含有5％CO2的加湿空气环境下进行。第一次的培养基更换是在经过驯化期间后，更换处于对数生长期的表皮角质细胞的培养基，此时，用于更换的新鲜生长培养基使用含有MCL的培养基。MCL浓度如下：相对于表皮角质细胞的细胞数，每个细胞添加50pg磁铁矿。之后，通过用含MCL生长培养基进行培养，将MCL摄入表皮角质细胞。
(4)使用磁体的细胞培养方法
摄入MCL的表皮角质细胞在几乎达到汇合状态后，通过胰蛋白处理，使细胞由组织培养皿的底面剥离，将其接种于具有非粘附性底面的24孔超低粘附孔板(Corning公司制造)。接种细胞数为2×106个/孔。另一方面，将未摄入MCL的表皮角质细胞接种于24孔超低粘附孔板，细胞数为2×106个/孔，以此作为对照。
接种后，在各孔的底面外侧设置钕磁体(外形3.0cmφ、表面磁束密度0.45T)，然后培养1天，观察表皮角质细胞是否成片，是否形成未分化细胞。进一步将培养基更换为分化诱导培养基，然后再设置有钕磁体的状态下培养1天，观察表皮角质细胞是否分化，是否形成多层细胞片。结果，未摄入MCL的对照的表皮角质细胞不与孔底面粘附，不形成未分化细胞片。而摄入了MCL的表皮角质细胞形成了5层重叠的未分化细胞片(参照图3(a))。该未分化细胞片可容易地如下回收：取下设置于孔底面外侧的钕磁体，然后将前端附着有经亲水处理的PVDF膜(聚氟化乙烯膜)的棒状铝镍钴磁体(外形1.0cmφ残留磁束密度1.27T)由上方接近培养液面，通过磁力使细胞片浮至培养液面，经由PVDF膜吸引到磁体上，直接提起。将未分化细胞片用分化诱导培养基进一步培养1天，则部分未分化细胞的形成分化的10层细胞片(参照图3(b))。由于分化，该多层细胞片收缩，取掉设置于孔的底面外侧的钕磁体，则细胞片浮游于培养基中，容易地与孔底面剥离。该多层细胞片具有可用镊子处理的强度。
图3(c)是通过Green等人的培养方法得到的以往的细胞片的截面图，刊载于“人体再生”(立花隆著、中央公论新公司、2000年6月10日发行)的229页。Green等人的培养方法中，细胞通过粘附于容器底面而产生自动分化，得到图3(c)那样的角化层多的多层细胞片。而上述实施例中，可认为不直接粘附培养容器上，而是通过磁力吸引进行培养，因此得到未分化的细胞之间层叠的多层细胞片。另外，图3(a)中，几乎所有的细胞层都是未分化细胞层，与图3(b)、图3(c)相比，很多细胞层成为未分化细胞层。
[实施例2]
实施例1中，对于培养视网膜色素上皮细胞(以下称为RPE)，制备细胞片的情形进行说明。
(1)使用细胞等
正常人RPE细胞采用ATCC(美国典型培养物保藏中心)的ARPE-19细胞。培养在37℃、在含有5％CO2的加湿空气环境下进行。培养基使用在DMEM/HAM的F12中添加10％胎牛血清和抗生素(浓度100U/m的氨苄青霉素和浓度0.1mg/ml的链霉素)的培养基。
(2)MCL的制备
MCL与上述实施例1的(2)同样制备。
(3)MCL向RPE细胞摄入
将ARPE-19细胞悬浮于培养基，制备细胞悬浮液，接种于组织培养皿(Asahi Techno Glass制造)，浓度为6×105个/cm2。培养24小时后，更换为含有MCL(磁铁矿浓度25pg/细胞或50pg/细胞)的培养基，再次培养。为了进行磁铁矿摄入分析，定期采样，用硫氰酸钾法测定铁成分浓度，同时通过使用锥虫蓝的染色排除法确认存活细胞数。
迅速发生ARPE-19细胞对磁铁矿的摄入。用含有MCL的培养基开始培养，8小时后，在磁铁矿浓度为25pg/细胞、50pg/细胞的培养基中，细胞中磁铁矿浓度分别为10pg/细胞、27pg/细胞，达到最高值(参照图4)。之后，细胞中磁铁矿的浓度因细胞繁殖而稀释，开始培养48小时后，浓度稍微变淡。
将ARPE-19细胞在含有MCL的培养基(磁铁矿浓度为25pg/细胞、50pg/细胞)中的繁殖，将其和ARPE-19细胞在不含有MCL的培养基中的繁殖进行比较，研究MCL对ARPE-19细胞的有害性。在任何浓度下，MCL都不抑制ARPE-19细胞的繁殖(参照图5)。因此，在以下的实验中，ARPE-19细胞摄入磁铁矿时，均在磁铁矿浓度为50pg/细胞的培养基中进行。
(4)使用磁体进行的细胞培养方法
通过磁力，在使ARPE-19细胞聚集的状态下进行培养，制备4mm2或以下的多层细胞片。具体地，通过以下的顺序制备细胞片并进行评价。即，添加MCL，4小时后将细胞数为3×104的细胞接种到设于24孔超低粘附孔板(corning公司制造)中央的2.4mm直径的克隆环中(高度10cm、内部面积4mm2、Asahi Techno Glass制造)的内侧。换算成细胞密度，为8×103个细胞/mm2，这相当于十层汇合状态的细胞层叠的密度。孔板的表面为亲水性水凝胶层。接着在超低粘附孔板的表面背侧中央设置圆柱状钕磁体(直径22mm、高10mm、4000高斯)，以产生与板底面垂直的磁力的状态培养一天，形成1mm2的片状结构，为了确认所得RPE细胞片的层叠，观察其截面，发现含有MCL的ARPE-19细胞以60μm的厚度重叠15层(参照图6)。苏木精和曙红染色未见RPE细胞片内有明显的坏死部分。
使用不含MCL的ARPE-19细胞时，以及在孔板下没有磁体的情况下培养摄入MCL的ARPE-19细胞时，不形成细胞片，除去克隆环，则细胞分散。
(5)利用磁体进行的回收和转移
开始培养1天后除去24孔超低粘附孔板背面的磁体。结果RPE细胞片由孔的底面剥离。接着准备转移设备：如图7所示，在圆柱状钕磁体10(直径30mm、高15mm、4000高斯)的中央通过磁力拉住金属丝12(直径2mm、长度40mm)。将该金属丝12的前端接触培养基的表面，通过磁力，RPE细胞片14不被破坏地浮起至表面，附着于金属丝12的前端。金属丝12的前端的磁束密度为1100高斯。将附着于该金属丝12的RPE细胞片14移入装有10ml培养液的100mm直径的组织培养皿(Asahi Techno Glass制造)中，在此，将磁体10从金属丝12上取下，轻轻敲打金属丝12，RPE细胞片便从金属丝上脱离，落入培养液的表面，由该结果可知：通过该转移设备可以回收或转移RPE细胞片。之后，在该组织培养皿中培养RPE细胞片。培养1天后，RPE细胞片附着于组织培养皿。之后进一步培养RPE细胞片，则16天后，来自细胞片的细胞活跃地繁殖起来。
本发明并不限于上述事实例，在不脱离本发明的技术性范围内，当然可以以各种形式实施。
产业实用性
本发明可用于体外培养细胞的细胞培养技术中，例如可用于以细胞片等用作身体各部分的替代物作为医疗用具的医疗机械产业。
Claims (12)
1.细胞培养方法，该方法培养细胞，包含以下步骤：
磁化步骤：通过在粘附依赖性细胞中保有磁性微粒，使该细胞磁化；
接种步骤：在具有细胞非粘附性底面的培养容器中接种上述磁化的细胞；
吸引步骤：上述接种步骤后，通过磁力将上述磁化的细胞吸引到上述培养容器的底面；
培养步骤：以通过磁力将上述磁化的细胞吸引到上述培养容器的底面的状态培养至规定状态；以及
释放步骤：上述磁化的细胞达到上述规定状态之后，除去上述磁力，将上述达到了规定状态的细胞从上述培养容器的底面释放。
2.权利要求1的细胞培养方法，其中上述磁性微粒被包入脂质体中，构成包入磁性微粒的正电荷脂质体(MPCL)，上述磁化步骤中，通过使上述细胞摄入上述MPCL，使该细胞磁化。
3.权利要求1的细胞培养方法，其中上述磁性微粒被包入固定有抗体的脂质体中，构成包入磁性微粒的脂质体(AML)，在上述磁化步骤中，通过使上述细胞与上述AML结合，细胞被磁化，其中所述AML上固定有与该细胞特异性结合的抗体。
4.权利要求1-3中任一项的细胞培养方法，该方法包含回收步骤：在上述释放步骤后，通过磁力回收达到了规定状态的细胞。
5.权利要求4的细胞培养方法，其中在上述回收步骤中，将悬挂式支撑膜放入培养容器，利用磁力使上述达到规定状态的细胞附着于该支撑膜上，提起，回收。
6.权利要求5的细胞培养方法，其中在上述回收步骤中，上述磁力使用可通过通电、断电来控制磁化·消磁的电磁体产生。
7.权利要求1-6中任一项的细胞培养方法，其中上述粘附依赖性细胞为表皮细胞或视网膜色素上皮细胞。
8.权利要求1-7中任一项的细胞培养方法，其中上述培养步骤中，通过磁力，将上述磁化的细胞吸引到上述培养容器的底面，以该状态培养至形成细胞片。
9.权利要求8的细胞培养方法，其中上述培养步骤中，通过磁力，将上述磁化的细胞吸引到上述培养容器的底面，以该状态培养至形成多层细胞片。
10.细胞片，该细胞片是通过权利要求8或9的细胞培养方法制备的。
11.细胞片，该细胞片是多个细胞层重叠的细胞片，上述细胞层几乎都是未分化细胞层。
12.细胞片，该细胞片由保有磁性微粒的粘附依赖性细胞构成。
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