CN103937671A - 一种模拟前房抗重力培养的装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种模拟前房抗重力培养的装置，包括一倒置的35mm培养皿、一培养皿盖和一磁铁，培养皿内放置9.0—9.5ml含细胞的培养液，细胞为可代替角膜内皮细胞的种子细胞，且所述细胞含有免疫纳米磁珠标记或吞噬纳米磁珠，所述磁铁为复合结构，磁铁内圈部分是钕铁硼磁铁，3500高斯，内圈直径14-15mm，外围部分是铜或铁，外围直径18-20mm，磁铁高度为8-10mm。本装置可以模拟前房密闭并充满液体的环境，其深度模拟了前房深度，加磁场后可抗重力培养磁珠标记或吞噬磁珠的细胞，模拟了人体正常的体位。该装置中设计的磁铁可以使细胞均匀分布，模拟了正常角膜内皮细胞呈均匀单层分布的特点。

Description

一种模拟前房抗重力培养的装置
技术领域
本发明涉及干细胞/组织工程研究领域，更具体地讲，涉及一种模拟前房抗重力培养的装置。
背景技术
角膜内皮细胞是角膜和房水之间的屏障，可将水从角膜基质泵入前房，通过泵功能和屏障功能维持角膜的透明性。人的角膜内皮细胞在体内损伤后无法增殖，因为其停留在G1期，只能靠剩余细胞体积扩大移行来修复角膜内皮缺损。当细胞密度低于400-500个细胞/mm2，角膜内皮失代偿，导致角膜水肿，产生大泡性角膜病变，甚至视力丧失。全世界角膜供体的严重缺乏，使更多的研究聚焦在干细胞移植代替角膜内皮细胞上，包括角膜内皮前体细胞，角膜基质干细胞，人胚胎干细胞，人脐血间充质干细胞。内皮祖细胞最早是用CD34磁珠从外周血中分离得到。内皮祖细胞可以从脐带血，胚胎肝脏或骨髓中获取，表达CD34，CD133，vWF，能摄取DiI-Ac-LDL，表达UEA-1。
目前有各种生物和合成材料用于组织工程角膜内皮层构建，如角膜脱细胞基质(Choi JS,Williams JK,Greven M,Walter KA,Laber PW,Khang G,et al.Bioengineering endothelialized neo-corneas using donor-derived cornealendothelial cells and decellularized corneal stroma.Biomaterials.2010；31:6738-45.)，牛角膜脱细胞后板层(Bayyoud T,Thaler S,Hofmann J,Maurus C,Spitzer MS,Bartz-Schmidt KU,et al.Decellularized bovine cornealposterior lamellae as carrier matrix for cultivated human corneal endothelial cells.Current eye research.2012；37:179-86.)，丝素膜(Madden PW,Lai JN,George KA,Giovenco T,Harkin DG,Chirila TV.Human corneal endothelial cell growth on asilk fibroin membrane.Biomaterials.2011；32:4076-84.)。生物相容性差和难降解限制了这些材料的应用。研究者们开始探索免载体的移植方法。温度敏感培养皿可获得角膜内皮细胞单层，但是在手术中很难将这一单层细胞进行移植，仍需借助其他载体(Hsiue GH,Lai JY,Chen KH,Hsu WM.A novel strategy forcorneal endothelial reconstruction with a bioengineered cell sheet.Transplantation.2006；81:473-6.)。Mimura等将吞噬铁颗粒的角膜内皮细胞注射入前房，用磁铁吸引修复角膜内皮缺损。这个方法的缺点在于含铁血黄素的沉积对角膜内皮及视网膜等毒性作用(Mimura T,Shimomura N,Usui T,Noda Y,Kaji Y,Yamgami S,et al.Magnetic attraction of iron-endocytosed corneal endothelial cells toDescemet's membrane.Experimental eye research.2003；76:745-51；Mimura T,Yamagami S,Usui T,Ishii Y,Ono K,Yokoo S,et al.Long-term outcome ofiron-endocytosing cultured corneal endothelial cell transplantation with magneticattraction.Experimental eye research.2005；80:149-57.)。
免载体的移植方法目前都需要通过动物实验验证，探索移植所需的各个条件需要牺牲较大量的动物数量，如果利用体外装置来验证，就可以大量减少动物实验。目前未见文献报道模拟前房抗重力培养的装置。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种模拟前房抗重力培养的装置。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种模拟前房抗重力培养的装置，其特征在于，所述装置包括一倒置的35mm培养皿、一培养皿盖和一磁铁，所述培养皿内放置9.0—9.5ml含细胞的培养液，所述细胞为可代替角膜内皮细胞的种子细胞，且所述细胞含有免疫纳米磁珠标记或吞噬纳米磁珠，所述磁铁为复合结构，磁铁内圈部分是钕铁硼磁铁，3500高斯，内圈直径14-15mm，外围部分是铜或铁，外围直径18-20mm，磁铁高度为8-10mm。
作为一个优选方案，所述细胞为人脐血内皮祖细胞、人脐血间充质干细胞、骨髓内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、iPS细胞、角膜内皮细胞、角膜内皮前体细胞和角膜内皮祖细胞中的一种或几种。
作为一个优选方案，所述细胞的含量为细胞总数＝角膜内皮细胞密度×底面积，所述底面积为35mm培养皿的底面积。
本发明的优点在于，本装置可以模拟前房密闭并充满液体的环境，其深度模拟了前房深度，加磁场后可抗重力培养磁珠标记或吞噬磁珠的细胞，模拟了人体正常的体位。该装置中设计的磁铁可以使细胞均匀分布，模拟了正常角膜内皮细胞呈均匀单层分布的特点。通过这个装置，可以在体外验证体内前房注射免疫纳米磁珠标记的细胞或吞噬SPION磁珠或吞噬其他纳米磁珠的细胞，在磁场引导下定向移动贴附到角膜的效果，并可体外研究并确定体内移植时所需的磁场强度和磁场持续作用时间，减少了不必要的动物牺牲。
附图说明
图1为模拟前房抗重力培养的装置的示意图。
图2为细胞经磁铁吸引后吸附于培养皿底部的示意图。
图3为人脐血内皮祖细胞(UCB EPCs)CD34磁珠标记后细胞的增殖能力。(A)CCK-8显示CD34磁珠标记后体外培养不同天数后细胞增殖情况。OD值显示磁珠标记不影响细胞的增殖，差异无统计学差异(P>0.05)。(B)免疫荧光显示磁珠标记和未标记UCB EPCs的Ki-67的表达情况(200×)。(C)Ki-67的阳性率两组间无统计学差异(P>0.05)。
图4为体外用磁铁吸引CD34免疫磁珠标记的人脐血内皮祖细胞(UCBEPCs)。(A)磁铁吸引2小时的UCB EPCs在不同时间点的细胞贴附情况(40×)。(B)体外模拟前房装置示意图。磁珠标记的UCB EPCs用磁铁吸引，倒置培养。(C)磁铁吸引24小时的UCB EPCs在不同时间点的细胞贴附情况(40×)。
图5为不同磁铁对磁珠标记的UCB EPCs的吸引效果比较，(A)现有磁铁(3500高斯，10mm直径，5mm高度)吸引24小时后，可见兔骨髓内皮祖细胞贴壁的范围分布在磁铁的边缘(40×)。(B)磁铁中央作用区域很少细胞(100×)。(C)本发明中设计的磁铁，周边无细胞(40×)。(D)本发明中设计的磁铁，细胞均匀分布在磁铁的15mm直径范围内(100×)。
图6为移植后角膜外观及厚度。(A)术后2周。各组角膜水肿明显，角膜较厚。(B)术后4月。磁珠标记人脐血内皮祖细胞加磁铁组(实验组)角膜少量混浊。磁珠标记人脐血内皮祖细胞不加磁铁组(对照组)和后弹力层内皮层撕除不注射细胞组(模型组)角膜混浊明显。OCT显示磁珠加磁铁组角膜厚度明显低于对照组和模型组，并且接近于正常组。(C)三组角膜厚度从术后2周到4月，均呈下降趋势。(Nano group＝实验组，Control group＝对照组，Modelgroup＝模型组，Normal group＝正常组)。
图7为术后4月各组角膜水肿分级，角膜厚度，眼压，内皮细胞密度，前房角。(A)角膜水肿分级。磁珠加磁铁组的角膜水肿评分(1±0)明显低于对照组(3.5±0.6)和模型组(3.8±0.5)(P<0.01)。(B)角膜厚度。实验组角膜厚度明显低于对照组和模型组(P<0.01)，接近于正常角膜(P＝0.049)。(C)眼压。各组与正常组眼压相比，均无明显差异(P>0.05)。(D)内皮细胞密度。实验组角膜中央角膜内皮密度仍低于正常组(P<0.05)。(E)前房角。OCT显示实验组前房角开放，未见细胞或磁珠堆积。(**P<0.01,*P<0.05)。(Nano＝实验组，Control＝对照组，Model＝模型组，Normal＝正常组)。
图8为移植4月后组织学检测。(A)HE染色见实验组移植的人脐血内皮祖细胞与受体角膜基质紧密贴附，呈单层生长，对照组角膜中央仅见很少量细胞，模型组角膜中央未见细胞。(上面一排100×，下面一排400×)(B)实验组移植细胞表达AQP1，呈红色荧光，但弱于正常组，对照组和模型组不表达AQP1(400×)。(C)实验组可见CM-Dil标记，呈红色荧光(I)(200×)，人抗核抗体染色发现移植细胞核着染，呈深棕色(II)(400×)。(D)普鲁士蓝染色实验组(I)与正常组(II)一样，角膜内皮层未见蓝色着染。CD34纳米磁珠普鲁士蓝染色呈蓝色(III)(400×)。(Nano group＝实验组，Control group＝对照组，Model group＝模型组，Normal group＝正常组)。
图中标号表示为：
1——35mm培养皿；11——细胞；2——培养皿盖；3——磁铁；31——内圈部分；32——外围部分。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
1.材料和方法
1.1.人脐带血来源
人脐带血来源于上海复旦大学附属妇产科医院组织库。取脐血前均签署知情同意书。实验方法通过上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会批准。实验严格遵照赫尔辛基宣言。
1.2.人脐血内皮祖细胞(UCB EPCs)的培养
从人的脐带血中用Ficoll密度梯度离心液(1.077g/ml，STEMCELL公司)分离出单核细胞，用含2％胎牛血清(FBS，Gibco公司)的PBS洗3遍，将单核细胞接种于I型胶原铺层的6孔板(Millipore公司)中，用含10％胎牛血清的EGM-2培养液(Clonetics，Lonza公司)37℃培养箱中培养。培养4天后，将未贴壁的细胞吸除，继续用EGM-2培养液培养贴壁细胞，每两天换一次液。UCB EPCs的克隆于第9-11天用0.25％胰酶(Gibco公司)消化，传代后细胞培养改用含5％血清的EGM-2培养。
1.3.人脐血内皮祖细胞的鉴定
人脐血内皮祖细胞的鉴定包括Dil-Ac-LDL(Invitrogen公司)，CD133(MAB4399,Millipore公司)，CD34(sc-9095,Santa Cruz公司)和vWF(Abcam公司)。方法如下：人脐血内皮祖细胞用10μg/ml DiI-Ac-LDL37℃培养箱中培养4小时，4％多聚甲醛固定后，加10μg/ml的UEA-1(Sigma-Aldrich公司)4℃2小时。结果用荧光显微镜观察(OLYMPUS IX51，Japan)[3]。将UCB EPCs接种到纤维蛋白(Millipore公司)铺层的盖玻片上，培养1天，用4％多聚甲醛室温固定15分钟。PBS洗后用封闭液(10％山羊血清，0.3％Triton X-100，0.1％叠氮化钠)封闭1小时。然后加一抗，4℃冰箱过夜。PBS洗后加二抗AlexaFluor546/488goat anti-mouse/rabbit(BD公司)1:800稀释室温1小时。细胞核用Hoechst33342(Invitrogen)染。阴性对照是不加一抗。用荧光显微镜观察细胞表达情况。阳性细胞计数至少5个视野，500到1000个细胞。
1.4.CD34免疫磁珠标记人脐血内皮祖细胞
人脐血内皮祖细胞用EasySep人脐血CD34阳选试剂盒标记(StemCellTechnologies公司,Vancouver,BC,Canada)。方法如下：将第二代UCB EPCs重悬于100μl的工作液中(2×108细胞/ml，PBS含2％胎牛血清和1mM EDTA，不含Ca++和Mg++)，放入BD无菌流式管中，加入EasySep阳选混合液(含单克隆抗体，是一个四聚体抗体复合物，可以靶向结合CD34抗原和葡聚糖)100μl/ml，混匀后室温放置15分钟。再加入EasySep磁纳米颗粒(磁葡聚糖铁颗粒悬液)50μl/ml细胞，混匀后放置室温10分钟。加入工作液使总体积为2.5ml。用吸管轻轻上下混匀2-3次。将管子放入磁铁，静置5分钟。拿起磁铁，并倒置，倒去悬液。磁珠标记的细胞会留在管内。移出管子，加2.5ml工作液，混匀，放入磁铁再倒置5分钟，倒去液体。磁选的细胞留在管内，用于后续实验。
1.5.体外评估CD34免疫磁珠标记后对细胞增殖能力的影响
我们进一步研究了免疫磁珠对UCB EPCs生长的影响。CCK-8(Dojindo,Kumamoto，日本)用于检测磁珠的毒性和细胞增殖情况。第二代UCB EPCs细胞重悬并接种到96孔板中，5×103细胞/孔。分磁珠标记组和未标记组。第0、1、2、3、4、5天，CCK-8溶液加入96孔板中，放37℃培养箱3小时，然后用酶标仪(ELX800,BioTeK,美国)450nm波长检测。细胞的增殖力与450nm波的吸光度相应。
细胞增殖标记物Ki-67(小鼠抗人Ki-67抗体，BD公司)用于检测CD34免疫磁珠标记的UCB EPCs的增殖能力。免疫细胞化学过程如上所述。
1.6.磁铁的设计
在Mimura的研究中，用了钕铁硼磁铁，3500高斯，10mm直径，5mm高度(Mimura T,Shimomura N,Usui T,Noda Y,Kaji Y,Yamgami S,et al.Magneticattraction of iron-endocytosed corneal endothelial cells to Descemet's membrane.Experimental eye research.2003；76:745-51)。在本研究中，我们改良了磁铁(由我们设计，由上海特必灵电子科技有限公司制作)。这是一个复合结构，内圈部分是钕铁硼磁铁，3500高斯，内圈部分直径14-15mm(优选直径15mm)，外围部分是铜或铁，外围直径18-20mm(优选直径20mm)。磁铁高度为8-10mm(优选8mm)。
1.7.体外用磁铁吸引CD34磁珠标记的UCB EPCs
磁铁吸引的有效性在体外用本发明的模拟前房抗重力培养的装置来检测。35mm的培养皿中加入6ml EGM-2(5％血清)培养液，CD34免疫磁珠标记的UCB EPCs重悬为2ml共2×106个细胞加入培养皿中，再加入1ml EGM-2培养液使充满培养皿，小心盖上培养皿盖，避免液体的流出。多次研究发现，9ml的液体含量使得液体恰好能通过液面张力，使培养皿盖和培养液紧密贴附，不留空隙。再将皿平行移出超净台，拇指和食指捏紧培养皿，快速倒置培养皿。将消毒过的磁铁放在35mm培养皿上，37℃培养箱培养。实验分为2组，一组是磁铁放置2小时后，移除磁铁，吸除培养液和未贴壁的细胞，加入新的EGM-2培养液，显微镜下拍照，加足培养液，继续倒置培养，于24小时，48小时观察拍照。第二组为磁铁放置24小时，移去磁铁，吸除培养液和未贴壁细胞，加入新的EGM-2培养液，显微镜下拍照，加足培养液，继续倒置培养，于48小时观察拍照。
所用细胞悬液中细胞的数量应根据相应的角膜内皮细胞密度计算，如兔的角膜内皮细胞密度为2500个细胞/mm2，35mm培养皿的底面积为800mm2，就可以计算出培养液中应含有的细胞总数＝角膜内皮细胞密度×底面积，即2×106个细胞，避免过多细胞。
同时比较不同磁铁的吸引效果。
1.8.体内定向移植磁珠标记的UCB EPCs
手术过程参照DMEK手术方法(Descemet membrane endothelialkeratoplasty，DMEK)。新西兰大白兔，体重2.0-2.5kg，用氯胺酮(10mg/kg)和陆眠宁(6mg/kg)肌注麻醉。美多丽扩瞳，倍诺喜表麻(Santen公司)，中央角膜用9mm角膜环钻压迹。角巩缘9点位用钻石刀做2.5mm的小切口。右眼为实验眼。手术在眼科显微镜(Leica M620F18，德国)下完成。前房注射粘弹剂(博士伦公司)。沿压迹撕除角膜后弹力层和内皮层。前房用乳酸钠林格液(Baxter公司)冲洗，去除多余粘弹剂。切口用10-0的线(Ethicon公司)缝合。UCB EPCs用CM-Dil(C700,Invitrogen公司)和CD34磁珠标记后(4×105细胞/100μl EGM-2)用1ml针筒25G的针头于8点位注射入前房。磁铁用绷带固定在眼睑前12小时，吸引细胞定向移动到角膜基质层。
实验分为4组，每组4只兔子，分别为：CD34免疫磁珠标记磁铁吸引组(实验组)，CD34免疫磁珠标记不加磁铁组(对照组)，单纯后弹力层内皮层撕除组(模型组)，以及正常组。
1.9.移植后角膜观察
术后每周观察手术眼，并于术后2周，2月，4月进行检测，包括裂隙灯观察，眼前节照相，角膜水肿，角膜厚度，前房角，眼压，内皮密度检测。角膜水肿分级按照Mimra的方法：0，角膜完全透明；1，少量角膜混浊，但虹膜血管可看清；2，中度角膜混浊，虹膜血管仍可看到；3，重度角膜混浊，只能看到瞳孔边缘；4，完全角膜混浊，瞳孔看不清。中央角膜厚度和前房角用ZeisscCirrus HD-OCT(Carl Zeiss Meditec公司)扫描观察。眼压用SUOER SW-500回弹式眼压计测量。角膜内皮密度用Topcon sp3000p非接触内皮镜检测。
1.10.UCB EPCs的组织学检测
移植4个月后，兔子用耳缘静脉注射空气的方法处死，取角膜并用4％多聚甲醛固定18小时。角膜石蜡切片用于HE染色，小鼠抗人核单克隆抗体(MAB1281，Millipore公司)免疫组化染色(仅染人的细胞核)(由LeicaBOND-MAXTM全自动免疫组化仪完成)，普鲁士蓝染色(染铁)。
角膜冰冻切片用于CM-Dil标记检测，AQP-1(兔多克隆AQP1抗体，sc-20810，Santa cruze公司)免疫荧光染色。
1.11.统计学分析
所有数据用平均值±标准差(standard deviation，SD)来表示。单因素方差分析用于比较CCK-8，角膜水肿分级，角膜厚度和眼压，t检验用于Ki-67和内皮细胞密度的检测。P值小于0.05认为有统计学差异。
2.结果
2.1.UCB EPCs的特性
UCB EPCs的克隆于第4-6天出现，于第8天克隆数和大小明显增加。每10ml脐带血培养第5天可有20±2个克隆，于第8天增加到64±5个克隆。克隆直径也从第5天的0.90±0.74mm，增加到第8天的1.56±1.47mm，有些克隆可融合。克隆形态呈圆形，细胞簇集呈铺路石样单层生长。传代后细胞呈短梭形。UCB EPCs可以摄取Dil-Ac-LDL并且结合UEA-1，表达CD133，CD34和vWF。
2.2.CD34磁珠标记的细胞活力和增殖力
CCK-8用于检测CD34磁珠标记的UCB EPCs的增殖能力。统计学分析发现标记磁珠的UCB EPCs的增殖力与正常UCB EPCs之间没有差异(P>0.05)(图3A)。
免疫荧光发现磁珠标记的UCB EPCs和未标记的EPCs的Ki-67表达率分为为(69.66％±7.67，70.77％±6.45，P>0.05)，无统计学差异(图3B、C)。结果表明，磁珠标记EPCs并不会影响细胞的活力和增殖力。
2.3.体外检测用磁铁吸引CD34免疫磁珠标记UCB EPCs的效果
磁铁吸引CD34磁珠标记UCB EPCs的效果用体外模拟前房装置抗重力培养来检测。发现细胞可抗重力贴附于倒置的皿底，细胞贴附范围为磁铁吸引的15mm直径范围。磁铁作用时间2小时和24小时对细胞贴壁数量没有明显差异(图4)。
模拟前房抗重力培养的装置结构示意图如图1所示，包括一倒置的35mm培养皿1、一培养皿盖2和一磁铁3，所述培养皿1内放置9.0—9.5ml含细胞的培养液，所述细胞含有免疫纳米磁珠标记或吞噬纳米磁珠，所述磁铁3为复合结构，磁铁内圈部分31是钕铁硼磁铁，3500高斯，内圈直径14-15mm，外围部分32是铜或铁，外围直径18-20mm，磁铁高度为8-10mm。图2为细胞经磁铁吸引后吸附于培养皿底部的示意图。该装置的深度模拟了前房深度，但用于移植时还要考虑眼睑厚度的影响，因此35mm培养皿的深度即10mm是比较合适的。正常成人的前房深度约3-3.5mm，睑缘宽度为2mm，眼睑厚度约2.5-5.5mm，兔的前房深度约为2.08mm。加磁场后可抗重力培养磁珠标记或吞噬磁珠的细胞，模拟了人体正常的体位。
该装置中设计的磁铁可以使细胞均匀分布，模拟了正常角膜内皮细胞呈均匀单层分布的特点。该装置中设计的磁铁横截面为直径为15mm的圆，模拟了角膜的形态和大小，但需略大于角膜直径(人角膜直径11mm，兔角膜直径13.5mm)，可使细胞吸引更充分。
本发明中对现有的磁铁和我们自己设计的磁铁进行了比较。前者磁铁吸引24小时后，可见兔骨髓内皮祖细胞贴壁的范围主要分布在磁铁的边缘，磁铁中央作用区域无细胞或很少细胞。我们设计的磁铁，细胞均匀分布在磁铁的15mm直径范围内(图5)。
2.4.移植后角膜透明度和厚度的检测
术后2周，各组角膜水肿明显水肿，角膜较厚。但磁珠-磁铁组(实验组)的角膜稍薄于对照组和模型组(图6A)。手术后4个月，磁珠-磁铁组(实验组)的角膜少量混浊，而磁珠不加磁铁组(对照组)，撕除后弹力层内皮层无细胞移植的模型组(模型组)的角膜重度到完全水肿混浊(图6B)。磁珠-磁铁组(实验组)的角膜厚度从术后2周1322.5±187.9μm下降到术后4月490±21.6μm，磁珠不加磁铁组(对照组)的角膜厚度从术后2周1517.5±36μm下降到术后4月832.5±53.2μm，模型组的角膜厚度从术后2周1637.5±45.7μm下降到术后4月1000±14.2μm。正常角膜厚度为350±18.3μm(图6C)。
术后4月，角膜水肿评分磁珠-磁铁组(实验组)(1±0)明显低于磁珠不加磁铁组(对照组)(3.5±0.6)和模型组(模型组)(3.8±0.5)(P<0.001)(图7A)。
术后4月，角膜厚度磁珠-磁铁组(实验组)要明显低于磁珠不加磁铁组(对照组)和模型组(模型组)(P<0.001)，接近于正常角膜厚度(P＝0.049)(图7B)。
正常兔眼压为4.76±1.35mmHg。术后4月检测，各组间眼压无统计学差异(实验组，4.36±1.63mmHg，P＝0.767；对照组，5.11±1.62mmHg，P＝0.858；模型组，6±0.89mmHg，P＝0.124)(图7C)。
磁珠-磁铁组的角膜中央内皮细胞密度术后4月为2294±152个细胞/mm2仍低于正常角膜内皮细胞密度2798±227细胞/mm2)(P＝0.01)(图7D)。其他两组因为角膜水肿混浊明显，角膜内皮密度测不出。
OCT扫描见实验组前房角开放，未见移植细胞堵塞前房角(图7E)。
2.5.移植后组织学检测
HE染色可见磁珠-磁铁组(实验组)的UCB EPCs紧密贴附与受体角膜基质，并呈单层生长，表达水通道蛋白AQP1。磁珠不加磁铁组(对照组)角膜中央极少见移植细胞，不表达AQP1。模型组角膜中央未见后弹力层和内皮层，未见细胞，不表达AQP1。正常角膜高表达AQP1(图8A、8B)。
磁珠-磁铁组移植细胞可见CM-Dil标记的弱红色荧光，人抗核抗体染色呈深棕色阳性，证明是移植的UCB EPCs(图8C)。
磁珠-磁铁组移植细胞普鲁士蓝染色未见蓝色着染，说明没有铁残留(图8D)。
3.讨论
免疫磁珠纳米颗粒可通过磁珠上连接的抗体识别目标抗原形成复合体，目前广泛用于细胞标记和分选。本发明中，UCB EPCs可通过双极四聚体抗体复合物连接到磁纳米颗粒上。这个四聚体可以识别细胞表面抗原和磁珠外围的葡聚糖，从而将两者结合起来。磁珠可以有效连接到细胞上。医学上，尤其是体内移植应用的优势在于磁珠非常小，没有细胞毒性，生物相容性好，操作简单。EasySepTM操作快，无需分离柱。体外实验显示磁珠不影响UCB EPCs的活力和增殖力。通过磁铁吸引，磁珠标记的UCB EPCs可定向移动。体内普鲁士蓝染色未见铁残留。OCT显示无细胞或磁珠堵塞前房角。眼压也没有改变。证明了磁珠标记UCB EPCs的安全和有效。
本发明中设计的磁铁可使磁力线均匀分布于磁铁范围内，直径为15mm，略大于兔角膜直径，保证了细胞贴附的范围和均匀分布。模拟前房抗重力培养的装置在可于体外验证磁珠磁铁抗重力定向移动细胞的可行性和有效性。体外实验证明磁珠标记的UCB EPCs可以在磁铁吸引下有效定向抗重力向上移动，并且贴附于倒置的培养皿底，呈均匀分布。UCB EPCs的体内和体外实验中用的细胞量相当于正常角膜内皮细胞密度，既保证了细胞的量，又避免了过多细胞堵塞房角。
移植后，实验组(磁珠-磁铁组角膜)仅少量水肿，而对照和模型组明显水肿。实验组的角膜厚度接近正常角膜。前房注射磁珠标记的UCB EPCs并没有引起眼压明显增高或降低。移植后的UCB EPCs能表达AQP1，说明已初步建立泵功能。磁珠标记的UCB EPCs体内可有效定向移植，并修复角膜内皮缺损。
在本发明模拟前房抗重力培养的装置中，用CD34免疫磁珠标记的人的脐血内皮祖细胞可有效被磁铁吸引，定向抗重力移动并贴附生长，在体内可定向移动到受体角膜基质层，并且有效修复角膜内皮缺损。本装置可以模拟前房密闭并充满液体的环境，其深度模拟了前房深度，加磁场后可抗重力培养磁珠标记或吞噬磁珠的细胞，模拟了人体正常的体位。该装置中设计的磁铁可以使细胞均匀分布，模拟了正常角膜内皮细胞呈均匀单层分布的特点。通过这个装置，可以在体外验证体内前房注射免疫纳米磁珠标记的细胞或吞噬SPION磁珠或吞噬其他纳米磁珠的细胞，在磁场引导下定向移动贴附到角膜的效果，并可体外研究并确定体内移植时所需的磁场强度和磁场持续作用时间，减少了不必要的动物牺牲。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种模拟前房抗重力培养的装置，其特征在于，所述装置包括一倒置的35mm培养皿、一培养皿盖和一磁铁，所述培养皿内放置9.0—9.5ml含细胞的培养液，所述细胞为可代替角膜内皮细胞的种子细胞，且所述细胞含有免疫纳米磁珠标记或吞噬纳米磁珠，所述磁铁为复合结构，磁铁内圈部分是钕铁硼磁铁，3500高斯，内圈直径14-15mm，外围部分是铜或铁，外围直径18-20mm，磁铁高度为8-10mm。
2.根据权利要求1所述的一种模拟前房抗重力培养的装置，其特征在于，所述细胞为人脐血内皮祖细胞、人脐血间充质干细胞、骨髓内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、iPS细胞、角膜内皮细胞、角膜内皮前体细胞和角膜内皮祖细胞中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种模拟前房抗重力培养的装置，其特征在于，所述细胞的含量为细胞总数＝角膜内皮细胞密度×底面积，所述底面积为35mm培养皿的底面积。
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