JPWO2004083412A1 - 細胞培養方法及び細胞シート - Google Patents
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Abstract
Description
この懸念を解消するために、種々の提案がなされている。例えば、特公平6−104061号公報には、酵素処理を施さずに環境温度を変化させることで、増殖させた細胞を支持体表面から剥離・回収する技術が開示されている。具体的な実施例としては、ポリスチレン製のペトリ皿の表面をN−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはN,N−ジエチルアクリルアミドで被覆して電子線照射で重合させたあと、牛胎児血清(FCS)を20%含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を培地として牛の大動脈の血管内皮細胞を5%CO2中、37℃で培養して十分増殖させ、その後4℃に冷却し放置して酵素処理等を行うことなく付着培養細胞を剥離させたことが記載されている。この結果は、温度を37℃から4℃に下げることでペトリ皿の表面が疎水性から親水性へと変化したことによると記載されている。
このような温度感応性ポリマーの使用は、培養組織の剥離方法に関する1つの手法として認知されつつあるが、酵素処理を施すことなく培養組織を剥離させる方法としてより多くの選択肢を提供することは技術の発展のために必要なことである。また、温度感応性ポリマーによる方法は、単層のシートを重ねることで重層化組織を構築することができるが、単層のシートを一枚ずつ積層していくのは手間がかかる。
上述した目的の少なくとも一つを達成するために、本発明は以下の手法を採用した。即ち、本発明は、細胞を培養する細胞培養方法であって、
接着依存性の細胞に磁性微粒子を保持させることにより該細胞を磁性化する磁性化工程と、
細胞非接着性の底面を有する培養容器に前記磁性化された細胞を播種する播種工程と、
前記播種工程のあと前記磁性化された細胞を磁力によって前記培養容器の底面に吸引する吸引工程と、
前記磁性化された細胞を磁力によって前記培養容器の底面に吸引したまま所定状態になるまで培養する培養工程と、
前記磁性化された細胞が前記所定状態に達したあと前記磁力を除去することにより前記所定状態に達した細胞を前記培養容器の底面から解放する解放工程と
を含むものである。
この細胞培養方法では、細胞非接着性の底面を有する培養容器に磁性化された細胞を播種したあと、該磁性化された細胞を磁力によって培養容器の底面に吸引し、そのまま所定状態になるまで培養し、所定状態に達したあと磁力を除去することにより所定状態に達した細胞を細胞非接着性の底面から解放する。つまり、接着依存性細胞は培養容器の底面に磁力によって吸引され擬似的に接着しているに過ぎないため、磁力を除去すれば培養容器の底面から容易に解放される。したがって、酵素処理を施さずに培養容器から培養後の細胞を取り出すことができる。また、温度感応性ポリマーを使用する方法に比べて環境温度を大きく変化させることなく培養容器から培養後の細胞を取り出すことができる。
本発明の磁性化工程で用いる接着依存性の細胞(培養面に直接又は間接的に接着したあとその接着面積を広げていき、その後細胞分裂する細胞、足場依存性細胞ともいう)としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の細胞が挙げられる。この温血動物の細胞としては、例えば、角化細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞(角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、羊膜上細胞、網膜色素上皮細胞などを含む)、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれらの細胞の前駆細胞のほか、胚性幹細胞(ESC)や間葉系幹細胞(MSC)などの幹細胞や接着依存性のガン細胞が挙げられる。また、細胞非接着性の底面としては、細胞接着依存性の細胞が接着しない又は接着しにくい性質の底面であればどのようなものでもよく、ポリスチレン、ポリプロピレン、フッ素樹脂、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリカーボネート、ポリエステルなどを材質とする培養容器の底面(メンブレンでもよい)や、アガロース、寒天、ゼラチン、コラーゲン、フィブリンなどでコーティングされた培養容器の底面(メンブレンでもよい)や、陽性荷電した培養容器の底面などが挙げられる。細胞非接着性の底面を有する容器としては、例えば、コーニング社の超低接着性プレート(商品名)などが挙げられる。なお、接着しにくい性質の底面とは、磁力を除去したときに磁性化された細胞が軽く容器を振れば底面から離れる程度の接着性を持つ底面をいう。
本発明の磁性化工程で用いる磁性微粒子としては、細胞に保持されると共に保持されることで細胞に磁性を付加するものであればどのようなものでもよいが、例えば、マグネタイトなどの磁性微粒子をリポソームで封入した磁性微粒子封入正電荷リポソーム(MPCL,Magnetic particle cationic liposome)や抗体を固定化したリポソームで封入した磁性微粒子封入リポソーム(AML,Antibody−immobilized magnetoliposome)を構成する磁性微粒子であってもよいし、第一化学製品社のMACS(Magnetic Cell Sorting and Separation of Biomolecules)内の磁性マイクロビーズやベリタス社の磁性ナノパーティクル(商品名EasySep)などであってもよい。これらの磁性微粒子のうち、MPCLやAMLのようにリポソームを含む磁性微粒子は、リポソームの存在によって細胞内に取り込まれるので一つの細胞が多くの磁性微粒子を取り込むことができ、磁力によって培養容器の底面に吸引され得る程度の磁気を容易に持つことができるため、好ましい。
MPCLは、図1に一例を示すようにマグネタイト等の磁性微粒子をリポソームで封入しリポソーム間に正電荷脂質を備えた構造を持つ。多くの細胞は負電荷を有しているため正電荷を持つMPCLと結合しやすく、またMPCLはリポソームを有しているため細胞内に取り込まれやすい。このため、本発明において磁性微粒子としてMPCLを採用すれば、種々の細胞の培養に適用することができる。MPCLは、例えばJpn.J.Cancer Res.第87巻第1179〜1183頁(1996年)に記載されたマグネタイト封入正電荷リポソーム(MCL,Magnetite cationic liposome)の製造方法を参照して調製すればよい。磁性化工程でMPCLを採用するときには、MPCLを1細胞当り磁性微粒子として1〜150pg、特に20〜150pg使用することが好ましく、また、磁性化工程では培養しようとする細胞とMPCLとの接触を開始してから0.5〜8時間後、特に3〜5時間後に次工程へ進むことが好ましい。
AMLは、図2に一例を示すように、マグネタイト等の磁性微粒子をリポソームで封入しリポソーム間に抗体を備えた構造を持つ。抗体としては培養しようとする特定の細胞に特異的に結合するものを選択する。抗体と特異的に結合する部位を持つ細胞はAMLの抗体と結合しやすく、またAMLはリポソームを有しているため細胞内に取り込まれやすい。AMLは、例えばJ.Chem.Eng.Jpn.第34巻第66〜72頁(2001年)に記載された方法を参照して調製すればよい。磁性化工程でAMLを採用するときには、AMLを1細胞当り磁性微粒子として1〜150pg、特に20〜150pg使用することが好ましく、また、磁性化工程では培養しようとする細胞とAMLとの接触を開始してから0.5〜8時間後、特に3〜5時間後に次工程へ進むことが好ましい。
本発明の播種工程では、細胞種や目的とする培養組織の大きさなどによって適宜播種密度などを設定すればよいが、1×103〜1×106個/cm2の範囲で播種密度を設定するのが一般的である。
本発明の吸引工程では、磁性化した細胞を培養容器の底面に吸引する磁力を加えればよい。例えば、磁性化した細胞を培養容器の底面外側に設置した磁石により培養容器の底面に吸引する場合、磁性微粒子の種類、磁性微粒子が細胞に取り込まれた量、培養容器の底面の材質、その底面の厚さなどに基づいて、適宜磁力を決定する。
本発明の培養工程では、培養対象となる細胞の種類によって液体培地の種類を適宜選定すればよい。例えば、周知のDMEMやα−MEM、M199培地などを選定してもよい。また、EGFやFGFに代表される成長因子等の添加因子を適宜添加してもよい。この培養工程では細胞が所定状態になるまで培養するが、所定状態とは目的に応じて適宜選定すればよい。例えば、培養細胞により細胞シートが形成されるまで培養してもよく、このとき細胞シートは単層化細胞シートであってもよいし、重層化細胞シートであってもよい。あるいは、継代培養に利用する場合には、継代培養操作のしやすさを考慮して各細胞ごとに分散した状態を選定してもよい。
本発明の解放工程において磁力を除去するには、磁性化した細胞が培養容器の底面に吸引しない程度の磁力になるようにすればよい。例えば、磁性化した細胞を培養容器の底面外側に設置した磁石により培養容器の底面に吸引していた場合、磁性微粒子の種類、磁性微粒子が細胞に取り込まれた量、培養容器の底面の材質、その底面の厚さなどに基づいて、その磁石を培養容器底面から離間する距離を決定する。
本発明の細胞培養方法は、解放工程のあと所定状態に達した細胞を磁力によって回収する回収工程を含んでいてもよい。この回収工程では、培養容器に懸架用支持膜を入れ該支持膜に所定状態に達した細胞を磁力を利用して付着させて引き上げることにより回収してもよい。ここで懸架用支持膜とは、所定状態に達した細胞をほぼそのまま懸架できるものであればいずれのものでもよく、編物、織布、不織布、紙、樹脂シートなどが挙げられる。たとえば、滅菌ガーゼ、滅菌和紙、滅菌濾紙、滅菌不織布のほか、PVDF膜(ポリフッ化ビニリデン膜)やPTFE膜(ポリテトラフルオロエチレン膜)等の親水性膜(表面を親水処理したものを含む)や、シリコーンゴムなどの柔軟性のある高分子材料やポリグリコール酸、ポリ乳酸などの生分解性ポリマーや寒天培地やコラーゲンゲル、ゼラチンゲルなどのハイドロゲルなどをシート状にしたものなどが挙げられる。また、磁力としては通電・遮電により励磁・消磁を制御可能な電磁石の磁力を用いてもよい。こうすれば、所定状態に達した細胞を回収する作業を自動化しやすいばかりでなく、その後細胞を移動したりパッケージングしたりする作業も自動化しやすいため便利である。
本発明の細胞培養方法によって製造される細胞シートは、培養容器に直接接着させずに磁力によって吸引して培養したため、細胞層が複数積層しているときには細胞層のすべて又は多くが未分化細胞層となる。このような未分化細胞層が豊富な細胞シートはこれまでに知られていなかったため、例えば創傷部分へ移植した時に高い創傷治癒効果が期待される。
図2は、抗体が固定化された磁性微粒子封入リポソーム(AML)の一例の模式図である。
図3は、細胞シートの断面写真である。
図4は、培養時間とマグネタイト取り込み量との関係を表すグラフである。
図5は、培養時間と生存細胞数との関係を表すグラフである。
図6は、ヘマトキシリンとエオシンで染色したRPE(網膜色素上皮)細胞シートの断面を表す写真である。
図7は、RPE細胞シートを移送する様子を表す説明図で、(a)はシートがワイヤに付着する前の様子を表し、(b)はシートがワイヤに付着したときの様子を表し、(c)はシートがワイヤから外れたときの様子を表す。
(1)使用細胞
正常ヒト表皮角化細胞は研究用として市販されているクラボウ社製のものを用いた。表皮角化細胞の培地としては、増殖用培地として無血清培地HuMedia−KG2(クラボウ社製)を使用し、分化誘導培地としてHuMedia−KG2に塩化カルシウムを添加して総カルシウム濃度を1.0mMに調整したものを使用した。
(2)マグネタイト封入正電荷リポソーム(MCL,Magnetite cationic liposome)の調製
MCLは、Jpn.J.Cancer Res.第87巻第1179〜1183頁(1996年)に記載された方法により調製した。具体的には、まず3種類のリン脂質、即ちN−(α−トリメチルアンモニオアセチル)ジドデシル−D−グルタメート クロリド(相互薬工社製)、ジラウロイルホスファチジルコリン(シグマケミカル社製)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(シグマケミカル社製)をモル比1:2:2で含むリポソーム膜を作成し、続いて1mLのコロイド状マグネタイト(マグネタイト量20mg、マグネタイトは戸田工業社製)を添加して、周知のボルテックス法にてMCLを作成した。マグネタイト濃度はチオシアン酸カリウム法で測定したところ、18mg/mlであった。
(3)表皮角化細胞へのMCLの取り込み
表皮角化細胞を増殖用培地に懸濁して細胞懸濁液を調整し、組織培養皿(旭テクノグラス社)に1×104個/cm2となるように播種した。細胞が細胞培養皿の底面に接着するまで静置した後、増殖用培地を加えてCO2インキュベータ内で培養した。培養は37℃、5%CO2を含む加湿空気環境下で行った。1回目の培地交換では、馴化期間を過ぎ、対数増殖期にある表皮角化細胞の培地を交換したが、この際、交換用の新鮮な増殖用培地にはMCLを含ませたものを使用した。MCL濃度は表皮角化細胞の細胞数に対して1細胞当りマグネタイトとして50pgになるように添加した。この後、MCL含有増殖用培地で培養することによって、MCLを表皮角化細胞に取り込ませた。
(4)磁石を用いた細胞培養方法
MCLを取り込んだ表皮角化細胞がほぼコンフルエント状態に至ったあと、トリプシン処理によって組織培養皿の底面から細胞を剥離し、非接着性の底面を有する24ウェル超低接着プレート(Corning社製)に播種した。播種細胞数は2×106個/ウェルとなるように播種した。一方、コントロールとしてMCLを取り込ませていない表皮角化細胞を24ウェル超底接着プレートに2×106個/ウェルとなるように播種した。
播種後、各ウェルの底面外側にネオジ磁石(外形3.0cmφ、表面磁束密度0.45T)を設置したあと1日間培養し、表皮角化細胞がシート化して未分化細胞シートを形成するか否かを観察した。更に培地を分化誘導培地に交換したあとネオジ磁石を設置したままの状態で1日間培養し、表皮角化細胞が分化して重層化細胞シートを形成するか否かを観察した。その結果、MCLを取り込んでいないコントロールの表皮角化細胞は、ウェルの底面に接着せず、未分化細胞シートを形成しなかった。これに対して、MCLを取り込んだ表皮角化細胞は、5層に重層化した未分化細胞シートを形成した(図3(a)参照)。この未分化細胞シートは、ウェルの底面外側に設置したネオジ磁石を外した後、親水処理したPVDF膜(ポリフッ化ビニリデン膜)を先端に付着させた棒状のアルニコ磁石(外形1.0cmφ、残留磁束密度1.27T)を上方から培養液面に近づけることで磁力によって細胞シートを培養液面に浮上させPVDF膜を介して磁石に吸引しそのまま引き上げることにより、容易に回収することができた。また、未分化細胞シートを分化誘導培地で更に1日間培養したところ、未分化細胞の一部が分化した10層の重層化細胞シートを形成した(図3(b)参照)。この重層化細胞シートは、分化によってシートが収縮しており、ウェルの底面外側に設置したネオジ磁石を外すと培地中に浮遊し、容易にウェルの底面から剥離した。また、この重層化細胞シートは、ピンセットを用いて扱うことができるほどの強度を持っていた。
ところで、図3(c)はグリーンらの培養方法により得られた従来の細胞シートの断面図であり、書籍「人体再生」(立花隆著、中央公論新社、2000年6月10日発行)の229頁に掲載されているものである。このグリーンらの培養方法では、細胞が容器底面に接着することで自動的に分化が発生し、図3(c)のような角化した層の多い重層化細胞シートが得られたものと考えられる。これに対して、上述した実施例では、培養容器に直接接着させずに磁力で吸引して培養したため未分化のまま細胞同士が重層化したものと考えられる。ちなみに、図3(a)ではほぼすべての細胞層が未分化細胞層であり、図3(b)でも図3(c)に比べて多くの細胞層が未分化細胞層となっている。
(1)使用細胞等
正常なヒトRPE細胞として、ATCC(American Type Culture Collection)のARPE−19細胞を用いた。培養は37℃、5%CO2を含む加湿空気環境下で行った。また、培地として、DMEM/HAM’sF12に10%のウシ胎児血清と抗生物質(濃度100U/mlのペニシリンと濃度0.1mg/mlのストレプトマイシン)を添加したものを使用した。
(2)MCLの調製
MCLは、上述した実施例1の(2)と同様にして調製した。
(3)RPE細胞へのMCLの取り込み
ARPE−19細胞を培地に懸濁して細胞懸濁液を調製し、組織培養皿(旭テクノグラス社)に6×105個/cm2となるように播種した。24時間培養したのち、MCL(マグネタイト濃度25pg/cell又は50pg/cell)を含む培地に交換し、再び培養した。マグネタイト取り込みの分析を行うため、定期的にサンプリングし、チオシアン酸カリウム法で鉄分濃度を測定すると共にトリパンブルーを利用した色素排除法により生存細胞数を確認した。
ARPE−19細胞によるマグネタイトの取り込みは急速に起こった。MCLを含む培地による培養開始から8時間後、マグネタイト濃度25pg/cell、50pg/cellの培地において、細胞のマグネタイト濃度はそれぞれ10pg/cell、27pg/cellと最高値に達した(図4参照)。その後、細胞のマグネタイト濃度は細胞増殖によって希釈し、培養開始から48時間後には濃度がわずかに薄くなった。
また、MCLを含む培地(マグネタイト濃度25pg/cell、50pg/cell)におけるARPE−19細胞の増殖と、MCLを含まない培地におけるARPE−19細胞の増殖を比較し、ARPE−19細胞に対するMCLの有害性を調べた。しかし、いずれの濃度においても、MCLがARPE−19細胞の増殖を抑制することはなかった(図5参照)。したがって、その後の実験においてARPE−19細胞にマグネタイトを取り込ませる際には、マグネタイト濃度50pg/cellの培地で行った。
(4)磁石を用いた細胞培養方法
磁力によりARPE−19細胞を集積させた状態で培養することにより4mm2以下の重層化細胞シートを作製した。具体的には以下の手順により細胞シートを作製し、評価した。即ち、MCLを添加してから4時間後、細胞数3×104の細胞を24ウェル超低接着プレート(コーニング社)の中央に配した2.4mm径のクローニングリング(高さ10cm、内部面積4mm2、旭テクノグラス社)の内側に播種した。なお、細胞密度に換算すると、8×103cells/mm2となり、これはコンフルエント状態の細胞を十重にした密度に相当する。プレートの表面は親水性ヒドロゲル層である。次に超低接着プレートの表面の裏側中央に、円柱状ネオジ磁石(直径22mm、高さ10mm、4000ガウス)を配置し、プレート底面に対し垂直な磁力が発生している状態で1日培養したところ、1mm2のシート状構造を形成していた。得られたRPE細胞シートが重層化していることを確認するためその断面を観察すると、MCLを含むARPE−19細胞が厚さ60μmで15層に重層していることがわかった(図6参照)。また、ヘマトキシリン染色とエオシン染色では、RPE細胞シート内に目立った壊死部分は見られなかった。
なお、MCLを含まないARPE−19細胞を用いた場合や、MCLを取り込んだARPE−19細胞をプレート下の磁石なしで培養した場合には、細胞シートは形成されず、クローニングリングを取り除くと細胞が分散してしまった。
(5)磁石を利用した回収と移送
培養開始から1日で、24ウェル超低接着プレートの裏面の磁石を取り除いた。すると、RPE細胞シートがウェルの底面から剥離した。次に、移送機器として、図7に示すように、円柱状ネオジ磁石10(直径30mm、高さ15mm、4000ガウス)の中央に磁力で引きつけられている鉄のワイヤ12(直径2mm、長さ40mm)を用意した。このワイヤ12の先端を培地の表面に付けると、磁力によってRPE細胞シート14が表面まで破壊されることなく浮上し、ワイヤ12の先端に付着した。なお、ワイヤ12の先端の磁束密度は1100ガウスであった。そして、このワイヤ12に付着したRPE細胞シート14を、10mlの培養液の入った100mm径の組織培養皿(旭テクノグラス社)に移し、そこで磁石10をワイヤ12から外しワイヤ12を軽く叩くと、RPE細胞シートがワイヤから離れて培養液の表面に落ちた。この結果から、この移送機器によってRPE細胞シートの回収や移送が可能であると判断した。その後、その組織培養皿でRPE細胞シートを培養した。1日培養したのちには、RPE細胞シートは組織培養皿に付着した。その後更にRPE細胞シートを培養すると、16日後には細胞シートから出てきた細胞が活発に増殖していた。
なお、本発明は上記実施例に何等限定されるものではなく、本発明の技術的範囲を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施し得ることは勿論である。
Claims (12)
- 細胞を培養する細胞培養方法であって、
接着依存性の細胞に磁性微粒子を保持させることにより該細胞を磁性化する磁性化工程と、
細胞非接着性の底面を有する培養容器に前記磁性化された細胞を播種する播種工程と、
前記播種工程のあと前記磁性化された細胞を磁力によって前記培養容器の底面に吸引する吸引工程と、
前記磁性化された細胞を磁力によって前記培養容器の底面に吸引したまま所定状態になるまで培養する培養工程と、
前記磁性化された細胞が前記所定状態に達したあと前記磁力を除去することにより前記所定状態に達した細胞を前記培養容器の底面から解放する解放工程と
を含む細胞培養方法。 - 前記磁性微粒子はリポソームに封入されて磁性微粒子封入正電荷リポソーム(MPCL)を構成し、前記磁性化工程では前記細胞に前記MPCLを取り込ませることにより該細胞を磁性化する、請求項1に記載の細胞培養方法。
- 前記磁性微粒子は抗体を固定化したリポソームに封入されて磁性微粒子封入リポソーム(AML)を構成し、前記磁性化工程では前記細胞と該細胞に特異的に結合する抗体を固定化した前記AMLとを結合させることにより細胞を磁性化する、請求項1に記載の細胞培養方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の細胞培養方法であって、
前記解放工程のあと前記所定状態に達した細胞を磁力によって回収する回収工程を含む、細胞培養方法。 - 前記回収工程では、前記培養容器に懸架用支持膜を入れ該支持膜に前記所定状態に達した細胞を磁力を利用して付着させて引き上げることにより回収する、請求項4に記載の細胞培養方法。
- 前記回収工程では、前記磁力として通電・遮電により励磁・消磁を制御可能な電磁石の磁力を用いる、請求項5に記載の細胞培養方法。
- 前記接着依存性の細胞は、表皮細胞あるいは網膜色素上皮細胞である、請求項1〜6のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 前記培養工程では、前記磁性化された細胞を磁力によって前記培養容器の底面に吸引したまま細胞シートが形成されるまで培養する、請求項1〜7のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 前記培養工程では、前記磁性化された細胞を磁力によって前記培養容器の底面に吸引したまま重層化細胞シートが形成されるまで培養する、請求項8に記載の細胞培養方法。
- 請求項8又は9に記載の細胞培養方法によって製造される細胞シート。
- 細胞層が複数積層した細胞シートであって、
前記細胞層のほぼすべてが未分化細胞層である、細胞シート。 - 磁性微粒子を保持した接着依存性細胞で構成される細胞シート。
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---|---|---|---|---|
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DE102005028899B4 (de) * | 2005-06-17 | 2007-09-20 | Gkss-Forschungszentrum Geesthacht Gmbh | Hautäquivalent und Verfahren zur Erzeugung desselben |
DE102005028895A1 (de) * | 2005-06-17 | 2006-12-21 | Gkss-Forschungszentrum Geesthacht Gmbh | Verfahren zur Immobilisierung von Zellen |
US20070003528A1 (en) * | 2005-06-29 | 2007-01-04 | Paul Consigny | Intracoronary device and method of use thereof |
WO2007116594A1 (ja) * | 2006-03-30 | 2007-10-18 | National University Corporation Nagoya University | 細胞構造体の形成方法 |
US10407660B2 (en) | 2010-08-10 | 2019-09-10 | Greiner Bio-One North America, Inc. | Hardware for magnetic 3D culture |
JP5407344B2 (ja) * | 2009-01-13 | 2014-02-05 | 大日本印刷株式会社 | 生体組織の作製方法 |
JP5407343B2 (ja) | 2009-01-13 | 2014-02-05 | 大日本印刷株式会社 | 生体組織の作製方法 |
JP5407345B2 (ja) * | 2009-01-13 | 2014-02-05 | 大日本印刷株式会社 | 生体組織の作製方法 |
WO2011038370A1 (en) * | 2009-09-25 | 2011-03-31 | N3D Biosciences, Inc. | Materials for magnetizing cells and magnetic manipulation |
ES2644243T3 (es) | 2011-02-01 | 2017-11-28 | Nano3D Biosciences, Inc. | Ensayo de viabilidad celular en 3D |
JP6048839B2 (ja) * | 2011-11-08 | 2016-12-21 | 国立大学法人名古屋大学 | iPS細胞由来血管前駆細胞シート及びその作製方法 |
WO2013094369A1 (ja) | 2011-12-20 | 2013-06-27 | テルモ株式会社 | 細胞培養物移送器具 |
CN103937671A (zh) * | 2014-04-23 | 2014-07-23 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种模拟前房抗重力培养的装置 |
US20170106088A1 (en) * | 2014-06-03 | 2017-04-20 | University Of Houston System | Magnetic directed alignment of stem cell scaffolds for regeneration |
JP2016021969A (ja) * | 2014-07-24 | 2016-02-08 | 国立大学法人 東京大学 | 細胞培養装置およびこれを備える細胞培養試験観察システム |
CN106591119B (zh) * | 2015-10-15 | 2021-10-15 | 干细胞技术公司 | 细胞培养装置 |
US20200239833A1 (en) | 2017-08-08 | 2020-07-30 | Greiner Bio-One North America, Inc. | Use of magnetic cells to manipulate non-magnetic cells |
CN108559700B (zh) | 2018-01-30 | 2021-10-08 | 京东方科技集团股份有限公司 | 细胞片层转移装置和细胞片层处理系统 |
US20210231637A1 (en) * | 2018-04-27 | 2021-07-29 | Ion Chat Research Corporate | Method for measuring intracellular potential with a capacitance type potential measurement device |
SG11202101676TA (en) * | 2018-08-31 | 2021-03-30 | Fujifilm Irvine Scientific Inc | Venting system for a mixing apparatus |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002042419A2 (en) * | 2000-11-21 | 2002-05-30 | Biocrystal, Ltd. | Cell culture apparatus and methods of use |
US20030022370A1 (en) * | 2001-07-27 | 2003-01-30 | Rocco Casagrande | Magnetic immobilization of cells |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5486457A (en) * | 1993-08-25 | 1996-01-23 | Children's Medical Center Corporation | Method and system for measurement of mechanical properties of molecules and cells |
DE19716732C2 (de) * | 1997-03-07 | 1999-03-25 | Max Delbrueck Centrum | Spezifische Magnetosomen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
US6455310B1 (en) * | 1999-03-23 | 2002-09-24 | Biocrystal Ltd. | Cell culture apparatus and method for culturing cells |
US6410309B1 (en) * | 1999-03-23 | 2002-06-25 | Biocrystal Ltd | Cell culture apparatus and methods of use |
CN1302306A (zh) * | 1999-03-23 | 2001-07-04 | 日清纺织株式会社 | 聚合物、粘结剂树脂、离子导电聚合物电解质组合物和蓄电池 |
US7132275B2 (en) * | 2001-05-14 | 2006-11-07 | The John Hopkins University | Multifunctional magnetic nanowires |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002042419A2 (en) * | 2000-11-21 | 2002-05-30 | Biocrystal, Ltd. | Cell culture apparatus and methods of use |
US20030022370A1 (en) * | 2001-07-27 | 2003-01-30 | Rocco Casagrande | Magnetic immobilization of cells |
Non-Patent Citations (3)
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---|
JPN6010005465, Jpn J Cancer Res. 1996 Nov;87(11):1179−83. * |
JPN6010005468, Biochim Biophys Acta. 1983 Oct 26;735(1):193−5. * |
JPN6010005471, J Biosci Bioeng. 2002;94(6):606−13. * |
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