CN103289896A - 场效应细胞培养皿系统及应用 - Google Patents

Abstract

一种场效应细胞培养皿系统由培养皿本体和测量电路组成，培养皿本体由皿底座、皿壁、传感阵列、连接线、参考电极构成，测量电路由寻址开关、寻址控制器、电源、检流计构成。传感阵列包含了700′700个场效应传感器，场效应传感器的工作原理是耗尽型p沟道场效应细胞膜电位传感为场效应漏-源电流，细胞膜电位可以控制传感器p沟道电阻，从而控制漏-源电流。该细胞培养皿有益之处在于：(1)可以在细胞无应激的非正常生理状态下检测细胞膜电位；(2)可以检测电极性有正有负的细胞膜电位；(3)传感阵列寻址实现大区域细胞膜电位的传感，使本发明的细胞培养皿与传统细胞培养皿使用无差异，可在检测细胞膜电位中的应用。

Description

场效应细胞培养皿系统及应用

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种细胞培养皿系统，具体地说，是涉及一种细胞膜电位检测的细胞培养皿系统。 

背景技术

细胞膜电位是一种基本生物现象，它是由于细胞膜内外K⁺、Na⁺、Cl^-等离子浓度的差异产生的化学势。对于单种离子，该化学势电位V_m可以用Nernst方程描述： 

$V_m=\frac{58}{z}\ln \frac{c_e}{c_i}$

对于多种离子，该化学势电位V_m可以用Goldman-Hodgkin-Katz方程描述： 

$V_m=\frac{\mathrm{RT}}{F}\ln \frac{p_k{\left[K^{+}\right]}_e+p_{\mathrm{Na}}{\left[{\mathrm{Na}}^{+}\right]}_e+p_{\mathrm{Cl}}{\left[{\mathrm{Cl}}^{-}\right]}_i}{p_k{\left[K^{+}\right]}_i+p_{\mathrm{Na}}{\left[{\mathrm{Na}}^{+}\right]}_i+p_{\mathrm{Cl}}{\left[{\mathrm{Cl}}^{-}\right]}_e}$

不同种类的细胞，胞内外各种离子的浓度有一点差别，所表现出来的静息电位也有一点差别。但总体上说，各种细胞在静息时，胞内负离子数要多于胞外负离子数，表现出细胞静息电位为负值，如下表(R.M.Berne,M.N.Levy，Physiology,3^rd edit,Mosby Year Book)。 

当细胞膜受到各种刺激，如电刺激、机械刺激、化学刺激、生物刺激等，细胞膜上的离子选择性通道打开，膜内外离子在浓度差的作用下发生扩散，如胞外Na⁺和Cl^-向胞内扩散、胞内K⁺向胞外扩散，结果胞内总离子数呈正性。之后，胞膜上的离子选择性通道随时间关闭，这种离子扩散逐渐停止，同时，细胞膜上的Na⁺-K⁺离子泵将胞内Na⁺和K⁺泵回到原来的静息状态。这种离子转运变化导致的细胞膜电位的动态变化，就是动作电位。 

细胞膜电位的检测有电压钳技术和膜片钳技术，这两种技术是将电极插入细胞膜或贴敷在细胞膜表面，对细胞膜造成了外源性的机械刺激。细胞在这种刺激下会产生一定程度的应激，使细胞处于非正常生理状态。因此，研发一种没有外源性刺激的细胞膜电位检测 技术具有现实意义。 

Fromherz等提出了神经-硅连接，研究将蚂蝗神经元Retzius细胞贴敷在p型场效应管的裸栅极，检测动作电位作用下场效应管的漏-源电流，其电流信号与动作电位相匹配，栅极平均电压超过动作电位变化的25%，并建立神经-硅连接的阻容电路模型(Science,252,1290-1293,1991)。朱大中采用0.6μm标准CMOS工艺实现阵列式细胞电信号传感芯片，该芯片的细胞-器件连接为电极连接，并作为MOS管栅极，在2×2mm²的芯片上制备了6×6个传感器，电位范围0.1～5mV(固体电子学研究进展，25(4),507-512,2005)。施朝霞也是采用0.6μm标准CMOS工艺实现8×8阵列式传感芯片，电位范围0.1～25mV(中国发明专利申请,201110348912.4)。 

发明内容

本发明的目的是提供一种场效应细胞培养皿系统，它是由培养皿本体和测量电路构成，培养皿本体的输出与测量电路的输入连接。培养皿本体由皿底座和皿壁组成，构成一个U型容积体。皿底座是一块在N型硅半导体衬底上制备有传感器阵列、连接线和参考电极等的硅片，传感器阵列包含700×700个场效应传感器，每个场效应传感器之间相互独立。连接线一头与传感器阵列相连接，另一头连接在皿底座边缘。参考电极暴露在U型容积体内侧的皿底座表面，并用连接线连到皿底座边缘。 

场效应传感器由N型硅半导体衬底、源极、漏极、SiO₂绝缘层组成。它是在一块掺杂浓度较低、电阻率较高的N型硅半导体衬底上用光刻扩散的方法形成两个高掺杂的P型半导体区。然后，在该N型硅半导体衬底的一侧表面生长一层很薄的SiO₂绝缘层，SiO₂绝缘层外侧可以与细胞液接触。N型硅半导体衬底的另一侧在两个P型半导体区分别放置金属连接线，并引导到皿底座的边缘。这两个P型半导体区一个称为源极，另一个称为漏极。 

测量电路由电源、检流计、参考电极、寻址开关和寻址控制器等组成。寻址开关的GND端与来自培养皿本体皿底座上的参考电极连接，同时，参考电极与场效应传感器的源极连在一起。寻址开关的输入端分别与对应于培养皿本体传感器阵列上各场效应传感器的漏极连接。寻址开关的输出端和GND端与电源和检流计串联连接。检流计由检测电阻和放大器组成，并且检测电阻与放大器并联连接。 

寻址控制器输出有径寻址(LON)和纬寻址(LAT)两种寻址线，输入到寻址开关的控制端。径寻址和纬寻址的位数均为10位，可以作出1024×1024的编码，以满足700×700个场效应传感器的选择需求。在同一时刻，10位径寻址线和纬寻址线的输出均只有一位为1，其余均为0。当径寻址和纬寻址为1的地址交叉在一起时，其所对应的开关就被选通。 

本发明的另一个目的是提供一种场效应细胞培养皿系统在检测细胞膜电位中的应用。 

本发明的有益之处在于： 

(1)用细胞培养皿的形式实现对细胞膜电位检测，使细胞在无应激的非正常生理状态下检测细胞膜电位； 

(2)用耗尽型p沟道场效应作传感，可以检测电极性有正有负的细胞膜电位。 

(3)用传感器阵列寻址的方法实现大区域细胞膜电位的传感，使本发明的细胞培养皿可以与传统细胞培养皿使用无差异。 

附图说明

图1是场效应细胞培养皿测量系统示意图图。 

图2是场效应传感器工作原理图。 

图3是场效应传感器传感特性及传感过程示意图。 

图4是测量电路图。 

图5是阵列寻址示意图。 

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明加以详细说明。 

实施例1： 

参见图1，场效应细胞培养皿系统由培养皿本体1和测量电路2组成。培养皿本体1的输出与测量电路2的输入连接。培养皿本体1由皿底座3和皿壁4组成，构成一个U型容积体，用于存放细胞液。皿底座3是一块在N型硅半导体衬底9上制备有传感器阵列5、连接线6和参考电极7等的硅片，传感器阵列5包含700×700个场效应传感器8，每个场效应传感器8之间相互独立，用于感受细胞膜电位。连接线6一头与传感器阵列5相连接，另一头连接在皿底座3边缘，用于与测量电路2连接。参考电极7暴露在U型容积体内侧的皿底座3表面，作为0电位参考点，并用连接线6连到皿底座3边缘，用于与测量电路2连接。 

皿底座3选择尺寸40×40mm²；皿壁4直径30mm，高8mm；传感器阵列5区域21×21mm²；场效应传感器8区域20×20μm²；间距10μm²。在该传感器阵列5区域中可以安排700×700个场效应传感器。传感器阵列5的制备经过硅片选取、脊波导光刻、刻蚀去胶、热氧、N区光刻、N区注入、剥离光刻胶、P区光刻、P区注入、剥离光刻胶、溅射SiO₂、通孔区光刻、通孔区刻蚀、金属化、金属光刻、金属刻蚀等工艺步骤。 

实施例2： 

参见图2，场效应传感器8由N型硅半导体衬底9、源极10、漏极11、SiO₂绝缘层12组成。它是在一块掺杂浓度较低、电阻率较高的N型硅半导体衬底9上用光刻扩散的方法形成两个高掺杂的P型半导体区。然后，在该N型硅半导体衬底9的一侧表面生长一层很薄的SiO₂绝缘层12，SiO₂绝缘层12外侧可以与细胞液接触，适合于贴壁细胞培养。N型硅半导体衬底9的另一侧在两个P型半导体区分别放置金属连接线6，并引导到皿底座3的边缘。这两个P型半导体区一个称为源极10，另一个称为漏极11。 

场效应传感器8的工作原理如下： 

细胞15在SiO₂绝缘层12表面贴壁生长，并被细胞培养液16包绕。当细胞15处于静息状态时，胞内总离子数呈负性，细胞膜电位17为负极性，源极10与细胞15之间形成一个方向向上的电场。该电场在近SiO₂绝缘层12一侧形成反型层18和耗尽层19，其中反型 层18是以正电荷(空穴)为多数载流子的P型导电沟道，将源极10和漏极11连接起来。耗尽层19排斥N型硅半导体衬底9中的多数载流子(电子)，形成空间电荷隔离带，使导电沟道内的正电荷(空穴)不扩散到N型硅半导体衬底9。当细胞15处于兴奋状态时，一种是胞内总离子数负性减少，另一种是胞内总离子数为正性。对于前一种情况，反型层18宽度较小，导电沟道电阻增大，在电源13电压不变的情况下，检流计14电流I_D将减小。对于后一种情况，反型层18消失，导电沟道也随之消失，甚至于在胞内总离子数为深度正性时，耗尽层19也消失。这时，源极10-N型硅半导体衬底9为反向PN结，漏极11-N型硅半导体衬底9为正向PN结，它们是两个背靠背的二极管，不可能导电，即检流计14电流I_D为0。这种场效应传感方式称为耗尽型p沟道场效应传感技术。 

综上所述，场效应传感器8的传感特性V_m-I_D如图3所示。当细胞膜电位17随时间变化为V_m(t)，通过场效应传感器8传感特性V_m-I_D的传感，可以在检流计14获得漏极11电流I_D(t)，实现细胞膜电位17通过场效应传感器8传感为检流计14电流I_D(t)的目的。 

实施例3： 

参见图4，测量电路2由电源13、检流计14、参考电极7、寻址开关20和寻址控制器21等组成。寻址开关20的GND端与来自培养皿本体1皿底座3上的参考电极7连接，同时，参考电极7与场效应传感器8的源极10连在一起，作为0电位参考点。寻址开关20的输入端分别与对应于培养皿本体1传感器阵列5上各场效应传感器8的漏极11连接。寻址开关20的输出端和GND端与电源13和检流计14串联连接，这样，电源13和检流计14通过寻址开关20与培养皿本体1传感器阵列5上的场效应传感器8形成通电回路，参见图3。检流计14由检测电阻22和放大器23组成，并且检测电阻22与放大器23并联连接。在电源13恒定电压作用下，该通电回路电流I_D可以被检流计14检出，检测电阻22将电流I_D转换为电压，并通过放大器23放大后显示、存储、记录等。 

寻址控制器21输出有径寻址(LON)和纬寻址(LAT)两种寻址线，输入到寻址开关20的控制端。径寻址和纬寻址的位数均为10位，可以作出1024×1024的编码，以满足700×700个场效应传感器8的选择需求。在同一时刻，10位径寻址线和纬寻址线的输出均只有一位为1，其余均为0。当这两位1交叉在一起时，其所对应的开关就被选通，如图5是一个实例。设LON后六位是010000，LAT后六位是000010，经过对应位的与运算，寻址开关20对应的TES开关被选通，控制了培养皿本体1传感器阵列5上对应的场效应传感器8被选择。此刻，寻址开关20的输出端和GND端与电源13和检流计14连通，与培养皿本体1传感器阵列5上对应的场效应传感器8形成通电回路，则检流计14输出的是该场效应传感器8的细胞膜电位信号。 

实施例4： 

在海马神经元培养中的应用例。 

超净台内使用1ml0.1mg/ml的多聚赖氨酸(Poly-L-lysine，美国Sigma公司)包被在本发明细胞培养皿30min，吸弃，过夜晾干备用；75%酒精消毒清洁级健康新生24h以内的 Sprague-Dawley(SD)大鼠(浙江大学实验动物中心)，雌雄不限，体重5-7g，断头安息；取大脑海马组织，剥除脑膜和血管，放入冰浴中的解剖液(葡萄糖/蔗糖溶液，HEPES缓冲液，D1盐溶液，无菌水，pH值7.2-7.4，4℃保存)内；将海马组织切碎后，转移至3ml0.25%胰酶溶液(Trypsin，美国Amresco公司)中，37℃消化20min；吸管吸弃胰酶，用3ml37℃温浴的种植液(高糖DMEM(美国Invitrogen公司)，PBS(pH7.4)，马血清(Horse serum，HS，奥地利PAA公司)，0.2M L-谷氨酰氨(L-Glutamine，奥地利PAA公司)，抗生素(Penicillin &Streptomycin，奥地利PAA公司))中和胰酶，洗组织两遍；加入3ml种植液，先后用粗口和细口吸管轻轻吹打后离心1min，制成单细胞悬液重复2次；计数后将细胞悬液用种植液稀释，按1×10⁶/ml密度接种培养皿，2ml/皿；4h后全量换成用Neurobasal使用液(Neuronbasal培养基(美国Invitrogen公司)，0.2M L-谷氨酰氨，抗生素，B₂₇supplement)半量换液，第3天用Neurobasal使用液半量换液，加上2μl10μM阿糖胞苷(Ara-c，美国Sigma公司，再隔3天用Neurobasal使用液半量换液。 

海马神经元纯度鉴定：取出培养7天的海马神经元，吸掉培养液，用温预热下(37℃)0.01mol/L PBS(pH7.4)洗2遍，4%多聚甲醛固定30min，再用PBS轻洗2遍，用0.1%Triton X100的PBS液中孵育10min破膜，PBS洗5min，3次，滴加正常山羊血清37℃，1h封闭，滴加一抗MAP2(兔源)(阴性对照用PBS代替一抗)，4℃冰箱孵育过夜，PBS洗5min，3次，滴加二抗(羊抗兔)1:200室温90min，PBS洗5min，3次。用激光共聚焦显微镜(德国Leica)观察。 

Claims (5)

1.一种场效应细胞培养皿系统，由培养皿本体（1）和测量电路（2）构成，培养皿本体（1）的输出与测量电路（2）的输入连接，培养皿本体（1）由皿底座（3）和皿壁（4）组成，构成一个U型容积体，皿底座（3）上设有传感器阵列（5）、连接线（6）和参考电极（7），传感器阵列（5）包含700′700个场效应传感器（8），每个场效应传感器（8）之间相互独立，参考电极（7）暴露在U型容积体内侧的皿底座（3）表面，并用连接线（6）连到皿底座（3）边缘，连接线（6）一头与传感器阵列（5）相连接，另一头连接在皿底座（3）边缘；测量电路（2）由电源（13）、检流计（14）、参考电极（7）、寻址开关（20）和寻址控制器（21）组成，寻址开关（20）的GND端与皿底座（3）上的参考电极（7）连接，同时，参考电极（7）与场效应传感器（8）的源极（10）连在一起，寻址开关（20）的输入端分别与传感器阵列（5）所对应的场效应传感器（8）漏极（11）连接，输出端和GND端与电源（13）和检流计（14）串联连接，检流计（14）由检测电阻（22）和放大器（23）组成，并且检测电阻（22）和放大器（23）并联连接。

2.根据权利要求1所述的一种场效应细胞培养皿系统，其特征在于，所述的场效应传感器（8）由N型硅半导体衬底（9）、源极（10）、漏极（11）、SiO₂绝缘层（12）组成，它是在一块N型硅半导体衬底（9）上用光刻扩散形成两个P型半导体区，在N型硅半导体衬底（9）的一侧表面生长一层SiO₂绝缘层（12），另一侧在两个P型半导体区分别放置连接线（6），并引导到皿底座（3）的边缘。

3.根据权利要求1所述的一种场效应细胞培养皿系统，其特征在于，所述的寻址控制器（21）输出有径寻址和纬寻址两种寻址线与寻址开关（20）的控制端连接，径寻址和纬寻址的位数均为10位，其中一位为1，其余均为0，当径寻址和纬寻址为1的地址交叉在一起时，其所对应的开关就被选通。

4.根据权利要求1所述的一种场效应细胞培养皿系统，其特征在于，皿底座（3）是一块在N型硅半导体衬底（9）上设有传感器阵列（5）、连接线（6）和参考电极（7）的硅片。

5.根据权利要求1所述的一种场效应细胞培养皿系统在检测细胞膜电位中的应用。

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