ES2919859T3

ES2919859T3 - Métodos y aparato para la detección rápida de microorganismos infecciosos

Info

Publication number: ES2919859T3
Application number: ES12860579T
Authority: ES
Inventors: Song Shi; James Nadeau; Michael Brasch
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2022-07-28
Anticipated expiration: 2032-12-19
Also published as: US20170261464A1; JP6257523B2; CA2859914A1; US9970896B2; US20150247819A1; US9671364B2; EP2795306A1; CA2859914C; WO2013096404A1; EP2795306B1; EP2795306A4; JP2015503729A; CN104487834A; CN104487834B

Abstract

Una serie de micro cámaras (220) con transistores de efecto de campo sensibles a iones individuales (ISFET) (300) dispuestos por el mismo para monitorear la actividad de células individuales en la microarray para determinar la presencia o ausencia de microorganismos en una muestra (390). Además de la presencia o ausencia de una sola célula, ciertas realizaciones adicionales contemplan el comportamiento de la célula de monitoreo. El comportamiento celular incluye todo el rango de actividad celular, así como la respuesta celular a los cambios en las condiciones ambientales de los cambios en la respuesta debido a la adición de componentes de muestra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y aparato para la detección rápida de microorganismos infecciosos

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La sepsis es un problema de salud importante debido a su alta frecuencia de ocurrencia y alta tasa de mortalidad en los hospitales. La sepsis se caracteriza por un estado inflamatorio de todo el cuerpo, denominado síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), y por la presencia de una infección conocida o sospechada. El sistema inmunitario puede provocar esta respuesta inflamatoria como consecuencia de microbios en la sangre, la orina, los pulmones, la piel u otros tejidos, por ejemplo. Una de las principales causas de sepsis es una infección del torrente sanguíneo (BSI). La BSI se diagnostica más comúnmente mediante un hemocultivo, en el que una muestra de sangre se incuba con un medio en una atmósfera controlada para promover el crecimiento bacteriano. Los sistemas de hemocultivo automatizados actuales pueden tardar de 12 a 48 horas en detectar la presencia de microorganismos infecciosos en la sangre y pueden tardar hasta 5 días en descartar la presencia de cualquier microorganismo infeccioso. Puede llevar otras 12 a 48 horas identificar los microorganismos infecciosos mediante el subcultivo del hemocultivo positivo y la realización de pruebas de identificación y susceptibilidad antimicrobiana. Estos resultados pueden llegar demasiado tarde para alterar el curso del tratamiento y resultar en la muerte del paciente. Sería ventajoso que el tiempo necesario para detectar la presencia de microorganismos infecciosos en la sangre u otros fluidos o tejidos corporales pudiera acortarse a menos de 24 horas, y más preferentemente a menos de 8 horas. En consecuencia, se siguen buscando métodos y un aparato más eficaces en el tiempo para detectar la presencia o ausencia de microorganismos infecciosos en una muestra biológica para determinar, por ejemplo, si un paciente tiene una BSI.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En la presente memoria se describen métodos y un aparato para la detección rápida del crecimiento de microorganismos en muestras biológicas (por ejemplo, sangre) para análisis para determinar la presencia o ausencia de microorganismos infecciosos en las muestras. Los métodos y el aparato se describen en las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIGURA 1 es un esquema de un ISFET que se usa en combinación con el método y el aparato para la detección de BSI descritos en la presente memoria;

la FIGURA 2A es una vista lateral de un recipiente de recogida de muestras con una matriz de cámaras miniaturizadas que contienen ISFET dispuesta en su parte inferior;

la FIGURA 2B es una vista inferior de la matriz de cámaras miniaturizadas que contienen ISFET de la FIGURA 2A.

la FIGURA 3 es una sección esquemática de una cámara miniaturizada individual dispuesta en un ISFET; la FIGURA 4 es una sección esquemática de un transistor de efecto de campo sensible a iones de tipo p de la técnica anterior; y

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Se utilizan matrices de cámaras miniaturizadas con transistores de efecto de campo sensibles a iones individuales (ISFET) para determinar la presencia o ausencia de incluso un solo microorganismo en la muestra. Los ISFET se colocan en cámaras adaptadas para recibir muestras que pueden contener en o más microorganismos. El ISFET se coloca en la parte inferior de la cámara. En una realización, el aparato comprende una matriz con 5.000 a 10.000 cámaras. La matriz puede incluir tan solo 100 cámaras o menos, o hasta 10.000.000 de cámaras o más. La matriz puede tener una disposición de una o varias filas. Según la invención, cada cámara de la matriz incluye un ISFET individual dispuesto en el fondo de la cámara. La matriz de cámaras se dispone en la parte inferior de un tubo de recogida centrifugable. En otra realización, el aparato comprende una matriz bidimensional con hasta 10.000 filas y 10.000 columnas de cámaras, cada una con un ISFET individual, por ejemplo, construido debajo de las cámaras, preferiblemente con menos de 500 filas y 500 columnas de cámaras. En una realización, la matriz se coloca y está contenida en una carcasa que también puede acomodar muestras, ya sea antes o después de la prueba, o en ambos casos. La carcasa puede proporcionar, por ejemplo, una estructura física que contiene un gran volumen de muestras y permite que los organismos dentro de la muestra sean conducidos a los pocillos de la matriz sin necesidad de transferir manualmente la muestra a cada pocillo de forma individual. Como se describió anteriormente, la carcasa puede incluir componentes adicionales o alternativos, tal como componentes electrónicos o imanes, para proporcionar un campo electrostático o magnético al volumen de la carcasa, así como a la matriz de cámaras en la carcasa. El campo electrostático o magnético se puede utilizar para conducir microorganismos a las cámaras. Nuevamente, la configuración de la carcasa será en gran medida una cuestión de elección de diseño, según el tamaño y la configuración de la matriz, los mecanismos utilizados para conducir los organismos a la cámara subyacente, etc. Se observa que, en ciertas aplicaciones, debido a las disposiciones contempladas, es probable que los microorganismos solo acaben dispuestos en una fracción de las cámaras.

La cámara miniaturizada en la parte superior de un ISFET individual tiene un volumen que oscila entre 1 femtolitro y 1 microlitro, preferiblemente entre 1 picolitro y 1 nanolitro. El volumen de la cámara se selecciona para garantizar que el volumen del contenido sea lo suficientemente bajo para permitir la detección incluso de pequeños cambios en el entorno de la muestra (por ejemplo, pH) debido a la presencia de incluso un solo microorganismo en la cámara. La forma de la cámara y la forma de la abertura en la cámara es en gran medida una cuestión de elección del diseño. Se contemplan formas convencionales tales como rectangulares, cúbicas o cilíndricas. La pared de la cámara puede ser vertical, inclinada o de cualquier otra configuración o forma. En ciertas realizaciones, la elección del diseño dictará si la pared de la cámara se estrechará y en qué medida. El grado de estrechamiento puede afectar la capacidad de la cámara para retener la célula individual dentro de la cámara. Según la invención, la profundidad de las cámaras oscila entre aproximadamente 5 gm y aproximadamente 100 gm, y se selecciona en función de los objetivos. Por ejemplo, y no como limitación, la profundidad de la cámara puede localizar o concentrar la fuente de las señales que se están controlando. Por ejemplo, en realizaciones en las que la cámara con un volumen relativamente pequeño se coloca debajo de un volumen mucho mayor para contener la mayor parte de la muestra (tal como se describe en detalle a continuación), cierta verticalidad requerirá que los cambios en el entorno de la cámara tarden más (por ejemplo, un cambio de pH causado por protones que resultan de la actividad metabólica celular) en difundirse en alejamiento con respecto al sensor y fuera de la cámara, dando más tiempo para que se detecte el cambio. En otros ejemplos, el tamaño de la cámara puede optimizarse para acomodar uno, dos o más microorganismos dentro de la cámara. El control del número de microorganismos puede aumentar la sensibilidad de detección y acortar el tiempo de detección. El tamaño de la cámara también se puede seleccionar para permitir que las cámaras reciban microorganismos mientras se evita simultáneamente que entren en la cámara células de mamíferos más grandes. Esto permite obtener una cantidad de selectividad en el tipo de célula que se detecta. Según la invención, cada cámara tiene una abertura del orden de aproximadamente 5 gm, cuyo tamaño puede actuar como un filtro para evitar que las células de mamíferos (que pueden ser del orden de aproximadamente 10 pm) entren en la cámara, permitiendo al mismo tiempo que las células bacterianas entren en la cámara.

Se cree que la concentración de microorganismos infecciosos en una muestra (por ejemplo, sangre) puede ser tan baja como uno en diez mililitros (mL) en el momento en que se extrae la muestra de un paciente. Concentraciones tan bajas están por debajo de los límites actuales para una determinación fiable de la presencia o ausencia de los microorganismos en la muestra. Por lo tanto, los métodos conocidos para la detección requieren aumentar el número de microorganismos hasta un número/concentración capaz de una detección fiable o aumentar la sensibilidad del sensor utilizado. Otros métodos conocidos de detección utilizan un enfoque molecular que también tiene sus inconvenientes. La detección molecular que usa cebadores y sondas de nucleótidos es generalmente conocida en la técnica. Los cebadores y las sondas se hibridan con el ADN o el ARN de uno o más organismos objetivo. En dichos enfoques moleculares, los organismos (o las células de organismos multicelulares) generalmente deben destruirse para obtener el ácido nucleico que se amplificará y detectará. Dado que la cantidad de ácido nucleico así obtenido a menudo no es suficiente para obtener una señal detectable, se requieren etapas de amplificación (que se realizan en combinación con los cebadores y otros reactivos de amplificación, tales como la enzima polimerasa). Debido a que tales ensayos son específicos del objetivo, es necesario tener alguna idea de la identidad del organismo objetivo para diseñar un conjunto de cebador/sonda para la detección del objetivo. Además, los ensayos moleculares actualmente no pueden distinguir entre el ADN derivado de organismos vivos y muertos. Este inconveniente en los métodos moleculares actuales requiere la adición de etapas de preparación de muestras que retiran los ácidos nucleicos de la muestra sin origen en el organismo objetivo vivo (por ejemplo, ADN de patógeno circulante), o se debe realizar una suposición posiblemente incorrecta de que el ácido nucleico que se detecta representa una infección actual. Por lo tanto, dichos ensayos son complicados de diseñar, complicados de realizar y carecen de precisión. Por lo tanto, los ensayos que no son específicos del objetivo, pero que pueden proporcionar información sobre el objetivo, son muy deseables porque se pueden usar ampliamente.

Como se indicó anteriormente, los ISFET se utilizan para medir concentraciones de iones o cambios en las concentraciones de iones o proporciones de concentración en solución. Cuando cambia la concentración de iones (como H+), la corriente a través del transistor cambiará en consecuencia. Haciendo referencia a la FIGURA 1, en tal disposición, la solución 160 se usa como electrodo de puerta. Surge un voltaje entre el sustrato 110 y las superficies dieléctricas de puerta 170 (por ejemplo, un óxido) debido a una cubierta de iones. La hidrólisis superficial de los grupos Si-OH de los materiales de puerta 160/170 varía en soluciones acuosas debido al valor de pH de la solución. Los materiales dieléctricos de puerta 170 típicos incluyen SiO2, Si3N4, Al2O3 y Ta2O5. El ISFET 100 también tiene electrodos de fuente y drenaje 150 en contacto con regiones de fuente y drenaje de silicio dopado 120 y 130, respectivamente. Se forma un aislante 140 sobre el ISFET, con ventanas de contacto a través del aislante para los electrodos de drenaje y fuente 150. Se forma una capa de pasivación 165 sobre el dispositivo para garantizar la integridad del dispositivo a lo largo del tiempo.

Los ISFET se han utilizado anteriormente para la detección de microorganismos en agua o la producción de alimentos. Cambiaso, A., y col., "An H+-FET-based system for on-line detection of microorganisms in waters", Sensors and Actuators B 34 págs. 245-251 (1996), describe un sistema de flujo continuo con un ISFET de Si3N4 para la detección en línea de E. coli en agua. Pourciel-Gouzy M.L., y col., "Development of pH-ISFET sensors for the detection of bacterial activity", Sensor and Actuators B 103 págs. 247-251 (2004), describe el concepto de adaptación de sensores pH-ISFET para la detección de actividad de Lactobactillus acidophilus utilizando microtanques de plexiglás o PDMS. Castellarnau, M. y col., "Integrated cell positioning and cell-based ISFET biosensors", Sensors and Actuators B 120, págs. 615-620 (2007), describe un biosensor basado en células que comprende electrodos dielectroforéticos (DEP) integrados para el posicionamiento celular e ISFET. Castellarnau y col. describe además que cuando se coloca E. coli en la puerta ISFET mediante DEP local, el pH local se redujo minutos después de la adición de azúcar. Por el contrario, los valores de pH obtenidos con el ISFET de referencia o el medidor de pH comercial en solución a granel fueron mínimos. Bettaieb, F. y col., "Immobilization of E. coli bacteria in three-dimensional matrices for ISFET biosensor design", Bioelectrochemistry 71 págs. 118-125 (2007), describe un sistema electroquímico basado en un biosensor microbiano que utiliza un derivado de E. coli K-12 como transductor primario para detectar agentes biológicamente activos. Se utilizó un sensor ISFET para medir los cambios de pH de bacterias inmovilizadas en geles de agarosa. Con respecto a la medición de la actividad de una célula individual utilizando electrodos de pH, Ges, I. y col., "On-chip acidification rate measurements from single cardiac cells confined in sub-nanoliter volumes", Biomed. Microdevices 10 págs. 347-354 (2008), describe un sistema de microfluidos para atrapar y medir las tasas de acidificación de miocitos cardíacos individuales. En el dispositivo descrito por Ges y col., una solución concentrada de micotios fluye a través de un canal en un dispositivo de microfluidos PDMS transparente con sensores de electrodo de óxido de iridio integrados usando presión positiva. Una vez que las células pasan sobre el sensor, según lo confirmado con inspección visual, se aplica presión negativa para detener el flujo de la solución principal y se sellan válvulas mecánicas a cada lado del sensor para detener el flujo residual y atrapar una célula individual en la ubicación del sensor para permitir mediciones de pH. Por lo tanto, todas las referencias descritas anteriormente requieren estrategias de captura complicadas para capturar microorganismos de una sola célula, y están limitadas en la cantidad de información que pueden obtener de los microorganismos capturados.

Como se señaló anteriormente, se ha utilizado un ISFET discreto para la detección de grandes cantidades de microorganismos (o los cambios en una muestra como resultado de una gran cantidad de microorganismos) en la muestra, con concentraciones de microorganismos a menudo del orden de 108 cfu/ml en solución de muestra a granel (mililitros). Las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria requieren menos microorganismos en muestras clínicas complejas tales como sangre, esputo, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido peritoneal y orina para lograr la detección. Las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria permiten además la detección y la medición cinética de la respuesta de los microorganismos debido a perturbaciones en la muestra o las condiciones de la muestra o que resultan de la aplicación de condiciones predefinidas.

La tecnología ISFET a menor escala se ha utilizado para detectar y analizar constituyentes celulares, más particularmente, para la secuenciación del ADN. La patente US 7.948.015, de Rothberg y col., y US2010/0300895 A1, describen una matriz FET a gran escala que controla los cambios en la concentración de iones de hidrógeno para secuenciar el ADN. El ADN objetivo se une a pequeñas perlas, lo que facilita la disposición del ADN en los micropocillos de la matriz, y diferentes bases de nucleótidos fluyen secuencialmente sobre las perlas con ADN. Los eventos de unión se anotan en función de los cambios de pH en el ISFET, lo que ayuda al usuario a determinar la secuencia del ADN objetivo.

Haciendo referencia a las FIGURAS 2A-B, según la invención, se usa un tubo de recogida de muestras 200. En una realización, el tubo de muestras es un tubo de recogida centrifugable esterilizado evacuado 210, tal como un tubo BD Vacutainer®, de Becton Dickinson and Company. Una matriz de microcámaras 220 se dispone cerca de la parte inferior del tubo 210. Un ISFET 230 se dispone en la parte inferior de cada microcámara.

Según una realización, se extrae sangre de un paciente al interior del tubo 210 con reactivos estabilizadores de organismos y de lisis sanguínea contenidos en su interior. En otras realizaciones, la muestra se extrae o se obtiene de otro modo (como en el caso de hisopos para pacientes o muestras ambientales) y se somete a preparación o procesamiento de la muestra (por ejemplo, separación de otros constituyentes de la muestra) antes de agregarse al tubo 210. El tubo 210 tiene una matriz de cámaras de tamaño micrométrico 220, teniendo cada cámara de tamaño micrométrico un ISFET 230 en la base de la cámara. La matriz de microcámaras está soportada por un sustrato.

En una configuración ilustrativa, para conducir cualquier microorganismo en el tubo hacia las microcámaras, el tubo se somete a un vórtice y giro, por ejemplo, con una fuerza centrífuga relativa (RCF) de hasta aproximadamente 12 kg durante hasta a 30 minutos para completar la lisis de las células humanas en la muestra y para conducir los microorganismos en la muestra hacia las cámaras individuales de tamaño micrométrico en la base del tubo. Como resulta conocido por los expertos en la técnica, se puede usar un gel de gradiente de densidad para separar los desechos celulares humanos en la muestra de los microorganismos en la muestra. Los desechos celulares humanos lisados permanecerán en el sobrenadante, que se descarta. Para facilitar el metabolismo y el crecimiento de los microorganismos (por ejemplo, la división celular y otras actividades metabólicas capaces de ser detectadas por un ISFET), se añaden medios de crecimiento, por ejemplo, el medio BD BACTEC™ Plus Aerobic, de Becton, Dickinson and Company, a las partes de la muestra que permanecen en las cámaras de tamaño micrométrico. El ISFET proporcionará una señal si el pH de la muestra cambia, y ese cambio de pH se corresponderá con la presencia de un microorganismo en la microcámara.

Las condiciones de la muestra pueden optimizarse para recuperar microorganismos de la matriz de muestras. Por ejemplo, cuando un paciente ha sido pretratado con agentes antimicrobianos, se requiere una matriz o medio para separar el agente antimicrobiano de los microorganismos. El entorno de la muestra también puede controlarse para facilitar la detección. Por ejemplo, la muestra se puede combinar con componentes que aumentan la generación de protones por parte de los microorganismos en la muestra. La muestra puede combinarse con aditivos y someterse a condiciones que impulsen el crecimiento selectivo de ciertos organismos sobre otros. Por ejemplo, cuando las muestras contienen microorganismos de fondo no patógenos, las condiciones y los nutrientes se seleccionan para favorecer el crecimiento del microorganismo objetivo sobre los microorganismos de fondo. En una realización de la invención, habrá un pequeño número de pocillos ocupados por microorganismos en relación con el número total de pocillos debido a la pequeña concentración esperada de microorganismos en una muestra. Los pocillos vacíos se pueden utilizar como controles negativos para tener en cuenta y sustraer las señales de fondo de material tal como desechos celulares, lo que permite una mayor sensibilidad en la detección del cambio de pH en los pocillos ocupados.

Esto se explica con referencia a las FIGURAS 3-4. La FIGURA 3 ilustra un ISFET 300. El ISFET se forma sobre un sustrato de vidrio 310. Se forma una capa semiconductora 340 (por ejemplo, silicio) sobre el sustrato 310 con regiones de fuente 350 y drenaje 350 formadas en la misma. El electrodo de fuente 320 y el electrodo de drenaje 330 se forman en las regiones de fuente y drenajes 350. En la capa de silicio 340 se forma una capa de óxido de metal 360. Ejemplos de óxido de metal incluyen óxido de aluminio (AbOs), pentóxido de tantalio (TaaOs) y dióxido de silicio (SiO2). La FIGURA 4 ilustra una realización alternativa de un ISFET y se describe con más detalle en la patente US 7.948.015, de Rothberg y col.

La FIGURA 4 ilustra una sección de un ISFET 50 de tipo p (canal p) fabricado utilizando un proceso CMOS (Semiconductor de óxido de metal complementario) convencional. La fabricación de un ISFET de tipo P se basa en un sustrato de silicio 52 de tipo p, en el que se forma un pocillo 54 de tipo n que forma un "cuerpo" de transistor. Unas regiones S y D de tipo p (p+) altamente dopadas, que constituyen una fuente 56 y un drenaje 58 del ISFET, se forman dentro del pocillo 54 de tipo n. Una región B de tipo n (n+) altamente dopada también se forma dentro del pocillo de tipo n para obtener una conexión de cuerpo conductor (o "a granel") 62 con el pocillo de tipo n. Una capa de óxido 65 se dispone sobre las regiones de conexión de fuente, drenaje y cuerpo, a través de la que se practican unas aberturas para obtener conexiones eléctricas (a través de conductores eléctricos) con estas regiones; por ejemplo, el contacto metálico 66 sirve como conductor para obtener una conexión eléctrica con el drenaje 58, y el contacto metálico 68 sirve como conductor para obtener una conexión común con la fuente 56 y el pocillo 54 de tipo n, a través de la conexión de cuerpo altamente conductor 62. Se forma una puerta de polisilicio 64 sobre la capa de óxido en una ubicación sobre una región 60 del pocillo 54 de tipo n, entre la fuente 56 y el drenaje 58. Debido a que está dispuesta entre la puerta de polisilicio 64 y el cuerpo de transistor (es decir, el pocillo de tipo n), la capa de óxido 65 a menudo se denomina "puerta de óxido".

Al igual que un MOSFET, el funcionamiento de un ISFET se basa en la modulación de la concentración de carga provocada por una capacitancia MOS (semiconductor de óxido de metal) constituida por la puerta de polisilicio 64, la puerta de óxido 65 y la región 60 del pocillo 54 de tipo n entre la fuente y el drenaje. Cuando se aplica un voltaje negativo a través de las regiones de puerta y fuente (V^gs<0 voltios), se crea un "canal p" 63 en la interfaz de la región 60 y el óxido de puerta 65 al vaciar esta área de electrones. Este canal p 63 se extiende entre la fuente y el drenaje, y la corriente eléctrica se conduce a través del canal p cuando el potencial puerta-fuente V^gses lo suficientemente negativo como para atraer orificios desde la fuente hacia el canal. El potencial puerta-fuente con el que el canal 63 comienza a conducir corriente se denomina voltaje de umbral de transistor V^th(el transistor conduce cuando V^gstiene un valor absoluto mayor que el voltaje de umbral V^th). La fuente se denomina así porque es la fuente de los portadores de carga (orificios para un canal p) que fluyen a través del canal 63; del mismo modo, el drenaje es donde los portadores de carga abandonan el canal 63.

En el ISFET 50 de la FIGURA 4, el pocillo 54 de tipo n (cuerpo del transistor), a través de la conexión de cuerpo 62, es forzado a polarizarse al mismo potencial que la fuente 56 (es decir, V^sb= 0 voltios), como se ve por el contacto metálico 68 conectado tanto a la fuente 56 como a la conexión de cuerpo 62. Esta conexión evita la polarización directa de la región de fuente p+ y el pocillo de tipo n y, por lo tanto, facilita el confinamiento de los portadores de carga en el área de la región 60 en donde se puede formar el canal 63. Cualquier diferencia de potencial entre la fuente 56 y el cuerpo/pocillo tipo n 54 (un voltaje de fuente a cuerpo distinto de cero V^sb) afecta al voltaje de umbral V^thdel ISFET según una relación no lineal, y se conoce comúnmente como el "efecto de cuerpo", que en muchas aplicaciones no es deseable.

Como también se muestra en la FIGURA 4, la puerta de polisilicio 64 del ISFET 50 está acoplada a múltiples capas de metal dispuestas dentro de una o más capas de óxido adicionales 75 dispuestas sobre el óxido de puerta 65 para formar una estructura de "puerta flotante" 70. La estructura de puerta flotante se denomina así porque está aislada eléctricamente de otros conductores asociados con el ISFET; es decir, se intercala entre el óxido de puerta 65 y una capa de pasivación 72. En el ISFET 50, la capa de pasivación 72 constituye una membrana sensible a iones que da lugar a la sensibilidad a iones del dispositivo; es decir, la presencia de iones en una "solución de analito" 74 (una solución que contiene iones de interés) en contacto con la capa de pasivación 72, particularmente en un área sensible 78 sobre la estructura de puerta flotante 70, altera las características eléctricas del ISFET para modular una corriente que fluye a través del canal p 63 entre la fuente 56 y el drenaje 58. La capa de pasivación 72 puede comprender uno cualquiera de una variedad de materiales diferentes para facilitar la sensibilidad a iones particulares; por ejemplo, las capas de pasivación que comprenden nitruro de silicio u oxinitruro de silicio generalmente permiten obtener sensibilidad a la concentración de iones de hidrógeno (pH) en la solución de analito 74, mientras que las capas de pasivación que comprenden cloruro de polivinilo con un contenido de valinomicina permiten obtener sensibilidad a la concentración de iones de potasio en la solución de analito (se conocen materiales adecuados para la capas de pasivación y sensibles a otros iones tales como sodio, plata, hierro, bromo, yodo, calcio y nitrato, por ejemplo).

Con respecto a la sensibilidad a iones, surge una diferencia de potencial eléctrico, que se denomina comúnmente "potencial de superficie", en la interfaz sólido/líquido de la capa de pasivación 72 y la solución de analito 74 en función de la concentración de iones en el área sensible 78 debido a una reacción química (por ejemplo, que generalmente implica la disociación de grupos de superficie de óxido por los iones en la solución de analito en las proximidades del área sensible 78). Este potencial de superficie a su vez afecta al voltaje de umbral V^thdel ISFET; por lo tanto, es el voltaje de umbral V^thdel ISFET el que varía con los cambios en la concentración de iones en la solución de analito 74 en la proximidad del área sensible 78.

Haciendo referencia de nuevo a la FIGURA 3, en esta realización particular, la microcámara 370 se forma en el ISFET 300 y la parte de la microcámara 370 que contiene la muestra 390 se dispone sobre la región de óxido de metal 360 del ISFET 300. La microcámara se forma en un material aislante 380 (por ejemplo, nitruro de silicio (Si3N4)). En esta realización, las dimensiones de la microcámara son de 500 gm3 (10x10x50 gm). Como se indica en la FIGURA 3, la producción de H+ (es decir, protones) es una indicación de división celular. La producción de dióxido de carbono (CO2) también puede ser una indicación de metabolismo celular. Por ejemplo, la ecuación de la respiración aeróbica es C6H12O6 602 ^ 6H2O 6CO2 ATP. En otros ejemplos, la ecuación de la fermentación alcohólica de la glucosa es C6H12O6 ^ 2C2H5OH 2CO2 2ATP. En otro ejemplo, la ecuación para la fermentación del ácido láctico es C6H12O6 ^ 2CH3CHOHCOOH 2ATP. Cuando el CO2 se disuelve en agua, produce ácido carbónico, y el ácido carbónico produce un cambio de pH asociado. El número de protones o la cantidad de CO2 generada durante los procesos metabólicos o por división celular variará de un organismo a otro, al igual que el tiempo de división celular. El umbral mínimo para la detección fiable de la presencia de un microorganismo es inferior a 500.000 protones y puede ser tan bajo como 50.000 protones.

Los comportamientos celulares que pueden controlarse mediante dispositivos y métodos descritos en la presente memoria incluyen toda la gama de actividad celular (respiración, crecimiento, división celular, etc.), así como la respuesta celular a cambios en las condiciones ambientales (por ejemplo, temperatura, pH) o cambios en la respuesta debido a la adición de componentes de muestra (por ejemplo, antibióticos, antifúngicos, nutrientes, etc.). Los comportamientos celulares pueden controlarse usando una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, después de someter la muestra a condiciones que provocan el crecimiento de microorganismos en la muestra, se puede controlar la muestra para detectar un cambio en las condiciones indicativo del crecimiento de microorganismos. Como se describió anteriormente, uno de tales cambios en las condiciones puede ser la concentración de dióxido de carbono detectada en las cámaras. Se pueden generar curvas de crecimiento de microorganismos en base a estos datos. Tales curvas pueden trazar el crecimiento celular a lo largo del tiempo o los valores de una condición de muestra (por ejemplo, concentración de CO2) a lo largo del tiempo. A medida que se recogen dichos datos (generalmente en tiempo real), también se puede observar el cambio en la tasa de crecimiento o la actividad metabólica celular debido a la adición de un constituyente de muestra (por ejemplo, un antibiótico). Además, las curvas de crecimiento obtenidas pueden compararse con una o más curvas de crecimiento estándar de microorganismos conocidos para identificar el microorganismo en la muestra.

Cabe señalar que todos o algunos de los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizar de forma manual o automática. Por ejemplo, la preparación de una muestra y/o microorganismos antes de la exposición al ISFET se puede lograr mediante métodos automatizados. Las etapas automatizadas para la preparación de muestras antes del análisis del ensayo son bien conocidas en la técnica y no se describen en detalle en la presente memoria. Es más, el análisis y/o la interpretación de los datos pueden automatizarse. Tal equipo automatizado es bien conocido por los expertos en la técnica. Algunos o todos los métodos descritos en la presente memoria también pueden integrarse con otros métodos analíticos automatizados.

Aunque los métodos descritos en la presente memoria generalmente se relacionan con el análisis de muestras clínicas, los métodos y el aparato de la presente invención pueden usarse con muestras clínicas o no clínicas. Por ejemplo, las muestras clínicas que pueden analizarse incluyen cualquier tipo de muestra analizada normalmente en laboratorios clínicos o de investigación, incluidos, aunque no de manera limitativa, sangre, suero, plasma, fracciones de sangre, líquido articular, orina, semen, saliva, heces, líquido cefalorraquídeo, contenido gástrico, secreciones vaginales, homogeneizados de tejidos, aspirados de médula ósea, homogeneizados de huesos, esputo, aspirados, hisopos y enjuagues de hisopos, otros fluidos corporales y similares. La muestra se puede cultivar y se puede utilizar una muestra cultivada. Por otro lado, las muestras no clínicas que pueden analizarse incluyen, aunque no de manera limitativa, productos alimenticios, bebidas, productos farmacéuticos, cosméticos, agua (por ejemplo, agua potable, agua no potable y aguas residuales) lastres de agua de mar, aire, suelo, aguas negras, material vegetal (por ejemplo, semillas, hojas, tallos, raíces, flores, frutos), productos sanguíneos (por ejemplo, plaquetas, suero, plasma, fracciones de glóbulos blancos, etc.), muestras de órganos o tejidos de donantes, muestras de guerra biológica, jugos de frutas, jugos o lavados de carne, y champús y otros productos de consumo.

Aunque la presente invención se ha descrito con referencia a realizaciones particulares, debe entenderse que estas realizaciones son meramente ilustrativas de los principios y aplicaciones de la presente invención. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL

La presente invención se aplica a un aparato de detección de microorganismos en donde se utiliza un tubo de recogida centrifugable con una matriz de cámaras que incluyen ISFET para determinar la presencia o ausencia de microorganismos en una muestra.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Aparato para determinar la presencia de un microorganismo en una muestra, comprendiendo el aparato:

una carcasa (200) que incluye un primer extremo adaptado para recibir una muestra y un volumen para recibir la muestra en su interior; y

una matriz de cámaras miniaturizadas que contienen ISFET (220) dispuesta en el volumen de modo que la muestra recibida está sobre la matriz de cámaras (220), estando cada cámara (220) en comunicación fluida con el volumen de carcasa superior para recibir la muestra y teniendo un transistor de efecto de campo sensible a iones (230, 300) dispuesto en la parte inferior de la cámara (220), en donde el transistor de efecto de campo sensible a iones (230, 300) está configurado para detectar un cambio en la muestra indicativo de al menos uno de la presencia o ausencia o respuesta de un microorganismo en la muestra,

en donde cada cámara en la matriz de cámaras (220) tiene una altura entre aproximadamente 5 gm y aproximadamente 100 gm y un volumen que varía de 1 femtolitro a 1 microlitro, preferiblemente de 1 picolitro a 1 nanolitro,

y en donde cada cámara (220) tiene una abertura del orden de 5 gm para acomodar al menos un microorganismo recibido del volumen dentro de la cámara (220),

caracterizado por que la carcasa (200) es un tubo de recogida centrifugable (210), y en donde la matriz de cámaras (220) está dispuesta en la parte inferior del tubo de recogida (210).

2. Aparato según la reivindicación 1, que comprende además componentes electrónicos configurados para proporcionar un campo electrostático al volumen y la matriz de cámaras (220) dispuesta en el mismo.

3. Aparato según la reivindicación 1, que comprende además componentes magnéticos configurados para proporcionar un campo magnético al volumen y la matriz de cámaras (220) dispuesta en el volumen.

4. Método para determinar la presencia de un microorganismo en una muestra, que comprende:

introducir la muestra en un volumen de una carcasa (200) que tiene una matriz de cámaras miniaturizadas que contienen ISFET (220) dispuesta en el mismo,

y en donde cada cámara tiene una abertura del orden de 5 gm para acomodar al menos un microorganismo recibido del volumen dentro de la cámara (220), y

en donde la carcasa (200) es un tubo de recogida centrifugable (210) y en donde la matriz de cámaras (220) se dispone en la parte inferior del tubo de recogida (210);

someter la muestra a condiciones que hacen que al menos algunos de los microorganismos en la muestra fluyan hacia la abertura de al menos algunas de las cámaras (220) en la carcasa (200), en donde cada cámara (220) tiene un transistor de efecto de campo sensible a iones (230, 300) dispuesto en la parte inferior de la cámara (220); y

detectar un cambio en la parte de la muestra dispuesta en la cámara (220) indicativo de al menos uno de la presencia o ausencia o respuesta del microorganismo.

5. Método según la reivindicación 4, en donde se hace que los microorganismos fluyan hacia la matriz de cámaras (220) en la carcasa (200) mediante centrifugación.

6. Método según la reivindicación 4, en donde se hace que los microorganismos fluyan hacia la matriz de cámaras (220) (i) sometiendo la muestra a un campo eléctrico o (ii) introduciendo partículas magnéticas o paramagnéticas en la muestra, estando configuradas las partículas magnéticas o paramagnéticas para atraer y unir el microorganismo a las mismas, y sometiendo la muestra a un campo magnético.

7. Método según la reivindicación 4, que comprende además:

añadir agentes antimicrobianos en al menos algunas de las cámaras (220);

determinar la susceptibilidad del microorganismo a los agentes antimicrobianos comparando el cambio en la muestra detectado en una primera cámara (220) que contiene el agente antimicrobiano con un cambio en la muestra detectado en una segunda cámara (220) que no contiene el agente antimicrobiano.

8. Método según la reivindicación 4, que comprende además:

someter la muestra a condiciones que provocan el crecimiento de los microorganismos;

controlar la muestra para un cambio en las condiciones indicativo del crecimiento de microorganismos; y generar una curva de crecimiento del microorganismo en base al cambio en las condiciones de la muestra.

9. Método según la reivindicación 8, que comprende además determinar la identidad del microorganismo comparando la curva de crecimiento generada del microorganismo con una o más curvas de crecimiento estándar de microorganismos conocidos.

10. Método según la reivindicación 9, en donde generar la curva de crecimiento del microorganismo comprende controlar el crecimiento celular a lo largo del tiempo o controlar los valores de la condición de una muestra a lo largo del tiempo.

11. Método según la reivindicación 10, en donde la condición de la muestra es la concentración de dióxido de carbono.

12. Método según la reivindicación 8, en donde la curva de crecimiento se genera en tiempo real.

13. Método según la reivindicación 12, que comprende además:

añadir un constituyente a la muestra; y

determinar un cambio en la curva de crecimiento en respuesta al constituyente añadido,

en donde el constituyente es un antibiótico, un antifúngico o un nutriente para microorganismos.