JP6257523B2 - 感染性微生物の迅速な検出のための方法及び装置 - Google Patents

Description

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本出願は、２０１１年１２月２２日に出願した“Methods and Apparatus for Rapid Detection of Infectious Microorganisms”と題する米国特許仮出願第６１／５７９，３６５号の出願日の利益を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれている。

敗血症は、病院におけるその高発生頻度及び高死亡率のため、重要なヘルスケアの問題である。敗血症は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）と呼ばれる全身炎症状態によって、また、既知又は疑われる感染の存在によって特徴付けられる。免疫系が、例えば、血液、尿、肺、皮膚、または他の組織における病原菌の結果として、この炎症反応を引き起こすことがある。敗血症の主要な原因の１つは、血流感染（ＢＳＩ）である。ＢＳＩは、最も一般的には、細菌の増殖を促進するために制御された雰囲気中で血液のサンプルが培養基と共に培養される血液培養によって診断される。現行の自動血液培養システムは、１２〜４８時間かけて血液中の感染性微生物の存在を検出でき、また、任意の感染性微生物の存在を除外するために５日ほどかかる場合がある。血液培養陽性を二次培養し且つ識別及び抗菌薬感受性試験を実施することによって感染性微生物を識別するのに、別に１２〜４８時間かかることがある。これらの結果は遅すぎて治療コースを変更することができず、患者に死をもたらすことがある。血液またはその他の体液、または組織における感染性微生物の存在を検出するための時間を２４時間未満に、より好ましくは８時間未満にすることができるならば有利であろう。したがって、例えば生物学的サンプル中での感染性微生物の存在または非存在を検出して患者がＢＳＩを有するかどうかを判定するための、より時間的に効率的な方法及び装置が引き続き求められている。

本明細書において、サンプル中の感染性微生物の存在又は非存在を判定するための分析のための、生物学的サンプル（例えば、血液）における微生物の増殖の迅速な検出のための方法及び装置について記載する。一実施形態では、例えば、チャンバの基部に位置することができる個々のイオン感応電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）を持つ小型チャンバのアレイは、サンプル中の単一の微生物でさえ、その存在または非存在を判定するために用いられる。単一細胞の存在または非存在に加えて、別の特定の実施形態では、細胞の挙動を観察することを企図する。細胞の挙動は、細胞の活動の全体範囲（呼吸、増殖、細胞分裂など）、及び、環境条件（例えば、温度、ｐＨ）の変化またはサンプル成分（例えば、抗生物質、抗真菌剤、栄養素など）の添加に応答する変化に対する細胞の応答を含む。細胞の挙動は種々の公知技術を用いて観察できる。例えば、生物の増殖曲線が生成され、細胞応答に関するデータが得られる。このような曲線は、細胞の経時的な増殖またはサンプルの条件（例えば二酸化炭素濃度）の経時的な値を図で示すことができる。このようなデータの収集時（典型的にはリアルタイム）には、代謝活動のサンプル成分（例えば抗生物質）の添加に起因する、増殖速度または細胞の変化もまた観察できる。このようなデータによるサンプル成分（例えば、抗生物質）を添加する（典型的にはリアルタイムで）増殖速度または細胞の代謝活性の変化を収集されているとしても観察することができる。本明細書で開示される方法及び装置は、とりわけ、微生物検出、微生物の識別、及び、環境条件又は（例えば抗生物質のような抗菌剤）サンプル成分のいずれかの変化に対する微生物の応答の評価に用いられる。

個々のＩＳＦＥＴの上部の小型チャンバは、１フェムトリットルから１マイクロリットルに及ぶ容積を有するが、１ピコリットルから１ナノリットルが好ましい。チャンバの容積を内容物の容積が充分に小さいように選択して、たとえチャンバ内の単一の微生物の存在に起因する、サンプルの周囲の状況（environment）（例えばｐＨ）の小さな変化でさえ検出を行えることを確実にする。チャンバの形状及びチャンバ内の開口の形状は概して設計上の選択的事項である。矩形、立方体、または円筒形状など、従前の形状が考えられる。チャンバの壁は、垂直な、傾斜した、または他のどんな形状または形態にもすることができる。特定の実施形態において、チャンバの壁をテーパー状にするかどうか及びどの程度までするかは、設計上の選択により決定されるであろう。テーパーの角度は、チャンバが単一の細胞をチャンバ内に保持する能力に影響を及ぼすことができる。ウェルの深さもまた、目的に基づいて例えばおよそ５μｍからおよそ１００μｍに選択することができる。限定のためではないが、例えば、チャンバの深さによって、観察されている信号の発生源を特定することまたは集中させることができる。例えば、相対的に小容積のチャンバがサンプルのバルクを保持するためのより大容積のすぐ下に配置される（以下で詳述される）実施形態において、特定の垂直な状態は、チャンバの周囲状況における変化（例えば、細胞の代謝活性により生じるプロトンによって引き起こされるｐＨ変化）がセンサから及びチャンバから広がるのにもっと時間がかかることを必要とし、その変化を検出するにはより多くの時間がかかる。別の例において、チャンバの大きさを最適化して、一つか二つ、または二つよりもっと多い微生物をチャンバ内に収容して、検出感度を向上し、及び、検出時間を短縮できる。チャンバの大きさを選択して、微生物を収容する一方で、哺乳動物のより大きな細胞が同時にチャンバ内に侵入することが防止される。したがって、チャンバ設計は、検知される細胞のタイプの選択性を提供することができる。

一実施形態において、装置は５，０００乃至１０，０００のチャンバを持つアレイからなる。アレイは１００またはもっと少なチャンバを含んでもよいし、１０，０００，０００またはもっと多いチャンバを含んでもよい。アレイサイズは概して設計上の選択的事項である。例示的なアレイサイズが本明細書に記載されているが、本明細書に記載の実施形態を他のアレイサイズに容易に適合させることができる。アレイは、単一または複数列配列とすることができる。上述したとおり、アレイ内の各チャンバは、例えば、チャンバ底部に配置されることができる個々のＩＳＦＥＴを有する。本明細書に記載の実施形態は、チャンバの底部にＩＳＦＥＴが配置されるものとして説明したが、チャンバ内でのＩＳＦＥＴの配置は限定されない。チャンバ内でのＩＳＦＥＴの配置は設計上の選択的事項である。別の実施形態において、装置は、例えばチャンバの下部に造られた個々のＩＳＦＥＴをそれぞれが持つ、最大で１０，０００列及び１０，０００行のチャンバの２次元アレイからなることができ、５００列及び５００行のチャンバより少ないことが好ましい。

一実施形態において、アレイは、サンプルを試験する前、試験した後、或いはその両方のいずれの場合にも収容（receive）することもまたできるハウジング内に置かれ、また該ハウジングに収容（contain）される。ハウジングは、例えば、大きなサンプル容積をもち、サンプルを手作業によって各ウェルに個別に移動させる必要なしに、サンプル中の微生物をアレイのウェル内へ移すことを可能にする物理構造を備えていてよい。さらに、ハウジングの構成は概して設計上の選択的事項であり、アレイサイズや構成、下に置くチャンバ内に有機体を移すために用いるメカニズムなどに基づくものである。例えば、ハウジングは、微生物をチャンバ内に移すことができる静電界を発生させる電子素子を、追加的または代替的に含むことができる。ハウジングはまた、磁界を発生させるコンポーネントを含んでもよい。磁界を用いて、微生物を磁性粒子または常磁性粒子に結び付けるかそうでなければ結合させることによって、微生物をチャンバ内へ導く。

一例では、ハウジングは、サンプルを受容するように適合された第一の端部、及び、サンプルをその中に受容するための容積を含む。サンプルがハウジング内でチャンバのアレイの上にあるように、チャンバのアレイが容積内に配置される。各チャンバは、オーバーレイハウジングの容積と流体連通しており、その中に配置されたＩＳＦＥＴを有し、ＩＳＦＥＴは、サンプル中の微生物の存在または非存在または応答の少なくとも一つを示す、サンプルにおける変化を検出するように構成されている。

なお、特定の用途では、構成要素の配置及びサンプル中の微生物の凝縮によっては、しばしば微生物が最後にはチャンバのうちほんのわずかにしか行かないであろうことが予想されることに留意されたい。“空の”チャンバは、チャンバ内の微生物の活動に対する条件の変化が観察されているチャンバからのバックグラウンド信号を差し引く制御して使用できる。

ＩＳＦＥＴ製造用の基板は、シリコン、ガラス、セラミックまたはプラスチック材料で作ることができる。ＩＳＦＥＴは当業者に周知であり、本明細書では詳細に説明しない。ＩＳＦＥＴ及びＩＳＦＥＴの製造について、Hsiaoらによる"DNA Cell Conjugates"と題された国際公開第２０１０１１８２３５号パンフレット、Rothbergらによる"Methods and Apparatus for Measuring Analytes Using Large Scale FET Arrays"と題された米国特許第７，９８４，０１５号明細書、及び、M. Gotohの"Construction of Amorphous Silicon ISFET, " Sensors and Actuators, Vol. 16, pp. 55-65 （1989）が記載しており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。典型的には、ＩＳＦＥＴはｎ型またはｐ型シリコン半導体材料上に構築される。本明細書が開示するＩＳＦＥＴ装置の一実施形態はまた、最新の液晶ディスプレイの駆動に用いられるアクティブマトリクス薄膜トランジスタ（ＴＦＴ）のように、経済的にガラス基板上に構築することができる。ＩＳＦＥＴをセラミックまたはプラスチック基板上に構築することもまた考えられる。

概して、提案の方法は、チャンバと統合された個々のＩＳＦＥＴをもつ小型チャンバのアレイの製造を含み、統合されたチャンバ／ＩＳＦＥＴは、例えば、サポート基板上に配置される。この方法はまた、個々のチャンバに微生物を入れることを可能にするシステムと流体連通した小型チャンバを配置することを含む。上述したように、チャンバを、単一の微生物または２以上の微生物を収容するように設計してもよい。サンプル中の微生物（存在する場合）を「移す（drive）」ためのメカニズムは、例えば遠心分離を含む。本明細書において企図される他のドライブ機構として、前述したような静電気及び／または磁気力によるもの、または、音波力、親和力、重力などによるものがある。選択されたメカニズムは微生物を首尾よくチャンバ内に移すが、微生物の生存能力に悪影響を及ぼすことはない。この方法はさらに、微生物増殖のための条件を作成するための増殖培養基の、サンプルへの添加を企図する。容積が少ないと、ｐＨまたはチャンバ内の微生物の存在及び／または応答を示す他のサンプル条件のわずかな変化でさえ、ＩＳＦＥＴによって検出が可能になる。

例えば、種々の微生物は種々の培養基、抗生物質、及び／または、固有の基質（すなわち、特定の微生物に固有の酵素により識別される栄養素）に対し違ったように且つ識別可能なように応答する。したがって、特定の添加剤に応答する微生物の代謝活性を示す変化についてチャンバ内の条件を観察すると、成長できる微生物が存在するという指示に加えて、微生物の同一性に関する情報を得ることができる。例えば、抗菌剤を含有する１つのチャンバ内のサンプルにおける変化と抗菌剤を含有しない別のチャンバ内のサンプルにおける変化を比較して、チャンバ内の微生物の抗菌剤に対する感受性を判定することができる。さらに、未知の微生物が既知の化合物に代謝的にどのように応答するかに基づき、サンプル中の未知の微生物を特定できる。本発明の実施形態は、さらに、信号の検出を増幅する化合物の、サンプルへの添加を企図する。例えば、特定の糖分の代謝は、酸及び／または二酸化炭素、次にＩＳＦＥＴによる検出に相応大きい信号を生成するそれらの産生を比較的多く生成する。このような糖分は、ここでは“インデューサ基質（inducer substrates）”と呼ばれ、検出または測定を増進し／促進する、微生物における特定の応答を誘導する。

上述したように、様々なメカニズムを用いて、微生物をチャンバ内に移すことができる。微生物をＩＳＦＥＴの頂部上の個々のチャンバ内に位置させる方法は、遠心分離、直流電界、及び、電気泳動を含む。代替的に、ラテックスビーズまたは磁性ビーズなどの、ＩＳＦＥＴの頂部上の個々のチャンバのサイズよりも小さい固体オブジェクトは、微生物結合リガンドで官能化できる。次いで、微生物を含むサンプルは官能化ビーズと混合され、微生物はビーズ上のリガンドと結合される。結合された微生物をもつビーズは、次いで、ＩＳＦＥＴの頂部上のチャンバ内へ、遠心分離または磁界などの重力または外力によって移される。ビーズに添付されるリガンドは、アポリポタンパク質Ｈ、フィブロネクチン、レクチン、及び、マンノース結合レクチンなどの、当業者に公知の非特異性微生物結合因子から選択することができる。ビーズに添付されるリガンドはまた、汎グラム陽性抗体、汎グラム陰性抗体、パン酵母抗体、病原体特異的抗体などの、種々の特定の微生物結合因子の組み合わせとすることができる。

本明細書に記述されるＢＳＩ検出のための方法及び装置に関連して用いられるＩＳＦＥＴの概略図である。 小型ＩＳＦＥＴ含有チャンバのアレイを底部に配置されて有するサンプル採取容器の側面図である。 図２Ａの小型ＩＳＦＥＴ含有チャンバのアレイの底面図である。 ＩＳＦＥＴ上に配置される個々の小型チャンバのアレイの概略断面図である。 別の従来技術のｐ型イオン感応電界効果トランジスタの概略断面図である。

個々のイオン感応電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）を持つ小型チャンバのアレイは、サンプル中の単一の微生物でさえ、その存在または非存在を判定するために用いられる。一つまたはそれよりも多くの微生物を含む可能性があるサンプルを収容（receive）するのに適合したチャンバ内に、ＩＳＦＥＴが置かれる。ＩＳＦＥＴはそのチャンバ内に置かれる。特定の実施形態において、ＩＳＦＥＴはチャンバの底部に置かれる。一実施形態において、装置は５，０００乃至１０，０００のチャンバを持つアレイからなる。アレイは１００またはもっと少なチャンバを含んでもよいし、１０，０００，０００またはもっと多いチャンバを含んでもよい。アレイは、単一または複数列配列とすることができる。上述したとおり、アレイ内の各チャンバは、個々のＩＳＦＥＴを、例えば、チャンバ底部に配置されて有する。別の実施形態において、装置は、例えばチャンバの下部に造られた個々のＩＳＦＥＴをそれぞれが持つ、最大で１０，０００列及び１０，０００行のチャンバの２次元アレイからなることができ、５００列及び５００行のチャンバより少ないことが好ましい。一実施形態において、アレイは、サンプルを試験する前、試験した後、或いはその両方のいずれの場合にも収容（accommodate）することもまたできるハウジング内に置かれ、また該ハウジングに収容（contain）される。ハウジングは、例えば、大きなサンプル容積をもち、サンプルを手作業によって各ウェルに個別に移動させる必要なしに、サンプル中の有機体をアレイのウェル内へ移すことを可能にする物理構造を備えていてよい。上述したとおり、ハウジングは、ハウジング内のチャンバのアレイにだけでなくチャンバの容積にも電界または磁界を印加する電気的要素または磁気的要素などの、追加的または代替的な要素を有していてよい。電界または磁界を用いて、微生物をチャンバ内へ移すことができる。さらに、ハウジングの構成は概して設計上の選択的事項であり、アレイサイズや構成、下に置くチャンバ内に有機体を移すために用いるメカニズムなどに基づくものである。注意すべきは、特定の応用においては、熟慮した構成（arrangement）のため、微生物は最後には一部のチャンバ内だけになる可能性があることである。

個々のＩＳＦＥＴの上部の小型チャンバは、１フェムトリットルから１マイクロリットルに及ぶ容積を有するが、１ピコリットルから１ナノリットルが好ましい。チャンバの容積を内容物の容積が充分に小さいように選択して、たとえチャンバ内の単一の微生物の存在に起因する、サンプルの周囲の状況（environment）（例えばｐＨ）の小さな変化でさえ検出を行えることを確実にする。チャンバの形状及びチャンバ内の開口の形状は概して設計上の選択的事項である。矩形、立方体、または円筒形状など、従前の形状が考えられる。チャンバの壁は、垂直な、傾斜した、または他のどんな形状または形態にもすることができる。特定の実施形態において、チャンバの壁をテーパー状にするかどうか及びどの程度までするかは、設計上の選択により決定されるであろう。テーパーの角度は、チャンバが単一の細胞をチャンバ内に保持する能力に影響を及ぼすことができる。ウェルの深さもまた、目的に基づいて例えばおよそ５μｍからおよそ１００μｍに選択することができる。限定のためではないが、例えば、チャンバの深さによって、観察されている信号の発生源を特定することまたは集中させることができる。例えば、相対的に小容積のチャンバがサンプルのバルクを保持するためのより大容積のすぐ下に配置される（以下で詳述される）実施形態において、特定の垂直な状態は、チャンバの周囲状況における変化（例えば、細胞の代謝活性により生じるプロトンによって引き起こされるｐＨ変化）がセンサから及びチャンバから広がるのにもっと時間がかかることを必要とし、その変化を検出するにはより多くの時間がかかる。別の例において、チャンバの大きさを最適化して、一つか二つ、またはもっと多い微生物をチャンバ内に収容するようにしてよい。微生物の数を制御することによって、検出感度を向上でき、及び、検出時間を短縮できる。チャンバの大きさを選択して、微生物をチャンバに収容できるようにする一方で、哺乳動物のより大きな細胞が同時にチャンバ内に侵入することを防止することができる。これによって、検出する細胞のタイプの選択量が提供される。例示であって限定ではないが、チャンバはおよそ５μｍオーダーで開口を有していてよく、この大きさがフィルタとして動作して、（およそ１０μｍオーダーであろう）哺乳動物の細胞がチャンバに侵入することを防止する一方、細菌性の細胞をチャンバに侵入させることができる。

サンプル（例えば血液）中での感染性微生物の濃縮（concentration）は患者からサンプルが抜き取られた時点では１０ミリリットル（ｍＬ）中に一つにすぎないと考えられている。このような低濃縮は、サンプル中の微生物の存在または非存在についての信頼できる判定のための最新のリミット（current limits）より下である。したがって、知られている検出方法は、微生物の数が信頼に足る検出を行える数／濃縮になるまで培養すること、または、使用するセンサの感度を増大することを必要とする。他に知られている検出方法は、これもまた欠点を有する分子手法（molecular approach）を用いる。ヌクレオチドプライマ及びプローブを用いる分子検出が当技術分野で一般に知られている。プライマとプローブは、一つまたはもっと多いターゲット有機体のＤＮＡまたはＲＮＡへ異種交配する。このような分子手法では、一般に有機体（または多細胞有機体の細胞）は破壊され、増幅及び検査されるべき核酸が得られる。このように得られた核酸の量は検出可能な信号を得るにはしばしば十分ではないため、増幅ステップ（このステップは、プライマ及びポリメラーゼ酵素などの他の増幅試薬と関連して実行される）が必要になる。このような分析試料はターゲットに固有であるため、ターゲット検出のためのプライマ／プローブのセットを設計するために、ターゲット有機体の同一性について少なくも幾つかのアイデアがなければならない。さらに、分子の分析試料によって、生体から得られたＤＮＡと死んだ有機体を現時点では区別することができない。このような最新の分子方法における欠点は、核酸を生きたターゲット有機体（例えば循環病原体ＤＮＡ）由来ではない検体から除去する、サンプル準備ステップの追加を必要とすること、または、検出された核酸が最新の感染症を表すという推定が誤ってされる可能性があり得ることである。したがって、このような分析試料は設計には複雑であり、実施には複雑であり、精確さに欠けている。したがって、ターゲット固有ではなく、ターゲットについて情報を生み出すことのできる分析試料が、広範な配置が可能であることから、大いに望まれている。

上述したとおり、ＩＳＦＥＴｓは溶液中のイオン濃縮、イオン濃縮における変化、または濃縮比を測定するために用いられる。イオン（Ｈ^＋など）濃縮が変化すると、トランジスタを流れる電流がそれに応じて変化する。図１を参照すると、このような構成にあっては、溶液１６０がゲート電極として用いられる。イオンの被覆によって、基板１１０とゲート誘電（例えば酸化物）面１７０の間に電圧が生じる。ゲート材料１６０／１７０のＳｉ−ＯＨ群の表面の加水分解は、水溶液中でその溶液のｐＨ値に起因して変化する。典型的なゲート誘電材料１７０は、ＳｉＯ_２，Ｓｉ_３Ｎ_４，Ａｌ_２Ｏ_３及びＴａ_２Ｏ_５を含む。ＩＳＦＥＴ１００はまた、シリコンをドープしたソース領域及びドレイン領域１２０及び１３０と接触するソース電極及びドレイン電極１５０を夫々有する。絶縁体１４０がＩＳＦＥＴ上に形成され、絶縁体を貫く、ソース電極及びドレイン電極１５０のためのコンタクト窓を持つ。保護層１６５がデバイス上に形成され、デバイスの長期にわたる完全性が保証される。

ＩＳＦＥＴは従前、水中または食品の製造における微生物の検出に用いられてきている。Ａ．Ｃａｍｂｉａｓｏらによる”An H⁺-FET-based system for on-line detection of microorganisms in waters”, Sensors and Actuators B 34 （1996）の２４５−２５１頁では、Ｓｉ_３Ｎ_４ＩＳＦＥＴを持った、水中の大腸菌のオンライン検出のためのフローシステムについて説明している。Ｍ．Ｌ．Ｐｏｕｒｃｉｅｌ−Ｇｏｕｚｙらによる”Development of pH-ISFET sensors for the detection of bacterial activity”, Sensors and Actuators B 103 （2004）の２４７−２５１頁では、プレクシグラス（商標）またはPDMSマイクロタンクを用いたアシドフィルス菌の活動の検出のためのｐＨ−ＩＳＦＥＴの適応の概念について説明している。Ｍ．Ｃａｓｔｅｌｌａｒｎａｕらによる”Integrated cell positioning and cell-based ISFET biosensors”, Sensors and Actuators B 120 （2007）の６１５−６２０頁では、細胞のポジショニングのための集積した二電子電極及びＩＳＦＥＴから成るセルベースのバイオセンサについて説明している。Ｃａｓｔｅｌｌａｒｎａｕらはさらに、大腸菌が局部ＤＥＰのそばのＩＳＦＥＴゲート上にあるときは、糖分を加えた後すぐに局所的なｐＨが低下したことを説明している。これに対して、バルク溶液中で基準ＩＳＦＥＴにより、または商業的なｐＨメーターにより得られたｐＨ値は最小であった。Ｆ．Ｂｅｔｔａｉｅｂらによる”Immobilization of E. coli bacteria in three-dimensional matrices for ISFET biosensor design”, Bioelectrochemistry 71 （2007）の１１８−１２５頁では、生化学的に活発な化学物質を検出するための主トランスジューサとして大腸菌Ｋ−１２派生物を用いた微生物バイオセンサに基づく電気化学システムについて記述している。ＩＳＦＥＴセンサを用いてアガロースゲル中で固定化した細菌のｐＨの変化を測定した。ｐＨ電極を用いた単一細胞の活動の測定について、Ｉ．Ｇｅｓらによる”On-chip acidification rate measurements from single cardiac cells confined in sub-nanoliter volumes”,Biomed. Microdevices 10 （2008）の３４７−３５４頁では、単一の心筋細胞の酸性化速度をトラップして測定するための微小流体システムについて記述している。Ｇｅｓらが記述したデバイスにおいては、濃縮したマイコタイズ（mycotyes）の溶液が、陽圧を用いた集積した酸化イリジウム電極センサを持つクリアなＰＤＭＳ微小流体デバイス内の流路を通って流れる。細胞がセンサを通過すると、目視検査で確かめられるように、陰圧が加わって溶液の主流を止め、そして、機械式バルブがセンサの各サイドで密閉されて残りの流れを止め且つセンサ位置で単一の細胞をトラップしてｐＨ測定を可能にする。したがって、上述した文献はすべて、単一細胞微生物を捕捉するために複雑な捕捉ストラテジーが必要であり、且つ、捕捉した微生物から入手することができる情報量に制約がある。上述した文献はすべて、本明細書に参照のため組み込まれる。

上述したとおり、個別のＩＳＦＥＴが、サンプル中の大量の微生物（またはサンプル中の多数の微生物の結果としての変化）であって微生物の濃縮をしばしばバルク（ミリリットル）サンプル溶液中で１０^８ｃｆｕ／ｍｌのオーダーでもつ微生物の検出に用いられてきた。明細書において説明される本発明の実施形態では、血液、痰、唾液、脳脊髄液、胸膜液、腹水、尿などの複雑な臨床検体中に微生物がより少ないことが、検出をやり遂げるために必要とされる。明細書において説明される本発明の実施形態では、さらに、予め定義された条件の適用から生じる、サンプルまたはサンプル条件の変動による微生物応答の検出または反応速度測定を可能にする。

より小スケールのＩＳＦＥＴテクノロジーが、細胞の構成物質を検出及び分析するために、より詳細にはＤＮＡ塩基配列決定法に用いられてきた。Ｒｏｔｈｂｅｒｇらの米国特許明細書第７，９４８，０１５号もまた参照により本明細書に組み込まれるが、ここでは、水素イオン濃縮における変化を観察してＤＮＡを配列する大規模ＦＥＴアレイについて記述されている。ターゲットＤＮＡが小さなビーズに結合し、このためＤＮＡをアレイのマイクロウェル中に置くことが容易になり、そして、種々のヌクレオチド塩基がＤＮＡと一緒のビーズ上を連続して流される。結びつく事象は、ｐＨ変化に基づいてＩＳＦＥＴにおいてノートされ、ユーザーがターゲットＤＮＡの配列を判定する助けになる。

一実施形態において、図２Ａ−Ｂを参照すると、サンプル採取管２００が備えられている。一実施形態において、このサンプル管は、Becton Dickinson and Company のBD Vacutainer（登録商標） tubeなどの、真空の無菌遠心式採取管２１０である。マイクロチャンバのアレイ２２０は管２１０の底部近くに配置される。図示の実施形態において、ＩＳＦＥＴ２３０が各マイクロチャンバの底部に配置される。

一実施形態によれば、血液が患者から管２１０へと、それに含まれる有機体安定化及び血液溶解反応物と一緒に抜き取られる。別の実施形態では、サンプルが抜き取られまたはそうでなく取得されて（患者スワブのためまたは環境サンプルの場合など）、準備すなわちサンプル処理（例えば、他のサンプル成分からの分離）を、管２１０に加えられる前に受ける。上述したとおり、この特定の実施形態において、管２１０はミクロンサイズのチャンバ２２０のアレイを備え、それぞれのミクロンサイズチャンバはチャンバ基部にＩＳＦＥＴ２３０を有する。ミクロンチャンバアレイは基板により支持されている。

一つの例示的な構成において、管内の微生物をマイクロチャンバ内へ移すために、管は、例えば最長３０分の間に最大約１２ｋｇの相対的遠心力（ＲＣＦ）での渦巻きまたはスピンにさらされて、サンプル中の人体細胞の溶解を完全なものにし、そしてサンプル中の微生物を管の基部にあるミクロンサイズのチャンバの銘々の中へ移す。当業者に知られているとおり、密度勾配ゲルを用いてサンプル中の人体細胞の破片をサンプル中の微生物から分離することができる。溶解した人体細胞の破片は上澄みの中に残るが、廃棄される。微生物の代謝及び増殖を促進するために、培養基、例えば、Becton Dickinson and Company によるBD BACTEC（登録商標）Plus Aerobic mediumなどが、ミクロンサイズのチャンバ内に残っているサンプルの部分に加えられる。サンプルのｐＨが変化するとＩＳＦＥＴが信号を出力し、ｐＨ変化は、マイクロチャンバ内の微生物の存在と同等であるとみなされる。

サンプルの条件を最適化して検体母体（specimen matrix）から微生物を回復してもよい。例えば、患者が事前に抗菌処置されている場合、微生物から抗菌を分離するために母体また培養基が必要である。サンプル環境を制御して検出を容易にしてもよい。例えば、サンプルは、サンプル中で微生物によるプロトンの発生を増やす成分と結合することができる。サンプルは添加物と結合することができ、特定の有機体の選択的増殖を他に対し駆り立てる条件にさらされることができる。例えば、サンプルが付随の非病原性微生物を含んでいる場合、条件と栄養を選択すると、付随の微生物より目的の微生物の増殖に好都合となる。

本発明の一実施形態において、微生物が占有する、ウェルの総数に対して少数のウェルが、サンプル中の微生物の予期される小さな濃縮に起因して存在する。空いているウェルを負の制御として使用して、細胞の破片などの物質からの背景信号を明確にし（account for）及び抽出し、占有されるウェル内のｐＨ変化のより高い検出感度を可能にする。

このことについて図３−４を参照して説明する。図３はＩＳＦＥＴ３００を表している。ＩＳＦＥＴはガラス基板３１０上に形成されている。基板３１０上には、ソース３５０及びドレイン３５０領域が形成された半導体層（例えばシリコン）３４０が形成されている。ソース電極３２０及びドレイン電極３３０がソース及びドレイン領域３５０上に形成されている。シリコン層３４０上には金属酸化層３６０が形成されている。金属酸化物の例として、酸化アルミニウム（Ａｌ_２Ｏ_３）、酸化タンタル（Ｔａ_２Ｏ_５）、及び、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）を含む。図４はＩＳＦＥＴの別の実施形態を表し、Ｒｏｔｈｂｅｒｇらの米国特許明細書第７，９４８，０１５号でより十分に説明されている。

図４は、従来のＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor; 相補型金属酸化膜半導体）プロセスを用いて製造されたｐ型（ｐチャンネル）ＩＳＦＥＴ５０の断面を表す。ｐ型ＩＳＦＥＴの製造はｐ型シリコン基板５２に基づき、そこには、トランジスタ“ 本体”を形成するｎ型ウェル５４が形成される。十分にドープした、ＩＳＦＥＴのソース５６及びドレイン５８を構成するｐ型（ｐ^＋）領域Ｓ及びＤが、ｎ型ウェル５４内に形成されている。十分にドープしたｎ型（ｎ^＋）領域Ｂもまたｎ型ウェル内に形成されており、導電体（または“バルク”）接続６２をｎ型ウェルに提供している。酸化層６５が、ソース、ドレイン、及び、導電体接続上に配置され、開口がこの層を通じて作られて、これらの領域に (電気伝導により)電気的接続を提供する。例えば、金属コンタクト６６はドレイン５８への電気的接続を提供する導体として働き、金属コンタクト６８はソース５６への及び高度導電体接続６２を介するｎ型ウェル５４への電気的接続を提供する導体として働く。ポリシリコンゲート６４が上記酸化層上の、ソース５６とドレイン５８の間のｎ型ウェル５４の領域６０の上の位置に形成されている。ポリシリコンゲート６４とトランジスタ本体（すなわち上記ｎ型ウェル）に配置されているために、酸化層６５はしばしば“ゲート酸化物”と呼ばれる。

ＭＯＳＦＥＴと同様、ＩＳＦＥＴの動作は、ポリシリコンゲート６４、ゲート酸化物６５、及び、ソースとドレインの間のｎ型ウェル５４の領域６０により構成されるＭＯＳ（Metal-Oxide-Semiconductor）キャパシタにより引き起こされる電荷の集中の変調に基づく。負の電圧（Ｖ_ＧＳ＜０ボルト）がゲートソース領域間に印加されると、領域６０とゲート酸化物６５のインターフェイスにおいて、このエリアの電子を激減させることで“ｐチャンネル６３”が作られる。ｐチャンネル６３がゲートソース間に延在し、ゲートソース電位Ｖ_ＧＳがソースからチャンネルへ正孔を引き寄せるのに十分な負電位のときは、電流がｐチャンネルを通じて導電する。チャンネル６３が電流を導電し始めるゲートソース電位はトランジスタの閾値電圧Ｖ_ＴＨと呼ばれる（トランジスタはＶ_ＧＳの絶対値が閾値電圧Ｖ_ＴＨより大きくなると導通する）。ソースは、チャンネル６３を通って流れる電荷キャリア（ｐチャンネルの正孔）のソースであることから、そのように名づけられた。同様に、ドレインは電荷キャリアがチャンネル６３を離れるところである。

図４のＩＳＦＥＴ５０において、ｎ型ウェル５４(トランジスタ本体)は、ソース５６及び導電体接続６２の両方に接続された金属コンタクト６８によってわかるように、導電体接続６２を介して強制的にソース５６と同電位（すなわち、Ｖ_ＳＢ＝０ボルト）にバイアスされる。この接続により、ｐ^＋ソース領域とｎ型ウェルの順バイアスを防止し、それによって、領域６０のチャンネル６３が形成されるエリアへの電荷キャリアの閉じ込めが促進される。ソース５６と本体／ｎ型ウェル５４の間のどんな電位差（非ゼロのソース本体電圧Ｖ_ＳＢ）も非線形関係に従ってＩＳＦＥＴの閾値電圧Ｖ_ＴＨに影響し、通常、“ボディエフェクト”と呼ばれており、これは多くの応用において好ましくない。

また、図４に表されたとおり、ＩＳＦＥＴ５０のポリシリコンゲート６４が、ゲート酸化物６５の上に配置された１つまたはそれよりも多い追加の酸化層７５内に配置された複数の金属層に結合して、“フローティングゲート構造”７０を形成している。フローティングゲート構造はＩＳＦＥＴに関連する他の導電物から電気的に分離されていることからそのように名づけられている。すなわち、ゲート酸化物６５と保護層７２の間にサンドイッチされている。ＩＳＦＥＴ５０において、保護層７２がデバイスのイオン感応性を生じさせるイオン感応膜を構成し、保護層７２に接触している“被分析溶液（analyte solution）”７４（興味のあるイオンを含む溶液）中のイオンの、特にフローティングゲート構造７０上の感知領域７８における存在によりＩＳＦＥＴの電気的特性が変化して、ｐチャンネル６３を通じてソース５６とドレイン５８の間を流れる電流を変調するようになる。保護層７２は特定のイオンに対する感度を促進する様々な異種材料のどれか一つを含んでもよい。例えば、窒化ケイ素または酸窒化ケイ素を含有する保護層は一般に、被分析溶液７４中の水素イオンの濃縮（ｐＨ)に対する感度を提供し、一方、バリノマイシンを含有するポリ塩化ビニル含む保護層は、被分析溶液中のカリウムイオンの濃縮に対する感度を提供する(保護層に適し、例えばナトリウム、銀、鉄分、臭素、ヨウ素、カルシウム、及び、硝酸塩などの他のイオンに感度を有する材料が知られている)。

イオン感応に関して、通常は “表面電位”と呼ばれる電位差が、感知領域７８における化学反応（例えば、通常は感知領域７８近傍の被分析溶液中での酸化物表面基（oxide surface group）のイオンによる解離を含む）に起因するイオン濃縮の作用として、保護層７２と被分析溶液７４の固体／液体インターフェイスにおいて発生する。この表面電位は順にＩＳＦＥＴの閾値電圧Ｖ_ＴＨに影響し、よって、感知領域７８近傍の被分析溶液７４中でのイオン濃縮の変化とともに変動するのはＩＳＦＥＴの閾値電圧Ｖ_ＴＨである。

再び図３を参照すると、この特定の実施形態ではマイクロチャンバ３７０がＩＳＦＥＴ３００上に形成され、マイクロチャンバ３７０のうちサンプル３９０を含んでいる部分が、ＩＳＦＥＴ３００の金属酸化層３６０の上に位置している。マイクロチャンバは絶縁材料３８０（例えば窒化ケイ素（Ｓｉ_３Ｎ_４））で形成されている。この実施形態において、マイクロチャンバの容積は５００μｍ^３（１０×１０×５００μｍ）である。図３に表されたような、Ｈ^＋（すなわちプロトン）の発生が細胞分裂の兆候である。二酸化炭素（ＣＯ_２）の発生もまた細胞分裂の兆候である。例えば、酸素呼吸の式は
Ｃ_６Ｈ_１２Ｏ_６ ＋ ６Ｏ_２ → ６Ｈ_２Ｏ ＋ ６ＣＯ_２ ＋ ＡＴＰ
である。別の例では、グルコースのアルコール発酵の式は
Ｃ_６Ｈ_１２Ｏ_６ → ２Ｃ_２Ｈ_５ＯＨ ＋ ２ＣＯ_２ ＋ ２ＡＴＰ
である。別の例では、乳酸発酵の式は
Ｃ_６Ｈ_１２Ｏ_６ → ２ＣＨ_３ＣＨＯＨＣＯＯＨ ＋ ２ＡＴＰ
である。水の中にＣＯ_２が溶解している場合、炭酸が発生して、炭酸は付随のｐＨ変化を生じる。代謝過程の間または細胞分裂ごとに、細胞分裂の時間のとおり、発生されるプロトンの数またはＣＯ_２の量は有機体（生体）ごとに変動する。信頼に足る微生物の存在検出の最小の閾値は５００，０００プロトンより小さく、５０，０００プロトンとすることができる。

本明細書において説明されるデバイス及び方法によって観察される細胞の挙動は、細胞の活動の全体範囲（呼吸、増殖、細胞分裂など）、及び、環境条件（例えば、温度、ｐＨ）の変化またはサンプル成分（例えば、抗生物質、抗真菌剤、栄養素など）の添加に応答する変化に対する細胞の応答を含む。細胞の挙動は種々の公知技術を用いて観察できる。例えば、サンプルがサンプル中の微生物を増殖させる条件に支配された後で、微生物の増殖を示す、条件の変化を観察できる。上述のとおり、条件のこのような変化はチャンバ内で検出された二酸化炭素の濃度の可能性がある。このデータに基づいて微生物の増殖曲線を作成できる。このような曲線は、細胞の経時的な増殖またはサンプルの条件（例えば二酸化炭素濃度）の経時的な値を図で示すことができる。このようなデータの収集時（典型的にはリアルタイム）には、代謝活動のサンプル成分（例えば抗生物質）の添加に起因する、増殖速度または細胞の変化もまた観察できる。さらに、取得した増殖曲線を、１つまたはそれよりも多くの、知られている微生物の標準の増殖曲線と比較して、サンプル中の微生物を特定することができる。

注意すべきことは、本明細書において説明されるデバイス及び方法の全部または幾つかを、手作業でまたは自動化したやり方で実施してもよいということである。例えば、ＩＳＦＥＴに触れさせるのに先立つ検体及び／または微生物の準備を、自動化した方法で行ってもよい。分析試料の分析に先立つサンプルの準備のための自動化ステップは当技術分野において良く知られており、本明細書中に詳細に記載していない。また、ＩＳＦＥＴ上に微生物を付着することも自動化することができ、検体の準備の自動化の一部として、または別個のステップとして自動化できる。さらに、マイクロタイタープレートまたは他のマルチウェルまたはマルチチャンバの構成におけるマイクロウェル中にサンプルを導入するための自動化装置が当業者に良く知られており、本明細書中に詳細に記載していない。さらにまた、データの分析及び／または解釈を自動化しても良い。このような自動化装置は当業者に良く知られている。本明細書において説明した方法の全部または幾つかを、他の自動化した分析方法と統合しても良い。

本明細書において説明した方法は一般に臨床サンプルの解析に関連しているものの、本発明の方法及び装置は臨床サンプルまたは非臨床サンプルに用いることができる。例えば、解析される臨床サンプルには、典型的には臨床研究室または研究用研究室で試験されるどんな種類のサンプルも含まれ、限定ではなく、血液、血清、血漿、血液分画、滑液、尿、精液、唾液、糞便、脳脊髄液、胃内容物、膣分泌物、組織ホモジネート、骨髄穿刺液、骨ホモジネート、痰、吸引液、スワブ及びスワブリンス、その他体液、などが含まれる。サンプルは培養することができ、培養サンプルを用いることができる。一方で、試験される非臨床サンプルは、限定ではなく、食材、飲み物、薬剤、化粧品、水（例えば、飲料水、非飲料水、及び、廃水）、海水バラスト、空気、土、汚水、工場資材（例えば、種、葉、幹、根、花、果実）、血液製剤（例えば、血小板、漿液、血漿、白血球の破片など）、ドナー臓器または組織サンプル、細菌戦サンプル、果物汁、肉汁または残飯、及び、シャンプー及びその他消費者製品を含む。

本明細書では特定の実施形態を参照して本発明について説明してきたが、これら実施形態は本発明の原理及び応用の単なるであることを理解できよう。したがって、例示した実施形態に数多くの修正をすることができること、及び、添付の請求の範囲が定める本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、別の構成を考案できることを理解できよう。

本発明は、例えば、ＩＳＦＥＴを含んだチャンバのアレイを持つ採取管を用いてサンプル中の微生物の存在または非存在を判定する微生物検出装置に適用することができる。

Claims (15)

1. サンプル中の微生物の存在を判定する装置であって、
   サンプルを受容するように適合された第一の端部、及び、該サンプルをその中に受容するための容積を含むハウジング、並びに、
   チャンバのアレイであって、前記受容したサンプルが該チャンバのアレイの上にあるように該容積内に配置されており、各チャンバは、前記サンプルを受容するために前記ハウジングの前記容積と流体連通しており、及び、イオン感応電界効果トランジスタをその中に配置されて有しており、前記イオン感応電界効果トランジスタは、前記サンプルにおける変化であって、前記サンプル中の微生物の存在及び非存在及び応答のうち少なくとも一つを示す変化を検出するように構成されている、チャンバのアレイ
   を備え、
   前記チャンバの少なくとも幾つかは、前記チャンバ内の前記容積から受容した少なくとも１つの微生物を収容するように約５μｍから約１００μｍの間の高さと約５μｍから約１００μｍの間の上部開口とを有し、前記チャンバのアレイの各チャンバが、
   （ａ）（１）保護膜、または（２）絶縁体のどちらかによって形成された壁面、及び、
   （ｂ）（１）ソース及びドレインに接触している金属酸化層または（２）ソース及びドレインに接触しているゲート誘電のどちらかによって形成された底面
   によって形成されており、
   前記ハウジングは遠心分離採取管であり、該遠心分離採取管の底部近傍に前記チャンバのアレイが配置されていることを特徴とする装置。
2. 請求項１に記載の装置において、さらに、
   前記容積及びその中に配置された前記チャンバのアレイに電界を印加するように構成された電気的要素を備えることを特徴とする装置。
3. 請求項１に記載の装置において、さらに、
   前記容積及びその中に配置された前記チャンバのアレイに磁界を印加するように構成された磁気的要素を備えることを特徴とする装置。
4. サンプル中の微生物の存在を判定する方法において、
   前記サンプルを、その中にチャンバのアレイを配置されて有するハウジングの容積に導入するステップであって、前記チャンバの少なくとも幾つかは、約５μｍから約１００μｍの間の高さと、その上部における開口であって幅が約５μｍから約１００μｍまでの上部開口を、前記容積から前記チャンバ内に少なくとも１つの微生物を受容するように有し、及び、前記ハウジングは遠心分離採取管であり、そこにおいて、該遠心分離採取管の底部近傍に前記チャンバのアレイが配置されており、前記チャンバのアレイの各チャンバが、
   （ａ）（１）保護膜、または（２）絶縁体のどちらかによって形成された壁面、及び、
   （ｂ）（１）ソース及びドレインに接触している金属酸化層または（２）ソース及びドレインに接触しているゲート誘電のどちらかによって形成された底面
   によって形成されている、ステップ、
   前記サンプル中の少なくとも幾つかの微生物を前記ハウジング内の前記チャンバの少なくとも幾つかの前記上部開口に流入させる条件に前記サンプルをさらすステップであって、前記チャンバの少なくとも幾つかが、その中に配置されたイオン感応電界効果トランジスタを備えている、ステップ、及び、
   前記サンプルの前記チャンバ内に配置された部分における変化であって前記微生物の存在及び非存在及び応答のうち少なくとも一つを示す変化を検出するステップ
   を有することを特徴とする方法。
5. 請求項４に記載の方法において、
   前記微生物は、遠心分離によって、前記ハウジング内で前記チャンバのアレイに向かって流されることを特徴とする方法。
6. 請求項４に記載の方法において、
   前記微生物は、（ｉ）前記サンプルを電界にさらすことによって、または、（ii）前記サンプル中に磁性粒子または常磁性粒子を導入することによって、前記チャンバのアレイに向かって流され、前記磁性粒子または常磁性粒子は、前記微生物を引き付けてそれに結び付くように構成され、及び、前記サンプルを磁界にさらすことを特徴とする方法。
7. 請求項４に記載の方法において、さらに、
   前記チャンバの少なくとも幾つかに抗菌剤を添加するステップ、及び、
   前記抗菌剤を含有する第１チャンバ内で検出されたサンプルにおける変化を、前記抗菌剤を含有しない第２チャンバ内で検出されたサンプルにおける変化と比較することで、前記抗菌剤に対する前記微生物の感受性を判定するステップ
   を有することを特徴とする方法。
8. 請求項４に記載の方法において、さらに、
   前記微生物を増殖させる条件に前記サンプルをさらすステップ、
   微生物の増殖を示す条件の変化について前記サンプルを観察するステップ、及び、
   前記サンプル条件の前記変化に基づいて前記微生物の増殖曲線を生成するステップ
   を有することを特徴とする方法。
9. 請求項８に記載の方法において、さらに、
   生成された前記微生物の増殖曲線を、１つまたはそれよりも多くの、知られている微生物の標準の増殖曲線と比較することにより、前記微生物の同一性を判定するステップを含むことを特徴とする方法。
10. 請求項９に記載の方法において、
    前記微生物の増殖曲線を生成する前記ステップは、細胞を経時的に観察すること、または、サンプル条件の値を経時的に観察することを含むことを特徴とする方法。
11. 請求項１０に記載の方法において、
    前記サンプル条件は二酸化炭素の濃度であることを特徴とする方法。
12. 請求項８に記載の方法において、
    前記増殖曲線をリアルタイムで生成することを特徴とする方法。
13. 請求項１２に記載の方法において、さらに、
    前記サンプルに成分を添加するステップ、及び、
    該添加成分に応答する前記増殖曲線における変化を判定するステップ
    を有し、
    前記成分が、抗生物質、抗真菌剤、または、微生物の栄養素であることを特徴とする方法。
14. 請求項１に記載の装置において、
    前記イオン感応電界効果トランジスタは、基板、該基板上に設けられたソース電極及びドレイン電極、並びに、前記ソース電極と前記ドレイン電極の間に形成されたギャップを備えることを特徴とする装置。
15. 請求項４に記載の方法において、
    前記イオン感応電界効果トランジスタは、基板、該基板上に設けられたソース電極及びドレイン電極、並びに、前記ソース電極と前記ドレイン電極の間に形成されたギャップを備えることを特徴とする方法。

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