KR101230681B1 - 박테리아 농축을 위한 마이크로채널 전기영동 칩 및 이를 이용한 박테리아 농축 방법 - Google Patents

박테리아 농축을 위한 마이크로채널 전기영동 칩 및 이를 이용한 박테리아 농축 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 음극 전극이 있는 박테리아 시료 저장조, 양극 전극이 있는 폴리머 용액 저장조 및 상기 저장조 사이에 배열된 단일 또는 복수개의 마이크로채널을 포함하는 박테리아 농축을 위한 마이크로채널 전기영동 칩, 상기 마이크로채널 전기영동 칩을 포함하는 박테리아 농축용 키트 및 상기 마이크로채널 전기영동 칩을 이용한 박테리아 농축 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 박테리아 농축을 위한 마이크로채널 전기영동 칩 및 이를 이용한 박테리아 농축 방법은 병원성 박테리아가 낮은 농도로 포함되어 있는 분석 대상 시료 용액 내의 박테리아를 신속하고 효율적으로 농축할 수 있으므로, 최근 다양한 산업적 및 학술연구적 목적으로 활발하게 개발되고 있는 마이크로채널 칩 내에서의 다양한 종류의 박테리아의 신속하고 효율적인 농축 방법으로 활용할 수 있다.

Description

박테리아 농축을 위한 마이크로채널 전기영동 칩 및 이를 이용한 박테리아 농축 방법{A microchannel electrophoresis chip for concentrating bacteria and a method of concentrating bacteria using the same}
본 발명은 박테리아 농축을 위한 마이크로채널 전기영동 칩 및 이를 이용한 박테리아 농축 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 음극 전극이 있는 박테리아 시료 저장조, 양극 전극이 있는 폴리머 용액 저장조 및 상기 저장조 사이에 배열된 단일 또는 복수개의 마이크로채널을 포함하는 박테리아 농축을 위한 마이크로채널 전기영동 칩, 상기 마이크로채널 전기영동 칩을 포함하는 박테리아 농축용 키트 및 상기 마이크로채널 전기영동 칩을 이용한 박테리아 농축 방법에 관한 것이다.
음식이나 물 등을 통해서 전염이 되는 식중독이나 수인성 질병을 일으키는 병원성 박테리아의 검출을 위해서는, 일반적으로 분석 대상이 되는 시료를 채취한 후에 분석 시료 중의 박테리아의 수가 분석하기에 충분히 많지 않기 때문에 우선적으로 박테리아가 잘 자리는 영양배지를 사용하여 분석하고자 하는 박테리아의 수를 증가시키기 위한 배양을 먼저 한다. 이와 같은 박테리아 배양을 하루 내지 수일에 걸쳐서 하고 난 후 박테리아의 유전자를 채취하여 유전자 검사 특정 유전자를 선택적으로 증폭시켜서 그 유전자 DNA의 양을 대량으로 증가시키는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 한다. 이와 같은 과정을 거쳐서 많은 수의 유전자 DNA를 얻고 난 후에 겔 전기영동(gel electrophoresis)이나 유전자분석 장비를 사용하여 그 유전자 DNA를 분석함으로써 결과적으로 박테리아 세포의 종류를 확인할 수 있고, 분석 대상이 되는 시료 중에 병원성 박테리아가 포함되어 있는지 아닌지의 여부를 판단하게 된다. 그러나 이와 같은 일반적인 병원성 박테리아의 검출을 위한 분석 방법은 초기의 분석 대상 시료 내의 박테리아의 농도가 낮아 박테리아의 농도를 증가시키기 위한 배양 등의 과정을 거쳐야하기 때문에, 분석하는 과정이 수일에서 일주일 정도의 시간이 소요되므로 빠르게 병원성 박테리아를 고효율로 농축하고 분석하는 방법의 개발이 필요하다.
살모넬라, 리스테리아, 대장균 등의 병원성 박테리아는 크기가 수 마이크로미터 정도로 작은 막대모양, 구형 등의 형태를 가지고 있으며, 세포벽에 박테리아의 이동을 용이하게 하는 길고 가는 편모(flagella)가 하나 또는 다수 개 있으며 작은 섬모(pili)들이 많이 있다. 동물세포나 식물세포가 세포 안에 핵막으로 둘러싸여 있으며 유전물질인 DNA가 포함되어 있는 세포핵이 존재하는 반면, 박테리아 세포는 세포 내에 핵막이나 세포핵이 존재하지 않고 유전물질인 DNA가 세포 내부에 다른 미세 소기관들과 함께 같이 존재하게 된다. 그리고 박테리아는 증식하기 적당한 환경조건일 경우에 빠르게 증식을 하는데, 예를 들어 대장균의 경우에 섭씨 37도 정도의 온도에서 영양분이 충분한 환경에서 대장균의 수가 두 배로 증가하는 데에 약 30분에서 1시간 정도 소요된다. 이와 같은 박테리아의 빠른 증식 속도 때문에 여름철 온도도 높고 습도가 높은 장마철에 식중독과 같은 병원성 전염병이 빈번하게 발생하게 된다.
일반적으로 병원성 박테리아 검출을 위한 목적이나 학술연구의 목적을 위해서 다양한 종류의 박테리아 세포를 대상으로 분석을 하는 과정에서 상기한 바와 같이 박테리아 세포의 크기가 수 마이크로미터 크기로 매우 작기 때문에 우선적으로 박테리아 수를 증가시키기 위한 조작을 먼저 수행하게 된다. 일반적으로 박테리아 검출이나 분석을 위해서 사용하고 있는 장비와 방법은 충분히 많은 수 이상의 박테리아가 포함된 시료를 사용해야 분석이 가능하기 때문에 박테리아 세포의 배양이나 농축은 박테리아 분석 과정에서 중요한 단계이다. 박테리아 농축을 위해서 현재 많이 사용하고 있는 방법은 박테리아 세포가 포함된 시료 용액을 원심분리기 튜브에 넣고 고속으로 회전함으로써 박테리아 세포를 원심력에 의해서 튜브의 바닥에 농축시키는 방법이 사용되고 있다. 그러나 이와 같이 농축하는 방법에는 박테리아를 대상으로 한 분석이나 검출 및 활용에 있어서 한계가 있다.
한편, 랩온어칩(lab-on-a-chip)이나 마이크로 플루이딕 칩(microfluidic chip)을 사용한 분석칩의 개발이 현재 전 세계적으로 활발하게 진행되고 있으며 이 분석칩을 사용한 동물세포와 식물세포를 대상으로 한 분석뿐만 아니라 박테리아를 대상으로 한 분석기술도 다양한 방법으로 개발이 진행되고 있다. 분석칩을 사용하여 박테리아를 분석할 시에 적은 양의 시료 용액(수백 마이크로리터 수준)만 있어도 분석이 가능하며 빠른 분석 시간(수 분 내지 수 시간)에 분석을 완료할 수 있으며, 다양한 종류의 박테리아를 동시에 검출하는 것도 가능한 방법이다. 또한 제조하기가 간단할 뿐만 아니라 소형화된 분석칩이기 때문에 휴대가 가능하고 다양한 바이오산업에 적용하기에 용이하다.
이에 본 발명자들은 박테리아를 농축하고 분석하는 방법에 대한 한계를 인식하고, 랩온어칩, 마이크로 플루이딕 칩 등이 갖는 우수한 장점들을 활용하여 박테리아를 농축하는 방법을 찾고자 예의 노력한 끝에, 마이크로채널 전기영동 칩을 이용하여 박테리아를 고효율로 농축할 수 있는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 음극 전극이 있는 박테리아 시료 저장조, 양극 전극이 있는 폴리머 용액 저장조 및 상기 저장조 사이에 배열된 단일 또는 복수개의 마이크로채널을 포함하는 박테리아 농축을 위한 마이크로채널 전기영동 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 마이크로채널 전기영동 칩을 포함하는 박테리아 농축용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마이크로채널 전기영동 칩을 이용한 박테리아 농축 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 음극 전극이 있는 박테리아 시료 저장조, 양극 전극이 있는 폴리머 용액 저장조 및 상기 저장조 사이에 배열된 단일 또는 복수개의 마이크로채널을 포함하는 박테리아 농축을 위한 마이크로채널 전기영동 칩을 제공한다.
본 발명에서 용어, "박테리아"는 하등한 생물체로서 일반적으로 단세포로 이루어져 활동하는 미생물을 총칭하며, 원핵생물의 1군인 세균을 의미한다. 본 발명에서 박테리아는 상기 마이크로채널 전기영동 칩을 이용하여 고효율로 농축할 수 있으며, 바람직하게는 병원성 박테리아일 수 있고, 보다 바람직하게는 살모넬라(salmonella), 리스테리아(listeria) 또는 대장균(escherichia coli)일 수 있다.
본 발명에서 용어, "시료"는 검사, 시험, 분석 등에 쓰이는 정성, 정량분석의 대상이 되는 물질 또는 생물을 의미하며, 본 발명에서는 농축하기 위한 박테리아 세포가 포함된 시료일 수 있다.
본 발명에서 용어, "폴리머 용액"은 분자가 기본 단위의 반복으로 이들 분자들이 서로 중합하여 이루어진 화합물을 포함하는 용액을 의미하며, 박테리아 세포가 폴리머 용액 내에 있는 폴리머 분자사슬과 만나 박테리아 클러스터를 형성하게 하는 역할을 한다. 상기 폴리머 용액은 바람직하게는 고농도 수용액 폴리머 용액을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 셀룰로즈계 폴리머, 폴리에텔렌 옥시드 폴리머, 폴리비닐파이롤리돈 폴리머 용액을 사용할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 폴리비닐파이롤리돈 폴리머 용액을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "저장조"는 물질이나 용액 등을 모아서 간수하는 데에 쓰이는 용기를 의미하며, 음극 전극이 있는 박테리아 시료 저장조와 양극 전극이 있는 폴리머 용액 저장조로 구성될 수 있다.
본 발명에서 음극 전극 및 양극 전극은 외부의 전원공급장치를 사용하여 전기장을 부가하기 위하여 저장조의 양쪽에 배열한 것으로서, 박테리아 시료 저장조는 음극 전극을, 폴리머 용액 저장조는 양극 전극을 포함할 수 있다. 상기 음극 전극 및 양극 전극은 이에 제한되지는 않으나, 백금선을 일정한 길이로 절단하여 제조한 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "마이크로채널"은 마이크로미터 크기의 내경을 갖는 통로를 의미하며, 박테리아 세포가 이동할 수 있는 통로일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 염기성 용액을 주입하여 마이크로채널 표면에 음의 전하를 갖도록 하여 마이크로채널 내에서 박테리아 세포와 고농도 수용성 폴리머 용액이 만나 박테리아 클러스터를 형성한다.
상기 마이크로채널 전기영동 칩의 소재는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 투명한 폴리머 소재 또는 세라믹 소재를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 투명한 폴리머 소재는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate) 또는 폴리스티렌(polystyrene)을 사용할 수 있으며, 상기 세라믹 소재는 유리 또는 석영을 사용할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 마이크로채널 전기영동 칩을 포함하는 박테리아 농축용 키트를 제공한다.
본 발명의 박테리아 농축용 키트는 박테리아 시료 저장조, 폴리머 용액 저장조 및 마이크로채널을 포함하는 마이크로채널 전기영동 칩뿐만 아니라 농축 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 마이크로채널 전기영동 칩을 이용한 박테리아 농축 방법을 제공한다. 구체적으로, (a) 마이크로채널에 pH 8 내지 12의 염기성 용액을 주입하는 단계; (b) 상기 염기성 용액을 제거하고 상기 마이크로채널에 완충용액을 주입하는 단계; (c) 박테리아 시료 저장조에 박테리아가 포함된 시료 용액을 주입하는 단계; (d) 폴리머 용액 저장조에 고농도 수용성 폴리머 용액을 주입하는 단계; 및 (e) 음극 전극과 양극 전극에 전기장을 부가하는 단계를 포함하는 마이크로채널 전기영동 칩을 이용한 박테리아 농축 방법을 제공한다.
상기 마이크로채널에 염기성 용액을 채우고 수십 분 내지 한 시간 정도 두면 마이크로채널 내벽 표면이 음의 전하를 갖게 된다. 이후, 마이크로채널, 양극 저장조 및 음극 저장조에 완충용액을 채우고 양극 및 음극 전극에 외부의 전원공급장치를 사용하여 전기장을 부가하게 되면 용액에 존재하는 양의 하전을 띤 입자나 이온은 양극 전극 쪽으로 이동하게 되는데 이와 같은 이동을 전기영동(electrophoresis)이라 한다. 또한, 음의 전하를 띠는 마이크로채널 표면에 양의 전하를 띠는 이온들이 모여서 전기이중층을 형성한다. 이 때, 전기장이 부가되면 마이크로채널 표면에 모인 양의 전하를 띤 이온층이 음의 전극 방향으로 이동하게 되는데 이와 같은 이동에 의해서 마이크로채널 내부의 용액도 함께 음의 전극 방향으로 이동하게 되는 전기삼투압류흐름(electroosmotic flow)이 발생하게 된다. 본 발명은 이와 같은 전기영동과 전기삼투압류흐름을 사용하여 마이크로채널 전기영동 칩을 이용한 박테리아의 고효율 농축 방법을 제공할 수 있다. 일반적으로 박테리아 세포의 세포벽에는 양의 하전을 띤 성분과 음의 하전을 띤 성분이 공존하지만 전체적으로 볼 때 박테리아 세포는 약한 음의 하전을 띠고 있으므로 양극 전극 방향으로 이동함으로써 박테리아를 농축할 수 있다.
본 발명에서 상기 박테리아 농축 방법은 상기 박테리아가 클러스터(cluster)를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있다. 상기 박테리아 클러스터는 상기 박테리아가 포함된 시료 용액 중의 박테리아 세포와 상기 고농도 수용성 폴리머 용액 중의 폴리머 분자사슬이 결합하여 형성될 수 있으며, 바람직하게는 상기 박테리아의 5 내지 20배일 수 있으며, 보다 바람직하게는 10 내지 20배일 수 있다.
본 발명에서 상기 박테리아 농축 방법에 의하여 농축이 가능한 박테리아는 그람 양성균 및 그람 음성균을 모두 포함하며, 바람직하게는 병원성 박테리아일 수 있고, 보다 바람직하게는 살모넬라(salmonella), 리스테리아(listeria) 또는 대장균(escherichia coli)일 수 있다.
본 발명에서 상기 (a) 단계는 마이크로채널에 pH 8 내지 12의 염기성 용액을 주입하는 단계로서, 상기 마이크로채널 표면에 음의 전하를 갖도록 하는 역할을 한다. 상기 염기성 용액은 바람직하게는 염화나트륨, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨일 수 있다.
본 발명에서 상기 (b) 단계는 상기 염기성 용액을 제거하고 상기 마이크로채널에 완충용액을 주입하는 단계로서, 상기 완충용액은 바람직하게는 인산 완충용액, TE(Tris-EDTA) 완충용액 또는 TBE(Tris-borate-EDTA) 완충용액일 수 있으며, 보다 바람직하게는 TBE(Tris-borate-EDTA) 완충용액일 수 있다.
본 발명에서 상기 (c) 단계는 박테리아 시료 저장조에 박테리아가 포함된 시료 용액을 주입하는 단계로서, 농축하고자 하는 박테리아가 포함된 시료 용액이라면 이를 제한없이 사용할 수 있다. 상기 시료 용액은 특별히 이에 제한되지 않으나 상기 완충용액을 0.1 내지 50중량%로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 (d) 단계는 폴리머 용액 저장조에 고농도 수용성 폴리머 용액을 주입하는 단계로서, 상기 폴리머 용액은 박테리아 세포가 폴리머 용액 내에 있는 폴리머 분자사슬과 만나 박테리아 클러스터를 형성하게 하는 역할을 한다. 상기 폴리머 용액은 바람직하게는 셀룰로즈계 폴리머, 폴리에틸렌 옥시드 폴리머 또는 폴리비닐파이롤리돈 폴리머 용액일 수 있으며, 보다 바람직하게는 폴리비닐파이롤리돈 폴리머 용액일 수 있다. 상기 셀룰로즈계 폴리머 또는 폴리에틸렌 옥시드 폴리머는 0.5 내지 3 중량% 범위의 농도로 제조될 수 있으며, 상기 폴리비닐파이롤리돈 폴리머는 5 내지 25 중량% 범위의 농도로 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 (e) 단계는 음극 전극과 양극 전극에 전기장을 부가하는 단계로서, 외부의 전원공급장치를 이용할 수 있다. 상기 전기장을 부가함으로써, 전기영동흐름 및 전기삼투압류흐름이 발생하여 고효율 박테리아 농축이 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따라 마이크로채널 전기영동 칩을 이용한 박테리아 클러스터 형성에 의한 박테리아 농축 방법을 단계적으로 모식적으로 나타낸 과정도는 도 2와 같다. 마이크로채널 전기영동 칩의 마이크로채널(32)에 강한 염기성을 갖는 용액을 주입하여 수십분 동안 둠으로써 상기 마이크로채널(32) 내부 벽면이 음의 전하를 갖도록 처리를 하였다. 이후, 상기 마이크로채널(32)에 채워진 상기 염기성 용액을 제거하고 완충용액을 주입하였다. 도 2의 (가)에 나타낸 바와 같이, 박테리아 시료 저장조(11)에 박테리아 시료 용액(13)을 주입하고 폴리머 용액 저장조(21)에 고농도 수용성 폴리머 용액(23)을 주입하였다. 이때, 박테리아 세포(13)가 포함된 시료 용액에 일정량의 완충용액을 주입한 후에 박테리아 시료 저장조(11)에 주입하고, 수용성 폴리머(23)를 완충용액에 용해시켜서 제조한 고농도 수용성 폴리머 용액(23)을 폴리머 용액 저장조(21)에 주입할 수 있다. 도 2의 (나)는 외부의 전원공급장치(45)를 사용하여 상기 마이크로채널 전기영동 칩의 양극 전극(22)과 음극 전극(12) 사이에 전기장을 부가함으로써 상기 마이크로채널(32) 내에서 박테리아 세포(13)가 전기영동흐름(61)에 따라서 양극 전극(22)이 있는 방향으로 이동하고 동시에 전기삼투압류흐름(65)에 의해서 폴리머 용액(23)이 음극 전극(12)이 있는 방향으로 이동하는 과정을 나타낸다. 이 과정에서 상기 박테리아 세포(13)가 양의 전극(22)이 있는 방향으로 이동하는 것은 박테리아 세포(13)가 갖는 전체적인 약한 음의 전하 때문에 이동을 하는 것이고, 상기 고농도 수용성 폴리머 용액(23)이 음의 전극(12)이 있는 방향으로 이동하는 것은 상기 마이크로채널 표면(33)이 음의 전하를 갖기 때문에 상기 마이크로채널 표면(33)에 모인 양의 전하를 갖는 이온층이 음의 전극으로 끌리는 현상에 의해 상기 마이크로채널(32) 내부의 용액이 음의 전극(12)으로 이동하는 현상인 전기삼튜압류흐름(65)에 의한 것이다. 도 2의 (다)는 상기 마이크로채널(32)의 박테리아 클러스터 형성구간(51)에서 상기 박테리아 세포(13)와 상기 수용성 폴리머 분자사슬(23)이 서로 반대편으로 이동하는 과정에서 서로 만나서 박테리아 클러스터(55)를 형성해가는 과정을 나타낸다. 초기에 상기 박테리아 세포(13)와 상기 폴리머 분자사슬(23)이 만남으로써 비교적 작은 박테리아 클러스터 전구체(52)가 형성이 되고 지속적으로 이동해오는 상기 박테리아 세포(13)와 상기 폴리머 분자사슬(23)이 지속적으로 뭉침으로써 큰 박테리아 클러스터(55)가 형성될 수 있다. 도 2의 (라)는 형성된 박테리아 클러스터(55)가 양의 전극(22)이 있는 방향으로 이동을 계속하여 상기 마이크로채널(32) 끝인 상기 폴리머 용액 저장조(21)에 지속적으로 쌓이는 과정을 나타내는 것으로, 상기 박테리아 클러스터(55)가 상기 마이크로채널(32)을 이동하여 상기 마이크로채널(32)의 끝을 빠져나오면 상기 고농도 수용성 폴리머 용액이 담겨져 있는 상기 폴리머 용액 저장조(21)에서 상기 고농도 수용성 폴리머 용액의 고점성 용액(23)에 의해서 상기 박테리아 클러스터(55)가 분산되지 않고 계속 쌓이게 됨으로써 고효율 박테리아 농축이 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 박테리아 농축을 위한 마이크로채널 전기영동 칩 및 이를 이용한 박테리아 농축 방법은 병원성 박테리아가 낮은 농도로 포함되어 있는 분석 대상 시료 용액 내의 박테리아를 신속하고 효율적으로 농축할 수 있으므로, 최근 다양한 산업적 및 학술연구적 목적으로 활발하게 개발되고 있는 마이크로채널 칩 내에서의 다양한 종류의 박테리아의 신속하고 효율적인 농축 방법으로 활용할 수 있다.
도 1은 마이크로채널 전기영동 칩의 각 부분의 구성성분과 구조를 나타내는 개략도이다.
도 2는 마이크로채널 전기영동 칩의 마이크로채널 내에서 전기장의 부가에 의해 박테리아 세포가 이동하면서 박테리아 클러스터를 형성하는 과정을 나타내는 개략도이다.
도 3은 내경이 100 ㎛ 이고, 길이가 10 ㎜ 인 마이크로채널 6개가 부채꼴 모양으로 배열되도록 제조된 마이크로채널 전기영동 칩의 사진이다.
도 4는 마이크로채널 전기영동 칩을 이용하여 전기장의 부가에 의해 그람 음성균인 살모넬라(salmonella typhimurium) 세포 클러스터가 형성된 후 마이크로채널 끝부분에 지속적으로 농축되는 실험결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 마이크로채널 전기영동 칩을 이용하여 전기장의 부가에 의해 그람 양성균인 리스테리아(listeria monocytogenes) 세포 클러스터가 형성된 후 마이크로채널 끝부분에 지속적으로 농축되는 실험결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 마이크로채널 전기영동 칩을 이용하여 전기장의 부가에 의해 형성된 세 가지 종류의 박테리아 세포, 즉 리스테리아, 살모넬라 및 대장균(escherichia coli) 세포 클러스터의 크기를 나타내는 실험결과를 나타내는 사진과 그래프이다.
도 7은 마이크로채널 전기영동 칩을 이용하여 살모넬라, 리스테리아 및 대장균 등의 다양한 세포들이 혼합된 박테리아 클러스터를 형성한 후 살모넬라 세포에만 특이적으로 부착되는 형광염료가 달린 항체 분자(FITC conjugated anti-Salmonella antibodies)를 사용하여 농축된 살모넬라 세포의 형광 이미지를 나타내는 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 박테리아 농축을 위한 마이크로채널 전기영동 칩의 제조
박테리아를 고효율로 농축하는 방법을 개발하기 위하여 박테리아 농축을 위한 마이크로채널 전기영동 칩을 제조하였다. 도 1은 마이크로채널 전기영동 칩의 각 부분의 구성성분과 구조를 나타내는 개략도로서, 좌측도는 전기장을 부가하기 전의 개략도이고, 우측도는 전기장을 부가한 후 박테리아 클러스터를 형성하고 형성된 박테리아 클러스터가 폴리머 용액 저장조에 지속적으로 모이는 박테리아 농축과정을 나타내는 개략도이다. 도 3은 내경이 100 ㎛ 이고, 길이가 10 ㎜ 인 마이크로채널 6개가 부채꼴 모양으로 배열되도록 제조된 마이크로채널 전기영동 칩의 사진이다. 도 1 및 3에서 보듯이, 마이크로채널 전기영동 칩(100)은 음극 전극(12)이 있는 박테리아 시료 저장조(11)와 양극 전극(22)이 있는 폴리머 용액 저장조(21) 및 상기 저장조 사이에 배열된 마이크로채널(32)로 구성하였으며, 내경이 100 ㎛이고, 길이가 10 ㎜인 마이크로채널 6개를 부채꼴 모양으로 배열하였다.
실시예 2: 마이크로채널 전기영동 칩을 이용한 살모넬라( salmonella typhimurium ) 세포의 농축
마이크로채널 전기영동 칩을 이용하여 그람 음성균인 살모넬라 세포의 농축을 실시하였다. 내경이 100㎛이고, 길이가 10 ㎜인 마이크로채널을 이용하였다. 그리고, 수산화나트륨 등과 같은 염기성 용액을 사용하여 pH를 8.5로 조정하였다. 살모넬라(salmonella typhimurium)의 농도는 5×104 CFU/ml in 1×TBE 을 주입하였고, 폴리머 용액은 20% 폴리비닐파이롤리돈(polyvinylpyrrolidone) in 1×TBE 을 주입하였다. 전기장을 150 V/cm 부가하여 전기장을 부가하기 전, 전기장 부가 후 1분 30초, 3분 및 5분에 각각 농축결과를 확인하였다. 도 4는 마이크로채널 전기영동 칩을 이용하여 살모넬라 세포 클러스터가 형성된 후 마이크로채널 끝부분에 지속적으로 농축되는 실험결과를 나타내는 사진으로서, (가)는 전기장을 부가하기 전의 사진, (나)는 전기장을 부가하고 1분 30초 후의 사진, (다)는 전기장을 부가하고 3분 후의 사진, (라)는 전기장을 부가하고 5분 후의 사진을 나타낸다. 사진에 표기한 스케일 막대는 40 ㎛ 이다.
도 4에서 보듯이, 살모넬라 박테리아 클러스터가 형성되면서 폴리머 용액 저장조 내의 마이크로채널 끝부분에 지속적으로 농축되는 실험결과를 확인하였으며, 형성된 클러스터의 크기는 약 25 ㎛ 였다. 이러한 결과는 약 2 ㎛ 정도 크기의 살모넬라 박테리아 세포가 상기 마이크로채널에서 박테리아 클러스터를 형성함으로써 박테리아 하나 크기의 10배 이상의 크기인 약 25 ㎛ 정도 크기의 클러스터를 형성하고, 상기 형성된 클러스터가 지속적으로 한 곳에 모임으로써 박테리아의 농축 효율을 증대시킴을 의미한다.
실시예 3: 마이크로채널 전기영동 칩을 이용한 리스테리아( listeria monocytogenes ) 세포의 농축
마이크로채널 전기영동 칩을 이용하여 그람 양성균인 리스테리아 세포의 농축을 실시하였다. 내경이 100㎛이고, 길이가 10 ㎜인 6개의 마이크로채널을 이용하였고, 상기 6개의 마이크로채널은 부채꼴 모양으로 배열하였다. pH는 8.5의 조건을 사용하였다. 리스테리아(listeria monocytogenes)의 농도는 5×104 CFU/ml in 1×TBE 을 주입하였고, 폴리머 용액은 20% 폴리비닐파이롤리돈(polyvinylpyrrolidone) in 1×TBE 을 주입하였다. 전기장을 100 V/cm 부가하여 전기장을 부가하기 전, 전기장 부가 후 1분 30초, 3분, 5분 및 10분에 각각 농축결과를 확인하였다. 도 5는 마이크로채널 전기영동 칩을 이용하여 리스테리아 세포 클러스터가 형성된 후 마이크로채널 끝부분에 지속적으로 농축되는 실험결과를 나타내는 사진으로서, (가)는 전기장을 부가하고 1분 30초 후의 사진, (나)는 전기장을 부가하고 3분 후의 사진, (다)는 전기장을 부가하고 5분 후의 사진, (라)는 전기장을 부가하고 10분 후의 사진을 나타낸다. 사진에 표기한 스케일 막대는 80 ㎛ 이다.
도 5에서 보듯이, 리스테리아 박테리아 클러스터가 형성되면서 폴리머 용액 저장조 내의 마이크로채널 끝부분에 지속적으로 농축되는 실험결과를 확인하였다. 또한, 마이크로채널을 부채꼴 모양으로 배열함으로써, 6개의 마이크로채널이 폴리머 용액 저장조에 모이는 구조로 되어 있기 때문에 폴리머 용액 저장조에 지속적으로 모이게 됨으로써 박테리아의 농축 효율을 더욱 증대시킴을 확인하였다.
실시예 4: 마이크로채널 전기영동 칩을 이용한 농축된 박테리아 클러스터의 크기 측정
마이크로채널 전기영동 칩을 이용하여 세 가지 종류의 박테리아 세포, 즉 그람 양성균인 리스테리아(listeria monocytogenes), 그람 음성균인 살모넬라(salmonella typhimurium) 및 대장균(escherichia coli) 세포의 농축을 실시하고 박테리아 클러스터의 크기를 측정하였다. 내경이 100㎛이고, 길이가 10 ㎜인 6개의 마이크로채널을 이용하였고, 상기 6개의 마이크로채널은 부채꼴 모양으로 배열하였다. 리스테리아, 살모넬라 및 대장균의 농도는 각각 5×104 CFU/ml in 1×TBE 을 주입하였고, 폴리머 용액은 20% 폴리비닐파이롤리돈(polyvinylpyrrolidone) in 1×TBE 을 주입하였다. 전기장을 25 V/cm 부가하여 전기장 부가 후 5분에 농축결과를 확인하였다. 도 6은 마이크로채널 전기영동 칩을 이용하여 형성된 세 가지 종류의 박테리아 세포, 즉 리스테리아, 살모넬라 및 대장균 세포 클러스터의 크기를 나타내는 실험결과를 나타내는 사진과 그래프로서, (가)는 리스테리아 세포 클러스터의 형성을, (나)는 살모넬라 클러스터의 형성을, (다)는 대장균 세포 클러스터의 형성을 나타낸 사진을 나타내며, (라)는 리스테리아, 살모넬라 및 대장균 세포 클러스터의 크기를 나타내는 그래프를 나타낸다. 사진에 표기한 스케일 막대는 80 ㎛ 이다.
도 6에서 보듯이, 리스테리아, 살모넬라 및 대장균이 각각 클러스터를 형성하면서 폴리머 용액 저장조 내의 마이크로채널 끝부분에 지속적으로 농축되는 실험결과를 확인하였다. 또한, 형성된 박테리아 클러스터의 크기는 20 내지 35 ㎛ 범위 내에서 형성됨을 확인하였다. 이러한 수치는 마이크로채널 전기영동 칩을 이용한 박테리아 농축 방법이 효율적으로 박테리아 클러스터를 형성하여 고효율로 박테리아를 농축할 수 있음을 의미한다.
실시예 5: 형광 이미지를 이용한 살모넬라 클러스터 형성 확인
마이크로채널 전기영동 칩을 이용하여 다양한 종류의 박테리아 세포, 즉 리스테리아(listeria monocytogenes), 살모넬라(salmonella typhimurium) 및 대장균(escherichia coli) 세포 등의 다양한 세포들이 혼합된 혼합 박테리아 시료 용액을 사용한 박테리아의 농축을 실시하고, 그 중에서 형광 이미지를 이용하여 살모넬라 세포의 박테리아 클러스터만을 확인하였다. 내경이 100㎛이고, 길이가 10 ㎜인 마이크로채널을 이용하였고, pH는 8.5의 조건을 사용하였다. 리스테리아, 살모넬라 및 대장균의 농도는 각각 5×104 CFU/ml in 1×TBE 을 주입하였고, 폴리머 용액은 20% 폴리비닐파이롤리돈(polyvinylpyrrolidone) in 1×TBE 을 주입하였다. 전기장을 100 V/cm 부가하여 전기장 부가 후 5분에 박테리아 클러스터 형성을 확인하였고, 이후 살모넬라 세포에만 특이적으로 부착되는 형광염료가 달린 항체 분자(FITC conjugated anti-Salmonella antibodies)를 사용하여 농축된 살모넬라 세포의 형광 이미지를 찍었다. 도 7은 마이크로채널 전기영동 칩을 이용하여 농축된 살모넬라 세포의 형광 이미지를 나타내는 사진이다. 사진에 표기한 스케일 막대는 40 ㎛ 이다. 도 7에서 보듯이, 혼합된 시료 용액을 사용한 경우에도 살모넬라 세포의 클러스터가 형성되었음을 확인할 수 있었다.

Claims (13)

  1. (a) 음극 전극이 있는 박테리아 시료 저장조;
    (b) 양극 전극이 있는 폴리머 용액 저장조; 및
    (c) 상기 저장조 사이에 배열된 단일 또는 복수개의 마이크로채널을 포함하는 박테리아 농축을 위한 마이크로채널 전기영동 칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로채널은 내경이 30 내지 300 ㎛, 길이가 5 내지 100 ㎜, 모양이 원형 또는 다각형인 것인 마이크로채널 전기영동 칩.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 복수개의 마이크로채널은 부채꼴 모양으로 배열된 것인 마이크로채널 전기영동 칩.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로채널 전기영동 칩은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리스티렌(polystyrene), 유리 및 석영으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 소재로 제조한 것인 마이크로채널 전기영동 칩.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 마이크로채널 전기영동 칩을 포함하는 박테리아 농축용 키트.
  6. (a) 마이크로채널에 pH 8 내지 12의 염기성 용액을 주입하는 단계;
    (b) 상기 염기성 용액을 제거하고 상기 마이크로채널에 완충용액을 주입하는 단계;
    (c) 박테리아 시료 저장조에 박테리아가 포함된 시료 용액을 주입하는 단계;
    (d) 폴리머 용액 저장조에 고농도 수용성 폴리머 용액을 주입하는 단계; 및
    (e) 음극 전극과 양극 전극에 전기장을 부가하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 마이크로채널 전기영동 칩을 이용한 박테리아 농축 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 박테리아가 박테리아 클러스터(cluster)를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 박테리아 클러스터는 상기 박테리아의 5 내지 20배의 크기를 갖는 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 박테리아는 살모넬라(salmonella), 리스테리아(listeria) 또는 대장균(escherichia coli)인 것인 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 염기성 용액은 염화나트륨, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨인 것인 방법.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 완충용액은 인산 완충용액, TE(Tris-EDTA) 완충용액 또는 TBE(Tris-borate-EDTA) 완충용액인 것인 방법.
  12. 제6항에 있어서,
    상기 시료 용액은 상기 완충용액을 0.1 내지 50중량%로 포함하는 것인 방법.
  13. 제6항에 있어서,
    상기 폴리머 용액은 셀룰로즈계 폴리머, 폴리에틸렌 옥시드 폴리머 또는 폴리비닐파이롤리돈 폴리머 용액인 것인 방법.
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