JP6748056B2 - 核酸の自動化された加工処理および電気泳動による試料調製のための装置、方法およびシステム - Google Patents
核酸の自動化された加工処理および電気泳動による試料調製のための装置、方法およびシステム Download PDFInfo
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Description
この出願は、2014年10月15日に出願された「Apparatuses, Methods and Systems for Automated Processing of Nucleic Acids」との表題の米国仮特許出願第62/064,454号および2015年6月23日に出願された「Methods and Devices for Electrophoretic Sample Preparation」との表題の米国仮特許出願第62/183,514号に対する優先権を主張する。本出願は、上記参照された出願のそれぞれの開示全体を参考として本明細書に援用する。
実施例:迅速電気泳動精製と共にアガロース試料プラグを使用した、ウシ全血からの超高分子量DNAの調製。
アガロースにおける血液細胞の固定。
2%アガロース(SeaKem Gold、Lonza)を、2gのアガロースを100mLの1×KBB/2mM EDTA(50mLの10×KBB、2mLの500mM
EDTAを500mLとする)に添加することにより調製する。
一定分量を45℃まで冷却する。
2mLのアガロースを、2mLのウシ全血(Lampire Biologicals)と混合し、直径60mmのペトリ皿内に注ぎ、冷却させる。
(0.5×KBBバッファーは、51mMトリス塩基、28.8mM TAPS酸、0.08mM EDTA酸、pH8.7である。)
試行1:SDSバッファーからの除タンパク。
2つの12ウェル1.5mm厚コームを有するGalileo galileo 1214ゲルボックストレイ内に水平アガロースゲルを調製し、0.5×KBB+0.5%SDS中の1%SeaKem Goldアガロース(Lonza)100mLを添加する。
全血/アガロースを有するペトリ皿から、直径6.35mmのディスクをパンチアウトし、アガロースゲルのウェルに移す。
250Vでの21分間の電気泳動により除タンパクする。
ウェルからディスクを除去し、TEを伴う新しいペトリ皿に移す。
試行2:SDS/チオ尿素バッファーからの除タンパク
ゲルが、上に列挙した成分に加えて、2Mチオ尿素を含有することを除き、すべてのステップを上の試行1の通り実施する。このゲルは、固めるのに冷却(4℃、30分)を要する。
ディスクは、TE内のペトリ皿内にある。
ディスクをプラスチックスパチュラでTEから除去し、一端をペーパータオルにタップすることによりブロット乾燥させ、78μLの水/16μLの10×NEBバッファー/1μLの1M DTT/3μLのNEB BSAおよび以下の通り酵素を有する2mL微量遠心チューブに添加する。
Cutsmartを使用した反応は強いpptを有し、おそらくバッファー中のK+による。
1%seakem goldおよび0.5×KBBバッファーを用いて水平ゲルを調製し、ディスクを上のものから試料ウェルに移し、Pippin Pulse(Sage Science)を使用して、80Vで、300、100、30、10、30、10、45のフィールドパラメータ(定数A〜G)(MJ5プロトコール)で12時間泳動させる。
標準は、低分子量マーカー(NEBエクステンドラダー)、ラムダゲノムDNA(48.5Kbp)およびNEBラムダラダーPF標準を含む。
分析ゲル電気泳動後、試料プラグディスクを、ゲルローディングウェルから除去し、24ウェルマイクロプレートにおいて700μLの0.5μg/mL臭化エチジウム中で染色した。除タンパクしたが、分析用ゲル上で泳動させなかった対照ディスクもまた染色し、右下のウェルに示す。
目的:全血をアガロースと混合するとき、SDSの存在下で電気泳動によりタンパク質のすべてを除去できることを実証し、アガロースプラグ試料の得られたタンパク質プロファイルを、プロテイナーゼKで処理したアガロースプラグのタンパク質プロファイルと比較する。
全血をアガロースと混合する
48℃の0.5×KBBバッファー(Sage Science)プラス1mM EDTA中1.5%seakem goldアガロース2mLに、2mLの全血を添加し、混合するための急速回旋後、混合物を直径60mmのペトリ皿中に注ぎ、冷却させる。
プロテイナーゼKで処理することにより除タンパクする
ラン1:ペトリ皿から、パンチを使用して直径6.35mmのディスクを製造し、ディスクを一晩、揺動しながら、1mLのSarEバッファーを有する2mL微量遠心チューブ内でインキュベートする。
(SarEバッファー:1mLを製造するため、375μLの水、100μLの10%重量/体積 Nラウリルサルコシン、500μLのNa2EDTA、および25μLの20mg/mLプロテイナーゼK溶液(Fisher Scientific、カタログ#
FP2500150)を混合する)
ラン2:6.35mmのディスクを、1mLのSTCPバッファーを用いることを除いて上の通りインキュベートする
STCPバッファー:1mLを製造するため、890μLの水、50μLの10%重量/体積SDS、50μL 1MトリスHCl、pH7.5、1μLの1M CaCl2、5μLの20mg/mLプロテイナーゼKを混合する
ラン3:(プロテアーゼなしの対照):ディスクを、0.5×KBB/0.5%SDSを含有するバッファーを用いることを除いて上の通りインキュベートする
SDSの存在下で電気泳動により除タンパクする
ラン4:6.35mmのディスクを、アガロースゲル(1%seakem gold、0.5×KBB、0.5%SDS、1mM EDTA)のウェルに移す。泳動バッファーは同じ(0.5×KBB/0.5%SDS/1mM EDTA)である。ゲル(総体積50mLのアガロース)を、6ウェルフォーマーを有する1.5mm厚コームを有するGalileo bioscienceモデル0708ゲルボックス内に注ぐ。 220Vで5分間電気泳動する。この時間は、暗褐色のヘモグロビンバンドがアガロースディスクを完全にクリアにするのに十分である。
ディスクを、1mLの新しい泳動バッファーを有する2mL微量遠心チューブに移す。
ラン5:電気泳動が220Vで8分間であることを除き、ラン4と同様。
ラン6:4分後にアガロースゲルウェル(現在は無色のディスクを含有)に5mM TCEP溶液を充填し、5分間待機し、4分間220Vで電気泳動することを除き、ラン4と同様。
ラン7:電気泳動がTCEP添加後に8分間であることを除き、ラン6と同様。
ラン8:さらなる処理なしの対照(未処理)A 6.35mmディスク(全血からの明赤色)。
アガロースディスクを可溶化し、分析SDS PAGE上に可溶性物質を泳動させることにより、除タンパクの程度を決定する
ランからのディスクを、80μLのTUSバッファー、10μLのSDS PAGE用4×LDS試料バッファー(invitrogen)および1μLの500mM TCEP溶液と混合し、85℃で6分間加熱することにより可溶化した。
(TUSバッファーは、3grのチオ尿素、260μLの50×TE(USB biochemicals)、2.6mLの10%SDS、および13mLまでの水を組み合わせることにより製造され、この溶液は42℃で可溶性である。このバッファーは、チオ尿素約3M、1×TEおよびSDS2%である。)
20μLの可溶化物質を、4〜20%の勾配SDSゲル(Genscript、ExpressPlus PAGE Gel、4〜20%、15ウェル、カタログNo:M42015)上にロードした。
ゲル分析のための対照
A:5μLの全血+80μLのTUS、10μLの4×LDS、1μLのTCEP
B:1μLの全血+80μLのTUS、10μLの4×LDS、1μLのTCEP
C:2μLの20mg/mLプロテイナーゼK++80μLのTUS、10μLの4×LDS、1μLのTCEP
追跡用色素が底部に到達するまで、19ワットの定電力でゲルを泳動させ、ゲルを水ですすぎ、クマシーブルー(Thermo fisherカタログ#24620、PageBlue Protein Staining Solution)で染色し、水で脱染し、ライトボックスを使用して撮影した(透過照明)。画像を、Capture NXソフトウェア(Nikon)で分析した。
レーン9は、約0.1μLの未処理全血である。レーン14は、処理なしの全血/アガロースディスク(約0.26μLの全血に等しいゲルローディング)である。
レーン3および4は、界面活性剤およびプロテイナーゼKのみとのインキュベーションによって(タンパク質の電気泳動除去なし)除タンパクされたディスクを示し、消化のために使用されたプロテイナーゼK混合物自体は、レーン10におけるものである。
レーン5〜8は、電気泳動で除タンパクされたディスクを示す。
図9Bは、薄いバンドを示すために強化された、同じゲルを示す。
一部の実施形態では、ライブラリー構築の前に試料からヒトDNAを物理的に引く(subtract)ことによりコストを減少させる、試料調製のための方法が提供される。かかる実施形態では、試料からの90%またはそれ超までの核酸を除去でき、必要とされる1試料当たりのシークエンシングの量の低減をもたらす(したがって、1試料あたりのシークエンシングコストを比例して減少させる)。したがって、一部の実施形態では、全血試料からのWBC DNAのサブトラクションのための高速でスケーラブルな方法が提供される。
図10A〜Gは、電気泳動バッファー(5)が充填されたプラスチック容器(2)と、高分子の分離に好適な電気泳動ゲルマトリクス(3)とを含む、一部の実施形態による使い捨てカセットデバイス(1)の断面図を示す。カセットのゲル部分はまた、ゲルによりいずれかの側に電気泳動バッファーチャンバーから隔離された試料ウェル(6)を有する。図10Hの概略上面図に示す通り、ゲル部分(3)は、カセット容器(2)を側方に満たし、そのことにより、2つの隔離されたバッファーチャンバー(5)をゲルのいずれかの側に創出する。
図11(カセットの上面図を示す。米国特許公開第2015/0101932号も参照のこと)の使い捨てカセットは、試料ウェル(16)に加えて、試料ウェルの上流の試薬ウェル(15)を含む。試薬ウェルは、試料ウェルと(−)分離バッファーチャンバーとの間に位置していてもよい。DNAのような負に荷電した分析物を、一方向から他方向へと移動させることができる分離電極(4)も含まれ、分析物の所望の分離が達成されたとき、分離電極は停止され、溶出チャネル電極(13)が始動し、分離された負に荷電した分析物を上方へと、バッファーが充填された溶出モジュール(10)内に移動させる。溶出モジュールは、(+)電極側でPES限外濾過膜(カットオフ10kDa)を用いてシールされており、これは、ゲノムDNA分子を溶出モジュールの内側に保持する。
I、およびFragmentase(New England Biolabs)を含む。他の試薬、例えば合成オリゴヌクレオチドアダプター二重鎖をロードさせたトランスポザーゼもまた使用でき、その例には、変異体Tn5トランスポザーゼ、Nextera(Illumina)、Kapa Biosystemsにより製造された変異体Tn5トランスポザーゼ、および変異体Muトランスポザーゼ試薬、MuSeek(Thermo Life)が含まれる。他の試薬は、制限エンドヌクレアーゼを含む。制限エンドヌクレアーゼを使用するとき、放出されたDNA生成物がきわめて大きくなるように、消化条件は、非常に限定された範囲の消化のみを可能にするものであってもよい。とりわけ好ましいDNA切断試薬は、制限酵素、例えばCviKI−1(New England Biolabs)であり、これは、非常に低い配列特異性を有し、ゲノムDNAのメチル化状態に影響されない。CviKI−1および類似の低特異性酵素による限定的な消化は、切断部位のほぼランダムなセットを生成しうる。
図14A〜Bは、例示的カセット1400の上面図を示し、これは、中央試料ゲルチャネル1401、試料ウェル1402、試料チャネル電気泳動電極1403(陰極)および1404(陽極)を有する。図14Aに示す通り、電極は、試料(初期は試料ウェル1402内に含有される)を、チャネル1401に沿って、陽極1404に向かって電気泳動により駆動するために使用される。図14Bは、陰極1406(陰極)と1407(陽極)との間の電気泳動を介した受け入れ領域1405内への異なる試料画分(例えば、DNAの画分)の回収を示す。
− TnおよびPacBioアダプター(そしてインキュベートする)、
− T4pol、dNTP、E.coliリガーゼ、およびNAD(そしてインキュベートする)、
− エキソヌクレアーゼT5(そしてインキュベートする)。
一部の実施形態では、これらのインキュベーションは、順次(示した通り)実施されるが、他の実施形態では、インキュベーションは同時に実施できるか、および/または、これらのインキュベーションのすべてを使用しなくてもよい。
実施例:ヤギ全血からのゲノムDNAの電気泳動抽出。
2%アガロースゲル(SeaKem Gold、Lonza)を、10mMトリス−HCl、pH7.6で注型した。ゲルは、厚さおよそ11mmで、厚さ1.5mm×深さ7mm×幅11mmの試料ウェルを有していた。ゲルを、0.5×KBBバッファー(1×KBB=50mMトリス、37mM TAPS、0.08mM EDTA、pH8.7)を、追加の5mM EDTAおよび1%SDSと共に含有するミニゲルボックス内に置いた。ゲルを、ゲルの表面がバッファーの下に沈まないように(試料ウェル内容物が、リザーバー内のバッファーと流体接触しないように)浸漬させ、バッファーは、ゲルの端部でその高さの約75%を覆っていた。ゲルを電気泳動バッファーと接触させた後、試料をできるだけ素早くロードし、電気泳動電力を始動した。各レーンの試料は、80μlのTBSEG(50mM トリス−HCl、pH7.6、150mM NaCl、5mM EDTA、10%グリセロール)と混合された、20μlの新鮮なヤギ全血(ACDで抗凝固処理、Lampire Biologicals)であった。
レーン1−一般的制限バッファーのみ
レーン2−一般的制限バッファー+50ユニットのHindIII(NEB)
レーン3−一般的制限バッファー+50ユニットのSalI(NEB)
レーン4−0.5×KBB(SDSを有しない電気泳動バッファー)
アガロースゲルの調製:
RBC溶解バッファー中453ng/μlである100μLの単離WBC、
300μLのTBSEG(50mMトリス−HCl、pH7.6、150mM NaCl、1mM EDTA、5%グリセロール)、
2mg/mLずつのブロモフェノールブルーおよびフェノールレッドを有する5μLの溶液
を混合することにより調製した。
RBC溶解バッファー中453ng/μlである40μlの単離WBC、
300μLのTBSEG、
2mg/mLずつのブロモフェノールブルーおよびフェノールレッドを有する5μLの溶液
を混合することにより調製した。
結果を図20に示す。レーン12および14(800ngのDNA/レーン、トランスポザーゼなし)を、レーン13、15、および16(800ngのDNA/レーン、トランスポザーゼあり)と比較すると、DNAの用量依存性切断があることがわかり、トランスポザーゼなしでは、DNAは試料ウェルの壁に留まり、それが大きすぎてゲルに進入できないことを示す。トランスポザーゼ添加ありでは、数百kbpよりも大きい見かけ上の移動度を有する、消化されたDNAのバンドが見られる。これは予想されたことである。なぜなら、合成アダプターをロードさせた変異体Tn5トランスポザソームは、HMW DNAと容易に反応し、合成アダプターの挿入の際にHMW標的DNAを断片化することが実証されているからである。
0.5×KBBバッファー中の0.75%アガロースを含有する、図15Cに示すタイプのカセットを使用した。試薬および試料ウェルの総体積はそれぞれ、350および90μlであった。
5’CTGTCTCTTATACACATCTTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTAGATGTGTATAAGAGACAG3’/
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
試料から核酸を単離するためのシステムであって、
核酸および非核酸要素を含む試料を固定するように構成されているヒドロゲルマトリクス、
前記ヒドロゲルマトリクス中に拡散し、
固定された生体試料と反応し、
細胞の試料の非核酸要素を放出する
ように構成されている試薬、
ならびに
前記非核酸要素の放出後に前記ヒドロゲルマトリクスから前記核酸を溶出するための手段を含む、システム。
(項目2)
前記ヒドロゲルマトリクスが、アガロースゲルを含む、項目1に記載のシステム。
(項目3)
前記生体試料を、ヒドロゲルを含有する融解したゲルと混合して前記ヒドロゲルマトリクスを調製すること、ならびに前記試薬の添加および除去を調節することのうちの少なくとも1つを行うように構成されている1つまたは複数の自動化された液体取扱いデバイスをさらに含む、項目1に記載のシステム。
(項目4)
前記ヒドロゲルマトリクスが担体に付着することを可能にするために前記ヒドロゲルマトリクスと互いにかみ合う形状を有するように構成されている担体
をさらに含む、項目1に記載のシステム。
(項目5)
前記ヒドロゲルマトリクスが、ほぼ等しい体積部のヒドロゲルおよび前記生体試料を含有する、項目1に記載のシステム。
(項目6)
前記試薬が、溶解のための界面活性剤溶液、細菌、真菌、および/もしくは植物の細胞壁を消化するように構成されている酵素を含有する溶液、プロテアーゼ溶液、DNA加工処理酵素を含有する溶液、シークエンシングライブラリーを作製するための酵素および合成アダプターを含有する溶液、ならびに/またはトランスポザソームを含有する溶液を含む、項目1に記載のシステム。
(項目7)
前記ヒドロゲルマトリクスからの前記核酸の電気泳動による溶出を補助するための濾過膜をさらに含み、前記濾過膜は、前記核酸をサイズに基づいて選択的に保持するようにサイズが設定された細孔を含有する、項目1に記載のシステム。
(項目8)
電場が、核酸をサイズに基づいて選択的に回収するように操作される、項目1に記載のシステム。
(項目9)
核酸および非核酸要素を含有する試料から核酸を単離するための方法であって、
温度調節された容器内で前記試料を融解したヒドロゲルと混合するステップ、
生体試料および前記融解したヒドロゲルの混合物のゲル化を引き起こし、前記生体試料を固定するように構成されているヒドロゲルマトリクスを形成するように、前記容器の温度を低下させるステップ、
固定された前記生体試料と反応し前記非核酸要素を放出するために、前記ヒドロゲルマトリクス中に拡散するように構成されている試薬を前記ヒドロゲルマトリクスに導入するステップ、ならびに
前記ヒドロゲルマトリクスから前記核酸を抽出するステップ
を含む方法。
(項目10)
前記ヒドロゲルマトリクスが、アガロースゲルを含む、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記生体試料が、DNA分子を含む、項目9に記載の方法。
(項目12)
前記融解したヒドロゲルと前記生体試料の前記混合が、自動化された液体取扱いデバイスを介して行われる、項目9に記載の方法。
(項目13)
前記試薬への前記ヒドロゲルマトリクスの前記導入が、前記ヒドロゲルマトリクスを担持する担体を前記試薬の混合物中に浸漬することによって行われる、項目9に記載の方法。
(項目14)
前記試薬への前記ヒドロゲルマトリクスの前記導入が、前記試薬を前記ヒドロゲルマトリクス中に電気泳動によって移動させることによって行われる、項目9に記載の方法。
(項目15)
前記核酸をサイズに基づいて選択的に保持するようにサイズが設定された細孔を含有する濾過膜を介して前記核酸を濾過するステップをさらに含む、項目9に記載の方法。
(項目16)
非核酸要素の放出後に前記ヒドロゲルマトリクスから前記非核酸要素を電気泳動によって除去するステップをさらに含む、項目9に記載の方法。
(項目17)
電気泳動バッファーを有する容器、
前記容器内に構成されている電気泳動ゲルマトリクス部分、および
前記電気泳動ゲルマトリクス部分中に構成されている試料ウェル
を含む、電気泳動カセットであって、
前記電気泳動ゲルマトリクス部分が、前記容器を横切って側方に延在して前記容器を2つのチャンバーに分割し、2つの部分のそれぞれが、前記電気泳動バッファーで満たされており、
試料ウェルが、前記電気泳動ゲルマトリクス部分によって前記電気泳動バッファーから隔離されている、
電気泳動カセット。
(項目18)
前記電気泳動ゲルマトリクス部分が、アガロースである、項目17に記載の電気泳動カセット。
(項目19)
前記電気泳動ゲルマトリクス部分が、デンプン、寒天、アガロース、およびポリアクリルアミドのうちの少なくとも1種である、項目17に記載の電気泳動カセット。
(項目20)
前記電気泳動バッファーが、pH7およびpH9の間のpHを有する、前記項目のいずれかに記載の電気泳動カセット。
(項目21)
前記電気泳動バッファーが、キレート剤としてEDTAを含む、前記項目のいずれかに記載の電気泳動カセット。
(項目22)
少なくとも1つの陽極および少なくとも1つの陰極をさらに含み、
前記少なくとも1つの陽極が、前記2つのチャンバーのうちの第1のチャンバーに接続されており、
前記少なくとも1つの陰極が、前記2つのチャンバーのうちの第2のチャンバーに接続されている、
項目17に記載の電気泳動カセット。
(項目23)
電気泳動バッファーで満たされた前記2つのチャンバーが、溶解試薬を受け入れるようにさらに構成されている、項目22に記載の電気泳動カセット。
(項目24)
前記溶解試薬が、陰イオン性界面活性剤および界面活性剤適合性プロテアーゼのうちの少なくとも1種である、項目23に記載の電気泳動カセット。
(項目25)
前記陰イオン性界面活性剤が、約0.1%から約10%重量/体積の間の濃度を有するSDSである、項目24に記載の電気泳動カセット。
(項目26)
前記溶解試薬が、陰イオン性界面活性剤SDSおよびプロテイナーゼKの混合物である、項目24に記載の電気泳動カセット。
(項目27)
電圧が前記電極間を横切って印加されると、前記溶解試薬が、前記電気泳動ゲルマトリクス部分を通して前記試料ウェル内に駆動される、項目23に記載の電気泳動カセット。
(項目28)
前記試料ウェルが生体試料を含有し、電圧を印加することにより、前記2つのチャンバーのうちの前記第2のチャンバーの近くの前記試料ウェルの側面に前記生体試料内のDNA分子の蓄積が引き起こされる、項目24に記載の電気泳動カセット。
(項目29)
前記電圧を逆にすることによって、前記DNA分子が前記試料ウェルの前記側面から離れて移動される、項目28に記載の電気泳動カセット。
(項目30)
前記試料ウェルと前記2つのチャンバーのうちの前記第2のチャンバーとの間に配置された試薬ウェルをさらに含む、項目22に記載の電気泳動カセット。
(項目31)
第1の端部、第2の端部、長さ、幅、第1の長さ方向の側面および第2の長さ方向の側面を有する電気泳動ゲルマトリクス、
前記第1の端部に近接する電気泳動ゲルマトリクス部分中に構成されている試薬を含有する試薬ウェル、
生体細胞の試料を含有し、前記第1の端部に近接し前記試薬ウェルと前記第2の端部との間の前記電気泳動ゲルマトリクス中に構成されている試料ウェル、
前記第1の端部に配置された1対の電気泳動電極のうちの第1の陰極、
前記第2の端部に配置された前記1対の電気泳動電極のうちの第1の陽極
を含む、電気泳動システムであって、
前記1対の電気泳動電極を横切って第1のバイアス電圧を印加すると、試薬が、前記試薬ウェルから、前記試料ウェル内にかつ/または前記試料ウェルを通して駆動される、
電気泳動システム。
(項目32)
前記試料ウェルが、細胞懸濁物を含む、項目31に記載の電気泳動システム。
(項目33)
前記試薬ウェルが、負に荷電した溶解試薬を含む、項目31または32に記載の電気泳動システム。
(項目34)
溶解剤からの溶解の結果として、前記細胞懸濁物中に含有される前記細胞のDNA分子が生成される、項目33に記載の電気泳動システム。
(項目35)
前記DNA分子が、前記試料ウェルの少なくとも1つの側面に蓄積する、項目34に記載の電気泳動システム。
(項目36)
前記1対の電気泳動電極を横切って第2のバイアス電圧を印加すると、蓄積した前記DNAが前記試料ウェルの外に電気泳動されることが引き起こされる、項目35に記載の電気泳動システム。
(項目37)
前記ゲルの前記第1の長さ方向の側面に沿って配置された複数の溶出受け入れ領域またはチャネルであって、それぞれの受け入れ領域が、前記ゲルの前記第1の長さ方向の側面に隣接して配置された第1の側面と、前記受け入れ領域の前記第1の側面から離れて配置された第2の側面とを有する、複数の溶出受け入れ領域またはチャネル、ならびに
それぞれの溶出受け入れチャネルに対応する複数対の溶出電極であって、第1の対の溶出電極の第1の溶出陰極が、第1の溶出受け入れチャネルの前記第1の側面の反対側の前記ゲルの前記第2の長さ方向の側面に近接して配置され、前記第1の対の第1の溶出陽極が、前記第1の溶出受け入れチャネルの前記第2の側面に近接して配置される、複数対の溶出電極
をさらに含み、ここで
第2の始動により、前記溶出受け入れチャネルのうちの1つのチャネルおよび/または別のチャネルに近接して、電気泳動された前記DNAのDNA断片の蓄積が引き起こされ、
前記複数対の溶出電極のうちの1つの対および/または別の対の間を横切ってバイアス電圧を印加することにより、前記DNA断片がそれぞれの溶出チャネルのうちの1つのチャネルおよび/または別のチャネルの中に駆動される、
項目36に記載の電気泳動システム。
(項目38)
項目31に記載のシステムを提供するステップ、
試料ウェル内に細胞懸濁物をロードするステップ、
試薬ウェル内に試薬をロードするステップ、
第1の電圧バイアスを1対の電気泳動電極を横切って印加するステップであって、前記第1の電圧バイアスの印加は、前記試薬ウェルから前記試料ウェルへの前記試薬の移動が引き起こされる、ステップ
を含む、電気泳動方法であって、
前記試薬は、前記懸濁物中の細胞の溶解を引き起こすように構成されており、
前記細胞からのDNA分子は、前記試料ウェルの少なくとも1つの側面に蓄積する、
電気泳動方法。
(項目39)
前記細胞懸濁物を前記試料ウェル内でインキュベートするステップをさらに含む、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記DNA分子を断片に破壊するステップをさらに含む、項目38に記載の方法。
(項目41)
DNA断片を前記試料ウェルから複数の溶出チャネルに電気泳動によって駆動するステップをさらに含む、項目38に記載の方法。
(項目42)
インキュベーションが、
第1の添加物を前記試料ウェルに添加し、その中で前記試料ウェルの内容物である前記細胞と共にインキュベートすること、ならびに/または
第2の添加物を前記試料ウェルに添加し、その中で前記細胞と共にインキュベートすること、ならびに/または
第3の添加物を前記試料ウェルに添加し、その中で前記細胞と共にインキュベートすること
を含む、項目39に記載の方法。
(項目43)
前記第1の添加物、前記第2の添加物、および前記第3の添加物、ならびにそれらの対応するインキュベーションが逐次行われる、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記第1の添加物が、TnおよびPacBioアダプターであり、
前記第2の添加物が、T4pol、dNTP、E.coliリガーゼ、およびNADであり、
前記第3の添加物が、エキソヌクレアーゼT5である、
項目42または43に記載の方法。
Claims (29)
- 細胞を含有する試料から核酸を単離するための核酸単離方法であって、
細胞を含有する試料を、電気泳動ゲルマトリクス中に構成された試料ウェルにロードするステップと、
溶解試薬を、前記電気泳動ゲルマトリクス中に構成された試薬ウェルにロードするステップと、
第1の電圧バイアスを、少なくとも1対の電気泳動電極を横切って印加するステップと
を含み、ここで、
前記電圧バイアスの印加は、前記溶解試薬を、前記電気泳動ゲルマトリクスの部分を通して前記試料ウェル内に駆動するように構成されており、
前記溶解試薬は、前記試料ウェル内での前記細胞の溶解を引き起こすように構成されており、そして、
前記電圧バイアスの印加は、前記細胞から溶解された核酸を、前記電気泳動ゲルマトリクス内の前記試料ウェルの壁に絡めさせるか、または蓄積させるように構成されている、方法。 - 前記電圧バイアスの印加の前に、前記溶解試薬が前記試薬ウェルにロードされる、請求項1に記載の方法。
- 前記試料および前記溶解試薬の少なくとも1つが、キレート剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1対の電気泳動電極が、陰極および陽極を含み、
前記陰極が、前記電気泳動ゲルマトリクスの第1の端に配置されており、
前記陽極が、前記電気泳動ゲルマトリクスの第2の端に配置されており、
前記試薬ウェルが、前記試料ウェルおよび前記電気泳動ゲルマトリクスの前記第1の端の間に配置されており、そして、
前記核酸は、前記電気泳動ゲルマトリクスの前記第2の端に最も近い前記試料ウェルの壁に絡められるか、または蓄積させられる、請求項1に記載の方法。 - 前記試薬ウェルおよび前記試料ウェルの少なくとも1つを空にするステップと、
前記少なくとも1対の電極を横切って第2の電圧を印加するステップであって、前記第2の電圧は、前記第1の電圧の逆電圧であり、前記第2の電圧は、前記試料ウェルの壁に絡められるか、または蓄積させられた核酸の、前記壁から離れて前記試料ウェルの内部に戻る移動を引き起こすように構成されている、ステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記試料ウェルから前記核酸を除去するステップをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 前記試料ウェルおよび前記試薬ウェルの少なくとも1つを空にするステップと、
前記試料ウェルおよび前記試薬ウェルの少なくとも1つを、修飾化合物または核酸修飾酵素を含むバッファーで再充填するステップと、
第2の電圧バイアスを、前記少なくとも1対の電気泳動電極を横切って印加するステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記試料ウェルの壁に絡められるか、または蓄積させられた核酸を、前記第2の電圧バイアスを印加する前に、前記核酸修飾酵素とインキュベートするステップをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記第2の電圧バイアスを印加する前に、前記核酸修飾酵素を不活性化するステップをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記核酸修飾酵素の不活性化が、前記試料ウェルおよび前記試薬ウェルの少なくとも1つにSDSを添加するステップを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記核酸修飾酵素が、二本鎖エンドヌクレアーゼを含み、
前記試料ウェルの壁に絡められるか、または蓄積させられた核酸と前記二本鎖エンドヌクレアーゼとのインキュベーションが、ランダムに断片化された核酸を生じさせる、請求項8に記載の方法。 - 前記核酸が、HMW DNAを含み、前記ランダムに断片化されたHMW DNAが、数100bp〜数千kbのサイズ分布を有する、請求項11に記載の方法。
- 前記第2の電圧バイアスの印加が、前記断片化された核酸を、前記電気泳動ゲルマトリクス中に構成された溶出チャネルに向かって電気泳動させる、請求項11に記載の方法。
- 少なくとも1対の溶出電極を始動して、前記断片化された核酸を、前記試料ウェルの壁から、バッファーが充填された溶出モジュール内に電気溶出するステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記溶出モジュールから、前記断片化された核酸を回収するステップをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 前記試料ウェルの壁に絡められるか、または蓄積させられた核酸に対して少なくとも1つの処理を適用するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの処理が、逐次的酵素処理を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの処理のそれぞれの間に、前記少なくとも1対の電気泳動電極を横切って第2の電圧バイアスを印加するステップをさらに含む、請求項16に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの処理が、以下:制限酵素、蛍光標識化、核酸修復ミックス、反応ミックス、ニッキングエンドヌクレアーゼ、Taq DNAポリメラーゼおよび蛍光ヌクレオチド、ならびに非特異的二本鎖エンドヌクレアーゼの少なくとも1つを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記溶解試薬が陰イオン性界面活性剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 溶解試薬が、キレート剤をさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 前記溶解試薬が、ドデシル硫酸ナトリウムを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記陰イオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウムを含む、請求項20に記載の方法。
- ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が、0.1%から10%重量/体積の間である、請求項22に記載の方法。
- ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が、0.1%から10%重量/体積の間である、請求項23に記載の方法。
- 前記キレート剤がEDTAを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記EDTAが、1〜50mMの濃度である、請求項26に記載の方法。
- 前記キレート剤がEDTAを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記EDTAが、1〜50mMの濃度である、請求項28に記載の方法。
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