JP2017533703A5

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Publication number: JP2017533703A5
Application number: JP2017521158A
Authority: JP
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2018-02-01
Anticipated expiration: 2035-10-15

Description

上の本明細書においてと同様に、特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「担持する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆ）」等のすべての移行句は、オープンエンド型である、すなわち、含むが限定されないことを意味するものと理解されるべきである。米国特許庁特許審査基準セクション２１１１．０３に記載の通り、「からなる」および「から本質的になる」という移行句のみがそれぞれ、クローズドエンド型であるか、セミクローズドエンド型である移行句とする。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
試料から核酸を単離するためのシステムであって、
核酸および非核酸要素を含む試料を固定するように構成されているヒドロゲルマトリクス、
前記ヒドロゲルマトリクス中に拡散し、
固定された生体試料と反応し、
細胞の試料の非核酸要素を放出する
ように構成されている試薬、
ならびに
前記非核酸要素の放出後に前記ヒドロゲルマトリクスから前記核酸を溶出するための手段を含む、システム。
（項目２）
前記ヒドロゲルマトリクスが、アガロースゲルを含む、項目１に記載のシステム。
（項目３）
前記生体試料を、ヒドロゲルを含有する融解したゲルと混合して前記ヒドロゲルマトリクスを調製すること、ならびに前記試薬の添加および除去を調節することのうちの少なくとも１つを行うように構成されている１つまたは複数の自動化された液体取扱いデバイスをさらに含む、項目１に記載のシステム。
（項目４）
前記ヒドロゲルマトリクスが担体に付着することを可能にするために前記ヒドロゲルマトリクスと互いにかみ合う形状を有するように構成されている担体
をさらに含む、項目１に記載のシステム。
（項目５）
前記ヒドロゲルマトリクスが、ほぼ等しい体積部のヒドロゲルおよび前記生体試料を含有する、項目１に記載のシステム。
（項目６）
前記試薬が、溶解のための界面活性剤溶液、細菌、真菌、および／もしくは植物の細胞壁を消化するように構成されている酵素を含有する溶液、プロテアーゼ溶液、ＤＮＡ加工処理酵素を含有する溶液、シークエンシングライブラリーを作製するための酵素および合成アダプターを含有する溶液、ならびに／またはトランスポザソームを含有する溶液を含む、項目１に記載のシステム。
（項目７）
前記ヒドロゲルマトリクスからの前記核酸の電気泳動による溶出を補助するための濾過膜をさらに含み、前記濾過膜は、前記核酸をサイズに基づいて選択的に保持するようにサイズが設定された細孔を含有する、項目１に記載のシステム。
（項目８）
電場が、核酸をサイズに基づいて選択的に回収するように操作される、項目１に記載のシステム。
（項目９）
核酸および非核酸要素を含有する試料から核酸を単離するための方法であって、
温度調節された容器内で前記試料を融解したヒドロゲルと混合するステップ、
生体試料および前記融解したヒドロゲルの混合物のゲル化を引き起こし、前記生体試料を固定するように構成されているヒドロゲルマトリクスを形成するように、前記容器の温度を低下させるステップ、
固定された前記生体試料と反応し前記非核酸要素を放出するために、前記ヒドロゲルマトリクス中に拡散するように構成されている試薬を前記ヒドロゲルマトリクスに導入するステップ、ならびに
前記ヒドロゲルマトリクスから前記核酸を抽出するステップ
を含む方法。
（項目１０）
前記ヒドロゲルマトリクスが、アガロースゲルを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記生体試料が、ＤＮＡ分子を含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記融解したヒドロゲルと前記生体試料の前記混合が、自動化された液体取扱いデバイスを介して行われる、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記試薬への前記ヒドロゲルマトリクスの前記導入が、前記ヒドロゲルマトリクスを担持する担体を前記試薬の混合物中に浸漬することによって行われる、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記試薬への前記ヒドロゲルマトリクスの前記導入が、前記試薬を前記ヒドロゲルマトリクス中に電気泳動によって移動させることによって行われる、項目９に記載の方法。
（項目１５）
前記核酸をサイズに基づいて選択的に保持するようにサイズが設定された細孔を含有する濾過膜を介して前記核酸を濾過するステップをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１６）
非核酸要素の放出後に前記ヒドロゲルマトリクスから前記非核酸要素を電気泳動によって除去するステップをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１７）
電気泳動バッファーを有する容器、
前記容器内に構成されている電気泳動ゲルマトリクス部分、および
前記電気泳動ゲルマトリクス部分中に構成されている試料ウェル
を含む、電気泳動カセットであって、
前記電気泳動ゲルマトリクス部分が、前記容器を横切って側方に延在して前記容器を２つのチャンバーに分割し、２つの部分のそれぞれが、前記電気泳動バッファーで満たされており、
試料ウェルが、前記電気泳動ゲルマトリクス部分によって前記電気泳動バッファーから隔離されている、
電気泳動カセット。
（項目１８）
前記電気泳動ゲルマトリクス部分が、アガロースである、項目１７に記載の電気泳動カセット。
（項目１９）
前記電気泳動ゲルマトリクス部分が、デンプン、寒天、アガロース、およびポリアクリルアミドのうちの少なくとも１種である、項目１７に記載の電気泳動カセット。
（項目２０）
前記電気泳動バッファーが、ｐＨ７およびｐＨ９の間のｐＨを有する、前記項目のいずれかに記載の電気泳動カセット。
（項目２１）
前記電気泳動バッファーが、キレート剤としてＥＤＴＡを含む、前記項目のいずれかに記載の電気泳動カセット。
（項目２２）
少なくとも１つの陽極および少なくとも１つの陰極をさらに含み、
前記少なくとも１つの陽極が、前記２つのチャンバーのうちの第１のチャンバーに接続されており、
前記少なくとも１つの陰極が、前記２つのチャンバーのうちの第２のチャンバーに接続されている、
項目１７に記載の電気泳動カセット。
（項目２３）
電気泳動バッファーで満たされた前記２つのチャンバーが、溶解試薬を受け入れるようにさらに構成されている、項目２２に記載の電気泳動カセット。
（項目２４）
前記溶解試薬が、陰イオン性界面活性剤および界面活性剤適合性プロテアーゼのうちの少なくとも１種である、項目２３に記載の電気泳動カセット。
（項目２５）
前記陰イオン性界面活性剤が、約０．１％から約１０％重量／体積の間の濃度を有するＳＤＳである、項目２４に記載の電気泳動カセット。
（項目２６）
前記溶解試薬が、陰イオン性界面活性剤ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫの混合物である、項目２４に記載の電気泳動カセット。
（項目２７）
電圧が前記電極間を横切って印加されると、前記溶解試薬が、前記電気泳動ゲルマトリクス部分を通して前記試料ウェル内に駆動される、項目２３に記載の電気泳動カセット。
（項目２８）
前記試料ウェルが生体試料を含有し、電圧を印加することにより、前記２つのチャンバーのうちの前記第２のチャンバーの近くの前記試料ウェルの側面に前記生体試料内のＤＮＡ分子の蓄積が引き起こされる、項目２４に記載の電気泳動カセット。
（項目２９）
前記電圧を逆にすることによって、前記ＤＮＡ分子が前記試料ウェルの前記側面から離れて移動される、項目２８に記載の電気泳動カセット。
（項目３０）
前記試料ウェルと前記２つのチャンバーのうちの前記第２のチャンバーとの間に配置された試薬ウェルをさらに含む、項目２２に記載の電気泳動カセット。
（項目３１）
第１の端部、第２の端部、長さ、幅、第１の長さ方向の側面および第２の長さ方向の側面を有する電気泳動ゲルマトリクス、
前記第１の端部に近接する電気泳動ゲルマトリクス部分中に構成されている試薬を含有する試薬ウェル、
生体細胞の試料を含有し、前記第１の端部に近接し前記試薬ウェルと前記第２の端部との間の前記電気泳動ゲルマトリクス中に構成されている試料ウェル、
前記第１の端部に配置された１対の電気泳動電極のうちの第１の陰極、
前記第２の端部に配置された前記１対の電気泳動電極のうちの第１の陽極
を含む、電気泳動システムであって、
前記１対の電気泳動電極を横切って第１のバイアス電圧を印加すると、試薬が、前記試薬ウェルから、前記試料ウェル内にかつ／または前記試料ウェルを通して駆動される、
電気泳動システム。
（項目３２）
前記試料ウェルが、細胞懸濁物を含む、項目３１に記載の電気泳動システム。
（項目３３）
前記試薬ウェルが、負に荷電した溶解試薬を含む、項目３１または３２に記載の電気泳動システム。
（項目３４）
溶解剤からの溶解の結果として、前記細胞懸濁物中に含有される前記細胞のＤＮＡ分子が生成される、項目３３に記載の電気泳動システム。
（項目３５）
前記ＤＮＡ分子が、前記試料ウェルの少なくとも１つの側面に蓄積する、項目３４に記載の電気泳動システム。
（項目３６）
前記１対の電気泳動電極を横切って第２のバイアス電圧を印加すると、蓄積した前記ＤＮＡが前記試料ウェルの外に電気泳動されることが引き起こされる、項目３５に記載の電気泳動システム。
（項目３７）
前記ゲルの前記第１の長さ方向の側面に沿って配置された複数の溶出受け入れ領域またはチャネルであって、それぞれの受け入れ領域が、前記ゲルの前記第１の長さ方向の側面に隣接して配置された第１の側面と、前記受け入れ領域の前記第１の側面から離れて配置された第２の側面とを有する、複数の溶出受け入れ領域またはチャネル、ならびに
それぞれの溶出受け入れチャネルに対応する複数対の溶出電極であって、第１の対の溶出電極の第１の溶出陰極が、第１の溶出受け入れチャネルの前記第１の側面の反対側の前記ゲルの前記第２の長さ方向の側面に近接して配置され、前記第１の対の第１の溶出陽極が、前記第１の溶出受け入れチャネルの前記第２の側面に近接して配置される、複数対の溶出電極
をさらに含み、ここで
第２の始動により、前記溶出受け入れチャネルのうちの１つのチャネルおよび／または別のチャネルに近接して、電気泳動された前記ＤＮＡのＤＮＡ断片の蓄積が引き起こされ、
前記複数対の溶出電極のうちの１つの対および／または別の対の間を横切ってバイアス電圧を印加することにより、前記ＤＮＡ断片がそれぞれの溶出チャネルのうちの１つのチャネルおよび／または別のチャネルの中に駆動される、
項目３６に記載の電気泳動システム。
（項目３８）
項目３１に記載のシステムを提供するステップ、
試料ウェル内に細胞懸濁物をロードするステップ、
試薬ウェル内に試薬をロードするステップ、
第１の電圧バイアスを１対の電気泳動電極を横切って印加するステップであって、前記第１の電圧バイアスの印加は、前記試薬ウェルから前記試料ウェルへの前記試薬の移動が引き起こされる、ステップ
を含む、電気泳動方法であって、
前記試薬は、前記懸濁物中の細胞の溶解を引き起こすように構成されており、
前記細胞からのＤＮＡ分子は、前記試料ウェルの少なくとも１つの側面に蓄積する、
電気泳動方法。
（項目３９）
前記細胞懸濁物を前記試料ウェル内でインキュベートするステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記ＤＮＡ分子を断片に破壊するステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
ＤＮＡ断片を前記試料ウェルから複数の溶出チャネルに電気泳動によって駆動するステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
インキュベーションが、
第１の添加物を前記試料ウェルに添加し、その中で前記試料ウェルの内容物である前記細胞と共にインキュベートすること、ならびに／または
第２の添加物を前記試料ウェルに添加し、その中で前記細胞と共にインキュベートすること、ならびに／または
第３の添加物を前記試料ウェルに添加し、その中で前記細胞と共にインキュベートすること
を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４３）
前記第１の添加物、前記第２の添加物、および前記第３の添加物、ならびにそれらの対応するインキュベーションが逐次行われる、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記第１の添加物が、ＴｎおよびＰａｃＢｉｏアダプターであり、
前記第２の添加物が、Ｔ４ｐｏｌ、ｄＮＴＰ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、およびＮＡＤであり、
前記第３の添加物が、エキソヌクレアーゼＴ５である、
項目４２または４３に記載の方法。

Claims

試料から核酸を単離するためのシステムであって、
核酸および非核酸要素を含む試料を固定するように構成されているヒドロゲルマトリクス、
前記ヒドロゲルマトリクス中に拡散し、
固定された生体試料と反応し、
細胞の試料の非核酸要素を放出する
ように構成されている試薬、
ならびに
前記非核酸要素の放出後に前記ヒドロゲルマトリクスから前記核酸を溶出するための手段を含む、システム。
前記ヒドロゲルマトリクスが、アガロースゲルを含む、請求項１に記載のシステム。
前記生体試料を、ヒドロゲルを含有する融解したゲルと混合して前記ヒドロゲルマトリクスを調製すること、ならびに前記試薬の添加および除去を調節することのうちの少なくとも１つを行うように構成されている１つまたは複数の自動化された液体取扱いデバイスをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
前記ヒドロゲルマトリクスが担体に付着することを可能にするために前記ヒドロゲルマトリクスと互いにかみ合う形状を有するように構成されている担体
をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
前記ヒドロゲルマトリクスが、ほぼ等しい体積部のヒドロゲルおよび前記生体試料を含有する、請求項１に記載のシステム。
前記試薬が、溶解のための界面活性剤溶液、細菌、真菌、および／もしくは植物の細胞壁を消化するように構成されている酵素を含有する溶液、プロテアーゼ溶液、ＤＮＡ加工処理酵素を含有する溶液、シークエンシングライブラリーを作製するための酵素および合成アダプターを含有する溶液、ならびに／またはトランスポザソームを含有する溶液を含む、請求項１に記載のシステム。
前記ヒドロゲルマトリクスからの前記核酸の電気泳動による溶出を補助するための濾過膜をさらに含み、前記濾過膜は、前記核酸をサイズに基づいて選択的に保持するようにサイズが設定された細孔を含有する、請求項１に記載のシステム。
電場が、核酸をサイズに基づいて選択的に回収するように操作される、請求項１に記載のシステム。
核酸および非核酸要素を含有する試料から核酸を単離するための方法であって、
温度調節された容器内で前記試料を融解したヒドロゲルと混合するステップ、
生体試料および前記融解したヒドロゲルの混合物のゲル化を引き起こし、前記生体試料を固定するように構成されているヒドロゲルマトリクスを形成するように、前記容器の温度を低下させるステップ、
固定された前記生体試料と反応し前記非核酸要素を放出するために、前記ヒドロゲルマトリクス中に拡散するように構成されている試薬を前記ヒドロゲルマトリクスに導入するステップ、ならびに
前記ヒドロゲルマトリクスから前記核酸を抽出するステップ
を含む方法。
前記ヒドロゲルマトリクスが、アガロースゲルを含む、請求項９に記載の方法。
前記生体試料が、ＤＮＡ分子を含む、請求項９に記載の方法。
前記融解したヒドロゲルと前記生体試料の前記混合が、自動化された液体取扱いデバイスを介して行われる、請求項９に記載の方法。
前記試薬への前記ヒドロゲルマトリクスの前記導入が、前記ヒドロゲルマトリクスを担持する担体を前記試薬の混合物中に浸漬することによって行われる、請求項１０に記載の方法。
前記試薬への前記ヒドロゲルマトリクスの前記導入が、前記試薬を前記ヒドロゲルマトリクス中に電気泳動によって移動させることによって行われる、請求項９に記載の方法。
前記核酸をサイズに基づいて選択的に保持するようにサイズが設定された細孔を含有する濾過膜を介して前記核酸を濾過するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
非核酸要素の放出後に前記ヒドロゲルマトリクスから前記非核酸要素を電気泳動によって除去するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
電気泳動バッファーを有する容器、
前記容器内に構成されている電気泳動ゲルマトリクス部分、および
前記電気泳動ゲルマトリクス部分中に構成されている試料ウェル
を含む、電気泳動カセットであって、
前記電気泳動ゲルマトリクス部分が、前記容器を横切って側方に延在して前記容器を２つのチャンバーに分割し、２つの部分のそれぞれが、前記電気泳動バッファーで満たされており、
試料ウェルが、前記電気泳動ゲルマトリクス部分によって前記電気泳動バッファーから隔離されている、
電気泳動カセット。
前記電気泳動ゲルマトリクス部分が、アガロースである、請求項１７に記載の電気泳動カセット。
前記電気泳動ゲルマトリクス部分が、デンプン、寒天、アガロース、およびポリアクリルアミドのうちの少なくとも１種である、請求項１７に記載の電気泳動カセット。
前記電気泳動バッファーが、ｐＨ７およびｐＨ９の間のｐＨを有する、請求項１７に記載の電気泳動カセット。
前記電気泳動バッファーが、キレート剤としてＥＤＴＡを含む、請求項１７に記載の電気泳動カセット。
少なくとも１つの陽極および少なくとも１つの陰極をさらに含み、
前記少なくとも１つの陽極が、前記２つのチャンバーのうちの第１のチャンバーに接続されており、
前記少なくとも１つの陰極が、前記２つのチャンバーのうちの第２のチャンバーに接続されている、
請求項１７に記載の電気泳動カセット。
電気泳動バッファーで満たされた前記２つのチャンバーが、溶解試薬を受け入れるようにさらに構成されている、請求項２２に記載の電気泳動カセット。
前記溶解試薬が、陰イオン性界面活性剤および界面活性剤適合性プロテアーゼのうちの少なくとも１種である、請求項２３に記載の電気泳動カセット。
前記陰イオン性界面活性剤が、約０．１％から約１０％重量／体積の間の濃度を有するＳＤＳである、請求項２４に記載の電気泳動カセット。
前記溶解試薬が、陰イオン性界面活性剤ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫの混合物である、請求項２４に記載の電気泳動カセット。
電圧が前記電極間を横切って印加されると、前記溶解試薬が、前記電気泳動ゲルマトリクス部分を通して前記試料ウェル内に駆動される、請求項２３に記載の電気泳動カセット。
前記試料ウェルが生体試料を含有し、電圧を印加することにより、前記２つのチャンバーのうちの前記第２のチャンバーの近くの前記試料ウェルの側面に前記生体試料内のＤＮＡ分子の蓄積が引き起こされる、請求項２４に記載の電気泳動カセット。
前記電圧を逆にすることによって、前記ＤＮＡ分子が前記試料ウェルの前記側面から離れて移動される、請求項２８に記載の電気泳動カセット。
前記試料ウェルと前記２つのチャンバーのうちの前記第２のチャンバーとの間に配置された試薬ウェルをさらに含む、請求項２２に記載の電気泳動カセット。
第１の端部、第２の端部、長さ、幅、第１の長さ方向の側面および第２の長さ方向の側面を有する電気泳動ゲルマトリクス、
前記第１の端部に近接する電気泳動ゲルマトリクス部分中に構成されている試薬を含有する試薬ウェル、
生体細胞の試料を含有し、前記第１の端部に近接し前記試薬ウェルと前記第２の端部との間の前記電気泳動ゲルマトリクス中に構成されている試料ウェル、
前記第１の端部に配置された１対の電気泳動電極のうちの第１の陰極、
前記第２の端部に配置された前記１対の電気泳動電極のうちの第１の陽極
を含む、電気泳動システムであって、
前記１対の電気泳動電極を横切って第１のバイアス電圧を印加すると、試薬が、前記試薬ウェルから、前記試料ウェル内にかつ／または前記試料ウェルを通して駆動される、
電気泳動システム。
前記試料ウェルが、細胞懸濁物を含む、請求項３１に記載の電気泳動システム。
前記試薬ウェルが、負に荷電した溶解試薬を含む、請求項３１または３２に記載の電気泳動システム。
溶解剤からの溶解の結果として、前記細胞懸濁物中に含有される前記細胞のＤＮＡ分子が生成される、請求項３３に記載の電気泳動システム。
前記ＤＮＡ分子が、前記試料ウェルの少なくとも１つの側面に蓄積する、請求項３４に記載の電気泳動システム。
前記１対の電気泳動電極を横切って第２のバイアス電圧を印加すると、蓄積した前記ＤＮＡが前記試料ウェルの外に電気泳動されることが引き起こされる、請求項３５に記載の電気泳動システム。
前記ゲルの前記第１の長さ方向の側面に沿って配置された複数の溶出受け入れ領域またはチャネルであって、それぞれの受け入れ領域が、前記ゲルの前記第１の長さ方向の側面に隣接して配置された第１の側面と、前記受け入れ領域の前記第１の側面から離れて配置された第２の側面とを有する、複数の溶出受け入れ領域またはチャネル、ならびに
それぞれの溶出受け入れチャネルに対応する複数対の溶出電極であって、第１の対の溶出電極の第１の溶出陰極が、第１の溶出受け入れチャネルの前記第１の側面の反対側の前記ゲルの前記第２の長さ方向の側面に近接して配置され、前記第１の対の第１の溶出陽極が、前記第１の溶出受け入れチャネルの前記第２の側面に近接して配置される、複数対の溶出電極
をさらに含み、ここで
第２の始動により、前記溶出受け入れチャネルのうちの１つのチャネルおよび／または別のチャネルに近接して、電気泳動された前記ＤＮＡのＤＮＡ断片の蓄積が引き起こされ、
前記複数対の溶出電極のうちの１つの対および／または別の対の間を横切ってバイアス電圧を印加することにより、前記ＤＮＡ断片がそれぞれの溶出チャネルのうちの１つのチャネルおよび／または別のチャネルの中に駆動される、
請求項３６に記載の電気泳動システム。
請求項３１に記載のシステムを提供するステップ、
試料ウェル内に細胞懸濁物をロードするステップ、
試薬ウェル内に試薬をロードするステップ、
第１の電圧バイアスを１対の電気泳動電極を横切って印加するステップであって、前記第１の電圧バイアスの印加により、前記試薬ウェルから前記試料ウェルへの前記試薬の移動が引き起こされる、ステップ
を含む、電気泳動方法であって、
前記試薬は、前記懸濁物中の細胞の溶解を引き起こすように構成されており、
前記細胞からのＤＮＡ分子は、前記試料ウェルの少なくとも１つの側面に蓄積する、
電気泳動方法。
前記細胞懸濁物を前記試料ウェル内でインキュベートするステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
前記ＤＮＡ分子を断片に破壊するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
ＤＮＡ断片を前記試料ウェルから複数の溶出チャネルに電気泳動によって駆動するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
インキュベーションが、
第１の添加物を前記試料ウェルに添加し、その中で前記試料ウェルの内容物である前記細胞と共にインキュベートすること、ならびに／または
第２の添加物を前記試料ウェルに添加し、その中で前記細胞と共にインキュベートすること、ならびに／または
第３の添加物を前記試料ウェルに添加し、その中で前記細胞と共にインキュベートすること
を含む、請求項３９に記載の方法。
前記第１の添加物、前記第２の添加物、および前記第３の添加物、ならびにそれらの対応するインキュベーションが逐次行われる、請求項４２に記載の方法。
前記第１の添加物が、ＴｎおよびＰａｃＢｉｏアダプターであり、
前記第２の添加物が、Ｔ４ｐｏｌ、ｄＮＴＰ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、およびＮＡＤであり、
前記第３の添加物が、エキソヌクレアーゼＴ５である、
請求項４２または４３に記載の方法。