ES2341103T3

ES2341103T3 - Procedimiento de separacion continua de particulas usando reticulados de obstaculos alineados asimetricamente respecto a campos.

Info

Publication number: ES2341103T3
Application number: ES03799838T
Authority: ES
Inventors: Richard Lotien Huang; James Christopher Sturm; Robert Hamilton Austin
Original assignee: Princeton University
Current assignee: Princeton University
Priority date: 2002-10-23
Filing date: 2003-10-23
Publication date: 2010-06-15
Anticipated expiration: 2023-10-23
Also published as: EP1585583B1; WO2004037374A3; DE60332046D1; US20070187250A1; WO2004037374A2; AU2003299553A8; US20130168298A1; AU2003299553A1; ATE463292T1; US7150812B2; US7988840B2; EP1585583A2; US8282799B2; US20120006728A1; EP1585583A4; US20040144651A1; US8906322B2

Abstract

Un dispositivo microfluídico para separar partículas según su tamaño que comprende: un canal microfluídico y un reticulado que comprende una red de intersticios dentro del canal microfluídico, en el que el dispositivo emplea un campo que propele las partículas que se separan en el canal microfluídico; y caracterizado porque un flujo del campo procedente de los intersticios se divide desigualmente en un componente principal del flujo y un componente secundario del flujo en intersticios subsiguientes en la red, de tal modo que la dirección media del componente secundario del flujo no es paralela a la dirección media del campo, y, cuando se introducen partículas en el reticulado, las partículas que tienen un tamaño menor que un tamaño crítico predeterminado son transportadas, por lo general, en la dirección media del campo, y las partículas que tienen un tamaño al menos igual que el tamaño crítico son transportadas, por lo general, en la dirección media del componente principal del flujo, separándose con ello las partículas según su tamaño.

Description

Procedimiento de separación continua de partículas usando reticulados de obstáculos alineados asimétricamente respecto a campos.

Campo de la invención

La presente invención versa acerca de procedimientos y dispositivos para separar partículas según su tamaño. Más específicamente, la presente invención versa acerca de un procedimiento y un dispositivo microfluídicos para la separación de partículas según su tamaño.

Antecedentes

La separación por tamaño o masa es una técnica analítica y preparativa fundamental en biología, medicina, química y en la industria. Los procedimientos convencionales incluyen la electroforesis en gel, el fraccionamiento campo-flujo, la sedimentación y la cromatografía por exclusión de tamaño [J. C. Giddings, Unified Separation Science (Wiley, Nueva York, 1991)]. La electroforesis en gel utiliza un campo eléctrico para hacer que las moléculas cargadas se separen en un medio en forma de gel, que hace de matriz de colado. Las moléculas se cargan inicialmente en un extremo de la matriz de gel, y se separan en zonas componentes según migran por el gel. El fraccionamiento campo-flujo se lleva a cabo en un canal fino a modo de cinta en el que el perfil del flujo es parabólico. Se cargan las partículas como una zona de muestra, y luego fluyen por el canal. La separación se produce cuando partículas de propiedades diferentes fluyen en diferentes posiciones de flujo, debido a la influencia de un campo, lo que da como resultado velocidades de migración diferentes. El campo se aplica perpendicular al flujo. La sedimentación utiliza la aceleración gravitatoria o centrífuga para obligar a las partículas a atravesar un fluido. Las partículas migran por el fluido a diferentes velocidades, dependiendo de su tamaño y densidad, y, por ello, se separan. La cromatografía por exclusión de tamaño (CET) utiliza un tubo lleno de perlas porosas, mediante las cuales se lavan moléculas de muestra. Las moléculas menores que los poros pueden entrar en las perlas, lo que alarga su trayectoria de migración, mientras que las mayores que los poros únicamente pueden fluir entre las perlas. De esta forma, las moléculas menores son retenidas, como media, durante más tiempo y así se separan de las moléculas mayores. Sin embargo, las zonas se amplían al pasar por la columna, porque hay muchas trayectorias de migración posibles para cada molécula, y cada trayectoria tiene una longitud diferente, y, en consecuencia, un tiempo de retención diferente. Esta ampliación de la zona de trayectorias múltiples (difusión de Eddy) es un factor fundamental que limita la resolución. J. C. Giddings, Unified Separation Science (John Wiley & Sons, Nueva York, 1991). Otros procedimientos de separación según el tamaño, incluyendo la electroforesis en gel y el fraccionamiento campo-flujo, también conllevan procesos estocásticos, lo que puede limitar su resolución. J. C. Giddings, Nature 184, 357 (1959); J. C. Giddings, Science 260, 1456 (1993). El documento US 5 837 115 da a conocer un aparato y un procedimiento de clasificación para fraccionar y simultáneamente ver microestructuras individuales, como células libres, virus, macromoléculas o partículas diminutas en un medio fluido, en el que el aparato de clasificación está compuesto de un sustrato que tiene un receptáculo situado en su interior, teniendo el receptáculo paredes laterales y un suelo, y en el que se coloca un reticulado de obstáculos dentro del receptáculo, elevándose los obstáculos del suelo del receptáculo.

No puede insistirse lo suficiente en la necesidad de una separación fiable y rápida de grandes biomoléculas, como el ADN y las proteínas. Recientemente, se han demostrado estructuras fabricadas a micro/nanoescala que aprovechan diversas ideas para la separación del ADN. El uso de estructuras fabricadas a micro/nanoescala como matrices de colado para la separación de partículas se dio a conocer en la patente estadounidense nº 5.427.663. Según ese documento, las moléculas de ADN se separan según son impulsadas por campos eléctricos a través de un reticulado de postes. La patente estadounidense nº 5.427.663 da a conocer un aparato y un procedimiento de clasificación para fraccionar y simultáneamente ver microestructuras y macromoléculas individuales, incluyendo ácidos nucleicos y proteínas. Según la patente estadounidense nº 5.427.663, se proporciona un sustrato que tiene un receptáculo poco profundo situado en un lateral del mismo, y se proporciona un reticulado de obstáculos que sobresalen del suelo de los receptáculos para que interactúen con las microestructuras y retarden la migración de las mismas. Para crear la migración de las microestructuras, se fabrican electrodos en dos lados del receptáculo para generar campos eléctricos en el fluido. Esto es análogo a la electroforesis convencional en gel. Sin embargo, el gel es sustituido por estructuras micromecanizadas como matrices de colado.

Se han dado a conocer varias matrices de colado microfabricadas. En un diseño, reticulados de obstáculos clasifican moléculas de ADN según sus coeficientes de difusión usando un campo eléctrico aplicado [Chou, C. F. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 13762 (1999)]. El campo eléctrico propele las moléculas directamente por los intersticios entre los obstáculos, en el que cada intersticio está directamente debajo de otro intersticio. Los obstáculos están modelados de forma que la difusión esté polarizada en una dirección según fluye el ADN por el reticulado. Tras fluir a través de muchas filas de obstáculos, se detectan ADN con diferentes coeficientes de difusión en diferentes posiciones. Sin embargo, dado que el coeficiente de difusión para las moléculas grandes es reducido, los reticulados asimétricos de obstáculos son lentos, típicamente con tiempos de utilización de más de 2 horas. En un segundo diseño, trampas entrópicas que consisten en una serie de muchos estrechamientos angostos (< 100 nm) separadas por regiones más anchas y más profundas (algunos micrómetros) reducen el tiempo de separación a aproximadamente 30 minutos [Han, J. & Craighead, H. G., Science 288, 1026 (2000)]. Dado que los estrechamientos se fabrican para que sean más angostos que el radio de giro para que se separen las moléculas de ADN, actúan como barreras entrópicas. La probabilidad de que una molécula supere la barrera entrópica depende del peso molecular, y, por ello, las moléculas de ADN migran en el reticulado de trampas entrópicas con movilidades diferentes. Las moléculas mayores, como más grados de libertad configuracional, migran con mayor rapidez en estos dispositivos. En un tercer diseño, un reticulado hexagonal de postes actúa como matriz de colado en una electroforesis de campo por impulsos para la separación de moléculas de ADN en el intervalo de 100 kb [Huang, L. R., Tegenfeldt, J. O., Kraeft, J. J., Sturm, J. C., Austin, R. H. y Cox, E. C., Nat Biotechnol. 20,1048 (2002)]. Sin embargo, generalmente estos dispositivos requieren características con tamaños comparables o menores que los de las moléculas que se fraccionan. Han, J. & Craighead, H. G. Separation of long DNA molecules in a microfabricated entropic trap array. Science 288, 1026-1029 (2000); Turner, S. W., Cabodi, M., Craighead, H. G. Confinement-induced entropic recoil of single DNA molecules in a nanofluidic structure. Phys Rev Lett. 2002 Mar 25; 88(12):128103; Huang, L. R., Tegenfeldt, J. O., Kraeft, J. J., Sturm, J. C., Austin, R. H. y Cox, E. C. A DNA prism for high-speed continuous fractionation of large DNA molecules. Nat Biotechnol. 2002 Oct; 20(10): 1048-51; y Huang, L. R., Silberzan, P., Tegenfeldt, J. O., Cox, E. C., Sturm, J. C., Austin, R. H. y Craighead, H. Role of molecular size in ratchet fractionation. Phys. Rev. Lett. 89, 178301 (2002). La necesidad de rasgos de tamaño pequeño tienen los siguientes efectos perjudiciales: (i) los dispositivos no pueden fraccionar moléculas pequeñas, como las proteínas; (ii) los dispositivos pueden tener un rendimiento muy bajo y, por ello, no son instrumentos útiles para la preparación de muestras; (iii) los dispositivos únicamente pueden analizar un volumen muy pequeño de muestras, y, por lo tanto, requieren habitualmente muestras concentradas o equipos caros para una detección de muestras; y (iv) la fabricación de los dispositivos requiere técnicas punteras de fabricación y, por ello, de costo elevado.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un dispositivo microfluídico para separar partículas conforme a la reivindicación 1.

En una realización preferida, la presente invención proporciona un dispositivo microfluídico para separar partículas según su tamaño que comprende un canal microfluídico y un reticulado ordenado de obstáculos dentro del canal microfluídico. El reticulado ordenado de obstáculos es asimétrico con respecto a la dirección media del campo aplicado. El dispositivo emplea un campo que propele las partículas que se separan en el canal microfluídico.

La invención también proporciona un procedimiento para separar partículas conforme a la reivindicación 15.

En una realización preferida, la presente invención también proporciona un procedimiento para separar partículas según su tamaño que comprende: introducir las partículas que deban separarse en un canal microfluídico que comprende una red ordenada de obstáculos, y aplicar un campo a las partículas, en el que el reticulado ordenado de obstáculos es asimétrico con respecto a la dirección media del campo aplicado.

En otra realización preferida, la presente invención proporciona un dispositivo microfluídico para separar partículas según su tamaño que comprende un canal microfluídico y reticulados múltiples en serie dentro del canal microfluídico, en el que cada reticulado tiene un tamaño crítico diferente. El dispositivo emplea un campo que propele las partículas que se separan en el canal microfluídico. Cada uno de los reticulados comprende una red de intersticios en los que un flujo del campo procedente de los intersticios se divide desigualmente en un componente principal del flujo y un componente secundario del flujo en intersticios subsiguientes en la red. La dirección media del componente principal del flujo en cada reticulado no es paralela a la dirección media del campo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de un dispositivo de reticulado conforme a una realización de la presente invención. El dispositivo consiste en un reticulado asimétrico de obstáculos con respecto a la dirección del campo.

La Figura 2 muestra un diagrama esquemático de una vista en perspectiva de una realización preferida de la invención, que comprende un sustrato base con una superficie principal, en la que se crea una pista de obstáculos para formar una red de intersticios, en la que ocurren cascadas de bifurcaciones desiguales del flujo del campo. La pista de obstáculos puede estar tapada con una capa de cubierta para formar una red cerrada de intersticios.

La Figura 3 muestra un diagrama esquemático de un reticulado de obstáculos. El reticulado de obstáculos es simétrico con respecto a las líneas discontinuas (eje principal), pero asimétrico con respecto a la dirección del campo.

La Figura 4 muestra un diagrama esquemático de una realización de la invención, que comprende una red de intersticios definidos por un reticulado de obstáculos. Cada línea de corriente representa una cantidad igual de flujo de campo. El flujo de campo de un intersticio se divide en dos intersticios subsiguientes, en los que las cantidades de flujo que entran en los intersticios son desiguales. En este caso, dos líneas de corriente van a la izquierda (componente principal del flujo) y una línea de corriente va a la derecha (componente secundario del flujo) en cada intersticio. La flecha gris indica la dirección del reticulado.

La Figura 5 muestra un diagrama esquemático de partículas separadas en un dispositivo de reticulado conforme a una realización de la presente invención. Las partículas pequeñas se mueven en la dirección del campo, y las grandes hacia la dirección del reticulado.

La Figura 6 muestra un diagrama esquemático de un reticulado de obstáculos que muestra las dimensiones características del reticulado. \lambda denota el periodo de una fila de obstáculos, d el intersticio de separación entre obstáculos y a\lambda el desplazamiento lateral de cada fila.

La Figura 7 muestra un diagrama esquemático de un reticulado particular que muestra que las líneas de campo rodean los obstáculos. La línea discontinuo del centro marca la división de las líneas de campo que van a lados diferentes del obstáculo.

La Figura 8 muestra un diagrama esquemático de un reticulado particular que ilustra que las líneas de campo desplazan sus posiciones relativas en los intersticios. Como ilustración, a = 1/3 y cada intersticio se divide en tres ranuras, que se denotan por 1, 2 y 3. Las líneas de campo que pasan por la ranura 1 van a la ranura 2 en el siguiente intersticio; las que pasan por la ranura 2 van a la 3, y las que pasan por la 3, a la 1.

La Figura 9 muestra un diagrama esquemático de un reticulado particular que ilustra la trayectoria de las partículas pequeñas.

La Figura 10 muestra un diagrama esquemático de un reticulado particular que ilustra el desplazamiento de las partículas grandes por los obstáculos.

La Figura 11 muestra un diagrama esquemático de un reticulado particular que ilustra la trayectoria de las partículas grandes. Las partículas grandes se mueven a lo largo de la dirección del reticulado (modo de desplazamiento). Obsérvese que aunque la partícula parta del lado izquierdo del intersticio, acaba moviéndose al lado derecho y se queda a la derecha, por cuanto es desplazada constantemente por obstáculos.

La Figura 12 muestra un gráfico de la dirección de la migración de las partículas en función de su tamaño. Existe un tamaño crítico de partícula R_{0} en el que ocurre una transición brusca de la dirección de migración.

La Figura 13 muestra un diagrama esquemático de dos reticulados de tamaños críticos diferentes en serie. Las partículas en la salida 1 son menores que R_{1}, tamaño crítico del primer reticulado de la serie; las de la salida 2, entre el tamaño R_{1} y R_{2}, y las de la salida 3 son mayores que R_{2}, tamaño crítico del segundo reticulado.

La Figura 14 muestra un diagrama esquemático de múltiples reticulados en serie, en los que cada reticulado tiene un tamaño crítico diferente. La línea horizontal discontinua representa la división entre reticulados subsiguientes, y cada reticulado subsiguiente en la serie tiene un tamaño crítico creciente. Así, puede fraccionarse y analizarse con un dispositivo una distribución continua de tamaños moleculares.

La Figura 15 muestra una vista esquemática en planta de una realización de la invención que usa un reticulado cuadrado de obstáculos circulares para formar la red de intersticios, inclinado un ángulo pequeño \theta con respecto al campo. El reticulado cuadrado es surcado por los vectores primitivos x e y, que son perpendiculares entre sí. La bifurcación del flujo del campo ocurre debido a la asimetría del reticulado de obstáculos con respecto al
campo.

La Figura 16 muestra una vista esquemática en planta de una realización de la invención. Cada obstáculo está centrado en un punto del entramado, surcado por los vectores primitivos x e y. Sin embargo, los obstáculos pueden tener formas diferentes.

La Figura 17 muestra una vista esquemática en planta de una realización de la invención. Cada obstáculo puede ser idéntico, con el mismo periodo horizontal \lambda. Sin embargo, cada fila de obstáculos está desplazada horizontalmente una cantidad diferente con respecto a la fila anterior, y la pista de obstáculos no es un entramado periódico.

La Figura 18 muestra un diagrama esquemático de un dispositivo microfluídico para la separación por flujo continuo, con estructuras de carga de muestras.

La Figura 19 muestra un diagrama esquemático de un dispositivo microfluídico para la separación por flujo continuo tal como se construye en el Ejemplo 1.

La Figura 20 muestra imágenes fluorescentes de microesferas que migran en el reticulado de obstáculos, que muestran (A) los dos modos de transporte para (B) la separación de las microesferas sin dispersión alguna. Los puntos grises en (A), que representan los obstáculos, se han superpuesto sobre la imagen fluorescente.

La Figura 21 muestra los perfiles fluorescentes de microesferas separadas usando velocidades reducidas de \sim40 \mum/s (curvas superiores) y \sim400 \mum/*s (curvas inferiores) escaneados a \sim11 mm del punto de la inyección. Las perlas de 0,60 \mum, 0,80 \mum y 1,03 \mum de diámetro son verdes fluorescentes, mientras que las de 0,70 \mum y 0,90 \mum son rojas, y, por ello, cada escaneo se muestra como dos curvas que representan los dos colores.

La Figura 22 muestra los ángulos de migración medidos como función del diámetro de las microesferas a dos velocidades diferentes de flujo.

La Figura 23 muestra un diagrama esquemático de un dispositivo para la separación de partículas que comprende un reticulado que tiene 9 secciones (divididas por líneas discontinuas) de tamaños críticos diferentes, y estructuras para la carga de muestras. Aunque la orientación y las constantes del entramado del reticulado se mantienen iguales, se cambian los diámetros de los obstáculos para crear intersticios d de tamaños diferentes y tamaños críticos diferentes.

La Figura 24 muestra la separación en alta resolución de microesferas fluorescentes de 0,80 \mum (izquierda), 0,90 \mum (centro) y 1,03 \mum (derecha), usando un reticulado de tamaño de intersticio variable. Aunque la orientación y las constantes del entramado del reticulado se mantienen iguales, se cambian los diámetros de los obstáculos para crear intersticios d de tamaños diferentes, marcados en el lado izquierdo de la imagen fluorescente. Las líneas de corriente individuales de 1,03 \mum muestran claramente una migración en zigzag.

La Figura 25 muestra el perfil fluorescente de las partículas separadas escaneado a 14 mm del punto de la inyección.

La Figura 26 muestra una imagen fluorescente de moléculas de ADN separadas según su tamaño usando un dispositivo de la presente invención. Las moléculas se introducen en la parte superior de la figura.

La Figura 27 muestra un diagrama esquemático de un dispositivo usado para concentrar una muestra. La dirección del campo puede estar definida por las paredes laterales del reticulado. La zona sombreada muestra las trayectorias de las partículas mayores que el tamaño crítico, inyectadas desde la parte superior. Las partículas se mueven contra la pared lateral y se concentran.

La Figura 28 muestra un diagrama esquemático de un dispositivo para concentrar partículas. El dispositivo comprende un reticulado, que mueve las partículas contra un límite del reticulado, y canales microfluídicos y depósitos para la carga y la recogida de muestras.

La Figura 29 muestra una imagen fluorescente de moléculas de ADN que se concentran contra un límite del reticulado. Las muestras de ADN se introdujeron desde la parte superior de la imagen.

La Figura 30 muestra un diagrama esquemático de un dispositivo que tiene un reticulado ordenado de obstáculos y que emplea un campo no uniforme en el que la dirección del campo cambia de un lado al otro del reticulado.

La Figura 31 muestra un diagrama esquemático de un dispositivo que tiene un reticulado ordenado de obstáculos en un canal microfluídico curvado. El canal curvado puede dar como resultado un campo que no es uniforme.

Descripción detallada

La presente invención proporciona un procedimiento y un dispositivo para separar partículas según su tamaño conforme a las reivindicaciones 1 y 15, usando un reticulado que comprende una red de intersticios, en los que el flujo del campo procedente de los intersticios se divide desigualmente en los intersticios subsiguientes. Se aplica un campo al reticulado para propeler las partículas que se separan en el reticulado. En una realización preferida, el reticulado es un reticulado ordenado de obstáculos en un canal, en la que el reticulado es asimétrico con respecto a la dirección del campo aplicado. En realizaciones preferidas adicionales, el canal que contiene el reticulado es un canal microfluídico. El término "canal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura por la que puede fluir un fluido. Un canal puede ser un capilar, un conducto, una tira de textura hidrófila en una superficie por lo demás hidrófoba en la que están confinados fluidos acuosos, etc. El término "microfluídico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema o un dispositivo que tiene uno o más canales, conductos o cámaras fluídicos que están fabricados, por lo general, a una escala milimétrica a nanométrica; por ejemplo, que tengan típicamente al menos una dimensión transversal en el intervalo de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 1 mm.

La presente invención es útil para la separación de partículas biológicas según su tamaño, incluyendo bacterias, células, orgánulos, virus, ácidos nucleicos (es decir, ADN, etc.), proteínas y complejos proteínicos, al igual que otras partículas no biológicas suspendidas en fluido, como polímeros, polvos, látex, emulsiones o coloides industriales. Además de en la separación de partículas, el procedimiento puede usarse para analizar la distribución de tamaño de muestras, o para extraer partículas de cierto intervalo de tamaños de mezclas de partículas. Además, debido a las características de gran tamaño, el dispositivo puede ser un instrumento de alto rendimiento para la preparación de muestras. La presente invención puede proporcionar las ventajas de un coste de fabricación reducido, una resolución elevada y un rendimiento de muestras mejorado.

En una realización preferida, la presente invención proporciona un dispositivo microfluídico que separa partículas en fluido según su tamaño. Se aplica un campo a las partículas que se separan según pasan las partículas por el reticulado. El término "campo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier fuerza o entidad vectorial que pueda usarse para propeler las partículas en el reticulado. El campo que impulsa las partículas que se separan puede ser un campo de fuerza, como un campo eléctrico, un campo centrífugo o un campo gravitatorio. El campo que impulsa las partículas que se separan puede ser también un flujo de fluidos, como un flujo de fluidos movido por presión, un flujo electroosmótico, acción capilar, etc., en el que la entidad del vector es la densidad del flujo del fluido. Además, el campo puede ser una combinación de un campo de fuerza y un flujo de fluido, como un flujo electrocinético, que es una combinación de un campo eléctrico y de un flujo electroosmótico. En realizaciones preferidas, la dirección media del campo será paralela a las paredes del canal que contiene el reticulado.

El reticulado para el uso en la presente invención comprende una red de intersticios que crea un patrón de campo de tal modo que el flujo de campo procedente de un intersticio dentro de la red se divide en cantidades desiguales (un componente principal del flujo y un componente secundario del flujo) en los intersticios subsiguientes (véase, por ejemplo, la Figura 4), aunque los intersticios puedan ser de dimensiones idénticas. Mirando el reticulado en su conjunto, las divisiones desiguales del flujo del campo, como media, tienden en una dirección. Así, los componentes principales del flujo se desvían, como media, en la misma dirección (es decir, se desvían al mismo lado del obstáculo), de tal modo que la dirección media de los componentes principales del flujo no es paralela a la dirección media de los componentes secundarios del flujo ni a la dirección media del campo. Se prefiere que una mayoría de los componentes principales del flujo se desvíen en la misma dirección. En una realización particularmente preferida, el reticulado es un reticulado ordenado, en el que el componente principal del flujo procedente de cada evento de bifurcación se desvía en la misma dirección. Generalmente, el componente secundario del flujo que sale de un intersticio alimenta al componente principal del flujo que sale de un intersticio subsiguiente (Figura 4).

El término "intersticio", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura en la que pueden fluir fluidos o partículas. Un intersticio puede ser un capilar, un espacio entre dos obstáculos en el que pueden fluir fluidos, una textura hidrófila en una superficie por lo demás hidrófoba en la que están confinados fluidos acuosos, etc. En una realización preferida de la invención, la red de intersticios está definida por un reticulado de obstáculos. En esta relación, los intersticios serían el espacio entre obstáculos adyacentes. En una realización preferida, la red de intersticios se construirá con un reticulado de obstáculos en la superficie de un sustrato (Figura 2). El término "obstáculo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura física o a una textura en la que no pueden penetrar las partículas que se separan, y, por ello, un obstáculo puede referirse a un poste que sobresale de un sustrato base, una barrera hidrófoba para fluidos acuosos, etc. En algunas realizaciones, el obstáculo puede ser permeable al campo. Por ejemplo, un obstáculo puede ser un poste hecho de material poroso, en el que los poros permiten la penetración del campo, pero son demasiado pequeños para que entren las partículas que se separan.

En una realización preferida, la red de intersticios, en la que el flujo se divide de forma desigual, se forma usando un reticulado periódico de obstáculos que es asimétrico con respecto a la dirección media del campo. Una característica importante de esta realización es que el reticulado de obstáculos es asimétrico con respecto al campo, aunque el propio reticulado pueda ser simétrico con respecto a otros ejes (Figura 3). El término asimétrico, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un reticulado de obstáculos en el que el flujo del campo procedente de un intersticio entre dos obstáculos se bifurca por un obstáculo subsiguiente, de tal modo que el flujo del campo bifurcado no se divide en dos cantidades iguales (por ejemplo, véanse las líneas de corriente de campo de la Figura 4). Esto puede lograrse cuando la dirección media del campo no es paralela a un eje principal del reticulado (Figura 3). En una realización, un reticulado ordenado está inclinado un ángulo \theta, desviado con respecto al campo (por ejemplo, en la Figura 15), en el que el ángulo \theta de desviación se selecciona de tal modo que el reticulado no esté alineado con el campo (es decir, es asimétrico con respecto al campo). De manera alternativa, también puede lograrse un reticulado asimétrico usando un reticulado que comprende filas de obstáculos en el que cada fila está desplazada lateralmente con respecto a la fila anterior y el factor de desalineamiento, a, es mayor que 0 y menor que 0,5 (Figura 6). En una realización preferida, el reticulado de obstáculos será un reticulado ordenado en el que un eje principal del reticulado no es paralelo a la dirección del campo (Figura 3). El término asimétrico se refiere al reticulado de obstáculos (por ejemplo, al eje del reticulado) y no a la forma de los obstáculos individuales. Se prefiere que el reticulado sea un reticulado ordenado para maximizar el número de eventos de bifurcación que pueden ocurrir según pasa la muestra por el reticulado (véase, por ejemplo, la Figura 4).

Tal como se usa en el presente documento, el término "ordenado" se refiere a un reticulado que tiene una disposición espacial generalmente periódica o repetitiva. Por ejemplo, la disposición espacial repetitiva puede ser cuadrada, rectangular, hexagonal, oblicua, etc. En otras realizaciones, no es preciso que el reticulado sea un reticulado ordenado.

En una realización de la invención, las partículas fluyen por un reticulado asimétrico de obstáculos, y se separan, según su tamaño, en corrientes diferentes (Figura 5). Mientras que las partículas pequeñas siguen la dirección del campo, las partículas grandes migran en la dirección del reticulado. La dirección del reticulado se corresponde con la dirección media del componente principal del flujo del campo (por ejemplo, véase la flecha gris de la Figura 4). La teoría básica del proceso de transporte se ilustra esquemáticamente en la Figura 5. La Figura 5 representa una realización de un reticulado asimétrico de obstáculos en el que el reticulado está desalineado (es decir, es asimétrico) con respecto al campo. Para el tipo de reticulado representado en la Figura 6, el factor de desalineamiento, a, es mayor que 0 y menor que 0,5. Cuando a = 0 o a = 0,5, el reticulado es asimétrico con respecto al eje del campo. Tal como se muestra en la Figura 6, cada fila de obstáculos está desplazada horizontalmente con respecto a la fila previa por a\lambda, donde \lambda es la distancia entre los centros de los obstáculos. De cara a esta exposición, supongamos que a vale 1/3. En realizaciones preferidas, las partículas que van a separarse son impulsadas a través del reticulado por medio de un flujo fluido. Debido al reducido número de Reynolds de estos dispositivos, las líneas de flujo pueden ser laminares, lo que da como resultado una turbulencia y unos efectos inerciales despreciables.

Dado que el reticulado de obstáculos está alineado de forma asimétrica con respecto al campo, es decir, que el entramado de obstáculos es asimétrico con respecto a la dirección media del campo, las líneas de campo que atraviesan un intersticio tienen que rodear el obstáculo en la fila siguiente (Figura 7). Para considerar la asignación de líneas de campo en la fila siguiente, suponemos que el campo en el intersticio entre los obstáculos es localmente uniforme, es decir, las líneas de campo está separadas por igual en cada intersticio. Esta puede ser una buena aproximación si el campo es eléctrico. Esta suposición puede relajarse en el caso de otros campos. El flujo total del campo \phi que atraviesa un intersticio es dividido por el obstáculo subsiguiente y, según pasa el flujo a los dos intersticios subsiguientes (Figura 7), se parte en dos corrientes, el componente principal del flujo y el componente secundario del flujo. Si esa dirección media del campo es vertical (paralela a las paredes del canal), a\phi tiene que ir a un intersticio y (1-a)\phi al otro. Por lo tanto, en cada intersticio se da una división desigual del flujo de campo. Generalmente, el componente secundario del flujo que sale de un intersticio alimenta al componente principal del flujo que sale de un intersticio subsiguiente (Figura 4).

Si dividimos cada intersticio en 1/a ranuras (Figura 8, para ilustrar a = 1/3), cada línea de campo se desplaza a la siguiente ranura según pasa por una fila de manera cíclica: las líneas de campo que pasan por la posición 1 estarán en la posición 2 en la fila siguiente; las que pasan por la posición 2 irán a la posición 3... las de la posición 1/a volverán a la posición 1. Las partículas pequeñas siguen el campo y se desplazan de una posición a la siguiente de manera cíclica (Figura 9). Dado que las partículas pequeñas pueden volver a su ranura (posición relativa en el intersticio) original después de 1/a filas, sus trayectorias siguen la dirección del campo y no se dispersan después de rodear muchos obstáculos. Debido al movimiento "en zigzag" de las partículas pequeñas, este patrón de transporte puede denominarse "modo de zigzag".

En cambio, las partículas de diámetro grande en comparación con la anchura de la ranura no seguirán las líneas de corriente individuales, sino que, en vez de ello, serán propelidas por muchas líneas de corriente, lo que cambia de manera fundamental la dirección final de su migración. Tal como se muestra en la Figura 10, una partícula en contacto con un obstáculo y cuyo radio característico es mayor que ad (la anchura del intersticio), seguirá una línea de campo que atraviesa el intersticio 2, porque su centro cae en el intersticio 2. Ahora bien, las líneas de campo van a la ranura 3 en el intersticio siguiente, de modo que el centro de la partícula también debería estar en la ranura 3. Sin embargo, la ranura 3 no tiene suficiente sitio para la partícula. Por lo tanto, la partícula se desplaza de vuelta a la ranura 2. Este proceso puede repetirse cada vez que una partícula grande se aproximada a una fila de obstáculos. Dado que las partículas grandes se desplazan a la ranura 3 a la ranura 2, siguen la dirección del reticulado (Figura 11). El movimiento de las partículas grandes por el reticulado se denomina modo de "desplazamiento".

En resumidas cuentas, existe un radio crítico de partícula R_{0} por encima del cual las partículas se mueven en la dirección del reticulado (modo de desplazamiento), y por debajo del cual las partículas siguen la dirección media del campo (modo de zigzag) (Figura 12). El tamaño crítico, R_{0}, puede determinarse por a y d, donde a es el factor de desalineamiento y d es la anchura del intersticio. En el caso en que los campos están distribuidos de forma homogénea en los intersticios, R_{0} = ad. Así, el radio hidrodinámico de una partícula (su radio) determina qué modo de transporte sigue. Obsérvese además que la teoría anterior puede generalizarse fácilmente para otros campos, como campos electroforéticos o campos fluidos movidos por presión considerando flujos de iones en vez de flujos de fluidos.

En una realización de la presente invención, el dispositivo puede emplearse como filtro. El término "filtro", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un dispositivo que extrae partículas de un fluido que estén en ciertos intervalos de tamaño. La brusca transición del ángulo de migración con respecto al tamaño es ideal para los filtros (Figura 12). Preferentemente, las micro/nanoestructuras de los reticulados se crean mediante técnicas de micro/nanofabricación. La Figura 13 muestra el diagrama esquemático de un filtro de la invención, en el que las partículas inyectadas se separan en tres grupos de tamaños diferentes. En principio, un reticulado puede fijar un radio crítico (tamaño) para la separación de partículas, y separar una mezcla de partículas en dos grupos de partículas, en uno de los cuales las partículas son mayores que el tamaño crítico, y en el otro de los cuales las partículas son menores. Dos reticulados de tamaños críticos diferentes puestos juntos en serie pueden separar una mezcla de partículas en tres intervalos de tamaños: grandes, medianas y pequeñas (Figura 13). La muestra de partículas de diferentes tamaños se inyecta en el primer reticulado, que tiene un tamaño crítico (R_{1}) menor que el segundo (R_{2}). Mientras que las partículas de tamaño grande y mediano se mueven en el modo de desplazamiento en el primer reticulado, las pequeñas se mueven en el modo de zigzag y son apartadas. Cuando las partículas pasan al segundo reticulado, las partículas de tamaño mediano pasan al modo de zigzag y son apartadas de las grandes. Se pueden recoger moléculas de tamaños diferentes en la salida del segundo reticulado, que puede hacer de filtro molecular y de instrumento de preparación de muestras. Además, el intervalo de tamaños de las partículas que van a la salida 2, determinado por R_{1} y R_{2}, puede ser muy estrecho. Por ejemplo, el dispositivo puede estar diseñado para distinguir un único tamaño de fragmentos de restricción de ADN entre decenas o cientos de otros tamaños de fragmentos. Este dispositivo podría sustituir las técnicas convencionales de electroforesis en gel y de corte en gel.

En otra realización de la invención, el dispositivo de la invención puede fraccionar moléculas según su tamaño. Puede lograrse una selectividad elevada en la región de transición brusca (Figura 12) usando un único reticulado de radio crítico (tamaño) fijo. De forma alternativa, la separación de partículas en un intervalo amplio de tamaños puede requerir una selectividad menor, lo que podría lograrse usando muchos reticulados en serie, cada uno de los cuales tiene un tamaño crítico diferente (Figura 14). La Figura 14 muestra un diagrama esquemático de múltiples reticulados en serie, en el que cada reticulado tiene un tamaño crítico diferente. La línea horizontal discontinua representa la división entre reticulados subsiguientes, y cada reticulado subsiguiente de la serie tiene un tamaño crítico creciente. Así, puede fraccionarse y analizarse con un único dispositivo una distribución continua de tamaños moleculares. De hecho, pueden diseñarse características homogéneas del ángulo de migración con respecto al tamaño de las partículas, incluyendo relaciones lineales y exponenciales, usando muchos reticulados en serie, teniendo cada uno un tamaño crítico diferente. El tamaño crítico de un reticulado puede ajustarse cambiando la anchura d del intersticio, desplazando los obstáculos, o ambos.

En una realización de la invención, el dispositivo puede comprender un reticulado ordenado de obstáculos y puede emplear un campo no uniforme, en el que la dirección del campo cambia de un extremo al otro del reticulado (Figura 30). En una realización, las direcciones cambiantes del campo pueden crearse mediante un canal microfluídico curvado. Dado que el tamaño crítico del reticulado depende de la dirección del campo, el campo no uniforme crea sección de reticulado de tamaños críticos diferentes. Esto puede desearse para el fraccionamiento de las partículas en un intervalo de tamaños amplio. En la realización particular mostrada en la Figura 30, la dirección del campo es grande en la primera sección de reticulado, y luego se reduce en las siguientes secciones de reticulado, creando un tamaño crítico grande en la primera sección y tamaños críticos menores en las secciones siguientes.

En otra realización de la invención, el dispositivo comprende un reticulado cuadrado ordenado de obstáculos en un canal microfluídico curvado (Figura 31). El canal curvado puede dar como resultado un campo que no es uniforme. El cambio en la dirección del campo de un extremo al otro del reticulado crea un gradiente de tamaños críticos en el reticulado, porque el tamaño crítico puede depender de la dirección del campo. Además, la intensidad del campo, otro parámetro que puede calibrarse, puede ser ajustada cambiando la anchura del canal microfluídico. Este dispositivo puede tener mejor intervalo de separación y mejor resolución que un reticulado de un único tamaño crítico fijo. También puede crearse un gradiente continuo de tamaños críticos de un extremo al otro del reticulado cambiando la anchura de los intersticios.

En una realización de la invención, el reticulado comprende un entramado cuadrado de obstáculos cilíndricos, estando inclinado el reticulado un ángulo \theta, desviado con respecto al campo (Figura 15). Un ángulo desviado \theta de tan^{-1}(a) es equivalente a un factor de desalineamiento de a en la Figura 6.

En otra realización de la invención, el reticulado que comprende una red de intersticios puede formarse mediante una pista de obstáculos que no son idénticos (Figura 16). Más específicamente, los obstáculos pueden tener formas o dimensiones diferentes. Dado que el entramado en el que se alzan los obstáculos es asimétrico con respecto al campo, el flujo del campo en cada intersticio entre los obstáculos se divide de forma desigual en los intersticios subsiguientes.

En otra realización de la invención, la pista de obstáculos, que forma la red de intersticios, puede no ser un entramado periódico. Por ejemplo, la Figura 17 muestra una vista esquemática en planta de una realización de la invención en la que cada obstáculo puede ser idéntico y tener el mismo periodo horizontal \lambda. Sin embargo, cada fila de obstáculos está desplazada horizontalmente una cantidad diferente con respecto a la fila anterior, y la pista de obstáculos no es un entramado de Bravais [N. W. Ashcroft y N. D. Mermin, Solid State Physics (Saunders College Publishing, 1976)]. No obstante, el flujo del campo en el reticulado experimenta cascadas de bifurcaciones, porque la pista de obstáculos es asimétrica con respecto a la dirección media del campo. Dado que el tamaño crítico depende de la asimetría de la división del flujo del campo, que se originó en la asimetría del reticulado con respecto al campo, esta realización puede ser útil para separar partículas en un intervalo amplio.

En otra realización de la invención, se cargan partículas en el reticulado usando muchos canales microfluídicos en la parte superior del reticulado (Figura 18). Los muchos canales generan un patrón de campo que es generalmente uniforme de un extremo al otro del reticulado. Las partículas se inyectan desde uno o más canales conectados a uno o más depósitos que contienen las partículas, que han de ser llevadas por el campo de un extremo al otro del
reticulado.

En otra realización de la invención, se descargan partículas del reticulado, por ejemplo a través de los canales microfluídicos al final del reticulado (Figura 18). A continuación las partículas pueden ser dirigidas al siguiente componente de la tableta microfluídica para un uso ulterior.

En otra realización, el dispositivo de la invención puede concentrar partículas mayores que un tamaño crítico (Figura 27). Esta realización puede aprovechar la capacidad del reticulado para desviar las partículas de la dirección del campo aplicado en modo de desplazamiento. Las partículas se introducen por un lateral del reticulado. Las partículas mayores que el tamaño crítico del reticulado (que se mueven en modo de desplazamiento) se amontonan contra otro límite del reticulado. En este caso, el dispositivo de la invención hace de concentrador. A continuación, la muestra concentrada puede encaminarse al siguiente componente de la tableta microfluídica para un uso ulterior, tal como crear una zona de muestras para el fraccionamiento. La muestra concentrada también puede sacarse de la tableta para aplicaciones ulteriores.

En una realización preferida de la invención, el dispositivo es fabricado a escala micro/nanométrica. Las técnicas de microfabricación pueden seleccionarse entre las conocidas en la técnica; por ejemplo, las técnicas usadas convencionalmente para la fabricación de circuitos integrados basados en el silicio, la estampación, el moldeo, el moldeo por inyección, etcétera [E. W. Becker et. al., Microelectronic Engineering 4 (1986), páginas 35 a 56]. Ejemplos de técnicas de fabricación adecuadas incluyen la fotolitografía, la litografía por haz de electrones, la litografía de estampación, el grabado iónico reactivo, el grabado húmedo, la ablación láser, la estampación, el moldeo, el moldeo por inyección y otras técnicas [H. Becker et. al., J. Micromech. Microeng. 8 (1998), páginas 24 a 28]. El dispositivo microfluídico puede fabricarse de materiales que sean compatibles con las condiciones presentes en la aplicación particular objeto de interés. Tales condiciones incluyen, sin limitación, pH, temperatura, aplicación de disolventes orgánicos, fuerza iónica, presión, aplicación de campos eléctricos, carga superficial, propiedades de adherencia, tratamiento de superficies, funcionalización de superficies, biocompatibilidad. Los materiales del dispositivo también se escogen por sus propiedades ópticas, sus propiedades mecánicas y por su inertidad a los componentes de la aplicación que haya de llevarse a cabo en el dispositivo. Tales materiales incluyen, sin limitación, vidrio, cristal de silicio, caucho de silicona, silicio, cerámica y sustratos poliméricos, por ejemplo plásticos, dependiendo de la aplicación prevista.

Ejemplos

En lo que sigue se describirán realizaciones específicas representativas de la invención, incluyendo cómo pueden fabricarse tales realizaciones.

Ejemplo 1

Se construyó un dispositivo microfluídico (Figura 19). El canal microfluídico tiene 16 mm de longitud, 3,2 mm de anchura y 10 \mum de profundidad. El reticulado que llena el canal consiste en un entramado cuadrado de obstáculos cilíndricos (Figura 19A), en el que la distancia entre centros, \lambda, es de 8 \mum, y la separación d entre los obstáculos es de 1,6 \mum (Figura 19B). El campo aquí empleado es un flujo de campo movido por presión. El entramado está girado 5,7º (tan^{-1} 0,1) con respecto al canal (Figura 19A), lo que define la dirección del flujo. La rotación de tan^{-1} 0,1 corresponde a a = 0,1; así, cada 10 filas hay un desplazamiento de una distancia completa \lambda (Figura 19A). En principio, esta configuración proporciona 10 ranuras, en vez de las 3 presentadas más arriba. Las partículas se inyectan desde un canal con 10 \mum de anchura y son llevadas de un extremo al otro del reticulado por un flujo movido por presión, que se hace uniforme por los muchos canales en la parte superior y en la inferior del reticulado (Figura 19C). Los canales microfluídicos y el reticulado se fabricaron en una oblea de silicio usando fotolitografía y grabado iónico reactivo profundo, técnicas usadas de forma convencional para la fabricación de circuitos integrados basados en el silicio. Se taladraron orificios que atravesaban las obleas para el acceso de los fluidos antes de tapar con una cubierta de vidrio revestida con caucho de silicona (RTV-615 de General Electric) para encajonar el reticulado.

Los dos modos de transporte fueron observados experimentalmente usando microesferas fluorescentes de 0,40 \mum y 1,03 \mum de poliestireno en tampón acuoso (Figura 20A) (en los experimentos se usó tampón 0,1\times de Tris-Borato-EDTA con un contenido del 0,02% de POP-6, una poliacrilamida lineal de rendimiento optimizado (Perkin-Elmer Biosystems)). Se capturó la imagen mediante microscopía fluorescente con un tiempo de exposición prolongado para mostrar las trayectorias de las partículas individuales. El brillo variable a lo largo de la trayectoria refleja las diferentes velocidades de flujo de una microesfera en el reticulado, más apagado en los intersticios estrechos, debido a la mayor velocidad del flujo y menor tiempo de residencia. Tal como estaba predicho, la microesfera de 0,40 \mum (izquierda) cruzaba una columna de obstáculos cada 10 filas en el modo de zigzag, mientras que la microesfera de 1,03 \mum (derecha) era encaminada a lo largo del eje del reticulado de obstáculos en el modo de desplazamiento.

La Fig. 20B muestra la separación del flujo continuo de microesferas de 0,40 \mum y 1,03 \mum inyectadas en el reticulado desde un canal de suministro en la parte superior. En esta imagen se superpusieron muchas trayectorias. Las esferas de 0,40 \mum y 1,03 \mum migraron a \sim0º (dirección del flujo) y \sim5.7º (rotación del reticulado), respectivamente, con respecto a la dirección del flujo, como cabía esperar. La presión usada para mover el flujo era de 30 kPa, que creaba una velocidad media del flujo de \sim400 \mum/s. El tiempo de recorrido por el dispositivo fue de \sim40 s.

Para estudiar la resolución del dispositivo, se mezclaron microesferas fluorescentes de 0,60 \mum, 0,70 \mum, 0,80 \mum, 0,90 \mum y 1,03 \mum de diámetro y se inyectaron en el reticulado (las concentraciones de las microesferas de 0,60 \mum, 0,70 \mum, 0,80 \mum, 0,90 \mum y 1,03 \mum fueron, respectivamente, de 0,015%, 0,010%, 0,010%, 0,005% y 0,005% de contenido sólido). Las perlas se separaron en corrientes diferentes usando una velocidad reducida de \sim40 \mum/s, creada mediante una presión impulsora de 3 kPa. En la Figura 21 se muestra el perfil de fluorescencia, escaneado a 11 mm del punto de la inyección. Las direcciones de migración medidas con respecto al flujo (campo), definidas como los ángulos de migración, se trazan en la Figura 22 como función del tamaño de la microesfera, lo que demuestra que, con esta velocidad de flujo (\sim40 \mum/s), la transición del modo de zigzag al de desplazamiento es gradual. Lo homogéneo de la transición probablemente se deba al movimiento browniano de las partículas entre las líneas de corriente. Con una velocidad de flujo de 40 \mum/s, un coeficiente de 0,73 \mum^{2}/s de difusión de partículas de 0,6 \mum en agua (H. C. Berg, Random Walks in Biology, Princeton University Press, Nueva Jersey, 1993, p. 56) tiene una longitud de difusión de \sim0,54 \mum durante los 0,2 s que le lleva moverse los 8 \mum que hay de una fila de obstáculos a la siguiente. Esto es un factor de 3 mayor que la anchura media de la ranura de \sim0,16 \mum.

Para minimizar los efectos del movimiento browniano, se aumentó el número de Péclet incrementando la velocidad de flujo. El número de Péclet se define como

1

en la que v es la velocidad del flujo, d es la dimensión característica del reticulado y D es el coeficiente de difusión de la partícula que se separa. La Figura 22 muestra una transición más brusca cuando la velocidad del flujo aumenta en un factor de 10 (\sim400 \mum/s), creada por una presión impulsora de 30 kPa. La velocidad elevada del flujo no solo aumenta la selectividad, de modo que el dispositivo sea más sensible a los cambios de tamaño, sino que también acorta el tiempo de tránsito a \sim40s. La transición ocurre aproximadamente a 0,8 \mum (Figura 22). Los coeficientes de variación (CV) de tamaño de las mejores microesferas monodispersas comercialmente disponibles son 1,3%, 1,0% y 1,0% para 0,70 \mum, 0,80 \mum y 0,90 \mum, según la medición del fabricante. El coeficiente de variación (CV) del diámetro de la partícula se define como

2

en la que \Delta\phi es la desviación típica de \phi, y (\phi) la media de \phi. Las anchuras máximas medidas a 11 mm del punto de inyección corresponden a CV de 2,5%, 1,2% y 0,9% para estos tres tamaños, respectivamente (Figura 21). Los CV se calculan según:

3

en la que x es la posición lateral de la banda y \Deltax la desviación típica medida (semiancho). Obsérvese que los máximos medidos de 0,80 \mum y 0,90 \mum son igual de agudos que las varianzas en el tamaño de las propias microesferas, y, por ello, al ampliación de bandas en nuestro dispositivo es menor que la varianza conocida en el tamaño de las partículas.

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Ejemplo 2

Una ventaja de la flexibilidad de la microfabricación es que el reticulado puede diseñarse para que tenga anchuras variables de intersticio en función de la distancia, optimizándose con ello la separación de mezclas complejas. Para demostrar este aspecto, se fabricó un dispositivo que contenía 9 secciones, cada una de las cuales tenía una anchura de intersticio diferente, empezando con 1,4 \mum y acabando con 2,2 \mum en incrementos de 0,1 \mum (Figuras 23 y 24). Las anchuras variables de los intersticios se diseñaron para calibrar el diámetro crítico en 9 fases, desde \sim0,70 \mum hasta \sim1,10 \mum, para que una partícula de un tamaño dado pase del modo de desplazamiento al modo de zigzag al aumentar la anchura de los intersticios.

Se inyectó una mezcla de microesferas monodispersas (CV = 1%) de 0,80 \mum, 0,90 \mum y 1,03 \mum desde el lateral del reticulado con intersticios pequeños (Figuras 23 y 24), y se hizo fluir a \sim400 \mum/s usando una presión impulsora de 30 kPa. Inicialmente, todas las microesferas eran mayores que el tamaño crítico, y migraron con el mismo ángulo con respecto al flujo vertical (modo de desplazamiento). Sin embargo, las microesferas de 0,80 \mum (izquierda) pasaron pronto a la dirección del flujo (vertical), presumiblemente en modo de zigzag. Las microesferas de 0,90 \mum pasaron a vertical en la cuarta sección, y las microesferas de 1,03 \mum hicieron la transición aproximadamente en la octava sección. El perfil de intensidad fluorescente se escaneó a \sim14 mm del punto de la inyección (Figura 25), y demostró que los picos de 0,80 \mum, 0,90 \mum y 1,03 \mum tenían CV de 1,1%, 1,2% y 1,9%, respectivamente (véanse las barras de escala, centrados en las medias de los picos). En cambio, el CV del 1%, atribuible a la falta de uniformidad en la población de microesferas se muestra como las barras de escala negras por debajo de los picos. Obsérvese que una fracción de las microesferas de 1,03 \mum se separó del pico principal y formó una sub banda, lo más probable debido a la falta de homogeneidad en la población de microesferas. Una vez más, los picos se resuelven virtualmente a la monodispersión de las microesferas sumamente uniformes disponibles comercialmente. El tiempo de recorrido fue
de \sim40 s.

Los resultados de las Figuras 21 y 25 sugieren que la resolución del dispositivo puede superar nuestra capacidad de medirla. En principio, se podrían descubrir los límites de resolución para el enfoque explorando la potencia de resolución del actual reticulado con una serie de clases de tamaños que varíen en intervalos de aproximadamente 0,01 \mum en torno a \sim1 \mum, cada clase con un CV de \sim0,1%.

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Ejemplo 3

Se construyó un dispositivo que tenía dimensiones de reticulado y estructuras de carga idénticas a las del Ejemplo 1 para la separación de ácidos nucleicos según su peso molecular. El dispositivo se fabricó de cristal de silicio en vez de silicio usando las mismas técnicas descritas en el Ejemplo 1. Como campo se usaron campos eléctricos, en vez del flujo de fluidos movido por presión. Se usó una mezcla de colifago \lambda y T2 ADN_{bc} (48,5 kb y 164 kb, respectivamente) a \sim2 \mug/ml y \sim1 \mug/ml como muestra de prueba y se visionó mediante microscopía fluorescente. Se tincionó el ADN con TOTO-1 (Molecular Probes) a una proporción de 1 molécula de tinción por 10 pares de bases. Se añadieron POP-6 al 1%, una poliacrilamida lineal de rendimiento optimizado (Perkin-Elmer Biosystems), y 10 mM de ditiotreitol (DTT) al tampón 1/2\times de Tris-Borato-EDTA para suprimir el flujo electroosmótico y el fotoblanqueado, respectivamente. Los campos eléctricos se aplicaron usando electrodos sumergidos en depósitos de tampón. Las velocidades de migración de las moléculas se controlaron con el voltaje aplicado a los depósitos, y se midieron observando la velocidad de moléculas individuales.

Las dos especies se separaron con buena resolución usando un campo eléctrico de \sim5 V/cm (Figura 26).

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Ejemplo 4

Un dispositivo de la presente invención para concentrar moléculas de ADN se fabrica y se muestra esquemáticamente en la Figura 28. El dispositivo comprende un reticulado y canales microfluídicos para la inyección y la extracción de muestras que son idénticos en dimensiones a los del Ejemplo 1. El campo usado en este ejemplo es un campo eléctrico, aplicado usando electrodos sumergidos en los depósitos de los fluidos tampón. El dispositivo se fabrica de cristal de silicio usando las técnicas descritas en el Ejemplo 1. Se usó colifago T2 ADN a \sim1 \mug/ml en tampón 1/2\times de Tris-Borato-EDTA que contenía un 0,1% de POP-6, una poliacrilamida lineal de rendimiento optimizado (Perkin-Elmer Biosystems) y 10 mM de ditiotreitol (DTT) como muestra de prueba. El ADN se cargó en el dispositivo en el depósito de muestras, y se concentró contra un límite del reticulado hasta \sim120 \mug/ml (Fig. 29). La intensidad del campo eléctrico era de \sim5 V/cm. La muestra concentrada se extrae del reticulado y se recoge en el depósito de recogida de muestras (Figura 28).

Aunque la presente invención se describe con respecto a ejemplos particulares y realizaciones preferidas, se entiende que la presente invención no está limitada a estos ejemplos ni a estas realizaciones, sino que está limitada por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Un dispositivo microfluídico para separar partículas según su tamaño que comprende:

: un canal microfluídico y

: un reticulado que comprende una red de intersticios dentro del canal microfluídico, en el que

: el dispositivo emplea un campo que propele las partículas que se separan en el canal microfluídico; y caracterizado porque

: un flujo del campo procedente de los intersticios se divide desigualmente en un componente principal del flujo y un componente secundario del flujo en intersticios subsiguientes en la red, de tal modo que la dirección media del componente secundario del flujo no es paralela a la dirección media del campo, y, cuando

: se introducen partículas en el reticulado, las partículas que tienen un tamaño menor que un tamaño crítico predeterminado son transportadas, por lo general, en la dirección media del campo, y

: las partículas que tienen un tamaño al menos igual que el tamaño crítico son transportadas, por lo general, en la dirección media del componente principal del flujo, separándose con ello las partículas según su tamaño.

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2. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 1, en el que el reticulado es un reticulado ordenado de obstáculos.

3. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 2, en el que el reticulado ordenado de obstáculos es asimétrico con respecto a la dirección media del campo.

4. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que el reticulado ordenado de obstáculos comprende obstáculos dispuestos en filas, en el que cada fila subsiguiente de obstáculos está desplazada lateralmente con respecto a la fila anterior.

5. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que el reticulado ordenado de obstáculos está inclinado un ángulo \theta, desviado con respecto a la dirección del campo.

6. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el campo es un flujo fluido, eléctrico, electroforético, electroosmótico, centrífugo, gravitatorio, hidrodinámico, un gradiente de presión o una acción capilar.

7. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 6, en el que el campo es un flujo fluido.

8. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 6, en el que el campo es un campo eléctrico.

9. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las partículas son bacterias, células, orgánulos, virus, ácidos nucleicos, proteínas, complejos proteínicos, polímeros, polvos, látex, emulsiones o coloides.

10. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las partículas son moléculas de ADN.

11. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además una primera salida, configurada para aceptar partículas mayores que el tamaño crítico predeterminado, y una segunda salida, configurada para aceptar partículas menores que el tamaño crítico predeterminado.

12. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el dispositivo comprende reticulados múltiples en serie dentro del canal microfluídico, en el que cada reticulado tiene un tamaño crítico dife-
rente.

13. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 12, en el que un último reticulado de la serie comprende al menos una salida configurada para aceptar partículas transportadas en la dirección media del componente principal del flujo de al menos un reticulado en la serie.

14. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además un límite, de tal modo que cuando las partículas que tienen un tamaño mayor que el tamaño crítico predeterminado se introducen en el reticulado, las partículas que tienen un tamaño mayor que el tamaño crítico predeterminado son transportadas por lo general hasta el límite, concentrándose por ello las partículas en el límite.

15. Un procedimiento para separar partículas según su tamaño, que comprende:

: introducir las partículas que deban separarse en un canal microfluídico que comprende una red de intersticios dentro del canal microfluídico; y

: aplicar un campo a las partículas para propeler a las partículas en el canal microfluídico, caracterizado porque

: un flujo del campo procedente de los intersticios se divide desigualmente en un componente principal del flujo y un componente secundario del flujo en intersticios subsiguientes en la red, de tal modo que la dirección media del componente secundario del flujo no es paralela a la dirección media del campo, y

: las partículas que tienen un tamaño menor que un tamaño crítico predeterminado son transportadas, por lo general, en la dirección media del campo, y

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16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la red de intersticios está construida de un reticulado de obstáculos.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el reticulado de obstáculos es un reticulado ordenado de obstáculos.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el reticulado ordenado de obstáculos es asimétrico con respecto a la dirección media del campo.

19. El procedimiento de las reivindicaciones 17 y 18, en el que el reticulado ordenado de obstáculos comprende obstáculos dispuestos en filas, en el que cada fila subsiguiente de obstáculos está desplazada lateralmente con respecto a la fila anterior.

20. El procedimiento de las reivindicaciones 17 y 18, en el que el reticulado ordenado de obstáculos está inclinado un ángulo \theta, desviado con respecto a la dirección del campo.

21. El procedimiento de una reivindicación cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en el que el campo es un flujo fluido, eléctrico, electroforético, electroosmótico, centrífugo, gravitatorio, hidrodinámico, un gradiente de presión o una acción capilar.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que el campo es un flujo fluido.

23. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que el campo es un campo eléctrico.

24. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en el que las partículas son bacterias, células, orgánulos, virus, ácidos nucleicos, proteínas, complejos proteínicos, polímeros, polvos, látex, emulsiones o coloides.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que las partículas son moléculas de ADN.

26. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, que comprende además introducir las partículas que tienen al menos el tamaño crítico predeterminado en una primera salida, y las partículas menores que el tamaño crítico predeterminado en una segunda salida.

27. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, que comprende además transportar las partículas que tienen un tamaño al menos igual de grande que el tamaño crítico predeterminado hasta un límite del canal microfluídico, concentrando con ello las partículas en el límite.