JP6716057B2 - 細胞を分離する方法及び装置 - Google Patents
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Description
特に、血液中から赤血球及び白血球よりもサイズが大きい癌細胞を分離する技術は、癌の診断、治療効果判定、治療法選択等に利用できる可能性があるため有用である。
特許文献1は、「決定論的横変位(Deterministic Lateral Displacement)」(DLD)によって粒子をサイズで分離する方法を開示する。
DLD法は、流路中に配列した柱等の障害物によって所定のしきい値よりサイズが大きい粒子を流体自体の流れの方向とは違う方向に移動させる方法であり、しきい値を障害物間のギャップより大幅に小さくすることで、目詰まりを防ぎつつ細胞をサイズで分離することが可能となる。
非特許文献1は、DLDを用いて、癌細胞と赤血球及び白血球を分離する技術を開示する。
しかし、同文献に記載されたデータの中で白血球の混入が最も少ない条件でも0.4%、すなわち血液1mL(ミリリットル)を処理するさいに1.32×104個の白血球が、癌細胞を回収した液に混入している。
また、この方法及び装置は3倍希釈した血液を毎分7μLで流すものであり、処理量が少なく、癌細胞は血液1mL当たり、数個ということもあることを考えると、分離に長時間要し実用的でない。
非特許文献2は、DLD法により癌細胞をサイズで分離した後、例えばあらかじめ磁気ビーズをつけておいた白血球を、磁気を利用して取り除くという2段階の分離法を開示する。
しかし、この方法及び装置は2段階法であって、煩雑である上に癌細胞をサイズで分離した後に磁気を利用して白血球を取り除く場合に、血液1mL当たり3.2×104個の白血球が癌細胞を回収した液に混入している。
本発明は、流体Aと流体BとをDLDアレイ中で合流させた際に合流界面にて乱れが生じない程度に相対的に粘度が低い流体B側に増粘剤を加え、流体Aの粘度に近づけた点に特徴がある。
そこで、前記流体Bに増粘剤を加えるか、又は、前記流体Aを希釈した上で前記流体Bに増粘剤を加えた。
本明細書では、状態としては液又は液体と表現し、分離の対象となる場合に流体と表現した。
ここで標的細胞は、例えば血液中の赤血球や白血球よりサイズが大きい癌細胞である。
流路中に、流体の流れを横切る方向に3個以上の柱部(障害物)Dを所定のギャップGを介して等間隔に立設した列を有する。
流体の流れ方向に沿って前記列を複数の列として配設し、次の列は前の列と比べて柱部(障害物)Dの位置を所定の距離dだけ流体の流れを横切る方向にシフトさせて配設した。
なお、柱部間の中心ピッチをλで示してある。
これにより、サイズの大きい細胞Lは、ギャップGの間を通過すると次の柱部が流れの障害になるように距離dだけシフトさせてあるので、図2では実線の矢印で示すように流体の流れとは異なる下方向に移動する。
これに対して小さいサイズの細胞Sは、流体の層流に沿って点線の矢印で示すように、柱部間を通過する。
これによりサイズの大きい標的細胞は、流体B側に取り込まれ、流体Aから分離される。
これに対して本発明は、流体Bの粘度が流体Aの粘度に近づくように増粘剤を加えたので、合流後の流体Aと増粘剤を加えた調整流体Bの単位時間当たりの移動距離が近づき、上記合流界面における層流の乱れが少なく、標的細胞の分離精度が高い効果がある。
流体Aとなる血液中には、標的細胞である癌細胞よりもサイズが小さい赤血球及び白血球が多く存在する。
流体Bとなるバッファー中に増粘剤を加えて血液の粘度に近づけることで、あるいは血液を希釈した上でバッファー中に増粘剤を加えて、相互に粘度を近づけることでバッファー中に癌細胞を回収するとともに赤血球及び白血球の混入を少なく抑えることができる。
他方には、血液側の回収部A13と、バッファー側の回収部B14とを有する。
試験条件を図3(a)の表に示し、バッファー側回収液中への赤血球及び白血球の混入数と癌細胞の回収率を図3(a),(b)の表に示す。
血液の希釈には、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)を用い、バッファーにはPBSに0.5%BSA,2mMのEDTAを添加した。
試験No.1は、血液(希釈なし)を毎分50μL(マイクロリットル)注入し、バッファーを増粘剤添加なしで毎分50μL注入した。
その結果、バッファー側回収液への赤血球の混入が目視で確認できた。
バッファー側回収液には数億個程度の赤血球が混入していると考えられる。
試験No.2は、血液(希釈なし)を毎分50μL注入し、バッファーを増粘剤添加なしで毎分100μL注入した。
血液1mL当たりバッファー側回収液への赤血球及び白血球の混入数は4.10×106個であった。
試験No.3は、血液(希釈なし)、33重量パーセントとなるようにグリセリン(増粘剤)を添加したバッファーともに毎分100μL注入した。
血液1mL当たりバッファー側回収液への赤血球及び白血球の混入数は3.96×104個であった。
試験No.4は、2倍希釈した血液、25重量パーセントとなるようにグリセリン(増粘剤)を添加したバッファーともに毎分200μL注入した。
希釈なしの血液1mL当たりバッファー側回収液への赤血球及び白血球の混入数は2.12×103個であり、うち赤血球はほぼ確認できなかった。
試験No.1とNo.2の比較から、粘度が低いバッファーの注入量を血液の注入量より多くすることで、バッファー側回収液への赤血球の混入を抑えることができる。
しかし、試験No.2においても白血球の混入が多かった。
これに対して、試験No.3に示すようにバッファーに増粘剤として、グリセリンを33重量パーセントとなるように添加することで白血球の混入を抑えることができ、さらに試験No.4に示すように血液をPBSにて2倍に希釈した上で、バッファーにグリセリンを25重量パーセントとなるように添加することでバッファー側回収液への白血球の混入を血液1mL当たり1万個以下の2千個程度にまで抑えることができた。
増粘剤の添加量は、増粘剤の種類に応じて適宜、設定することができる。
例えばグリセリンの場合は、血液の希釈率を考慮しつつ、バッファーに対して5〜50重量パーセントの範囲で調整するのが好ましい。
その結果を図3(b)に示す。
MCF−7は99.7%、MDA−MB−231は98.4%、KYSE−510は99.6%の回収率であった。
これにより、試験No.4の条件では白血球の混入を抑え、癌細胞を効率的に回収できることが明らかになった。
11 流体Aの注入部
12 流体B(調整流体B)の注入部
13 回収部A
14 回収部B
Claims (4)
- 標的細胞と当該標的細胞よりもサイズが小さい細胞が1種以上含まれる流体Aと、
前記標的細胞を取り出すための流体Bとを、DLD(Deterministic Lateral Displacement)デバイス中で合流させることで前記流体A中の標的細胞を前記流体B中に分離させる方法であって、
前記流体Aよりも粘度が低い前記流体Bに増粘剤を加えたことを特徴とする細胞を分離する方法。 - 前記流体Aを希釈した上で前記流体Bに増粘剤を加えたことを特徴とする請求項1記載の細胞を分離する方法。
- 前記増粘剤は、グリセリン,グリセリン脂肪酸エステル,エチレングリコール,エチレングリコール脂肪酸エステル,プロピレングリコール,プロピレングリコール脂肪酸エステル,ポリエチレングリコール,ポリエチレングリコール脂肪酸エステル,ゼラチン,多糖類,ペクチン,グアーガム,キサンタンガム,タマリンドガム,カラギーナン,カルボキシメチルセルロースのうちいずれか1つ以上であることを特徴とする請求項1又は2記載の細胞を分離する方法。
- 前記標的細胞は血液中に含まれる癌細胞であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の細胞を分離する方法。
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