JP6716057B2 - 細胞を分離する方法及び装置 - Google Patents

Description

本発明は、液体中の細胞をサイズによって分離する方法及び装置に関する。

液体中に存在する細胞をサイズで分離する方法は、様々なものが混在する試料から標的とする細胞を分離するための有用な方法の一つである。
特に、血液中から赤血球及び白血球よりもサイズが大きい癌細胞を分離する技術は、癌の診断、治療効果判定、治療法選択等に利用できる可能性があるため有用である。
特許文献１は、「決定論的横変位（Deterministic Lateral Displacement）」（ＤＬＤ）によって粒子をサイズで分離する方法を開示する。
ＤＬＤ法は、流路中に配列した柱等の障害物によって所定のしきい値よりサイズが大きい粒子を流体自体の流れの方向とは違う方向に移動させる方法であり、しきい値を障害物間のギャップより大幅に小さくすることで、目詰まりを防ぎつつ細胞をサイズで分離することが可能となる。
非特許文献１は、ＤＬＤを用いて、癌細胞と赤血球及び白血球を分離する技術を開示する。
しかし、同文献に記載されたデータの中で白血球の混入が最も少ない条件でも０．４％、すなわち血液１ｍＬ（ミリリットル）を処理するさいに１．３２×１０^４個の白血球が、癌細胞を回収した液に混入している。
また、この方法及び装置は３倍希釈した血液を毎分７μＬで流すものであり、処理量が少なく、癌細胞は血液１ｍＬ当たり、数個ということもあることを考えると、分離に長時間要し実用的でない。
非特許文献２は、ＤＬＤ法により癌細胞をサイズで分離した後、例えばあらかじめ磁気ビーズをつけておいた白血球を、磁気を利用して取り除くという２段階の分離法を開示する。
しかし、この方法及び装置は２段階法であって、煩雑である上に癌細胞をサイズで分離した後に磁気を利用して白血球を取り除く場合に、血液１ｍＬ当たり３．２×１０^４個の白血球が癌細胞を回収した液に混入している。

国際公開ＷＯ２００４／０３７３７４号公報

Enrichment of circulating tumor cells in tumor-bearing mouse blood by a deterministic lateral displacement microfluidic device , Hiromasa Okano et al , Biomed Microdevices Vol.17(2015) , P.9964 Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells , Emre Ozkumur et al , Science Translational Medicine Vol.5(2013) , P.179ra47

本発明は、液体中から標的細胞を分離する方法及びそれに用いる装置の提供を目的とする。

本発明に係る細胞を分離する方法は、標的細胞と当該標的細胞よりもサイズが小さい細胞が１種以上含まれる流体Ａと、前記標的細胞を取り出すための流体Ｂとを、ＤＬＤ（Deterministic Lateral Displacement）デバイス中で合流させることで前記流体Ａ中の標的細胞を前記流体Ｂ中に分離させる方法であって、前記流体Ａよりも粘度が低い前記流体Ｂに増粘剤を加えたことを特徴とする。

本発明にてＤＬＤデバイスとは、「決定論的横変位」（ＤＬＤ）法によるパターンからなる流路（ＤＬＤアレイ）を有するデバイスをいい、構造については後述する。
本発明は、流体Ａと流体ＢとをＤＬＤアレイ中で合流させた際に合流界面にて乱れが生じない程度に相対的に粘度が低い流体Ｂ側に増粘剤を加え、流体Ａの粘度に近づけた点に特徴がある。

標的細胞を含有する流体Ａは、例えば血液等であり、相対的に粘度が高く、流体Ｂは細胞に害の少ない液体が用いられ、例えばリン酸緩衝生理食塩水あるいはリン酸緩衝生理食塩水に添加剤を加えたもの等のバッファー（緩衝液）であり、相対的に粘度が低い。
そこで、前記流体Ｂに増粘剤を加えるか、又は、前記流体Ａを希釈した上で前記流体Ｂに増粘剤を加えた。
本明細書では、状態としては液又は液体と表現し、分離の対象となる場合に流体と表現した。
ここで標的細胞は、例えば血液中の赤血球や白血球よりサイズが大きい癌細胞である。

本発明において増粘剤は、グリセリン及びその誘導体，グリセリン脂肪酸エステル及びその誘導体，エチレングリコール及びその誘導体，エチレングリコール脂肪酸エステル及びその誘導体，プロピレングリコール及びその誘導体，プロピレングリコール脂肪酸エステル及びその誘導体，ポリエチレングリコール及びその誘導体，ポリエチレングリコール脂肪酸エステル及びその誘導体，ゼラチン及びその誘導体，多糖類及びその誘導体，ペクチン，グアーガム，キサンタンガム，タマリンドガム，カラギーナン，カルボキシメチルセルロースのうちいずれか１つ以上であるのが好ましい。

本発明に用いる細胞を分離する装置は、ＤＬＤアレイ部と、当該ＤＬＤアレイ部の一方に標的細胞と当該標的細胞よりサイズが小さい細胞が１種以上含まれる流体Ａの注入部と、流体Ｂに増粘剤を加えた調整流体Ｂの注入部とを有し、前記ＤＬＤアレイ部の他方に前記流体Ａを主に回収する回収部Ａと、前記標的細胞を取り込んだ調整流体Ｂを主に回収する回収部Ｂとを有し、前記ＤＬＤアレイは流路中であって流体の流れを横切る方向に３個以上の柱部を所定のギャップＧを介して等間隔に立設した列を流体の流れ方向に沿って複数列に配設してあり、且つ各列は直前に流体が通過する列と比べて柱部の位置を所定の距離ｄだけ流体の流れを横切る方向にシフトさせて配設したものであることを特徴とする。

上記のＤＬＤアレイのパターン例を図２に示す。
流路中に、流体の流れを横切る方向に３個以上の柱部（障害物）Ｄを所定のギャップＧを介して等間隔に立設した列を有する。
流体の流れ方向に沿って前記列を複数の列として配設し、次の列は前の列と比べて柱部（障害物）Ｄの位置を所定の距離ｄだけ流体の流れを横切る方向にシフトさせて配設した。
なお、柱部間の中心ピッチをλで示してある。
これにより、サイズの大きい細胞Ｌは、ギャップＧの間を通過すると次の柱部が流れの障害になるように距離ｄだけシフトさせてあるので、図２では実線の矢印で示すように流体の流れとは異なる下方向に移動する。
これに対して小さいサイズの細胞Ｓは、流体の層流に沿って点線の矢印で示すように、柱部間を通過する。
これによりサイズの大きい標的細胞は、流体Ｂ側に取り込まれ、流体Ａから分離される。

従来のＤＬＤ法による分離方法では、標的細胞が含まれる流体Ａの粘度が高く、これよりも流体Ｂの粘度が小さいためにＤＬＤアレイ中に合流させると、流体Ａと流体Ｂの単位時間当たりの移動距離が異なり、流体Ａと流体Ｂの合流界面に層流の乱れが生じ、標的細胞の分離が難しいか、あるいは流体Ｂ中に標的細胞以外のサイズの小さい細胞が多く混入する問題があった。
これに対して本発明は、流体Ｂの粘度が流体Ａの粘度に近づくように増粘剤を加えたので、合流後の流体Ａと増粘剤を加えた調整流体Ｂの単位時間当たりの移動距離が近づき、上記合流界面における層流の乱れが少なく、標的細胞の分離精度が高い効果がある。

これを具体的に例えば血液中に含まれる癌細胞の分離を例に説明すると、次のような効果がある。
流体Ａとなる血液中には、標的細胞である癌細胞よりもサイズが小さい赤血球及び白血球が多く存在する。
流体Ｂとなるバッファー中に増粘剤を加えて血液の粘度に近づけることで、あるいは血液を希釈した上でバッファー中に増粘剤を加えて、相互に粘度を近づけることでバッファー中に癌細胞を回収するとともに赤血球及び白血球の混入を少なく抑えることができる。

（ａ）は試験及び評価に用いたＤＬＤデバイスの例を示し、（ｂ）はＤＬＤアレイ部分の拡大図を示す。 ＤＬＤアレイのパターンの例を示す。 細胞を分離する方法の試験結果を示し、（ａ）は血液１ｍＬ当たりのバッファー側回収液中への赤血球及び白血球の混入数を示し、（ｂ）は癌細胞の回収率を示す。

図１に示したＤＬＤデバイスを用いて、前記流体Ｂに相当するバッファーへの赤血球及び白血球の混入数と癌細胞の回収率を評価した。

ＤＬＤデバイスは、ＤＬＤアレイ１０の一方に流体Ａ（血液）の注入部１１、流体Ｂ（バッファ−）又は流体Ｂに増粘剤を加えた調整流体Ｂの注入部１２とを有する。
他方には、血液側の回収部Ａ１３と、バッファー側の回収部Ｂ１４とを有する。

前記ＤＬＤデバイスを用い、流体Ａとして血液、流体Ｂとしてバッファー、あるいはこのバッファーに増粘剤を加えた調整流体Ｂを注入し、ＤＬＤアレイ中で合流させ、血液側とバッファー側をそれぞれ回収した。
試験条件を図３（ａ）の表に示し、バッファー側回収液中への赤血球及び白血球の混入数と癌細胞の回収率を図３（ａ），（ｂ）の表に示す。
血液の希釈には、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用い、バッファーにはＰＢＳに０．５％ＢＳＡ，２ｍＭのＥＤＴＡを添加した。
試験Ｎｏ．１は、血液（希釈なし）を毎分５０μＬ（マイクロリットル）注入し、バッファーを増粘剤添加なしで毎分５０μＬ注入した。
その結果、バッファー側回収液への赤血球の混入が目視で確認できた。
バッファー側回収液には数億個程度の赤血球が混入していると考えられる。
試験Ｎｏ．２は、血液（希釈なし）を毎分５０μＬ注入し、バッファーを増粘剤添加なしで毎分１００μＬ注入した。
血液１ｍＬ当たりバッファー側回収液への赤血球及び白血球の混入数は４．１０×１０^６個であった。
試験Ｎｏ．３は、血液（希釈なし）、３３重量パーセントとなるようにグリセリン（増粘剤）を添加したバッファーともに毎分１００μＬ注入した。
血液１ｍＬ当たりバッファー側回収液への赤血球及び白血球の混入数は３．９６×１０^４個であった。
試験Ｎｏ．４は、２倍希釈した血液、２５重量パーセントとなるようにグリセリン（増粘剤）を添加したバッファーともに毎分２００μＬ注入した。
希釈なしの血液１ｍＬ当たりバッファー側回収液への赤血球及び白血球の混入数は２．１２×１０^３個であり、うち赤血球はほぼ確認できなかった。
試験Ｎｏ．１とＮｏ．２の比較から、粘度が低いバッファーの注入量を血液の注入量より多くすることで、バッファー側回収液への赤血球の混入を抑えることができる。
しかし、試験Ｎｏ．２においても白血球の混入が多かった。
これに対して、試験Ｎｏ．３に示すようにバッファーに増粘剤として、グリセリンを３３重量パーセントとなるように添加することで白血球の混入を抑えることができ、さらに試験Ｎｏ．４に示すように血液をＰＢＳにて２倍に希釈した上で、バッファーにグリセリンを２５重量パーセントとなるように添加することでバッファー側回収液への白血球の混入を血液１ｍＬ当たり１万個以下の２千個程度にまで抑えることができた。
増粘剤の添加量は、増粘剤の種類に応じて適宜、設定することができる。
例えばグリセリンの場合は、血液の希釈率を考慮しつつ、バッファーに対して５〜５０重量パーセントの範囲で調整するのが好ましい。

次に２倍希釈した血液、２５重量パーセントとなるようにグリセリン（増粘剤）を添加したバッファーともに毎分２００μＬの条件で、癌細胞の回収率を確認した。
その結果を図３（ｂ）に示す。
ＭＣＦ−７は９９．７％、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は９８．４％、ＫＹＳＥ−５１０は９９．６％の回収率であった。
これにより、試験Ｎｏ．４の条件では白血球の混入を抑え、癌細胞を効率的に回収できることが明らかになった。

１０ ＤＬＤアレイ
１１ 流体Ａの注入部
１２ 流体Ｂ（調整流体Ｂ）の注入部
１３ 回収部Ａ
１４ 回収部Ｂ

Claims (4)

1. 標的細胞と当該標的細胞よりもサイズが小さい細胞が１種以上含まれる流体Ａと、
   前記標的細胞を取り出すための流体Ｂとを、ＤＬＤ（Deterministic Lateral Displacement）デバイス中で合流させることで前記流体Ａ中の標的細胞を前記流体Ｂ中に分離させる方法であって、
   前記流体Ａよりも粘度が低い前記流体Ｂに増粘剤を加えたことを特徴とする細胞を分離する方法。
2. 前記流体Ａを希釈した上で前記流体Ｂに増粘剤を加えたことを特徴とする請求項１記載の細胞を分離する方法。
3. 前記増粘剤は、グリセリン，グリセリン脂肪酸エステル，エチレングリコール，エチレングリコール脂肪酸エステル，プロピレングリコール，プロピレングリコール脂肪酸エステル，ポリエチレングリコール，ポリエチレングリコール脂肪酸エステル，ゼラチン，多糖類，ペクチン，グアーガム，キサンタンガム，タマリンドガム，カラギーナン，カルボキシメチルセルロースのうちいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞を分離する方法。
4. 前記標的細胞は血液中に含まれる癌細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞を分離する方法。