WO2016035799A1 - 運動性精子の分離方法及び分離装置並びに授精用精子液 - Google Patents

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WO2016035799A1
WO2016035799A1 PCT/JP2015/074895 JP2015074895W WO2016035799A1 WO 2016035799 A1 WO2016035799 A1 WO 2016035799A1 JP 2015074895 W JP2015074895 W JP 2015074895W WO 2016035799 A1 WO2016035799 A1 WO 2016035799A1
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sperm
flow
path
motile
run
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PCT/JP2015/074895
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Inventor
山下健一
宮崎真佐也
永田マリアポーシャ
前田英明
Original Assignee
国立研究開発法人産業技術総合研究所
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating a motile sperm that separates a sperm having good motility from semen or the like that lacks motor ability or is mixed with dead sperm or malformed sperm, etc. Further, the present invention relates to a sperm solution for insemination obtained by the separation method or the separation device.
  • artificial insemination is frequently performed in the livestock field to produce livestock. Artificial insemination may also be performed in the treatment of human infertility.
  • semen used for artificial insemination is often obtained from male cattle and then frozen with liquid nitrogen.
  • dead sperm in semen disturbs the movement of other sperm, captures it, or releases chemical species that should be used as needed in the process leading to fertilization.
  • the semen used for artificial insemination has a high proportion of sperm with good motility, and from which dead sperm is removed.
  • motile sperm various methods for recovering sperm having good motility (hereinafter also referred to as motile sperm) have been proposed in the field of livestock and infertility treatment of humans.
  • the method of separating using the motor ability of living sperm is a useful method as a means for separating and collecting motile sperm from sperm that have lost motility because the load on sperm is relatively small. It can be said.
  • a polycycloolefin plate as a collection device for motile spermatozoa using microchannels to form two laminar flows called a sorting fluid stream laminar flow and a medium fluid stream laminar flow.
  • a method for recovering motile sperm is known in which only motile sperm out of the sperm flowing in the medium fluid stream crosses the laminar flow interface and is collected in the sorted fluid stream (see, for example, Patent Document 1). .
  • the buffer flow path for moving up the sperm while allowing the buffer solution to flow down has a constant cross-sectional shape to the reservoir for storing the sperm. It is directly connected to the wall surface while maintaining
  • the entrance for the sperm to enter the run-up road is narrow, and the effect of collecting and concentrating the sperm to concentrate on the run-up road was not obtained.
  • the conventional sperm separation apparatus and separation method can recover only about 10 sperm per minute.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and provides a method for separating motile sperm that can efficiently separate motile sperm.
  • the present invention also provides a sperm solution for insemination containing a sperm group selected by a sperm separation apparatus, a sperm separation apparatus, and a sperm separation method.
  • a sperm with high mobility is connected by communicating a narrow buffer flow path and a sperm upstream path to a sperm reservoir before selection.
  • the preparation environment before the rhetaxis phenomenon occurs by forming a gathering area of high-density sperm group near the communicating base end of the sperm run-up path I tried to arrange it.
  • the buffer flow path is bifurcated from the base end in order to form a gathering area for the high-density sperm group.
  • a reverse flow is generated from the bifurcated branch channel toward the center by forming a roughly crescent-shaped sperm guide structure at the proximal end of the buffer channel.
  • a narrow buffer flow path and a sperm uplift are communicated with the pre-selection sperm storage tank, and sperm with high mobility is passed through the sperm uplift by the rhetaxis phenomenon.
  • a gathering area was prepared in the vicinity of the communicating base end of the sperm run-up road to gather the sperm group before the rhetaxis phenomenon occurs at high density to prepare the preparation environment.
  • the sperm solution for insemination according to the present invention contains a motile sperm group selected by the above-described method for separating motile sperm and a motile sperm group selected by using the above-described apparatus for separating motile sperm. It was decided to.
  • a separation method capable of efficiently separating motile sperm can be provided.
  • separate a motile sperm efficiently can be provided.
  • a sperm solution for insemination containing a large amount of motile sperm can be provided.
  • the motile sperm is characterized by forming a gathering area of high-density sperm group in the vicinity of the communicating base of the sperm run-up road to prepare the preparation environment before the rhetaxis phenomenon occurs
  • the pre-selection sperm can be semen as obtained from a male animal individual, or semen that has been thawed after freezing.
  • a component-adjusted semen in which the components constituting the concentration and seminal plasma are adjusted, and a sperm-containing solution prepared by dispersing sperm in a predetermined buffer solution can also be used. That is, the pre-selection sperm to be added to the reservoir in this specification includes the meaning of semen as obtained from a male animal individual, as well as thawed semen, component-adjusted semen, and sperm-containing fluid. It should be understood as a generic term.
  • the method for separating motile spermatozoa according to the present embodiment, by providing a gathering area of high-density sperm groups, the number of sperm entering the upstream path can be dramatically improved, and artificial insemination is possible. It is possible to recover a sperm solution for insemination containing motile sperm at a practical concentration.
  • the collection area of the high-density sperm group is an area where spermatozoa gather at a concentration higher than the sperm concentration of the pre-selection sperm solution, and if such a collection area can be formed, its means, method, configuration, etc. are particularly It is not limited. If an example of such a gathering area is given, it can also be formed, for example, by bifurcating the buffer channel from the base end.
  • the sperm run-up path may be composed of a plurality of run-up paths separated by a partition wall.
  • the sperm run-up path formed in a predetermined width and a predetermined height over a predetermined length is partitioned by a partition wall having the predetermined height along the length direction, and a plurality of tracks with a narrower width are used.
  • An alley may be formed.
  • the number of partition walls is not particularly limited.
  • the number of partition walls can be set to 1 or more, more preferably in the range of 1 to 5, more preferably in the range of 3 to 5.
  • the number of upstream paths is 2 or more. More preferably, it can be 2 to 6, more preferably 4 to 6.
  • the position of the partition wall with respect to the width direction of the sperm upstream is not particularly limited, and can be changed according to the properties such as the flow rate and flow velocity of the liquid to be fed, but a certain interval is provided in the width direction of the sperm upstream. Thus, it is desirable to arrange a plurality of partition walls in parallel.
  • the upstream path formed by providing the partition wall is not particularly limited as long as the upstream and downstream have a flow path cross section flowing as a laminar flow, and an example is given for the purpose of understanding the invention. If so, the channel width can be about 50 to 1000 ⁇ m and the channel height can be about 50 to 1000 ⁇ m.
  • the width of the partition wall itself is not particularly limited, but for example, the width is about 50 to 500 ⁇ m considering the size of the sperm itself and the hydrodynamic characteristic value.
  • the height of the partition wall can be about 50-500 ⁇ m, preferably about the same height as the sperm run-up path, and the partition height is high enough to prevent sperm and upstream traffic between adjacent run-up paths. It is desirable.
  • the length of the partition wall is slightly shorter than the length of the sperm run-up path.
  • the partition wall is formed from a position 2 to 20 ⁇ m inside from the start end of the sperm run-up path to a position about 5 to 20 ⁇ m inside from the end, and a wide part without a partition wall is formed near the start end and end of the sperm run-up path. It is good to form.
  • the tip of the bifurcated branch channel of the buffer channel may be gradually narrowed.
  • a back flow may be generated from the bifurcated branch channel toward the center by a straight flow of the buffer solution discharged from the buffer channel.
  • a sperm guiding structure is formed at the base end of the buffer flow path, thereby causing a back flow from the bifurcated flow path toward the center. You may do it.
  • the sperm guiding structure is formed wider than the narrow upstream, but has a shape that can generate a flow with a low Reynolds number (for example, 1500 or less), so that the sperm is involved in turbulent flow. It is possible to efficiently guide sperm to the narrow upstream.
  • the sperm induction structure may have a roughly crescent shape (roughly crescent) to generate a backflow from the bifurcated branch channel toward the center.
  • a flow velocity attenuation area where the flow velocity of each flow stagnates may be formed in an area where the straight flow from the buffer flow channel and the reverse flow from the bifurcated flow channel intersect.
  • this velocity reduction area is an area where the flow stays due to the merge of the straight flow and the reverse flow, and the flow becomes slow, and is connected to the outside of the sperm induction part structure.
  • MSMS Mobile Sperm sorting Microfluidic System
  • Non-Patent Document 1 is a device that is seemingly similar to the structure of the microchannel 12 in the sperm sperm separation device according to this embodiment, which will be described in detail later. Although having a configuration, this MSMS is greatly different in that it does not include a high-density sperm group gathering area such as a sperm induction structure.
  • the collection area and a rhetaxis-inducing region for inducing rhetaxis in the sperm by a buffer flow flowing from the buffer flow path are provided close to or overlapping with each other.
  • the concentration of sperm can be increased and the sperm can be guided to the upstream path very efficiently.
  • the present invention relates to a method for separating motile sperm from low motile sperm and / or non-motile sperm, which comprises motile sperm and at least one of low motile sperm or non-motile sperm.
  • a lamellar space is disposed in the pre-sperm solution, and a buffer flow is caused to flow into the lamellar space to form a laminar flow-induced rhetaxis-induced flow that induces leotaxis in the motile sperm.
  • a laminar collective flow that flows in the direction of merging with the rhetaxis-induced flow is generated in the laminar space portion, and the vicinity of the merged portion of the rhetaxis-induced flow and the collective flow is from outside the lamellar space portion.
  • the sperm that has been assembled is induced by the rheotaxis-induced flow to induce the rhetaxis into the buffer solution flow, and the induced sperm is moved up a predetermined distance in the buffer solution flow. It can also be said that the present invention provides a method for separating motile sperm that separates sperm that have been run up as motile sperm.
  • the present invention is a method for separating motile sperm from pre-selection sperm fluid containing sperm collected from an animal, the storage unit storing pre-selection sperm fluid, and a storage unit
  • a sperm selection section comprising: a buffer flow path in which a buffer solution flows as a laminar flow toward the storage section; a upstream path communicating with the storage section so that the sperm runs up from the storage section into the buffer flow path; and
  • a wide laminar path for inducing laminar flow with two or more different directions is formed while maintaining a laminar flow state of the buffer solution. It can also be said that the present invention provides a method for separating motile spermatozoa, characterized in that motile sperm is run up from the pre-reservoir and flowed into the selection section.
  • sperm fluid for artificial insemination for intrauterine sperm injection
  • in vitro or microinsemination is not limited to this.
  • it can also be used as a sperm solution for use.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing the configuration of a separation apparatus for motile sperm (hereinafter referred to as separation apparatus D) according to this embodiment.
  • the separation device D is configured by placing three cylindrical bodies 4 on a main body 3 formed by superposing a bottom forming plate 1 and a chip body 2. Moreover, the inside of each cylinder 4 is made into the buffer solution storage part 5, the pre-selection sperm liquid storage part 6, and the collection
  • a predetermined amount of buffer solution is injected into the buffer solution storage unit 5
  • a predetermined amount of pre-selection sperm solution is injected into the pre-selection sperm solution storage unit 6, and a predetermined amount of buffer solution is also injected into the recovery unit 7.
  • the motile sperm is selected from the sperm contained in the pre-selection sperm liquid housed in the pre-selection sperm liquid storage unit 6 and can be recovered together with the buffer solution by the recovery unit 7. That is, a sperm solution for insemination containing a motile sperm group can be prepared.
  • the bottom forming plate 1 that constitutes the main body 3 is a substrate on which the chip body 2 is placed. It functions as a member that forms the bottoms of the pre-sperm fluid storage unit 6 and the recovery unit 7 and forms the bottom of a flow path pattern 12a described later formed on the back surface of the chip body 2.
  • the bottom forming plate 1 can be formed of, for example, glass or resin (acrylic or PDMS).
  • the chip body 2 constituting the main body 3 is a plate-like member formed of resin, and is formed of polydimethylsiloxane (PDMS) in this embodiment.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the chip body 2 has three holes. These three holes are respectively a buffer solution hole portion 8 constituting a part of the buffer solution storage portion 5 described above, a reservoir portion hole portion 9 constituting a part of the pre-selection sperm fluid storage portion 6, and a recovery. This is a recovery part hole 10 that constitutes a part of the part 7.
  • a flow path pattern 12a is formed on the back surface of the chip body 2 by fine processing.
  • This flow path pattern 12 a is for forming the micro flow path 12 by superimposing the bottom forming plate 1 and the chip body 2.
  • the flow path pattern 12a includes a buffer solution hole 8, a reservoir hole 9, a plurality of grooves 11 for communicating the recovery hole 10, and a sperm guide structure for forming the sperm guide structure described above. It is formed by engraving the concave portion 13 for forming the portion.
  • Each cylinder 4 is arranged at the periphery of the buffer solution hole 8, the reservoir portion hole 9, and the recovery portion hole 10, so that the buffer solution storage portion 5, the pre-selection sperm fluid storage portion 6, and the recovery portion. 7 functions as a wall for increasing the capacity that can be accommodated.
  • Each cylinder 4 has an outer diameter larger than the diameter of each hole, and is arranged and fixed in a watertight manner on the periphery of each hole.
  • the reservoir-recovery communication channel 20 includes a run-up path 23 formed from the junction 22 toward the pre-selection sperm fluid reservoir 6 and a recovery path 24 formed from the junction 22 toward the recovery section 7. It consists of.
  • the buffer solution supplied to the junction 22 by the buffer solution supply path 21 is configured such that a part flows to the upstream path 23 and the remaining part flows to the recovery path 24.
  • the buffer solution flow that flows into and flows down the upstream path 23 is also referred to as upstream and downstream, and the buffer solution flow that flows into the recovery path 24 and flows down is referred to as a recovery flow.
  • the run-up path 23 is a flow path for guiding sperm from the pre-selection sperm liquid stored in the pre-selection sperm liquid storage unit 6 and selecting motile sperm. 26.
  • the narrow upstream channel 25 moves the spermatozoa upstream toward the junction 22 by moving the sperm up in the direction of the junction 62 while reversing the flow in the upstream upstream generated by the buffer solution diverted at the junction 22.
  • So-called low-motile sperm and / or non-motile sperm such as malformed sperm or sperm that is inferior to motility when performing artificial insemination, are dropped upstream and do not reach the junction 22 It is a channel for making it.
  • the sperm guidance structure part 26 is a part that functions as an attracting means for efficiently guiding the sperm in the pre-selection sperm fluid storage part 6 to the narrow upstream path 25, and is a part indicated by hatching in FIG.
  • the broken line shown in the downstream end part (downstream end part of the run-up path 23) of the sperm guidance structure part 26 is the slit-shaped opening part 27 opened on the side wall part of the sperm fluid storage part 6 before selection.
  • the narrow upstream path 25, the sperm guidance structure 26, and the slit-shaped opening 27 constitute a sperm selection part structure.
  • the recovery path 24 is a flow path for recovering the sperm that reaches the merging section 22 by going up the narrow uphill path 25 in the upstream direction and collecting the sperm that reaches the merging section 22.
  • 7 is a part for pouring into 7.
  • the sperm addition step of adding the pre-selection sperm liquid to the pre-selection sperm liquid storage part 6 is performed, and the selection accommodated in the pre-selection sperm liquid storage part 6
  • Sperm having good motility is efficiently selected from a large number of populations by the slit-shaped opening 27, the sperm guide structure 26, and the narrow uphill 25 from the previous sperm solution, and is collected by the collection unit 7 together with the collection flow. It will be.
  • the upstream upstream exceeds the limit flow rate at which sperm that has motility but does not want to be recovered can flow upward, and sperm with good motility is upstream.
  • the buffer solution supply path 21 is formed so that the buffer solution flow becomes a laminar flow velocity in the upstream channel 23 (the narrow upstream channel 25 and the sperm guiding structure portion 26) below the maximum flow rate that can be increased. Yes.
  • the buffer solution supply path 21 has a flow rate that exceeds the movement ability of the sperm that has reached the confluence 22 (upward). Is formed.
  • the buffer solution supply passage 21 is formed by the two buffer solution supply passages 21 so as to have a flow passage cross-sectional area capable of supplying the upstream and downstream conditions satisfying the above conditions and a flow rate capable of generating a recovery flow. is doing.
  • the sperm group before the occurrence of the rhetaxis is densely assembled in the vicinity of the communicating base end of the sperm run-up path (narrow run-up road 25) to prepare the preparation environment
  • the point which formed the area can be mentioned.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram showing a configuration in the vicinity of the sperm guidance structure portion 26.
  • the sperm guiding structure portion 26 is a portion having a substantially crescent shape in plan view, and the width gradually narrows toward the lower left in the figure, and the central portion 30C in the vicinity of the connection region with the narrow uphill path 25.
  • the left leg 30L extending in a sharp shape and the right leg 30R extending in a sharp shape with the width gradually narrowing toward the lower right in the figure form a bifurcated shape.
  • the sperm guiding structure portion 26 is formed in a gradually narrowed shape from the left side portion 30L and the right side portion 30R to the central portion 30C and the narrow upstream path 25.
  • the collective flow 32 generated in the left flank 30L and the right flank 30R is near the sharp tip of the left flank 30L and the right flank 30R and is outside the layered space of the sperm guidance structure 26 before selection.
  • a suction flow 33 for drawing sperm from the liquid storage unit 6 is generated, and sperm is supplied to the collective flow 32 one after another. Sperm riding on the collective flow 32 are gradually collected to the central portion 30C.
  • a flow velocity reduction area 34 is formed in which the flow is attenuated by the merge of the rheotaxis-induced flow 31 and the collective flow 32 generated in the left flank 30L and the right flank 30R.
  • the flow is stagnant or very slight.
  • sperm collected in or near the flow velocity reduction area 34 in the central portion 30C by the collective flow 32 stays and gradually accumulates, so that the spermatozoa are shaded in the central portion 30C in FIG.
  • a gathering area 35 in which sperm are present at a high concentration (high density) is formed.
  • the gathering area 35 formed in this way can be regarded as a preparation environment before the occurrence of the rhetaxis phenomenon, and functions as a standby area for efficiently guiding sperm to the narrow uphill 25.
  • the gathering area 35 is provided close to or overlapping (partially overlapping in FIG. 5) with the rhetaxis induction region 36.
  • FIG. 6 is an explanatory view showing the configuration of a separation apparatus for motile sperm (hereinafter referred to as separation apparatus E) according to a modification.
  • This separation device E is identical in that it includes the same main body 3 as the above-described separation device D, but in order to form the buffer solution storage unit 5, the pre-selection sperm fluid storage unit 6, and the recovery unit 7,
  • the structure is different in that a block body 40 formed of a soft resin such as silicon is placed on the portion 3.
  • the alternate long and short dash line is a line surrounding the sperm induction structure 26 that is one of the characteristic structures of the separation device D and the separation device E.
  • the sperm induction structure 26 is indicated by a solid line, The part is shown with a broken line.
  • the BB cross section and the CC cross section show a state cut at a position half the thickness of the sperm guiding structure portion 26.
  • the first cylindrical hole drilled in the block body 40 is a buffer solution storage hole 41, which is a hole for forming a storage space for the buffer solution storage unit 5.
  • the second cylindrical hole is a pre-selection sperm fluid storage hole 42 and is a hole for forming a storage space for the pre-selection sperm fluid storage unit 6.
  • the third cylindrical hole is a recovery hole 43 and is a hole for forming a storage space for the recovery unit 7.
  • the separation apparatus E provided with such a configuration, it is possible to efficiently separate the motile sperm and to prepare a sperm solution for insemination containing a large amount of the motile sperm. In contrast, since there is no portion that protrudes as a whole of the device, it is possible to eliminate structural vulnerability derived from the protruding portion.
  • this test is also a test for preparing a sperm solution for insemination, more specifically, a test for preparing a sperm solution for artificial insemination.
  • the part corresponding to the chip body 2 of the separation apparatus D was tested as the chip body shown in FIG. 8, and the number of recovered sperm, the proportion of sperm with mobility, linear velocity, curve velocity, straight advance Seeking sex.
  • the chip body shown in FIG. 8 has substantially the same configuration as the microchannel 12 described above in plan view.
  • the inner diameter of the buffer solution storage part indicated by a is 10 mm
  • the inner diameter of the pre-selection sperm liquid storage part indicated by b is 7 mm
  • the inner diameter of the recovery part indicated by c is 8 mm
  • the length of the buffer solution supply path indicated by A is 20.58 mm
  • the width of the narrow upstream path shown by B is 2.5 mm
  • the width is 200 ⁇ m
  • the depth is 100 ⁇ m
  • the length of the recovery path 24 shown by C is 2.5 mm
  • the width is 200 ⁇ m
  • the depth is 100 ⁇ m
  • the depth of the substantially crescent-shaped sperm-guiding structure shown by the hanging is 100 ⁇ m
  • the area in plan view is 12.14 mm 2 .
  • a separation apparatus for motile sperm was configured using this chip body, and a preparation test of a sperm solution for insemination was performed by adding a buffer solution and freeze-thawing semen as a pre-selection sperm solution.
  • the sperm solution for insemination according to the present embodiment is a sperm solution suitable for artificial insemination, containing motile sperm at an extremely high concentration.
  • the created mesh data was imported into Fluent 6.3 manufactured by Ansys Japan Co., Ltd., which is general-purpose thermal fluid analysis software, and computational fluid dynamics calculation was performed.
  • the calculation condition is that the flow rate of the buffer solution flowing in from the run-up path is 20 ⁇ m / sec, the slit-like opening communicating with the pre-selection sperm fluid storage part is pressure-released, the other parts are walls, and no-slip
  • the boundary conditions were analyzed with a 20 ⁇ m cubic mesh. The results are shown in FIGS.
  • FIG. 12 is a vector diagram showing a state in which the direction of the center part 70C is viewed in three dimensions from the tip of the left side part 30L. As shown in FIG. 12, from the result of the computational fluid dynamics calculation, a strong flow toward the central portion 70C indicated by a large arrow is generated at the sharp tip portion of the left side portion 30L as compared with other arrows. It was shown that.
  • FIG. 13 is a vector diagram showing a state in which the direction of the right side 70R is viewed in three dimensions from the narrow upstream path 25 side.
  • the flow velocity accelerates in the vicinity of the connecting portion with the sperm guiding structure portion 26, and when entering the sperm guiding structure portion 26, it becomes a slow flow and forms the rhetaxis-induced flow 31. It was shown that. In addition, the rheotaxis-induced flow 31 was also shown to be laminar.
  • FIG. 14 is an explanatory diagram showing contours of the flow velocity distribution in the narrow upstream path 25 and the sperm guidance structure 26 in plan view.
  • the image enclosed in the square frame in FIG. 14 is an image in which the contrast of the narrow upstream path 25 indicated by a broken line is changed.
  • a flow velocity reduction area 34 having a very slow flow velocity is formed in the central portion 30C, which is formed by the merging of the rhetaxis-induced flow 31 and the two collective flows 32. It was shown that.
  • the flow velocity rises immediately before the upstream flows into the sperm induction structure portion 26, and the rhetaxis-induced flow 31 extends over a wide range, so that the rhetaxis-induced region 36 extends over a wide range. Is formed, causing a wide range of motile spermatozoa to cause rhetaxis to the narrow uphill 25.
  • a suction flow 33 is generated in the vicinity of the tip of the left flank 30L and the right flank 30R, and sperm is supplied to the collective flow 32 one after another from the pre-selection sperm fluid storage unit 6.
  • a flow velocity reduction area 34 is formed by the merge of the rhetaxis-induced flow 31 and the collective flow 32. Along with this, a large amount of sperm carried by the collective flow 32 stays, and the collective area 35 It is formed.
  • this high flow velocity portion serves as a sieve, and motile sperm is selected.
  • motile sperm is selected.
  • a sufficient sperm concentration can be secured.
  • the sperm that has passed the high flow velocity part goes up the narrow uphill path 25 relatively easily and is collected through the junction 22.
  • FIGS. 16 (a) to 16 (c) the portion corresponding to the chip body 2 of the separation device D described above was replaced with various chip bodies having deformed flow channel portions shown in FIGS. 16 (a) to 16 (c), and were tested and recovered.
  • the number of sperm was determined.
  • FIG. 16 the deformation
  • each of the deformed flow channel portions illustrated is shown for easy understanding of the structure subjected to the test, and the ratio of the sizes is not always accurate. Although the thickness and width of the narrow uphill are exaggerated, the dimensions are based on the sperm guidance structure 26 described above in actual tests.
  • the deformed flow path portion P shown in FIG. 16 (a) is formed by forming a layered space portion over the entire outer periphery of the pre-selection sperm fluid storage portion 6 formed in a circular shape in plan view, and is bifurcated from the narrow upstream channel 25.
  • the portion corresponding to the right side portion or the left side portion is not sharply converged on the inner wall of the pre-selection sperm fluid storage portion 6.
  • the structure shown in (a) has a large opening area of the slit-like opening that opens to the pre-selection sperm fluid storage part 6, so that the inflow efficiency of the sperm into the deformed flow path part is improved, that is, sperm induction. It was predicted that it might function as a structural part.
  • the deformed flow channel portion Q shown in FIG. 16 (b) forms a layered space portion over the half circumference of the pre-selection sperm fluid storage portion 6 and branches into a bifurcated shape from the narrow upstream channel 25.
  • This is the same as the sperm induction structure 26 described above in that the portion corresponding to the portion or the left side portion is shaped to converge sharply on the inner wall of the pre-selection sperm fluid reservoir.
  • the outer wall portion of the deformed flow channel portion Q is different from the sperm guiding structure portion 26 in that the outer wall portion of the deformed flow channel portion Q is not gradually narrowed from the portion corresponding to the left and right side portions toward the narrow upstream path 25. ing.
  • the deformed flow path portion R shown in FIG. 16 (c) forms a layered space portion over substantially 1/8 of the pre-selection sperm fluid storage portion 6 and branches into a bifurcated shape from the narrow upstream channel 25.
  • the portion corresponding to the right side or left side has a shape that sharply converges on the inner wall of the pre-selection sperm fluid storage part, and further, the outer wall part of the deformed flow channel part from the part corresponding to the left and right side parts The shape gradually narrows toward the narrow uphill 25.
  • the outer wall portion of the deformed flow path portion R is different from the above-described sperm guiding structure portion 26 in that it is not a smooth curved shape that bulges outward toward the sperm guiding structure portion but is a straight line. I have to.
  • a deformed channel part P, a deformed channel part Q, a deformed channel part R, and the like are conceivable. Therefore, we examined and examined how much sperm recovery efficiency can be expected for these deformed flow channel sections.
  • the outer periphery of the pre-selection sperm fluid reservoir 6 was formed in an annular shape, but a noticeable set above the sperm concentration in the pre-selection sperm fluid reservoir 6 was observed in this annular portion. There wasn't.
  • the deformed flow path part P, the deformed flow path part Q, and the deformed flow path part R cannot form a gathering area of high-density sperm groups, and can be a preparation environment before the rhetaxis phenomenon occurs. Not shown.
  • the substantially crescent-shaped sperm guiding structure section 26 is interposed between the pre-selection sperm fluid storage section 6 and the narrow uplift path 25, the deformation flow path Compared with the shape of the sperm assembly of the part P, the deformed channel part Q, and the deformed channel part R, a reverse flow is generated from the gradually narrowed portions at both ends of the substantially crescent moon shape and flows into the narrow uphill path at once. It becomes.
  • FIG. 17 is a schematic view showing an enlarged narrow upstream section in the apparatus for separating sperm motility according to the present embodiment, showing a plan view on the left side and a cross section of each narrow upstream path on the right side.
  • FIG. 17A shows a narrow upstream path 25a in which the partition wall 60 is not provided and the upstream space S is not divided, similarly to the microchannel 12 described above.
  • the dimensions of the narrow upstream path 25a used in this verification are as follows: the length L from the connecting portion with the sperm guiding structure portion 26 to the connecting portion with the merging portion 22 is 1 mm, the width W is 300 ⁇ m, and the height H is 100 ⁇ m. is there.
  • FIG. 17B shows a narrow upstream path 25b in which one partition wall 60 is provided in the substantially central portion of the upstream space S and two upstream paths 61 are formed.
  • the dimensions of the narrow upstream road 25b are as follows: the overall width W1 of the narrow upstream road 25b is 350 ⁇ m, the width W2 of each upstream path 61 is 150 ⁇ m, the width W3 of the partition wall 60 is 50 ⁇ m, and other dimensions are the same as the narrow upstream road 25a.
  • the length L is 1 mm and the height H is 100 ⁇ m.
  • the length of the partition wall 60 is shorter than the length L by the lengths K1 and K2, and a wide portion 62 (shown by hatching in the figure) without the partition wall in the width W1 direction. Forming.
  • the length K1 and the length K2 are each 10 ⁇ m.
  • FIG. 17 (c) shows a narrow uphill 25c in which three partition walls 60 are provided in the uplift space S and four uphill paths 61 are formed.
  • the dimensions of the narrow upstream road 25c are as follows: the overall width W4 of the narrow upstream road 25c is 490 ⁇ m, the width W5 of each upstream path 61 is 100 ⁇ m, the width W6 of the partition wall is 30 ⁇ m, and the narrow upstream road 25a and the narrow upstream road 25b.
  • the length L is 1 mm and the height H is 100 ⁇ m.
  • the length of the partition wall 60 is shorter than the length L by the lengths K1 and K2, and the wide portion 62 (in the drawing) without the partition wall in the width W1 direction. (Shown by shading).
  • the length K1 and the length K2 are each 10 ⁇ m.
  • the sperm concentration of the sperm fluid collected by the separation apparatus provided with the narrow upstream path 25a in which the partition wall 60 is not formed was 1.548 ⁇ 10 6 particles / mL
  • the sperm concentration of the sperm fluid collected by the separation apparatus provided with the narrow upstream channel 25b provided with one partition wall 60 and composed of the two upstream channels 61 is 2.825 ⁇ 10 6 particles / mL, about 1.5 to More sperm was recovered at a sperm concentration of about 2 times.
  • the sperm concentration of the recovered sperm fluid is 7.629 ⁇ 10 6 cells / mL. It was recovered at a sperm concentration about 5 times that of the narrow uphill 25a.
  • the sperm motility rate is 100%, which can be said to be an extremely excellent sperm screening result.
  • the present inventors have moved up (recoverable) per unit time even when a plurality of upstream paths 61 are formed by providing partition walls 60 in the narrow upstream path 25. It was expected that the number of sex spermatozoa would not change compared to the case where the partition wall 60 was not provided. However, in fact, as described above, a surprisingly efficient sperm recovery was realized.
  • narrow narrow upstream 25b and the narrow upstream 25c are representatively shown in the point that many normal spermatozoa can be recovered over a wider base while steadily excluding dead sperm in the semen. It can be said that there is a technical significance of the characteristic configuration.
  • sperm with high mobility can be obtained by communicating a narrow buffer solution flow path and a sperm upstream path with a sperm reservoir before selection.
  • a gathering area of high-density sperm group is formed near the communication base end of the sperm run-up path to prepare a preparation environment before the rhetaxis phenomenon occurs.
  • Buffer solution storage unit 6 Pre-selection sperm solution storage unit 7
  • Collection unit 12 Micro channel 21 Buffer solution supply channel 23 Upstream channel 25 Narrow upstream channel 26
  • Sperm guiding structure unit 27 Slit-shaped opening 30C Central part 30L Left side part 30R Right Also part 31 rheotaxis-induced flow 32 collective flow 33 suction flow 34 velocity reduction area 35 collective area 36 rhetaxis-induced region D separation device P deformation flow path part Q deformation flow path part R deformation flow path part

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Abstract

　運動性精子を効率良く分離することのできる運動性精子の分離方法を提供する。　選抜前精子貯留槽に狭隘な緩衝液流路と精子遡上路とを連通することにより、運動性の高い精子をレオタキシス現象により精子遡上路を介して選抜する運動性精子の分離方法において、精子遡上路の連通基端近傍に高密度精子群の集合エリアを形成してレオタキシス現象が生起する前の準備環境を整えるようにした。また、高密度精子群の集合エリアを形成するために、緩衝液流路を基端から二叉状に分岐させたことや、緩衝液流路の二叉分岐流路の先端部はそれぞれ漸次狭窄状に形成したことにも特徴を有する。

Description

運動性精子の分離方法及び分離装置並びに授精用精子液
　本発明は、運動能力を欠いたり、死んだ精子や奇形の精子などが混在する精液等から運動性が良好な精子を分離する運動性精子の分離方法、及び、運動性精子の分離装置、並びに、前記分離方法や前記分離装置により得られた授精用精子液に関する。
　従来、畜産分野において、家畜を生産するために、人工授精が頻繁に行われている。また、ヒトの不妊治療などにおいても、人工授精が行われる場合がある。
　このような人工授精では、オスの個体から得られた精液を、メスの子宮内に注入して受胎させるため、できるだけ受胎効率の良い精液が望まれる。
　例えば畜産牛の分野において、人工授精に供される精液は、オスのウシから得た後に液体窒素で凍結されたものであることが多い。
　ところが、凍結後に解凍した精液は、その精液中に含まれる精子の多くが既に死んでいたり運動性が失われており、その割合は約５割～７割にも達する場合が多く、また、奇形の精子も一部含まれていることから、受胎効率の向上を妨げる原因の一つとなっている。
　また、精液中の死んだ精子は、他の精子の運動を阻害したり、捕捉したり、または受精に至る過程で必要に応じて用いられるはずの化学種を無秩序に放出する。
　すると、この化学種により良好な運動性を有する精子までが影響を受け、精液の質が更に低下することとなり好ましくない。
　従って、人工授精に用いられる精液は、運動性が良好な精子の割合が高く、死んだ精子などが除かれたものであるのが望ましい。
　そこで以前より、畜産の分野やヒトの不妊治療の分野では、良好な運動性を有する精子（以下、運動性精子とも称する。）を回収する方法が種々提案されている。
　中でも、生きている精子が有する運動能力を利用して分離する方法は、精子に対する負荷も比較的小さいため、運動性を失った精子から運動性精子を分離し回収する手段として有用な方法であると言える。
　例えば、スライドガラス大の基板に刻設された微細な流路（マイクロ流路）に緩衝液などの所定の液を流し、運動性精子がこの緩衝液の流れに逆らって遡上する性質を利用して、回収する方法が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
　また、同様にマイクロ流路を用いた運動性精子の回収装置として、ポリシクロオレフィンのプレートに４つのチャンバーを設置し、選別流体ストリーム層流、媒体流体ストリーム層流と呼ばれる２つの層流を形成させ、媒体流体ストリームに流れる精子のうち運動性精子のみが層流界面を渡って、選別流体ストリームに集められることで、運動性精子を回収する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
　このような方法によれば、遠心分離に供する方法などに比して、精子に対する物理的ダメージやＤＮＡ損傷を軽減することができ、比較的良質な精子を回収することができる。
特表２００５－５１８７９４号公報
Microfluidics and Nanofluidics, 2007, Vol.3, 561-570
　しかしながら、上記非特許文献１に記載されている従来の精子の分離装置は、緩衝液を流下させつつ精子を遡上させる緩衝液流路が、精子を貯留しておく貯留部へ一定の断面形状を維持したまま壁面に直接連結されている。
　それゆえ、貯留部内においてそれぞれランダムに動いている精子集団の中に急流が流れ込んでいるような状態となっており、精子に対してレオタキシス(rheotaxis)を惹起可能な領域が極めて狭く、寧ろ緩衝液流路への精子の接近を妨げるような状態となっていた。
　また、緩衝液流路は精子が遡上する遡上路としての役割を有する部位でもあるが、この遡上路としての機能の側面から鑑みても、一定の断面形状を維持したまま貯留部の壁面に直接連結されていると言える。
　従って、精子が遡上路に進入するための間口が狭く、精子を集合させて濃縮して遡上路に誘導するという効果が得られるものではなかった。
　それゆえ、従来の精子の分離装置や分離方法では、１分間あたり約10個程度の精子しか回収することができなかった。
　また、上記従来の特許文献１に記載の方法では、媒体流体ストリームの層流界面を越えるほど運動性の高い精子しか選抜流体ストリームに移動できないため、これも同様に結果として少量の精子しか回収できないという問題を有している。しかも、２つの層流をコントロールして揺らぎのない界面を形成するためには、極めて高度な手技が必要となり、事実上、容易に作業を行えるとは言い難いものであった。
　これら従来の方法によっても、相当に優れた運動性精子を極少数選抜することは可能ではある。例えば体外受精（顕微授精）を行う場合にあっては、従来程度の効率で精子が得られれば問題はない。しかしながら、人工授精、すなわち子宮腔内精子注入法(intra uterine insemination:IUI)等を行う場合には、精子の分離に要する時間などを踏まえると、現実的には回収効率を著しく（例えば、１万～１０万倍）向上させる必要がある。
　勿論、従来の精子分離装置や分離方法を複数同時に実行したり、繰り返し実行することにより更に多くの精子を回収することは可能であるものの、人工授精に必要な程度の回収効率を得るのは現実的ではなく、また、作業が繁雑であるが故に時間を要し、精子が経時劣化してしまうこととなる。
　本発明は、斯かる事情に鑑みてなされたものであって、運動性精子を効率良く分離することのできる運動性精子の分離方法を提供する。また、本発明では、運動性精子の分離装置や、同運動性精子の分離装置及び前記運動性精子の分離方法によって選抜された精子群を含有する授精用精子液についても提供する。
　上記従来の課題を解決するために、本発明に係る運動性精子の分離方法では、選抜前精子貯留槽に狭隘な緩衝液流路と精子遡上路とを連通することにより、運動性の高い精子をレオタキシス現象により精子遡上路を介して選抜する運動性精子の分離方法において、精子遡上路の連通基端近傍に高密度精子群の集合エリアを形成してレオタキシス現象が生起する前の準備環境を整えるようにした。
　また、高密度精子群の集合エリアを形成するために、緩衝液流路を基端から二叉状に分岐させたことにも特徴を有する。
　また、緩衝液流路の二叉分岐流路の先端部はそれぞれ漸次狭窄状に形成したことにも特徴を有する。
　また、緩衝液流路からの直進流により二叉分岐流路から中央に向かって逆流を生起することにも特徴を有する。
　また、緩衝液流路の基端に略三日月形状(roughly crescent)の精子誘導構造部を形成することにより、二叉分岐流路から中央に向かって逆流を生起することにも特徴を有する。
　また、緩衝液流路からの直進流と、二叉分岐流路からの逆流との交わるエリアに、各流の流速が停滞する流速減殺エリアを形成したことにも特徴を有する。
　また、前記精子遡上路は、仕切壁で隔てられた複数の遡上小路より構成したことにも特徴を有する。
　また、本発明に係る運動性精子の分離装置では、選抜前精子貯留槽に狭隘な緩衝液流路と精子遡上路とを連通し、運動性の高い精子をレオタキシス現象により精子遡上路を介して選抜する運動性精子の分離装置において、精子遡上路の連通基端近傍に、レオタキシス現象が生起する前の精子群を高密度に集合させて準備環境を整える集合エリアを形成した。
　また、本発明に係る授精用精子液では、前述の運動性精子の分離方法によって選抜された運動性精子群や、前述の運動性精子の分離装置を用いて選抜された運動性精子群を含有することとした。
　本発明によれば、運動性精子を効率良く分離することのできる分離方法を提供することができる。また、本発明によれば、運動性精子を効率良く分離可能な分離装置を提供することができる。さらに、本発明によれば、運動性精子を多く含有する授精用精子液を提供することができる。
本実施形態に係る運動性精子の分離装置を示した説明図である。 本実施形態に係る運動性精子の分離装置の構成を示した分解斜視図である。 本実施形態に係る運動性精子の分離装置の構成を示した断面図である。 マイクロ流路の構成を示した説明図である。 精子誘導構造部を示した説明図である。 変形例に係る運動性精子の分離装置の構成を示した説明図である。 変形例に係る運動性精子の分離装置の構成を示した説明図である。 授精用精子液の調製試験に用いたチップ体の構成を示した説明図である。 授精用精子液の調製試験の結果を示した説明図である。 数値流体力学計算に用いた精子誘導構造部の形状データの説明図である。 数値流体力学計算での解析対象とした形状を示す説明図である。 数値流体力学計算により得られた結果を示すベクトル図である。 数値流体力学計算により得られた結果を示すベクトル図である。 数値流体力学計算により得られた流速分布を示す説明図である。 解析結果の考察を示した説明図である。 他の精子誘導構造部形状を示した説明図である。 狭隘遡上路の変形例を示した説明図である。 各狭隘遡上路を備えた分離装置にて回収された精子の検討結果を示す説明図である。
　本発明の一つの実施形態としては、選抜前精子貯留槽に狭隘な緩衝液流路と精子遡上路とを連通することにより、運動性の高い精子をレオタキシス現象により精子遡上路を介して選抜する運動性精子の分離方法において、精子遡上路の連通基端近傍に高密度精子群の集合エリアを形成してレオタキシス現象が生起する前の準備環境を整えるようにしたことを特徴とする運動性精子の分離方法が挙げられる。
　ここで、選抜前精子液とは、オスの動物個体より得られたままの精液や、凍結後解凍された精液を用いることができるのは勿論のこと、精漿や緩衝液を添加して精子濃度や精漿を構成する成分を調整した成分調整精液や、精子を所定の緩衝液に分散させて調製した精子含有液も用いることができる。すなわち、本明細書において貯留部に添加する選抜前精子液は、オスの動物個体より得られたままの精液としての意味合いを含むのは勿論のこと、解凍精液、成分調整精液、精子含有液を総称する言葉として解するべきである。
　そして、本実施形態に係る運動性精子の分離方法によれば、高密度精子群の集合エリアを設けることにより、遡上路に進入する精子の数を飛躍的に向上させることができ、人工授精に実用可能な濃度で運動性精子を含有する授精用精子液を回収可能とすることができる。
　高密度精子群の集合エリアは、選抜前精子液の精子濃度よりも高い濃度で精子が集合する領域であり、このような集合エリアを形成可能であれば、その手段や方法、構成等は特に限定されるものではない。このような集合エリアの一例を挙げるならば、例えば、緩衝液流路を基端から二叉状に分岐させることで形成することも可能である。
　また、精子遡上路は、仕切壁で隔てられた複数の遡上小路より構成しても良い。
　すなわち、所定長さに亘って所定幅及び所定高さに形成した精子遡上路の遡上空間内を、長さ方向に沿った前記所定高さの仕切壁によって仕切り、より狭幅で複数遡上小路を形成しても良い。
　仕切壁の数は特に限定されるものではなく、例えば１以上、より好ましくは１～５の範囲内、更に好ましくは３～５の範囲内で設けることができ、遡上小路の数は２以上、より好ましくは２～６、更に好ましくは４～６とすることができる。また、精子遡上路の幅方向に対する仕切壁の位置は特に制限されず、送液する流量や流速などの性質に応じて変更することができるが、精子遡上路の幅方向に一定の間隔を置いて、複数の仕切壁を並列に並べることが望ましい。
　また、仕切壁を設けることにより形成された遡上小路は、遡上流が層流として流れる流路断面を有していれば特に限定されるものではなく、発明の理解の供すべく敢えて一例を挙げるならば、その流路幅は50～1000μｍ、流路高さは50～1000μｍ程度とすることができる。
　また、仕切壁自体の幅についても特に限定されるものではないが、敢えて一例を挙げるならば、精子自体の大きさや流体力学的特性値を勘案すると、その幅は50～500μｍ程度である。仕切壁の高さは50～500μｍ程度とすることができ、望ましくは精子遡上路の高さと略同じ高さとして、隣り合う遡上小路間で精子や遡上流の行き交いを阻止できる程度に仕切る高さとするのが望ましい。
　このような構成とすることにより、仕切壁を設けた場合と設けない場合とで同じ遡上流の流量であっても、より多くの精子を回収することができる。この現象は、本発明者らの鋭意研究により見いだされたものであり、その機序は未だ予想の範囲内ではあるものの、遡上流の有無に拘わらず壁付近に集合するという精子の習性と、精子遡上路内を流れる遡上流の放物線型流速分布が仕切壁によって更に細分化されたこととが相乗的に作用して惹起されるものと考えられる。
　また、仕切壁の長さは、精子遡上路の長さよりも僅かに短いのが望ましい。仕切壁は、例えば、精子遡上路の始端より2～20μｍほど内側の位置から、終端より5～20μｍほど内側の位置まで形成し、精子遡上路の始端及び終端近傍に仕切壁のない広幅部を形成すると良い。
　このような広幅部を形成することにより、精子遡上路の端部における乱流の発生が防止され、精子の円滑な遡上を促すことができる。
　また、緩衝液流路の二叉分岐流路の先端部はそれぞれ漸次狭窄状に形成しても良い。このような構成とすることにより、集合エリアへの集合効率をさらに向上させることができる。
　また、緩衝液流路から吐出させる緩衝液の直進流により二叉分岐流路から中央に向かって逆流を生じさせるようにしても良い。このような構成によれば、逆流により選抜前精子液中の精子を集合エリアに効率的に集合させることができ、集合エリアにおける精子濃度をさらに向上させることができる。
　特に、このような作用を生じせしめるより具体的な構成として、例えば、緩衝液流路の基端に精子誘導構造部を形成することにより、二叉分岐流路から中央に向かって逆流を生起するようにしても良い。
　また精子誘導構造部は、狭隘遡上路に比して幅広に形成しながらも、レイノルズ数の低い（例えば、１５００以下）流れを生起可能な形状としているため、精子が乱流に巻き込まれてしまうことがなく、効率的に狭隘遡上路へ精子を誘導することができる。
　さらに精子誘導構造部は、略三日月形状(roughly crescent)として二叉分岐流路から中央に向かって逆流を生起するようにしても良い。
　このような略三日月形状の精子誘導部構造を備えることにより、精子を効率良く集合させつつ、遡上路に精子を大量に誘導することができる。
　また、この精子誘導部構造には、緩衝液流路からの直進流と、二叉分岐流路からの逆流との交わるエリアに、各流の流速が停滞する流速減殺エリアを形成しても良い。
　付言すれば、この流速減殺エリアは、直進流と逆流との合流によって流れが滞留し流動が緩慢となる領域であり、精子誘導部構造外と連結するような領域である。
　そして、このような流速減殺エリアを設けることにより、集合エリアからの精子の流失（散逸）を抑制して集合エリアにおける精子濃度の高濃度化を助長することができる。すなわち、流速減殺エリアと集合エリアとは、少なくとも一部が重畳して設けられることとなる。
　なお、前述の非特許文献１に記載されているMobile Sperm sorting Microfluidic System (MSMS)は、後に詳述する本実施形態に係る運動性精子の分離装置におけるマイクロ流路１２の構造と一見類似の装置構成を有しているが、このMSMSは精子誘導構造部の如き高密度精子群の集合エリアを備えていない点で大きく異なっている。
　しかも、本実施形態に係る運動性精子の分離方法や装置では、この集合エリアと、緩衝液流路より流入する緩衝液流によって精子にレオタキシスを惹起させるレオタキシス惹起領域とを近接または重畳して設けることにより、精子の高濃度化や精子の遡上路への誘導を極めて効率良く行うことができる。
　付言すれば、本発明は、低運動性精子及び／又は非運動性精子からの運動性精子の分離方法において、運動性精子と低運動性精子或いは非運動性精子の少なくとも１つとを含有する選別前精子液中に層状空間部を配置して、同層状空間部内に緩衝液流を流入させて前記運動性精子にレオタキシスを惹起させる層流のレオタキシス惹起流を形成すると共に、このレオタキシス惹起流の流動に伴って、同レオタキシス惹起流と合流する方向に流動する層流の集合流を前記層状空間部内で生起させ、前記レオタキシス惹起流と前記集合流との合流部近傍を前記層状空間部外から集合流に乗って精子が集合させられる集合エリアとし、前記レオタキシス惹起流で前記運動性精子に対してレオタキシスを惹起できるレオタキシス惹起可能領域を前記集合エリアに近接又は重畳して設け、集合させた精子に対して前記レオタキシス惹起流によりレオタキシスを惹起させて前記緩衝液流に誘導し、誘導した精子を緩衝液流中で所定距離だけ遡上させて、遡上できた精子を運動性精子として分離する運動性精子の分離方法を提供するものであるとも言える。
　また更に付言するならば、本発明は、動物より採取された精子を含有する選抜前精子液から運動性精子を分離する方法であって、選抜前精子液を貯留する貯留部と、貯留部に連通し貯留部方向へ緩衝液が層流として流れる緩衝液流路と、貯留部から緩衝液流路中を精子が遡上するように貯留部に連通した遡上路と、よりなる精子の選抜部構造を形成すると共に、前記遡上路の下流部には、前記緩衝液の層流状態を維持しつつ緩流とし、かつ２つ以上の向きの異なる層流を誘起させる広幅の層状経路を形成し、前期貯留部から運動性精子を遡上させて前記選抜部に流入させることを特徴とする運動性精子の分離方法を提供するものであるとも言える。
　以下、本実施形態に係る運動性精子の分離方法、及び、運動性精子の分離装置について、図面を参照しつつ分離装置の構成に言及しながら説明する。なお以下の説明では、授精用精子液の一具体例として人工授精用（子宮腔内精子注入法用）の精子液について言及するが、これに限定されるものではなく、試験管内授精や顕微授精用の精子液としても使用可能であることは勿論である。
　図１は、本実施形態に係る運動性精子の分離装置（以下、分離装置Ｄという。）の構成を示した説明図である。図１に示すように、分離装置Ｄは、底部形成板１とチップ体２とを重畳して形成した本体部３上に、３つの筒体４を載置して構成している。また、各筒体４の内部を、それぞれ緩衝液収容部５、選抜前精子液貯留部６、回収部７としている。
　そして、緩衝液収容部５に緩衝液を所定量注入し、選抜前精子液貯留部６に選抜前精子液を所定量注入し、回収部７にも緩衝液を所定量注入しておくことで、マイクロ流体の働きによって、選抜前精子液貯留部６に収容した選抜前精子液中に含まれる精子の中から運動性精子を選抜し、回収部７にて緩衝液と共に回収可能としている。すなわち、運動性精子群を含有する授精用精子液を調製可能としている。
　本体部３を構成する底部形成板１は、図２の分解斜視図、及び図３の断面図に示すように、チップ体２を載置するための基板であり、緩衝液収容部５や選抜前精子液貯留部６、回収部７の底部を形成したり、チップ体２の裏面に形成した後述の流路パターン１２ａの底部を形成する部材としての役割を果たすものである。なお、底部形成板１は、例えばガラスや樹脂（アクリルやPDMS）により形成することができる。
　本体部３を構成するチップ体２は、樹脂にて形成された板状の部材であり、本実施形態ではポリジメチルシロキサン（PDMS）にて形成している。
　また、チップ体２には、３つの孔を穿設している。これら３つの孔は、それぞれ前述の緩衝液収容部５の一部を構成する緩衝液用孔部８と、選抜前精子液貯留部６の一部を構成する貯留部用孔部９と、回収部７の一部を構成する回収部用孔部１０である。
　また、チップ体２の裏面には、微細加工によって流路パターン１２ａが形成されている。この流路パターン１２ａは、底部形成板１とチップ体２とを重ね合わせることでマイクロ流路１２を形成するためのものである。流路パターン１２ａは、緩衝液用孔部８や、貯留部用孔部９、回収部用孔部１０を連通させる複数の溝部１１や、前述の精子誘導構造部を形成するための精子誘導構造部形成用凹部１３を刻設することで形成している。
　各筒体４は、緩衝液用孔部８や、貯留部用孔部９、回収部用孔部１０の周縁に配置して、緩衝液収容部５や選抜前精子液貯留部６、回収部７における収容可能量を大きくするための壁体として機能するものである。各筒体４は、それぞれの孔部の直径よりも大きな外径を有しており、各孔部の周縁に水密状に配置固定される。
　次に、底部形成板１とチップ体２を重ね合わせることで形成されるマイクロ流路１２の構成について、図４を参照しながら説明する。
　図４（ａ）に示すように、分離装置Ｄが備えるマイクロ流路１２は、選抜前精子液貯留部６の壁面の一部を構成する貯留部用孔部９と回収部用孔部１０とを結ぶ貯留部－回収部連通流路２０と、緩衝液用孔部８から貯留部－回収部連通流路２０の中途部に連結させた２本の緩衝液供給路２１とで構成している。また、貯留部－回収部連通流路２０と、緩衝液供給路２１とが交わる部分を合流部２２としている。
　貯留部－回収部連通流路２０は、合流部２２から選抜前精子液貯留部６側に向けて形成した遡上路２３と、合流部２２から回収部７側に向けて形成した回収路２４とで構成している。
　また、緩衝液供給路２１は、緩衝液収容部５内に収容した緩衝液を合流部２２に送給するための流路である。すなわち、緩衝液収容部５及び緩衝液供給路２１は、緩衝液供給手段として機能する。
　緩衝液供給路２１により合流部２２に供給された緩衝液は、一部が遡上路２３へ流れ、残部が回収路２４に流れるように構成している。なお、以下の説明において、遡上路２３に流れ込み流下する緩衝液流を遡上流ともいい、回収路２４に流れ込み流下する緩衝液流を回収流という。
　遡上路２３は、選抜前精子液貯留部６内に貯留されている選抜前精子液から精子を誘導し、運動性精子を選抜するための流路であり、狭隘遡上路２５と精子誘導構造部２６とで構成している。
　狭隘遡上路２５は、合流部２２にて分流した緩衝液により生ずる遡上流中で精子を流れに逆行させながら合流部６２方向へ遡上させることにより、運動性精子を合流部２２へ向けて遡上させつつ、奇形の精子や人工授精を行うに際し好ましくない程度に運動性に劣る精子など、所謂低運動性精子及び／又は非運動性精子を遡上流に乗せて脱落させ合流部２２に至らないようにするための流路である。
　また、精子誘導構造部２６は、選抜前精子液貯留部６内の精子を効率良く狭隘遡上路２５へ導くための誘引手段として機能する部位であり、図４において網掛けで示す部位である。なお、精子誘導構造部２６の下流側端部（遡上路２３の下流側端部）に示す破線は、選抜前精子液貯留部６の側壁部に開口させたスリット状開口部２７である。
　このように、マイクロ流路１２では、狭隘遡上路２５、精子誘導構造部２６、スリット状開口部２７により、精子の選抜部構造を構成している。
　回収路２４は、狭隘遡上路２５を遡上流に逆らって遡上し合流部２２に至った精子を回収するための流路であり、合流部２２に至った精子を回収流に乗せて回収部７へ流し込むための部位である。
　そして、このような構成を有するマイクロ流路１２によれば、選抜前精子液貯留部６に選抜前精子液を添加する精子添加工程を行い、同選抜前精子液貯留部６に収容された選抜前精子液から、スリット状開口部２７、精子誘導構造部２６、狭隘遡上路２５により良好な運動性を有する精子が多数の母集団から効率良く選抜され、回収流と共に回収部７に回収されることとなる。
　特に、本実施形態に係る分離装置Ｄのマイクロ流路１２では、遡上流が、運動性を有するが回収を望まない精子が遡上できる限界の流速を上回り、良好な運動性を有する精子が遡上できる限界の流速以下で、且つ、遡上路２３（狭隘遡上路２５及び精子誘導構造部２６）にて緩衝液流が層流となる流速となるように、緩衝液供給路２１が形成されている。
　また、本実施形態に係る分離装置Ｄのマイクロ流路１２では、回収流が、合流部２２に至った（遡上できた）精子の運動能力を上回る流速となるように緩衝液供給路２１が形成されている。
　すなわち、緩衝液供給路２１は、２つの緩衝液供給路２１によって、合流部２２に対し、上記条件を満たす遡上流と回収流を生成できる流量を供給可能な流路断面積を有するように形成している。
　そして、本実施形態に係る運動性精子の分離装置Ｄに特徴的な点としては、図４（ｂ）に示す従来のマイクロ流路５０の構造と比較して分かるように、選抜前精子貯留槽としての選抜前精子液貯留部６に、狭隘な緩衝液流路や精子遡上路として機能する遡上路を連通し、運動性の高い精子をレオタキシス現象により精子の遡上路として機能する狭隘遡上路２５を介して選抜する運動性精子の分離装置において、精子遡上路（狭隘遡上路２５）の連通基端近傍に、レオタキシス現象が生起する前の精子群を高密度に集合させて準備環境を整える集合エリアを形成した点を挙げることができる。
　図５は、精子誘導構造部２６近傍の構成を示した説明図である。図５に示すように精子誘導構造部２６は平面視略三日月形状を有する部位であり、狭隘遡上路２５との接続領域近傍である中央部３０Ｃと、図中左下方へ向かって幅が漸次狭窄して尖鋭状に伸延する左又部３０Ｌと、図中右下方へ向かって幅が漸次狭窄して尖鋭状に伸延する右又部３０Ｒとで二叉状に構成している。付言すれば、精子誘導構造部２６は、左又部３０Ｌ及び右又部３０Ｒから中央部３０Ｃ、狭隘遡上路２５へと漸次狭窄状に形成している。
　また図５に示すように、狭隘遡上路２５を流下する遡上流は、層状の空間形状を有する精子誘導構造部２６に至ると、同精子誘導構造部２６に存在する精子にレオタキシスを惹起する層流状の流れとなる。ここでは、この層流状の流れをレオタキシス惹起流３１と称し、同レオタキシス惹起流３１によって精子に対し狭隘遡上路２５へ向かう方向へのレオタキシスを惹起可能な領域（図５中、狭隘遡上路２５と精子誘導構造部２６の境界近傍にて破線で示す扇状領域）をレオタキシス惹起領域３６と称する。
　狭隘遡上路２５より遡上流としての緩衝液流が流入してレオタキシス惹起流３１が生じると、同レオタキシス惹起流３１の流動に伴って相対負圧による引込みが生じ、左又部３０Ｌ及び右又部３０Ｒには、レオタキシス惹起流３１に対して逆行しつつ交わるように、中央部３０Ｃに向かって集合流３２が生じる。
　左又部３０Ｌ及び右又部３０Ｒにて生じた集合流３２は、左又部３０Ｌ及び右又部３０Ｒの尖鋭先端部分近傍にて、精子誘導構造部２６の層状空間部外となる選抜前精子液貯留部６から精子を引き込む吸引流３３を生じさせ、集合流３２に精子を次々と供給する。集合流３２に乗った精子は、徐々に中央部３０Ｃへ集められることとなる。
　中央部３０Ｃでは、レオタキシス惹起流３１と左又部３０Ｌ及び右又部３０Ｒにて生起した集合流３２との合流により互いの流れが減殺される流速減殺エリア３４が形成される。この流速減殺エリア３４では、流れが停滞するか又は極僅かとなっている。
　従って、集合流３２によって中央部３０Ｃの流速減殺エリア３４内やその近傍に集められた精子は滞留し徐々に蓄積されることとなるため、図５中の中央部３０Ｃにて網掛けで示すように、精子が高濃度（高密度）で存在する集合エリア３５が形成される。
　このように形成された集合エリア３５は、レオタキシス現象を生起させる前の準備環境と捉えることができ、狭隘遡上路２５に効率良く精子を誘導するためのスタンバイ領域として機能することとなる。
　しかも、分離装置Ｄでは、この集合エリア３５をレオタキシス惹起領域３６と近接又は重畳（図５では一部重畳）して設けている。
　従って、精子の高濃度集合領域に存在する運動性精子にレオタキシスを惹起させることができ、極めて効率良く運動性精子を狭隘遡上路２５へ誘導することができる。
〔変形例に係る運動性精子の分離装置〕
　次に、変形例に係る運動性精子の分離装置について説明する。なお、以下の説明において、前述の分離装置Ｄと同様の構成については同じ符号を付して説明を省略する。
　図６は、変形例に係る運動性精子の分離装置（以下、分離装置Ｅという。）の構成を示した説明図である。この分離装置Ｅは、前述の分離装置Ｄと同じ本体部３を備える点で一致しているが、緩衝液収容部５や選抜前精子液貯留部６、回収部７を形成するために、本体部３上にシリコン等の軟質樹脂にて形成したブロック体４０を載置している点で構成を異にしている。
　具体的には、前述の分離装置Ｄは、３つの孔部が形成されたチップ体２を備える本体部３上に、それぞれの孔部の直径よりも大きな外径を有する筒体４を各孔部の周縁に水密状に配置固定することで、緩衝液収容部５や選抜前精子液貯留部６、回収部７を形成したが、本変形例に係る分離装置Ｅは、図７に示すように、本体部３の３つの孔に対応する位置にブロック体４０を水密状に配置固定し、同ブロック体４０に筒状の緩衝液収容部５や選抜前精子液貯留部６、回収部７を形成している。なお、図７中一点鎖線は、分離装置Ｄや分離装置Ｅに特徴的な構造の一つである精子誘導構造部２６を囲う線であり、同精子誘導構造部２６は実線で示し、その他の部分は破線で示している。また、Ｂ－Ｂ断面及びＣ－Ｃ断面は、精子誘導構造部２６の厚みの半分の位置で切断した状態を示している。
　ブロック体４０に穿設された１つ目の筒状孔は緩衝液収容孔４１であり、緩衝液収容部５の収容空間を形成するための孔である。また、２つ目の筒状孔は選抜前精子液貯留孔４２であり、選抜前精子液貯留部６の収容空間を形成するための孔である。また、３つ目の筒状孔は回収孔４３であり、回収部７の収容空間を形成するための孔である。
　そして、このような構成を備えた分離装置Ｅによれば、運動性精子を効率良く分離したり、運動性精子を多く含有する授精用精子液を調製できるのは勿論のこと、分離装置Ｄに比して装置全体として突出する部分がないため、突出部分に由来する構造的な脆弱性を解消することができる。
〔授精用精子液の調製試験〕
　次に、本実施形態に係る運動性精子の分離方法、及び運動性精子の分離装置を用いた授精用精子液の調製について説明する。本試験はすなわち、授精用精子液の調製試験、より具体的には人工授精用精子液の調製試験でもある。
　本試験では、分離装置Ｄのチップ体２に該当する部分を、図８に示すチップ体として試験し、回収できた精子の数や、運動性を有する精子の割合、直線速度、曲線速度、直進性を求めた。
　図８において示すチップ体は、平面視において前述のマイクロ流路１２と略同じ構成を有するものである。ａで示す緩衝液収容部の内径は10mm、ｂで示す選抜前精子液貯留部の内径は７mm、ｃで示す回収部の内径は８mm、Ａで示す緩衝液供給路の長さは20.58mm、幅300μｍ、深さ100μｍ、Ｂで示す狭隘遡上路の長さは2.5mm、幅200μｍ、深さ100μｍ、Ｃで示す回収路２４の長さは2.5mm、幅200μｍ、深さ100μｍであり、網掛けで示す略三日月状の精子誘導構造部の深さは100μｍで、平面視における面積は12.14mm2である。
　このチップ体を用いて運動性精子の分離装置を構成し、緩衝液と選抜前精子液としての凍結解凍精液を添加して、授精用精子液の調製試験を行った。
　試験で使用した凍結解凍精液は、総精子濃度が69±4.5百万/ml、動いている精子の割合が21±5.8％、直線速度は67±14μｍ/sec、曲線速度は144±11μｍ/sec、直進性は0.44±0.06であった。また、スクリーニング時間は、30分間とした。本試験結果を図９に示す。
　図９からも分かるように、前述のチップ体を用いることにより、非特許文献１に記載されている数10個／分と比較すると、30分あたり9.7±0.98百万／mlという約３万倍以上の濃度で効率良く精子を分離することができた。すなわち、人工授精に適した精子液の調製を行うことができた。
　また、動いている（生きている）精子の割合に着目すると、使用した凍結解凍精液（未処理）では21±5.8％であったのに対し、本実施形態に係る運動性精子の分離方法、及び運動性精子の分離装置を用いて回収された授精用精子液中の精子の生きている割合は、92±6.4％にまで高められているのが分かる。
　また、直進性についても向上しており、従って、奇形の精子も極めて効率良く除去されていることが示された。
　このように、本実施形態に係る運動性精子の分離方法、及び運動性精子の分離装置によれば、従来の緩衝液流路を遡上路として精子を遡上させる精子の分離に比べて、極めて効率良く良好な運動性精子を回収できることが示された。
　付言すれば、本実施形態に係る授精用精子液は、運動性精子を極めて高濃度で含有する、人工授精に適した精子液であることが示された。
〔数値流体力学計算に基づく精子誘導構造部での流速分布の検証〕
　次に、分離装置Ｄが上述の精子誘導構造部２６を備えることにより、どのような仕組みで運動性精子の高効率の回収が実現し得るのかについて検討すべく、数値流体力学計算(Computational Fluid Dynamics:CFD)を行うことにより検証を行った。
　まず、図１０に示す精子誘導構造部の形状データをコンピュータに入力し、図１１に示すようなメッシュモデルの作成を行った。
　次いで、作成したメッシュデータを汎用熱流体解析ソフトウェアであるアンシス・ジャパン株式会社製Fluent6.3に取り込んで、数値流体力学計算を行った。計算条件としては、遡上路から流入させる緩衝液流の流速を20μm/secとし、選抜前精子液貯留部に連通するスリット状開口部は圧力開放とし、それ以外の部分は壁とし、no-slip境界条件とし、20μm立方体メッシュでの解析とした。その結果を図１２～図１４に示す。
　図１２は、左又部３０Ｌ先端から中央部７０Ｃ方向を立体的に見た状態を示したベクトル図である。図１２に示すように、数値流体力学計算の結果から、左又部３０Ｌの尖鋭状先端部分には、他の矢印に比して大きな矢印で示された中央部７０Ｃ方向へ向かう強い流れが生じていることが示された。
　また、このような中央部３０Ｃへ向かう強い流れは右又部３０Ｒでも確認された。すなわち、精子誘導構造部２６では、遡上流の流入によって生じるレオタキシス惹起流３１により、左又部３０Ｌ及び右又部３０Ｒにおいて、レオタキシス惹起流３１とは逆向きの交わる方向（合流する方向）で中央部３０Ｃへ向かう層流の集合流３２がそれぞれ生じていることが示された。
　図１３は、狭隘遡上路２５側から右又部７０Ｒ方向を立体的に見た状態を示したベクトル図である。狭隘遡上路２５を流れる層流の遡上流は、精子誘導構造部２６との接続部近傍において流速が加速し、精子誘導構造部２６内に進入すると緩流となってレオタキシス惹起流３１を形成することが示された。さらに、レオタキシス惹起流３１もまた、層流であることが示された。
　図１４は、平面視における狭隘遡上路２５及び精子誘導構造部２６での流速分布を等高線状に示した説明図である。なお、図１４中の四角枠で囲んだ画像は、破線で示す狭隘遡上路２５部分のコントラストを替えた画像である。
　図１４及び前述の図１２にも示されるように、中央部３０Ｃには、レオタキシス惹起流３１と２つの集合流３２との合流によって形成された、流速が極めて緩慢な流速減殺エリア３４が形成されていることが示された。
　また、前述したように、四角枠で示した画像より、狭隘遡上路２５では、精子誘導構造部２６との接続部近傍において流速が高まることが分かる。
　これらの結果から、本実施形態に係る運動性精子の分離方法や運動性精子の分離装置では、以下のような作用により高効率の運動性精子の回収が実現していることが示された。
　すなわち、図１５にも示すように、まず精子誘導構造部２６に遡上流が流入する直前に流速の上昇が起こり、広範囲に亘ってレオタキシス惹起流３１が及ぶことととなり、広範囲にレオタキシス惹起領域３６が形成されて、広範囲の運動性精子に対して狭隘遡上路２５へのレオタキシスを惹起する。
　また、レオタキシス惹起流３１が生じると、左又部３０Ｌ及び右又部３０Ｒにて集合流３２が生じ、中央部３０Ｃに精子が集合させられることとなる。
　集合流３２の発生により、左又部３０Ｌ及び右又部３０Ｒの先端部近傍にて吸引流３３が生じ、選抜前精子液貯留部６から集合流３２に精子を次々と供給する。
　中央部３０Ｃでは、レオタキシス惹起流３１と集合流３２との合流によって流速減殺エリア３４が形成されており、これに伴い集合流３２によって運ばれた精子は大量に滞留することとなり、集合エリア３５が形成される。
　この集合エリア３５に近接又は重畳してレオタキシス惹起領域３６が存在することで、大量の精子に対してレオタキシスが惹起され、次々と狭隘遡上路２５へ泳いでゆくこととなる。
　狭隘遡上路２５の入り口近傍では流速が高まっているため、この高流速部位が篩の役割を果たし、運動性精子が選別される。しかも、この「篩」に挑む精子の数が膨大であるため、十分な精子濃度が確保できる。
　高流速部位を越えた精子は、比較的容易に狭隘遡上路２５を遡上し、合流部２２を経て回収される。
　本実施形態に係る運動性精子の分離方法や運動性精子の分離装置では、上述のような作用が相俟って、運動性精子の回収効率を飛躍的に高めていることが示された。
〔精子誘導構造部の形状変化に伴う回収効率の検討〕
　前述の分離装置Ｄにおける精子誘導構造部２６は平面視略三日月状に形成したものであったが、次に、精子誘導構造部に相当する広幅状の流路部位（以下、変形流路部という。）の形状を違えた場合の回収効率について試験結果を交えつつ説明する。
　ここでは、前述の分離装置Ｄのチップ体２に該当する部分を、図１６の（ａ）～（ｃ）に示す変形流路部を備えた種々のチップ体に差し替えて試験し、回収できた精子の数を求めた。なお、図１６中において変形流路部は網掛けで示している。また、図示した各変形流路部は、試験に供した構造の理解を容易とするために示すものであり、大きさの比率などは必ずしも正確ではなく、例えば、貯留部に対する変形流路部や狭隘遡上路の厚みや幅などは誇張して示しているが、実際の試験では前述の精子誘導構造部２６に準じた寸法としている。
　図１６（ａ）に示す変形流路部Ｐは、平面視円形に形成した選抜前精子液貯留部６の外方全周に亘り層状空間部を形成したものであり、狭隘遡上路２５より二叉状に分岐しているものの、右又部や左又部に相当する部分が選抜前精子液貯留部６の内壁に尖鋭状に収束する形状となっていない点で特徴的である。また、この（ａ）に示す構造は、選抜前精子液貯留部６に開口するスリット状開口部の開口面積が大きいため、精子の変形流路部への流入効率が向上する、すなわち、精子誘導構造部として機能するかもしれないとの予想がなされた。
　図１６（ｂ）に示す変形流路部Ｑは、選抜前精子液貯留部６の半周に亘り層状空間部を形成したものであり、狭隘遡上路２５より二叉状に分岐すると共に、右又部や左又部に相当する部分が選抜前精子液貯留部の内壁に尖鋭状に収束する形状となっている点で前述の精子誘導構造部２６と同様である。ただし、変形流路部Ｑの外壁部分は、左右又部に相当する部分から狭隘遡上路２５へ向かって漸次狭窄する形状とはなっていない点で前述の精子誘導構造部２６と構造を異にしている。
　図１６（ｃ）に示す変形流路部Ｒは、選抜前精子液貯留部６の略１／８周に亘り層状空間部を形成したものであり、狭隘遡上路２５より二叉状に分岐すると共に、右又部や左又部に相当する部分が選抜前精子液貯留部の内壁に尖鋭状に収束する形状としており、更に、変形流路部の外壁部分が左右又部に相当する部分から狭隘遡上路２５へ向かって漸次狭窄する形状としている。ただし、変形流路部Ｒの外壁部分は、前述の精子誘導構造部２６の如く同精子誘導構造部の外方へ膨出湾曲した滑らかな曲線状ではなく、直線状である点で構造を異にしている。
　このように、選抜前精子液貯留部６に精子集合部を付加形成するという基本的な構造としては、変形流路部Ｐや、変形流路部Ｑ、変形流路部Ｒなどが考えられる。そこで、これらの変形流路部についてどの程度の精子回収効率が期待できるかについて試験し検討を行った。その結果、まず変形流路部Ｐについては、選抜前精子液貯留部６の外周を環状に形成したものの、この環状部分において選抜前精子液貯留部６の精子濃度以上の顕著な集合は観察されなかった。
　また変形流路部Ｑは、選抜前精子液貯留部６と狭隘遡上路２５との間に選抜前精子液貯留部６の円弧に合わせた一辺方形状の変形流路部を介設したが、方形部分の角部に偏って選別前精子が滞留して狭隘遡上路２５へ運動性精子が遡上できないという欠点があった。
　また変形流路部Ｒは、選抜前精子液貯留部６と狭隘遡上路２５との間に略三角形状の変形流路部を介設したが、略三角形状の拡幅が小さいため、中央部３０Ｃに精子を集合させるための集合流が生起しにくく、運動性精子の遡上効率が低下した。
　これらの結果から、変形流路部Ｐや変形流路部Ｑ、変形流路部Ｒは、高密度精子群の集合エリアを形成することはできず、レオタキシス現象が生起する前の準備環境となり得ないことが示された。
　一方、本実施形態に係る分離装置Ｄや分離装置Ｅでは、選抜前精子液貯留部６と狭隘遡上路２５との間に略三日月状の精子誘導構造部２６を介設したために、変形流路部Ｐや変形流路部Ｑ、変形流路部Ｒの精子集合体の形状と比較し、略三日月形状の両端の漸次狭窄部分から逆流を生起して狭隘遡上路に一気呵成に流入していくこととなる。
〔狭隘遡上路の仕切壁数（遡上小路数）の変化に伴う回収効率の検証〕
　次に、図１７及び図１８を参照しつつ、これまで説明してきたような一つの空間により形成される狭隘遡上路と、狭隘遡上路に仕切壁を設けてより多くの空間に分割して形成した場合とについて、精子の回収試験結果を踏まえつつ説明する。
　図１７は、本実施形態に係る運動性精子の分離装置における狭隘遡上路部分を拡大して示した模式図であり、左側に平面図を示し、右側に各狭隘遡上路の断面を示す。
　図１７（ａ）は、上述してきたマイクロ流路１２と同様、仕切壁６０を設けず遡上空間Ｓを分割していない狭隘遡上路２５ａを示している。本検証にて使用する狭隘遡上路２５ａの寸法は、精子誘導構造部２６との接続部分から合流部２２との接続部分までの長さＬが１mm、幅Ｗが300μｍ、高さＨが100μｍである。
　図１７（ｂ）は、遡上空間Ｓ内の略中央部に仕切壁６０を１つ設け、２つの遡上小路６１が形成された狭隘遡上路２５ｂを示している。狭隘遡上路２５ｂの各寸法は、狭隘遡上路２５ｂの全体幅Ｗ１が350μｍ、各遡上小路６１の幅Ｗ２が150μｍ、仕切壁６０の幅Ｗ３が50μｍであり、その他は狭隘遡上路２５ａと同じく長さＬが１mm、高さＨが100μｍである。また、仕切壁６０の長さは、長さＬよりも長さＫ１及びＫ２分だけ短く形成し、幅Ｗ１方向に亘って仕切壁のない広幅部６２（図中網掛けにて示す。）を形成している。狭隘遡上路２５ｂにおいて長さＫ１及び長さＫ２は、それぞれ10μｍとしている。
　図１７（ｃ）は、遡上空間Ｓ内に仕切壁６０を３つ設け、４つの遡上小路６１が形成された狭隘遡上路２５ｃを示している。狭隘遡上路２５ｃの各寸法は、狭隘遡上路２５ｃの全体幅Ｗ４が490μｍ、各遡上小路６１の幅Ｗ５が100μｍ、仕切壁の幅Ｗ６が30μｍであり、狭隘遡上路２５ａや狭隘遡上路２５ｂと同じく長さＬが１mm、高さＨが100μｍである。また、狭隘遡上路２５ｂと同様に、仕切壁６０の長さは、長さＬよりも長さＫ１及びＫ２分だけ短く形成し、幅Ｗ１方向に亘って仕切壁のない広幅部６２（図中網掛けにて示す。）を形成している。狭隘遡上路２５ｃにおいて長さＫ１及び長さＫ２は、それぞれ10μｍとしている。
　本検証においては、これら狭隘遡上路２５ａ、狭隘遡上路２５ｂ、狭隘遡上路２５ｃを用いて、回収される精子がどのように変化するかについて検討を行った。なお、本検証では、黒毛和種の凍結精子液を用い、いずれの狭隘遡上路においても同じ遡上流の流量で３０分間捕集を行った。その結果を図１８に示す。
　図１８からも分かるように、仕切壁６０を形成していない狭隘遡上路２５ａを備えた分離装置にて回収された精子液の精子濃度は1.548×106個/mLであったのに対し、仕切壁６０を１つ設けて２つの遡上小路６１にて構成した狭隘遡上路２５ｂを備える分離装置にて回収された精子液の精子濃度は2.825×106個/mLであり、およそ1.5～2倍程度の精子濃度にてより多くの精子が回収された。
　更には、仕切壁６０を３つ設けて４つの遡上小路６１にて構成した狭隘遡上路２５ｃを備える分離装置によれば、回収された精子液の精子濃度が7.629×106個/mLと狭隘遡上路２５ａの約５倍の精子濃度にて回収された。
　また、いずれの狭隘遡上路を備えた分離装置においても、精子運動率は100％であり、極めて優れた精子スクリーニング結果であると言える。
　当初、実験前の段階において本発明者らは、狭隘遡上路２５に仕切壁６０を設けて遡上小路６１を複数形成した場合であっても、単位時間あたりに遡上する（回収できる）運動性精子の数は、仕切壁６０を設けない場合に比して変わらないと予想していた。しかしながら、実際のところは上述のように、実に驚くべき高効率な精子の回収が実現された。
　これは、精子は壁や壁付近に集まりやすいという習性があることや、仕切壁６０によって放物線型流速分布が分割されたということが相乗的に作用して、運動性精子の遡上効率が高まったものと考えられる。
　なお、回収される精子濃度が高くなるにつれ、直線速度や曲線速度、直進性、頭部振幅、頭部振動数の値は僅かずつながら低下する傾向が見られたが、これらは回収する精子数が大幅に増えたことに伴う当然の結果であり、これらの値の低下による受胎効率の低下よりも、精子回収量の増加に伴う受胎効率の向上の方がはるかに上回るため、実際の授精作業等においては何ら問題はない。
　付言するならば、精液中の死んだ精子を堅実に除外しつつも、正常な精子をより広い裾野に亘って数多く回収できる点に、上記狭隘遡上路２５ｂや狭隘遡上路２５ｃにおいて代表的に示される特徴的な構成の技術的意義があると言える。
　上述してきたように、本実施形態に係る運動性精子の分離方法によれば、選抜前精子貯留槽に狭隘な緩衝液流路と精子遡上路とを連通することにより、運動性の高い精子をレオタキシス現象により精子遡上路を介して選抜する運動性精子の分離方法において、精子遡上路の連通基端近傍に高密度精子群の集合エリアを形成してレオタキシス現象が生起する前の準備環境を整えるようにしたため、運動性精子を効率良く分離することのできる運動性精子の分離方法を提供することができる。
　最後に、上述した各実施の形態の説明は本発明の一例であり、本発明は上述の実施の形態に限定されることはない。このため、上述した各実施の形態以外であっても、本発明に係る技術的思想を逸脱しない範囲であれば、設計等に応じて種々の変更が可能であることは勿論である。
　５　緩衝液収容部
　６　選抜前精子液貯留部
　７　回収部
　１２　マイクロ流路
　２１　緩衝液供給路
　２３　遡上路
　２５　狭隘遡上路
　２６　精子誘導構造部
　２７　スリット状開口部
　３０Ｃ　中央部
　３０Ｌ　左又部
　３０Ｒ　右又部
　３１　レオタキシス惹起流
　３２　集合流
　３３　吸引流
　３４　流速減殺エリア
　３５　集合エリア
　３６　レオタキシス惹起領域
　Ｄ　分離装置
　Ｐ　変形流路部
　Ｑ　変形流路部
　Ｒ　変形流路部

Claims (10)

  1. 　選抜前精子貯留槽に狭隘な緩衝液流路と精子遡上路とを連通することにより、運動性の高い精子をレオタキシス現象により精子遡上路を介して選抜する運動性精子の分離方法において、
    　精子遡上路の連通基端近傍に高密度精子群の集合エリアを形成してレオタキシス現象が生起する前の準備環境を整えるようにしたことを特徴とする運動性精子の分離方法。
  2. 　高密度精子群の集合エリアを形成するために、緩衝液流路を基端から二叉状に分岐させたことを特徴とする請求項１に記載の運動性精子の分離方法。
  3. 　緩衝液流路の二叉分岐流路の先端部はそれぞれ漸次狭窄状に形成したことを特徴とする請求項２に記載の運動性精子の分離方法。
  4. 　緩衝液流路からの直進流により二叉分岐流路から中央に向かって逆流を生起することを特徴とする請求項３に記載の運動性精子の分離方法。
  5. 　緩衝液流路の基端に略三日月形状の精子誘導構造部を形成することにより、二叉分岐流路から中央に向かって逆流を生起することを特徴とする請求項４に記載の運動性精子の分離方法。
  6. 　緩衝液流路からの直進流と、二叉分岐流路からの逆流との交わるエリアに、各流の流速が停滞する流速減殺エリアを形成したことを特徴とする請求項５に記載の運動性精子の分離方法。
  7. 　前記精子遡上路は、仕切壁で隔てられた複数の遡上小路より構成したことを特徴とする請求項１～６いずれか１項に記載の運動製精子の分離方法。
  8. 　選抜前精子貯留槽に狭隘な緩衝液流路と精子遡上路とを連通し、運動性の高い精子をレオタキシス現象により精子遡上路を介して選抜する運動性精子の分離装置において、
    　精子遡上路の連通基端近傍に、レオタキシス現象が生起する前の精子群を高密度に集合させて準備環境を整える集合エリアを形成したことを特徴とする運動性精子の分離装置。
  9. 　請求項１～７いずれか１項に記載の運動性精子の分離方法によって選抜された運動性精子群を含有する授精用精子液。
  10. 　請求項８に記載の運動性精子の分離装置を用いて選抜された運動性精子群を含有する授精用精子液。
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