WO2021079826A1 - 血液用デバイス - Google Patents

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WO2021079826A1
WO2021079826A1 PCT/JP2020/038986 JP2020038986W WO2021079826A1 WO 2021079826 A1 WO2021079826 A1 WO 2021079826A1 JP 2020038986 W JP2020038986 W JP 2020038986W WO 2021079826 A1 WO2021079826 A1 WO 2021079826A1
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blood
flow path
column
porous material
particles
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知大 久保
洋昭 山中
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株式会社 ＴＬ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
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    • C12M47/04—Cell isolation or sorting

Definitions

  • the present invention relates to a blood device, particularly a blood cell separation device. It also relates to how to use these devices.
  • Patent Document 1 describes the classification of blood cells by microchannels.
  • An object of the present invention is to provide a device suitable for clearing clogging and a method of using the device.
  • a blood device including a column and a microchannel located downstream of the column.
  • the column comprises a porous material as a stationary phase. Blood in contact with the porous material flows through the microchannels. Blood device.
  • the porous material is composed of particles.
  • the column is further provided with an accommodating portion capable of accommodating the porous material, and further provided with a filter for trapping particles of the porous material on the side close to the microchannel downstream of the accommodating portion. Small particles having a particle size equal to or less than the cutoff diameter have been removed from the particles of the porous material in advance. The opening of the filter is smaller than the cutoff diameter.
  • ⁇ 3> The blood device according to ⁇ 2>, wherein the cutoff diameter is in the range of 25 to 100 ⁇ m.
  • ⁇ 4> The blood device according to any one of ⁇ 2> and ⁇ 3>, wherein the mesh diameter of the filter is in the range of 20 to 40 ⁇ m, and the range is less than the cutoff diameter.
  • the particles have a particle size distribution, and the central particle size d50V in the volume-based integrated distribution is 25 to 280 ⁇ m. However, the particle size distribution is the particle size before the small particles are removed by cutoff.
  • the blood device according to any one of ⁇ 2> to ⁇ 4>, which represents a distribution.
  • a filter for trapping particles of the porous material is further provided on the side far from the fine flow path upstream of the accommodating portion.
  • the microchannel hydrodynamically classifies blood cells in the blood.
  • the blood device according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>.
  • the fine flow path is made of a flat chip having a pillar dense zone and a hydraulic flow path located downstream of the pillar dense zone.
  • the column connects to the front or back of the planar chip and Further comprising an outlet for discharging the hydraulically classified blood cells from the microchannel to the outside of the blood device.
  • the blood device according to ⁇ 7>.
  • the porous material is composed of particles.
  • the particles of the porous material have a porous surface made of a polysaccharide, silica or resin.
  • the blood device according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>.
  • the blood device is provided with the column and the microchannel as separate bodies, the column having a connecting portion, the microchannel having an inlet, and the connecting portion.
  • the present invention makes it possible to provide a device suitable for clearing clogging in a fine flow path and a method of using the device.
  • FIG. 1 Schematic diagram of the blood separation device.
  • FIG. 2 The partial plan view of the microchannel shown by area VII of FIG. Observation image 2 (upper row) of the fine flow path according to Comparative Example 1 and a sketch thereof (lower row).
  • Observation image 3 (upper row) of the fine flow path according to Comparative Example 2 and a sketch thereof (lower row). Sectional drawing of the fine flow path of a reference example.
  • One aspect of the present invention is a blood separation device including a column and a microchannel located downstream of the column.
  • Blood contains cells and plasma.
  • Cells include blood cells and other cells that circulate in the blood.
  • the cells in the blood are a mixture of cells of various sizes. Each cell type exhibits a unique particle size distribution with respect to cell size.
  • the blood separation device is a device for classifying cells in blood according to their size. By classifying blood using a blood separation device, a population of cells enriched with a particular cell tumor can be obtained.
  • An example of classification is hydraulic classification performed in a fine channel.
  • Examples of blood types to be classified using a blood separation device and cell types that can be concentrated are as follows.
  • the target blood contains blood cells as a cell type to be concentrated.
  • Blood cells may be fetal-derived nucleated red blood cells.
  • the blood obtained contains fetal-derived nucleated red blood cells.
  • Fetal-derived nucleated red blood cells are contained in pregnant women's blood. The subjects of diagnosis are fetal and pregnant women. The column is used to pretreat the pregnant woman's blood. Fetal-derived nucleated red blood cells are concentrated by classification using microchannels. Obtain data useful for diagnosis of the foetation from concentrated fetal-derived nucleated red blood cells.
  • the target blood includes other cells that circulate in the blood and are not blood cells as cell types to be concentrated. It may be a circulating tumor cell (CTC).
  • CTC circulating tumor cell
  • the blood obtained contains CTC.
  • CTCs can be found, for example, in the blood of subjects suspected of having cancer, cancer patients, and subjects who have already been treated for cancer. These persons are the subjects of diagnosis.
  • the blood is pretreated using a column.
  • CTC is concentrated by classification using a fine flow path. Perform the steps necessary to concentrate the CTC whether or not it is contained in the blood. Obtain useful data for cancer diagnosis from the concentrated CTC.
  • the cell type contained in the target blood and to be concentrated may be myeloma cells.
  • the blood obtained contains myeloma cells.
  • Myeloma cells can be detected as microresidual lesions (MRDs), for example, in patients treated for myeloma. These persons are the subjects of diagnosis.
  • MRDs microresidual lesions
  • An example of myeloma is multiple myeloma.
  • Blood collected from such patients is pretreated with a column. Concentrate myeloma cells by classification. Perform the steps necessary to concentrate myeloma cells whether or not they are contained in the blood. Obtain useful data for diagnosis of MRD from concentrated myeloma cells.
  • FIG. 1 shows the blood separation device 1.
  • the blood separation device 1 includes a column 50 and a microchannel 20.
  • a flow path chip 70 having a multi-layer structure may be formed by stacking several fine flow paths 20.
  • the flow path chip 70 may be a chip having only one layer of fine flow paths 20.
  • the fine flow path 20 in the uppermost layer of the flow path chip 70 will be described.
  • the layer below the uppermost layer of the flow path chip 70 may have the same fine flow path as the fine flow path 20 described below, or may have a different fine flow path.
  • the column 50 and the fine flow path 20 may be configured as separate bodies.
  • the column 50 is arranged on the upstream side of the fine flow path 20.
  • the column 50 includes at least a porous material 51 and filters 53a and b.
  • the column 50 is for performing column chromatography using the porous material 51 filled therein as a stationary phase and blood BL as a mobile phase. Details of the column 50 will be described later with reference to FIG.
  • the blood BL and the porous surface of the porous material 51 are brought into contact with each other to react and interact with the components in the blood BL.
  • the microchannel 20 is used for separating floating cells such as blood cells.
  • the fine flow path 20 shown in FIG. 1 has a flow path structure on the order of micrometers.
  • Such a microchannel structure is suitable for blood classification (Patent Document 1).
  • a chip having a fine channel used for classifying blood may be particularly referred to as a blood cell separation chip or a channel chip.
  • Blood BL is classified in the microchannel 20 and reaches each outlet 22ac.
  • the fine flow path 20 has a main flow path 23.
  • One end of the main flow path 23 is an inlet 21a.
  • the other end of the main flow path 23 is an outlet 22c.
  • the microchannel 20 further has a subchannel 24.
  • the end of the auxiliary flow path 24 is the inlet 21b.
  • the end of the sub-flow path 24 is connected to the main flow path 23 at the merging portion 28.
  • the main flow path 23 has flow path parts 25ad in order from the inlet 21a to the outlet 22c.
  • the flow path parts 25ad are connected from the inlet 21a to the outlet 22c.
  • the fine flow path 20 has branch flow paths 26a and 26b. Both the branch flow paths 26a and 26b are flow paths that branch from the main flow path 23.
  • the branch flow path 26a and the branch flow path 26b branch from the main flow path 23 in this order from the upstream side.
  • One ends of the branch flow paths 26a and 26b are connected to the main flow path 23 by the flow path part 25c.
  • the branch flow paths 26a and 26b are arranged on the side facing the sub-flow path 24. There are outlets 22a and 22b at the other ends of the branch flow paths 26a and 26b.
  • each of the branch flow paths 26a and 26b has a plurality of fine flow paths branching from the main flow path 23.
  • the small flow paths are arranged along the direction from the upstream to the downstream of the main flow path 23.
  • Each microchannel reaches outlets 22a and 22b, respectively.
  • the small flow paths meet before the outlets 22a and 22b, respectively.
  • the flow path part 25d reaches the outlet 22c.
  • blood BL is sent to the column 50 at a predetermined flow rate.
  • the blood BL sent to the column 50 enters the flow path part 25a via the inlet 21a.
  • the fine flow path 20 has a sub flow path 24.
  • the subchannel 24 is connected to the syringe 35.
  • the clear liquid CL is contained in the syringe 35.
  • the clear liquid CL is a liquid that does not contain floating cells.
  • Clear liquid CL is a liquid that does not damage blood cells or other cells.
  • the clear solution CL is a buffer solution.
  • the clear solution CL may be PBS.
  • a fraction of the cell suspension is discharged to each outlet.
  • a fraction F3 is obtained at the outlet 22c
  • a fraction F2 is obtained at the outlet 22b
  • a fraction F1 is obtained at the outlet 22a.
  • Fractions F1 and F2 each contain cells classified in channel part 25c.
  • Fraction F3 contains plasma that has passed through channel part 25c. The details of the classification process of the floating cells that have passed through the flow path part 25b shown in the area VII of FIG. 1 will be described later with reference to FIG. 7.
  • FIG. 2 shows the column 50 viewed from the front.
  • the column 50 includes a column body 60.
  • the column body 60 includes at least a porous material 51, an accommodating portion 52 for accommodating the porous material 51, and filters 53a and b.
  • the column 50 may further include connecting portions 54 and 55.
  • the connecting portion 54 is removable from the syringe 30.
  • the connecting portion 55 is removable from the inlet 21a of the fine flow path 20.
  • a tube 56 may be provided between the filter 53a and the connecting portion 54.
  • the porous material 51 is a material having a porous surface. In other words, a large number of micropores are formed on the surface of the porous material 51.
  • the porous material 51 may be particles.
  • the particles may be spherical.
  • the particles may be beads. In the present specification, the beads refer to a group of particles formed by a method in which each particle becomes spherical.
  • the porous material 51 may be a material that sinks in blood. It is preferable that small particles are cut off from the particles used as the porous material 51, if necessary.
  • the cutoff is to remove small particles having a particle size equal to or less than the cutoff diameter from the particles of the porous material in advance. Specifically, it can be performed by sieving with a mesh or the like. For details on the cut-off of porous materials, see ⁇ 3. > Will be described later.
  • the blood that comes into contact with the porous surface of the porous material 51 may be whole blood that has not been diluted with another liquid.
  • Whole blood means that blood is not separated for each blood component and contains all components such as blood cells and plasma.
  • the porous material 51 may interact with some of the floating cells contained in whole blood.
  • the interacting components themselves may clog the microchannel 20.
  • the interacting components may indirectly promote clogging of the microchannel 20.
  • the porous material may react with the components contained in plasma.
  • the porous material may interact with components contained in plasma.
  • the porous material may be combined with other non-porous material.
  • non-porous particles may be coated with a porous material to form porous particles.
  • the center of the particle does not have to be porous.
  • the center of the particle may be a ferromagnet.
  • the material of the porous material may be a polysaccharide.
  • the micropores of the porous material may be formed of a polysaccharide.
  • the polysaccharide may be crosslinked.
  • the polysaccharide may be any of agarose, dextran and allyl dextran.
  • the polysaccharide may be modified.
  • the modification may be DEAE (Diethylethanolamine) modification.
  • the material of the porous material may be silica or resin.
  • the particulate porous material may be one that can be used for gel filtration chromatography.
  • Gel filtration chromatography is size exclusion chromatography in which the mobile phase is an aqueous solution.
  • the DNA may be fractionated at this time.
  • the exclusion limit for DNA of the porous material is preferably 45 base pairs or more.
  • the exclusion limit for DNA of the porous material may be 165 or more, or may be less than or equal to 165.
  • the exclusion limit for DNA of the porous material may be 1078 or more, or may be less than or equal to.
  • the particulate porous material may be one capable of fractionating proteins. It is preferable that the lower limit of the fractionation range of the porous material with respect to the protein is 1 ⁇ 10 4 Da or more. It is preferable that the upper limit of the fractionation range of the porous material with respect to the protein is 4 ⁇ 10 6 Da or more.
  • the particulate porous material preferably satisfies at least one of the above.
  • the accommodating portion 52 has a configuration capable of accommodating the porous material 51.
  • the shape of the accommodating portion 52 is an end face with both end faces open, and can be, for example, a hollow shape having a cylindrical shape or a square cylinder shape in a cross-sectional view.
  • the shape of the accommodating portion 52 is cylindrical, since the accommodating portion 52 does not have a corner portion, the retention of the porous material 51 and the flowing blood BL at the corner portion can be suppressed. Therefore, it is particularly preferable that the shape of the accommodating portion 52 is cylindrical.
  • the cross-sectional shape includes any of a perfect circle, a substantially perfect circle, and an ellipse.
  • the filters 53a and b have a network structure in which particles of the porous material cannot pass through, but a desired liquid such as blood that is classified in a fine flow path can pass through. That is, the filters 53a and b trap the particles of the porous material. Since small particles having a particle size equal to or less than the cutoff diameter are previously removed from the particles of the porous material, small particles having a particle size smaller than a certain particle size are excluded. Therefore, the filters 53a and bb are smaller than the cutoff diameter of the particles of the porous material, that is, the minimum particle diameter contained in the particles of the porous material, and may have a network structure through which cells such as blood cells can pass. preferable.
  • the size of the cell is, for example, about 12 ⁇ m at the largest. Therefore, for example, a filter having each network structure having a diameter of 20 to 40 ⁇ m, particularly preferably a diameter of 20 ⁇ m can be used. That is, it is preferable that the diameters of the network structures are the same.
  • the "mesh structure” in the present specification means the opening of the filters 53a and b.
  • the mesh structure includes both a structure in which straight lines are arranged so as to intersect vertically and horizontally and a structure in which polygons are repeatedly arranged. As those arranged so that straight lines intersect vertically and horizontally, for example, a grid-like one is included.
  • the mesh structure may be one in which circles are repeatedly arranged.
  • the filter can be arranged at least on the inlet 21a side of the fine flow path 20 at both ends of the accommodating portion 52. That is, the filter 53b can be placed on the downstream side of the blood flow in the column 50. Further, the filters 53a and bb can be arranged at both ends of the accommodating portion 52. That is, the filters 53a and b can be arranged on both the upstream side and the downstream side of the blood flow in the column 50. That is, the filters 53a and bb can be arranged so as to completely cover the entire surface of the open end faces located on both end faces of the accommodating portion 52.
  • the outer diameters of the filters 53a and bb are preferably at least the outer diameter of the accommodating portion 52 in order to completely cover the entire surface of the open end surface of the accommodating portion 52.
  • the connecting portions 54 and 55 are members for connecting the column body 60 to the syringe located upstream of the column 50 and the fine flow path located downstream. As shown in FIG. 2, the connecting portion 54 has a configuration in which it can be attached to and detached from the syringe 30.
  • the connecting portion 55 has a structure that can be attached to and detached from the inlet 21a of the fine flow path 20.
  • the shapes of the connecting portions 54 and 55 are not particularly limited, but it is preferable that the connecting portions 54 and 55 have a configuration that can be easily attached to and detached from each configuration.
  • the connecting portion 54 may have a shape including a concave portion that fits into the shape of the convex portion at the tip of the syringe 30.
  • the connecting portion 55 may have a shape provided with a convex portion corresponding to the concave portion of the inlet 21a of the fine flow path 20. Further, it is also possible to provide screw-shaped grooves on the surfaces of the convex portions and the concave portions so that they can be rotated and connected to each other. With such a configuration, the column 50 and the fine flow path 20 can be reliably connected, and the operability is improved.
  • the shapes of the connecting portions 54 and 55 may be such that they cannot be removed once they are connected to the syringe 30 or the inlet 21a.
  • the connection can be made more reliably, and even when the pressure from the syringe 30 is applied to each connection portion, the blood flowing through the connection portion does not easily leak to the outside. That is, the watertightness at the connecting portion can be improved.
  • a tube 56 is provided between the filter 53a and the connecting portion 54.
  • the tube 56 may have flexibility, and for example, a silicone resin tube, a polyvinyl chloride tube, or the like can be used.
  • a pinch valve may be provided on the tube 56.
  • a separate tube may be provided between the filter 53b and the connecting portion 55. If the distance from the syringe 30 to the column body 60 is short, the tube 56 may not be provided. Without the tube 56, ⁇ 2-4.
  • the connecting portion 54 described in> is provided, for example, the connecting portion 54 may be directly connected to the filter 53a.
  • Cutoff means removing small particles from the particles of the porous material.
  • FIG. 3 shows the particle size distribution of the porous particles as a volume-based integrated distribution.
  • the particles of the porous material have a particle size distribution.
  • the median particle size of the cumulative volume distribution (d50V) of the porous material is the median particle size in the volume-based integrated distribution.
  • the particle size in the state where the particles are swollen in the buffer solution is used as a reference. Examples of particle size measurement are the effective diameter obtained by the laser diffraction / scattering method and the sphere volume equivalent diameter obtained by the Coulter method.
  • the central particle diameter d50V is preferably less than 500 ⁇ m.
  • the central particle size d50V is preferably 25 to 280 ⁇ m, more preferably 25 to 165 ⁇ m, and even more preferably 45 to 165 ⁇ m.
  • the surface area of the porous material can be made suitable for contact with blood.
  • small particles are cut off from the particles of the porous material as needed.
  • small particles having a particle size of CF or less of the cutoff diameter are removed in advance. That is, the cutoff diameter CF means the smallest particle diameter contained in the particles of the porous material.
  • the cutoff diameter CF is in the range of 25 to 100 ⁇ m.
  • the cutoff diameter CF has a range of 25 to 70 ⁇ m, preferably 40 to 70 ⁇ m. It is preferable to remove small particles by sieving with a mesh.
  • a cell strainer may be used to remove small particles from the population of particles of the porous material. By removing the small particles, it is possible to suppress clogging of the fine flow path due to the small particles in the porous material mixed in the blood.
  • the particle size distribution of the original particles changes. That is, the cutoff has the effect of size selection.
  • the central particle size also changes after size selection.
  • the central particle size d50V in the present specification is based on the particle size distribution before removing small particles from the original particles by cutoff.
  • the above is the blood separation device according to the present invention.
  • the column and the microchannel may be configured as separate bodies. At the time of use, the column and the microchannel can be combined and used as one blood cell separation device.
  • the column and the fine flow path can be connected by, for example, a connecting portion having the above-mentioned uneven structure. Further, for example, it can be connected by a connecting portion having a screw-shaped groove on the surface of the concave-convex structure.
  • the column and the fine flow path may be integrally configured.
  • the structure may include a column structure connected to the inlet of the fine flow path.
  • the blood separation device according to the present invention may be a cartridge integrated with a syringe. Further, this cartridge may be used by connecting to a driving device for driving a fine flow path, or by arranging the cartridge inside the driving device.
  • the flow path chip 70 of this example has eight layers including a fine flow path 20 and a fine flow path equivalent thereto.
  • the uppermost layer of the flow path chip 70 is composed of a plate-shaped sheet to which an inlet 71 connected to the inlet 21a of the fine flow path 20 is attached.
  • the inlet 71 is an inlet that bundles the inlet 21a of the microchannel 20 of the channel chip 70 and the inlets of other microchannels.
  • the flow path chip 70 is provided with an outlet 72 connected to the outlet 22c of the fine flow path 20 in the lowermost layer thereof.
  • the outlet 72 is an outlet that bundles the outlet 22c of the fine flow path 20 of the flow path chip 70 and the outlets of other fine flow paths.
  • the blood BL sent from the syringe 30 passes through the column 50.
  • the behavior of blood BL in column 50 will be described later with reference to FIG.
  • the finest flow path 20 in the uppermost layer will be described.
  • the other layers also have the same structure as the fine flow path 20.
  • the blood BL that has passed through the column 50 and the inlet 71 enters the microchannel 20 from the inlet 21a.
  • the blood BL that has entered the microchannel 20 enters the main channel 23 formed in each layer of the stacked microchannels 20.
  • the flow path portion 25a includes pillar dense zones 11 and 13 acting as filters and compartments 12 and 14.
  • the pillar dense zones 11 and 13 are shown by hatching of vertical lines. Details of the flow path part 25a will be described later with reference to FIG. That is, the fine flow path 20 is made of a flat chip including pillar dense zones 11 and 13 and a hydraulic flow path located downstream of the pillar dense zones 11 and 13.
  • the microchannel 20 classifies the floating cells contained in the blood.
  • the microchannels in the lower layer in the channel chip 70 also classify suspended cells in the same manner.
  • the fraction F3 reaches the outlet 72 of the classified suspended cells via the outlet 22c. Details of the process of classifying floating cells will be described later with reference to FIG.
  • FIG. 5 is an enlarged front sectional view of the column 50 shown in the area V of FIG. FIG. 5 shows the interaction between the column and blood.
  • Blood BL contains annuclear red blood cells 27, nucleated cells 29ac and precipitation-causing substance CC.
  • Nucleated cells 29a-c are cells of different sizes.
  • the precipitation-causing substance CC is a substance presumed to be one of the causes of clogging (debris) of the fine flow path 20 and the fine flow path 80.
  • the blood BL sent from the syringe 30 at a predetermined flow rate passes through the column body 60 of the column 50.
  • the precipitation-causing substance CC passes through the porous material 51.
  • the porous material 51 interacts with the precipitation-causing substance CC contained in the blood to significantly reduce their precipitation property.
  • the porous material 51 may adsorb the precipitation-causing substance CC to suppress the occurrence of clogging (debris) in the fine flow path 20 and other fine flow paths.
  • the non-nucleated erythrocytes 27 and the nucleated cells 29a-c flow through the gaps of the porous material 51. Therefore, the porous material 51 does not obstruct the flow of blood cells.
  • the blood that has passed through the column 50 subsequently passes through the pillar dense zone 11 provided in the main flow path 23.
  • the pillar dense zone will be described with reference to FIG.
  • FIG. 6 shows an observation image (upper row) of the fine flow path shown in the area VI of FIG. 1 and a sketch thereof (lower row).
  • the pillar dense zone 11 will be described with reference to FIG. FIG. 6 is also an observation image of the embodiment. Examples will be described later.
  • the pillar dense zone 11 shown in FIG. 6 acts as a filter.
  • the pillar dense zone 11 prevents impurities in the blood, for example, insoluble components larger than blood cells, from entering the flow path portion downstream of the pillar dense zone 11.
  • impurities in the blood for example, insoluble components larger than blood cells
  • the pillar dense zone 11 is provided so as to cross the blood flow in the flow path portion 25a. Blood flows from the upstream left side in the figure to the downstream right side (indicated by white arrows).
  • the pillar dense zone 11 connects the upper surface and the lower surface of the flow path portion 25a.
  • the shape of each pillar is not a shape that provides great resistance to blood flow.
  • each pillar is preferably a shape that reduces resistance to a fluid, and can be, for example, a drop shape having a circular shape, an elliptical shape, or a streamlined shape in a plan view.
  • a drop-shaped pillar is shown as an example, but the present invention is not limited to this.
  • the pillar dense zone 11 does not significantly reduce the blood flow rate.
  • the flow path part 25a has a section 12.
  • the section 12 is adjacent to the pillar dense zone 11 on the downstream side of the pillar dense zone 11. Pillars are sparse in compartment 12.
  • the flow path portion 25a further includes a pillar dense zone 13.
  • the pillar dense zone 13 is a pillar dense zone located next to the pillar dense zone 11 in the downstream direction as seen from the pillar dense zone 11.
  • the configuration of the pillar dense zone 13 may be the same as that of the pillar dense zone 11.
  • the compartment 12 is surrounded by the pillar dense zone 11, the pillar dense zone 13, and the side wall of the flow path part 25a, that is, the side wall of the fine flow path.
  • the flow path part 25a further has a compartment 14.
  • the section 14 is adjacent to the pillar dense zone 13 on the downstream side of the pillar dense zone 13.
  • the flow path portion 25a is further provided with a pillar dense zone downstream of the compartment 14. Reference numerals 15 and 17 will be described with reference to Examples.
  • the floating cells contained in the blood that has passed through the pillar dense zone 11 included in the channel part 25a are subsequently classified in the channel part 25b.
  • the process of classifying suspended cells in the microchannel will be described with reference to FIG. 7.
  • FIG. 7 shows a fine flow path 20 in a plan view.
  • the figure schematically shows the process of classifying floating cells by the microchannel 20.
  • the branch flow path 26a shows 10 fine flow paths
  • the branch flow path 26b shows 3 fine flow paths.
  • blood BL continuously flows from the flow path part 25a (not shown in FIG. 7) further upstream of the flow path part 25b.
  • Blood BL contains a large amount of cells.
  • the flow of the clear liquid CL is continuously contacted with the flow of the blood BL from the side thereof.
  • the cells flowing through the main flow path 23 are continuously pushed from the side of the main flow path 23.
  • the flow of blood BL is continuously pushed to the opposite side of the flow of clear liquid CL.
  • the floating cells are continuously pushed to the branch flow paths 26a and 26b, and the floating cells continuously flow into these branch flow paths.
  • anucleated erythrocytes 27 continuously flow into the branch flow path 26a.
  • the anucleated erythrocytes 27 in the blood BL are hydraulically classified in the channel part 25b.
  • the classification is continuously performed on the side of the blood BL flow that is not in contact with the clear liquid CL flow.
  • the branch flow path 26a acts as a removal flow path for the anucleated erythrocytes 27.
  • the inscribed diameter of the fine flow path of the branch flow path 26a is 12 to 19 ⁇ m.
  • the inscribed diameter may be any of 13, 14, 15, 16, 17, and 18 ⁇ m.
  • nucleated cells 29a-c continuously flow into the branch flow path 26b.
  • the nucleated cells 29a-c in the blood BL are hydraulically classified. The classification is continuously performed on the side of the blood BL flow that is not in contact with the clear liquid CL flow. In particular, a cell suspension of nucleated cells is continuously obtained from the branch flow path 26b.
  • the branch flow path 26b functions as a recovery flow path for the nucleated cells 29a-c.
  • the inscribed diameter of the fine flow path of the branch flow path 26b is 20 to 30 ⁇ m.
  • the inscribed diameter may be any of 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 and 29 ⁇ m.
  • the diameter of nucleated cells including nucleated red blood cells is considered to be 11 to 13 ⁇ m.
  • the inscribed diameter of each of the branch flow paths 26a and 26b shown in FIG. 7 is the diameter of the inscribed circle in the orthogonal cross section of the small flow path.
  • the cross section of the flow path may be a quadrangle, another polygon, or a circle.
  • Floating cells and plasma that have not been taken up by the branch flow paths 26a and 26b continuously pass through the flow path part 25d as a flow-through FT. After that, it reaches the exit 22c in FIG. For example, aggregated blood cells are included in the flow-through FT.
  • the above is a series of steps for classifying using the blood separation device according to the embodiment.
  • small particles are cut off from the porous particles.
  • beads Sepharose CL-6B are used as the porous particles.
  • Sepharose is a trademark.
  • the gel matrix of Sepharose CL6B is a sphere composed of 6% crosslinked agarose.
  • the particle size before cutoff is 45 to 165 ⁇ m.
  • the mesh size of the cell strainer is 40 ⁇ m, 70 ⁇ m and 100 ⁇ m. Filtering is performed for each mesh size cell strainer.
  • the mesh size of the cell strainer corresponds to the cutoff diameter. Large particles filtered by cutoff are placed in a column and used for pretreatment. The smaller the mesh size, the greater the number of particles filtered on the mesh. Wash the beads twice with PBS.
  • each bead in the same volume of clarified solution as the bead. Add 20 ⁇ L of the bead suspension to 2 mL of clarified solution and mix them well.
  • the clarified solution is a PBS-based buffer solution. A mixture of beads and clarified solution is further added to the clarified solution.
  • the inside of the blood cell separation chip is immersed in the buffer solution in advance by flowing a part of the clarification solution through the blood cell separation chip in advance. The treatment of immersing the blood cell separation chip is performed for 40 minutes.
  • the cut-off beads are stored in the column housing.
  • the column contains, for example, 50 ⁇ L of beads having a cutoff diameter of 70 ⁇ m.
  • “Blood” in this example is whole blood collected from a healthy human adult.
  • the blood collection tube used when collecting blood contains citric acid and EDTA, which suppress blood coagulation. By collecting a specified amount of blood into the blood collection tube, an appropriate amount of citric acid and EDTA are automatically added to the blood.
  • Sample blood is obtained by spiked fluorescent particles on the whole blood on the third day stored at 4 ° C. after blood collection.
  • spike means adding a small amount of cells or a cell-like substance.
  • “Fluorescent particles” are spherical particles that imitate a small amount of fetal-derived nucleated red blood cells contained in pregnant woman's blood. For example, in FIG. 5, it corresponds to nucleated cells 29ac.
  • a clear solution (PBS-based buffer solution) is added to the obtained sample blood, and the mixture is diluted 5-fold.
  • two types of fluorescent particles having different diameters are spiked into blood. Specifically, resin fluorescent particles having a diameter of 8.42 ⁇ m and a diameter of 10 ⁇ m are spiked into blood.
  • FITC Particles catalog # F1CP-80-2) manufactured by Spherotech is used as fluorescent particles having a diameter of 8.42 ⁇ m.
  • As the 10.0 ⁇ m fluorescent particles Invitrogen's FluoSpheres TM polystyrene microspheres, 10 ⁇ m, blue fluorescent (365/415) are used.
  • fluorescent particles having different diameters For 1 mL of diluted blood, 60 fluorescent particles having different diameters, each having a diameter of 8.42 ⁇ m and a diameter of 10 ⁇ m, are spiked for a total of 120 particles.
  • the whole blood may be diluted after the spike of the fluorescent particles.
  • 300 fluorescent particles having different diameters, each having a diameter of 8.42 ⁇ m and a diameter of 10 ⁇ m, may be spiked and diluted 5-fold with respect to 1 mL of whole blood.
  • Pretreatment is performed by passing diluted sample blood through a column, classifying with a single layer blood cell separation chip, and collecting fluorescent particles.
  • a large number of leukocytes containing lymphocytes can be obtained in the fraction F2.
  • Many unnucleated mature erythrocytes are obtained in fraction F1.
  • Most (> 99.9%) of the cells that have flowed into the blood cell separation chip flow out to the fraction F1.
  • Not many blood cells can be obtained in F3.
  • the fluorescent particles are lymphocyte-like, they are expected to be contained in the fraction F2.
  • the sample blood to be flowed in Examples, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 is as described in (2) above, and is under the same conditions.
  • the rate at which sample blood is sent from the syringe is 20 ⁇ L / min.
  • the speed at which the clarified solution is sent from the syringe is 40 ⁇ L / min. 90 minutes after the start of classification, when 1.8 mL of sample blood was flowed, fluorescent particles were collected from the fraction consisting of F1 to F3 fractional fluorescent particles, and the recovery rate was determined.
  • the difference between the examples and Comparative Examples 1 and 2 is the configuration of the columns of the blood separation device.
  • the columns of the examples include both CL-6B beads and filters.
  • the column is filled with 50 ⁇ L of CL-6B beads having a cutoff diameter of 70 ⁇ m.
  • the mesh of the filter is grid-like and has a diameter of 20 ⁇ m.
  • Comparative Example 1 does not have a column. That is, Comparative Example 1 does not include both CL-6B beads and a filter.
  • the sample blood is introduced directly into the blood cell separation chip.
  • the column of Comparative Example 2 is not filled with CL-6B beads. That is, the column of Comparative Example 2 has only a filter and does not have CL-6B beads.
  • the mesh of the filter is grid-like as in the examples and has a diameter of 20 ⁇ m.
  • the recovery rate of fluorescent particles can be obtained by using the following formula 1.
  • the "number of fluorescent particles recovered in a certain period of time” is the number of fluorescent particles found by actual measurement.
  • the "expected value of the number of fluorescent particles contained in the blood cells fractionated within a certain period of time" in the above [Equation 1] can be obtained by using the following equation 2.
  • Table 1 below shows the recovery rates of the fluorescent particles of Examples and Comparative Examples 1 and 2.
  • the upper part of Table 1 shows the recovery rate of fluorescent particles when CL-6B beads having a cutoff diameter of 70 ⁇ m and sample blood were allowed to flow for 90 minutes.
  • the number of fluorescent particles found by measurement from the fractions consisting of F1 to F3 is 76 fluorescent particles having a diameter of 8.42 ⁇ m and 85 fluorescent particles having a diameter of 10.0 ⁇ m.
  • Fractions F1 ⁇ blood count found from a fraction consisting of F3 is 1.27 ⁇ 10 9 cells. Blood per 1mL of whole blood prior to the addition of the fluorescent particles is 4.42 ⁇ 10 9 cells.
  • the number of fluorescent particles per 1 mL of whole blood was 313 for those having a diameter of 8.42 ⁇ m and 268 for those having a diameter of 10 ⁇ m.
  • the recovery rate of fluorescent particles obtained from the above measured values using the above calculation formulas [Equation 1] and [Equation 2] is 84.5% for those having a diameter of 8.42 ⁇ m and 110. It was 4%.
  • the middle part of Table 1 shows the recovery rate of fluorescent particles when the cutoff diameter is 70 ⁇ m and the sample blood is flowed for 90 minutes.
  • the number of fluorescent particles found by measurement from the fractions consisting of F1 to F3 is 114 fluorescent particles having a diameter of 8.42 ⁇ m and 131 fluorescent particles having a diameter of 10.0 ⁇ m.
  • Fractions F1 ⁇ blood count found from a fraction consisting of F3 is 1.70 ⁇ 10 9 cells. Blood per 1mL of whole blood prior to the addition of the fluorescent particles is 4.42 ⁇ 10 9 cells.
  • the number of fluorescent particles per 1 mL of whole blood was 307 with a diameter of 8.42 ⁇ m and 297 with a diameter of 10 ⁇ m.
  • the recovery rate of fluorescent particles obtained from the above measured values using the above calculation formulas [Equation 1] and [Equation 2] was 96.6% for those having a diameter of 8.42 ⁇ m and 114. It was 7%.
  • the lower part of Table 1 shows the recovery rate of fluorescent particles when the cutoff diameter is 70 ⁇ m and the sample blood is flowed for 90 minutes.
  • the number of fluorescent particles found by measurement from the fractions consisting of F1 to F3 is 133 fluorescent particles having a diameter of 8.42 ⁇ m and 127 fluorescent particles having a diameter of 10.0 ⁇ m.
  • Fractions F1 ⁇ blood counts found Fractions consisting of F3 is 1.71 ⁇ 10 9 cells / mL. Blood per 1mL of whole blood prior to the addition of the fluorescent particles is 4.42 ⁇ 10 9 cells.
  • the number of fluorescent particles per 1 mL of whole blood was 313 for those having a diameter of 8.42 ⁇ m and 289 for those having a diameter of 10 ⁇ m.
  • the recovery rate of fluorescent particles obtained from the above measured values using the above calculation formulas [Equation 1] and [Equation 2] was 109.8% for those having a diameter of 8.42 ⁇ m and 114. It was 3%.
  • This example is performed as a model experiment for enrichment of fetal-derived nucleated red blood cells.
  • the above results indicate that column pretreatment is useful in concentrating fetal nucleated red blood cells.
  • classification can be performed for a long time by suppressing clogging of the blood cell separation chip.
  • a large amount of sample blood can be treated by performing classification for a long time by the method using the blood separation device of this example. This indicates that the amount of fetal-derived nucleated red blood cells obtained per treatment is large.
  • the evaluation of the clogging rate of the blood cell separation chip will be described with reference to FIGS. 6, 8 and 9.
  • the image data of the microchannel 20 (blood cell separation chip, hereinafter referred to as the chip) of FIG. 1 is acquired while the blood is flowing through the chip.
  • the clogging rate is evaluated by performing image analysis on the acquired image data. Specifically, the main flow path 23 (flow path part 25a) of the chip of FIG. 1 is evaluated.
  • the evaluation of the flow path part 25a in this example and Comparative Examples 1 and 2 is performed 30 to 90 minutes after the sample blood is started to flow. No clogging was observed in Examples, and clogging was observed in Comparative Examples 1 and 2.
  • a specific method for evaluating the clogging rate will be described with reference to FIG. 8 showing Comparative Example 1 in which clogging has occurred.
  • FIG. 8 shows an observation image (upper row) of the flow path part 25a in Comparative Example 1 and a sketch thereof (lower row).
  • FIG. 8 is an enlarged view of the portion shown by the area VI in FIG. The clogging rate is evaluated for the compartment 12.
  • the observation image is acquired while looking at the chip in a plan view.
  • the chip is photographed with HOZAN USB cam software to obtain the image data shown in the upper part of FIG. Image data is read into ImageJ software and analyzed on the software.
  • the area 15 corresponding to the section 12 is cut out from the image data.
  • the total number of pixels in the area 15 is treated as the total area of the partition 12.
  • the debris portion 16 in the area 15 is visually distinguished from the flow portion 17.
  • the debris portion 16 is occupied by debris accumulated starting from the pillar dense zone 11.
  • "Debris" is a gel-like substance formed from the precipitation-causing substance CC (see FIG. 5) contained in the sample blood. If this debris penetrates into the pillar dense zone 11, it causes clogging of the pillar dense zone 11. The debris section 16 pushes the flow of blood cells away. On the other hand, blood cells are flowing smoothly in the flowing portion 17.
  • a line is visually drawn between the debris portion 16 and the flow portion 17.
  • the total number of pixels of the portion of the area 15 excluding the debris portion 16, that is, the flow portion 17, is obtained. This is specified as the area of the flow unit 17.
  • the area of the flow portion 17 is subtracted from the total area of the area 15 to obtain the estimated area of the debris portion 16. This estimated area is used as the debris area.
  • the debris area occupying the total area of the section 12 is calculated as a percentage. Such a value is defined as a clogging rate.
  • FIG. 9 shows an observation image (upper row) of the flow path part 25a in Comparative Example 2 and a sketch thereof (lower row).
  • FIG. 6 shows an observation image (upper row) of the flow path part 25a in the first embodiment and a sketch (lower row) thereof.
  • Comparative Example 1 does not have a column. That is, Comparative Example 1 does not include both CL-6B beads and a filter.
  • the sample blood is introduced directly into the blood cell separation chip.
  • the column of Comparative Example 2 is not filled with CL-6B beads. That is, the column of Comparative Example 2 has only a filter and does not have CL-6B beads.
  • the mesh of the filter is grid-like and has a diameter of 20 ⁇ m.
  • the columns of the examples include both CL-6B beads and filters.
  • the column is filled with 50 ⁇ L of CL-6B beads having a cutoff diameter of 70 ⁇ m.
  • the mesh of the filter is grid-like and has a diameter of 20 ⁇ m.
  • Table 2 below shows the clogging rates of the blood cell separation chips of Examples and Comparative Examples 1 and 2.
  • the clogging rate is the clogging rate at the time when the sample blood is allowed to flow for 90 minutes.
  • Comparative Example 1 not provided with both CL-6B beads and a filter, the clogging rate was 46.6%. Further, in Comparative Example 2 having a column provided only with a filter and not provided with CL-6B beads, the clogging rate increased to 96.5%, and most of the compartments 12 were clogged. This indicates that the filter alone does not suppress clogging. As shown in FIGS. 8 and 9, in each comparative example, it is presumed that the pillar dense zone 11 is connected with debris to cause clogging. Further, since the clogging rate in Comparative Example 2 is higher than that in Comparative Example 1, it is considered that the filter is likely to generate a precipitation-causing substance that causes debris.
  • the column provided with CL-6B beads and the filter can suppress the generation of debris. Therefore, it is possible to provide a blood separation device suitable for clearing clogging. Further, the blood used in this example and each comparative example is blood 3 days after blood collection. Even with such blood, it is possible to recover rare cells such as fetal-derived nucleated red blood cells by using a small amount of beads.
  • FIG. 10 is a reference example showing a state in which classification is performed without using a column.
  • the figure is a partial front sectional view showing how the porous material 51 is poured into the fine flow path 20 together with the blood BL.
  • Blood BL contains annuclear red blood cells 27, nucleated cells 29ac and precipitation-causing substance CC.
  • the porous material 51 interacts with, for example, the precipitation-causing substance CC, and has an effect of eliminating clogging in the fine flow path 20.
  • the microchannel 80 is the lower microchannel described in FIG.
  • the fine flow path 80 includes an inlet 81a and a main flow path 83.
  • the inlet 81a is equivalent to the inlet 21a of the microchannel 20.
  • the main flow path 83 is equivalent to the main flow path 23 of the fine flow path 20.
  • the blood flow is indicated by a black arrow.
  • Blood BL enters the main flow path 23 via the inlet 21a of the fine flow path 20.
  • the porous material 51 accumulates at the inlet 81a. It does not collect at the entrance 21a.
  • the porous material 51 does not enter the main flow path 23 or the main flow path 83. That is, at the beginning of the flow of the blood BL, the porous material 51 filled in the inlet 81a interacts with the blood BL.
  • the porous material 51 is not filled at the inlet 21a, there is a possibility that the effect of eliminating clogging by the porous material 51 cannot be obtained.
  • the blood separation device including the column according to this embodiment is advantageous especially when the amount of beads is small.
  • the blood cell separation device may be another blood device.
  • the blood device comprises a column and a microchannel located downstream of the column.
  • the column comprises a porous material as a stationary phase. Blood in contact with the porous material flows into the microchannel.
  • the blood device is a blood analysis device. Blood is physically or chemically analyzed in microchannels.

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Abstract

血液用デバイス（１）は、カラム（５０）とカラム（５０）の下流に位置する微細流路（２０）とを備える。カラム（５０）は多孔質材を固定相として備え、微細流路（２０）に多孔質材と接触した血液が流れる。血液用デバイス（１）はカラム（５０）と微細流路（２０）とが別体として提供されるものである。カラム（５０）は連結部（５５）を有し、微細流路（２０）は入口（２１ａ）を有し、連結部（５５）と入口（２１ａ）とを連結することによってカラム（５０）と微細流路（２０）とを一体化させてから血液（ＢＬ）をカラム（５０）より通す。

Description

血液用デバイス
　本発明は血液用デバイス、特に血球分離用デバイスに関する。また、これらデバイスの使用方法に関する。
　特許文献１には、微細流路による血球の分級が記載されている。
国際公開第２０１８／１２３２２０号
　血液を微細流路中に流すと微細流路中で目詰まりが生じることがある。本発明は目詰まりの解消に適したデバイスとその使用方法を提供することを課題とする。
＜１＞カラムと前記カラムの下流に位置する微細流路とを備える血液用デバイスであって、
　前記カラムは多孔質材を固定相として備え、
　前記微細流路に前記多孔質材と接触した血液が流れる、
　血液用デバイス。
＜２＞前記多孔質材は粒子からなり、
　前記カラムは、前記多孔質材を収容可能な収容部をさらに備え、前記収容部の下流の前記微細流路に近い側に、前記多孔質材の粒子をトラップするフィルターをさらに備え、
　前記多孔質材の粒子からは、カットオフ径以下の粒子径を有する小さな粒子が予め除去されており、
　前記フィルターの目開きは、前記カットオフ径よりも小さい、
　＜１＞に記載の血液用デバイス。
＜３＞前記カットオフ径は２５～１００μｍの範囲にある、＜２＞に記載の血液用デバイス。
＜４＞前記フィルターが有する網目の径は２０～４０μｍの範囲にあり、当該範囲はカットオフ径未満である、＜２＞又は＜３＞のいずれか一項に記載の血液用デバイス。
＜５＞前記粒子は粒子径分布を有するとともに、その体積基準の積算分布における中央粒子径ｄ５０Ｖが２５～２８０μｍである、ただし前記粒子径分布はカットオフにより前記小さな粒子を除去する前の粒子径分布を表す、＜２＞～＜４＞のいずれか一項に記載の血液用デバイス。
＜６＞前記収容部の上流の前記微細流路に遠い側に、前記多孔質材の粒子をトラップするフィルターをさらに備える、
　＜２＞～＜５＞のいずれか一項に記載の血液用デバイス。
＜７＞前記微細流路に前記多孔質材と接触した血液が流れると、前記微細流路が前記血液中の血球を水力学的に分級する、
　＜１＞～＜６＞のいずれか一項に記載の血液用デバイス。
＜８＞前記微細流路は、ピラー密集帯と前記ピラー密集帯の下流に位置する水力学的流路とを備える平面的なチップで作られており、
　前記カラムが前記平面的なチップの表又は裏に対して接続し、
　前記微細流路から前記血液用デバイスの外部に前記水力学的に分級された血球を放出する出口をさらに備える、
　血球分離用の、
　＜７＞に記載の血液用デバイス。
＜９＞前記多孔質材は粒子からなり、
　前記多孔質材の粒子は、多糖類、シリカ又は樹脂からなる多孔質性の表面を備える、
　＜１＞～＜８＞のいずれか一項に記載の血液用デバイス。
＜１０＞前記血液用デバイスは前記カラムと前記微細流路とが別体として提供されるものであり、前記カラムは連結部を有し、前記微細流路は入口を有し、前記連結部と前記入口とを連結することによって前記カラムと前記微細流路とを一体化させてから血液を前記カラムより通す、＜１＞～＜９＞のいずれか一項に記載の血液用デバイスの使用方法。
　本発明により微細流路中の目詰まりの解消に適したデバイスとその使用方法を提供することが可能となる。
血液分離用デバイスの模式図。 カラムの正面図。 多孔質の粒子の粒子径分布。 血液分離用デバイスの正面断面図。 図４のエリアＶで示すカラムの拡大正面断面図。 図１のエリアＶＩで示す微細流路の観察像１（上段）及びそのスケッチ（下段）。実施例。 図１のエリアＶＩＩで示す微細流路の部分平面図。 比較例１に係る微細流路の観察像２（上段）及びそのスケッチ（下段）。 比較例２に係る微細流路の観察像３（上段）及びそのスケッチ（下段）。 参考例の微細流路の断面図。
＜１．血液分離用デバイス＞
　本発明の一態様は、カラムと前記カラムの下流に位置する微細流路とを備える血液分離用デバイスである。血液には、細胞及び血漿が含まれる。細胞には、血球及び血液中を循環する他の細胞が含まれる。血液中の細胞は様々な大きさの細胞が混じりあっている。各細胞種は細胞の大きさに関して固有の粒子径分布を示す。血液分離用デバイスとは、血液中の細胞をその大きさによって分画する分級を行うためのデバイスである。血液分離用デバイスを用いて血液を分級することによって、特定の細胞腫が濃縮された細胞の集団を得ることができる。分級の例は微細流路内にて行う水力学的分級である。
　血液分離用デバイスを用いた分級の対象とする血液の種類および濃縮可能な細胞種の例は以下の通りである。
　対象とする血液には濃縮すべき細胞種として血球が含まれる。血球は胎児由来有核赤血球でもよい。取得される血液は胎児由来有核赤血球を含有する。胎児由来有核赤血球は妊婦血に含まれる。診断の対象者は胎児及び妊婦である。カラムを用いて当該妊婦血を前処理する。微細流路を用いた分級により胎児由来有核赤血球を濃縮する。濃縮された胎児由来有核赤血球より胎児に対する診断に有用なデータを取得する。
　対象とする血液には濃縮すべき細胞種として、血液中を循環する細胞であって血球ではない他の細胞が含まれる。それは循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）でもよい。取得される血液はＣＴＣを含有する。ＣＴＣは例えばがんの疑われる被験者、がん患者及びがんの治療をすでに受けた被験者の血液に含まれる可能性がある。これらの者が診断の対象者となる。カラムを用いて当該血液を前処理する。微細流路を用いた分級によりＣＴＣを濃縮する。ＣＴＣが血液に含まれているか否かに関わらずＣＴＣを濃縮するのに必要な工程を実行する。濃縮されたＣＴＣよりがんの診断に有用なデータを取得する。
　対象とする血液に含まれる細胞であって濃縮すべき細胞種は骨髄腫細胞でもよい。取得される血液は骨髄腫細胞を含有する。骨髄腫細胞は例えば骨髄腫の治療を行った患者から微小残存病変（ＭＲＤ）として検出される可能性がある。これらの者が診断の対象者となる。骨髄腫の一例は多発性骨髄腫である。かかる患者から採取した血液をカラムを用いて前処理する。分級により骨髄腫細胞を濃縮する。骨髄腫細胞が血液に含まれているか否かに関わらず骨髄腫細胞を濃縮するのに必要な工程を実行する。濃縮された骨髄腫細胞よりＭＲＤに対する診断に有用なデータを取得する。
　以下に水力学的な分級のためのデバイスの一例を示す。まず、図１の模式図を参照して血液分離用デバイス１の全体像について説明する。図１には血液分離用デバイス１が示されている。
　図１に示すように、血液分離用デバイス１は、カラム５０と微細流路２０とを備える。図１に示すように、いくつかの微細流路２０を重ねることで、多層構造を有する流路チップ７０としてもよい。流路チップ７０は１層の微細流路２０のみを有するチップでもよい。以下、流路チップ７０の最上層の微細流路２０について説明する。流路チップ７０の最上層よりも下の層は、以下に説明する微細流路２０と同様の微細流路を備えていてもよく、異なる微細流路を備えていてもよい。カラム５０と微細流路２０とは別体として構成されてもよい。カラム５０は微細流路２０の上流側に配置される。
　図１に示すように、カラム５０の一端と血液ＢＬを入れたシリンジ３０とが連結される。また、カラム５０の他端と微細流路２０の入口２１ａとが連結される。カラム５０は少なくとも多孔質材５１とフィルター５３ａ、ｂとを備える。一態様においてカラム５０はこれに充填された多孔質材５１を固定相とし、血液ＢＬを移動相としてカラムクロマトグラフィーを行うためのものである。カラム５０の詳細は図２を用いて後述する。血液ＢＬと多孔質材５１の多孔質性の表面とを接触させ、血液ＢＬ中の成分と反応し相互作用させる。このようにシリンジ３０から所定の流量で血液ＢＬを送りカラム５０を通過することによって前処理された血液ＢＬが微細流路２０の入口２１ａに入る。
　微細流路２０は血球をはじめとする浮遊細胞の分離に用いる。図１に示す微細流路２０はマイクロメートルオーダーの流路構造を有する。このようなマイクロ流路構造は血液の分級に適したものである（特許文献１）。血液の分級に用いられる微細流路を有するチップを特に血球分離チップ又は流路チップと呼ぶ場合がある。血液ＢＬは、微細流路２０にて分級され各出口２２ａ－ｃへと到達する。
　図１において微細流路２０は主流路２３を有する。主流路２３の一方の端は入口２１ａとなっている。主流路２３のもう一方の端は出口２２ｃとなっている。微細流路２０はさらに副流路２４を有する。副流路２４の端は入口２１ｂとなっている。副流路２４の端は合流部２８にて主流路２３に接続している。
　図１において主流路２３は入口２１ａから出口２２ｃに向かって順に流路パート２５ａ－ｄを有する。流路パート２５ａ－ｄは入口２１ａから出口２２ｃまで一つながりとなっている。流路パート２５ａと流路パート２５ｂとの間に合流部２８がある。
　図１において微細流路２０は枝流路２６ａ及び２６ｂを有する。枝流路２６ａ及び２６ｂはいずれも主流路２３から分岐する流路である。上流側から順に枝流路２６ａ及び枝流路２６ｂがこの順で主流路２３から分岐する。枝流路２６ａ及び２６ｂの一端は流路パート２５ｃで主流路２３と接続する。流路パート２５ｃにおいて、副流路２４と対向する側に枝流路２６ａ及び２６ｂが配置されている。枝流路２６ａ及び２６ｂの他端に出口２２ａ及び出口２２ｂがある。
　図１において枝流路２６ａ及び２６ｂはいずれも主流路２３から分岐する細流路を複数個有する。各細流路は主流路２３の上流から下流への方向に沿って並ぶ。各細流路はそれぞれ出口２２ａ及び２２ｂに達する。各細流路はそれぞれ出口２２ａ及び２２ｂの手前で合流する。流路パート２５ｃの下流には流路パート２５ｄがある。流路パート２５ｄは出口２２ｃに達する。
　シリンジ３０からは、所定の流量で血液ＢＬをカラム５０に送る。カラム５０に送られた血液ＢＬは入口２１ａを経由して流路パート２５ａに入る。
　図１において微細流路２０は副流路２４を有する。副流路２４はシリンジ３５と連結されている。シリンジ３５には清澄液ＣＬが入れられている。清澄液ＣＬは浮遊細胞を含まない液体である。清澄液ＣＬは血球やその他の細胞にダメージを与えない液体である。清澄液ＣＬは緩衝液である。清澄液ＣＬはＰＢＳでもよい。シリンジ３５内に圧力をかけることで清澄液ＣＬは入口２１ｂから副流路２４に入る。清澄液ＣＬは副流路２４を流れる。清澄液ＣＬは流路パート２５ｂに流入する。
　各出口には細胞懸濁液の画分が排出される。出口２２ｃには画分Ｆ３が、出口２２ｂには画分Ｆ２が、出口２２ａには画分Ｆ１が得られる。画分Ｆ１及び画分Ｆ２には流路パート２５ｃで分級された細胞がそれぞれ含まれる。画分Ｆ３には流路パート２５ｃを通過した血漿が含まれる。図１のエリアＶＩＩで示す流路パート２５ｂ－ｄを通過した浮遊細胞の分級過程の詳細については図７を用いて後述する。
＜２．カラムの詳細＞
　次に、図２を参照してカラム５０の詳細について説明する。以降、図中のＸ、Ｙ及びＺの各軸はカラム５０の構成機能を理解するために便宜的に示したものである。
　図２には正面視したカラム５０が示されている。カラム５０はカラム本体６０を備える。カラム本体６０は、少なくとも多孔質材５１と、多孔質材５１を収容する収容部５２と、フィルター５３ａ、ｂとを備える。カラム５０はさらに連結部５４、５５を備えてもよい。連結部５４はシリンジ３０に着脱可能である。連結部５５は微細流路２０の入口２１ａに着脱可能である。フィルター５３ａと連結部５４との間にチューブ５６を備えてもよい。
　以下、各構成の詳細について説明する。
＜２－１．多孔質材＞
　多孔質材５１は表面が多孔質性を有する材料である。換言すると、多孔質材５１の表面には多数の微細孔が形成されている。多孔質材５１は粒子でもよい。粒子は球状でもよい。粒子はビーズでもよい。本明細書においてビーズとは、各粒子が球状となるような手法で形成された粒子群をいう。なお、多孔質材５１は血液中で沈むものでもよい。多孔質材５１として用いられる粒子からは、必要に応じて小さい粒子がカットオフされていることが好ましい。カットオフとは、多孔質材の粒子からカットオフ径以下の粒子径を有する小さな粒子を予め除去することである。具体的には、メッシュによる篩い分け等で行うことができる。多孔質材のカットオフの詳細は、＜３．＞にて後述する。
　多孔質材５１が有する多孔質性の表面に接触させる血液は、他の液体によって希釈されていない全血でもよい。全血とは血液が血液成分ごとに分離されておらず、血球、血漿等の全ての成分を含んでいるものを言う。例えば多孔質材５１が全血中に含まれる浮遊細胞の一部と相互作用してもよい。相互作用する成分はそれ自体が微細流路２０の目詰まりとなるものであってもよい。相互作用する成分は微細流路２０の目詰まりを間接的に促進するものであってもよい。
　多孔質材が血漿中に含まれる成分と反応してもよい。例えば多孔質材が血漿中に含まれる成分と相互作用してもよい。
　多孔質材は多孔質ではないその他の材料と結合していてもよい。例えば多孔質ではない粒子が多孔質材でコートされていることで多孔質性の粒子となっていてもよい。粒子の中心は多孔質性でなくてもよい。粒子の中心は強磁性体でもよい。
　多孔質材の材質は多糖類でもよい。多孔質材の微細孔は多糖類で形成されたものでもよい。多糖類は架橋されていてもよい。多糖類はアガロース、デキストラン及びアリルデキストランのいずれかでもよい。多糖類は修飾されていてもよい。修飾はＤＥＡＥ（Diethylethanolamine）修飾でもよい。また、多孔質材の材質はシリカ又は樹脂でもよい。
　粒子状の多孔質材はゲル濾過クロマトグラフィーに用いることのできるものでもよい。ゲル濾過クロマトグラフィーとは移動相が水溶液であるサイズ排除クロマトグラフィーである。またこの時にＤＮＡを分画することができるものでもよい。多孔質材のＤＮＡに対する排除限界は４５塩基対以上であることが好ましい。多孔質材のＤＮＡに対する排除限界は１６５以上でもよく、以下でもよい。多孔質材のＤＮＡに対する排除限界は１０７８以上でもよく、以下でもよい。
　粒子状の多孔質材はタンパク質を分画することができるものでもよい。多孔質材のタンパク質に対する分画範囲の下限が１×１０４Ｄａ以上であることが好ましい。多孔質材のタンパク質に対する分画範囲の上限が４×１０６Ｄａ以上であることが好ましい。粒子状の多孔質材は少なくとも上記いずれかを満たすことが好ましい。
＜２－２．収容部＞
　図２に示すように、収容部５２は多孔質材５１を収容可能な構成である。収容部５２の形状としては、両端面が開口した端面であり例えば断面視円筒状や角筒状の中空状とすることができる。例えば収容部５２の形状を円筒状とした場合、収容部５２が角部を有さないことにより角部での多孔質材５１及び流す血液ＢＬの滞留を抑制できる。したがって、収容部５２の形状は円筒状とすることが特に好ましい。収容部５２の形状を断面視円筒状とする場合、当該断面形状には正円、略正円、楕円のいずれも含まれるものとする。
＜２－３．フィルター＞
　フィルター５３ａ、ｂは、多孔質材の粒子は通過できないが、微細流路で分級を行う血液などの所望の液体は通過できる網目構造を有する。すなわち、フィルター５３ａ、ｂは多孔質材の粒子をトラップする。多孔質材の粒子からは、カットオフ径以下の粒子径を有する小さな粒子が予め除去されているため、ある一定の粒子径以下の小さな粒子は排除されている。したがって、フィルター５３ａ、ｂは、多孔質材の粒子のカットオフ径、すなわち多孔質材の粒子に含まれる最小の粒子径より小さく、血球をはじめとする細胞は通過可能な網目構造を備えることが好ましい。ここで、細胞の大きさは、例えば大きいもので１２μｍ程度である。したがって、例えば、各網目構造が２０～４０μｍの径、特に好ましくは２０μｍ径を有するフィルターを用いることができる。すなわち、網目構造の径が揃っていることが好ましい。当該網目構造を備えることにより、フィルター５３ａ、ｂによって多孔質材の粒子がカラム本体６０の外部へと漏れ出すことを抑制できる。
　ここで、本明細書における「網目構造」とは、フィルター５３ａ、ｂの目開きのことを意味する。網目構造は、直線が縦横に交差するように配置され構成されたものと、多角形が繰り返し配置されたものの両者を含む。直線が縦横に交差するように配置されたもののとして、例えば、格子状のものを含む。網目構造は、円形が繰り返し配置されたものでもよい。
　フィルターは、フィルター５３ｂとして示すように、収容部５２の両端のうち少なくとも微細流路２０の入口２１ａ側に配置できる。すなわち、フィルター５３ｂはカラム５０中の血液の流れの下流側に配置することができる。また、フィルター５３ａ、ｂは収容部５２の両端に配置することもできる。すなわち、フィルター５３ａ、ｂは、カラム５０中の血液の流れの上流側および下流側の両方に配置することができる。つまりフィルター５３ａ、ｂは、収容部５２の両端面に位置する開口端面の全面を完全に覆うように配置できる。フィルター５３ａ、ｂの外径は、収容部５２の開口端面の全面を完全に覆うために少なくとも収容部５２の外径以上の径を有することが好ましい。フィルター５３ａ、ｂを収容部５２の両端面に配置することによって、血液ＢＬは収容部５２に充填された多孔質材５１に接触しつつ、多孔質材５１が外部へ漏れ出ることを抑制できる。
＜２－４．連結部＞
　連結部５４、５５は、カラム本体６０をカラム５０の上流に位置するシリンジ及び下流に位置する微細流路へと連結するための部材である。図２に示すように、連結部５４はシリンジ３０に着脱可能な構成である。連結部５５は微細流路２０の入口２１ａに着脱可能な構成である。連結部５４、５５の形状は特に限定されないが、各構成へと着脱容易な構成とすることが好ましい。例えば、連結部５４は、シリンジ３０の先端の凸部の形状に嵌まる凹部を備える形状とすることができる。
　例えば、連結部５５は、微細流路２０の入口２１ａの凹部に対応する凸部を備える形状とすることができる。また、各凸部及び凹部の表面にネジ状の溝を設け、互いに回転させ連結することもできる。このような構成とすることにより、カラム５０と微細流路２０とを確実に連結することができ、操作性が向上する。
　連結部５４、５５の形状は例えば一度シリンジ３０や入口２１ａへと連結を行うと取り外すことができない構成としてもよい。取り外し不可の構成とした場合、より確実に連結でき、各連結部にシリンジ３０からの圧力がかかった場合においても、連結部を流れる血液が外部へと漏れ出にくい。すなわち、連結部における水密性を向上させることができる。
＜２－５．チューブ＞
　図２に示すように、一態様ではフィルター５３ａと連結部５４との間にチューブ５６を備える。チューブ５６は可撓性を有していてもよく、例えばシリコン樹脂チューブやポリ塩化ビニルのチューブ等を用いることができる。チューブ５６を備えることによって、血液を送り込むシリンジからカラム本体６０までの距離を取ることができる。例えばチューブ５６上にピンチバルブを設けてもよい。また、カラム５０を微細流路２０中に配置する場合は、フィルター５３ｂと連結部５５との間に別途チューブを設けてもよい。なお、シリンジ３０からカラム本体６０までの距離が短い場合、チューブ５６は備えなくてもよい。チューブ５６を備えず、＜２－４．＞にて説明した連結部５４を備える場合、例えばフィルター５３ａに連結部５４が直接連結された構成とすることも可能である。
＜３．多孔質材の粒子のカットオフ＞
　次に、図３を参照して多孔質の粒子の粒径分布について説明した後、多孔質材の粒子のカットオフについてより詳細に説明する。カットオフとは、多孔質材の粒子から小さい粒子を取り除くことを意味する。
　図３には多孔質の粒子の粒子径分布が体積基準の積算分布で示されている。多孔質材の粒子は粒子径分布を有する。多孔質材の中央粒子径ｄ５０Ｖ（Median particle size of the cumulative volume distribution）は体積基準の積算分布における中央粒子径である。粒子が多糖類からなる場合、粒子が緩衝液中で膨潤した状態における粒子径を基準とする。粒子径の測定例はレーザ回折・散乱法で求めた有効径やコールター法で求めた球体積相当径である。
　図３において、中央粒子径ｄ５０Ｖは５００μｍ未満であることが好ましい。中央粒子径ｄ５０Ｖは好ましくは２５～２８０μｍ、より好ましくは２５～１６５μｍ、さらに好ましくは４５～１６５μｍである。中央粒子径ｄ５０Ｖがかかる範囲にあることで、多孔質材の表面積を、血液との接触に好適なものとすることができる。
　図３において多孔質材の粒子からは、必要に応じて小さい粒子がカットオフされていることが好ましい。一態様において、カットオフ径ＣＦ以下の粒子径を有する小さな粒子が予め除去される。すなわち、カットオフ径ＣＦは多孔質材の粒子に含まれる最小の粒子径を意味する。カットオフ径ＣＦの範囲は２５～１００μｍである。カットオフ径ＣＦの範囲は２５～７０μｍであり、好ましくは４０～７０μｍである。小さな粒子の除去はメッシュによる篩い分けで行うことが好ましい。例えばセルストレーナーを用いて多孔質材の粒子の集団から小さな粒子を除去してもよい。小さな粒子が除去されていることで、血中に混ざった多孔質材中の小さな粒子による微細流路の目詰まりを抑制できる。
　微細流路の種類によっては微細流路に進入した多孔質材中の小さな粒子が何事もなく微細流路から流し出される。そのような微細流路では小さな粒子による目詰まりを考慮しなくてもよい。しかしながらそのような微細流路でも血中の何らかの化学的成分による目詰まり（後に述べるデブリ）は生じることがある。したがってそのような微細流路に対しても、多孔質材の粒子を適用することは目詰まりの抑制に有効であり、また多孔質材の粒子において小さな粒子をカットオフしているか否かに関わらない。
　元の粒子から小さな粒子が除去されると元の粒子の粒子径分布が変わる。すなわちカットオフにはサイズセレクションの効果がある。サイズセレクション後は中央粒子径も変化する。便宜上、本明細書において中央粒子径ｄ５０Ｖは、カットオフにより元の粒子から小さな粒子を除去する前の粒子径分布に基づくものとする。
　以上が本発明に係る血液分離用デバイスである。
　カラムと微細流路とは別体として構成されてもよい。使用時に、カラムと微細流路とを組み合わせて１つの血球分離用デバイスとして使用することができる。カラムと微細流路とは、例えば上述の凹凸構造を備える連結部によって連結することができる。また、例えば凹凸構造の表面にネジ状の溝を備える連結部によっても連結することができる。
　また、カラムと微細流路とは一体として構成されてもよい。例えば微細流路の入口に連結されたカラム構造を備える構造としてもよい。また、本発明に係る血液分離用デバイスは、シリンジと一体型のカートリッジとしてもよい。さらにこのカートリッジを、微細流路を駆動するための駆動装置に接続するか、又は駆動装置内部に配置するなどして用いてもよい。
　以下、図４～図７を参照して血液分離用デバイスを用いた血液の分級過程の詳細について説明する。
＜４．血液の流れの概略＞
　以下、図４を参照して血液分離用デバイス内部の血液の流れを説明する。図では、血液分離用デバイスを正面側から断面視している。白抜き矢印は血液ＢＬの一連の流れを示す。本例の流路チップ７０は微細流路２０及びこれと同等の微細流路からなる８層を有する。流路チップ７０の最上層は、微細流路２０の入口２１ａに接続する入口７１を取り付けた板状のシートからなる。入口７１は、流路チップ７０の微細流路２０の入口２１ａとその他の微細流路の入口とを束ねる入口である。流路チップ７０はその最下層に、微細流路２０の出口２２ｃに接続する出口７２を備える。出口７２は、流路チップ７０の微細流路２０の出口２２ｃとその他の微細流路の出口とを束ねる出口である。白抜き矢印が示すように、シリンジ３０から送られた血液ＢＬは、カラム５０を通過する。カラム５０内での血液ＢＬのふるまいは図５を用いて後述する。
　以下、流路チップ７０のうち、最上層の微細流路２０について説明する。他の層も微細流路２０と同様の構成を備える。図４に示すように、カラム５０と入口７１を通過した血液ＢＬは、入口２１ａより微細流路２０内に入る。微細流路２０中に入った血液ＢＬは、積層された微細流路２０の各層に形成された主流路２３に入る。流路パート２５ａはフィルターの役割を果たすピラー密集帯１１、１３と、区画１２、１４とを備える。図４では、ピラー密集帯１１、１３は縦線のハッチングで示す。流路パート２５ａの詳細は図６を用いて後述する。つまり、微細流路２０は、ピラー密集帯１１、１３と、当該ピラー密集帯１１、１３の下流に位置する水力学的流路とを備える平面的なチップで作られている。
　図４において、流路パート２５ａを通過した血液は続いて図１に示した流路パート２５ｂ－ｄを通過する。これにより微細流路２０は血液に含まれる浮遊細胞を分級する。流路チップ７０中の下層の微細流路も同様に浮遊細胞を分級する。分級された浮遊細胞のうち出口２２ｃを経由した先の出口７２には画分Ｆ３が到達する。浮遊細胞を分級する過程の詳細は図７を用いて後述する。
＜５．カラムと血液との相互作用＞
　以下、図５を参照し、カラムと血液との相互作用を説明する。図５は図４のエリアＶで示すカラム５０の拡大正面断面図である。図５にはカラムと血液との相互作用の様子が示されている。
　図５では説明を簡単にするため、微細流路２０と微細流路の下層の流路を代表する微細流路８０との合計２層のみを示す。
　図５では血液の流れを黒矢印で示す。血液ＢＬは無核赤血球２７、有核細胞２９ａ－ｃ及び沈殿原因物質ＣＣを含む。有核細胞２９ａ－ｃはそれぞれ大きさが異なる細胞である。沈殿原因物質ＣＣは、微細流路２０及び微細流路８０の詰まり（デブリ）の一因と推測される物質である。
　図５に示すように、シリンジ３０から所定の流量で送られた血液ＢＬは、カラム５０のカラム本体６０を通過する。図５に示すように、多孔質材５１中を沈殿原因物質ＣＣが通過する。ここで多孔質材５１は、血液中に含まれる沈殿原因物質ＣＣと相互作用することで、これらの沈殿性を大幅に低下させる。十分量の多孔質材５１を用いることで、沈殿原因物質ＣＣが微細流路２０のゲル状のデブリをほとんど形成しない程度までその沈殿性を低下させることが好ましい。多孔質材５１が沈殿原因物質ＣＣを吸着することで微細流路２０及びその他の微細流路の詰まり（デブリ）の発生を抑制してもよい。一方、無核赤血球２７及び有核細胞２９ａ－ｃは多孔質材５１の隙間を流れていく。したがって多孔質材５１は血球の流れを妨げない。
＜６．ピラー密集体＞
　カラム５０を通過した血液は続いて主流路２３が備えるピラー密集帯１１を通過する。以下、図６を参照し、ピラー密集帯について説明する。
　図６には図１のエリアＶＩで示す微細流路の観察像（上段）及びそのスケッチ（下段）が示されている。図６を参照してピラー密集帯１１について説明する。図６は実施例の観察像でもある。実施例については後述する。
　図６に示すピラー密集帯１１はフィルターの役割を果たす。ピラー密集帯１１は血液中の不純物、例えば血球よりも大きな不溶成分がピラー密集帯１１の下流の流路パートに入り込まないようにする。また凝集塊となっている血球があれば、一つ一つの血球をバラバラにするという役割を果たす。ピラー密集帯１１は流路パート２５ａ中の血液の流れを横切るように設けられている。血液は図中の上流の左側から下流の右側に流れる（白抜き矢印で示す）。ピラー密集帯１１は流路パート２５ａの上面と下面とを連結している。各ピラーの形状は血液の流れに対して大きな抵抗となる形状ではない。すなわち、各ピラーの形状は流体に対する抵抗が少なくなる形状が好ましく、例えば平面視で円状、楕円状、流線形を有する滴型とすることができる。図６では一例として滴型のピラーを示したがこれに限定されるものではない。またピラー密集帯１１は血液の流速を著しく低下させるものではない。
　図６において流路パート２５ａは区画１２を有する。区画１２はピラー密集帯１１の下流側でピラー密集帯１１と隣り合う。区画１２ではピラーが疎になっている。流路パート２５ａはピラー密集帯１３をさらに備える。ピラー密集帯１３はピラー密集帯１１から見た下流方向においてピラー密集帯１１の次に位置するピラー密集帯である。ピラー密集帯１３の構成はピラー密集帯１１と同等であってもよい。
　図６において、区画１２はピラー密集帯１１と、ピラー密集帯１３と、流路パート２５ａの側壁すなわち微細流路の側壁とによって囲まれている。流路パート２５ａはさらに区画１４を有する。区画１４はピラー密集帯１３の下流側でピラー密集帯１３と隣り合う。流路パート２５ａは区画１４の下流にもさらにピラー密集帯を備える。符号１５、１７は実施例にて説明する。
＜７．微細流路の浮遊細胞分級過程＞
　流路パート２５ａが備えるピラー密集帯１１を通過した血液に含まれる浮遊細胞は、続いて流路パート２５ｂ－ｄにおいて分級される。以下、図７を参照し、微細流路の浮遊細胞分級過程について説明する。
　図７には平面視した微細流路２０が示されている。図は微細流路２０による浮遊細胞の分級の過程を模式的に表している。説明を簡単にするため、枝流路２６ａには１０本の細流路が、枝流路２６ｂには３本の細流路が示されている。
　図７に示すように、流路パート２５ｂのさらに上流である流路パート２５ａ（図７では不図示）から血液ＢＬが連続的に流れてくる。血液ＢＬは細胞を大量に含んでいる。血液ＢＬの流れに対して、その側方より清澄液ＣＬの流れを連続的に接触させる。これにより主流路２３を流れる細胞を、主流路２３の側方から連続的に押し込む。結果として血液ＢＬの流れは清澄液ＣＬの流れとは反対側に連続的に押し込まれる。流路パート２５ｂ－ｃにおいて、枝流路２６ａ及び２６ｂ側に連続的に浮遊細胞が押しやられるとともに、これらの枝流路に浮遊細胞が連続的に流れ込む。
　図７に示すように、枝流路２６ａには無核赤血球２７が連続的に流れ込む。流路パート２５ｂにおいて血液ＢＬ中の無核赤血球２７を水力学的に分級する。分級は血液ＢＬの流れのうち、清澄液ＣＬの流れとは接触していない側で連続的に行われる。
　図７に示すように、枝流路２６ａは無核赤血球２７の除去流路として働く。枝流路２６ａの有する細流路の内接径は１２～１９μｍである。内接径は１３、１４、１５、１６、１７、及び１８μｍのいずれかでもよい。
　図７に示すように枝流路２６ｂには有核細胞２９ａ－ｃが連続的に流れ込む。流路パート２５ｂの下流の流路パート２５ｃにおいて、血液ＢＬ中の有核細胞２９ａ－ｃを水力学的に分級する。分級は血液ＢＬの流れのうち、清澄液ＣＬの流れとは接触していない側で連続的に行われる。特に枝流路２６ｂより有核細胞の細胞懸濁液を連続的に得る。
　図７に示すように枝流路２６ｂは有核細胞２９ａ－ｃの回収流路として働く。枝流路２６ｂの有する細流路の内接径は２０～３０μｍである。内接径は２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８及び２９μｍのいずれかでもよい。有核赤血球を初めとする有核細胞の径の大きさは１１～１３μｍと考えられる。
　図７に示す枝流路２６ａ及び２６ｂの各細流路の内接径は細流路の直交断面における内接円の直径である。細流路の断面は四角形でも他の多角形でも円でもよい。他の枝流路において同様である。枝流路２６ａ及び２６ｂに取り込まれなかった浮遊細胞や血漿はフロースルーＦＴとして連続的に流路パート２５ｄを通過する。その後、図１において出口２２ｃに到達する。例えば凝集した血球などがフロースルーＦＴに含まれる。
　以上により、枝流路２６ａからはある大きさ以上の浮遊細胞を含まない流体を回収することができる。結果として無核赤血球２７がここで分級を受ける。また有核細胞２９ａ及びその他の有核細胞は下流で分級を受ける。
　以上が一実施形態に係る血液分離用デバイスを用いて分級を行う一連の流れである。
＜実施例＞
　本実施例では、図６、８及び９を参照し、カラムによる微細流路の目詰まり解消効果を調べた実施例及び比較例とその効果を説明する。
　本実施例の一連の流れは次の（１）～（５）の通りである。
（１）多孔質の粒子であるビーズに含まれる小さな粒子のカットオフを行う。
（２）血液に蛍光パーティクルをスパイクして試料血を得る。
（３）血液を血液分離用デバイスに流し、分級する。
（４）分級後、Ｆ１－Ｆ３分画を回収し、蛍光パーティクルの回収率を評価する。
（５）分級中の血球分離チップの目詰まり率を評価する。
　上記（１）～（３）は実施例で行う分級の説明である。（４）は分級の結果得られたデータの評価である。（５）は分級中に得られたデータの評価である。
（１－１．）カットオフ
　本実施例では多孔質の粒子に対して小さな粒子のカットオフを行う。本実施例では多孔質の粒子としてビーズのSepharose CL-6Bを用いる。Sepharoseは商標である。Sepharose CL6Bのゲルマトリックスは６％架橋アガロースからなる球状体である。カットオフ前の粒子径は４５～１６５μｍである。１ｍＬのビーズをナイロン製のセルストレーナー（FALCON、商標）に入れる。スターラーで撹拌しながら一晩かけてビーズに対する濾別を行う。濾別にかける時間は数時間から２４時間でもよい。濾別は蒸留水中で行う。セルストレーナーのメッシュサイズは４０μｍ、７０μｍ及び１００μｍである。濾別は各メッシュサイズのセルストレーナーごとに行う。ここでは７０μｍメッシュのセルストレーナーの使用例について詳述する。セルストレーナーのメッシュサイズがカットオフ径に対応する。カットオフにより濾別された大きな粒子をカラムに収容し、前処理に用いる。なおメッシュサイズが小さいほど、メッシュ上に濾別される粒子の数が増える。ビーズの洗浄をＰＢＳで２回行う。
　各ビーズを、ビーズと同体積の清澄液で懸濁する。２ｍＬの清澄液に対してビーズの懸濁液２０μＬを添加して、これらをよく混合する。清澄液はＰＢＳをベースにした緩衝液である。ビーズと清澄液の混合液を、さらに清澄液に添加する。清澄液の一部を予め血球分離チップに流すことで事前に血球分離チップの内部を緩衝液に浸す。血球分離チップを浸す処理は４０分行う。
（１－２．）カットオフ径の評価
　分級を終えた血球分離チップを顕微鏡で観察する。１００μｍのビーズをカラムに入れて血液を前処理した場合、流路パート２５ａの内部や入口２１ａの近傍でデブリが観察された。流路はデブリによってやや目詰まりを起こしていた。これに対し、カットオフ径７０μｍ及び４０μｍのビーズで前処理した場合デブリは見られなかった。また２時間４０分にわたって試料血の分級を続けたが流路の目詰まりが見られなかった。デブリによる流路の目詰まりに対する抑制効果を得るにはカットオフ径を７０μｍ以下とするのが望ましいことが分かった。カットオフ径は６０μｍでもよく、５０μｍでもよい。
　なおカットオフ径４０μｍ、７０μｍ及び１００μｍのいずれの場合においても、試料血は全量を血球分離チップで処理することができた。デブリによって血球分離チップが目詰まりし分画できない試料血が余ることはなかった。以下の試験ではカットオフ径７０μｍを採用する。
　カットオフを行ったビーズをカラムの収容部に収容する。カラムには例えばカットオフ径７０μｍのビーズを５０μＬ収容する。
（２）血液への蛍光パーティクルのスパイク
　本実施例における「血液」とは、健康なヒトの成人から採取した全血である。血液を採取する際に用いる採血管には、血液凝固を抑制するクエン酸およびEDTAが含まれる。指定量の血液を採血管内に採取することで、自動的に適切な分量のクエン酸およびEDTAが血液中に添加される。採血後４℃で保存されていた３日目の全血に対して蛍光パーティクルをスパイクすることで試料血を得る。ここでスパイクとは細胞か細胞を模したものを微量加えることをいう。「蛍光パーティクル」とは、妊婦血に含まれる微量の胎児由来有核赤血球を模した球状の粒子である。例えば図５では有核細胞２９ａ－ｃに相当するものである。得られた試料血に清澄液（ＰＢＳをベースにした緩衝液）を加え、５倍に希釈する。本実施例では直径の異なる２種類の蛍光パーティクルを血液にスパイクする。具体的には直径８．４２μｍと直径１０μｍの樹脂製の蛍光パーティクルを血液にスパイクする。直径８．４２μｍの蛍光パーティクルとして、Spherotech社のFITC Particles (cat#F1CP-80-2)を用いる。１０．０μｍの蛍光パーティクルとして、Invitrogen社の FluoSpheres（商標） polystyrene microspheres, 10 μm, blue fluorescent (365/415)を用いる。希釈血１ｍＬに対し、直径８．４２μｍと直径１０μｍの、直径の異なる各蛍光パーティクルをそれぞれ６０個ずつ合計１２０個スパイクする。なお、蛍光パーティクルのスパイク後に全血の希釈を行ってもよい。例えば、全血１ｍＬに対し、直径８．４２μｍと直径１０μｍの、直径の異なる各蛍光パーティクルをそれぞれ３００個ずつスパイクし、５倍に希釈してもよい。
（３）血球分離チップによる分級
　希釈した試料血をカラムに通すことで前処理を行い、１層の血球分離チップによって分級し、蛍光パーティクルを回収する。分級の結果を図１及び図６に沿って説明すると画分Ｆ２にはリンパ球を含む白血球が多く得られる。画分Ｆ１に無核の成熟赤血球が多く得られる。なお血球分離チップに流入した細胞は大部分（＞９９．９％）が画分Ｆ１に流出する。Ｆ３には多くの血球は得られない。蛍光パーティクルはリンパ球様であるから画分Ｆ２に含まれることが期待される。
　実施例、比較例１及び比較例２において流す試料血は上記（２）で述べた通りであり、同条件である。シリンジから試料血を送る速度を２０μＬ／分とする。シリンジから清澄液を送る速度を４０μＬ／分とする。分級開始後９０分、試料血を１．８ｍＬ流した時点において、Ｆ１～Ｆ３分画蛍光パーティクルからなる画分から蛍光パーティクルを回収し、回収率を求める。
　実施例と、比較例１及び比較例２とで異なる点は、血液分離用デバイスのカラムの構成である。
　実施例のカラムはCL-6Bビーズ及びフィルターの両方を備える。カラムにはカットオフ径７０μｍのCL-6Bビーズが５０μＬ充填されている。フィルターの網目は格子状であり、２０μｍ径である。
　比較例１はカラムを備えない。すなわち、比較例１ではCL-6Bビーズ及びフィルターの両方を備えない。試料血は直接血球分離チップへと導入される。
　比較例２のカラムはCL-6Bビーズが充填されていない。すなわち、比較例２のカラムはフィルターのみを備え、CL-6Bビーズは備えない。フィルターの網目は実施例と同様格子状であり、２０μｍ径である。
（４）蛍光パーティクルの回収率の評価
　蛍光パーティクルの回収率は、以下の式１を用いて求めることができる。
［式１］
［蛍光パーティクル回収率（％）］＝（一定時間に回収された蛍光パーティクルの数）／（一定時間内に分画された血球に含まれている蛍光パーティクル数の期待値）＊１００
　「一定時間に回収された蛍光パーティクルの数」は実際に測定することで見つかった蛍光パーティクルの数である。
　上記［式１］の「一定時間内に分画された血球に含まれている蛍光パーティクル数の期待値」は以下の式２を用いて求めることができる。
［式２］
［一定時間内に分画された血球に含まれている蛍光パーティクル数の期待値（個）］＝｛（一定時間内に分画された血球数（cells））／（全血１ｍＬあたりの血球数（cells/mL））｝＊（蛍光パーティクルを５倍希釈血に加えた時点での全血１ｍＬあたりの蛍光パーティクルの個数（個／ｍＬ））
　実施例及び比較例１、２の蛍光パーティクルの回収率を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例について、表１の上段にはカットオフ径７０μｍのCL-6Bビーズ、試料血を９０分間流した場合の蛍光パーティクルの回収率が示されている。Ｆ１～Ｆ３からなる画分から測定により見つかった蛍光パーティクルの数は、直径８．４２μｍの蛍光パーティクルが７６個、直径１０．０μｍの蛍光パーティクルが８５個である。画分Ｆ１～Ｆ３からなる画分から見つかった血球数は１．２７×１０９個である。蛍光パーティクルを加える前の全血の１ｍＬあたりの血球数は４．４２×１０９個である。蛍光パーティクルを５倍希釈血に加えた時点での全血１ｍＬあたりの蛍光パーティクルの個数は直径８．４２μｍのものが３１３個、直径１０μｍのものが２６８個である。以上の測定値より上記計算式［式１］及び［式２］を用いて求めた蛍光パーティクルの回収率は、直径８．４２μｍのものは８４．５％であり、直径１０μｍのものは１１０．４％であった。
　比較例１について、表１の中段にはカットオフ径７０μｍ、試料血を９０分間流した場合の蛍光パーティクルの回収率が示されている。Ｆ１～Ｆ３からなる画分から測定により見つかった蛍光パーティクルの数は、直径８．４２μｍの蛍光パーティクルが１１４個、直径１０．０μｍの蛍光パーティクルが１３１個である。画分Ｆ１～Ｆ３からなる画分から見つかった血球数は１．７０×１０９個である。蛍光パーティクルを加える前の全血の１ｍＬあたりの血球数は４．４２×１０９個である。蛍光パーティクルを５倍希釈血に加えた時点での全血１ｍＬあたりの蛍光パーティクルの個数は直径８．４２μｍのものが３０７個、直径１０μｍのものが２９７個である。以上の測定値より上記計算式［式１］及び［式２］を用いて求めた蛍光パーティクルの回収率は、直径８．４２μｍのものは９６．６％であり、直径１０μｍのものは１１４．７％であった。
　比較例２について、表１の下段にはカットオフ径７０μｍ、試料血を９０分間流した場合の蛍光パーティクルの回収率が示されている。Ｆ１～Ｆ３からなる画分から測定により見つかった蛍光パーティクルの数は、直径８．４２μｍの蛍光パーティクルが１３３個、直径１０．０μｍの蛍光パーティクルが１２７個である。画分Ｆ１～Ｆ３からなる画分から見つかった血球数は１．７１×１０９個／ｍＬである。蛍光パーティクルを加える前の全血の１ｍＬあたりの血球数は４．４２×１０９個である。蛍光パーティクルを５倍希釈血に加えた時点での全血１ｍＬあたりの蛍光パーティクルの個数は直径８．４２μｍのものが３１３個、直径１０μｍのものが２８９個である。以上の測定値より上記計算式［式１］及び［式２］を用いて求めた蛍光パーティクルの回収率は、直径８．４２μｍのものは１０９．８％であり、直径１０μｍのものは１１４．３％であった。
　カットオフ径７０μｍのCL-6Bビーズを用いた場合、胎児由来有核赤血球の代替として用いた蛍光パーティクルの回収率はいずれも８０％以上であったことから、回収率は十分に高いものと判断される。
　本実施例は胎児由来有核赤血球の濃縮のモデル実験として行われる。上記の結果からカラムを用いた前処理は胎児由来有核赤血球の濃縮において有用であることが示される。具体的には血球分離チップの目詰まりを抑制することで長時間の分級を行うことができることが示される。本実施例の血液分離用デバイスを用いた方法により長時間の分級を行うことで大量の試料血を処理することができる。このことは一回の処理あたりの胎児由来有核赤血球の取得量が大きいことを示す。
（５）血球分離チップの目詰まり率の評価
　以下、血球分離チップの目詰まり率の評価について、図６、８及び９を参照し説明する。
　上記（４）で分級を終える前に、血液をチップに流している状態で図１の微細流路２０（血球分離チップ、以下チップ）の画像データを取得する。当該取得した画像データについて画像解析を行うことによって目詰まり率の評価を行う。具体的には、図１のチップの主流路２３（流路パート２５ａ）を評価する。本実施例と、比較例１及び比較例２とにおける流路パート２５ａの評価は、試料血を流し始めてから３０～９０分後に行う。実施例では目詰まりは観察されず、比較例１及び２において目詰まりが観察された。以下、目詰まりが生じた比較例１を示す図８を参照し、具体的な目詰まり率の評価方法について説明する。
　図８には比較例１における流路パート２５ａの観察像（上段）及びそのスケッチ（下段）が示されている。図８は図１のエリアＶＩで示した部分の拡大図である。目詰まり率の評価は区画１２に対して行う。USBカメラ（ホーザン株式会社）の下に試料血を流し続けている状態のチップを配置する。チップを平面視しながら観察像を取得する。チップをHOZAN USB cam softwareで撮影して図８の上段に示す画像データを得る。画像データはImageJソフトウェアに読み込み、同ソフトウェア上で解析する。
　図８において画像データ中から区画１２に相当するエリア１５を切り取る。エリア１５中の総ピクセル数を区画１２の総面積として取り扱う。エリア１５中のデブリ部１６を目視により流動部１７と区別する。デブリ部１６はピラー密集帯１１を起点に蓄積したデブリで占められている。「デブリ」とは、試料血に含まれる沈殿原因物質ＣＣ（図５参照）から形成されたゲル状の物質である。このデブリがピラー密集帯１１の中にまで入り込むとピラー密集帯１１の目詰まりの原因となる。デブリ部１６によって血球の流れが押しのけられる。これに対して流動部１７では血球がスムーズに流れている。
　図８において目視によりデブリ部１６と流動部１７との間に線を引く。エリア１５からデブリ部１６を除いた部分、すなわち流動部１７のピクセル数の総和を得る。これを流動部１７の面積として特定する。エリア１５の総面積から流動部１７の面積を減算して、デブリ部１６の推定面積を得る。この推定面積をデブリ面積とする。区画１２の総面積に占めるデブリ面積を百分率で求める。かかる値を目詰まり率とする。
　図９には比較例２における流路パート２５ａの観察像（上段）及びそのスケッチ（下段）が示されている。図６には実施例１における流路パート２５ａの観察像（上段）及びそのスケッチ（下段）が示されている。
　上述の通り（（４）参照）、比較例１、比較例２及び実施例のカラムの条件は以下の通りである。
　比較例１はカラムを備えない。すなわち、比較例１ではCL-6Bビーズ及びフィルターの両方を備えない。試料血は直接血球分離チップへと導入される。
　比較例２のカラムはCL-6Bビーズが充填されていない。すなわち、比較例２のカラムはフィルターのみを備え、CL-6Bビーズは備えない。フィルターの網目は格子状であり、２０μｍ径である。
　実施例のカラムはCL-6Bビーズ及びフィルターの両方を備える。カラムにはカットオフ径７０μｍのCL-6Bビーズが５０μＬ充填されている。フィルターの網目は格子状であり、２０μｍ径である。
　実施例及び比較例１、２の血球分離チップの目詰まり率を以下の表２に示す。当該目詰まり率は、試料血を９０分間流した時点における目詰まり率である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、CL-6Bビーズ及びフィルターの両方を備えない比較例１では、目詰まり率は４６．６％であった。また、フィルターのみを備え、CL-6Bビーズは備えないカラムを有する比較例２では、目詰まり率は９６．５％に上昇し、区画１２のほとんどが目詰まりを起こしていた。これは、フィルター単体では目詰まりを抑制しないことを示している。図８及び図９に示すように、各比較例ではピラー密集帯１１からデブリが連なるようにして目詰まりを生じていることが推察される。さらに、比較例２では比較例１に比べて目詰まり率が上昇していることから、フィルターによってデブリの原因である沈殿原因物質が発生しやすくなることが考えられる。
　これに対し、CL-6Bビーズ及びフィルターの両方を備えるカラムを有する実施例ではデブリが観察されず、目詰まり率は０．０％であった。以上の結果より、CL-6Bビーズ及びフィルターを備えるカラムは、デブリの発生を抑制することができる。したがって、目詰まりの解消に適した血液分離用デバイスを提供することが可能となる。さらに、本実施例及び各比較例において使用した血液は、採血後３日経過した血液である。そのような血液であっても、少量のビーズを用いることによって胎児由来有核赤血球等の稀少細胞を回収することが可能となる。
＜参考例＞
　図１０は、カラムを用いずに分級を行っている様子を表す参考例である。図は、微細流路２０に血液ＢＬとともに多孔質材５１を流し入れる様子を示す部分正面断面図である。血液ＢＬは無核赤血球２７、有核細胞２９ａ－ｃ及び沈殿原因物質ＣＣを含む。多孔質材５１は例えば沈殿原因物質ＣＣと相互作用し、微細流路２０中の目詰まり解消効果を備えるものである。
　図１０において、微細流路８０は図５で説明した下層の微細流路である。微細流路８０は入口８１ａと主流路８３とを備える。入口８１ａは微細流路２０の入口２１ａと同等である。主流路８３は微細流路２０の主流路２３と同等である。
　図１０では血液の流れを黒矢印で示す。血液ＢＬは微細流路２０の入口２１ａを経由して主流路２３へと入る。血液ＢＬの流し始めは、多孔質材５１が入口８１ａに溜まる。入口２１ａには溜まらない。主流路２３や主流路８３には多孔質材５１は進入しない。すなわち、血液ＢＬの流し始めでは、入口８１ａに充填された多孔質材５１が血液ＢＬと相互作用する。その一方で、入口２１ａでは多孔質材５１が充填されていないので多孔質材５１による目詰まり解消効果を得られない可能性がある。つまり、血液ＢＬとともに流し入れる多孔質材５１の量が少ない場合、流路チップ７０の上部において多孔質材５１による微細流路２０中の目詰まり解消効果にばらつきが生じ得る可能性がある。これに対し、カラムにCL-6Bビーズ及びフィルターの両方を備える実施例では、血液ＢＬが主流路２３に入る前に血液ＢＬとCL-6Bビーズとが反応するため、分級される前に沈殿原因物質を除去することができる。したがって特にビーズの量が少ない場合に本実施例に係るカラムを備える血液分離用デバイスは有利である。
　なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。例えば血球分離用デバイスはその他の血液用デバイスであってもよい。一例において、血液用デバイスはカラムと、カラムの下流に位置する微細流路とを備える。カラムは多孔質材を固定相として備える。多孔質材と接触した血液が微細流路に流れる。一例において、血液用デバイスは血液分析デバイスである。血液は微細流路内で物理的にあるいは化学的に分析される。
　この出願は、２０１９年１０月２３日に出願された日本出願特願２０１９－１９２４２０を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
１　血球分離用デバイス、１１　ピラー密集帯、１２　区画、１３　ピラー密集帯、１４　区画、１５　エリア、１６　デブリ部、１７　流動部、２０　微細流路、２１ａ，ｂ　入口、２２ａ－ｃ　出口、２３　主流路、２５ａ－ｄ　流路パート、２６ａ，ｂ　枝流路、２７　無核赤血球、２８　合流部、２９ａ－ｃ　有核細胞、３０　シリンジ、３５　シリンジ、５０　カラム、５１　多孔質材、５２　収容部、５３ａ、ｂ　フィルター、５４　連結部、５５　連結部、５６　チューブ、６０　カラム本体、７０　流路チップ、７１　入口、７２　出口、８０　微細流路、８１ａ　入口、８３　主流路、ＢＬ　血液、ＣＣ　沈殿原因物質、ＣＦ　カットオフ径、ＣＬ　清澄液、Ｆ１－Ｆ３　画分

Claims (10)

  1. 　カラムと前記カラムの下流に位置する微細流路とを備える血液用デバイスであって、
    　前記カラムは多孔質材を固定相として備え、
    　前記微細流路に前記多孔質材と接触した血液が流れる、
    　血液用デバイス。
  2. 　前記多孔質材は粒子からなり、
    　前記カラムは、前記多孔質材を収容可能な収容部をさらに備え、前記収容部の下流の前記微細流路に近い側に、前記多孔質材の粒子をトラップするフィルターをさらに備え、
    　前記多孔質材の粒子からは、カットオフ径以下の粒子径を有する小さな粒子が予め除去されており、
    　前記フィルターの目開きは、前記カットオフ径よりも小さい、
    　請求項１に記載の血液用デバイス。
  3. 　前記カットオフ径は２５～１００μｍの範囲にある、請求項２に記載の血液用デバイス。
  4. 　前記フィルターが有する網目の径は２０～４０μｍの範囲にあり、当該範囲はカットオフ径未満である、請求項２又は３のいずれか一項に記載の血液用デバイス。
  5. 　前記粒子は粒子径分布を有するとともに、その体積基準の積算分布における中央粒子径ｄ５０Ｖが２５～２８０μｍである、ただし前記粒子径分布はカットオフにより前記小さな粒子を除去する前の粒子径分布を表す、請求項２～４のいずれか一項に記載の血液用デバイス。
  6. 　前記収容部の上流の前記微細流路に遠い側に、前記多孔質材の粒子をトラップするフィルターをさらに備える、
    　請求項２～５のいずれか一項に記載の血液用デバイス。
  7. 　前記微細流路に前記多孔質材と接触した血液が流れると、前記微細流路が前記血液中の血球を水力学的に分級する、
    　請求項１～６のいずれか一項に記載の血液用デバイス。
  8. 　前記微細流路は、ピラー密集帯と前記ピラー密集帯の下流に位置する水力学的流路とを備える平面的なチップで作られており、
    　前記カラムが前記平面的なチップの表又は裏に対して接続し、
    　前記微細流路から前記血液用デバイスの外部に前記水力学的に分級された血球を放出する出口をさらに備える、
    　血球分離用の、
    　請求項７に記載の血液用デバイス。
  9. 　前記多孔質材は粒子からなり、
    　前記多孔質材の粒子は、多糖類、シリカ又は樹脂からなる多孔質性の表面を備える、
    　請求項１～８のいずれか一項に記載の血液用デバイス。
  10. 　前記血液用デバイスは前記カラムと前記微細流路とが別体として提供されるものであり、前記カラムは連結部を有し、前記微細流路は入口を有し、前記連結部と前記入口とを連結することによって前記カラムと前記微細流路とを一体化させてから血液を前記カラムより通す、請求項１～９のいずれか一項に記載の血液用デバイスの使用方法。
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