JP2021510200A - 半自動研究器具システム - Google Patents
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Abstract
電気泳動の間に分子を保持するためのカセットは、その中に構成されるレーンを伴う、筐体を有する。レーンは、第1の伸長縁と、第2の伸長縁とを有し、溶出モジュールは、レーンの中に受容され、レーンを第1のチャンバと、第2のチャンバとに分割するように構成される。第1の緩衝液リザーバが、第1の伸長縁に隣接して位置付けられ、第2の緩衝液リザーバが、第2の伸長縁に隣接して位置付けられる。第1のチャンバに面する溶出モジュールの第1の側は、多孔性滅菌濾過膜を備える。第2のチャンバに面する溶出モジュールの第2の側は、電気泳動の間に分子を保持するための細孔サイズを有する、限外濾過膜を備える。
Description
(関連出願の相互参照)
本願は、2018年1月5日に出願され、「A Semi−Automated Research Instrument System」と題された、米国仮出願第62/614,239号の優先権および利益を主張する。本願は、上記に参照される出願の開示を参照することによって、その全体として本明細書に明白に組み込まれる。
本願は、2018年1月5日に出願され、「A Semi−Automated Research Instrument System」と題された、米国仮出願第62/614,239号の優先権および利益を主張する。本願は、上記に参照される出願の開示を参照することによって、その全体として本明細書に明白に組み込まれる。
次世代配列決定(NGS)は、遺伝性遺伝子疾患の診断および腫瘍学における適切な療法の選択のために内科的治療においてますます使用されている。多くの遺伝性疾患および医療介入可能な癌遺伝子座が、タンパク質コード配列内で一塩基多型(SNP)であるため、最も臨床的な配列決定(すなわち、IlluminaおよびIon Torrent製プラットフォーム)が、ハイブリダイゼーションキャプチャ標的化サンプル調製(Agilent製SureSelct、Roche製Nimblegen、IDT製xGen)と組み合わせられたショートリード配列決定を使用して実行される。
しかしながら、ショートリードNGS法は、長さ100bpを上回るハプロタイプの決定、および本明細書では、欠失、重複、逆位、転座、リピート伸長を伴う再配列として定義される、構造多型(「SV」)の検出等の長域ゲノム解析にはあまり好適ではない。ショートリード法は、特に、SV切断点およびハプロタイプが、リピート配列の領域を伴うときに不利である。
これは、近年の大規模な患者コホートに関する研究が、いくつかのタイプの癌が、SNPではなくSVによって引き起こされるドライバ異変を含有することを示唆するため、臨床的配列決定分野に関して重大な問題を提示する(4)。癌の別の集団研究(全ゲノムの汎癌分析)は、52個の異なる遺伝子座において有意に再発したSVを見出した(10)。同様に、遺伝性疾患の有意(但し、まだ未知である)な割合が、ショートリード法によっては検出され得ない欠失、リピート伸長、および他のSVによって引き起こされるとする認識が高まりつつある(11、12)。最後に、4mb MHC領域全体を横断して拡張するハプロタイプ構造が、多くの複雑な免疫障害を解読するために重要となるであろうという蓄積する証拠が蓄積されつつある(13で精査される)。ここで再び、ショートリード法は、多型の離散点を同定し得るが、それらの間のつながりは、家系分析から(間接的に)推測され得るのみである。
SVおよび拡張ハプロタイプの信頼性のある検出は、Pacific Biosciences、Oxford Nanopore、10XGenomics、Bionanogenomics、およびGenomic Visionによって開発されたもの等のロングリード単一分子配列決定(または光学マッピング法)を要求する(2−12)。ショートリード遺伝子パネルおよびエクソーム配列決定の場合におけるように、臨床環境におけるロングリード配列決定の使用が、経済的理由のために、標的化配列決定に限定されるであろう可能性が高い。残念ながら、これらのロングリード配列決定法のための標的化サンプル調製は、従来の標的化ショートリード配列決定と比較されると、労力を要し、非効率的、かつ高価なままである。
種々の装置、システム、および方法が、本明細書に説明される。いくつかの実施形態では、電気泳動の間に分子を保持するための、分子保持カセットは、筐体と、筐体内に構成される、レーンとを含む。レーンは、第1の伸長縁と、第2の伸長縁とを有し得る。溶出モジュールが、レーンの中に受容されるように構成され得、レーンを第1のチャンバと、第2のチャンバとに分割し得る。第1の緩衝液リザーバが、第1の伸長縁に隣接して位置付けられ得、第2の緩衝液リザーバが、第2の伸長縁に隣接して位置付けられ得る。第1のチャンバに面する溶出モジュールの第1の側は、多孔性滅菌濾過膜を備え得、第2のチャンバに面する溶出モジュールの第2の側は、電気泳動の間に分子を保持するための細孔サイズを有する、限外濾過膜を備え得る。
いくつかの実施形態では、カセットはさらに、第1のチャンバ内に構成される、少なくとも1つの電極と、第2のチャンバ内に構成される、少なくとも1つの電極とを備え得る。
限外濾過膜は、15kDa限外濾過器であり得る。限外濾過膜の細孔サイズは、電気泳動の間にDNAを保持するように構成され得る。
溶出モジュールは、第1の緩衝液リザーバと第2の緩衝液リザーバとの間の中心に位置付けられ得る。溶出モジュールは、第1の緩衝液リザーバと第2の緩衝液リザーバとの間に位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、溶出モジュールは、溶出モジュールと、サンプルウェルとを備え得る。溶出モジュールは、サンプルを受容するように構成され得る。
カセットはさらに、アガロースゲルを含み得る。アガロースゲルは、多孔性滅菌濾過膜の隣に流し込まれ得る。アガロースゲルは、ゲルカラムを形成するように流し込まれ得、ゲルカラムの寸法は、第1のチャンバの中への標的分子の損失を最小限にさせるように構成される。
いくつかの実施形態では、電気泳動の間に分子を保持するための、分子保持カセットは、筐体と、筐体内に構成される、複数のレーンとを備える。複数のレーンはそれぞれ、第1の伸長縁と、第2の伸長縁とを有する。複数の溶出モジュールが、それぞれ、各レーンを第1のチャンバと、第2のチャンバとに分割するように、複数のレーンのあるレーンの中に受容されるように構成され得る。第1の緩衝液リザーバが、各レーンの第1の伸長縁に隣接して位置付けられ得、第2の緩衝液リザーバが、各レーンの第2の伸長縁に隣接して位置付けられ得る。各レーンの第1のチャンバに面する溶出モジュールの第1の側は、多孔性滅菌濾過膜を備え、各レーンの第2のチャンバに面する溶出モジュールの第2の側は、限外濾過膜を備える。限外濾過膜は、電気泳動の間に分子を保持するための細孔サイズを有する。
いくつかの実施形態では、標的粒子の標的区画を単離および収集するための方法は、溶出モジュールのサンプルウェルの中にサンプルを受容するステップを含み得る。SDS含有溶解緩衝液が、第1の緩衝液チャンバの中に受容され得、第1の緩衝液チャンバは、溶出モジュールの第1の側に沿って構成される。第1の電気泳動電圧が、標的粒子が、溶出モジュールと第2の緩衝液チャンバとの間の溶出モジュールの第2の側に沿って構成される、ゲル区画の中で不動化され、非標的粒子が、ゲル区画を通過し、第2の緩衝液チャンバの中に入るように印加され、サンプルの成分を、溶出モジュールの第2の側に沿って構成される、第2の緩衝液チャンバに向かって移行させ得る。第1の緩衝液チャンバ、第2の緩衝液チャンバ、および溶出モジュールは、洗浄され、Cas9反応緩衝液で充填され得る。溶出モジュールは、空にされ、Cas9酵素混合物で再充填され、ゲル区画内で不動化された標的粒子の区分を切断し得る。SDS停止液が、溶出モジュールの中に装填され得、第2の電気泳動電圧が、印加され、標的粒子からCas9を解放し、Cas9を第2の緩衝液チャンバの中に移行させ得る。第1の緩衝液チャンバ、第2の緩衝液チャンバ、および溶出モジュールは、洗浄され、溶出緩衝液で充填され得る。第3の電気泳動電圧が、逆方向に印加され、標的粒子の切断された区分をゲル区画から溶出モジュールの中に移行させ得る。
溶出モジュールの第1の側は、限外濾過器を備え得、溶出モジュールの第2の側は、多孔性滅菌フィルタを備え得る。多孔性滅菌フィルタは、標的粒子の切断された区分が、第3の電気泳動電圧の印加の間およびその後に、溶出モジュールから出ることを防止し得る。
標的粒子は、DNAであり得、DNAの切断された区分は、所望されるゲノム標的を含み得る。
いくつかの実施形態では、第2の電気泳動電圧の印加は、第1の電気泳動電圧および/または第3の電気泳動電圧の印加より短くあり得る。
第1の電気泳動電圧の印加は、SDSを溶出モジュールを通して移行させ、サンプルを溶解させ、サンプルの非標的粒子を、非標的粒子が、ゲル区画を通過し、第2の緩衝液チャンバの中に入るようにコーティングし得る。第2の電気泳動電圧の印加は、標的粒子より小さい粒子を第2の緩衝液チャンバの中に移行させる。
電気泳動器具システムは、電気泳動ステーションと、本明細書に説明されるもの等の少なくとも1つの電気泳動カセットを受容するように構成される、引き出しとを含み得る。本システムはまた、液体取扱ロボットと、引き出しを第1の側方向に移動させるステップが、少なくとも1つのカセットの第1の側を液体取扱ロボットに暴露させ、引き出しを第2の側方向に移動させるステップが、引き出しを電気泳動ステーションの中に挿入させるように、引き出しを側方に移動させるように構成される、側方延在アームとを備え得る。電気泳動区分は、少なくとも1つのカセットに対応する、電極であって、電気泳動電圧を印加するように構成される、電極を収容する。本システムはまた、少なくとも1つの低温貯蔵コンパートメントと、少なくとも1つの室温貯蔵コンパートメントとを含み得る。
標的化ロングリード配列決定のための、統合された高スループットの自動サンプル調製システムが、開発されている。提案されるシステムは、臨床的診断環境におけるロバストな無人自動処理を対象とする。
極めて高い分子量(HMW)のDNA(100〜2,000kb)の抽出および酵素処理のための半自動研究器具システム(図1A−B)が、提供される。本システムは、未損傷細胞または単離された核を入力サンプルとして使用する。入力サンプルが、アガロースゲルカセット(図1A)の中に装填され、染色体長のDNAが、サンプルウェルコンパートメントを通したSDSの電気泳動によってサンプルから抽出される。SDSコーティングされたタンパク質、脂質が、中心アガロースゲルカラムを通してサンプルウェルから離れるように電気泳動されるが、染色体長のDNAは、サンプルウェルのアガロースゲル壁の中でしっかりと絡まり、不動化される。サンプルウェルは、DNAのいかなる損失を伴わずに、空にされ、再充填されることができる。これは、サンプルウェルを酵素反応混合物で再充填することによって、不動化されたDNAの処置を可能にする。多くの制限酵素、DNAポリメラーゼ、リガーゼ、トランスポザーゼ、非特異的DNAクリベース、および化膿レンサ球菌Cas9を含む、多くの一般的に使用されるDNA処理酵素は、アガロースの中に容易に拡散する。DNA処理の後、サイズ選択電気泳動の付加的工程が、実施され、DNA産物の、ゲル分離カラム(図1A)の片側に沿って配列される、一連の6つの緩衝液で充填された溶出モジュールの中への電気泳動溶出が、後に続く。DNA処理ステップは、所望されるDNA産物のサイズを長さ2メガベース(mb)未満に低減させるために、ある切断を含む(2mbを上回るDNAは、サンプルウェル内で不動化されたままとなり、電気泳動の間に移動することが不可能となるであろう)。
図1Aに示されるように、各カセットは、2つの物理的に隔離されるサンプル処理面積を有する。カセットは、標準的な96ウェルプレートの占有面積を有する。中心アガロースチャネルは、2つの装填ウェルを有する。細胞または核が、サンプルウェル内に装填され、SDS系溶解試薬が、試薬ウェルの中に装填される。電気泳動が、実行され、細胞または核が、溶解されている、サンプルウェルコンパートメントを通してSDSを駆動させる。染色体サイズのゲノムDNAが、サンプルウェル壁内で不動化される一方、他の成分が、SDSとともに、底部電極チャンバに搬送される。DNA処理およびサイズ選択電気泳動の後、DNA産物は、アガロースチャネルの右側に沿って位置付けられる、6つの溶出モジュールのアレイの中に電気泳動溶出される。
図1Bは、器具が、幅/高さ/奥行約1フィートであり、2つのカセットを保持することを示す。総サンプルスループットは、サンプル4個であり、試験実行時間は、サイズ選択ステップのサイズ範囲および所望の分解能に応じて、3〜7時間で変動する。
SageHLSシステムは、カスタマイズされたCas9ヌクレアーゼと併用され、10X Genomix Chromiumシステム内の標的化DNAライブラリを調製するために効率的に使用され得る、特異的な大きいゲノムDNA標的を単離することができる。図2は、本明細書において「CATCH」と称される、ワークフローの概略図を示す。未損傷の細胞または核が、カセットの中に装填され、電気泳動抽出が、上記に説明されるように実行され、染色体長のゲノムDNAをサンプルウェル壁内で不動化された状態で残す。酵素DNA処理が、配列決定されるべきゲノム領域(または複数の領域)の外側を切断するように設計される、カスタマイズされたCas9クリベースを使用して実行される。Cas9の消化後、サイズ選択電気泳動が、実行され、Cas9によって切断された標的領域を、サンプルウェルから離れるように、かつサンプルウェル壁内に捕捉されたままである、未切断のゲノムDNAから離れるように移動させる。ゲルチャネルからの電気泳動溶出の後、産物は、qPCRによって限局化され、ライブラリ構築のために直接10X Chromiumシステムの中で使用される。
ヒトBRCA1遺伝子を包含する200kbゲノム領域の標的化配列決定のワークフロー全体が、実証されている。150万個のヒトの二倍体培養細胞を入力物質として使用して、Taqman qPCRによって測定されるような非標的化制御遺伝子(RNaseP)の約25倍の濃縮で、約30,000〜50,000個のBRCA1断片の複製物が、ピーク溶出モジュールから回収された。10X Genomics Chromiumシステム上のライブラリの調製後、それらは、Illumina NextSeq500システム上で配列決定された。試験の実行は、標的化BRCA1領域の155倍のカバレッジを生産し、ゲノムの非標的化残部は、わずか4.4倍のカバレッジであった(図3)。10X Long Ranger整合ソフトウェアを使用したさらなる解析が、完全に位相化されたハプロタイプが、両方のアリルに関して決定され得ることを実証した(図4)。BRCA1 HLS−CATCH産物の半分を上回るものが、gRNA設計から予測されるような完全長標的であった。
並行実験では、十分に調査された細胞株GM12878における40個の既知のSVを標的化するgRNAが、設計されたため、HLS−CATCH標的化もまた、大きいSVを検出するために使用され得ることが実証されている。標的化領域は、40個の明確に異なる100kbゲノム断片を標的化する、単一の多重HLS−CATCH手技において単離された。標的は、qPCRによって出力されたHLSカセットの中に限局化され、BRCA1遺伝子に関するように、10X Genomicsライブラリ調製およびIllumina配列決定を受けた。GM12878 chr1上のホモ接合型の40kb欠失の検出を実証する、ある予備的データが、図5に示される(Shin, Ji(原稿は、準備中である))。
図3−5のデータは、10X Genomicsライブラリ構築法と組み合わせられたHLS−CATCHが、標的化された様式で、高品質の長域ハプロタイプおよびSV呼出を提供し得ることを示す。これは、20kbより大きいゲノム断片を使用した標的化配列決定ワークフローの最初の成功した実証であると考える(14)。組み合わせられた技術の成功は、HLS−CATCHプロセスの効率的な標的濃縮と10X Chromiumワークフローの統合された増幅およびライブラリ構築プロセスとの間の優れた相補性に由来する。
上記に概説されるHLS−CATCH/10X Genomicsワークフローに基づいた診断試験は、遺伝子試験および腫瘍学において説得力のある利点を有し得る。ワークフローの標的化性質は、Illumina配列決定コストの実質的な減少を提供する($8,000(100倍に位相化されたChromium全ゲノム配列のためILMN試薬)対$500(図4のBRCA1の100倍に位相化された標的化ChromiumカバレッジのためのILMN試薬))。加えて、大きい標的化断片の解析は、同一アッセイにおけるSVおよびSNPの両方を検出するための機会を提供し、ハプロタイプ決定の追加された利点も伴う。
アプローチ
処理されるサンプルの数が、増加および/または最大限にされるように、そのような用途のために使用されるシステムが、高いサンプルスループットを有することは、有利であり得る。加えて、再現可能な方式で、効率的かつ特異的なCas9標的化切断を達成することも、有利であり得る。マウスのWBCおよびヒトの培養細胞(リンパ芽球様およびHEK293細胞)を用いた約30のHLS−CATCH実験では、CATCH標的の回収が、2〜50%の範囲にわたって広く変動している。同様に、標的濃縮は、15〜200倍で変動している。幸い、10X Chromiumライブラリ調製は、これらの範囲の下限におけるサンプルに対して非常に良好に作用する。例えば、図3−5の高カバレッジ標的化データは、CATCH標的回収物全体のわずか約1.5%(50,000個の複製物)および約25倍の濃縮を用いて生産された(両方の値が、qPCRによって、RNaseP遺伝子複製数に対して測定された)。これは、HLS−CATCH/10X Genomicsワークフローの別の相補的特徴であり得、すなわち、ワークフロー全体の成功は、実質的な濃縮に依存し、絶対的な標的純度には依存せず、これは、後者の場合では、複数のアリルが、液滴内に共に位置し、同一のリンクされた読取バーコードで標識されるであろう、「バーコード衝突」に起因する、非効率性につながるであろう。
処理されるサンプルの数が、増加および/または最大限にされるように、そのような用途のために使用されるシステムが、高いサンプルスループットを有することは、有利であり得る。加えて、再現可能な方式で、効率的かつ特異的なCas9標的化切断を達成することも、有利であり得る。マウスのWBCおよびヒトの培養細胞(リンパ芽球様およびHEK293細胞)を用いた約30のHLS−CATCH実験では、CATCH標的の回収が、2〜50%の範囲にわたって広く変動している。同様に、標的濃縮は、15〜200倍で変動している。幸い、10X Chromiumライブラリ調製は、これらの範囲の下限におけるサンプルに対して非常に良好に作用する。例えば、図3−5の高カバレッジ標的化データは、CATCH標的回収物全体のわずか約1.5%(50,000個の複製物)および約25倍の濃縮を用いて生産された(両方の値が、qPCRによって、RNaseP遺伝子複製数に対して測定された)。これは、HLS−CATCH/10X Genomicsワークフローの別の相補的特徴であり得、すなわち、ワークフロー全体の成功は、実質的な濃縮に依存し、絶対的な標的純度には依存せず、これは、後者の場合では、複数のアリルが、液滴内に共に位置し、同一のリンクされた読取バーコードで標識されるであろう、「バーコード衝突」に起因する、非効率性につながるであろう。
HLS−CATCHを修正および拡張し、非常に少量の細胞/核入力と協働させることもまた、有利であろう。これは、サイズおよび細胞数が非常に限定され得る、生体組織検査サンプル等の遺伝子型決定診断サンプルに関する重要な課題である。少量の細胞/核入力を使用するステップの成功は、上記に議論されるようなCas9消化条件を最適化するステップの成功に依存するであろう。
さらに、種々のタイプの腫瘍生体組織検査物質を含む、軟膜、凍結血液、新鮮および新鮮凍結固形組織を含む、種々の組織タイプを使用するために、HLS−CATCHの能力を完全に評価し、拡張することが、重要であり得る。
第I相では、カセットが、HLS−CATCHの高い標的濃縮を遂行するように設計され得る。新たな設計は、原HLSカセットの2次元電気泳動溶出ステップを排除し、それによって、カセットの製造が、(96ウェルプレート占有面積における)カセットあたり6〜12個のサンプルを処理することが可能になることを可能にし得る。新しいカセットタイプは、本明細書において「CATCH−1」と称され、IDは、「1次元」の略である。
第I相は、750,000個の二倍体の哺乳類細胞(ヒトまたはマウス)のサンプルを使用し、CATCH−1Dプロトタイプにおける、単一複製物の200,000bpゲノム標的断片の少なくとも20%(300,000個の複製物)の回収を達成するステップを含み得る。複製物の数は、qPCRによって測定され得る。200,000bpゲノム標的の濃縮は、非標的化ゲノム配列バックグラウンドの少なくとも20倍であってもよく、濃縮は、qPCRによって測定され得る。加えて、CATCH−1Dプロトタイプが、10X Genomics Chromium/Illuminaワークフロー内で効率的に配列決定され得るCATCH標的を生産することが、実証され得る。
第II相は、完全高スループット無人自動CATCH標的調製のための液体取扱能力を伴う、CATCH−1D器具の開発を含み得る。Cas9の消化が、CATCH−1D動作のために最適化され得る。第II相はまた、CATCH−1Dカセットまたはワークフローを少量の細胞または核入力と併用するために適合させるステップと、CATCH−1Dカセットまたはワークフローを診断上重要な組織タイプとの併用のために適合させるステップとを含み得る。
第I相アプローチ
CATCH−1Dカセットおよびその動作の基本概念が、図6および7に示される。SageHLSカセット(図1A)は、筐体605の各レーン610が、溶出モジュール620の両側に一対の緩衝液リザーバ635、640を備えるように修正される。各レーン610は、溶出モジュール615を受容するように構成されるスロットの両側に、伸長縁615を有する。溶出モジュール620が、対応するスロットの中に挿入されると、レーンは、第1のチャンバ625と、第2のチャンバ630とに分割される。第1のチャンバ625は、第1の緩衝液リザーバ635を備えてもよく、第2のチャンバ630は、第2の緩衝液リザーバ640を備えてもよい。
CATCH−1Dカセットおよびその動作の基本概念が、図6および7に示される。SageHLSカセット(図1A)は、筐体605の各レーン610が、溶出モジュール620の両側に一対の緩衝液リザーバ635、640を備えるように修正される。各レーン610は、溶出モジュール615を受容するように構成されるスロットの両側に、伸長縁615を有する。溶出モジュール620が、対応するスロットの中に挿入されると、レーンは、第1のチャンバ625と、第2のチャンバ630とに分割される。第1のチャンバ625は、第1の緩衝液リザーバ635を備えてもよく、第2のチャンバ630は、第2の緩衝液リザーバ640を備えてもよい。
いくつかの実施形態では、溶出モジュール620は、緩衝液リザーバ635、640の間の中心に位置付けられる、略中心に位置付けられる、または別様に据え付けられる。溶出モジュール620の片側に、多孔性滅菌濾過膜645が、取り付けられる。アガロースゲル660の小さい区画が、滅菌フィルタ645の外側表面に対して流し込まれる。溶出モジュール620の他側に、限外濾過膜650が、取り付けられる。限外濾過器650は、電気泳動の間にDNAを保持するであろう、細孔サイズを有する。
CATCH−1Dワークフローでは、溶出モジュール620は、サンプルウェル665および溶出モジュール620の両方としての役割を果たす。図7に図示され、図8のフローチャートに示されるように、細胞/核サンプルは、溶出モジュール620の中に装填され(810)、左の緩衝液チャンバ635は、空にされ、SDS含有溶解緩衝液で再充填される(815)。電気泳動電圧が、例えば、SDSが、溶出モジュールを通して移行し、入力材料を溶解させ、タンパク質および他の非DNA細胞成分を、それらが、小さいゲル区画660を通して右の緩衝液チャンバ640の中に移行するようにコーティングするように、1つ以上の電極655を介して印加される(820)。本周期の間に、ゲノムDNAは、原HLSプロセスにおけるように、小さいゲル区画660の中に移行し、そこで不動化される(原プロセスは、図2に示される)。この時点で、電気泳動が、停止され、カセットの3つのコンパートメント全て(左および右の緩衝液チャンバ635、640、および溶出モジュール620)は、徹底的に洗浄され(825)、Cas9反応緩衝液で再充填される(830)。溶出モジュール620は、次いで、空にされ(835)、ゲル660の中で不動化された、染色体長のゲノムDNAから所望されるゲノム標的を特異的に切断するであろう、Cas9酵素混合物で再充填される(840)。消化の後、溶出モジュール620は、SDS停止液で装填され(845)、Cas9が、DNAから解放され、右の緩衝液チャンバ640の中に移動されるように、電気泳動が、実行される(850)。本一掃のために要求される電気泳動周期は、変性されたCas9タンパク質が、アガロースゲル660内の大きいDNA CATCH標的よりはるかに迅速に移行するであろうため、非常に短時間である。このCas9一掃の電気泳動の後、カセットは、洗浄され(855)、溶出緩衝液で再充填される(860)。電気泳動が、逆方向に実行され(865)、CATCH産物を小さいゲル区画660から溶出モジュール620の中に移動させ、溶出モジュール620の左側の限外濾過膜650は、標的が逃散することを防止する。
CATCH−1Dカセットの設計は、原SageHLSカセットよりはるかに単純であり、プロトタイプの加工が、実施され得る。CATCH−1Dプロトタイプ試験のためにカスタマイズされた電極アレイを伴う、(付属Aに示されるもの等の)Sage Science製PippinHT器具が、使用されることができる。PippinHT器具は、最大12個のチャネルを伴うカセットを受け入れるように修正され得る。液体取扱ステップの全てが、(例えば、第I相の間)手動で実施されてもよい、または(例えば、第II相の間)自動化されてもよい。
CATCH−1Dワークフローには、原HLSワークフローとは異なる、いくつかの試薬汚染リスクが、存在する。一実施例が、溶出モジュールの入力サンプルウェルとしての使用から生じる。入力サンプルの一部の成分は、溶出モジュール表面に付着し、溶解および洗浄ステップの間に除去しにくいことが証明され得る。同様に、初期の溶解またはCas9一掃ステップに続いて、SDSのある残留量が、溶出モジュール内に留まるというあるリスクが存在する。(原HLSカセットの溶出モジュールは、入力サンプルまたは濃縮されたSDSに暴露されない。)
別の可能性として考えられる課題は、SDSを用いた電気泳動によるCas9一掃が、CATCH標的の右の緩衝液リザーバの中への損失を伴わずに遂行され得るように、ゲルカラム寸法を調節することである。これは、100kbを上回るCATCH標的に関して深刻な課題になろうことは予期されておらず、(Cas9一掃電気泳動の後)右のチャンバ緩衝液のqPCRによる標的損失は、測定されることができる。
CATCH−1Dワークフローに対する別の有意なリスクは、サイズ選択電気泳動ステップの不在である。原HLS−CATCHワークフローでは、サイズ選択電気泳動が、実施され、溶出の直前のCATCH産物の純度を増加させる。提案されるCATCH−1Dワークフローは、サイズ選択電気泳動を省略するが、電気泳動によるCas9一掃ステップは、CATCH標的DNAより有意に迅速に移行する低分子量DNAを除去する可能性を提供する。いずれの場合も、ある非特異的に切断されたHMW DNAは、CATCH産物とともに最終溶出において溶出されるであろう可能性が高く、CATCH産物の純度は、HLS−CATCHワークフローにおけるほど高くはならないであろう。しかしながら、優れた10Xの配列決定結果が、控え目な濃縮倍数(約15〜25倍)で取得され得るため、これは、問題になり得ない。加えて、Cas9消化条件のさらなる最適化、より良好なgRNA設計、および新しい変異Cas9酵素(または類似するプログラム可能なエンドヌクレアーゼ)が、サイズ選択の重要性を低減させ得る。
第II相アプローチ
第I相では、CATCH−1Dシステムの実行可能性が、実証される。第II相は、完全に自動化された高スループットCATCH−1Dシステムの開発を含む。
第I相では、CATCH−1Dシステムの実行可能性が、実証される。第II相は、完全に自動化された高スループットCATCH−1Dシステムの開発を含む。
CATCH−1Dカセットおよび器具の開発
第II相は、電気泳動を伴う液体取扱機能の自動CATCH−1Dシステムへの統合に関する詳細なシステム工学研究を特徴とする。例示的自動器具が、図9に図示される。電気泳動ステーションが、小型のOEMのガントリ様式液体取扱ロボットのデッキ上に直接統合される。電気泳動ステーションは、4つのCATCH−1D多重チャネルカセットを保持し得る電動式引き出しを有し得る。引き出しは、側方に拡張され、液体取扱ステップ(サンプル/試薬を装填する、カセット洗浄、産物を除去する)のために、カセットの上部を暴露し、電気泳動ステップのために(電極を収容する)ステーションの内側に引き込まれることができる。カセットあたりのチャネル数に合致する数のLHチャネルを伴う、単一の液体取扱ヘッドが、十分であり得る(図9では、カセットあたり8個のチャネルを示している)。図9に示されるように、入力サンプルおよびCas9試薬のための低温(4C)貯蔵装置、溶解試薬および電気泳動緩衝液のためのRT貯蔵装置、使い捨て可能先端のための貯蔵装置、および使用済み先端および廃液のための廃棄チャンバのための設備が、提供され得る。
第II相は、電気泳動を伴う液体取扱機能の自動CATCH−1Dシステムへの統合に関する詳細なシステム工学研究を特徴とする。例示的自動器具が、図9に図示される。電気泳動ステーションが、小型のOEMのガントリ様式液体取扱ロボットのデッキ上に直接統合される。電気泳動ステーションは、4つのCATCH−1D多重チャネルカセットを保持し得る電動式引き出しを有し得る。引き出しは、側方に拡張され、液体取扱ステップ(サンプル/試薬を装填する、カセット洗浄、産物を除去する)のために、カセットの上部を暴露し、電気泳動ステップのために(電極を収容する)ステーションの内側に引き込まれることができる。カセットあたりのチャネル数に合致する数のLHチャネルを伴う、単一の液体取扱ヘッドが、十分であり得る(図9では、カセットあたり8個のチャネルを示している)。図9に示されるように、入力サンプルおよびCas9試薬のための低温(4C)貯蔵装置、溶解試薬および電気泳動緩衝液のためのRT貯蔵装置、使い捨て可能先端のための貯蔵装置、および使用済み先端および廃液のための廃棄チャンバのための設備が、提供され得る。
カセットあたりの処理されるサンプルの最適数およびサンプル入力サイズを決定することを含み得る、プロトタイプ多重チャネルCATCH−1Dカセットが、加工され得る。加えて、(下記に説明されるような)チャネル/溶出モジュールの寸法の関数としてのDNA抽出およびCas9消化の効率が、決定され得る。CATCH−1Dカセットのチャネルは、小さくてもよく、そのため、多くのサンプルが、各カセット内で処理されることができる。決定はまた、十分なCATCH標的が、抽出され、診断の有用性のために十分な10X Genomicsのリンクされた読取カバレッジを入手することを確実にするために行われ得る。
抽出およびCATCH回収に及ぼすチャネル寸法効果を評価した後、第2の、実質的に最適化されたCATCH−1Dカセットもまた、構築され得る。バージョン2カセットを用いて完全に自動化された試験を実施し得る、初期の器具プロトタイプもまた、構築され得る。生産バージョンのCATCH−1Dカセットおよび自動化器具もまた、開発され得る。最終生産バージョンのカセットおよび器具のための製造プロトコルが、決定され得、最終システムが、試験され得る。
CATCH−1DにおけるHMW DNA抽出の最適化
CATCH−1Dプロセスの全体的効率は、2つの値の複合物である。第1のものは、入力サンプルからの初期ゲノムDNA抽出の効率である。第2のものは、Cas9によって消化されたCATCH標的の回収効率である。CATCH−1Dにおける初期ゲノムDNA抽出の効率は、1)細胞溶解およびDNA不動化が生じる、アガロースゲルサンプルウェルの表面積(より大きいSAが、より良好である)、および2)抽出の間の細胞あたりの洗浄剤使用量(より多い量が、より良好である)の関数であると考えられる。本課題を調査するために、異なるアガロースゲル断面積を伴う、多重チャネルCATCH−1Dプロトタイプが、加工され得、抽出効率が、サンプル入力の関数として評価され得る。抽出効率は、不動化されたDNAを頻繁切断制限酵素で消化し、消化物を電気溶出した後の総DNA回収量によって測定され得る。長いゲノムDNA断片(100〜200kb)の抽出効率は、不動化されたDNAを稀有切断制限酵素で消化し、既知の長さの特異性ゲノムDNA制限断片の電気泳動溶出収率を試験することによって測定され得る。特異的ゲノムDNA断片の回収量は、qPCRによって測定され得る。評価される最大入力装填量は、第I相の作業が、入力が、10X Chromium配列決定ワークフロー内で高カバレッジのための十分なCATCH標的(少なくとも300,000個の複製物)を生産するであろうことを実証し得るため、750,000個のヒトの二倍体細胞であり得る。
CATCH−1Dプロセスの全体的効率は、2つの値の複合物である。第1のものは、入力サンプルからの初期ゲノムDNA抽出の効率である。第2のものは、Cas9によって消化されたCATCH標的の回収効率である。CATCH−1Dにおける初期ゲノムDNA抽出の効率は、1)細胞溶解およびDNA不動化が生じる、アガロースゲルサンプルウェルの表面積(より大きいSAが、より良好である)、および2)抽出の間の細胞あたりの洗浄剤使用量(より多い量が、より良好である)の関数であると考えられる。本課題を調査するために、異なるアガロースゲル断面積を伴う、多重チャネルCATCH−1Dプロトタイプが、加工され得、抽出効率が、サンプル入力の関数として評価され得る。抽出効率は、不動化されたDNAを頻繁切断制限酵素で消化し、消化物を電気溶出した後の総DNA回収量によって測定され得る。長いゲノムDNA断片(100〜200kb)の抽出効率は、不動化されたDNAを稀有切断制限酵素で消化し、既知の長さの特異性ゲノムDNA制限断片の電気泳動溶出収率を試験することによって測定され得る。特異的ゲノムDNA断片の回収量は、qPCRによって測定され得る。評価される最大入力装填量は、第I相の作業が、入力が、10X Chromium配列決定ワークフロー内で高カバレッジのための十分なCATCH標的(少なくとも300,000個の複製物)を生産するであろうことを実証し得るため、750,000個のヒトの二倍体細胞であり得る。
Cas9消化およびCATCH標的回収の最適化
いったんチャネル/溶出モジュールの断面に伴った抽出効率の増減が理解されると、Cas9消化効率に関する調査が、開始され、入力サンプル装填量およびチャネル寸法に伴ったその増減方法を決定し得る。多くの種類の臨床サンプルが、少数の入力細胞を有するであろうため、カセットプロトタイプの性能は、少量の細胞入力で評価および最適化され得る。わずか50,000個の標的が回収された単一標的CATCH実験において、良好な10X Genomics配列カバレッジ(約100倍)を得ることが、可能である。いくつかの実験においては、Cas9標的(200kb BRCA1遺伝子座標的)の50%の回収を達成している。本回収値において、50,000個のみの未損傷細胞(または核)の入力が、同等(約100倍)のChromiumライブラリ配列決定カバレッジのために十分であろう。より高い標的回収が、達成されると、要求される細胞入力は、比例してより低くなり、これは、多くの臨床的に関連するサンプルが、非常に少量の細胞入力を有するであろうため、重要であり得る。10,000個代前半の数のヒトの細胞入力を用いて、100倍の標的化配列決定カバレッジが、達成され得る。
いったんチャネル/溶出モジュールの断面に伴った抽出効率の増減が理解されると、Cas9消化効率に関する調査が、開始され、入力サンプル装填量およびチャネル寸法に伴ったその増減方法を決定し得る。多くの種類の臨床サンプルが、少数の入力細胞を有するであろうため、カセットプロトタイプの性能は、少量の細胞入力で評価および最適化され得る。わずか50,000個の標的が回収された単一標的CATCH実験において、良好な10X Genomics配列カバレッジ(約100倍)を得ることが、可能である。いくつかの実験においては、Cas9標的(200kb BRCA1遺伝子座標的)の50%の回収を達成している。本回収値において、50,000個のみの未損傷細胞(または核)の入力が、同等(約100倍)のChromiumライブラリ配列決定カバレッジのために十分であろう。より高い標的回収が、達成されると、要求される細胞入力は、比例してより低くなり、これは、多くの臨床的に関連するサンプルが、非常に少量の細胞入力を有するであろうため、重要であり得る。10,000個代前半の数のヒトの細胞入力を用いて、100倍の標的化配列決定カバレッジが、達成され得る。
効率的な抽出およびCATCH標的回収のために適切なカセットチャネル寸法を最適化するステップに加えて、gRNA設計、gRNAタイプ、Cas9酵素選定、およびカセット内Cas9反応条件もまた、対処され得る。
Cas9反応条件(酵素濃度および緩衝液)が、CATCH標的回収のための支配的要因であり、gRNAタイプ、gRNA設計、およびCas9タイプは、あまり効果を及ぼさない。試験された殆ど全てのgRNAは、その意図される標的にある程度作用し、誘導体の75%は、等モルの標的/Cas9比(0.1〜0.4nM範囲内の濃度)におけるPCR産物の完全な消化を示す。また、いくつかの異なるgRNA設計ツール(guidescan.com製、Feng Zhang lab website at MIT製、Agilent製SureDesign Tool)が、成功裏に使用され得る。さらに、類似する切断効率が、2部分合成gRNAおよびT7polインビトロ転写単一gRNAを使用して認められ得る(但し、合成RNAが、使用するためにより容易かつより確実であると考える)。商業的に利用可能なCas9変異体が、インビトロアッセイにおいてwt−Cas9酵素より特異性であるとは見出されていない。
これらの初期的結論にもかかわらず、CRISPRヌクレアーゼ族は、絶えず拡張しており、本プロセスに関して有用であり得る、新しい変異体が、操作され得る。したがって、CATCH−1Dカセットにおける向上された性能のためのより多くの酵素が、選別され得る。同様に、近年、商業的に利用可能になりつつある、全長合成単一誘導RNAもまた、試験され得る。単一誘導体は、Cas9アセンブリワークフローを単純化させ得る。例えば、Synthegoが、供給元が、それらの合成単一誘導体が、インビトロ転写単一gRNAに対する有意に改良された特異度を有すると宣伝しているため、使用され得る。
HLS−CATCHプロセスでは、最良の標的回収が、切断部位ウィンドウあたり2〜3個のgRNA(切断部位あたり複数の誘導体が、使用され、単一gRNA認識配列内のSNPが、切断部位を排除するであろう可能性を回避する)、約2kbの切断部位ウィンドウ、およびサンプルウェル内における総濃度1〜4μMのCas9酵素(Cas9:総gRNA濃度比1:1でアセンブリされる)を使用して達成されている。SageHLSプロセスでは、標的回収はまた、Cas9酵素を、HMW DNAが、不動化される、サンプルウェルの中に電気泳動的に「注入」することによって有意に向上される。約50Vにおける1分周期の電気泳動が、使用されてもよい。酵素濃度および電気泳動注入が、CATCH標的の収率に最大の効果を及ぼす、2つのパラメータである。
他の臨床サンプルタイプのためのCATCH−1D法の開発
HLSワークフローは、上記の源の全てから取得される、全血、凍結全血、軟膜、新鮮固形組織、新鮮凍結組織、腫瘍生体組織、および核を含む、種々の物質のために適合され得る。CATCHプロセスに関して、抽出されたDNAが、アガロースゲル内での効率的な不動化が生じるために、ほぼ完全染色体長である、またはサイズが>>2mbであることが、重要であり得る。これは、CATCHプロセスが、新鮮な材料、または新鮮材料から調製される核を用いて最良に作用し得ることを意味する。これはまた、CATCHプロセスが、ホルマリン固定組織に関して作用する可能性が低いことを意味する。
HLSワークフローは、上記の源の全てから取得される、全血、凍結全血、軟膜、新鮮固形組織、新鮮凍結組織、腫瘍生体組織、および核を含む、種々の物質のために適合され得る。CATCHプロセスに関して、抽出されたDNAが、アガロースゲル内での効率的な不動化が生じるために、ほぼ完全染色体長である、またはサイズが>>2mbであることが、重要であり得る。これは、CATCHプロセスが、新鮮な材料、または新鮮材料から調製される核を用いて最良に作用し得ることを意味する。これはまた、CATCHプロセスが、ホルマリン固定組織に関して作用する可能性が低いことを意味する。
SageHLS開発が、哺乳類WBCまたはヒト細胞株、またはそれらの源から単離された核を用いて遂行された。SageHLSシステムは、CATCHプロセスのために十分な入力である、約2.5ugのゲノムDNAを含有すべきである、約50μlの全血からHMW DNAを単離するために使用されている。加えて、SageHLSは、HMW DNAの単離のために、凍結されたヒトの組織培養細胞(HEK293)と成功裏に併用されている。これらの2個のデータを前提として、軟膜、凍結軟膜、および凍結全血を処理するためのプロトコルが、見出され得る。
組織作業のために、組織解離のためのいくつかの器具および試薬システムが、細胞血球計測器およびFACS器具の供給元(BD BiosciencesおよびMiltenyi Biotech)によって開発されている。これらは、機械的および酵素処理の組み合わせを伴い、選択的濾過が、後に続き、単一細胞または核の懸濁液を生産する。これらのシステムは、新鮮な材料を用いたCATCH−1D入力のために良好に性能を発揮し得る。
凍結組織の培養組織を用いた限定された成功に基づいて、CATCHのための最も実行可能な臨床的組織サンプルは、新鮮凍結組織であろう。努力が、そのサンプルタイプに注力され得、上記で引用されたBDおよびMiltenyi製の器具類システムを使用した調査が、開始され得る。
CATCH−1D試薬キットの開発のための一貫した再現可能なワークフロー
CATCH−1Dおよび10X Genomicsワークフローの組み合わせが、臨床的配列決定の多くの分野において広い用途を有し得る。本理由のために、CATCH−1Dシステムの開発および最適化は、新しいCATCH試薬キットの迅速な生産のための最適な開発経路を確立するステップを含む。これは、ゲノム切断部位選択、切断部位ウィンドウ内でのgRNA選択、gRNA発注およびQCのための合理化された供給経路、追跡可能な産物付番、在庫、およびパッケージ化のための生命情報科学の統合を含み得る。
CATCH−1Dおよび10X Genomicsワークフローの組み合わせが、臨床的配列決定の多くの分野において広い用途を有し得る。本理由のために、CATCH−1Dシステムの開発および最適化は、新しいCATCH試薬キットの迅速な生産のための最適な開発経路を確立するステップを含む。これは、ゲノム切断部位選択、切断部位ウィンドウ内でのgRNA選択、gRNA発注およびQCのための合理化された供給経路、追跡可能な産物付番、在庫、およびパッケージ化のための生命情報科学の統合を含み得る。
臨床的な配列決定市場が、調査され、CATCH−1Dアプローチから恩恵を受け得る重要な診断分野を選択し得る。例えば、CATCH−1Dが、MHC領域内での長域配列決定を可能にするために使用されてもよい。加えて、遺伝性疾患試験および腫瘍学には、他の魅力的なアッセイ分野も存在する。
ヒトゲノムの任意の領域(または領域のセット)に関するCATCHアッセイを作成するために適用され得る、gRNAの設計のための最適化されたワークフローが、提供され得る。遺伝性疾患試験におけるいくつかのアッセイは、隣接している領域とともに単一遺伝子のみを伴い得る。他の試験は、SVに頻繁に関わる(おそらく、100個代前半の数の)癌遺伝子のパネルを伴い得る(10)。なおも他のものは、MHCのような広範なゲノム領域を横断して存在するCATCH産物を生産する、アッセイの設計を伴い得る(14)。
標的化CATCH−1Dおよび10X Chromium配列決定結果の解析のために特異的に設計された10X Genomic Long Rangerソフトウェアの修正、カスタマイズ、または新しいバージョンが、査定され得る。
新しいキットの性能を確認するための10X Chromium配列決定ワークフローおよびQC法が、開発され得る。qPCRは、回収および濃縮を査定するための安価かつ迅速な方法であるが、ある臨床的な配列決定方法が、開発され得る。
限定ではないが、本願において提示される、特許、特許出願、論説、ウェブページ、書籍等を含む、公開文書または他の文書への任意および全ての参照は、参照することによってそれらの全体として本明細書に組み込まれる。
本デバイス、システム、および方法の例示的実施形態が、本明細書に説明されている。他所に記載されるように、これらの実施形態は、例証の目的のためのみに説明されており、限定するものではない。他の実施形態もまた、可能性として考えられ、本開示によって網羅され、これは、本明細書に含有される教示から明白となるであろう。したがって、本開示の範疇および範囲は、上記に説明される実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、本開示およびそれらの均等物によってサポートされる請求項に従ってのみ定義されるべきである。また、本開示の実施形態は、分子処理に対応する任意または全ての要素を含む、任意の他の開示される方法、システム、およびデバイスからの任意および全ての要素をさらに含み得る、方法、システム、およびデバイスを含み得る。言い換えると、1つまたは別の開示される実施形態からの要素は、他の開示される実施形態からの要素と置換可能であり得る。加えて、開示される実施形態の1つ以上の特徴/要素は、除去されても、依然として、特許性のある主題をもたらし得る(したがって、本開示のさらに多くの実施形態をもたらし得る)。対応して、本開示のいくつかの実施形態は、そのような先行技術において開示されるシステム、デバイス、および/または方法の1つ以上の要素/特徴を具体的に欠くことによって、1つおよび/または別の参考文献/先行技術と特許的に明確に異なり得る。言い換えると、ある実施形態に対する請求項は、そのような特徴/要素を含む先行技術と特許的に明確に異なる実施形態をもたらす1つ以上の要素/特徴を具体的に排除するような否定的限界を含有し得る。
Claims (22)
- 電気泳動の間に分子を保持するための分子保持カセットであって、前記カセットは、
筐体と、
前記筐体内に構成されるレーンであって、前記レーンは、第1の伸長縁と、第2の伸長縁とを有する、レーンと、
溶出モジュールであって、前記溶出モジュールは、前記レーンの中に受容され、前記レーンを第1のチャンバと、第2のチャンバとに分割するように構成される、溶出モジュールと、
前記第1の伸長縁に隣接して位置付けられる第1の緩衝液リザーバと、
前記第2の伸長縁に隣接して位置付けられる第2の緩衝液リザーバと
を備え、
前記第1のチャンバに面する前記溶出モジュールの第1の側は、多孔性滅菌濾過膜を備え、
前記第2のチャンバに面する前記溶出モジュールの第2の側は、限外濾過膜を備え、前記限外濾過膜は、電気泳動の間に分子を保持するための細孔サイズを有する、カセット。 - 前記第1のチャンバ内に構成される少なくとも1つの電極と、前記第2のチャンバ内に構成される少なくとも1つの電極とをさらに備える、請求項1に記載のカセット。
- 前記限外濾過膜は、15kDa限外濾過器である、請求項1に記載のカセット。
- 前記溶出モジュールは、前記第1の緩衝液リザーバと前記第2の緩衝液リザーバとの間の中心に位置付けられる、請求項1に記載のカセット。
- 前記溶出モジュールは、前記第1の緩衝液リザーバと前記第2の緩衝液リザーバとの間に位置付けられる、請求項1に記載のカセット。
- アガロースゲルをさらに含む、請求項1に記載のカセット。
- 前記アガロースゲルは、前記多孔性滅菌濾過膜の隣に流し込まれる、請求項6に記載のカセット。
- 前記アガロースゲルは、ゲルカラムを形成するように流し込まれ、前記ゲルカラムの寸法は、前記第1のチャンバの中への標的分子の損失を最小限にさせるように構成される、請求項7に記載のカセット。
- 前記限外濾過膜の細孔サイズは、電気泳動の間にDNAを保持するように構成される、請求項1に記載のカセット。
- 前記溶出モジュールは、前記溶出モジュールと、サンプルウェルとを備える、請求項1に記載のカセット。
- 前記溶出モジュールは、サンプルを受容するように構成される、請求項1に記載のカセット。
- 電気泳動の間に分子を保持するための分子保持カセットであって、前記カセットは、
筐体と、
前記筐体内に構成される複数のレーンであって、前記複数のレーンのそれぞれは、第1の伸長縁と、第2の伸長縁とを有する、複数のレーンと、
複数の溶出モジュールであって、前記複数の溶出モジュールの各溶出モジュールは、前記複数のレーンの各レーンの中に受容され、各レーンを第1のチャンバと、第2のチャンバとに分割するように構成される、複数の溶出モジュールと、
各レーンの前記第1の伸長縁に隣接して位置付けられる第1の緩衝液リザーバと、
各レーンの前記第2の伸長縁に隣接して位置付けられる第2の緩衝液リザーバと
を備え、
各レーンの前記第1のチャンバに面する前記溶出モジュールの第1の側は、多孔性滅菌濾過膜を備え、
各レーンの前記第2のチャンバに面する前記溶出モジュールの第2の側は、限外濾過膜を備え、前記限外濾過膜は、電気泳動の間に分子を保持するための細孔サイズを有する、カセット。 - 標的粒子の標的区画を単離および収集するための方法であって、前記方法は、
溶出モジュールのサンプルウェルの中にサンプルを受容することと、
第1の緩衝液チャンバの中にSDS含有溶解緩衝液を受容することであって、前記第1の緩衝液チャンバは、前記溶出モジュールの第1の側に沿って構成される、ことと、
第1の電気泳動電圧を印加し、
標的粒子が、前記溶出モジュールと第2の緩衝液チャンバとの間の前記溶出モジュールの第2の側に沿って構成されるゲル区画の中で不動化され、
非標的粒子が、前記ゲル区画を通過し、前記第2の緩衝液チャンバの中に入る
ように、前記サンプルの成分を、前記溶出モジュールの第2の側に沿って構成される第2の緩衝液チャンバに向かって移行させることと、
前記第1の緩衝液チャンバ、前記第2の緩衝液チャンバ、および前記溶出モジュールを洗浄することと、
前記第1の緩衝液チャンバ、前記第2の緩衝液チャンバ、および前記溶出モジュールを、Cas9反応緩衝液で充填することと、
前記溶出モジュールを空にすることと、
前記溶出モジュールをCas9酵素混合物で再充填し、前記ゲル区画内で不動化された前記標的粒子の区分を切断することと、
前記溶出モジュールをSDS停止液で装填することと、
第2の電気泳動電圧を印加し、前記標的粒子から前記Cas9を解放し、Cas9を前記第2の緩衝液チャンバの中に移行させることと、
前記第1の緩衝液チャンバ、前記第2の緩衝液チャンバ、および前記溶出モジュールを洗浄することと、
前記第1の緩衝液チャンバ、前記第2の緩衝液チャンバ、および前記溶出モジュールを溶出緩衝液で充填することと、
第3の電気泳動電圧を逆方向に印加し、前記標的粒子の切断された区分を前記ゲル区画から前記溶出モジュールの中に移行させることと
を含む、方法。 - 前記溶出モジュールの第1の側は、限外濾過器を備え、前記溶出モジュールの第2の側は、多孔性滅菌フィルタを備える、請求項13に記載の方法。
- 前記多孔性滅菌フィルタは、前記標的粒子の切断された区分が、前記第3の電気泳動電圧の印加の間およびその後に、前記溶出モジュールから出ることを防止する、請求項14に記載の方法。
- 前記標的粒子は、DNAであり、前記DNAの切断された区分は、所望されるゲノム標的を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記第2の電気泳動電圧の印加は、前記第1の電気泳動電圧の印加より短い、請求項13に記載の方法。
- 前記第2の電気泳動電圧の印加は、前記第3の電気泳動電圧の印加より短い、請求項13または17に記載の方法。
- 前記第1の電気泳動電圧の印加は、SDSを前記溶出モジュールを通して移行させ、前記サンプルを溶解させ、前記サンプルの非標的粒子を、前記非標的粒子が、前記ゲル区画を通過し、前記第2の緩衝液チャンバの中に入るようにコーティングする、請求項13に記載の方法。
- 前記第2の電気泳動電圧の印加は、前記標的粒子より小さい粒子を前記第2の緩衝液チャンバの中に移行させる、請求項13に記載の方法。
- 電気泳動器具システムであって、前記システムは、
電気泳動ステーションと、
請求項1または請求項12に記載の少なくとも1つの電気泳動カセットを受容するように構成される引き出しと、
液体取扱ロボットと、
前記引き出しを側方に移動させるように構成される側方延在アームであって、
前記引き出しを第1の側方向に移動させることは、前記少なくとも1つのカセットの第1の側を前記液体取扱ロボットに暴露させ、
前記引き出しを第2の側方向に移動させることは、前記引き出しを前記電気泳動ステーションの中に挿入させる、側方延在アームと
を備え、
電気泳動区分は、前記少なくとも1つのカセットに対応する電極を収容し、前記電極は、電気泳動電圧を印加するように構成される、システム。 - 少なくとも1つの低温貯蔵コンパートメントと、少なくとも1つの室温貯蔵コンパートメントとをさらに備える、請求項21に記載のシステム。
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