RU2815513C2 - Способы и средства получения библиотеки для секвенирования - Google Patents
Способы и средства получения библиотеки для секвенирования Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815513C2 RU2815513C2 RU2021108003A RU2021108003A RU2815513C2 RU 2815513 C2 RU2815513 C2 RU 2815513C2 RU 2021108003 A RU2021108003 A RU 2021108003A RU 2021108003 A RU2021108003 A RU 2021108003A RU 2815513 C2 RU2815513 C2 RU 2815513C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- sequencing
- nucleic acid
- nucleic acids
- sample
- Prior art date
Links
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 127
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 95
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 143
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 130
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 130
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 108
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims abstract description 35
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000013819 transposition, DNA-mediated Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 claims description 47
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 43
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 claims description 36
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 claims description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 29
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 230000017105 transposition Effects 0.000 claims description 21
- -1 SytoxOrange Chemical compound 0.000 claims description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 17
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 claims description 14
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 14
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 11
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims description 10
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 claims description 9
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 claims 2
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 55
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 43
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 36
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 20
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 19
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 15
- 108010012306 Tn5 transposase Proteins 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 11
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 8
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 8
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 5
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 5
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 5
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 5
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 4
- BGWLYQZDNFIFRX-UHFFFAOYSA-N 5-[3-[2-[3-(3,8-diamino-6-phenylphenanthridin-5-ium-5-yl)propylamino]ethylamino]propyl]-6-phenylphenanthridin-5-ium-3,8-diamine;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCNCCNCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 BGWLYQZDNFIFRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 5-nitro-1h-indole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C2NC=CC2=C1 OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000007672 fourth generation sequencing Methods 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-1h-pyrrole Chemical compound [O-][N+](=O)C=1C=CNC=1 LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 229920000049 Carbon (fiber) Polymers 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- FGBAVQUHSKYMTC-UHFFFAOYSA-M LDS 751 dye Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.C1=CC2=CC(N(C)C)=CC=C2[N+](CC)=C1C=CC=CC1=CC=C(N(C)C)C=C1 FGBAVQUHSKYMTC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 description 2
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 2
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 2
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Natural products C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002355 alkine group Chemical group 0.000 description 2
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000004917 carbon fiber Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N isoguanine Chemical compound NC1=NC(=O)NC2=C1NC=N2 DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920001748 polybutylene Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 2
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- BFKJFAAPBSQJPD-UHFFFAOYSA-N tetrafluoroethene Chemical compound FC(F)=C(F)F BFKJFAAPBSQJPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-hydroxypyrimidine Chemical compound NC1=NC=CC(O)=N1 XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCGYMSSYSAKGPK-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-1h-indole Chemical compound C1=CC=C2NC([N+](=O)[O-])=CC2=C1 HCGYMSSYSAKGPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FTBBGQKRYUTLMP-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-1h-pyrrole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CN1 FTBBGQKRYUTLMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XORHNJQEWQGXCN-UHFFFAOYSA-N 4-nitro-1h-pyrazole Chemical compound [O-][N+](=O)C=1C=NNC=1 XORHNJQEWQGXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYDWQPKRHOGLPA-UHFFFAOYSA-N 5-nitroimidazole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CN=CN1 VYDWQPKRHOGLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBKVUFQGVWHZIR-UHFFFAOYSA-N 8-oxoguanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=NC(=O)N=C21 UBKVUFQGVWHZIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012110 Alexa Fluor 594 Substances 0.000 description 1
- 239000012111 Alexa Fluor 610 Substances 0.000 description 1
- 239000012112 Alexa Fluor 633 Substances 0.000 description 1
- 239000012115 Alexa Fluor 660 Substances 0.000 description 1
- 239000012116 Alexa Fluor 680 Substances 0.000 description 1
- 239000012117 Alexa Fluor 700 Substances 0.000 description 1
- 239000012118 Alexa Fluor 750 Substances 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N Azide Chemical compound [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- UIZZRDIAIPYKJZ-UHFFFAOYSA-J BoBo-3 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].S1C2=CC=CC=C2[N+](C)=C1C=CC=C1C=CN(CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCCN2C=CC(=CC=CC3=[N+](C4=CC=CC=C4S3)C)C=C2)C=C1 UIZZRDIAIPYKJZ-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- BRDJPCFGLMKJRU-UHFFFAOYSA-N DDAO Chemical compound ClC1=C(O)C(Cl)=C2C(C)(C)C3=CC(=O)C=CC3=NC2=C1 BRDJPCFGLMKJRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N EtOH Substances CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 1
- 238000010867 Hoechst staining Methods 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- QHNORJFCVHUPNH-UHFFFAOYSA-L To-Pro-3 Chemical compound [I-].[I-].S1C2=CC=CC=C2[N+](C)=C1C=CC=C1C2=CC=CC=C2N(CCC[N+](C)(C)C)C=C1 QHNORJFCVHUPNH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- ULHRKLSNHXXJLO-UHFFFAOYSA-L Yo-Pro-1 Chemical compound [I-].[I-].C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4O3)C)=CC=[N+](CCC[N+](C)(C)C)C2=C1 ULHRKLSNHXXJLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ZVUUXEGAYWQURQ-UHFFFAOYSA-L Yo-Pro-3 Chemical compound [I-].[I-].O1C2=CC=CC=C2[N+](C)=C1C=CC=C1C2=CC=CC=C2N(CCC[N+](C)(C)C)C=C1 ZVUUXEGAYWQURQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J YoYo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3O2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2O1 GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- JSBNEYNPYQFYNM-UHFFFAOYSA-J YoYo-3 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=CC=C2N(C3=CC=CC=C3O2)C)=CC=[N+]1CCC(=[N+](C)C)CCCC(=[N+](C)C)CC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=CC=C1N(C)C2=CC=CC=C2O1 JSBNEYNPYQFYNM-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVHDZUFNZLETBM-IWSIBTJSSA-N acridine red 3B Chemical compound [Cl-].C1=C\C(=[NH+]/C)C=C2OC3=CC(NC)=CC=C3C=C21 IVHDZUFNZLETBM-IWSIBTJSSA-N 0.000 description 1
- 125000002015 acyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N ctk1a3526 Chemical compound NP(N)(N)=O DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 229910000514 dolomite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010459 dolomite Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 102000016470 mariner transposase Human genes 0.000 description 1
- 108060004631 mariner transposase Proteins 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M mitoTracker Red Chemical compound [Cl-].C1=CC(CCl)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 108010009127 mu transposase Proteins 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000012508 resin bead Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000010979 ruby Substances 0.000 description 1
- 229910001750 ruby Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007841 sequencing by ligation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M thiazole orange Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4S3)C)=CC=[N+](C)C2=C1 ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ZCUFMDLYAMJYST-UHFFFAOYSA-N thorium dioxide Chemical compound O=[Th]=O ZCUFMDLYAMJYST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ секвенирования нуклеиновой кислоты, включающий: получение образца, содержащего нуклеиновую кислоту; приведение образца в контакт с ДНК-связывающей молекулой, содержащей ДНК-краситель; приведение образца в контакт с инсерционным ферментным комплексом с получением меченых фрагментов нуклеиновых кислот, причем инсерционный ферментный комплекс ингибируется ДНК-связывающей молекулой; и секвенирование меченых фрагментов нуклеиновых кислот с получением чтений последовательности. Также описан способ ингибирования, снижения или устранения вторичных секвенирующих чтений, включающий: получение образца, содержащего первичные нуклеиновые кислоты и вторичные нуклеиновые кислоты; приведение образца в контакт с ДНК-связывающей молекулой, которая предпочтительно связывает вторичные нуклеиновые кислоты, где ДНК-связывающая молекула содержит ДНК-краситель; и выполнение транспонирования ДНК на открытом хроматине, причем вторичные нуклеиновые кислоты не транспонируются или транспонируются с более низкой эффективностью, чем первичные нуклеиновые кислоты. Кроме того, раскрыта библиотека нуклеиновых кислот для секвенирования, полученная указанными способами, содержащая первичные секвенирующие чтения, полученные путем секвенирования ДНК, причем библиотека нуклеиновых кислот не включает в себя или имеет сниженное представление вторичных секвенирующих чтений благодаря ДНК-связывающим молекулам, которые предпочтительно связываются со вторичной ДНК, где ДНК-связывающая молекула содержит ДНК-краситель. Изобретение расширяет арсенал способов секвенирования. 3 н. и 23 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Системы, способы и композиции, предложенные в настоящем документе, относятся к анализам для избирательного контроля ферментативных реакций. В частности аспекты, описанные в настоящем документе, относятся к способам ингибирования, снижения или устранения вторичных секвенирующих чтений ДНК при секвенировании открытого хроматина, секвенировании полного генома или целевом секвенировании.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Ферменты являются полезным инструментом молекулярной биологии и геномики, поскольку они могут выполнять разнообразное число этапов в широком диапазоне областей применения от редактирования геномов, геномных анализов, секвенирования, фармацевтических применений и диагностики. В течение последнего десятка лет наблюдается революция в областях применения и разработках природных и сконструированных ферментов. Большое внимание уделяется специфичности и эффективности с особым акцентом на совершенствовании ферментной системы. Однако ферментативные системы демонстрируют нецелевые эффекты, что затрудняет анализ результатов.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Настоящее изобретение относится к системам, способам и композициям для избирательного контроля ферментативных реакций путем мечения искажающих субстратов, которые нарушают взаимодействие ферментов с субстратом, что позволяет уменьшить или устранить шум или ошибку, которые, как правило, присутствуют в ферментативной реакции.
[0004] Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к библиотекам нуклеиновых кислот, содержащим первичные секвенирующие чтения, полученные в результате секвенирования, например, секвенирующие чтения, полученные в результате секвенирования при анализе на доступный для транспозазы хроматин (ATAC-seq) для ядерной ДНК. В некоторых вариантах осуществления библиотеки нуклеиновых кислот включают в себя секвенирующие чтения из анализа, проводимого для секвенирования полного генома или хромосомной ДНК. В некоторых вариантах осуществления библиотеки нуклеиновых кислот не включают в себя или имеют сниженное представление вторичных секвенирующих чтений, например, с митохондриальной ДНК (мтДНА). В некоторых вариантах осуществления библиотеки нуклеиновых кислот относятся к бактериальной ДНК, плазмидам или внехромосомной ДНК.
[0005] Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к способам секвенирования нуклеиновой кислоты без секвенирования или со сниженным секвенированием вторичных нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления способы включают в себя получение образца, содержащего нуклеиновую кислоту, приведение образца в контакт с ДНК-связывающей молекулой, приведение образца в контакт с инсерционным ферментным комплексом с получением меченых фрагментов нуклеиновой кислоты и секвенирование меченых фрагментов нуклеиновой кислоты с получением чтений последовательностей.
[0006] Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к способам ингибирования, устранения или уменьшения вторичных секвенирующих чтений ДНК, таких как секвенирующие чтения митохондриальной ДНК (мтДНК). В некоторых вариантах осуществления способы включают в себя получение образца, содержащего вторичные нуклеиновые кислоты и первичные нуклеиновые кислоты, приведение образца в контакт с ДНК-связывающей молекулой, которая предпочтительно связывается со вторичными нуклеиновыми кислотами, такими как мтДНК, и выполнение транспонирования ДНК на открытом хроматине, причем вторичные нуклеиновые кислоты не транспонируются или транспонируются со сниженной эффективностью.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0007] На ФИГ. 1 представлена схема, иллюстрирующая модификацию мишени для контроля специфичности фермента. Все субстраты (1, 2 или 3) являются субстратами для фермента (5). Субстрат 3, модифицированный посредством 4, не является субстратом для фермента (5) вследствие модификации (4). Модификация (4) может представлять собой окрашивание ДНК, аффинную метку, молекулу, лиганд, фермент, пептид или другую модификацию.
[0008] На ФИГ. 2А-2С представлены гистограммы, показывающие, что растущие количества красителя Hoechst снижают количество чтений мтДНК в экспериментах с транспонированием, таким образом устраняя или уменьшая количество чтений нежелательной мтДНК. Слева направо: концентрация красителя Hoechst составляет 8 мкМ (ФИГ. 2А), 80 мкМ (ФИГ. 2В) и 800 мкМ (ФИГ. 2С).
[0009] На ФИГ. 3А-3С представлены ДНК-гели, демонстрирующие эффективность транспонирования различных ДНК-окрашивающих красителей. На ФИГ. 3А представлено окрашивание красителями Hoechst и SYBR Gold, на ФИГ. 3В представлено окрашивание Sytox Orange и Pico Green, а на ФИГ. 3С представлено окрашивание Qubit или отсутствие окрашивания. Препараты ДНК с высокой молекулярной массой указывают на неэффективное транспонирование. Как для SYBR Gold, так и для Sytox Orange ингибирование наблюдали при концентрациях более 100 мкМ.
[0010] На ФИГ. 4 представлены результаты различных исследованных красителей, в том числе Hoechst (100 мкМ), SYBR Gold (100 мкМ и 10 мкМ), Sytox Orange (100 мкМ), Pico Green (100 мкМ), Qubit (100 мкМ или 10 мкМ), и при отсутствии красителя. Результаты показывают, что только некоторые красители подходят для снижения или устранения вторичных секвенирующих чтений ДНК.
[0011] На ФИГ. 5 представлены результаты окрашивания Hoechst при 8 мкМ, 80 мкМ и 800 мкМ в течение различных периодов времени (2 минуты или 20 минут).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0012] В приведенном ниже подробном описании содержатся ссылки на соответствующие рисунки, которые являются частью настоящего документа. Если иное не следует из контекста, в графических материалах аналогичные символы, как правило, обозначают аналогичные компоненты. Предполагается, что иллюстративные варианты осуществления, описанные в подробном описании, графических материалах и пунктах формулы изобретения, не имеют ограничительного характера. Допускается использовать другие варианты осуществления и вносить другие изменения без отступления от сущности или объема заявленного объекта изобретения, предложенного в настоящем документе. Следует понимать, что аспекты настоящего описания, как по существу описано в настоящем документе и проиллюстрировано на фигурах, можно перераспределять, заменять, комбинировать, разделять и конструировать в широком спектре разных конфигураций, все из которых явным образом предусмотрены в настоящем описании.
[0013] Варианты осуществления систем, способов и композиций, предложенных в настоящем документе, относятся к контролю ферментативных реакций посредством предотвращения связывания фермента с мешающими субстратами, такими как субстрат, с которым фермент обычно связывается, но который не позволяет провести надлежащий анализ интересующего субстрата.
[0014] Традиционные ферментативные реакции не обладают специфичностью, необходимой для анализа различий между близкородственными субстратами. Например, ферменты к нуклеиновым кислотам плохо различают разные типы нуклеиновых кислот, такие как митохондриальная ДНК (мтДНК) в сравнении с ядерной ДНК. В итоге традиционные ферментативные реакции дают результаты как для целевого аналита, так и для нецелевых аналитов, таким образом спутывая результаты и приводя к временным и финансовым затратам и повышая уровень сложности анализа. Однако во многих сферах применения желательно контролировать избирательность ферментативных реакций.
[0015] Один из вариантов осуществления представляет собой систему и способ уменьшения, ингибирования или устранения нежелательных мишеней, с нацеливанием, таким образом, только на интересующий аналит. На Фиг. 1 схематически представлен принцип связывания фермента с субстратом. На Фиг. 1 фермент 5 способен распознавать и связывать разные субстраты 1, 2 и 3, которые затем ферментативно катализируются ферментом. Однако субстрат 3 модифицируют посредством модификации 4 так, что фермент 5 не распознает и не связывает субстрат 3. На Фиг.1 представлены способы и системы в виде общей схемы. В вариантах осуществления, предложенных в настоящем документе, принцип описан применительно к транспозазе и нуклеиновым кислотам, в частности применительно к первичному секвенирующему чтению ДНК (которое представляет собой секвенирующее чтение интересующей ДНК, включая, например, ядерную ДНК) и ко вторичному секвенирующему чтению ДНК (которое представляет собой секвенирующее чтение нежелательной ДНК, включая, например, митохондриальную ДНК (мтДНК) или внехромосомную ДНК). Однако следует понимать, что общие способы и системы применимы к другим фермент-субстратным системам. Варианты осуществления систем, способов и композиций улучшают специфичность ферментативных реакций, таким образом улучшая ферментативный анализ путем уменьшения нецелевых эффектов.
[0016] Например, данный подход можно применять так, что конкретные красители или ДНК-связывающие молекулы в целом могут доставляться к определенным мишеням с использованием хорошо известных аффинных меток. Эти аффинные метки могут включать в себя антительные конъюгаты и зонды гибридизации ДНК для блокирования нежелательной ферментативной активности. Посредством специфической блокировки определенных типов ДНК, но не других, можно уменьшить нежелательные нецелевые эффекты, которые демонстрируют определенные ферменты. Альтернативно специфические аффинные метки («блокаторы») можно использовать для привлечения ферментов к конкретным мишеням. Такие варианты применения могут включать в себя блокирование нецелевой активности широко используемых белков, таких как CRISPR-ферменты.
[0017] В настоящем документе термин «ДНК-связывающая молекула» относится к молекуле, которая может связываться со всей ДНК, но которая имеет предпочтительный доступ к определенной ДНК вследствие ее доступности, определяемой разнообразными факторами, в том числе, например, размером, зарядом или гидрофобностью ДНК-связывающей молекулы. В результате этого определенные типы ДНК предпочтительно блокируются, тогда как другие доступны для ферментных систем, способных создавать библиотеки секвенирования. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления дифференциальный доступ к ДНК допускается в определенных типах ДНК путем связывания с ДНК-связывающей молекулой, в результате чего ДНК становится менее активной в ферментативных реакциях. Например, ДНК-краситель не попадает в ядро, а может попадать в мтДНК, таким образом предпочтительно блокируя мтДНК.
[0018] Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к библиотеке нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления библиотека нуклеиновых кислот включает в себя секвенирующие чтения, полученные в ходе анализа с секвенированием доступного для транспозазы хроматина (ATAC-seq), для первичной ДНК (такой как ядерная ДНК), но не включает или включает в себя уменьшенные количества секвенирующих чтений нецелевых нуклеиновых кислот (вторичной ДНК), таких как мтДНК. В некоторых вариантах осуществления секвенирующие чтения вторичной ДНК устраняют, уменьшают или ингибируют благодаря ДНК-связывающим молекулам, которые предпочтительно связываются со вторичной ДНК. В некоторых вариантах осуществления ДНК-связывающая молекула содержит ДНК-краситель, аффинную метку, лиганд, фермент, пептид или биомолекулу. В некоторых вариантах осуществления ДНК-краситель содержит краситель Hoechst, SYBR Gold, Sytox Orange, Pico Green или Qubit. В некоторых вариантах осуществления библиотеку нуклеиновых кислот генерируют из популяции клеток, одиночной клетки, популяции клеточных ядер или ядра одиночной клетки.
[0019] В настоящем документе термин «библиотека нуклеиновых кислот» относится к специально созданному набору нуклеиновых кислот, который можно получить синтетическим или биосинтетическим путем во множестве разных форматов (например, библиотеки растворимых молекул и библиотеки олигонуклеотидов, присоединенных к гранулам из смолы, чипам из кремнезема или другим твердым подложкам). Кроме того, термин «матрица» включает в себя те библиотеки нуклеиновых кислот, которые могут быть получены путем нанесения нуклеиновых кислот по существу любой длины (например, от 1 до около 1000 нуклеотидных мономеров в длину) на субстрат.
[0020] Матрица может относиться к популяции различных микроэлементов, таких как микроэлементы, содержащие полинуклеотиды, которые связаны или прикреплены к поверхности таким образом, что разные микроэлементы можно отличать друг от друга в соответствии с относительным местоположением. Отдельный элемент матрицы может включать в себя одну копию микроэлемента или же может присутствовать множество копий микроэлемента в виде популяции микроэлементов в отдельном элементе матрицы. Популяция микроэлементов в каждом элементе, как правило, является гомогенной и имеет один вид микроэлементов. Таким образом, на элементе может присутствовать множество копий одной нуклеотидной последовательности, например, множество молекул нуклеиновых кислот, имеющих одинаковую последовательность.
[0021] В некоторых вариантах осуществления на элементе может присутствовать гетерогенная популяция микроэлементов. В некоторых вариантах осуществления элемент может включать в себя только один вид микроэлементов. В некоторых вариантах осуществления элемент может включать в себя множество разных видов микроэлементов, таких как смесь нуклеиновых кислот, имеющих разные последовательности. Соседние элементы матрицы могут быть отделены друг от друга. Элементы могут быть расположены рядом друг с другом или разделены зазором. В вариантах осуществления, в которых элементы разнесены друг от друга, соседние участки могут быть разнесены, например, на расстояние менее чем 100 мкм, 50 мкм, 10 мкм, 5 мкм, 1 мкм, 0,5 мкм, 100 нм, 50 нм, 10 нм, 5 нм, 1 нм, 0,5 нм или любое расстояние в пределах диапазона из любых двух из вышеперечисленных расстояний. Расположение элементов на матрице также можно понимать с точки зрения межцентровых расстояний между соседними элементами. Матрица, используемая в изобретении, может иметь соседние элементы с межцентровым расстоянием менее чем около 100 мкм, 50 мкм, 10 мкм, 5 мкм, 1 мкм, 0,5 мкм, 100 нм, 50 нм, 10 нм, 5 нм, 1 нм, 0,5 нм или любым расстоянием в пределах диапазона из любых двух из вышеперечисленных расстояний. В некоторых вариантах осуществления значения расстояний, описанные в настоящем документе, могут представлять собой среднее расстояние между соседними элементами матрицы. Таким образом, не все соседние элементы должны находиться в указанном диапазоне, если иное не указано особо, например, посредством конкретного утверждения о том, что расстояние представляет собой пороговое расстояние между всеми соседними элементами матрицы. Варианты осуществления могут включать в себя матрицы, имеющие элементы с различными плотностями. Например, диапазоны плотностей для определенных вариантов осуществления включают в себя от около 10000000 элементов/см2 до около 2000000000 элементов/см2; от около 100000000 элементов/см2 до около 1000000000 элементов/см2; от около 100000 элементов/см2 до около 10000000 элементов/см2; от около 1000000 элементов/см2 до около 5000000 элементов/см2; от около 10000 элементов/см2 до около 100000 элементов/см2; от около 20000 элементов/см2 до около 50000 элементов/см2; от около 1000 элементов/см2 до около 5000 элементов/см2 или с любой плотностью в пределах диапазона из любых двух из вышеуказанных плотностей.
[0022] В настоящем документе термин «поверхность» может относиться к части субстрата или опорной структуры, которая доступна для контакта с реагентами, гранулами или аналитами. Поверхность может быть по существу ровной или плоской. Альтернативно поверхность может иметь закругленную или контурную форму. Примерами контуров, которые можно использовать на поверхности, являются лунки, выемки, столбики, ребра, каналы или т.п. Примеры материалов, которые можно использовать в качестве субстрата или опорной структуры, включают в себя стекло, такое как модифицированное или функционализированное стекло; пластик, такой как акриловый, полистирольный или из сополимера стирола и другого материала, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретан или TEFLON; полисахариды или поперечно-сшитые полисахариды, такие как агароза или сефароза; нейлон; нитроцеллюлоза; смола; кремнезем или материалы на основе кремнезема, включая кремний и модифицированный кремний; углеродное волокно; металл; неорганическое стекло; пучок оптических волокон или различные другие полимеры. Поверхность, пригодная для использования в рамках изобретения, может быть изготовлена из одного материала или смеси нескольких различных материалов. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит лунки.
[0023] В настоящем документе термин «гранула» может относиться к небольшому телу, изготовленному из жесткого или полужесткого материала. Тело может иметь форму, описываемую, например, как сфера, овал, микросфера, или иную принятую форму частиц с симметричными или несимметричными размерами. Примеры материалов, которые можно использовать в гранулах, включают в себя стекло, такое как модифицированное или функционализированное стекло; пластик, такой как акриловый, полистирольный или из сополимера стирола и другого материала, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретан или TEFLON; полисахариды или поперечносшитые полисахариды, такие как агароза или сефароза; нейлон; нитроцеллюлоза; смола; кремнезем или материалы на основе кремнезема, включая кремний и модифицированный кремний; углеродное волокно; металл; неорганическое стекло; пучок оптических волокон или различные другие полимеры. Примеры гранул включают в себя стеклянные гранулы с контролируемыми порами, парамагнитные гранулы, золь двуокиси тория, гранулы сефарозы, нанокристаллы и другие известные в данной области гранулы. Гранулы могут быть изготовлены из биологических или небиологических материалов. Магнитные гранулы особенно пригодны к использованию из-за простоты манипуляций с магнитными гранулами с помощью магнитов. Гранулы, используемые в определенных вариантах осуществления, могут иметь диаметр, ширину или длину от 0,1 мкм до 100 мкм. Размер гранул можно выбирать таким образом, чтобы она имела уменьшенный размер и, следовательно, повышенную плотность, сохраняя при этом достаточный сигнал для анализа элементов.
[0024] В настоящем документе термин «гибридизация», «гибридизировать» или их грамматический эквивалент может относиться к реакции, в которой один или более полинуклеотидов взаимодействуют с образованием комплекса, который по меньшей мере частично образован посредством водородных связей между основаниями нуклеотидных остатков. Водородные связи могут возникать посредством спаривания оснований по Уотсону - Крику, связывания по Хугстину или любым другим специфичным для последовательности способом. Комплекс может иметь две цепочки, образующие дуплексную структуру, три или более цепочки, образующие многоцепочечный комплекс, одну самогибридизующуюся цепь или любую их комбинацию. Кроме водородного связывания цепочки также могут быть поперечно-сшитыми или соединены иными силами.
[0025] В настоящем документе термины «удлиняющий», «удлинение» или их любые грамматические эквиваленты могут относиться к добавлению дНТФ к праймеру, полинуклеотиду или другой молекуле нуклеиновой кислоты ферментом-удлинителем, таким как полимераза. Например, в некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, полученный удлиненный праймер включает в себя информацию о последовательности нуклеиновой кислоты. Хотя в некоторых вариантах осуществления описано выполнение удлинения с использованием полимеразы, такой как ДНК-полимераза или обратная транскриптаза, удлинение может быть выполнено любым другим способом, хорошо известным в данной области. Например, удлинение можно выполнять путем лигирования олигонуклеотидов друг с другом, например, олигонуклеотидов, которые гибридизовались с интересующей цепью.
[0026] В настоящем документе термины «лигирование», «лигировать» или другие их грамматические эквиваленты могут относиться к соединению двух нуклеотидных цепей фосфодиэфирной связью. Лигирование может включать в себя химическое лигирование. Такая реакция может быть катализирована лигазой. Термин «лигаза» относится к классу ферментов, которые катализируют эту реакцию с гидролизом АТФ или аналогичного трифосфата.
[0027] В настоящем документе термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» могут использоваться взаимозаменяемо и могут относиться к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов. Таким образом, эти термины включают в себя одно-, двух- или многоцепочечную ДНК или РНК. Примеры полинуклеотидов включают в себя ген или фрагмент гена, цельную геномную ДНК, геномную ДНК, эпигеномную ДНК, фрагмент геномной ДНК, митохондриальную ДНК (мтДНК), ядерную ДНК, рибосомную ДНК, экзон, интрон, матричную РНК (мРНК), регуляторную РНК, транспортную РНК, рибосомную РНК, некодирующую РНК (нкРНК), такую как РНК, взаимодействующую с PIWI (пиРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК) и длинную некодирующую РНК (длнкРНК), малую шпильку (мшРНК), малую ядерную РНК (мяРНК), микроРНК (мкрРНК), малую ядрышковую РНК (мяшРНК) и вирусную РНК, рибозим, кДНК, рекомбинантный полинуклеотид, разветвленный полинуклеотид, плазмиду, вектор, изолированную ДНК любой последовательности, изолированную РНК любой последовательности, полинуклеотидный зонд, праймер или амплифицированную копию любого из вышеперечисленных. Полинуклеотид может включать в себя модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, включая нуклеотиды с неприродными основаниями, нуклеотиды с модифицированными природными основаниями, такими как аза- или деазапурины. Полинуклеотид может состоять из конкретной последовательности четырех нуклеотидных оснований: аденина (А), цитозина (Ц), гуанина (Г) и тимина (Т). Также может присутствовать урацил (У), например, в качестве естественной замены тимина, если полинуклеотид представляет собой РНК. Урацил также может использоваться в ДНК. Термин «нуклеотидная последовательность» может относиться к буквенному представлению полинуклеотида или любой молекулы нуклеиновой кислоты, включающей природные и неприродные основания. Кроме того, ДНК может содержать неприродную(-ые) пару(-ы) оснований (UBP). UBP представляет собой сконструированную субъединицу (или нуклеотидное основание) ДНК, которая создана в лаборатории и не встречается в природе.
[0028] В настоящем документе первичная нуклеиновая кислота представляет собой интересующую нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления первичная нуклеиновая кислота представляет собой ядерную ДНК. Первичной нуклеиновой кислотой может быть любая нуклеиновая кислота, которую требуется проанализировать в образце. В настоящем документе вторичная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая присутствует в образце, но не является интересующей нуклеиновой кислотой и, следовательно, является интерферентом в контексте анализа интересующей нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления вторичная нуклеиновая кислота представляет собой митохондриальную ДНК (мтДНК) или внехромосомную ДНК. Вторичная нуклеиновая кислота может представлять собой любую нуклеиновую кислоту, которая присутствует в образце, но не является объектом анализа, и которую желательно ингибировать, уменьшить ее содержание или устранить из анализа с целью более эффективного и точного анализа интересующей нуклеиновой кислоты. Внехромосомная ДНК представляет собой любую ДНК, находящуюся за пределами ядра клетки. Ее также называют внеядерной ДНК или цитоплазматической ДНК.
[0029] Нуклеиновая кислота может содержать фосфодиэфирные связи и может иметь другие типы каркасов, включая, например, фосфорамидные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, О-метилфосфорамидитные и пептидные каркасы и связи нуклеиновых кислот. Нуклеиновая кислота может содержать любую комбинацию дезоксирибо- и рибонуклеотидов и любую комбинацию оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин, изогуанин и аналоги оснований, такие как нитропиррол (включая 3-нитропиррол) и нитроиндол (включая 5-нитроиндол). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может включать в себя по меньшей мере одно универсальное основание. Универсальное основание может спариваться с основаниями более чем одного другого типа оснований и может использоваться, например, при включении в олигонуклеотидные праймеры или вставки, которые используются для случайной гибридизации в образцах сложных нуклеиновых кислот, таких как образцы геномной ДНК. Примером универсального основания является инозин, который может спариваться с аденином, тимином или цитозином. Другие примеры включают в себя гипоксантин, 5-нитроиндол, ациклический 5-нитроиндол, 4-нитропиразол, 4-нитроимидазол и 3-нитропиррол. Можно использовать универсальные основания, которые могут спариваться с основаниями по меньшей мере двух, трех, четырех или более типов.
[0030] Анализ доступного для транспозазы хроматина с использованием секвенирования (ATAC-seq) относится к быстрому и чувствительному способу интегративного эпигеномного анализа. ATAC-seq захватывает открытые сайты хроматина и выявляет взаимосвязь между геномными позициями открытого хроматина, ДНК-связывающими белками, отдельными нуклеосомами и компактизацией более высокого порядка в регуляторных областях с нуклеотидным разрешением. Обнаружены классы ДНК-связывающих факторов, которые строго избегают, способны переносить или склонны перекрываться с нуклеосомами. Используя ATAC-seq, измеряли и оценивали последовательные ежедневные эпигеномы покоящихся человеческих Т-клеток у испытуемого посредством стандартных заборов крови, демонстрируя возможность считывания личных эпигеномов в клинических масштабах времени для контроля состояния здоровья и течения заболевания. Более конкретно, ATAC-seq можно выполнять путем обработки хроматина из одиночной клетки инсерционным ферментным комплексом с получением меченых фрагментов геномной ДНК. На этом этапе хроматин фрагментируют и метят (например, фрагментируют и метят в одной и той же реакции) с использованием инсерционного фермента, такого как Tn5 или MuA, который расщепляет геномную ДНК в открытых областях хроматина и добавляет адаптеры к обоим концам фрагментов. В некоторых вариантах осуществления применение представляет собой секвенирование полного генома или эпигеномное профилирование.
[0031] Секвенированием полного генома (WGS) называется способ многократного чтения генома, например, в форматах 10×, 20× и 40×, в целях секвенирования полного генома с использованием секвенирования следующего поколения. Целевым секвенированием называются способы или анализы, в которых определяют последовательность ДНК в выбранных локусах ДНК или генах в образце, например, секвенирование выбранной группы связанных с раком генов.
[0032] В некоторых случаях условия можно регулировать для получения желаемого уровня вставок в хроматин (например, вставку, которая происходит в среднем каждые 50-200 пар нуклеотидов в открытых областях). Хроматин, используемый в способе, может быть получен любым подходящим способом. В некоторых вариантах осуществления ядра могут быть выделены и лизированы, и хроматин может быть дополнительно очищен, например, от ядерной оболочки. В других вариантах осуществления хроматин может быть выделен путем приведения выделенных ядер в контакт с реакционным буфером. В этих вариантах осуществления выделенные ядра могут лизироваться при контакте с реакционным буфером (который содержит инсерционные ферментные комплексы и другие необходимые реагенты), что обеспечивает доступ инсерционных ферментных комплексов к хроматину. В этих вариантах осуществления способ может включать в себя выделение ядер из популяции клеток и объединение выделенных ядер с транспозазой и адаптерами, причем объединение приводит как к лизису ядер с высвобождением указанного хроматина, так и к получению меченных адаптером фрагментов геномной ДНК. Хроматин не требует поперечного сшивания, как в других способах (например, в способах ChIP-SEQ). В некоторых вариантах осуществления ферментативные реакции протекают непосредственно от клеток.
[0033] После фрагментации и мечения хроматина для получения меченых фрагментов геномной ДНК по меньшей мере некоторые из меченных адаптером фрагментов секвенируют для получения множества чтений последовательностей. Фрагменты можно секвенировать, используя любой подходящий способ. Например, фрагменты можно секвенировать по способу Illumina с обратимым терминатором, способу пиросеквенирования Roche (454), секвенирования Life Technologies путем лигирования (платформа SOLiD) или использования платформы Ion Torrent от Life Technologies. Примеры таких способов описаны в следующих публикациях: Margulies et al. (Nature 2005 437: 376-80); Ronaghi et al. (Analytical Biochemistry 1996 242: 84-9); Shendure et al. (Science 2005 309: 1728-32); Imelfort et al. (Brief Bioinform. 2009 10:609-18); Fox et al. (Methods Mol Biol. 2009;553:79-108); Appleby et al. (Methods Mol Biol. 2009; 513:19-39) и Morozova et al. (Genomics. 2008 92:255-64), которые включены в настоящий документ путем ссылки в целях предоставления общих описаний способов и конкретных этапов способов, включая все исходные продукты, способы получения библиотек, реагенты и конечные продукты для каждого из этапов. Как будет очевидно, сайты праймеров прямого и обратного секвенирования, совместимые с выбранной платформой для секвенирования следующего поколения, можно добавлять к концам фрагментов на этапе амплификации. В определенных вариантах осуществления фрагменты можно амплифицировать с использованием ПЦР-праймеров, которые гибридизуются с метками, добавленными к фрагментам, причем праймер, используемый для ПЦР, имеет 5'-хвосты, совместимые с конкретной платформой секвенирования. Способы выполнения анализа ATAC-seq описаны в заявке на РСТ № PCT/US 2014/038825, которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки.
[0034] В настоящем документе термин «хроматин» относится к комплексу молекул, включающему в себя белки и полинуклеотиды (например, ДНК, РНК), такому как обнаруживаемый в ядре эукариотической клетки. Хроматин частично состоит из гистоновых белков, образующих нуклеосомы, геномной ДНК и других ДНК-связывающих белков (например, факторов транскрипции), которые обычно связаны с геномной ДНК.
[0035] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, дополнительно включают в себя дополнительный анализ интересующей целевой нуклеиновой кислоты. Анализ может включать в себя, например, анализ ДНК, анализ РНК, анализ белков, фрагментацию с мечением, амплификацию нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеиновых кислот, получение библиотек нуклеиновых кислот, транспонирование с сохранением смежности (CPT-seq), комбинаторное индексированное секвенирование на одиночной клетке (SCI-seq) или амплификацию генома одиночной клетки, секвенирование полного генома по одиночным клеткам или по популяциям клеток, эпигеномику или любую их комбинацию.
[0036] Анализом ДНК называется любая методика, используемая для амплификации, секвенирования или иного анализа ДНК. Амплификация ДНК может быть выполнена с использованием ПЦР-методик. Анализ ДНК может также содержать методики ненацеленного и не основанного на ПЦР секвенирования ДНК (например, метагеномика). В качестве не имеющего ограничительного характера примера анализ ДНК может включать в себя секвенирование гипервариабельной области 16S рДНК (рибосомной ДНК) и использование секвенирования для идентификации видов по ДНК. В некоторых вариантах осуществления ДНК может включать в себя очищенную ДНК.
[0037] Анализом РНК называется любая методика, используемая для амплификации, секвенирования или иного анализа РНК. Для амплификации и секвенирования РНК можно использовать те же методики, что и для анализа ДНК. РНК, которая менее стабильна, чем ДНК, транслируется с ДНК в ответ на стимулы. Таким образом, анализ РНК может дать более точную картину метаболически активных членов сообщества и может использоваться для получения информации о работе сообщества организмов в образце. Секвенирование нуклеиновых кислот относится к использованию секвенирования для определения порядка нуклеотидов в последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК. В некоторых вариантах осуществления анализ ДНК также может включать в себя способы, которые не требуют или не используют амплификацию.
[0038] В настоящем документе термин «секвенирование» относится к способу, которым идентифицируют по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидов (например, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 200 или более последовательных нуклеотидов) полинуклеотида.
[0039] Термины «секвенирование следующего поколения», «высокопроизводительное секвенирование» или «NGS» по существу относятся к высокопроизводительным технологиям секвенирования, включая, без ограничений, массивно-параллельное опознавательное секвенирование, высокопроизводительное секвенирование, секвенирование с лигированием (например, секвенирование SOLiD), протон-ионное полупроводниковое секвенирование, секвенирование ДНК на наносферах, секвенирование одиночных молекул и секвенирование через нанопоры, и может относиться к параллелизированным платформам секвенирования путем синтеза или секвенирования путем лигирования, используемым в настоящее время компаниями Illumina, Life Technologies или Roche и т.д. Способы секвенирования следующего поколения могут также включать в себя способы секвенирования через нанопоры или способы электронного обнаружения, такие как технология Ion Torrent, предлагаемая компанией Life Technologies, или способ, основанный на флуоресценции одиночных молекул, предлагаемый компанией Pacific Biosciences и/или BGI Microfluidics.
[0040] Примеры методик секвенирования включают в себя целевое секвенирование, секвенирование отдельных молекул в реальном времени, секвенирование на основе электронной микроскопии, опосредованное транзиторами секвенирование, прямое секвенирование, случайное секвенирование методом «выстрел дробовика», секвенирование с дидезокситерминированием по Сэнгеру, целевое секвенирование, секвенирование экзонов, секвенирование всего генома, секвенирование путем гибридизации (например, на матрице, такой как микроматрица), пиросеквенирование, капиллярный электрофорез, гель-электрофорез, дуплексное секвенирование, цикловое секвенирование, секвенирование с удлинениями на одно основание, твердофазное секвенирование, высокопроизводительное секвенирование, массивное параллельное секвенирование методом «выстрел из дробовика», эмульсионная ПЦР, ко амплификация при пониженной температуре денатурации с ПЦР (COLD-ПЦР), мультиплексная ПЦР, секвенирование посредством обратимого терминатора-красителя, секвенирование спаренных концов, краткосрочное секвенирование, экзонуклеазное секвенирование, секвенирование путем лигирования, секвенирование коротких чтений, секвенирование отдельных молекул, секвенирование путем синтеза, секвенирование в реальном времени, секвенирование с обратным терминатором, ионное полупроводниковое секвенирование, секвенирование с наносферами, секвенирование через нанопоры, секвенирование 454, секвенирование с помощью анализатора Solexa Genome Analyzer, miSeq (Illumina), HiSeq 2000 (Illumina), HiSeq 2500 (Illumina), Illumina Genome Analyzer (Illumina), Ion Torrent PGM™ (Life Technologies), MinlON™ (Oxford Nanopore Technologies), технология реального времени SMRT™ (Pacific Biosciences), Probe-Anchor Ligation (cPAL™) (Complete Genomics/BGI), секвенирование SOLiD®, секвенирование MS-PET, масс-спектрометрия и их комбинация. В некоторых вариантах осуществления секвенирование включает в себя обнаружение продукта секвенирования с помощью прибора, например, без ограничений, ДНК-секвенатора ABI PRISM® 377, ABI PRISM® 310, 3100, 3100-Avant, 3730 или генетического анализатора 373OxI, ДНК-анализатора ABI PRISM® 3700 или системы Applied Biosystems SOLiD™ (все производства Applied Biosystems), системы Genome Sequencer 20 (Roche Applied Science) или масс-спектрометра. В определенных вариантах осуществления секвенирование содержит эмульсионную ПЦР. В определенных вариантах осуществления секвенирование содержит методику высокопроизводительного секвенирования. В определенных вариантах осуществления секвенирование содержит секвенирование полного генома. В определенных вариантах осуществления секвенирование содержит массивно-параллельное секвенирование (например, массивно-параллельное секвенирование методом «выстрел из дробовика»). Альтернативно секвенирование включает в себя целевое секвенирование.
[0041] Анализом белков называется исследование белков, которое может включать в себя протеомный анализ, определение посттрансляционной модификации интересующих белков, определение уровней экспрессии белков или определение взаимодействий белков с другими молекулами, в том числе с другими белками или нуклеиновыми кислотами.
[0042] В настоящем документе термин «тагментация» относится к модификации ДНК транспосомным комплексом, содержащим фермент транспозазу в комплексе с адаптерами, содержащими концевую последовательность транспозона. Фрагментация с мечением приводит к одновременной фрагментации ДНК и лигированию адаптеров к 5'-концам обеих цепей дуплексных фрагментов. После этапа очистки для удаления фермента-транспозазы к концам адаптированных фрагментов можно добавить дополнительные последовательности, например, с помощью ПЦР, лигирования или любой другой приемлемой методики, известной специалистам в данной области.
[0043] Секвенирование с транспозицией с сохранением смежности (СРТ-seq) относится к способу секвенирования при сохранении информации о смежности с использованием транспозазы с целью сохранения связи соседних фрагментов шаблонной нуклеиновой кислоты в целевой нуклеиновой кислоте. Например, СРТ можно проводить на нуклеиновой кислоте, такой как ДНК. СРТ-нуклеиновую кислоту можно захватывать путем гибридизации комплементарных олигонуклеотидов, имеющих уникальные индексы или штрихкоды, и иммобилизовать на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид, иммобилизованный на твердой подложке, в дополнение к штрихкодам может также содержать сайты связывания праймеров, уникальные молекулярные индексы. Преимуществом является то, что такое использование транспосом для поддержания физической близости фрагментированных нуклеиновых кислот повышает вероятность того, что фрагментированные нуклеиновые кислоты из той же исходной молекулы, например хромосомы, получат одинаковый уникальный штрихкод и индексную информацию от олигонуклеотидов, иммобилизованных на твердой подложке. В результате этого получается библиотека смежно-связанного секвенирования с уникальными штрихкодами. Библиотеку смежно-связанного секвенирования можно секвенировать для получения информации о смежности последовательности.
[0044] В настоящем документе термин «информация о смежности» относится к пространственным отношениям между двумя или более фрагментами ДНК на основе общей информации. Общий аспект информации может относиться к ближним, компартментным и дистантным пространственным отношениям. Информация об этих отношениях в молекулах облегчает иерархическую сборку или картирование чтений последовательностей, полученных из фрагментов ДНК. Эта информация о смежности повышает эффективность и точность такой сборки или картирования, поскольку традиционные способы сборки или картирования, используемые в связи с традиционными способами секвенирования методом «выстрел из дробовика», не учитывают относительные геномные точки начала или координаты отдельных чтений последовательности применительно к пространственным отношениям между двумя или более фрагментами ДНК, из которых получали отдельные чтения последовательности.
[0045] Таким образом, в соответствии с вариантами осуществления, описанными в настоящем документе, могут быть реализованы способы получения информации о смежности способами определения смежности ближнего диапазона для определения смежных пространственных отношений, способами определения смежности среднего диапазона для определения компартментных пространственных отношений или способами определения смежности дальнего диапазона для определения дистантных пространственных отношений. Эти способы способствуют точности и качеству сборки или картирования последовательности ДНК и могут использоваться с любым способом секвенирования, таким как описанные в настоящем документе.
[0046] Информация о смежности включает в себя относительное геномные точки начала или координаты отдельных чтений последовательности применительно к пространственным отношениям между двумя или более фрагментами ДНК, из которых были получены отдельные чтения последовательности. В некоторых вариантах осуществления информация о смежности включает в себя информацию о последовательности из неперекрывающихся чтений последовательности.
[0047] В некоторых вариантах осуществления информация о смежности для целевой нуклеотидной последовательности указывает на информацию о гаплотипе. В некоторых вариантах осуществления информация о смежности для целевой нуклеотидной последовательности указывает на информацию о геномных вариантах.
[0048] Комбинаторное индексированное секвенирование на одиночной клетке (SCI-seq) представляет собой методику секвенирования для одновременного создания тысяч библиотек одиночных клеток для разнообразных анализов, включая, например, полный геном, метилирование, РНК, одновременно ДНК и РНК, или Hi-C, или другие анализы библиотек, или любую их комбинацию.
[0049] Реакция транспонирования представляет собой реакцию, в которой один или более транспозонов вставляются в целевые нуклеиновые кислоты в случайных сайтах или почти случайных сайтах. Компоненты реакции транспонирования включают в себя транспозазу (или другой фермент, способный к фрагментированию и мечению нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем документе, такой как интеграза) и транспозонный элемент, который включает в себя двухцепочечную транспозонную концевую последовательность, связывающуюся с транспозазой (или другим ферментом, как описано в настоящем документе), и адапторную последовательность, присоединенную к одной из двух концевых последовательностей транспозона. Одна цепь двухцепочечной транспозонной концевой последовательности переносится в одну цепь целевой нуклеиновой кислоты, а комплементарная цепь транспозонной концевой последовательности не переносится (непереносящаяся транспозонная последовательность). Адапторная последовательность при необходимости или желании может включать в себя одну или более функциональных последовательностей или компонентов (например, последовательности праймеров, якорные последовательности, универсальные последовательности, спейсерные участки или последовательности индексных меток).
[0050] Технологию на основе транспозонов можно применять для фрагментации ДНК, например, как показано в примере рабочего процесса для наборов подготовки образцов NEXTERA™ XT и FLEX DNA (Illumina, Inc.), в которых целевые нуклеиновые кислоты, такие как геномная ДНК, обрабатывают транспосомными комплексами, которые одновременно фрагментируют и метят (тагментация) мишень, таким образом создавая популяцию фрагментированных молекул нуклеиновой кислоты, меченных уникальными адапторными последовательностями на концах фрагментов.
[0051] В настоящем документе термин «инсерционный ферментный комплекс» относится к комплексу, содержащему инсерционный фермент и две адапторные молекулы («транспозонные метки»), которые объединяют с полинуклеотидами для фрагментирования и добавления адаптеров к полинуклеотидам. Таким образом, инсерционный ферментный комплекс может представлять собой «транспосомный комплекс», состоящий из по меньшей мере одной транспозазы (или другого фермента, описанного в настоящем документе) и последовательности распознавания транспозона. В некоторых таких системах транспозаза связывается с последовательностью распознавания транспозона с образованием функционального комплекса, который способен катализировать реакцию транспонирования. В некоторых аспектах последовательность распознавания транспозона представляет собой двухцепочечную концевую последовательность транспозона. Транспозаза связывается с сайтом распознавания транспозазы в целевой нуклеиновой кислоте и вставляет последовательность распознавания транспозона в целевую нуклеиновую кислоту. В некоторых таких событиях вставки одна цепь последовательности распознавания транспозона (или концевой последовательности) переносится в целевую нуклеиновую кислоту, в результате чего происходит событие расщепления. Примеры процедур и систем транспонирования, которые можно легко адаптировать к использованию с транспозазами по настоящему описанию, описаны, например, в публикациях РСТ № WO10/048605, публикации патента США №2012/0301925, публикации патента США №2012/13470087 или публикации патента США №2013/0143774, каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки.
[0052] Примеры транспозаз, которые можно использовать с определенными вариантами осуществления, предложенными в настоящем документе, включают в себя (или кодируются ими): транспозазу Тп5 (см. Reznikoff et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 266, 729-734), транспозазу Sleeping Beauty (SB), Vibrio Haryi (транспозаза, охарактеризованная Agilent и используемая в продукте SureSelect QXT), транспозазу MuA и сайт распознавания транспозазы Mu, содержащий концевые последовательности R1 и R2 (Mizuchi, K., Cell, 35: 785, 1983; Savilahti, Η, et al., EMBO J., 14:4893, 1995), Staphylococcus aureus Tn552 (Colegio, O. et al., J. Bacteriol., 183:2384-8, 2001; Kirby, C. et al., Mol. Microbiol., 43:173-86, 2002), Tyl (Devine & Boeke, Nucleic Acids Res., 22:3765-72, 1994 и публикация РСТ № W095/23875), транспозон Tn7 (Craig, N.L., Science, 271:1512, 1996; Craig, N.L., Curr. Top.Microbiol. Immunol., 204:27-48, 1996), Tn/O и IS10 (Kleckner N. et al., Curr. Top.Microbiol. Immunol., 204:49-82, 1996), транспозазу Mariner (Lampe, D.J. et al., EMBO J., 15:5470-9, 1996), Tel (Plasterk, R.H., Curr. Top.Microbiol. Immunol., 204:125-43, 1996), Ρ Element (Gloor, G.B., Methods Mol. Biol., 260:97-114, 2004), Tn3 (Ichikawa & Ohtsubo, J. Biol. Chem., 265:18829-32, 1990), бактериальные инсерционные последовательности (Ohtsubo & Sekine, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:1-26, 1996), ретровирусы (Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2525-9, 1989) и ретротранспозон дрожжей (Boeke & Corces, Ann. Rev. Microbiol. 43:403-34, 1989). Дополнительные примеры включают в себя IS5, Tn10, Tn903, IS911 и сконструированные версии ферментов семейства транспозаз (Zhang et al., (2009) PLoS Genet. 5:el000689. Epub Oct. 16; Wilson C. et al. (2007) J. Microbiol. Methods 71:332-5), причем каждый из источников, процитированных в настоящем документе в отношении транспозазы, полностью включен в настоящий документ путем ссылки. Способы, описанные в настоящем документе, также могут включать в себя комбинации транспозаз, а не только одну транспозазу.
[0053] В некоторых вариантах осуществления транспозаза представляет собой транспозазу Tn5, MuA или транспозазу Vibrio Haryi либо их активный мутант. В других вариантах осуществления транспозаза представляет собой транспозазу Tn5 или ее активный мутант.В некоторых вариантах осуществления транспозаза Tn5 представляет собой гиперактивную транспозазу Tn5 (см., например, Reznikoff et al., публикацию РСТ № WO2001/009363, патенты США №№5,925,545, 5,965,443, 7,083,980 и 7,608,434 и Goryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem. 273:7367, 1998) или ее активный мутант. В некоторых аспектах транспозаза Tn5 представляет собой транспозазу Tn5, как описано в публикации РСТ № WO2015/160895, которая включена в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления транспозаза Tn5 представляет собой гибридный белок. В некоторых вариантах осуществления гибридный белок транспозаза Tn5 содержит слитую метку - фактор элонгации Ts (Tsf). В некоторых вариантах осуществления транспозаза Tn5 представляет собой гиперактивную транспозазу Tn5, содержащую мутации по аминокислотам 54, 56 и 372 относительно последовательности дикого типа. В некоторых вариантах осуществления гиперактивная транспозаза Tn5 представляет собой гибридный белок, причем необязательно слитый белок представляет собой фактор элонгации Ts (Tsf). В некоторых вариантах осуществления сайт распознавания представляет собой сайт распознавания транспозазы типа Tn5 (Goryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367, 1998). В одном варианте осуществления используют сайт распознавания транспозазы, образующий комплекс с гиперактивной транспозазой Tn5 (например, транспозазой EZ-Tn5™, Epicentre Biotechnologies, г.Мэдисон, штат Висконсин, США). В некоторых вариантах осуществления транспозаза Tn5 представляет собой транспозазу Tn5 дикого типа.
[0054] В любом из вариантов осуществления способов, композиций или систем, описанных в настоящем документе, транспозон включает в себя концевую последовательность транспозона. В некоторых вариантах осуществления концевая последовательность транспозона представляет собой мозаичную концевую (ME) последовательность. В некоторых вариантах осуществления ДНК помечена с использованием тагментации, причем ДНК помечена меткой и в метку включена транспозон-специфическая последовательность, такая как МЕ-последовательность. Таким образом, ДНК в образце дифференцируется от РНК на основе транспозон-специфической последовательности.
[0055] В любом из вариантов осуществления способов, композиций или систем, описанных в настоящем документе, транспозон включает в себя адапторную последовательность. Адапторные последовательности могут содержать одну или более функциональных последовательностей или компонентов, выбранных из группы, состоящей из последовательностей праймеров, якорных последовательностей, универсальных последовательностей, спейсерных областей, индексных последовательностей, последовательностей захвата, штрихкод-последовательностей, последовательностей расщепления, последовательностей, связанных с секвенированием, и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления адапторная последовательность содержит последовательность праймера. В других вариантах осуществления адапторная последовательность содержит последовательность праймера и индексную последовательность или штрихкод-последовательность. Последовательность праймера также может представлять собой универсальную последовательность. Настоящее описание не ограничено типом допустимых для использования адапторных последовательностей, и специалисту в данной области будут понятны дополнительные последовательности, которые могут использоваться для получения библиотеки и секвенирования следующего поколения. Универсальная последовательность представляет собой область нуклеотидной последовательности, которая является общей для двух или более фрагментов нуклеиновых кислот. Необязательно два или более фрагмента нуклеиновых кислот также имеют области с различиями в последовательности. Универсальная последовательность, которая может присутствовать в разных из множества фрагментов нуклеиновых кислот, может обеспечивать репликацию или амплификацию множества разных последовательностей с использованием одного универсального праймера, комплементарного универсальной последовательности.
[0056] Адаптеры включают в себя нуклеиновые кислоты, такие как одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Адаптеры могут включать в себя короткие нуклеиновые кислоты, имеющие длину менее чем, более чем или равную около 5 нуклеотидов, 10 нуклеотидов, 20 нуклеотидов, 30 нуклеотидов, 40 нуклеотидов, 50 нуклеотидов, 60 нуклеотидов, 70 нуклеотидов, 80 нуклеотидов, 90 нуклеотидов, 100 нуклеотидов или находящуюся в диапазоне между любыми двумя из вышеуказанных размеров.
[0057] В любом из вариантов осуществления адапторная последовательность или концевые последовательности транспозона, включая А14-МЕ, ME, В15-МЕ, ME', А14, В15 и ME, представлены ниже:
[0058] В некоторых вариантах осуществления включены последовательности праймеров для получения библиотек для секвенирования. В некоторых вариантах осуществления последовательность праймера представляет собой последовательность праймера Р5 или последовательность праймера Р7. Праймеры Р5 и Р7 используют на поверхности коммерческих проточных ячеек, поставляемых компанией Illumina, Inc., для секвенирования на различных платформах Illumina. В патентной публикации США №2011/0059865 А1 описаны последовательности праймеров, которые полностью включены в настоящий документ путем ссылки. К примерам праймеров Р5 и Ρ7, которые могут иметь алкиновую концевую группу на 5'-конце, относятся следующие:
[0059] и их производные или аналоги. В некоторых примерах последовательность Р7 включает в себя модифицированный гуанин в положении G*, например, 8-оксогуанин. В других примерах символ * указывает на то, что связь между G* и смежным 3' А представляет собой фосфоротиоатную связь. В некоторых примерах праймеры Р5 и/или Р7 включают в себя неприродные линкеры. Необязательно один или оба из праймеров Р5 и Р7 могут включать в себя хвост поли-Т. Хвост поли-Т по существу расположен на 5'-конце указанной выше последовательности, например, между 5'-основанием и концевым алкиновым звеном, но в некоторых случаях может быть расположен на 3'-конце. Последовательность поли-Т может включать в себя любое число Т-нуклеотидов, например от 2 до 20. Хотя в качестве примеров приведены праймеры Р5 и Р7, следует понимать, что в примерах, представленных в настоящем документе, можно использовать любые подходящие праймеры. Индексные последовательности, содержащие последовательности праймеров, включая последовательности праймеров Р5 и Р7, служат для добавления Р5 и Р7 в целях активации библиотеки для секвенирования.
[0060] Связывающая нуклеиновую кислоту молекула представляет собой молекулу, которая предпочтительно связывается с нуклеиновой кислотой, например, с ДНК или РНК. Связывающая нуклеиновую кислоту молекула, например ДНК-связывающая молекула, может быть специфичной к определенному типу нуклеиновой кислоты, не связываясь с другими типами нуклеиновых кислот. Например, ДНК-связывающая молекула может предпочтительно связываться с мтДНК, но не связываться или в меньшей степени связываться с другими нуклеиновыми кислотами, такими как ядерная ДНК. Примеры молекул, связывающих нуклеиновую кислоту, включают в себя пигмент или краситель, белок, фермент, биомолекулу, аффинную метку, частицу, флуоресцентную метку, пептид, лиганд или другую молекулу, способную специфически связываться с нуклеиновой кислотой. Таким образом, в некоторых примерах связывающая нуклеиновую кислоту молекула представляет собой краситель Hoechst, цианиновый краситель (включая, например, красители SYBR, такие как SYBR зеленый, SYBR золотой, оксазоловый желтый, тиазоловый оранжевый, Pico Green, Safe зеленый), 4',6-диамидино-2-фенилиндольные (DAPI) красители или красители Sytox (включая, например, Sytox зеленый или Sytox оранжевый). К другим связывающим нуклеиновые кислоты молекулам могут относиться, например, 7-AAD (7-аминоактиномицин D), акридиновый оранжевый, акридиновый красный, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610 R-фикоэритрин стрептавидин pH 7,2, Alexa Fluor 647 R-фикоэритрин стрептавидин pH 7,2. Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, аллофикоцианин (APC), BOBO-3-DNA, BOBO-3, Bodipy 650/665-X, Cy5.5, Cy5, DDAO, Draq5, бромид этидия, моноазид этидия, гомодимер этидия, гомодимер-1 этидия (EthD-1), гомодимер-1-ДНК этидия, гомодимер-2 этидия, LDS 751, LDS 751 (ДНК), LOLO-1, MitoTracker red, Nile blue-EtOH, OliGreen, реагент для количественного определения дцДНК, POPO-1-DNA, PO-PRO-1-DNA, йодид пропидия (PI), йодид-ДНК пропидия, Ribogreen, SYPRO Ruby, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, Texas Red, TO-PRO-1-DNA, TO-PRO-3, TO-PRO-5, TOTO-1-DNA, TOTO-3, YO-PRO-1-DNA, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-1-DNAh YOYO-3. Эти связывающие нуклеиновые кислоты молекулы представляют собой примеры пригодных для использования молекул, и специалисту в данной области будет понятно, что можно использовать любую связывающуюся с нуклеиновой кислотой молекулу, которая отличает интересующую целевую нуклеиновую кислоту от нецелевых нуклеиновых кислот.
[0061] Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к способу секвенирования нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления способ включает в себя получение образца, содержащего нуклеиновую кислоту, приведение образца в контакт с ДНК-связывающей молекулой, приведение образца в контакт с инсерционным ферментным комплексом с получением меченых фрагментов нуклеиновой кислоты и секвенирование меченых фрагментов нуклеиновой кислоты с получением чтений последовательности. В некоторых вариантах осуществления образец получен из популяции клеток, одиночной клетки, популяции клеточных ядер или ядра одиночной клетки. В некоторых вариантах осуществления образец содержит мтДНК и ядерную ДНК, причем ДНК-связывающая молекула связывается с мтДНК, но не с ядерной ДНК. В некоторых вариантах осуществления ДНК-связывающая молекула содержит ДНК-краситель, аффинную метку, лиганд, фермент, пептид или биомолекулу. В некоторых вариантах осуществления ДНК-краситель содержит краситель Hoechst, SYBR Gold, Sytox Orange, Pico Green или Qubit. В некоторых вариантах осуществления инсерционный ферментный комплекс представляет собой транспосому, содержащую транспозазу. В некоторых вариантах осуществления секвенирование выполняют с помощью ATAC-seq. В некоторых вариантах осуществления ATAC-seq включает в себя массовый ATAC-seq или ATAC-seq на одиночных клетках. В некоторых вариантах осуществления способ ингибирует, уменьшает или устраняет секвенирующие чтения мтДНК. В некоторых вариантах осуществления связывающая нуклеиновую кислоту молекула предпочтительно связывается со специфической последовательностью или последовательностями ДНК.
[0062] Некоторые варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, относятся к способу ингибирования, снижения или устранения секвенирующих чтений мтДНК. В некоторых вариантах осуществления способ включает в себя получение образца, содержащего мтДНК и интересующую нуклеиновую кислоту, приведение образца в контакт со связывающей ДНК молекулой, которая предпочтительно связывается со вторичной ДНК, такой как мтДНК, и выполнение транспонирования ДНК на открытом хроматине, причем вторичная ДНК, такая как мтДНК, не транспонируется. В некоторых вариантах осуществления образец получен из популяции клеток, одиночной клетки, популяции клеточных ядер или ядра одиночной клетки. В некоторых вариантах осуществления ДНК-связывающая молекула содержит ДНК-краситель, аффинную метку, лиганд, фермент, пептид или биомолекулу. В некоторых вариантах осуществления ДНК-краситель содержит краситель Hoechst, SYBR Gold, Sytox Orange, Pico Green или Qubit. В некоторых вариантах осуществления транспонирование ДНК выполняют с использованием ATAC-seq. В некоторых вариантах осуществления ATAC-seq включает в себя массовый ATAC-seq или ATAC-seq на одиночных клетках. В некоторых вариантах осуществления приведение образца в контакт с ДНК-связывающей молекулой блокирует транспонирование в мтДНК. В некоторых вариантах осуществления интересующая нуклеиновая кислота содержит ядерную ДНК. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя секвенирование ядерной ДНК.
[0063] В настоящем документе термин «образец» относится к любому образцу, содержащему интересующий аналит. Образец может представлять собой биологический образец, такой как биологический образец, содержащий интересующий аналит, включая, например, цельную кровь, сыворотку, тканевую жидкость, лимфу, спинномозговую жидкость, мокроту, мочу, кал, молоко, пот, слезную жидкость, пуповину, периферическую кровь, костный мозг, клетки или твердую ткань. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой популяцию клеток, клетку, популяцию клеточных ядер или ядро клетки. Образец может быть получен от субъекта, причем у субъекта желательно провести анализ одного или более интересующих аналитов. В настоящем документе термин «субъект» относится к животному, которое является объектом лечения, наблюдения или эксперимента. Термин «животные» включает в себя холоднокровных и теплокровных позвоночных и беспозвоночных, таких как рыбы, моллюски, рептилии, и в частности млекопитающие. Термин «млекопитающие» включает в себя, без ограничений, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, собак, кошек, овец, коз, коров, лошадей, приматов, таких как обезьяны, шимпанзе и человекообразные обезьяны, и в частности людей.
[0064] Образец может представлять собой текучую среду или пробу, полученные из источника в окружающей среде. Например, текучая среда или проба, полученные из источника в окружающей среде, могут быть получены или произведены из пищевых продуктов, продуктов питания, птицы, мяса, рыбы, напитков, молочного продукта, воды (включая сточные воды), прудов, рек, резервуаров, плавательных бассейнов, почв, установок по переработке и/или упаковке пищевых продуктов, сельскохозяйственных участков, гидрокультур (включая фермы по гидропонному выращиванию пищевых продуктов), фармацевтических производственных установок, мест с колониями животных или любых их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой текучую среду или пробу, собранную или полученную из клеточной культуры или колонии микроорганизмов.
[0065] В настоящем документе термины «аналит», «целевой аналит», «интересующий аналит» используются взаимозаменяемо и относятся к аналиту, измеряемому в способах и системах, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления аналит может представлять собой биомолекулу. Не имеющие ограничительного характера примеры биомолекул включают в себя макромолекулы, такие как полинуклеотид (например, ДНК или РНК), белки, липиды и углеводы. В некоторых случаях аналит может представлять собой гормоны, антитела, факторы роста, цитокины, ферменты, рецепторы (например, нейрональные, гормональные, рецепторы к питательным веществам и рецепторы клеточной поверхности) или их лиганды, маркеры рака (например, ПСА, ФНО-альфа), маркеры инфаркта миокарда (например, тропонин, креатинкиназа и т.п.), токсины, лекарственные средства (например, лекарственные средства, вызывающие зависимость), метаболические агенты (например, включая витамины) и т.п.Не имеющие ограничительного характера варианты осуществления белковых аналитов включают в себя пептиды, полипептиды, фрагменты белка, белковые комплексы, гибридные белки, рекомбинантные белки, фосфопротеины, гликопротеины, липопротеины, белки, меченные олигонуклеотидами, и т.п. Целевой аналит может представлять собой нуклеиновую кислоту, такую как ядерная ДНК.
[0066] И наоборот, нецелевой аналит представляет собой аналит, который в норме анализируется с помощью ферментативной реакции, но который не является целевым аналитом, так что анализируются как исследуемый аналит, так и нецелевой аналит, в результате чего снижается точность и достоверность результатов. Нецелевой аналит представляет собой аналит, который было бы предпочтительно не анализировать. Таким образом, предложенные в настоящем документе варианты осуществления относятся к способам и композициям, которые устраняют, уменьшают или ингибируют анализ нецелевого аналита.
[0067] К целевым нуклеиновым кислотам может относиться образец, в котором средний размер нуклеиновой кислоты образца менее чем, более чем или равен около 2 тыс. п.н., 1 тыс. п.н., 500 п.н., 400 п.н., 200 п.н., 100 п.н., 50 п.н. или находится в диапазоне между любыми двумя из вышеуказанных размеров. В некоторых вариантах осуществления средний размер нуклеиновой кислоты в образце менее чем, более чем или равен около 2000 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 400 нуклеотидов, 200 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 50 нуклеотидов или находится в диапазоне из любых двух вышеуказанных размеров.
[0068] В настоящем документе термин «реагент» описывает агент или смесь из двух или более агентов, используемых для реакции с образцом, взаимодействия с образцом, разведения образца или добавления к образцу, и может включать в себя агенты, используемые в анализах, описанных в настоящем документе, включая агенты для лизиса, анализа нуклеиновых кислот, реакций амплификации нуклеиновых кислот, анализа белков, реакций тагментации, реакций АТАС seq, CPT-seq или SCI-seq или других анализов. Таким образом, реагенты могут включать в себя, например, буферы, химические вещества, ферменты, полимеразу, праймеры, имеющие размер менее чем 50 пар нуклеотидов, матричные нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, метки, красители или нуклеазы. В некоторых вариантах осуществления реагент включает в себя лизоцим, протеиназу K, случайные гексамеры, полимеразу (например, ДНК-полимеразу Ф29, полимеразу Taq, полимеразу Bsu), транспозазу (например, Tn5), праймеры (например, адапторные последовательности Р5 и Р7), лигазу, катализирующий фермент, дезоксинуклеотидтрифосфаты, буферы или двухвалентные катионы.
[0069] В настоящем документе термины «выделенный», «выделять», «выделение», «очищенный», «очищать», «очистка» и их грамматические эквиваленты, используемые в настоящем документе, если не указано иное, относятся к снижению количества по меньшей мере одного загрязняющего вещества (такого как белковая и/или нуклеотидная последовательность) в образце или источнике (например, клетке), из которого выделяют материал. Таким образом, очистка приводит к «обогащению», например увеличению количества необходимого белка и/или нуклеотидной последовательности в образце.
[0070] Преимущества способов и композиций, описанных в настоящем документе, могут включать в себя, например, специфическое нацеливание на интересующую ДНК посредством секвенирования открытого хроматина (ATAC-seq), снижение, ингибирование, или устранение из анализа нежелательных секвенирующих митохондриальных чтений, снижение или устранение необходимости в разделении нежелательных мишеней для меньшей нагрузки на способы разделения, и снижение затрат, поскольку нежелательная информация не собирается и не анализируется.
[0071] Способы также можно комбинировать путем контроля реакционной способности и селективности фермента. Композиции и способы, описанные в настоящем документе, контролируют активность и специфичность ферментов посредством блокирования специфических мишеней. Как будет понятно специалисту в данной области, аналогичные принципы также могут быть применимы к анализам, относящимся к ДНК, белкам, РНК или любому интересующему аналиту либо комбинации аналитов.
[0072] Варианты осуществления систем и способов, предложенных в настоящем документе, можно использовать в сочетании с капельной системой разделения для использования при выделении образца внутри капли. В настоящем документе термин «разделение» или «разделенный» относится к разделению образца на множество частей или «порций». Порции могут быть твердыми или жидкими. В некоторых вариантах осуществления порция представляет собой твердую порцию, например, микроканал. В некоторых вариантах осуществления раздел представляет собой жидкую порцию, например, каплю. В некоторых вариантах осуществления жидкая порция (например, капля) представляет собой смесь несмешивающихся текучих сред (например, воды и масла) или эмульсию. В некоторых вариантах осуществления жидкая порция (например, капля) представляет собой водную каплю, окруженную несмешивающейся жидкостью-носителем (например, маслом). В других вариантах осуществления жидкая порция представляет собой водную каплю, которая физически или химически отделена от соседних водных капель так, что содержимое одной капли не диффундирует в соседние капли. Например, разделение можно выполнять с помощью каплегенератора (например, системы BioRad, системы Dolomite Microfluidics, системы Micronit Microfluidics, микрофлюидные устройства типа «вода в масле», системы 10Х Genomics или любая другая подходящая система разделения капель) для отдельного разделения, выделения и/или анализа интересующей нуклеиновой кислоты.
[0073] Варианты осуществления систем и способов, предложенные в настоящем документе, включают в себя наборы, содержащие реагенты для транспонирования, а также первый зонд, комплементарный первой метке, и второй зонд, комплементарный второй метке, причем первый и второй зонды иммобилизованы на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления первый зонд и второй зонд содержат штрихкод. В некоторых вариантах осуществления первый зонд и второй зонд представляют собой зонд поли-Т. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка представляет собой протравленную поверхность, лунку, матрицу, устройство с проточной ячейкой, микрофлюидный канал, гранулу, магнитную гранулу, колонку, каплю или микрочастицу.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Снижение чтений митохондриальной ДНК
[0074] В следующем примере продемонстрирован вариант осуществления уменьшения чтений мтДНК с использованием ATAC-seq.
[0075] Был получен образец, содержащий как ядерную ДНК, так и мтДНК. Образец разделяли на различные аликвоты и каждую аликвоту приводили в контакт с красителем Hoechst 33258 в различных концентрациях, включая 8 мкМ, 80 мкМ и 800 мкМ. Затем каждую аликвоту подвергали транспонированию и ATAC-seq и анализировали чтения ДНК.
[0076] Как показано на Фиг. 2А-2С, краситель Hoechst избирательно окрашивает мтДНК, предотвращая транспонирование в мтДНК, но допуская транспонирование ядерной ДНК. В таблице 1 представлены сводные данные по чтениям, показанным на Фиг. 2А-2С. Увеличение концентраций красителя Hoechst приводило к уменьшению чтений мтДНК с использованием ATAC-seq. Способы и композиции можно использовать в массовом ATAC-seq или ATAC-seq одиночных клеток для ингибирования, снижения или устранения нежелательных секвенирующих чтений мтДНК.
[0077] В дополнение к выполнению транспонирования и ATAC-seq образцы также окрашивали. Образцы окрашивали DAPI, и происходило окрашивание мтДНК, но не активно транскрибируемых (АТАС) областей ядерной ДНК. DAPI окрашивал ДНК за исключением определенных мест. В местах, где отсутствует окрашивание DAPI, происходит транскрипция РНК. Дифференциальное окрашивание мтДНК и активно не транскрибируемых областей ядерной ДНК эффективно ингибировало транспонирование в мтДНК и таким образом повышало эффективность ATAC-seq ядерной ДНК без нежелательного нецелевого транспонирования.
Пример 2. Эффективность различных ДНК-связывающих молекул
[0078] В следующем примере демонстрируется вариант осуществления уменьшения чтений мтДНК при ATAC-seq с помощью различных ДНК-связывающих молекул.
[0079] Был получен образец, содержащий как ядерную ДНК, так и мтДНК. Образец разделяли на различные аликвоты, и аликвоты приводили в контакт с разными красителями в различных концентрациях. Использовали пять разных красителей, включая Hoechst (в концентрациях 50 мкМ, 25 мкМ, 12 мкМ, 6 мкМ, 3 мкМ и 0,6 мкМ), SYBR Gold (в концентрациях 500 мкМ, 50 мкМ, 5 мкМ, 0,5 мкМ и 0,1 мкМ), Sytox Orange (в концентрациях 500 мкМ, 50 мкМ, 5 мкМ, 0,5 мкМ и 0,1 мкМ), Pico Green (в концентрациях 100 мкМ, 10 мкМ, 1 мкМ, 0,1 мкМ и 0,02 мкМ) и Qubit (в концентрациях 100 мкМ, 10 мкМ, 1 мкМ, 0,1 мкМ и 0,02 мкМ), как показано на Фиг. 3А-3С. Готовили другую аликвоту, которая не подвергалась воздействию какого-либо красителя. Затем каждую аликвоту подвергали транспонированию по технологии Nextera и продукты визуализировали на геле. На Фиг. 3А представлен гель для Hoechst и SYBR Gold. На Фиг. 3В представлен гель для Sytox Orange и Pico Green, а на Фиг. 3С представлен гель для Qubit и при отсутствии красителя. Препараты ДНК с высокой молекулярной массой указывают на неэффективное транспонирование. Ингибирование наблюдали для SYBR Gold и Sytox Orange при концентрациях более чем 100 мкМ.
[0080] Каждую аликвоту подвергали транспонированию и анализировали чтения ДНК, как показано на Фиг. 4 и 5. Как показано на Фиг. 4, Hoechst 33258 не изменяет профили ATAC-seq (расположение нуклеосом) и уменьшает чтения митохондриальной ДНК (это показано также на Фиг. 2А-2С). Hoechst обеспечивает относительно неизменный профиль ATAC-seq, в то же время не изменяя позиционирование нуклеосом. Некоторые красители, такие как SYBR Gold, связывались с ДНК, но изменяли позиционирование нуклеосом (ATAC-seq) по сравнению с контролем без красителей.
[0081] Как показано на Фиг. 5, специфическое блокирование мтДНК повышало специфичность секвенирования ядерной ДНК. Эти результаты показывают, что внедряемые ДНК-связывающие молекулы можно использовать для контроля ферментативной транспонирующей активности на ДНК.
[0082] Такой подход можно применять в более общем смысле, при котором конкретные красители или связывающие молекулы в целом можно доставлять до определенных мишеней с использованием хорошо известных аффинных меток, включая конъюгаты антител и зонды гибридизации ДНК, для блокирования нежелательной ферментативной активности. Альтернативно специфические аффинные метки («блокаторы») можно использовать для привлечения ферментов к конкретным мишеням. Такие области применения могут включать в себя блокирование нецелевой активности ферментов CRISPR.
[0083] В настоящем документе термин «содержащий» является синонимом терминов «включая», «включающий» или «характеризуется» и имеет включающий, а не ограничительный характер, и не исключает дополнительные неуказанные элементы или этапы способа.
[0084] В описании выше приведены несколько способов и материалов настоящего изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться модификациям в части способов и материалов, а также изменениям в части способов изготовления и оборудования. Такие модификации будут очевидны специалистам в данной области после изучения настоящего описания или реализации изобретения, описанного в настоящем документе, на практике. Следовательно, не предполагается, что настоящее изобретение ограничено конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе, но предполагается, что оно охватывает все модификации и альтернативные варианты в пределах истинного объема и сущности изобретения.
[0085] Все источники, процитированные в настоящем документе, включая, без ограничений, опубликованные и неопубликованные заявки, патенты и ссылки на литературу, полностью включены в настоящий документ путем ссылки и, следовательно, являются частью настоящего описания. В тех случаях, когда публикации, патенты или заявки на патенты, включенные путем ссылки, противоречат изложению, приведенному в настоящем описании, предполагается, что настоящее описание заменяет и/или имеет приоритет над любым таким противоречащим материалом.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Illumina, Inc.
<120> СИСТЕМЫ И СПОСОБЫ УПРАВЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ
РЕАКЦИЯМИ
<130> ILLINC.413WO
<150> 62/780,812
<151> 2018-12-17
<160> 8
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
<210> 2
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34
<210> 3
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 3
ctgtctctta tacacatct 19
<210> 4
<211> 14
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 4
tcgtcggcag cgtc 14
<210> 5
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 5
gtctcgtggg ctcgg 15
<210> 6
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 6
agatgtgtat aagagacag 19
<210> 7
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga gauctacac 29
<210> 8
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 8
caagcagaag acggcatacg agat 24
<---
Claims (33)
1. Способ секвенирования нуклеиновой кислоты, включающий:
получение образца, содержащего нуклеиновую кислоту;
приведение образца в контакт с ДНК-связывающей молекулой, содержащей ДНК-краситель;
приведение образца в контакт с инсерционным ферментным комплексом с получением меченых фрагментов нуклеиновых кислот, причем инсерционный ферментный комплекс ингибируется ДНК-связывающей молекулой; и
секвенирование меченых фрагментов нуклеиновых кислот с получением чтений последовательности.
2. Способ по п. 1, в котором образец представляет собой популяцию клеток, одиночную клетку, популяцию клеточных ядер или ядро одиночной клетки.
3. Способ по любому из пп. 1, 2, в котором образец содержит первичные нуклеиновые кислоты и вторичные нуклеиновые кислоты, причем ДНК-связывающая молекула предпочтительно связывает вторичные нуклеиновые кислоты, а не первичные нуклеиновые кислоты.
4. Способ по п. 3, в котором первичные нуклеиновые кислоты содержат ядерную ДНК.
5. Способ по п. 3, в котором вторичные нуклеиновые кислоты содержат митохондриальную ДНК (мтДНК) или внехромосомную ДНК.
6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором ДНК-краситель содержит краситель Hoechst, SYBR Gold, Sytox Orange, Pico Green или Qubit.
7. Способ по любому из пп. 1–6, в котором инсерционный ферментный комплекс представляет собой транспосому, содержащую транспозазу.
8. Способ по любому из пп. 1–7, в котором секвенирование выполняют путем анализа с секвенированием доступного для транспозазы хроматина (ATAC-seq) или путем секвенирования полного генома.
9. Способ по п. 8, в котором ATAC-seq содержит массовый ATAC-seq или ATAC-seq на одиночных клетках.
10. Способ по любому из пп. 1–9, который ингибирует, снижает или устраняет вторичные секвенирующие чтения.
11. Способ ингибирования, снижения или устранения вторичных секвенирующих чтений, включающий:
получение образца, содержащего первичные нуклеиновые кислоты и вторичные нуклеиновые кислоты;
приведение образца в контакт с ДНК-связывающей молекулой, которая предпочтительно связывает вторичные нуклеиновые кислоты, где ДНК-связывающая молекула содержит ДНК-краситель; и
выполнение транспонирования ДНК на открытом хроматине, причем вторичные нуклеиновые кислоты не транспонируются или транспонируются с более низкой эффективностью, чем первичные нуклеиновые кислоты.
12. Способ по п. 11, в котором образец представляет собой популяцию клеток, одиночную клетку, популяцию клеточных ядер или ядро одиночной клетки.
13. Способ по п. 12, в котором ДНК-краситель содержит краситель Hoechst, SYBR Gold, SytoxOrange, PicoGreen или Qubit.
14. Способ по любому из пп. 11–13, в котором транспонирование ДНК выполняют с использованием анализа с секвенированием доступного для транспозазы хроматина (ATAC-seq) или секвенирования полного генома из гДНК или из одиночных клеток.
15. Способ по п. 14, в котором ATAC-seq содержит массовый ATAC-seq или ATAC-seq на одиночных клетках.
16. Способ по любому из пп. 11–15, в котором приведение образца в контакт с ДНК-связывающей молекулой блокирует или снижает транспонирование во вторичные нуклеиновые кислоты.
17. Способ по любому из пп. 11–16, в котором первичные нуклеиновые кислоты содержат ядерную ДНК.
18. Способ по п. 17, дополнительно включающий секвенирование ядерной ДНК.
19. Способ по любому из пп. 11–18, в котором вторичные нуклеиновые кислоты содержат митохондриальную ДНК (мтДНК) или внехромосомную ДНК.
20. Библиотека нуклеиновых кислот для секвенирования, полученная способом по п. 1 или 11, содержащая первичные секвенирующие чтения, полученные путем секвенирования ДНК, причем библиотека нуклеиновых кислот не включает в себя или имеет сниженное представление вторичных секвенирующих чтений благодаря ДНК-связывающим молекулам, которые предпочтительно связываются со вторичной ДНК, где ДНК-связывающая молекула содержит ДНК-краситель.
21. Библиотека нуклеиновых кислот по п. 20, в которой секвенирование ДНК представляет собой анализ с секвенированием доступного для транспозазы хроматина (ATAC-seq) или анализ гДНК с секвенированием полного генома.
22. Библиотека нуклеиновых кислот по любому из пп. 20, 21, в которой первичные секвенирующие чтения представляют собой секвенирующие чтения ядерной ДНК.
23. Библиотека нуклеиновых кислот по любому из пп. 20–22, в которой вторичные секвенирующие чтения представляют собой секвенирующие чтения митохондриальной ДНК (мтДНК) или секвенирующие чтения внехромосомной ДНК.
24. Библиотека нуклеиновых кислот по любому из пп. 20-23, в которой ДНК-связывающая молекула способна связываться со специфической нуклеотидной последовательностью для устранения, снижения или ингибирования секвенирующих чтений или библиотек секвенирования для целевых областей нуклеиновых кислот.
25. Библиотека нуклеиновых кислот по любому из пп. 20-24, в которой ДНК-краситель содержит краситель Hoechst, SYBR Gold, Sytox Orange, Pico Green или Qubit.
26. Библиотека нуклеиновых кислот по любому из пп. 20–25, которая создана из популяции клеток, одиночной клетки, популяции клеточных ядер или ядра одиночной клетки.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/780,812 | 2018-12-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021108003A RU2021108003A (ru) | 2023-01-19 |
| RU2815513C2 true RU2815513C2 (ru) | 2024-03-18 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2609630C2 (ru) * | 2009-02-27 | 2017-02-02 | Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. | Геномный отбор и секвенирование с помощью кодированных микроносителей |
| WO2018218226A1 (en) * | 2017-05-26 | 2018-11-29 | 10X Genomics, Inc. | Single cell analysis of transposase accessible chromatin |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2609630C2 (ru) * | 2009-02-27 | 2017-02-02 | Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. | Геномный отбор и секвенирование с помощью кодированных микроносителей |
| WO2018218226A1 (en) * | 2017-05-26 | 2018-11-29 | 10X Genomics, Inc. | Single cell analysis of transposase accessible chromatin |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LINDSEY MONTEFIORI et al., "Reducing mitochondrial reads in ATAC-seq using CRISPR/Cas9", SCIENTIFIC REPORTS,Vol. 7, No. 1, 26 December 2017, реферат, фиг.2, стр.2. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3887540B1 (en) | Analysis of multiple analytes using a single assay | |
| EP3256604B1 (en) | Methods and compositions for analyzing cellular components | |
| AU2015273232B2 (en) | Methods and compositions for preparing sequencing libraries | |
| CN110592182B (zh) | 用于样品处理的组合物和方法 | |
| EP3436607B1 (en) | Linked duplex target capture | |
| CN114466935A (zh) | 基因突变分析 | |
| US20220195507A1 (en) | Methods and means for preparing a library for sequencing | |
| US20220340967A1 (en) | Linked target capture | |
| RU2815513C2 (ru) | Способы и средства получения библиотеки для секвенирования | |
| US10961573B2 (en) | Linked duplex target capture |