JP2021520785A - 哺乳類卵母細胞を裸化するためのマイクロ流体システムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2018年9月18日付で提出された米国仮特許出願第62/732,884号および2018年4月4日付で提出された米国仮特許出願第62/652,648号の利益を主張する。これら2つの先行出願の全記載内容を、引用により本明細書に援用する。
体外受精(In Vitro fertilization:IVF)などの生殖補助技術(Assisted Reproductive Technology:ART)は、不妊症または遺伝学的問題の処置、および子の受胎の補助に使用できる。IVFにおいては、成熟した卵子(卵母細胞)を卵巣から回収し、実験室で精子によって受精させることができる。次いで、受精卵(胚として知られる)を子宮内に移植することができる。IVFは、排卵誘発、卵母細胞回収、精子回収、受精、および胚移植という工程を伴う。従来のIVFにおいては、卵子と、準備した精子とを、シャーレ中の培養媒体に入れ、その中で卵子と精子とを一晩かけて自発的に受精させる。
本開示は、ヒト生殖補助の分野において広い用途を有する、周囲を覆っている卵丘細胞および冠細胞から卵母細胞を裸化するためのマイクロ流体システムを提供する。このシステムは、くびれユニットおよび拡張ユニットの繰り返しを有する1つ以上のチャネルを含む。一般的に、COCを含有する試料(COCのみをバッファーもしくは他の液体中に採取したもの、またはCOC、血餅、および多様なサイズの組織細片を含有する患者由来の未処理の卵胞液、のいずれか)をシステムの入口に注入し、試料がシステムの1つまたは複数のチャネル内を流れる際に、くびれユニットと拡張ユニットとが連携して卵母細胞の裸化を容易化する。たとえば、くびれユニットは、COCに力学的ストレスをかけるために、ぎざぎざのまたは滑らかな内表面などの表面特徴を含み得る。いくつかの実現例において、拡張ユニットは、COCがシステム内を転がりながら通ることができるように促す。いくつかの実施形態において、システムは、COCが連続的に流れ得るように構成される。
体外受精(IVF)および卵細胞質内精子注入(ICSI)などの生殖補助技術(ART)は、不妊症の処置方法としてますます広く用いられている。しかしながら、典型的なARTの手順は、高価である、時間がかかるといった、様々な制約を有し得る。また、典型的なARTの手順は、胚培養士などの高度な技術を有する技術者に依存しており、その結果、施術者による差異や標準化の欠如といったことが起こり得る。効果的なICSIのためには、卵母細胞中への精子の注入を容易化して、卵母細胞の形態、特に核成熟期の評価を可能とする目的で、典型的には、当該手順よりも前に卵母細胞を裸化しておくことが重要である。
図2A〜図2Cは、本開示に係る、卵母細胞から卵丘細胞を除去するためのマイクロ流体システム100の概略的な例証である。図2Aはシステム全体を示し、図2Bおよび図2Cは、マイクロ流体システム100のいくつかの部分を拡大して示す。図2Aを参照して、マイクロ流体システム100は、入口101、出口102、第1のステージ110、第2のステージ120、および第3のステージ130を含む。第1のステージ110、第2のステージ120、および第3のステージ130は、連携して、長く蛇行したチャネルを画定している。入口101は、COC 170aを受け、COC 170aを第1のステージ110へと導くように構成される。COC 170aは、バッファーまたは培養媒体と懸濁および/または混合されてよい。当該例証において、長く蛇行したチャネルは3つの「列」を含む。第1の(すなわち、上の)列は第1のステージ110および第2のステージ120を含み、第2および第3の(すなわち、下の)列は第3のステージ130を含む。チャネルは蛇行しているように示されているが、チャネルは、直線状、環状、または多様な他の形状であってもよい。また、チャネルは、マイクロ流体システム100の所望の用途に依存して、より多い、またはより少ない列を含んでもよい。
図3Aは、本開示の一実施形態に係るマイクロ流体システム100の第1のステージ110に位置する滑らかなくびれユニット141とこれに最も近い拡張ユニット140とを拡大して示す。図3Bは、本開示の一実施形態に係るマイクロ流体システム100の第2のステージ120に位置する滑らかなくびれユニット141とこれに最も近い拡張ユニット140とを拡大して示す。図3Cは、本開示の一実施形態に係るマイクロ流体システム100の第3のステージ130に位置するぎざぎざのくびれユニット142とこれに最も近い拡張ユニット140とを拡大して示す。
図4A〜図4Cは、本開示の一実施形態に係る、COCから卵丘細胞を除去するための複数のサブチャネルを有するチャネルを有するマイクロ流体システム600の概略的な例証である。複数のサブチャネルを有するマイクロ流体システム600は、たとえばCOCを含有する液体試料が1つのチャネルを遮断し得るまたは詰まらせ得るさらなる細片を含有し得る場合に、使用できる。多様なサブチャネルは、1つの通路が遮断された際または詰まった際にCOCが流れる多様な通路を提供し得る。
図5は、本開示の少なくとも1つの実施形態に係るマイクロ流体システム100の使用方法を示すブロック図である。例証する目的から、以下には、当該方法が、図2A〜図2Cを参照して上述されるマイクロ流体システム100と共に使用されるとして記載される。しかしながら、当該方法は、図4A〜図4Cを参照して上述される複数のサブチャネルを有するマイクロ流体システム600などの他のマイクロ流体システムと共に使用することもできる。当該方法は、液体試料を生成する工程(ブロック510)と、マイクロ流体システム100中に液体試料を注入する工程(ブロック520)と、マイクロ流体システム100内に液体試料を流す工程(ブロック530)と、裸化卵母細胞を回収する工程(ブロック540)とを含む。
以下の実施例において本発明がさらに記載されるが、これらの実施例は請求項中に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
約7〜12個のマウスCOCを含有する懸濁液10μlを0.3mg/mLのヒアルロニダーゼと共にプレインキュベートしたものを、培養媒体0.5mlを予め充填しておいたTygon(登録商標)チューブ中に移した。このチューブは、約1.27mmの内径を有するものであった。15ゲージの鈍針を用いて、チューブの一端をシリンジポンプに接続した。ポンプにより、一定の流速1ml/分をかけた。チューブの他端をマイクロ流体システムの入口に挿入した。次いで、試料を、本明細書中に記載されるようにマイクロ流体システム中に注入した。マイクロ流体システムを75mm×25mmスライドガラス1枚に接着した。マイクロ流体システムは3つのステージを有し、第3のステージは、くびれユニットの幅が80、90、100、110、120、130、または140μmのいずれかであった。30秒以内に、処理された卵母細胞を出口槽において集めた。チューブ中に移した全COCのうちの処理された卵母細胞の数として、収量を計算した。出口槽において集めた処理されたすべての卵母細胞のうちの裸化卵母細胞の割合として、効率を計算した。
卵核胞(GV)期の卵母細胞およびこれに関連するCOCを、裸化デバイスにおいて使用した。GV期のCOCは、広がっていない密集した卵丘−冠細胞の集まりを特徴とし、一方、中期II(MII)のCOCは、広がっていてそれほど密集していない卵丘−冠細胞の集まりを有し、冠細胞が透明帯から放射状に広がっている。マウスのMII期のCOCは、典型的には、大きなクラスタを形成している。GV期のCOCについて得られる最適化されたパラメータを、体外受精実験のための成熟したMII期のCOCに対して使用した。
くびれユニットの表面特徴が裸化性能にどう影響するかを調べるために、多様な傾斜角度θをシステムに導入した。「傾斜角度」とは、COCが流れる方向とくびれユニットのぎざぎざの歯の中央線との間の角度を指す。図8Aは、くびれチャネルに沿って傾斜したぎざぎざの歯の4つの異なる傾斜角度の例証である。図8A中に示されるとおり、θが0°から141°に増加すると、ぎざぎざの表面の内壁の歯が、COCの流れる方向に沿っておよびこれに従って傾斜していたものが、COCの流れる方向に逆らって傾斜するように変化した。図7Bおよび図7Cは、異なる傾斜角度θを有するマイクロ流体システムの収率および裸化効率を示す。
図4A〜図4Cを参照して上述されるマイクロ流体システム600と類似する、複数のサブチャネルを有するマイクロ流体システムを使用して、液体試料中に懸濁したCOCを裸化した。懸濁液は、COCおよび多様なサイズの細片を含有していた。懸濁液を0.3mg/mlのヒアルロニダーゼと共にプレインキュベートして、卵母細胞から卵丘細胞を緩めた。懸濁液を、流速3mL/分〜5mL/分にて、マイクロ流体システム内に流した。システムの第1のステージは、240ミクロンの幅を有するサブチャネルを含んでいた。システムの第2のステージは、140ミクロンの幅を有するサブチャネルを含んでいた。システムの第3のステージは、90ミクロンの幅を有するサブチャネルを含んでいた。どのステージも、流体の流れる方向に逆らって傾斜したぎざぎざの歯を有するポストを含んでいた。
ここまで、本発明が、その詳細な説明と共に説明されているが、前述される説明は例示を意図したものであり、本開示の範囲を限定するものではなく、本開示の範囲は付属の請求項の範囲によって定義されるということが理解される。他の態様、利点、および改変も、以下の請求項の範囲内である。
Claims (31)
- 付着している卵丘細胞から卵母細胞を裸化するためのシステムであって、
基体と、
入口、出口、および前記入口と前記出口との間に直列に配置された1つ以上のステージを備えるチャネルとを備え、
各ステージは、次のステージと流体接続しており、
各ステージは、1つ以上の拡張ユニットと1つ以上のくびれユニットとを備え、
前記ステージのうち少なくとも1つは、2つの対向壁をそれぞれ有する1つ以上のくびれユニットを備え、前記2つの対向壁のうち少なくとも1つは、複数の歯を備えるぎざぎざの内側表面を備える、システム。 - 各くびれユニットにおける前記2つの対向壁の各々は複数の歯を備え、第1の対向壁上の複数の歯は、第2の対向壁上の複数の歯の方を向いている、請求項1に記載のシステム。
- 前記第1の対向壁上の複数の歯の先端と前記第2の対向壁上の複数の歯の先端とは平行に配置されている、請求項2に記載のシステム。
- 前記第1の対向壁上の歯の先端と前記第2の対向壁上の歯の先端との間隔は、裸化される卵母細胞の直径に近い、請求項2または3のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記ステージのうち少なくとも1つは、1つ以上のくびれユニットと互い違いに配置された1つ以上の拡張ユニットを備える、請求項1に記載のシステム。
- 前記複数の歯のうち1つ以上は、前記チャネル内を通る流れの方向に逆らって約30度〜約90度の角度に設定されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記1つ以上のステージのうち少なくとも1つのステージは、滑らかな内側表面を有する1つ以上のくびれユニットを備える、請求項1〜6のいずれか1項に記載のシステム。
- 少なくとも1つの拡張ユニットは、約250〜約600ミクロンの幅を有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載のシステム。
- 少なくとも1つのくびれユニットは、約100〜約350ミクロンの幅を有する、請求項1〜8のいずれか1項に記載のシステム。
- 付着している卵丘細胞から卵母細胞を裸化するためのシステムであって、
基体と、
入口、出口、および直列に配置された3つのステージを備え、各ステージが次のステージと流体接続している、チャネルとを備え、
第1のステージは、第1のくびれユニットと互い違いに配置された一連の第1の拡張ユニットを備え、前記第1の拡張ユニットは第1の幅を有し、前記第1のくびれユニットは第2の幅と滑らかな内側表面とを有し、
第2のステージは、第2のくびれユニットと互い違いに配置された一連の第2の拡張ユニットを備え、前記第2の拡張ユニットは第3の幅を有し、前記第2のくびれユニットは第4の幅と滑らかな内側表面とを有し、
第3のステージは、第3のくびれユニットと互い違いに配置された一連の第3の拡張ユニットを備え、前記第3の拡張ユニットは第5の幅を有し、前記第3のくびれユニットは第6の幅と少なくとも2つの対向壁とを有し、
前記2つの対向壁の各々は、複数の歯を備えるぎざぎざの内側表面を備え、前記第3のくびれユニットの第1の対向壁上の複数の歯は、前記第3のくびれユニットの第2の対向壁上の複数の歯の方を向くように配置されており、前記第1の対向壁上の複数の歯の先端と前記第2の対向壁上の複数の歯の先端とは平行に配置されている、システム。 - 前記チャネルは約200〜300ミクロンの高さを有する、請求項1〜10のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記歯は、前記チャネル内を通る流れの方向に逆らって約30度〜約90度の角度に設定されている、請求項10および11のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記第1の幅は約250〜約600ミクロンであり、前記第2の幅は約200〜約350ミクロンである、請求項10〜12のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記第3の幅は約250〜約600ミクロンであり、前記第4の幅は約100〜約250ミクロンであり、前記第5の幅は約250〜約600ミクロンである、請求項10〜13のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記第6の幅は約70〜約120ミクロンである、請求項10〜14のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記歯の先端同士の間隔は約80〜110ミクロンである、請求項10〜15のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記第1の幅は約500ミクロンであり、前記第2の幅は約230〜260ミクロンであり、前記第3の幅は約500ミクロンであり、前記第4の幅は約130〜約160ミクロンであり、前記第5の幅は約500ミクロンであり、前記第6の幅は約90〜約120ミクロンであり、前記歯の先端同士の間隔は約90〜約110ミクロンである、請求項10に記載のシステム。
- 液体試料中において、付着している卵丘細胞から卵母細胞を裸化するためのシステムであって、
基体と、
入口、出口、および前記入口と前記出口との間に直列に配置された1つ以上のステージを備えるチャネルとを備え、
各ステージは、次のステージと流体接続しており、
各ステージは、前記チャネルにわたって配置された複数のポストからなる1つ以上の列を備え、所与の列におけるポストと当該列内における隣りのポストとの間に間隔があいて、隣り合う2つのポストの間にサブチャネルが画定されており、
少なくとも1つのステージにおける複数のポストの各々は、同じ列内における隣りのポストの対向壁に向き合うように、または前記チャネルの内壁に向き合うように配置された1対の壁を含み、前記複数のポストの各々における壁の少なくとも1つは、複数の歯を備えるぎざぎざの内側表面を備える、システム。 - 1つの列における隣り合うポストの対向壁の各々は、互いに向き合うように配置された複数の歯を備える、請求項18に記載のシステム。
- 第1のステージの少なくとも1つのサブチャネルは、約240〜260ミクロンの幅を備え、前記第1のステージは、流体試料から細片をろ過するように配置されたポストの列を備える、請求項18または19に記載のシステム。
- 第2のステージの少なくとも1つのサブチャネルは、約140〜160ミクロンの幅を備え、前記第2のステージは、流体試料から細片をろ過するように配置されたポストの列を備える、請求項18〜20のいずれか1項に記載のシステム。
- 第3のステージにおける少なくとも1つのサブチャネルは、約90〜110ミクロンの幅を備え、前記第3のステージは、卵母細胞を裸化するように配置されたポストの列を備え、各列における1つ以上のポストは、複数のぎざぎざの歯を備える、請求項18〜21のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記第3のステージにおけるすべてのポストは、同じ列内における隣りのポストの対向壁に向き合うように、または前記チャネルの内壁に向き合うように配置された1対の壁を含み、前記第3のステージにおける各ポストの各壁は、複数の歯を備えるぎざぎざの内側表面を備える、請求項22に記載のシステム。
- 第1のステージのすべてのサブチャネルは第1の幅を備え、第2のステージのすべてのサブチャネルは、前記第1の幅よりも小さい第2の幅を備える、請求項19〜23のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記複数のポストからなる1つ以上の列は、前記チャネルの長軸に対して垂直に配置されている、請求項18〜25のいずれか1項に記載のシステム。
- 液体試料中において卵母細胞から卵丘細胞を除去する方法であって、
1つ以上の卵母細胞を備える液体試料を得る工程と、
請求項1〜25のいずれか1項に記載のシステムの前記入口に前記液体試料を注入する工程と、
前記チャネルの1つ以上のステージ内に前記液体試料をある流速にて流す工程と、
前記出口から卵母細胞を回収する工程と、を備える、方法。 - 前記液体試料は卵胞液を備える、請求項26に記載の方法。
- 前記液体試料は、培養媒体またはバッファー媒体を備える、請求項26に記載の方法。
- 前記流速はほぼ一定であり、約0.5〜約5.0ml/分である、請求項25〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記流速は、約1.0ml/分〜約4.0ml/分である、請求項29に記載の方法。
- 前記卵母細胞はヒト卵母細胞であり、前記対向壁上の複数の歯の先端同士の間隔は約100〜110ミクロンである、請求項25〜30のいずれか1項に記載の方法。
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