CN116171137A - 用于自动化微流体卵母细胞剥脱的方法和装置 - Google Patents

用于自动化微流体卵母细胞剥脱的方法和装置 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的微流体装置。所述装置包括衬底。宽度为约200μm至约1mm的第一通道位于所述衬底内。所述第一通道从所述衬底的第一端延伸到第二端。所述第一通道具有沿着其表面布置的一个或多个脊元件。第一端口位于所述衬底中并且与所述通道的第一端流体连通。第二端口位于所述衬底中并且与所述通道的第二端流体连通。还公开了使用所述微流体装置剥脱卵丘卵母细胞复合体的系统和方法。

Description

用于自动化微流体卵母细胞剥脱的方法和装置
本申请要求于2020年7月6日提交的美国临时专利申请序列号63/048,531的优先权权益，所述美国临时专利申请特此以全文引用的方式并入。
技术领域
本发明技术涉及用于自动化微流体卵母细胞剥脱的方法和装置。
背景技术
卵母细胞剥脱涉及从卵丘卵母细胞复合体(COC)中移除卵丘细胞以产生剥脱的卵母细胞。卵母细胞剥脱是胚胎细胞显微操作的先决步骤。流行的人类不孕症治疗的临床程序，如Palermo等人,“将单精子胞质内注射到卵母细胞中后的妊娠(Pregnancies afterIntracytoplasmic Injection of Single Spermatozoon into an Oocyte)”《柳叶刀(Lancet)》340:17-18(1992)中讨论的胞质内精子注射(ICSI)以及Rock等人,“人卵巢卵子的体外受精和卵裂(In Vitro Fertilization and Cleavage of Human Ovarian Eggs)”《科学(Science)》100:105–107(1944)中讨论的体外受精，需要充分的卵母细胞剥脱和卵丘细胞移除才能成功。此外，哺乳动物胚胎研究的进展，如Wilmut等人,“源自胎儿和成年哺乳动物细胞的可存活的后代(Viable Offspring Derived from Fetal and AdultMammalian Cells)”《自然(Nature)》385:810-813(1997)以及Wakayama等人,“从注射卵丘细胞核的去核卵母细胞的足月发育小鼠(Full-Term Development of Mice fromEnucleated Oocytes Injected with Cumulus Cell Nuclei)”《自然》394:369-374(1998)中讨论的转基因和克隆动物生产，以及如Wang等人,“通过CRISPR/Cas介导的基因组工程一步产生携带多个基因突变的小鼠(One-Step Generation of Mice Carrying Mutationsin Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering)”《细胞(Cell)》153:910–918(2013)中讨论的新兴的基于CRISPR的基因工程方法，全部都依赖于剥脱的卵母细胞的关键制备。
卵丘和冠层移除允许明确评估卵母细胞胞质和胞质外状态。只有在完成卵母细胞剥脱步骤之后，才能实现驻留在卵周隙(previtalane)空间中的第一极体的可视化和作为指示核成熟的有丝分裂纺锤体的存在。当采用基于聚合酶链式反应(PCR)的技术时，完全和细致的卵丘移除也降低了来自母体卵丘细胞的外来DNA污染精子DNA的风险，如在Rienzi等人,“卵母细胞剥脱(Oocyte Denuding)”Nagy ZP,Varghese AC,Agarwal A,编辑《体外受精：当前和新兴方法和装置的教科书(In Vitro Fertilization:ATextbook of Currentand Emerging Methods and Devices.)》卡姆：施普林格国际出版公司(Cham:SpringerInternational Publishing)，(2019)的第133–145页中所讨论的。部分移除卵丘可能通过阻止卵母细胞在显微注射期间充分固定而损害显微操作的准确性。此外，如果卵丘细胞保持完整，那么卵丘/透明质酸酶反应的副产物可能导致透明带破裂和胚胎活力降低。这种方法与风险相关联，如卵母细胞孤雌生殖激活、PB1和有丝分裂纺锤体脱位、透明带断裂和卵母细胞变性。
在任何显微操作程序之前，通过机械处理或化学处理和机械处理的组合移除卵丘细胞。机械处理涉及使用一套尺寸合适的玻璃/塑料移液管，并且通过每个移液管反复用力冲洗COC。机械抽吸开始于直径较大的移液管，并且终止于内径略小于卵母细胞直径的移液管。
然而，在最常见和确定的方法中，首先用透明质酸酶(HA)对卵丘细胞进行酶促处理，以松开周围COC基质中的基于透明质酸的键，随后进行机械处理。单独的HA不能分散卵丘细胞，并且主要用于辅助上述机械移液。
在立体显微镜下，这两种方法通常都在凹槽和暖板上少量油覆盖的微小液滴内进行。在手动移液期间应小心谨慎，因为这不可避免地会对卵母细胞施加一些机械应力。虽然单独的机械移液免于酶促并发症，但单独的机械移液会迫使COC进入狭窄的微毛细管中，并对COC施加高机械应力，这最终可能导致透明带断裂和卵母细胞变性。
酶促处理可以减少卵母细胞上的机械应力，代价是剥脱程序增加了另外的步骤。另一方面，已经表明，高剂量的HA与有力的回收和移液的组合可以在小鼠和人类中诱导孤雌生殖激活卵母细胞，如在Palermo等人,“通过分区授精和胞质内精子注射进行的人类辅助受精的精子特性和结果(Sperm Characteristics and Outcome of Human AssistedFertilization by Subzonal Insemination and Intracytoplasmic SpermInjection)”,《生育与不孕(Fertil Steril)》59:826–835(1993)以及Muechler等人,“人类卵母细胞根据真空压力的孤雌生殖(Parthenogenesis of Human Oocytes as a Functionof Vacuum Pressure)”,《体外受精胚胎移植术杂志(J In Vitro Fert Embryo Transf.)6:335–337(1989)中所讨论的。类似但不太频繁的是，在显微注射期间，剧烈的移液可能使极体错位，并使有丝分裂纺锤体暴露于微针。大量的转移和洗涤步骤也使COC暴露于温度、pH和氧气水平变化，这可能损害卵母细胞的发育潜能。此外，手动剥脱程序需要高度熟练的胚胎学家，并且受到操作者之间和操作者本身的可变性的影响。因此，开发一种自动化系统将是有利的，所述自动化系统不仅减轻机械应力，最小化COC转移和处理步骤，而且减少劳动，同时提供一致的且最佳的剥脱程序以及单独细胞的容易追踪。
其他从业人员也提出了解决方案，但挑战仍然存在。例如，Zeringue等人,“利用微流体技术从哺乳动物受精卵中移除卵丘(Removal of Cumulus from Mammalian Zygotesusing Microfluidic Techniques)”,《生物医学微型装置(Biomed Microdevices)》3:219–224(2001)中描述了一种用于从单独COC中机械移除卵丘细胞的基于微流体的装置。所述装置由尺寸与COC的数量级大致相同的主通道组成。每个COC首先在直径比卵子直径稍窄的两个区域中受到挤压，以将COC团块重塑为圆环形状。通过抽吸在具有两个窄端口的角落中移除卵丘细胞，并且然后将其冲洗回到装载容器中。所述装置需要手动控制多个流体流，并且一次处理一个卵母细胞。卵母细胞还容易在剥脱端口受到挤压，这可能对所述卵母细胞施加高的且不可逆的机械应力。相同的技术也应用于体外受精(IVF)以从受精卵期细胞中移除卵丘。此类研究表明，基于微流体的卵丘移除增加了早期哺乳动物胚胎的发育潜力，并提高了所述程序的效率。
在另一个实例中，Weng等人,“用于辅助生殖疗法的卵丘-卵母细胞复合体的芯片上卵母细胞剥脱(On-Chip Oocyte Denudation from Cumulus-Oocyte Complexes forAssisted Reproductive Therapy)”,《实验室芯片(Lab Chip)》18:3892–3902(2018)展示了用于COC剥脱的芯片上卵母细胞剥脱装置。所述装置由具有重复锯齿状表面膨胀-收缩单元的微通道组成。将酶促处理的COC装载到微流体管中，并连接到注射泵。连续的流体流推动COC通过锯齿状导管，并朝向通道末端逐渐变窄。在此装置中，COC在物理接触下抵靠锯齿状壁推动，这可能导致所述COC过度变形。由于与COC本身相似的尺寸和恒定的微通道高度，所述装置也容易堵塞。将细胞装载到管中也增加了细胞损失和不必要的机械应力的风险。
Han等人,“在微流体装置上移除卵丘和俘获单个哺乳动物卵母细胞(CumulusRemoval And Single Mammal-Ian Oocyte Trapping on a Microfluidic Device)”,rsc.org.(来源:https://www.rsc.org/binaries/LOC/2009/Pdf/621-W61F.pdf)中描述了一种用于卵丘移除的基于真空和重力的混合装置。所述装置由用于装载和废物移除以及卵母细胞截留的一个入口端口和两个出口端口组成。通过向废物出口施加负压，浸没在HA溶液中的COC被带到消化区域，当卵丘细胞分散并接近两个出口的接合点时，停止负压并允许卵母细胞通过重力进入储存微室。装置的装载端口和圆筒包括可能导致入口端口中的细胞损失的平端。所述装置也是基于重力的，在此范围内这与粘附力和毛细管力相当。因此，对用于卵母细胞剥脱的新的或改进的方法和装置存在持续的和未满足的需求。
本发明旨在克服本领域中的这些和其它缺陷。
发明内容
本发明技术的一方面涉及一种用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的微流体装置。所述装置包括衬底。宽度为约200μm至约1mm的第一通道位于所述衬底内。所述第一通道从所述衬底的第一端延伸到第二端。所述第一通道具有沿着其表面布置的一个或多个脊元件。第一端口位于所述衬底中并且与所述通道的所述第一端流体连通。第二端口位于所述衬底中并且与所述通道的所述第二端流体连通。
本发明技术的另一个方面涉及一种用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的系统。所述系统包括本发明技术的微流体装置。光学成像装置被配置成对包括所述微流体装置的卵丘卵母细胞复合体的所述通道的一部分进行成像。计算装置耦接到所述光学成像装置。所述计算装置包括处理器，所述处理器耦接到存储器并且被配置成执行存储在所述存储器中的程序指令，所述程序指令包括基于从所述光学成像装置接收的一个或多个图像，确定位于所述通道的所述部分中的所述卵丘卵母细胞复合体的剥脱状态。向控制器提供一个或多个指令以交替地打开和关闭第一阀和第二阀。
本发明技术的又另一方面涉及一种用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的方法。所述方法包括提供本发明技术的微流体装置。通过第一端口将包括卵丘卵母细胞复合体的流体引入到所述微流体装置的通道中。激活第一阀和第二阀，使得所述卵丘卵母细胞复合体沿着所述通道在从第一端朝向第二端的第一方向上沿着一个或多个脊元件平移。
本发明技术的另外的方面涉及一种用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的方法。所述方法包括提供本发明技术的系统。通过第一端口将包括卵丘卵母细胞复合体的流体引入到所述微流体装置的通道中。激活第一阀和第二阀，使得所述卵丘卵母细胞复合体沿着所述通道在从第一端朝向第二端的第一方向上沿着一个或多个脊元件平移。使用光学成像装置监测所述卵丘卵母细胞复合体的位置和/或状态。基于所述卵丘卵母细胞复合体的位置和/或状态来调整所述第一阀和所述第二阀的所述激活。
所公开的装置和方法有利地提供了一种用于对卵丘卵母细胞复合体(COC)进行剥脱程序的集成半自动化装置。在显著降低所施加的机械应力的情况下，所公开的装置和方法通过非接触式剥脱技术实现了剥脱过程的自动化。所述装置也是高度灵活的，使得可以基于化学处理、细胞可变性和剥脱效率来调整程序。所述装置和方法还提供了程序的标准化，以使与手动操作相关联的可变性最小化。所述装置还可以由便宜的部件和简单的设备构造而成，所述组件和设备还可以与其它模块集成，以提高辅助生殖疗法的可负担性和效率。
所公开的装置和方法使卵母细胞上的物理应力最小化，提供了自动化的COC处理和转移，完成了卵丘细胞耗竭并且容易地视觉跟踪单独卵母细胞。所公开的装置和方法通过例如在通道的顶部上以相对于微通道的纵轴成倾斜角
Figure BDA0004106992160000051
放置脊而在微通道中产生横向或二次流来克服先前的挑战。这些脊引起对层流的各向异性阻力。轴向压力梯度会在流动中产生平均横向分量，所述平均横向分量源自结构化表面并跨通道底部向回循环，从而形成螺旋流线。
附图说明
图1是包括本发明技术的微流体装置的第一实施例的环境的部分框图和部分示意图。
图2A是本发明技术的微流体装置的微流体芯片的透视虚线图。
图2B是图2A所示的微流体芯片的第一端口的增强视图。
图2C是图2A所示的微流体芯片的通道的增强视图。
图2D是图2A所示的微流体芯片的第二端口的增强视图。
图3A是图2A所示的微流体芯片的通道的透视图。
图3B是图2A所示的微流体芯片的通道的示意图。
图4A是可以在本发明技术中使用的具有人字形脊元件的另一个示例性通道的透视图。
图4B是图4A所示的示例性通道的示意图。
图5是图1所示的示例性计算装置的框图。
图6是包括本发明技术的微流体装置的第二实施例的环境的部分框图和部分示意图。
图7A是本发明技术的另一个示例性微流体芯片的透视虚线图。
图7B是图7A所示的微流体芯片的补充通道上的全阀的增强视图。
图7C是图7A所示的微流体芯片的通道上的筛阀的增强视图。
图8A是图7A所示的微流体芯片的俯视图。
图8B是图8A上所示的筛阀的增强视图。
图9A和9B是加压前(图9A)和加压后(图9B)图7A中所示的具有筛阀的微流体芯片的一部分的侧视横截面视图。
图9C和9D是加压前(图9C)和加压后(图9C)图7A中所示的具有全阀的微流体芯片的一部分的侧视横截面视图。
图10A示出了从超数排卵的B6D2F1成年小鼠中获得的一群卵母细胞。
图10B示出了覆盖有卵丘细胞层的MII期小鼠卵母细胞。
图10C示出了通过手动移液剥脱的无卵丘的MII期卵母细胞。
图10D示出了使用本发明技术剥脱的无卵丘MII期卵母细胞。
图11A-11C示出了使用本发明技术剥脱MII期小鼠卵母细胞的图像。
图12展示了机械程序与本发明技术之间的卵母细胞制备比较。
图13展示了机械程序与本发明技术之间的胚胎发育比较。
图14示出了本发明技术的方法的流线速度场实验数据。
图15展示了本发明技术的方法的计算流体动力学模拟。
具体实施方式
本发明技术涉及用于自动化微流体卵母细胞剥脱的方法和装置。
本发明技术的一方面涉及一种用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的微流体装置。所述装置包括衬底。宽度为约200μm至约1mm的第一通道位于所述衬底内。所述第一通道从所述衬底的第一端延伸到第二端。所述第一通道具有沿着其表面布置的一个或多个脊元件。第一端口位于所述衬底中并且与所述通道的所述第一端流体连通。第二端口位于所述衬底中并且与所述通道的所述第二端流体连通。
图1是环境10的框图，所述环境包括用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的微流体装置12的第一实施例。环境12包括微流体装置12、计算装置14和成像装置16，尽管环境10也可以包括其它组合中的其它数量和/或类型的元件或装置，包括另外的电子器件，如数模转换器或另外的光学装置，其仅作为举例。
现在参考图1和2A-2D，在此实例中，微流体装置12包括微流体芯片17以及第一阀26、第二阀28、泵30和控制器32，所述微流体芯片包括衬底18、第一端口20、第二端口22和通道24，尽管微流体装置12也可以包括其它组合中的其它类型和/或数量的元件或部件，如耦接到控制器32的功率放大器34和支撑衬底18的外壳36。在一个实例中，微流体装置12可以仅包括微流体芯片17，所述微流体芯片被配置成分别耦接到图1所展示的另外的元件。微流体装置12有利地提供了一种可以用于剥脱卵丘卵母细胞复合体(COC)的集成半自动化装置。
衬底18被配置成容纳第一端口20、第二端口22和通道24。衬底18可以由任何合适的生物相容性材料形成，如玻璃、聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚(甲基丙烯酸酯)(PMMA)，其仅作为举例。尽管在如下所述的其它实例中，衬底18也可以具有多层，在此实例中衬底18形成为单层。
第一端口20和第二端口22位于衬底18中，并且提供用于引入包括COC的流体和从微流体芯片17移除所述流体的开口，尽管衬底18也可以包括如下所述的与通道24流体连通的其它数量的端口。第一端口20和第二端口22可以用作入口端口或出口端口。在此实例中，第一端口20和第二端口22被配置为微漏斗。此配置有利地防止COC在装载到微芯片17中的期间丢失。第一端口20和第二端口22延伸到衬底18中，并终止于通道24的顶部，分别如图2B和2D所示，使得第一端口20和第二端口22与通道24直接接触并流体连通。如图2A所示，第一端口20和第二端口22可以使用微型化软管配件和帽密封，以便在剥脱程序期间密封通道24。在一个实例中，衬底18的至少一部分是光学半透明的，以提供与成像装置16一起使用的通道24的视野，如下文进一步详细描述。
通道24位于衬底18内，并从第一端38延伸到第二端40，所述第一端耦接到第一端口20并与其流体连通，所述第二端耦接到第二端口22并与其流体连通。通道24在第一端38与第二端40之间具有约1cm至约10cm的长度。在实施例中，通道24具有约1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm的长度或其间的任何长度。通道24包括其上具有多个脊元件44的表面42。在一个实例中，表面42是通道24的顶表面(基于图2A所示的微流体芯片17的取向，所述取向是微流体装置12使用期间的取向)，尽管脊元件44可以位于通道24的其它表面上。在一个实例中，通道24沿着通道24的长度每毫米具有1至10个脊元件44。在另一个实例中，通道24沿着通道24的长度每毫米具有2至5个脊元件44。在又另一个实例中，通道24沿着通道24的长度每毫米具有2个脊元件44。
图3A和3B展示了通道24的透视图和示意图，所述通道的脊元件44位于通道24的表面42上。尽管将描述关于如图3A和3B所示的脊元件44的某些方面，但是应当理解，可以在其它配置中采用其它类型和/或数量的脊元件，如下文进一步详细描述的。脊元件44被配置成当第一流体流施加在第一端38与第二端40之间时，在通道24内产生二次流体流，或者反之亦然。二次流体流使第一流变成螺旋流、扭曲流、涡旋流或其组合中的一种，这有助于剥脱过程。可以采用脊元件的各种配置来实现期望的二次流。
再次参考图3A和3B，坐标系(x,y,z)和(x',y',z')指示通道24和脊元件44的主轴取向。在此实例中，通道24沿着纵轴(y)延伸，并且脊元件44沿着轴(y')定向。脊元件以相对于通道24的纵轴(y)成倾斜角(θ)的倾斜取向定位。在一个实例中，倾斜角(θ)小于90度。在另一个实例中，倾斜角(θ)在约30度至约70度的范围内。在又另一个实例中，倾斜角(θ)为约45度。在此实例中，脊元件44中的每个脊元件相对于其它脊元件44以平行取向定位，并且沿着通道24等距间隔开，尽管也可以采用其它配置。脊元件44的形状为矩形，尽管也可以采用其它形状，如曲线形、人字形、偏移人字形或其组合。
现在更具体地参考图3B，通道24的宽度(w)和高度(h)各自介于约200μm与1mm之间。在实施例中，通道24具有约200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm的宽度或其间的任何宽度。高度(h)足以使得标准尺寸COC可以位于通道24内，并且在剥脱过程期间不与脊元件44接触。举例来说，人类的标准COC是卵母细胞直径的2-3倍，平均为约110微米。在另一个实例中，小鼠卵母细胞的平均直径为90微米，并且COC是2-3倍大。在此实例中，脊元件44跨通道24的整个宽度(w)延伸，尽管在其它实例中，脊元件44也可以跨通道24的宽度(w)延伸大约80％-99％。如图3B所示，脊元件44的深度(αh)小于通道24的高度(h)的一半。脊元件44的深度(αh)可以介于约100μm与500μm之间。仅作为举例，脊元件44的深度(αh)可以为约100μm、200μm、300μm、400μm、500μm或其间的任何值。脊元件的厚度(即垂直于轴y'的尺寸)小于通道24的宽度(w)的一半。脊元件44的厚度可以介于约100μm与500μm之间。仅作为举例，脊元件44的深度(αh)可以为约100μm、200μm、300μm、400μm、500μm或其间的任何值。脊元件44被布置成使得其在剥脱过程期间不与COC大量接触，即，脊元件44不用于机械地剥脱卵母细胞。
图4A和4B展示了通道24的替代性实施例的透视图和示意图，所述通道的脊元件144位于通道24的表面42上。在此实例中，脊元件144具有人字形形状，即使如上所述，各种形状可以用于本文所述的脊元件。脊元件144形成为包括相对于通道24的中心线交替对称的两个连续的人字形区域的周期。在此实例中，不对称向量(β)是通道24的宽度(w)的函数(0<β<0.3)。不对称向量(β)可以是恒定的，或者可以相对于通道24的中心线以每半个周期交替。尽管描述了包括脊元件144的此替代性实施例，但是应当理解，可以沿着通道24采用具有其它形状和类型和/或数量的脊元件的多种其它配置。
第一阀26和第二阀28分别耦接到第一端口20和第二端口22。第一阀26和第二阀28是高速、三通/两位电磁阀，尽管也可以采用其它类型的阀。在一个实例中，第一阀26和第二阀28是生物相容性阀。第一阀26和第二阀28通过功率放大器34耦接到控制器32，使得第一阀26和第二阀28的操作由来自控制器32的信号控制。举例来说，第一阀26和第二阀28可以由控制器32产生的矩形信号控制(例如，如图1所示的切换信号1和切换信号2)。第一阀26和第二阀28接收信号，使得在每个时刻到第一阀26的信号(切换信号1)与到第二阀28的信号(切换信号2)相反，从而沿着通道24在一个方向上形成完整的微流体回路。控制器32通过调整所生成的矩形信号的占空比来控制通道24内部的流体的流速。例如，0％和100％的占空比将仅激活第一阀26和第二阀28中的一个，使得流体将在通道24中在单方向上流动。50％的占空比使通道24内部的净流体流量为零。相对于50％占空比的任何正或负偏移产生沿着通道24在任一方向上的净流体。
泵30与第一阀26和第二阀28流体连通，使得泵30被配置成基于第一阀26和第二阀28的位置在通道24内提供压力以沿着通道24产生流体流，如上所述。在一个实例中，泵30是气动泵。泵30包括压力源46和压力控制器48以控制提供到第一阀26和第二阀28的压力量，从而控制通道24中的流体流的速率。压力控制器48耦接到计算装置18，并且可以从其接收指令，以改变提供到第一阀26和第二阀28的压力量。
控制器32可以是用于向第一阀26和第二阀28提供信号的任何合适的装置，信号例如图1所示的矩形切换信号，，装置例如微控制器。仅作为举例，控制器32的型号可以是来自Lee公司(Lee Company)(康涅狄格州韦斯特布鲁克(Westbrook，CT))的LHDA2431115H。控制器32通过通信网络耦接到计算装置18，并且可以从计算装置18接收一个或多个指令，以改变第一阀26和第二阀28的占空比，如上所述。
现在更具体地参考图1和5，计算装置14包括通过总线56或其它通信链路耦接在一起的一个或多个处理器50、存储器52和通信接口54，即使计算装置14在其它配置中可以包括其它类型和/或数量的元件。
计算装置14的(一个或多个)处理器50可以执行存储在存储器52中的用于任何数量的通过本文中的实例所展示和描述的功能或其它操作的编程指令，所述编程指令包括基于来自成像装置16的图像确定通道24中的COC的剥脱状态(如下所定义)，并向控制器32提供指令以改变占空比，从而交替地打开和/或关闭第一阀26和第二阀28(仅作为举例)。例如，计算装置14的(一个或多个)处理器50可以包括一个或多个图形处理单元(GPU)、CPU或具有一个或多个处理核的通用处理器，即使可以使用其它类型的处理器。
计算装置14的存储器52存储如本文所展示和描述的本发明技术的一个或多个方面的编程指令，尽管所述编程指令中的一些或所有编程指令也可以存储在其它地方。各种不同类型的存储器存储装置可以用于存储器52，所述存储器存储装置如随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、硬盘驱动器(HDD)、固态驱动器(SSD)、闪存或耦接到处理器50的磁性系统、光学系统或其它读写系统读写的其它计算机可读介质。
因此，计算装置14的存储器52可以存储应用程序，所述应用程序可以包括可执行指令，当由计算装置14执行时，所述可执行指令使计算装置14执行动作，如执行如通过本文中的实例所展示和描述的用于剥脱COC的方法。应用程序可以被实施为其它应用程序的模块或部件。此外，应用程序可以被实施为操作系统扩展、模块、插件等。
计算装置14的通信接口54操作性地耦接并允许计算装置14、成像装置16、控制器32与压力控制器48之间的通信，它们全部通过一个或多个通信网络耦接在一起，即使可以使用针对其它装置和/或元件的其它类型和/或数量的连接和/或配置。通信网络可以包括任何数量和/或类型的通信网络，如局域网(LAN)或广域网(WAN)和/或无线网络，即使可以使用其它类型和/或数量的协议和/或通信网络。
尽管在本文中描述和展示了计算装置14的实施例，但是计算装置14可以在任何合适的计算系统或计算装置上实施。应当理解，本文所描述的装置和系统是出于示例性目的的，并且相关领域的技术人员将会理解，特定硬件和软件的许多变型是可能的。
可替代地，所述系统中的每个系统可以使用根据本文所描述和展示的教导编程的一个或多个通用计算机系统、微处理器、数字信号处理器和微控制器来方便地实施。此外，两个或更多个计算系统或装置可以替代上述系统中的任何一个系统。因此，分布式处理，如冗余和复制，的原理和优点也可以根据需要实施，以提高上述装置和系统的鲁棒性和性能。本申请的实施例还可以在使用任何合适的接口机构和通信技术跨任何合适的网络延伸的一个或多个计算机系统上实施，仅作为举例，所述接口机构和通信技术包括呈任何合适形式(例如，语音和调制解调器)的电信、无线通信介质、无线通信网络、蜂窝通信网络、G3通信网络、公共交换电话网络(PSTN)、分组数据网络(PDN)、互联网、内联网以及其组合。
成像装置16可以是用于获得通道24的图像的任何合适的光学成像装置，或者更具体地可以是位于通道24内的COC，即使也可以采用其它适当的成像装置。仅作为举例，成像装置16可以是电荷耦接装置(CCD)相机或互补金属氧化物半导体(CMOS)相机，即使可以采用任何合适的成像装置。成像装置16耦接到计算装置14，以根据本文所公开的方法提供通道24的至少一部分(包括位于其中的COC)的图像。
图7是环境100的框图，所述环境包括用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的微流体装置112的第二实施例。除了下文描述的之外，环境100包括与如上文所述的环境10相同的元件。如下文所述，环境100包括微流体装置112以及用于向微流体装置112上的另外的阀提供压力的另外的压力控制器148。
现在参考图6-9，除了下文详述的之外，微流体装置112在结构和操作上与微流体装置12相同。微流体装置112包括微流体芯片117，所述微流体芯片包括由多层构造而成的衬底118，如图9A-9D所示。在此实例中，微流体芯片117包括基础层158、控制层160和流动层162。基础层158由玻璃材料形成。控制层160形成在基础层158的上方，并且由可逆变形材料(如聚二甲基硅氧烷(PDMS))构造而成。如下文所述，控制层160向微流体芯片117提供多个另外的阀，因为控制层160可以变形为流动层162。举例来说，控制层160提供了沿着通道24布置的筛阀166。筛阀166可以用于在通道24中提供收缩(constriction)，以在通道24内提供另外的压力控制。图9A和9B展示了加压前(图9A)和加压后(图9B)的筛阀166。
流动层162包括通道24以及与通道24流体连通的补充通道164(1)-164(3)。补充通道164(1)-164(3)各自与用于将材料引入到微流体芯片117和/或从所述微流体芯片中移除材料的端口(未示出)相关联。此外，补充通道164(1)-164(3)可以与由压力控制器148操作的另外的电磁阀(未示出)相关联。举例来说，补充通道164(1)可以提供用于将HA引入到通道24的通道，以辅助剥脱过程，补充通道164可以提供用于将洗涤介质，如缓冲溶液，如来自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Adrich)(德国达姆施塔特(Darmstadt,Germany))的含有酚红和透明质酸酶(M2+HA)的embryomax M2培养基，产品号MR-051，引入到通道24的通道，而补充通道164(3)可以用于从微流体芯片117中移除材料，尽管补充通道164(1)-164(3)也可以用于将任何其它类型和/或数量的流体引入到通道24。控制层160还提供可以用于打开和关闭从与补充通道164(1)-164(3)相关联的端口到通道24的通路的全阀168。图9C和9D展示了加压前(图9C)和加压后(图9D)的全阀168。如图9D所示，控制层160在完全加压状态下阻挡流动层162，以阻止流体通过全阀168。
本发明技术的另一个方面涉及一种用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的系统。所述系统包括本发明技术的微流体装置。光学成像装置被配置成对包括所述微流体装置的卵丘卵母细胞复合体的所述通道的一部分进行成像。计算装置耦接到所述光学成像装置。所述计算装置包括处理器，所述处理器耦接到存储器并且被配置成执行存储在所述存储器中的程序指令，所述程序指令包括基于从所述光学成像装置接收的一个或多个图像，确定位于所述通道的所述部分中的所述卵丘卵母细胞复合体的剥脱状态。向控制器提供一个或多个指令以交替地打开和关闭第一阀和第二阀。
本发明技术的又另一方面涉及一种用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的方法。所述方法包括提供本发明技术的微流体装置。通过第一端口将包括卵丘卵母细胞复合体的流体引入到所述微流体装置的通道中。激活第一阀和第二阀，使得所述卵丘卵母细胞复合体沿着所述通道在从第一端朝向第二端的第一方向上沿着一个或多个脊元件平移。
现在将参考图1-3B描述用于剥脱卵丘卵母细胞复合体(COC)的示例性方法。所述方法可以类似地与本文所公开的其它实施例一起使用。首先，通过第一端口20将包括COC的流体引入到微流体芯片17的通道24中，即使包括COC的流体可以可替代地通过第二端口22引入到通道24。第一端口20被配置为漏斗以确保COC在引入到通道24期间不会损失。在一实例中，使用第一阀26和第二阀28利用脉冲流将COC引入到通道24中。
接下来，通过如上所述改变占空比来激活第一阀26和第二阀28，以在通道24中产生流体流，使得COC沿着通道24在从第一端38朝向第二端40的第一方向上沿着脊元件44平移。当第一流体流施加在第一端38与第二端40之间时，脊元件44在通道24内产生二次流体流，或者反之亦然。二次流体流使第一流变成螺旋流、扭曲流、涡旋流或其组合中的一种，这有助于剥脱过程。二级流产生用于剥脱COC的涡旋力。在一些实例中，剥脱几乎完全是由二次流产生的涡旋力进行的。在一些实例中，剥脱在没有与脊元件44进行任何机械接触的情况下发生，尽管在其它实例中可能与脊元件44有一些偶然的接触。剥脱不需要COC接触脊元件44，尽管可能会发生一些偶然的接触。剥脱不需要与脊元件44的另外的机械接触。可以改变第一阀26和第二阀28的占空比，以使流体流和COC沿着通道24在两个方向上振荡。在微流体通道24中引入振荡，以便获得实现亚微米粒子聚焦所需的无限长度。举例来说，COC可以以1000微米/秒至10000微米/秒的速率沿着通道24移位。
接下来，执行流体的来回振荡，直到卵丘细胞从COC分离以基于主要使用由脊元件44产生的二次流的通道24中的流体流产生剥脱的卵母细胞。具体地，当流体来回振荡时，流体穿过脊元件44。当流体振荡时，产生二次流，所述二次流产生涡旋力以提供如上所述的剥脱。振荡仅允许缩短通道24的长度。然后，可以从微流体芯片17中移除剥脱的卵母细胞，例如通过第二端口22。
本发明技术的另外的方面涉及一种用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的方法。所述方法包括提供本发明技术的系统。通过第一端口将包括卵丘卵母细胞复合体的流体引入到所述微流体装置的通道中。激活第一阀和第二阀，使得所述卵丘卵母细胞复合体沿着所述通道在从第一端朝向第二端的第一方向上沿着一个或多个脊元件平移。使用光学成像装置监测所述卵丘卵母细胞复合体的位置和/或状态。基于所述卵丘卵母细胞复合体的位置和/或状态来调整所述第一阀和所述第二阀的所述激活。
在一个实例中，成像装置16可以用于对包括COC的通道24的一部分进行成像。来自成像装置16的图像被提供到计算装置14。计算装置14分析图像以监测COC在通道24内的位置和/或状态。COC的状态指示卵母细胞剥脱的程度，即，卵母细胞是部分剥脱还是完全剥脱的。计算装置14然后可以改变第一阀26和第二阀28的占空比或由压力控制器48提供的压力，以改变通道24中的流体流，从而影响剥脱过程。
实例
以下实例旨在例示本公开的实施例的实践，但绝不旨在限制其范围。
实例1-
与常规方法相比，使用上述装置和方法进行研究。如图10A所展示的，从超数排卵的B6D2F1成年小鼠中获得一群卵母细胞。图10B展示了覆盖有卵丘细胞层的中期II期(MII)期小鼠卵母细胞。将卵母细胞暴露于1mg/ml HA持续30秒，并且立即冲洗并装载到微流体装置中。微流体芯片和常规方法的结果是相当的。图10C和10D分别展示了通过手动移液剥脱的无卵丘的MII期卵母细胞和使用本发明技术剥脱的无卵丘的MII期卵母细胞。
图11A-11C示出了使用本发明技术剥脱MII期小鼠卵母细胞的图像，与机械剥脱相反，本发明技术主要依赖于由通道中的脊元件产生的二次流。在5Hz的频率下将交替流的压力设置为2mbar。图11A展示了在未进行HA处理的情况下的新鲜装载的COC。图11B示出了处于部分剥脱状态的COC。图11B示出了处理30秒后完全剥脱的COC。图14和15示出了本发明技术的方法的流线速度场实验数据和计算流体动力学(CFD)模拟，所述流线速度场实验数据和CFD模拟展示了在剥脱过程中使用的通道内的二次流的产生。
为了确保所公开的装置和方法不会危及配子的发育潜能，对通过每种方法处理的50个卵母细胞进行压电致动的胞质内精子注射(ICSI)。通过机械程序或本发明技术的装置和系统剥脱的卵母细胞示出相似的分裂参数。图12展示了机械程序与本发明技术之间的卵母细胞制备比较，而图13展示了机械程序与本发明技术之间的胚胎发育比较。
表1展示了常规技术(左栏)与本发明技术的装置和方法(右栏)之间的比较结果。
Figure BDA0004106992160000141
尽管本文已经详细描绘和描述了优选实施例，但是对于相关领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神的情况下可以进行各种修改、添加、替换等，并且因此这些被认为是在随后的权利要求中限定的本发明的范围内。

Claims (43)

1.一种用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的微流体装置，其特征在于，所述装置包括：
衬底；
第一通道，所述第一通道具有约200μm至约1mm的宽度，位于所述衬底内并从第一端延伸到第二端，所述第一通道具有一个或多个沿着其表面布置的脊元件；
第一端口，所述第一端口位于所述衬底中并且与所述通道的第一端流体连通；以及
第二端口，所述第二端口位于所述衬底中并且与所述通道的第二端流体连通。
2.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，当以使用所述微流体装置期间定向时，所述一个或多个脊元件沿着所述通道的顶表面布置。
3.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述一个或多个脊元件被配置成当从所述通道的第一端向所述通道的第二端施加第一流体流时，在所述通道内产生二次流体流。
4.根据权利要求3所述的微流体装置，其特征在于，所述二次流体流使得所述第一流体流成为螺旋流、扭曲流、涡旋流或其组合中的一种。
5.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述一个或多个脊元件相对于所述通道的纵轴以倾斜取向定位。
6.根据权利要求5所述的微流体装置，其特征在于，所述一个或多个脊元件相对于所述通道的纵轴以小于90度的倾斜角定位。
7.根据权利要求6所述的微流体装置，其特征在于，所述倾斜角在约30度至约70度的范围内。
8.根据权利要求7所述的微流体装置，其特征在于，所述倾斜角为约45度。
9.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述一个或多个脊元件中的每一个脊元件相对于其它一个或多个脊元件中的每一个脊元件以平行取向定位。
10.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述一个或多个脊元件沿着所述通道等距间隔开。
11.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述一个或多个脊元件延伸所述通道的整个宽度。
12.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述一个或多个脊元件是曲线的。
13.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述一个或多个脊元件是矩形、人字形、偏移人字形或其组合中的一种。
14.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述通道包括约1cm至约10cm的长度。
15.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述一个或多个脊元件在所述衬底的表面中的深度小于所述通道的高度的一半。
16.根据权利要求15所述的微流体装置，其特征在于，一个或多个脊元件在所述衬底的表面中的深度为约100μm至约500μm。
17.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述一个或多个脊元件的厚度小于所述通道的宽度的一半。
18.根据权利要求17所述的微流体装置，其特征在于，所述一个或多个脊元件的厚度为约100μm至约500μm。
19.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述通道包括每毫米1至10个所述一个或多个脊元件。
20.根据权利要求19所述的微流体装置，其特征在于，所述通道包括每毫米2至5个脊。
21.根据权利要求20所述的微流体装置，其特征在于，所述通道包括每毫米2个脊。
22.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述衬底的至少一部分是光学半透明的，以提供所述通道的视野。
23.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，还包括一个或多个沿着所述通道布置的筛阀。
24.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，还包括至少一个与所述通道流体连通的二级通道。
25.根据权利要求24所述的微流体装置，其特征在于，还包括第三端口，所述第三端口位于所述衬底中并且与至少一个二级通道流体连通。
26.根据权利要求1所述的微流体装置，其特征在于，所述衬底包括基础层、控制层和流动层。
27.根据权利要求26所述的微流体装置，其特征在于，所述基础层是玻璃材料。
28.根据权利要求26所述的微流体装置，其特征在于，所述控制层是可逆变形材料。
29.根据权利要求26所述的微流体装置，其特征在于，所述通道位于所述衬底的流动层中。
30.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其特征在于，所述微流体装置还包括：
第一阀，所述第一阀耦接到所述第一端口；
第二阀，所述第二阀耦接到所述第二端口；
泵，所述泵与所述第一阀和所述第二阀流体连通；以及
控制器，所述控制器耦接到所述泵并且被配置成交替地打开和关闭所述第一阀和所述第二阀。
31.根据权利要求30所述的微流体装置，其特征在于，所述第一阀和所述第二阀是三通阀。
32.根据权利要求30所述的微流体装置，其特征在于，所述泵是气动泵。
33.一种用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的系统，其特征在于，所述系统包括：
根据权利要求30所述的微流体装置；
光学成像装置，所述光学成像装置被配置成对所述微流体装置的包括卵丘卵母细胞复合体的所述通道的一部分进行成像；以及
计算装置，所述计算装置耦接到所述光学成像装置，所述计算装置包括处理器，所述处理器耦接到存储器并且被配置成执行存储在所述存储器中的编程指令，所述编程指令包括：
基于从所述光学成像装置接收的一个或多个图像，确定位于所述通道的一部分中的卵丘卵母细胞复合体的剥脱状态；以及
向所述控制器提供一个或多个指令以交替地打开和关闭所述第一阀和所述第二阀。
34.一种用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的方法，其特征在于，所述方法包括：
提供根据权利要求30所述的微流体装置；
通过所述第一端口将流体引入到所述微流体装置的通道中，所述流体包括卵丘卵母细胞复合体；以及
激活所述第一阀和所述第二阀，使得所述卵丘卵母细胞复合体沿着所述通道在从第一端朝向第二端的第一方向上沿着所述一个或多个脊元件平移。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，进行所述激活以交替地沿着所述通道在从第一端朝向第二端的所述第一方向上和从第二端朝向第一端的第二方向上沿着所述一个或多个脊元件平移所述卵丘卵母细胞复合体。
36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，进行所述激活直到卵丘细胞从所述卵丘卵母细胞复合体分离以产生剥脱的卵母细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
从所述微流体装置中移除所述剥脱的卵母细胞。
38.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，引入所述流体包括向所述通道提供脉冲流体流。
39.一种用于剥脱卵丘卵母细胞复合体的方法，其特征在于，所述方法包括：
提供根据权利要求30所述的系统；
通过所述第一端口将流体引入到所述微流体装置的所述通道中，所述流体包括卵丘卵母细胞复合体；
使用所述泵激活所述第一阀和所述第二阀，使得所述卵丘卵母细胞复合体沿着所述通道在从第一端朝向第二端的第一方向上沿着所述一个或多个脊元件平移；
使用所述光学成像装置监测所述卵丘卵母细胞复合体的位置和/或状态；以及
由所述计算装置基于所述卵丘卵母细胞复合体的位置和/或状态来调整所述第一阀和所述第二阀的所述激活。
40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，进行所述激活以交替地沿着所述通道在从第一端朝向第二端的所述第一方向上和从第二端朝向第一端的第二方向上沿着所述一个或多个脊元件平移所述卵丘卵母细胞复合体。
41.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，进行所述激活直到卵丘细胞从所述卵丘卵母细胞复合体分离以产生剥脱的卵母细胞。
42.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
从所述微流体装置中移除所述剥脱的卵母细胞。
43.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，所述卵丘卵母细胞复合体以约1000微米/秒至约10000微米/秒的速率沿着所述通道交替地平移。
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