CN115038783A - 细胞培养微装置 - Google Patents

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Abstract

一种用于维持和培养在其中的细胞的细胞培养微装置，包括具有至少一个第一细胞载体单元的细胞培养单元，所述第一细胞载体单元限定于其中形成的细胞培养室，所述第一细胞载体单元由成形为支撑其上的细胞的至少一个室基座以及一个或多个室壁形成，所述一个或多个室壁具有围绕室边界包围所述细胞培养室的一个或多个室壁表面，所述第一细胞载体单元还提供导引表面，以引导仪器或液体定位在穿过室壁的孔进入细胞培养室，其中，所述细胞培养微装置的尺度配置为基本上将单个细胞或细胞团包围在其中。细胞培养微装置的实施例可适用于体外受精程序和药物疗效测试。

Description

细胞培养微装置
技术领域
本技术领域通常涉及用于细胞(特别是哺乳动物细胞)培养的微装置的进展。本发明的微装置通常是细胞载体装置的形式，以及用于细胞培养的微装置的形式。然而，载体装置同样适用于细胞培养、干细胞分化、细胞阵列检测、不孕症治疗，特别是体外受精(IVF)治疗。具体实施例涉及包括细胞培养单元、盒、阵列的微装置和包括细胞载体单元和细胞盖单元的灌流装置。
背景技术
自从组织培养微装置广泛使用，微尺度组织培养技术已经在复杂性上取得了进展，其使用和应用的领域已经变得更加多样化。微装置能够操作细胞及其培养环境，从而产生新的疗法、产品和工艺，其中许多仍处于起步阶段。新的微装置和现有微装置(如微流控装置、“在芯片上培养(culture on a chip)”技术、微支架和微操作装置)的改进，已经产生了3D组织工程、干细胞分化和生殖医学的新方法，以及取得了这些技术成功率的突破性进展。
例如，复杂的体外组织培养以前在成功和应用上受到可能通过扩散的有限气体交换的限制，然而，微毛细管灌流装置的发展现在能够培养和增殖更大、更复杂的组织。关于干细胞培养技术(及其应用)，各种胚胎组织的器官培养系统现在能够培养胚胎脑、视网膜、肢芽、肺、肾、唾液腺、毛囊和牙齿细胞系。新的组织工程技术的应用，以及使这些技术成为可能的微装置，将促进许多不同疗法的新的和改进的方法。
在生殖医学领域，改进的微装置对改善细胞培养和增殖的潜在益处是显著的。该领域的性质几乎无法替代自体细胞的体外培养和操作，因为这些细胞必须被采集、扩增并重新引入患者体内。
通过体外受精(IVF)的生殖援助变得越来越容易获得，并且最近有所改善，因此越来越多的患者正在获得这种援助。人类受精与胚胎学管理局发布的数据显示，总体而言，开始IVF治疗的女性比以前更有可能生育1。然而，在各个诊所之间观察到的IVF诊所成功率存在很大差异，一些诊所的成功率高达46％，而另一些诊所的成功率低至10％1。
在IVF程序的几个阶段(在卵子采集、卵子受精、早期胚胎发育、胚胎玻璃化冷冻和胚胎移植期间)，成功的可能性会有所不同。目前，卵子选择、受精、胚胎发育、胚胎冷冻保存和胚胎移植准备的成功在很大程度上取决于胚胎学家的技术。
在胚胎发育过程中，成功的IVF妊娠的决定因素在很大程度上涉及胚胎生长发育过程中存在的物理和环境条件。精子、卵子或发育中的胚胎可能发生的任何类型的快速环境变化、物理冲击或物理应激都会降低胚胎存活的可能性，进而降低胚胎成功植入以成功妊娠的可能性。
任何细胞培养系统的物理和环境条件都可能影响体外细胞的活力和增殖。例如，在刮片(手动/物理)、胰蛋白酶化(化学/酶)和超声波(物理/温和)之间进行选择，以分离为体内培养准备的贴壁细胞，这极大地影响了细胞的活力，并在很大程度上取决于所用的细胞类型、缓冲液和其他培养基成分。
在组织工程中，在形态发生和器官发生期间，功能性三维组织结构的组装依赖于组织单层之间的细胞间相互作用。这些细胞-细胞相互作用由培养系统内的物理和环境线索触发和维持，该线索包括机械力的施加、细胞形状、细胞外基质几何形状或其他特性、以及物理细胞-细胞接触和其他形态发生因子。同样，干细胞的分化也受到细胞培养基质中许多因素的影响，包括细胞特异性生长因子、酶和其他蛋白质，或这些成分或其副产物的消耗或积累。
对于胚胎发生而言，发育中的胚胎最重要的冲击或应激是通过处理和物理操作发生的，这受胚胎学家的经验、训练度和疲劳度的影响。对于IVF程序，胚胎生长和准备过程中的几个事件涉及胚胎学家的物理干预，因此对胚胎成功及其植入的可能性构成风险。在采集精子、卵子并将其引入体外环境的过程中，存在对精子和卵子产生应激或冲击的风险，包括在硅片中放置过程中的物理伤害和有害环境影响，以及放置在不同液体环境中产生的生化应激。
受精过程存在着引入精子所需的物理操作(无论是否为细胞质内操作)所造成的伤害风险。胚胎培养环境的优化和胚胎一旦发育后的取出，用于冷冻保存或植入，会增加物理伤害的风险。胚胎的物理植入也为胚胎的物理损害或损伤创造了机会。操作和处理导致受伤或休克的风险，以及IVF程序的成功，在很大程度上受胚胎学家的技术和护理以及胚胎学家可用工具和仪器的精确度，以及受胚胎学家影响的实验室环境条件(例如无菌、温度、任何形式的污染的预防，包括挥发性有机化合物，以及亲子鉴定的管理，以防止错误或混合亲子关系)的影响。
精密的工具和设备降低了胚胎学家可能出错导致精子、卵子或胚胎受伤或休克或错误亲子关系的可能性。此外，减少或消除胚胎学家的物理干预或操作的工具或设备，可降低对精子、卵子或胚胎可能造成物理休克的事件发生的可能性。此外，减少优化体外环境变化的工具或设备也可以减少对卵子或胚胎的生化应激。
虽然在IVF治疗中使用的显微注射装置以及可视化装置方面取得了进展，但在开发用于处理必须操作的相关细胞，或减少过度处理或操作的方式容纳这些细胞的微装置方面，进展甚微。
通常，在大体积液体培养基中培养发育中的胚胎，这可以最大限度地减少细胞使用重要培养基成分时因其消耗而产生的物理影响，也可以最大限度地减少培养基中废物浓度增加而产生的任何物理影响。然而，即使微小的废物增加和微小的营养物质减少也会对发育中的细胞产生显著的影响。胚胎发育过程中代谢需求的变化加剧了生长过程中培养基成分变化的物理影响。
这些挑战类似于在体外培养类器官或复杂组织的过程中遇到的挑战。细胞在发育为更复杂的组织和组织结构的过程中，不断变化的代谢需求对体外组织培养系统提出了更复杂的要求。
在所含体积的培养基中包含发育变化的物理影响并不简单。对于胚胎培养，很难提供足够的稀释度以将培养基变化的影响降至最低，因为培养基的体积必须保持足够小，以便胚胎学家能够定位胚胎，并且更大体积的培养基增加了胚胎稀释由胚胎产生的帮助其自身生长的已知物质或变得难以定位的可能性，从而导致过度处理或操作。
胚胎学家为解决这一问题而采取的一种常见方法是制备一系列培养基，通过这些培养基，发育中的胚胎在体外发育的整个过程中循环。这种方法的好处是，每种培养基、受精培养基或冷冻保存培养基都可以专门适应细胞在特定发育或操作阶段的需要，然而，即使优化培养基成分以满足胚胎生长阶段的要求，细胞在从一种液体介质移动到另一种液体介质时所经历的应激仍然对发育产生不利影响。
为了克服这个问题，人们开发了各种微流控和液体或气体灌流装置，并取得了不同程度的成功。微流控“在芯片上培养”微装置已开发出来，利用微流控将细胞或细胞团从一个细胞培养“浴”移动或“滚动”到下一个细胞培养“浴”，以防止过度操作造成细胞休克。其他微流控装置在受精卵发育至胚胎阶段的整个过程中，适用于允许液体介质连续流入和流出更传统的细胞培养皿系统，以及适用于为冷冻保存和胚胎移植做准备。这些发展很少被采用，许多胚胎学家仍然倾向于使用培养皿的静态培养技术，或培养皿的变型设计，因为胚胎更容易在这些容器中定位和取回。
这两种方法都没有解决最佳气体交换和液体交换的需要。在所有组织中，尤其是在形态发生和干细胞分化中，通过气体扩散的方式充分通气对发育是重要的。
将微流控技术应用于胚胎静态培养的尝试最近才出现2。研究人员仍在探索和优化技术，以确保卵子和发育中的胚胎不会过度移动，从而避免损伤或应激，同时管理可以容纳在微流控装置非常小通道中的非常小体积的培养基。然而，迄今为止，微流控装置内的灌流组合尚未实现任何程度的临床应用。
理查德·费曼(Richard Feynman)著作中确立的工程原理已经很好地证明，工程系统从宏观规模到微观规模的缩小呈现了新应用的更广泛范围，然而，它带来了蒸发、润滑、加热和惯性(其在如此小的规模下的工作方式截然不同)等物理挑战。对于体外细胞培养，适应这种规模的工程设计尚未得到充分解决。本发明通过设计创新至少部分解决了这些问题。
金·埃里克·德雷克斯勒(Kim Eric Drexler)的著作也证明，纳米和微型装置的使用提供了宏观装置无法获得的机会。大规模细胞装置往往依赖于多个细胞之间的随机相互作用，希望其中一种或多种相互作用将在预定的可接受范围内产生预期结果。微型装置允许直接与单个细胞相互作用，以更准确和更有效地产生预期结果。随后的相互作用基于更接近理想的对象，以产生更准确的结果。
通过维持精子、卵子和胚胎在其培养装置内的物理稳定性，胚胎学家可以更容易和/或更准确地处理或操作精子、卵子或胚胎，并将物理性休克和/或生化应激的风险降至最低，或进一步防止受精、胚胎培养或胚胎移植期间混合亲本的风险。培养过程中细胞的稳定可能提高IVF程序的成功率。
这种方法不仅可以解决发育中胚胎成功受精和培养的困难，还可以适用于梯度过程中对培养环境变化敏感的其他细胞系的培养。
发明内容
在本发明的一个方面中，本发明的实施例涉及一种用于维持和培养其中细胞的细胞培养微装置，所述细胞培养微装置包括：细胞培养单元，其具有至少一个第一细胞载体单元，所述第一细胞载体单元限定于其中形成的细胞培养室，所述第一细胞载体单元由成形为支撑其上的细胞的至少一个室基座以及一个或多个室壁形成，所述一个或多个室壁具有围绕室边界包围所述细胞培养室的一个或多个室壁表面，所述第一细胞载体单元还提供导引表面，以引导仪器或流体定位于穿过室壁的孔进入细胞培养室，其中所述细胞培养微装置的尺度配置为基本上包围其中的单个细胞或细胞团。
如本文中所用，术语“细胞”应理解为可与术语“细胞物质”互换，并应指的是作为本文所述发明主题的细胞、细胞群、组织或类器官。
如本文所用，术语“细胞培养”应描述为在受控条件下分离和维持细胞物质的任何工具或过程，用于进行测试、生长、观察、实验、培养基的采集或其他生物科学过程。
如本文所用，术语“微装置”应描述为以微米级(例如在0.1μm至1000μm之间)生产的制造。微装置应包括静态和机械的装置以及微流控领域的装置。
如本文所用，术语“维持细胞”指的是将细胞物质储存在受控环境中以制造活力所需条件的任何过程。术语“培养细胞”指的是细胞培养的过程。
如本文所用，术语“冷冻保存”指的是可互换的玻璃化(vitrification)或冷冻(freezing)。
如本文所用，术语“边界”指的是细胞室单元内部和细胞腔单元外部之间的三维分界，并可由壁、表面、开口和孔定义。
在优选实施例中，导引表面将限定一个弯曲的底部沟槽(trench)，将仪器穿过所述沟槽并通过孔引入细胞培养室。或者，流体可以被引导并通过所述弯曲的底部沟槽以及通过所述细胞培养室内外之间的孔穿过。
在替代实施例中，导引表面将限定通过室壁的狭窄的孔，仪器将穿过所述孔通过并通过所述孔被引入细胞培养室。或者，流体可被引导并通过所述细胞培养室内外之间的狭窄的孔穿过。
在优选实施例中，细胞室基座基本上是凹面的。或者，细胞腔室基座可以形成基本上是凸起状、阶梯状、凹陷状或其他形状，这些形状可用于支撑细胞培养室内的细胞物质。
本发明各方面的细胞载体单元配置为以微尺度形成。因此，它也优选由来自适合对细胞无毒的微尺度生产的物质形成。
某些实施例的一个或多个室壁可包括一个或多个朝室近端点倾斜的内壁表面，以便使其配置为引导仪器或细胞在培养室内的放置。
在优选实施例中，本发明各方面的一个或多个室壁包括近端壁，所述近端壁具有弯曲的内壁表面，其配置为引导仪器在培养室内的放置。
在某些实施例中，近端壁可以是阶梯状、凹陷状或以其他方式配置为引导仪器在培养室内的放置。
在优选实施例中，本发明各方面的细胞培养室是从上方打开，并且室基座包括弯曲的内表面。
本发明各方面的边界优选基本上呈盒状，其成形为具有顶部开口和与导引孔相对的弯曲近端壁，所述导引孔能够在处理期间为细胞物质提供方向和稳定性。细胞培养室优选地包括位于弯曲近端壁表面和培养基座表面的流体交换孔。或者，细胞培养室的占用空间基本上是三角形或V形的，并且向近端点倾斜。
在替代实施例中，本发明各方面的边界基本上是圆柱形、球形、三角形、非对称或阶梯形的。
在优选实施例中，本发明各方面的一个或多个室壁包括近端壁以及远端壁，所述近端壁具有弯曲的内壁表面，并且所述内壁表面配置为引导仪器在培养室内的放置，所述远端壁限定远端室边界并具有穿过室壁的孔，所述孔穿过室壁形成，所述孔限定了与从细胞培养室向外突出的细长导引部分连通的开口，所述细胞培养室具有于其中形成的通道，所述通道提供导引表面以引导仪器或流体进入细胞培养室。
优选地，本发明各方面的一个或多个室壁包括与弯曲近端壁相对的中间远端壁。所述中间远端壁包括所述孔并提供所述导引表面，所述导引表面限定在所述细胞培养室外部并且垂直于所述中间远端壁形成的管道。
优选地，中间远端壁的内表面基本上是凹面的，以引导仪器或流体从腔室朝向导引表面。或者，中间远端壁的内表面可以是平面的。
在优选实施例中，本发明各方面的一个或多个室壁包括至少一个左侧壁和至少一个一个右侧壁，每个侧壁都具有穿过其形成的左侧孔和右侧孔。
在优选实施例中，本发明各方面的近端壁具有穿过其形成的近端孔，所述近端孔配置为与导引表面水平对齐，以缓解流体通过孔与近端孔之间的细胞培养室的流动。
在优选实施例中，本发明各方面的孔配置为用于通过其进行灌流。优选地，所述孔位于通过所述腔室基座的位置，并且其大小使得细胞无法通过其穿过。或者，所述孔位于穿过室壁的位置或由分布在边界的一个或多个表面上的多个孔组成。
在优选实施例中，本发明各方面的近端壁包括适于通过其进行流体灌流的灌流入口开口，以及配置为用于将灌流管接合到灌流入口开口的管配件(tubing fitting)。
或者，管配件可配置为用于与灌流歧管或其他供应灌流介质的方式的接合。
液体交换孔也可以位于其他表面上，可以整合到其他孔和开口中，或者在某些情况下可能不需要用于细胞物质的维持和培养。
在优选实施例中，本发明各方面的第一细胞载体单元包括细胞室壁，所述细胞室壁具有外壁耦合件，所述外壁耦合件适于与在至少第二细胞载体单元上相应的外壁耦合件接合，从而形成细胞载体阵列。优选地，细胞载体阵列可以包括无限数量的细胞载体单元，每个单元适于与另一个单元接合。优选地，细胞载体阵列可以是水平面中的线性阵列，但或者也可以堆叠在垂直面中或是两者的混合。优选地，细胞载体单元将在水平面中夹在一起并在垂直面中堆叠，或者可以在水平面或垂直面中可滑动地接合在一起。
在某些实施例中，本发明各方面的细胞培养微装置包括至少一个第二细胞载体单元，其与第一细胞载体单元整合形成，从而形成细胞载体盒。优选地，细胞载体盒可以包括无限数量的细胞载体单元，每个单元与另一个单元整合连接。优选地，细胞载体盒将在水平面上呈线性，但也可以在垂直面上产生盒或两者的混合物。在优选实施例中，细胞载体盒可堆叠或与另一细胞载体盒接合以限定细胞载体盒阵列。
在替代实施例中，细胞培养阵列和细胞培养盒可形成为圆形阵列或盒，或者以另一种可以调整阵列或盒的形式用于进一步处理。
在优选实施例中，本发明各方面的细胞培养微装置还包括第一细胞盖单元，所述第一细胞盖单元具有第一盖壁，当第一细胞盖单元和第一细胞载体单元连接以形成细胞培养单元基座时，所述第一盖壁配置为覆盖细胞培养室上方开口的至少一部分。
在优选实施例中，细胞盖单元成形为基本上在三个表面上(包括顶部表面)围绕细胞载体单元，并且当位于顶部表面上时，细胞盖单元完全覆盖顶部开口。
在替代实施例中，细胞盖单元成形为基本上覆盖细胞载体单元的至少一个表面。
优选地，细胞盖单元具有至少一个边缘，所述边缘配置为终止于能够与本发明各方面的细胞载体单元接合的部分。优选地，能够与细胞载体单元接合的部分适于与细胞载体单元的基座接合，从而形成细胞培养基座。在另一优选形式中，细胞盖单元配置为可滑动地与细胞载体单元的基座接合。
在优选实施例中，本发明各方面的第一细胞盖单元包括外壁耦合件，所述外壁耦合件适于与至少一个第二细胞盖单元上的相应外壁耦合件接合，从而形成细胞盖阵列。优选地，细胞盖阵列可包括无限数量的细胞盖单元，每个单元适于与另一单元接合。优选地，细胞盖阵列将是水平面上的线性阵列，但或者也可以堆叠在垂直面上或是两者的混合。优选地，细胞盖单元将在水平面中夹在一起并在垂直面中堆叠，或者可以在水平面或垂直面中可滑动地接合在一起。
在优选实施例中，本发明各方面的细胞培养微装置还包括至少一个第二细胞盖单元，其与第一细胞盖单元整合形成，从而形成细胞盖盒。优选地，细胞盖盒可以包括无限数量的细胞盖单元，每个盖单元与另一盖单元整合连接。优选地，细胞盖盒将在水平面上呈线性，但或者也可以在垂直面上产生盒或是两者的混合物。在优选实施例中，细胞盖盒可堆叠或与另一细胞盖盒接合以限定细胞盖盒阵列。
在优选实施例中，本发明各方面的第一细胞盖单元和第一细胞载体单元限定了细胞培养单元基座。在优选实施例中，细胞培养单元基座由终止于平坦底部表面的第一细胞盖单元和第一细胞载体单元限定，以提供稳定的支撑。或者，细胞培养基座可以由一种配置中的第一细胞载体单元或第一细胞盖单元中的一个和另一种配置中的另一个来限定。
在优选形式中，细胞培养基座适于与另一细胞培养盒、细胞载体单元或细胞盖单元连接。当放置在表面上或当与另一组件或装置连接时，基座优选地配置为物理上稳定细胞载体单元。
在优选实施例中，本发明各方面的第一细胞盖单元配置为可滑动地与第一细胞载体单元接合。在优选实施例中，第一细胞盖单元成形为与垂直于近端-远端轴的第一细胞载体单元的两侧中的每一侧可滑动地接合。
在某些实施例中，第一细胞盖单元包括介质入口，其配置为与第一细胞载体单元上的管配件接合，并允许灌流管连接到其上的管配件上。或者，介质入口可配置为与灌流歧管或供应灌流介质的其他方式接合。
在优选实施例中，第一细胞盖单元还包括穿过其形成的接入孔，穿过第一细胞盖单元形成的接入孔配置为允许在第一位置从上方进入开口，并在第二位置从上方覆盖开口的至少一部分，并且适于从第一位置到第二位置可滑动地接合第一细胞载体单元。
在优选实施例中，接入孔的尺寸和形状与顶部开口相同，使得可以通过所述接入孔完全进入顶部开口。在替代实施例中，接入孔可以大于顶部孔，并且为倾斜形状，当配置为进入时，以引导仪器或细胞进入细胞培养室。
在某些实施例中，本发明各方面的室基座的外表面包括凹槽(notch)，其配置为容纳从细胞载体单元或细胞盖单元向外突出的凸耳(lug)。
本发明各方面的细胞培养微装置的使用方法，包括以下步骤：将一个细胞轻松放置在细胞培养微装置的细胞培养室内，并在其中培养细胞。
本发明各方面的细胞培养微装置的使用方法，包括以下步骤：获取用于构建细胞培养微装置的指令，并在增材制造过程中执行该指令。
在本发明各方面的优选形式中，细胞培养单元包括至少四个壁和限定于其中的细胞培养室的基座。所述至少四个壁优选地包括近端壁，所述近端壁具有限定细胞培养室的弯曲内表面，其中所述弯曲提供用于定向细胞处理装置、左侧壁、右侧壁和中间远端壁的参照点。在优选实施例中，中间远端壁包括穿过其形成的开口、限定细胞培养室的内表面和具有基本垂直于其形成的通道的外表面。所述通道优选地由左侧壁的内表面和右侧壁的内表面形成，其向远端延伸超过中间远端壁，并且基本上垂直于远端外壁终止，所述远端外壁具有在穿过其形成的开口。
在中间远端壁中、由通道和在外部远端壁中形成的开口优选地对齐，以提供从细胞培养载体远端到细胞培养室的视线。这种对齐优选地为胚胎学家或其他用户提供指导，以将仪器(例如微量移液管)小心地引入细胞培养室中，从而在对细胞几乎没有干扰或破坏的情况下进入细胞。
例如，试图从细胞培养室中取出胚胎进行植入的胚胎学家可以通过远端外壁开口引入微量移液管，他们可以在通道上移动和/或抱着(cradle)微量移液管的尖端，直到微量移液管到达近端壁的弯曲内表面。近端壁的弯曲引导微量移液管至细胞培养室的中心，此时胚胎学家可以轻轻地将胚胎细胞和培养基吸入或注射到微量移液管正下方。细胞培养载体的构造为仪器(例如微量移液管)提供物理支持，并为仪器的放置或定位提供指导，减少了操作人员可能伤害细胞或阻碍其最佳生长的错误的影响。因此，细胞培养载体的构造优化了培养技术，进而优化了细胞活力，并减少了用户错误的影响。
优选地，左侧和/或右侧壁包括穿过其形成的溢流开口。优选地，近端壁包括由位于近端壁外表面上的入口配件限定的入口开口。入口配件可作为管道或其他仪器的连接器。它可以连接用于将流体转移到细胞培养单元中以进行灌流培养的管道。入口配件还可以连接管等装置，这些装置仅用作细胞培养单元位置的参考点或维持细胞培养单元就位的固定器。
在另一优选形式中，入口开口、中间远端壁、通道和外部远端壁优选地对齐，以提供从远端壁通过细胞培养载体和通过入口开口的视线。优选地，通过细胞培养载体的视线对齐适于使细胞能够在通过细胞培养单元灌流培养基期间进行培养。优选地，细胞培养室的基座至少部分低于通过细胞培养载体的所述视线。这种配置最大限度地减少了由流体灌流引起的湍流或涌流(current)对培养细胞的物理破坏。
灌流技术可以优化某些细胞类型的生长条件，尤其是对培养基中的生化变化敏感的细胞，这些变化可能是由于培养基中营养物质的消耗或废物的增加而引起的，或那些当细胞在不同生长阶段培养时可能具有不同生化要求的细胞。用于IVF程序的胚胎培养可能受益于灌流培养，也可能受益于复杂结构(如瓣膜结构或类器官、皮肤、肝脏、肾脏、肺或其他组织移植物)的培养，或复杂细胞系(如骨髓或干细胞)的培养，或对易受组织排斥的患者的任何细胞系的培养。
现将参考附图以及详细说明书中公开的示例和优选实施例来描述本发明的广泛实施例。本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应被解释为仅限于本文描述的实施例。这些实施例仅以说明的方式提供，以使得本公开是彻底的、完整的，并将传达本发明的全部范围和广度。
附图说明
图1示出了根据本发明实施例的组装的细胞培养阵列或盒的顶部透视图。
图2示出了根据本发明实施例的组装细胞培养阵列或盒的前视图。
图3示出了根据本发明实施例的组装细胞培养阵列或盒的后视图。
图4示出了根据本发明实施例的组装细胞培养阵列或盒的底部透视图。
图5示出了根据本发明实施例的组装细胞培养阵列或盒的底视图。
图6示出了根据本发明实施例的未组装细胞培养阵列或盒的顶部透视图。
图7示出了根据本发明实施例的未组装细胞培养阵列或盒的后视图。
图8示出了根据本发明实施例的未组装细胞培养阵列或盒的底部透视图。
图9a和9b示出了根据本发明实施例的细胞培养单元载体的细胞摇篮部分。图9a示出了顶部透视图，图9b示出了底部透视图。图9c、9d和9e示出了未组装的细胞单元盖和未组装的细胞培养阵列。图9c示出了可扩展的细胞单元盖的后部透视图，图9d示出了可扩展的细胞培养阵列的后部透视图，图9e示出了可扩展的细胞培养阵列的底后部透视图。
图10a、10b和10c示出了根据本发明实施例的细胞培养单元载体。图10a示出了前顶部透视图，图10b示出了后顶部透视图。图10c示出根据替代实施例的细胞培养单元载体的前顶部透视图。图10d、10e和10f提供了细胞培养单元载体在用于与细胞培养阵列接合的三个位置的前顶部透视图。图10g和10h示出了细胞培养单元载体在用于将细胞引入细胞培养单元载体的两个接合位置的顶部透视图。
图11a、11b和11c示出了根据本发明实施例的具有位于其中的单元载体的细胞培养阵列或盒。图11a示出了后视图，图11b示出了前角视图，图11c示出了底部透视图。
图12示出了根据本发明实施例的细胞培养阵列或盒的侧视图。
图13a、13b和13c示出了在根据本发明实施例的细胞培养阵列或盒内的细胞接收微量注射移液管的侧视图。
图14示出了用于根据本发明实施例的细胞培养微装置的原子力显微镜(AFM)安装组件。
图15a、15b和15c提供了3D打印机聚合物毒性研究的结果。图15a示出了在存在根据本发明的微装置及其培养基时的胚胎发育的百分比，图15b示出了在存在根据本发明的微装置时的胚胎发育的百分比，图15c示出了DNA修复的百分比。
图16提供了示意图，图示出通过使用根据实施例的细胞培养单元的组织血管化。
图17a至17e提供了细胞培养优化研究的结果。图17a至17c示出了根据培养基类型和干预，从发育到第5天的每一天，在静态培养条件下的胚胎发育情况，图17e示出了相同组内的DNA修复百分比，图17f示出了相同处理组的内细胞团。
图18a至18d提供了氧气优化研究的结果。图18a至18d示出了暴露于不同氧浓度下的胚胎发育随时间的变化，图18e示出了相同组内DNA修复的百分比。
以下示例描述了本发明的几个实施例。
具体实施方式
以下实施例中所述的细胞培养微装置通常由以下构成：具有单元载体和单元盖的单个细胞培养单元、接合以形成具有阵列载体和阵列盖的细胞培养阵列的重复单元阵列、或整合以形成具有盒载体和盒盖的细胞培养盒的重复单元盒。当它们能够采取以下任何形式时，即作为单个单元、任何形状或数量的重复单元阵列、或任何形状或数量的重复单元盒时，通常在下文中称为“载体”和“盖”。
本领域技术人员将理解以统一形式、能够在阵列中接合的形式、以及整体包含多个“载体”或“盖”的形式制造“载体”和“盖”实施例的好处。虽然在下面的每个实施例中可能指的是这些形式中的一种，但应理解，在某些情况下可以替换成其他形式。
示例1-细胞培养阵列
图1示出了组装的细胞培养阵列100，其具有放置在阵列载体120上的阵列盖110。图1描绘了具有并排排列的五个重复细胞培养单元130a、130b、130c、130d和130e的线性细胞培养阵列。线性阵列盖110配置为使得每个单元盖与下一个单元盖相邻，从而在阵列盖110的顶部外部形成一个平面，其中每个单元盖之间有一个轻微的凹槽。所述盖由四个壁形成，包括终止于平面左端壁150(未示出)和平面右端壁160的矩形平面顶壁140，所述平面右端壁160以90度形成并从顶壁140向下延伸。通过横跨顶壁长度的顶壁140形成一系列环形开口170；通过每个单元盖的顶壁形成一个开口。左端壁150(未显示)和右端壁160终止于其底部边缘，所述底部边缘具有左基座法兰180(未显示)和右基座法兰190。
左基座法兰和右基座法兰可以配置为与其他部件啮合，例如机器人设备、培养皿、附加的细胞培养单元或其他实验室设备；或者，如图1所示，它们可以配置为简单地提供放置在其上时具有稳定性的细胞培养阵列100。
除了顶壁、左端壁和右端壁之外，阵列盖110还包括前壁。图2示出了阵列盖120的前壁200。阵列盖120的矩形平面前壁200以约90度从顶壁140向下延伸，并在左端壁150的前缘和右端壁160的前缘之间延伸。前壁200的底部边缘与左端壁150的底部边缘和右端壁160的底部边缘齐平。前壁200内的垂直凹槽210限定了下一个单元盖，并延伸通过阵列盖，在顶壁内形成连续凹槽。通过横跨顶壁宽度的前壁200形成一系列环形开口220a、220b、220c、220d和220e，因为通过每个单元盖的前壁形成一个开口。每个环形开口由从前壁表面突出的环形连接器230限定。环形连接器配置为与任何数量的不同装置连接，但最常见的是能够与硅管形成流体密封的简单硅管连接器。
图3示出了阵列盖100的开口背面，所述阵列盖具有位于其中的阵列载体250。阵列盖内每个单元盖之间的垂直凹槽210延伸通过内壁260之间的阵列盖，所述内壁260完成在阵列盖内每个单元盖的形成。如图3所示，形成每个单元盖的内壁260成形为或形成用于填充相邻单元载体之间的空间，以最小化单元载体和单元盖之间的间隙，从而使得单元盖的形状能够引导单元载体的滑动放置，并且也能够最小化每个单元盖的外壁表面之间的间隙。当在阵列中形成时，该配置的重复性质确保阵列载体的每个单元载体能够容易地滑动到相对于阵列盖的所需位置并牢固地定位在其中。
滑动机构270设置在每个单元盖壁的底部边缘，以将一个单元盖与下一个单元盖可逆且牢固地连接，形成阵列盖。滑动机构允许单个细胞培养单元以阵列的形式组装，但也易于彼此分离，因此一种细胞培养可以不同于另一种细胞培养进行处理，对培养中的细胞的(来自不必要的处理的)破坏或干扰最小。
通过图4中的透视图，以及图5中的直观视图，图4和图5示出了细胞培养阵列的基座。这些图说明了阵列载体底部表面的配置，示出了单个单元盖的内壁和基座法兰(左基座法兰180和右基座法兰190)的形状。滑动机构270仅延伸通过单个单元盖的内壁的一部分。
图6、图7和图8分别示出了分离并排的阵列盖和阵列载体，并提供了顶部透视图、后视图和底部透视图。参考图6，阵列载体120由具有并排排列的五个重复单元载体280a、280b、280c、280d和280e的线性细胞培养阵列载体构成。每个单元载体包括从单元载体的外前表面突出的介质入口290、在单元载体内形成的细胞摇篮300以及在细胞摇篮和单元载体280外部之间形成的导引通道310。介质入口290允许液体介质(或其他流体)的灌流进入或通过载体内的细胞环境。流体也可以通过导引通道310从载体内的细胞环境通过通道出口320流向单元载体的外部。图7示出了通道出口320的基座、导引通道310的底部表面和由介质入口290形成的孔的对齐。图7示出了通过这些开口形成的清晰视线，因此在通过介质入口290的细胞灌流期间引起的任何湍流都不太可能影响在细胞摇篮300中的细胞生长。
图6和图7示出了阵列盖110的环形连接器230相对于阵列载体120的介质入口290的相对尺寸。介质入口290的外表面配置为略微小于环形连接器230的内表面。因此，当阵列盖在阵列载体上滑动时，介质入口290的外表面能够非常紧密地匹配环形连接器230的内表面。因此，流体可以通过环形连接器和介质入口穿过，而不会通过这些接触点时泄漏流体。
图6和图8示出了通过阵列盖110的环形开口170相对于阵列载体120的位置。转到图8，进一步示出了滑动机构270由位于阵列盖110的各个单元盖之间的滑道330组成，其朝向阵列盖110的后部终止于阵列盖的各个单元盖之间的间隙340之前。阵列盖110的滑道330和间隙340与单元载体120上的滑块350啮合。当以重叠方式放置时，滑块350在滑道330上滑动，并由允许滑块350在各个单元盖之间滑动的空间引导。当滑块350到达间隙340时，滑动停止，并可停留在其中的闭合位置。在打开位置，滑块350与滑道330接触。在此位置，环形开口170位于细胞摇篮300上方，并与细胞摇篮300正确对齐，用于从上方将卵子或其他细胞最佳放置在摇篮中心。在闭合位置，滑块350移动并停止在间隙340内，由此环形开口170完全位于导引通道310上方，并且从上方覆盖细胞摇篮300。摇篮出口360也在图8的阵列载体120中示出。然而，该特征是可选的，如果它被提供，则允许其他通道到达细胞摇篮，使得能够移除或移植胚胎或其周围介质。
附图示出了线性阵列配置，然而，正如本领域技术人员显而易见的那样，阵列配置可以扩展到超过五个单元，并且还可以容易地适应于非线性阵列配置。例如，线性阵列配置可以容易地适应于圆形阵列，圆形阵列可以更容易地修正为能够用于自动化或机器人处理技术。例如，圆形阵列可以安装在转盘上，然后依次安装在显微镜或其他可视化装置中。操作员、手持装置或机器人装置可以更容易地接近转盘布置，用于移液、用于真空歧管的引入、用于泵系统的引入或低温保存过程的实施。
示例2-细胞培养单元
图9a和9b提供并示出了与导引通道310(如图6所示)分离的单个细胞单元载体的细胞摇篮300的配置；图10a和10b示出了完整的单个细胞培养单元400的内部配置。细胞单元载体400由五个壁形成，包括矩形平面左侧壁410和矩形平面右侧壁420，每个壁朝向单元的后部终止于以90度角连接的平面后出口壁430，并且朝向单元的前部终止于以90度角连接的平面前入口壁440。图9a和9b中所示的细胞摇篮在其最宽处测量值约为0.23mm，且在其最高处约为0.23mm。
来自入口壁420外前表面的环形突出物形成介质入口290，所述介质入口290具有约等于(但略小于)环形连接器230(图6)的内表面直径的直径。前入口壁440的内表面水平弯曲，以使能够将移液管通过通道出口320和导引通道310引入细胞摇篮区域，来将细胞摇篮区域的中心点定位在水平轴上。左侧壁410、右侧壁420和后出口壁430的内表面通常是平坦的。左侧壁410和右侧壁420各自包括溢流孔450，以允许介质从细胞摇篮300溢出，尤其是当用于进行细胞灌流时。如图9b所示，溢流孔450的最低点与导引通道310的最低点处于相同的高度，这确保多余的液体优先从细胞培养单元的侧面而不是通过导引通道310移出细胞摇篮区域。
示例3-细胞盖
图9c示出了细胞盖单元600，其配置为与其他细胞盖单元进行线性阵列组装，并用于容纳单一的细胞摇篮。该图示出了“拼图块”夹和锁系统610a和610b，该系统允许每个细胞盖单元在无限可扩展的线性阵列中相互啮合。图9c还示出了一种细胞盖单元的实施例，该细胞盖单元不具有用于进入细胞培养室的孔，而是依赖于细胞载体单元内的可滑动接合，以从上方覆盖或露出开口的至少一部分。细胞盖单元的此实施例示出了用于与细胞摇篮的入口通道470对齐的凹槽620。
图9d和图9e示出了完整地排列在线性细胞盖盒700中的细胞盖单元，所述细胞盖盒700具有进一步形成三维阵列的能力。在细胞盖盒的左侧和右侧，与后续单元保持方向的“拼图块”夹和锁系统710a和710b允许在这些方向上形成阵列。在该系统720a和720b的变化也示出在细胞盖盒的前部和后部，所述细胞盖盒类似地与后续单元保持方向，并允许在这些方向上形成阵列。细胞盖盒上方是一个凸耳730a，该凸耳配置为容纳到细胞盖盒下方的反向形状的凹槽730b中，以在该方向上堆叠。
图10a和图10b(以及图9a和9b)示出了从导引通道310(图10a和10b)分离细胞摇篮300的内壁460的位置。内壁460相对于前入口壁440、左侧壁410、右侧壁420和后出口壁430保持一致的高度，以便阵列盖120(或单元盖)在单元载体的顶部保持平齐，否则其是从上方打开。内壁460具有穿过其形成的纵向入口通道470。如图10a和10b所示，入口通道470的最低点与导引通道310的基座处于同一水平面。入口通道470朝向单元载体的后部敞开通向导引通道310，并朝向单元载体的前部敞开通向细胞摇篮300的内表面。细胞摇篮的内表面限定了用于在其中培养和/或生长细胞的细胞培养室510。
细胞培养室510的尺寸和形状由胚胎发育后的最大尺寸决定，以确保其中所含胚胎的物理稳定性。细胞摇篮300的尺寸约为0.23mm×0.23mm。限定细胞摇篮的表面形状通常为圆形，以符合细胞团的一般形状。特别地，每一个壁向下逐渐变小，以使细胞摇篮300具有更圆的内部形状。
细胞培养室510的位置远离灌流流体的流动。由介质入口、后出口壁、导引通道、纵向出口通道和溢流孔限定的孔通常是水平对齐，从而限定流体路径。细胞培养室的位置低于流体路径，从而确保细胞摇篮中的细胞保持浸没在液体介质中，并且不会受到流体路径上涌流的物理搅拌或其他破坏。细胞培养室的壁终止于细胞摇篮基座520，所述基座通常在水平面上形成的，位于相对于由介质入口、后出口壁、导引通道、纵向出口通道或溢流孔限定的孔较低的位置。细胞摇篮基座520还具有细胞摇篮出口530，所述细胞摇篮出口在使用时关闭，但可以被释放以排出细胞摇篮300内的流体。
图10c示出了细胞载体单元800特征的替代实施例，其包括狭窄的导引通道810、圆形的通道入口820和三角形占用空间的细胞培养室840。狭窄的导引通道810和圆形通道入口820协力工作，以允许引导仪器并将其插入细胞培养室840，而无需通过狭窄的导引通道移动或退出，但仍允许在仪器通过狭窄的导引通道时观察仪器。细胞培养室840的三角形占用空间展示了其他形状，其可能适合细胞培养室在无需弯曲的近端壁时采用。
示例4-细胞盖和细胞载体
图10d、图10e、图10f、图10g和图10h说明了根据实施例的细胞盖盒900如何与根据实施例的细胞载体单元950啮合。图10d示出了未装配的细胞盖盒900和细胞载体单元950的后部透视图，允许将细胞载体单元插入中心盖单元。图10d进一步示出了从上方打开的细胞培养室960，以及配置为允许通过其进入的环形开口920。该实施例的细胞培养室960的特征是每侧具有溢流孔965，允许从细胞培养室通过类似定位的盖溢流孔925发生潜在溢流。
图10e和图10g示出了在第一位置部分接合的细胞盖盒900和细胞载体单元950，其中可通过环形开口920从上方进入细胞培养室960，用于细胞沉积、处理和回收，以及可从上方和通过通道入口970进入导引通道980。
图10f和图10g示出了在第二位置完全接合的细胞盖盒900和细胞载体单元950，其中细胞培养室960被细胞盖盒900覆盖，介质入口990通过细胞盖盒的前部暴露。在此位置，溢流孔965与盖溢流孔925相邻，允许溢流从中通过。保持视线通过通道入口并进入细胞培养室960以及通过介质入口990。
转向如图10a和10b所示的载体单元400的外部形状，左侧壁410和右侧壁420以约100度向外连接到基座壁480，而后出口壁430和前入口壁440以90度连接到基座壁480。图9a、图9b、图10a和图10b示出了左侧滑动法兰490和右侧滑动法兰500从基座壁480突出。左侧法兰490和右侧法兰500成形为或以其他方式配置为将单元载体的基座固定在另一物体内或之上，或配置为在另一物体上或穿过另一物体滑动。图11a、11b和11c示出了单元载体400在阵列盖110内的放置。图11a提供了单元载体400的后视图，示出了通道出口320的定位。图11b提供了单元载体400的前视图，示出了介质入口290在阵列盖110的环形连接器230内的定位。图11c提供了单元载体400的底部透视图，单元载体400具有左侧法兰490和右侧法兰500，分别位于滑道330上的滑动啮合中。
在某些实施例中，如图8所示的滑块350可以被削减，以使阵列载体120的单个单元载体能够被打开或断开(使用或不使用专用的工具)成单个的单元载体中。当阵列载体120配置为以这种方式分解为单个单元载体时，阵列配置为在断裂时提供左侧和右侧法兰。
将单个细胞培养载体或单元载体从阵列中分离出来的能力可能为冷冻保存的细胞处理提供优势。例如，单个单元可在载体中制备以进行冷冻保存，并在将单元从阵列中分离后作为小份存储，而无需对细胞进行任何进一步的物理操作。
上述细胞培养阵列的小批量生产可使用生物相容性聚合物材料的3D打印技术进行。某些聚合物已被证明是可印刷的生物相容性材料，并且也被证明在制备用于冷冻保存时是耐破碎的，例如，纳米聚合物或透明级聚苯乙烯(crystal polystyrene)。
示例5-细胞培养阵列的使用
本文所述的实施例可用于任何种类的细胞培养，但能够在哺乳动物细胞系的培养中发现特殊用途。本文所述的实施例对于涉及胚胎形成的细胞培养特别有用，并且反过来也可用于随后的IVF程序中。
实施例还可用于一般细胞培养、静态灌流或培养中细胞的主动灌流。
如图12所示，单个细胞培养单元能够在阵列配置之外单独使用。单个硅管可通过环形连接器附接至单元，所述环形连接器可在需要时用于安置或定位单元。该管可用于将单元固定在适当位置，以便在显微镜下观察细胞，或使用微量移液管操作细胞等。该管可用于固定单元在液体介质中的位置，所述液体介质可以是静态的或流动的(例如，在较大容器中的介质中，单元被保留并不断被灌注或补充)。该管还可连接至泵或真空歧管，以迫使流体通过细胞培养单元并灌注保留在其中的细胞培养液。
如图13所示，细胞培养阵列在阵列内有五个细胞培养单元，内径为100μm的硅管附接到五个细胞培养单元中的三个。通过将细胞培养基通过三个单元中的每个单元进行通过每个单元载体的介质灌流，而其他两个单元则不进行灌流。
图14提供了用于在原子力显微镜(AFM)安装组件内保持细胞培养阵列的组件。在自动化或其他设备内安装细胞培养阵列时，可采用该组件的变体，例如，为激光、压电注射、微型泵、视觉“训练”机器人或其他设备的用户调整安装组件，以减少或消除胚胎学家在细胞培养期间的人工干预。
图14所示的组件保留了一个培养皿基座，所述培养皿基座具有直径为35mm、厚度为1mm的玻璃盘，用于在其中安装细胞培养阵列或细胞培养单元，如图12和13所示。培养皿可专门适用于维持其上的图12和13所示的硅管，或者也可简单地将其夹紧到位。用特殊支架安装培养皿，所述特殊支架可容纳12mm或25mm圆形盖玻片，用于高NA倒置光学显微镜。该组件允许维持在阵列或单元内的细胞在培养皿中培养和成像。
图14所示的封闭组件为封闭的流体细胞夹上的培养皿提供了配件。将夹密封在膜螺纹夹上，并固定在封闭的流体细胞培养皿上。进入培养皿的入口/出口通过端口塞提供，入口/出口管提供为穿过封闭的流体细胞培养皿。通过在封闭的流体细胞培养皿和玻璃盘之间安装O形圈，将组件密封在与AFM相连的螺纹底部夹上。本领域技术人员众所周知，需要更换或使用额外的O形圈，或使用装配工具、镊子和清洁刷来实现成功安装。
细胞培养阵列设计为除培养皿、显微镜载玻片或其他培养板外的用途。它并不替代这些装置，而是与这些现有的培养装置一起使用，以定位在这些装置内的细胞或细胞聚集体，在不干扰细胞的情况下处理细胞或细胞聚集体，更容易操作细胞或存储细胞。上述组件本质上是示例性的，并且可以容易地适于本领域技术人员的特定用途。例如，某些用户可能更愿意将微装置放置在载玻片上，该载玻片可以很容易地放置在上述组件中，以代替培养皿。
图14组件在灌流组件中实现，用于封闭和密封的阵列灌流。接入端口用于通过注射器注射、重力进料和微型泵系统进行阵列灌流的液体和气体交换。除了使用或不使用卵胞浆内单精子注射(ICSI)进行受精外，AFM安装可用于延时显微镜成像、胚胎培养(有灌流和无灌流)和玻璃化冷冻。聚合物、所用材料和特性(装置采用Nanoscribe GTProfessional机器(Nanoscribe GmbH，德国)进行微加工)。
实施例6–体外研究设计
所有实验均经阿德莱德大学动物伦理委员会(The University of AdelaideAnimal Ethics Committee)(M-2019-008)批准，并按照澳大利亚科学动物护理和使用实践守则(The Australian Code of Practice for The Care and Use of Animals forScientific Purposes)进行。9-11克的青春期前CBAxC57Bl/6F1杂种和瑞士白化雌性小鼠(3-4周龄)，在温度可控、日光周期为12小时(光照12小时：黑暗12小时)、自由饮水和进食下饲养在实验动物服务中心(Laboratory Animal Services)(澳大利亚阿德莱德大学(University of Adelaide,Australia))内。
青春期前雌性小鼠腹腔内给予5IU马绒毛膜促性腺激素(eCG；Folligon，Intervet，Boxmeer，荷兰)引发超数排卵，47小时后，小鼠腹腔内给予人绒毛膜促性腺激素(hCG；Humagon，Orgenon)。
然后将小鼠与来自同一品系的雄性(1雄：1雌)交配，并在第二天早上检查交配塞(copulation plug)。hCG后22小时，通过颈椎脱臼处死小鼠，从壶腹收集假定的受精卵(presumptive zygote)，随机分配给每个处理组。
研究中使用的培养基来源于ART Lab Solutions(澳大利亚阿德莱德)，包括胚胎冲洗和卵裂培养基。
微加工设计是在CAD中开发的，并使用Nanoscribe GT Professional(NanoscribeGmbH，德国)制造，其使用制造商推荐的聚合物、材料和设置进行微加工。
所有统计分析均使用GraphPad Prism 8.0(GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥)进行。进行统计分析，以比较标准胚胎培养中的胚胎发育和在存在其他变量(如下所述)的情况下在对接在库(Garage)内的舱(Pod)(Pods docked inside Garages)内的标准培养中的胚胎发育。为了确定是否应使用参数或非参数检验，首先进行正态性检验。使用非配对t检验(用于正态分布数据)或Kruskal-Wallis检验(用于非正态分布数据)评估组间平均值差异的统计显著性。P值<0.05被认为是显著差异，10％的差异被认为是生物学显著差异。
示例7-安全性初步分析
进行初步实验以研究Nanoscribe提供的3D可打印聚合物的毒性，并用于构建细胞培养阵列和单元，并确定其对胚胎发育的潜在影响。
下表提供了从处理后第1天(受精卵)和第2天(二个细胞)胚胎到第5天(囊胚)胚胎发育的第一次重复分析结果。
Figure BDA0003777940130000191
-体内：hCG和交配后94小时收集囊胚
-处理1：收集假定受精卵并根据标准胚胎培养方案使用新鲜卵裂培养基培养
-处理2：收集假定受精卵并在用于清洗小工具(gadget)的卵裂培养基中培养
-处理3：收集假定受精卵并在新鲜卵裂培养基+小工具中培养
-处理4：收集假定的受精卵并在用于清洗小工具的卵裂培养基+小工具中培养
下表提供了胚胎发育分析的第二次重复结果
Figure BDA0003777940130000192
-体内：hCG和交配后94小时收集囊胚
-处理1：收集假定受精卵并根据标准胚胎培养方案使用新鲜卵裂培养基培养
-处理2：收集假定受精卵并在用于清洗小工具的卵裂培养基中培养
-处理3：收集假定受精卵并在新鲜卵裂培养基+小工具中培养
-处理4：收集假定的受精卵并在用于清洗小工具的卵裂培养基+小工具中培养
下表提供了胚胎发育分析的第三次重复结果
Figure BDA0003777940130000201
-体内：hCG和交配后94小时收集囊胚
-处理1：收集假定受精卵并根据标准胚胎培养方案使用新鲜卵裂培养基培养
-处理2：收集假定受精卵并在用于清洗小工具的卵裂培养基中培养
-处理3：收集假定受精卵并在新鲜卵裂培养基+小工具中培养
-处理4：收集假定的受精卵并在用于清洗小工具的卵裂培养基+小工具中培养
进行进一步的研究将四个载体单元插入两个阵列载体中。在20μL卵裂培养液滴中进行胚胎培养。将来自高度刺激和交配的雌性4周龄F1 CBAxC57Bl6小鼠中的小鼠胚胎从受精卵培养24小时至2-细胞期。在4天内受精卵培养到囊胚的4个重复(每组有40个重复)的结果显示，在载体单元中培养的细胞与在培养皿中培养的细胞之间的活力无统计学显著差异。
3D打印机聚合物毒性研究的结果如图15a所示，该图示出了来自卵裂胚的CBAF1小鼠胚胎发育率的百分比。简言之，10个胚胎在20μL的卵裂培养液滴中培养。对于处理组，胚胎在使用3D打印技术生产的装置中培养，该装置包括2个阵列盖和10个单元载体，配置为2×5的单元阵列。将10个胚胎放置在20μL的卵裂培养液滴中。用石蜡油(paraffin oil)覆盖培养液滴。
将分配到组1的胚胎在干净的卵裂培养基中进行培养(对照)。将组2的胚胎在暴露于10个舱和2个库之前在卵裂培养基中进行培养。将组3的胚胎在新的卵裂培养基中进行培养，并与含10个舱和2个库的每份培养液滴共同孵育。将组4的胚胎在干净的卵裂培养基中进行培养，并与含10个舱和2个库的每份液滴共同孵育。
图15b示出了从卵裂胚胎发育成CBAF1小鼠胚胎的百分比。在10μL卵裂培养液滴中进行胚胎培养。分配到对照处理组的胚胎在标准培养条件下进行培养，分配到研究处理组的胚胎在对接在库内的舱内的标准培养条件下进行培养。研究处理培养组有5个舱s和1个库的每份液滴(平均值±SEM)。
对照和研究处理组的囊胚γH2A.X DNA修复染色后，CBAF1小鼠胚胎发育的DNA修复百分比如图15c所示。分配到对照处理组的胚胎在标准培养条件下进行培养，分配到研究处理组的胚胎在对接在库的舱内的标准培养条件下进行培养(平均值±SD)。
在所有研究中，处理组中均未观察到显著差异。制造过程中使用的材料的毒性没有显示出来，这表明微装置可能是安全的。
示例8–细胞培养单元内胚胎培养条件的优化
图16提供了图示通过使用根据实施例的细胞培养单元可实现的组织血管形成(vascularisation)的示意图。预计在最佳条件下，类器官(organoid)将在细胞培养室内成功发育。涂有Matrigel涂层的室为促进贴壁细胞的增殖提供了支架环境。通过细胞培养室和外部环境之间的其他孔，提供了细胞团的定向线性生长。通过单元载体和单元盖来选择孔的位置和尺寸，以促进血管形成，支持在原位生长。这些取决于细胞类型和类器官类型，并且可以由本领域技术人员确定。
对用于胚胎发育的细胞培养条件进行了优化。使用可适用于其他条件优化的方法确定最佳培养基和空气混合物。预计优化的细胞培养条件可转移至其他细胞类型的增殖。采集假定的受精卵并随机分配到五个处理组。每天观察和记录胚胎发育情况。
将胚胎分成五组，每组接受不同的培养基处理。对于分配到组1的胚胎，将按时发育的胚胎移到相同培养皿中的新卵裂培养液滴中。将组2的胚胎置于卵裂培养基中，然后在第3天移到含有新卵裂培养基液滴的新培养皿中。将组3的胚胎置于G1+培养基中，并将有活力的胚胎移到相同培养皿中的新G1+培养基液滴中。将组4的胚胎置于G1+培养基中，然后在第3天转移到新的G1+培养基滴液中。将组5的胚胎置于G1+培养基中培养，然后移到含有G2+培养基液滴的新培养皿中。胚胎培养在6％CO2、5％O2和37℃的加湿烘箱式常规培养箱中进行。
图17示出了在培养皿中有油覆盖的标准10μL培养液中培养的胚胎的胚胎发育结果百分比。从第1天到第5天，组1的胚胎在ART Lab Solutions胚胎卵裂培养基中培养。从第1天到第3天，组2的胚胎在ART Lab Solutions胚胎卵裂培养基中培养，然后将胚胎移到新的ART Lab Solutions胚胎卵裂培养基中并培养至第5天。从1天到第5天，组3的胚胎在Vitrolife G1+培养基中培养。从第1天到第3天，组4的胚胎在Vitrolife G1+培养基中培养，然后将胚胎移到新的Vitrolife G1+培养基中并培养至第5天。从第1天到第3天，组5的胚胎在Vitrolife G1+培养基中培养，然后移到新的Vitrolife G2+培养基中，并培养至第5天。
每天记录胚胎发育情况；每个处理组的胚胎发育百分比如图17所示。图17a示出了从第1天到第2天的胚胎发育百分比，图17b示出了从第1天到第4天的胚胎发育百分比，图17c示出了从第1天到第5天的胚胎发育百分比(平均值±SD)。到第5天，在Vitrolife G1+培养基中培养随后在第3天开始在Vitrolife G2+培养基中培养的胚胎，其发育显示出显著的改善。
图17d提供了进一步研究的结果，其中细胞在细胞单元载体内培养并被细胞单元盖覆盖。从1天到第5天，组1的胚胎在Vitrolife G1+培养基中培养。从第1天到第3天，组2的胚胎在Vitrolife G1+培养基中培养，然后将胚胎移到新的Vitrolife G1+培养基中并培养至第5天。从第1天到第3天，组3的胚胎在Vitrolife G1+培养基中培养，然后移到新的Vitrolife G2+培养基中并培养至第5天。图17d示出了当细胞在根据本发明的装置中培养时，每个处理组从第1天到第5天的胚胎发育百分比。
图17e显示了γH2a.x染色的百分比强度，其示出了在培养皿中有油覆盖的标准10μL培养液滴中培养的胚胎的DNA修复(对照为体内囊胚)。从第1天到第5天，组1的胚胎在ARTLab Solutions胚胎卵裂培养基中培养。从第1天到第3天，组2的胚胎在ART Lab Solutions胚胎卵裂培养基中培养，然后转移到新的ART Lab Solutions胚胎卵裂培养基中并培养到第5天。从1天到第5天，组3的胚胎在Vitrolife G1+培养基中培养。从第1天到第3天，组4的胚胎在Vitrolife G1+培养基中培养，然后移至新的Vitrolife G1+培养基中并培养至第5天。从第1天到第3天，组5的胚胎在Vitrolife G1+培养基中培养，然后移到新的VitrolifeG2+培养基中培养并培养到第5天(平均值±SD)。
图17f显示了在培养皿中有油覆盖的标准10μL培养液滴中培养的胚胎的内细胞团(ICM)占总细胞数(TCN)的百分比(对照为体内囊胚)。从第1天到第5天，组1的胚胎在ARTLab Solutions胚胎卵裂培养基中培养。从第1天到第3天，组2的胚胎在ART Lab Solutions胚胎卵裂培养基中培养，然后移至新的ART Lab Solutions胚胎卵裂培养基中并培养至第5天。从1天到第5天，组3的胚胎在Vitrolife G1+培养基中培养。从第1天到第3天，组4的胚胎在Vitrolife G1+培养基中培养，然后移至新的Vitrolife G1+培养基中并培养至第5天。从第1天到第3天，组的5胚胎在Vitrolife G1+培养基中培养，然后移至新的Vitrolife G2+培养基中并培养至第5天(平均值±SD)。
与未移动的在相同培养基中的胚胎相比，移动的胚胎的所有处理组的DNA修复和内细胞团百分比均得到改善。对于DNA修复和内细胞团百分比结果，在Vitrolife G1+培养基随后在Vitrolife G2+培养基中培养的胚胎比在第3天转移到Vitrolife G1+培养基的胚胎表现出改善。
通过开展进一步研究，将相同的干预置于细胞单元载体和细胞单元盖内培养的胚胎上，解决了在Vitrolife G1+培养基随后在Vitrolife G1+培养基中培养的胚胎发育不良的问题。虽然在Vitrolife G1+培养基随后在Vitrolife G2+培养基仍然显示出最佳的生长培养基条件，但在细胞单元载体和细胞单元盖中培养的细胞也显示出，改变培养基比不改变培养基有所改善。结果表明，细胞单元载体和细胞单元盖在5天的生长期维持相同的培养基，改善了生长缺陷。
图18a至18d示出了在6％CO2、5％O2、89％N2或6％CO2、20％O2、74％N2的空气混合物中以及在37℃的加湿条件下，在培养皿中有油覆盖的标准10μL培养液滴中培养的胚胎的胚胎发育百分比结果。图18a显示了从第1天到第2天的胚胎发育百分比，图18b显示了从第1天到第3天的胚胎发育百分比，图18c显示了从第1天到第4天的胚胎发育百分比，图18d显示了从第1天到第5天的胚胎发育百分比(平均值±SD)。图18e显示了γH2a.x染色的百分比强度，其示出了无论是否有增加的氧气-空气混合，在培养皿中有油覆盖的标准10μL培养液滴中培养的胚胎(对照组为活体囊胚)的DNA修复。
当胚胎在20％O2而不是5％O2中培养时，到第5天，胚胎发育百分比略有下降，但这一结果在整个培养期并不一致。然而，当细胞在20％O2存在下培养时，DNA修复百分比在第5天显示出显著改善。
这些结果表明，尽管细胞在发育过程中受到干扰时会受到创伤，但培养基的补充可以显著改善培养细胞的生长和活力。通过采用连续灌流引入新鲜培养基，以及在灌流过程中细胞未受到干扰时，这种改善有望增加。随着时间的推移，发育和活力结果的不一致反映了在每个生长阶段的发育中胚胎的不同需求。对于每个生长阶段，存在优化的生长培养基和其他培养条件下的静态灌流有望进一步改善生长结果。
在本说明书中，“包含(comprise)”一词或变体(例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”)将被理解为包含所述元素、整数或步骤，或一组元素、一组整数或一组步骤，但不排除任何其他的元素、整数或步骤，或一组元素、一组整数或一组步骤。
本文所述的各种装置和装置组件能根据需要以各种尺寸和/或大小提供。合适的尺寸和/或大小将根据连接组件的大小或使用领域而变化，这能够由本领域技术人员选择。
应当理解，根据需要，关于本发明的一个实施例描述的特征、元件和/或特性可以与本发明的其他实施例一起使用。
尽管本发明的优选实施例是为了说明目的而公开的，但本领域技术人员将理解，在不脱离本发明和所附权利要求的范围和精神的情况下，可以进行各种修改、添加和替换。
应当理解，当一个元素或层被称为“在另一个元素或层上(on)”或“在另一个元素或层内(within)”时，该元素或层可以直接在另一个元素或层上、或在另一个元素或层内、或介于元素或层内中间。相反，当一个元素被称为“直接在另一个元素或层上(directlyon)”或“直接在另一个元素或层(directly within)”时，不存在介于元素或层内中间。
如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关列出项目的任何和所有组合。
应当理解，尽管本文中使用术语第一、第二、第三等来描述各种元件、组件、区域、层和/或部分，但这些元件、组件、区域、层和/或部分不应受到这些术语的限制。这些术语仅用于区分一个元件、组件、区域、层或部分与另一个区域、层或部分。因此，第一元件、组件、区域、层或部分也能够被称为第二元件、组件、区域、层或部分，而不背离本发明的教导。
为了便于描述，本文使用空间相关术语，例如“下部(lower)”、“上部(upper)”、“顶部(top)”、“底部(bottom)”、“左部(left)”、“右部(right)”等，来描述图中所示的一个元件或特征与另一个(些)元件或特征的关系。应当理解，除了附图中描绘的方向之外，空间相关术语旨在包含使用或操作中的结构的不同方向。例如，如果图中的装置被翻转，则相对于其他元件或特征描述为“下部”的元件将相对于其他元件或特征定向为“上部”。因此，示例性术语“下部”可以包括上和下的方向。装置可以以其他方式定向(旋转90度或以其他方向)，并且应相应地解释本文中使用的空间相对描述符。
本文使用的术语仅用于描述特定实施例，并不旨在限制本发明。如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”也旨在包括复数形式。应进一步理解，当在本说明书中使用术语“包括(including)”、“包括(comprises)”和/或“包括(comprising)”时，具体说明了所述特征、整数、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元素、组件和/或其组的存在或添加。
本文参考示意图和/或横截面图示来描述本说明书的实施例，例如，这些示意图和/或横截面图示是本说明书优选实施例(和中间结构)的示意图。因此，由于例如制造技术和/或公差等原因，可以预期图示形状的变化。因此，说明书的实施例不应被解释为限于本文所示的组件的特定形状，而应包括例如从制造中产生的形状偏差。
除非另有定义，本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本说明书所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。应当进一步理解，诸如在常用词典中定义的术语，应当被解释为具有与其在相关技术的背景中的含义一致的含义，并且除非在此明确定义，否则不会以理想化或过于正式的意义来解释。
本说明书中对“一个实施例(one embodiment)”、“一个实施例(an embodiment)”、“示例实施例(example embodiment)”等的任何引用，意味着结合实施例描述的特定特征、结构或特性包括在说明书的至少一个实施例中。此类短语在说明书中不同位置的出现不一定都指的是相同的实施例。此外，当结合任何实施例描述特定特征、结构或特性时，结合实施例中的其他特征、结构或特性来实现和/或使用该特征、结构或特性是本领域技术人员的权限。
实施例还旨在包括或以其他方式涵盖上述任何或所有元件的使用方法和制造方法。
虽然上文已根据具体实施例描述了本发明，但应理解，本发明不限制于这些公开的实施例。在阅读本发明的教导后，本发明所属领域的技术人员应想到本发明的许多修改和其他实施例，并且这些修改和实施例将被本发明和所附权利要求书所涵盖。
本说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。对包括在本说明书中的文件、行为、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是为了提供本发明的背景。不应视为承认任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分，或者是与本发明相关领域的公知常识，因为在本申请的每项权利要求的优先权日之前，这些事项在澳大利亚或其他地方就已存在。
正如本领域技术人员依靠本说明书和附图中的公开所理解的那样，本发明的范围应该通过对所附权利要求及其法律等效物的正确解释和理解来确定。
引文
1.Data on IVF clinics show wide variation in success rate,BMJ 2002；325doi:https://doi.org/10.1136/bmj.325.7362.460/e(Published 31August 2002).
2.JMST Advances,June 2019,Volume 1,Issue 1–2,pp 1–11|Cite asMicrofluidic technology for in vitro fertilization(IVF).

Claims (16)

1.一种用于维持和培养在其中的细胞的细胞培养微装置，其包括：
细胞培养单元，其具有至少一个第一细胞载体单元，所述第一细胞载体单元限定在其中形成的细胞培养室，
所述第一细胞载体单元由至少以下形成：
室基座，其成形为支撑在其上的细胞，以及
一个或多个室壁，其具有围绕室边界包围细胞培养室的一个或多个室壁表面，
所述第一细胞载体单元还提供导引表面，以引导仪器或流体定位于穿过室壁的孔进入细胞培养室，
其中，所述细胞培养微装置的尺度配置为基本上将单个细胞或细胞团包围在其中。
2.根据权利要求1所述的细胞培养微装置，其中所述一个或多个室壁包括一个或多个朝室近端点倾斜的内壁表面，并且配置为引导培养室内仪器或细胞的放置。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养微装置，其中所述细胞培养室从上方打开，且所述室基座包括弯曲的内表面。
4.根据权利要求1或3所述的细胞培养微装置，其中所述一个或多个室壁包括：
近端壁，其具有弯曲的内壁表面，所述内壁表面配置为引导仪器在所述培养室内的放置，以及
远端壁，其限定远端室边界并具有穿过室壁于其中形成的孔，所述孔限定与从细胞培养室向外突出的细长导引部分连通的开口，所述细长导引部分具有于其中形成的通道，所述通道提供导引表面以引导仪器或流体进入细胞培养室。
5.根据权利要求4所述的细胞培养微装置，其中所述一个或多个室壁包括至少一个左侧壁和至少一个右侧壁，每个侧壁都具有穿过其形成的左侧孔和右侧孔。
6.根据权利要求2或4所述的细胞培养微装置，其中所述近端壁具有穿过其形成的近端孔，所述近端孔配置为与所述导引表面水平对齐，以减缓流体在所述孔与所述近端孔之间穿过细胞培养室的流动。
7.根据权利要求6所述的细胞培养微装置，其中所述近端壁包括适于穿过其用于流体灌流的灌流入口开口，以及配置为用于灌流管与灌流入口开口的接合的管配件。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞培养微装置，其中所述第一细胞载体单元包括细胞室壁，所述细胞室壁具有外壁耦合件，所述外壁耦合件适于与至少一个第二细胞载体单元上的相应外壁耦合件接合，从而形成细胞载体阵列。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞培养微装置，其进一步包括与所述第一细胞载体单元整合形成的至少一个第二细胞载体单元，从而形成细胞载体盒。
10.根据权利要求3或9所述的细胞培养微装置，其进一步包括第一细胞盖单元，所述第一细胞盖单元具有第一盖壁，当所述第一细胞盖单元与所述第一细胞载体单元连接以形成细胞培养单元基座时，所述第一盖壁配置为从上方覆盖所述细胞培养室开口的至少一部分。
11.根据权利要求10所述的细胞培养微装置，其中，所述第一细胞盖单元包括外壁耦合件，所述外壁耦合件适于与至少一个第二细胞盖单元上的相应外壁耦合件接合，从而形成细胞盖阵列。
12.根据权利要求11所述的细胞培养微装置，其进一步包含至少一个第二细胞盖单元，所述第二细胞盖单元与所述第一细胞盖单元整合形成，从而形成细胞盖盒。
13.根据权利要求12所述的细胞培养微装置，其中所述第一细胞盖单元还包括穿过其形成的接入孔，穿过所述第一细胞盖单元形成的接入孔配置为允许在第一位置从上方进入所述开口，并在第二位置从上方覆盖所述开口的至少一部分，并且适于从第一位置到第二位置可滑动地接合所述第一细胞载体单元。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的细胞培养微装置，其中所述室基座的外表面包括凹槽，所述凹槽配置为容纳从细胞载体单元或细胞盖单元向外突出的凸耳。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的细胞培养微装置的使用方法，其包括以下步骤：将一个细胞轻松放置在细胞培养微装置的细胞培养室内，并在其中培养细胞。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的细胞培养微装置的使用方法，其包括以下步骤：获取用于构建细胞培养微装置的指令，并在增材制造过程中执行所述指令。
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