JP2023504815A - 細胞培養マイクロデバイス - Google Patents

Abstract

内部において細胞を維持および培養するための細胞培養マイクロデバイスであって、内部に形成された細胞培養チャンバを画定する少なくとも１つの第１の細胞担体ユニットを有する細胞培養ユニットを備え、第１の細胞担体ユニットが、少なくとも、上部に細胞を担持するように成形されたチャンバベースと、チャンバ境界の周りで細胞培養チャンバを囲む１つ以上のチャンバ壁面を有する１つ以上のチャンバ壁と、から形成され、第１の細胞担体ユニットが、細胞培養チャンバに器具または流体を誘導するための、チャンバ壁を通過するアパチュアに位置決めされた誘導面をさらに提供し、細胞培養マイクロデバイスが、単一の細胞または細胞塊をその内部に実質的に囲むスケールで構成されている、細胞培養マイクロデバイス。細胞培養マイクロデバイスの実施形態は、インビトロ受精手順および薬剤有効性試験に適し得る。【選択図】図９ａ

Description

技術分野は、広義には、細胞、特に哺乳動物細胞の培養のためのマイクロデバイスの技術進歩に関する。本発明のマイクロデバイスは、広義には細胞担体デバイス、および細胞培養のためのマイクロデバイスの形態である。しかしながら、担体デバイスは、細胞培養、幹細胞分化、細胞アレイアッセイ、不妊治療、および具体的には、体外受精（ＩＶＦ）による処置に等しく適用可能である。具体的な実施形態は、細胞培養ユニット、カートリッジ、アレイ、ならびに細胞担体ユニットおよび細胞カバーユニットを備える灌流デバイスを備えるマイクロデバイスに関する。

組織培養マイクロデバイスが広範囲にわたって利用可能であることから、マイクロスケールの組織培養技術は、高度に洗練され、それらの使用分野および応用分野は、より多様になっている。マイクロデバイスは、新規な療法、製品、およびプロセスを生み出す、細胞およびその培養環境の操作を可能にし、その多くがまだ初期段階にある。新規なマイクロデバイス、ならびに、マイクロ流体デバイス、「チップ上での培養（ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ）」技術、マイクロ骨格、およびマイクロ操作デバイスなどの既存のマイクロデバイスの改善により、３Ｄ組織工学、幹細胞分化、および生殖医療への新規なアプローチが生まれ、また、これらの技術の成功率の画期的な進歩がもたらされた。

例えば、複雑なインビトロ組織培養は、従来は、拡散を介する可能な限られた気体交換によるものでしか、実際には適用できなかったが、微小毛細血管灌流デバイスの開発により、より大型かつより複雑な組織の培養および増殖が可能になった。幹細胞培養技術（およびその応用）に関しては、現在、種々の胚組織の臓器培養システムにより、胚性脳、網膜、四肢芽、肺、腎臓、唾液腺、毛包、および歯細胞株の培養が可能になった。新規な組織工学技術の適用、およびこれらの技術を可能にするマイクロデバイスは、多くの異なる療法への新規かつ改良されたアプローチの提供を促進する。

マイクロデバイスの改良によって、細胞の培養および増殖が改良されることにより、生殖医療の分野で重要な利益がもたらされる可能性が大きくなる。この分野の特徴としては、自己の細胞を、採取し、増殖させ、患者に再導入しなければならないという理由から、自己細胞のインビトロ培養および操作以外にはほとんど代わるものがない点が挙げられる。

体外受精（ＩＶＦ）による生殖補助は、より利用し易くなり、また最近改良された結果、アクセスする患者の数が増加している。ヒトの受精および胚研究に関する認可局（Ｈｕｍａｎ Ｆｅｒｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）によって発表されたデータは、全体的に、ＩＶＦ治療を開始した女性が以前よりも子供を産む可能性が高いことを示している^１。しかしながら、個々の診療所間でＩＶＦ治療の成功率に大きなばらつきが見られ、いくつかの診療所では４６％もの成功率が達成される一方で、他の診療所では１０％と低い^１。

成功可能性は、卵子の回収、卵子の受精、初期胚の発生、胚のガラス化、および胚の移植の間など、ＩＶＦのプロセスのいくつかの段階で変化する可能性がある。卵子の選抜の成否、受精、胚発生、胚の凍結保存、および胚移植の準備は、現在、胚培養士の技術に大きく依存している。

胚発生中に生じるＩＶＦ妊娠の成功の決定的要因は、その増殖および発生中に存在する物理的および環境的条件が大きく関与する。精子、卵子、または発生中の胚に起こり得るあらゆる種類の急激な環境変化、物理的ショック、または物理的ストレスは、胚の生存可能性を低下させ、その結果、その移植後の妊娠の成功率を低下させる可能性がある。

細胞培養システムにおける何らかの物理的および環境的条件は、インビトロでの細胞の生存能および増殖に影響を与える可能性が高い。例えば、インビボ培養の準備において接着細胞を剥離させるための、スクレイピング（手作業／物理的）、トリプシン化（化学的／酵素的）、および超音波（物理的／穏やか）の選択は、細胞の生存率に大きく影響し、使用される細胞型ならびに緩衝液および他の培地成分にも大きく依存する。

組織工学において、形態形成および器官形成の間の機能的な三次元組織構造の構築は、組織単層間の細胞間相互作用に依存する。これらの細胞間相互作用は、機械的な力の適用、細胞形状、細胞外マトリックスの形状または他の特性、ならびに物理的な細胞間接触および他の形態形成因子を含む、培養システム内の物理的および環境的なキュー（ｃｕｅ）によって引き起こされ、維持される。同様に、幹細胞の分化は、細胞特異的な増殖因子、酵素、および他のタンパク質、またはそれらの成分もしくはそれらの副産物の枯渇もしくは蓄積を含む、細胞培養マトリックス内の多くの因子によっても左右される。

胚発生の場合、発生中の胚に対する最も重大なショックまたはストレスは、取り扱いおよび物理的操作によって発生し、胚培養士の経験、訓練、および疲労によって影響を受ける。ＩＶＦ手順のための胚の増殖および調製中のいくつかの事象は、胚培養士による物理的介入を伴い、したがって、胚形成の成否およびその移植の可能性に対してリスクをもたらす。精子、卵子を採取し、それをエクスビボ環境に導入するプロセスは、インシリコの配置中に物理的な損傷および有害な環境的影響の両方、ならびに異なる流体環境への配置（ｐｌａｃｅｍｅｎｔ）による生化学的ストレスから、精子および卵子に対するストレスまたはショックのリスクをもたらす。

受精のプロセスは、精子を導入するために必要な物理的操作（これが細胞質内であるかどうかにかかわらず）による損傷のリスクをもたらす。胚培養のための環境の最適化、および凍結保存または移植のための発生済みの胚の除去は、物理的損傷のリスクを増加させる。胚の物理的な移植は、胚の物理的ダメージまたは損傷の機会を生じさせる。操作および取り扱いから生じる損傷またはショックのリスク、したがってＩＶＦ手順の成否は、胚培養士のスキルおよび注意力、ならびに胚培養士が利用可能なツールおよび装置の精度、ならびに胚培養士による影響下で設けられた実験室的な環境条件（例えば、無菌性、温度、揮発性有機化合物などの何らかの形態の汚染物質の防除、ならびに間違ったまたは混合された親子関係を防止するための親識別の管理体制）によって大きく影響を受ける。

精密なツールおよび機器は、胚培養士が誤って精子、卵子、または胚への損傷またはショック、あるいは間違った親子関係を生じさせる可能性を減少させる。さらに、胚培養士による物理的介入または操作を減少または排除するツールまたは機器は、精子、卵、または胚に対する物理的ショックを生じさせる事象が発生し得る可能性を減少させる。さらに、最適化されたエクスビボ環境における変動を減少させるツールまたは機器は、卵子または胚への生化学的ストレスも減少させる。

ＩＶＦ療法に使用されるマイクロインジェクションデバイスならびに可視化デバイスでは技術進歩がなされている一方で、関与する細胞を処理するためのマイクロデバイスの開発については、それらを操作する際の、または過度の取り扱いまたは操作を低減するための、技術については、ほとんど進歩していない。

典型的には、発生中の胚は、大量の液体培養培地中で培養されることで、細胞によって利用される重要な培地成分の枯渇から生じる物理的影響が最小限に抑えられ、また培養培地中への老廃物の濃度の増加から生じる物理的影響も最小限に抑えられる。しかしながら、老廃物のごくわずかな増加であっても、栄養素のごくわずかな減少は、発生中の細胞にかなり大きな影響を与える可能性がある。これらの増殖中の培養培地の組成変化による物理的影響は、発生中の胚の代謝ニーズの変化によって悪化する。

これらの課題は、インビトロでのオルガノイドまたは複雑な組織の開発において経験された課題に類似している。細胞がより複雑な組織、実際には組織構造に発達する過程を通じて、細胞の代謝ニーズが変化することにより、インビトロ組織培養システムにおいてより複雑な要件が課される。

ある体積の培養培地内の発生的変化に応じた物理的影響を加味することは、容易ではない。胚培養については、培養培地の体積は、胚が胚培養士によって位置換え可能な状態を維持するのに十分小さいままでなければならないため、培地の変化の影響を最小限に抑えるのに十分な希釈を行うことは困難であり、また、培地の体積が大きくなると、胚が胚自身の成長を補助するために胚によって産生される既知の物質が希釈されるか、または位置決めが困難になる可能性が増加して取り扱いまたは操作が過剰になるという可能性が増加する。

この問題に対処するために胚培養士が採用する一般的なアプローチとして、一連の培養培地の調製を行い、インビトロでの発生期間を通じて、発生中の胚をそれぞれ循環させることが行われる。このアプローチの利点は、培養培地、受精培地、または凍結保存培地が、各々、発生または操作の特定の段階での細胞のニーズに特異的に適応できる、ということであるが、胚の成長段階の要件を満たすように培地成分を最適化したとしても、ある液体培地から別の液体培地に移動させる際に細胞が経験するストレスは、依然として発生に対して悪影響を及ぼす。

この問題を克服するために、様々なマイクロ流体的、および液体もしくは気体灌流装置が、成功の程度の差こそあれ、開発されている。マイクロ流体的な「チップ上での培養」マイクロデバイスは、マイクロ流体を利用して細胞または細胞塊をある細胞培養「浴」から次のものへと移動または「転がす」ことで、過度の操作による細胞へのショックを防止すべく開発されている。他のマイクロ流体デバイスは、凍結保存および胚移植の準備のために、受精卵の胚期への発生期間を通じて、伝統的な細胞培養皿システムへの液体媒体の継続的な流入および流出を可能にするよう適合されている。これらの開発技術はあまり採用されておらず、多くの胚培養士はペトリ皿または設計変更されたペトリ皿を利用した静的培養技術を、これらの容器内への胚の位置決めおよび回収の利便性の理由から、好む傾向がある。

いずれのアプローチも、最適な気体交換、および液体交換のニーズに対処できるものではない。すべての組織、特に形態形成および幹細胞分化においては、気体拡散による適切な通気が発生にとって重要である。

近年、胚の静的培養にマイクロ流体技術を適用する試みが現れている^２。研究者は、ダメージまたはストレスを回避するために卵子および発生中の胚が過度に動かないようにする一方で、マイクロ流体デバイスの非常に小さなチャネル内に非常に微量の培養培地が保持されるよう管理するための技術を見出し、最適化している。しかしながら、これまで、マイクロ流体デバイス内での灌流を、何らかの程度で、臨床応用と組み合わせた試みはない。

マクロスケールからマイクロスケールへのエンジニアリングシステムのダウンスケーリングにより、新規なアプリケーションのスペクトルをより広範囲に広げることは、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｆｅｙｎｍａｎ氏の研究により確立されたエンジニアリング原理を通じて確立されているが、蒸発、潤滑、加熱、および慣性という物理的な課題をもたらし、それらはかかる小規模スケールでは非常に異なって作用する。このスケールに適応したエンジニアリング設計は、インビトロ細胞培養においては未だ適切に行われていない。本開示は、少なくとも部分的に、設計のイノベーションを通じて、これらの課題に対処する。

ナノおよびマイクロスケールのデバイスの使用が、マクロスケールデバイスでは利用できない機会を提供することは、Ｋｉｍ Ｅｒｉｃ Ｄｒｅｘｌｅｒ氏の研究においても確立されている。マクロスケール細胞デバイスは、多くの細胞間の乱雑な相互作用に依存する傾向があり、それは、これらの相互作用のうちの１つ以上が、事前に定義された許容可能なマージン内で意図する結果を生成することを期待して行われるものである。マイクロスケールデバイスは、個々の細胞を使用して直接相互作用させ、意図する結果をより正確かつ効率的に生み出すことを可能にする。その後の相互作用は、理想に非常に近い対象に基づくものとなり、より正確な結果が生み出される。

培養装置内における精子、卵子および胚の物理的安定性を維持することによって、胚培養士は、精子、卵子または胚をより容易におよび／または正確に取り扱い、または操作することが可能となり、また、物理的ショックおよび／または生化学的ストレスのリスクを最小限に抑えるか、あるいは受精、胚培養または胚移植中の親混合（ｍｉｘｅｄ ｐａｒｅｎｔａｇｅ）のリスクをさらに防止することができる。培養中の細胞の安定化は、ＩＶＦ手順の成否を改善し得る。

かかるアプローチは、発生胚の受精および培養を成功させるための困難性を解消するのみならず、勾配プロセスにおける培養環境の変化に感受性のある他の細胞株の培養にも適用され得る。

本発明の一態様では、本開示の実施形態は、内部において細胞を維持および培養するための細胞培養マイクロデバイスであって、内部に形成された細胞培養チャンバを画定する少なくとも１つの第１の細胞担体ユニットを有する細胞培養ユニットを備え、第１の細胞担体ユニットが、少なくとも、上部に細胞を担持するように成形されたチャンバベースと、チャンバ境界の周りで細胞培養チャンバを囲む１つ以上のチャンバ壁面を有する１つ以上のチャンバ壁と、から形成され、第１の細胞担体ユニットが、細胞培養チャンバに器具または流体を誘導するための、チャンバ壁を通過するアパチュアに位置決めされた誘導面をさらに提供し、細胞培養マイクロデバイスが、単一の細胞または細胞塊をその内部に実質的に囲むスケールで構成されている、細胞培養マイクロデバイスに関する。

本明細書で使用される「細胞」という用語は、「細胞材料」という用語と互換性があると理解されるべきであり、本明細書に記載される本発明の主題である細胞、細胞群、組織、またはオルガノイドを指すものとする。

本明細書で使用される場合、「細胞培養」という用語は、細胞材料が、試験、増殖、観察、実験、培養培地の回収、または他の生物科学的プロセスのための、制御された条件下で単離および維持される、あらゆるツールまたはプロセスを説明するものとする。

本明細書で使用される場合、「マイクロデバイス」という用語は、例えば、０．１μｍ～１０００μｍのミクロンスケールで製造される製造物を説明するものとする。マイクロデバイスは、静的および機械的デバイスの両方、ならびにマイクロ流体工学の領域のデバイス、を包含するものとする。

本明細書で使用される場合、「細胞を維持すること」という用語は、細胞材料が、生存に必要な条件を生成するよう制御された環境において保持されるあらゆるプロセスを指すものとする。「細胞を培養すること」という用語は、細胞培養のプロセスを指すものとする。

本明細書で使用される場合、「凍結保存」という用語は、交換可能な様式でのガラス化または凍結を指すものとする。

本明細書で使用される場合、「境界」という用語は、細胞チャンバユニットの内側と細胞チャンバユニットの外側との間の三次元境界を指すために使用され、壁、表面、開口部、およびアパチュアによって画定され得る。

好ましい実施形態では、誘導面は、湾曲した底部トレンチを画定し、そこを器具が通過して、アパチュアを経て細胞培養チャンバに導入される。代替的には、流体が、湾曲した底部トレンチによって、またそこを通過して、細胞培養チャンバの内側と外側との間のアパチュアを経て誘導され得る。

代替的な実施形態では、誘導面は、チャンバ壁を通過する狭いアパチュアを画定し、そこを器具が通過して、アパチュアを経て細胞培養チャンバに導入されることとなる。代替的には、流体が、細胞培養チャンバの内側と外側との間の狭いアパチュアによって誘導され、またそこを通過し得る。

好ましい実施形態では、細胞チャンバベースは、実質的に凹状であり得る。代替的には、細胞チャンバベースは、実質的に凸状、段状、くぼんだ形状、または、細胞培養チャンバ内で細胞材料を支持するために使用され得る他の形状に成形され得る。

本発明の態様の細胞担体ユニットは、マイクロスケールで形成されるよう構成される。したがって、好ましくは、細胞に対して無毒である、マイクロスケール製造に好適な材料から形成される。

特定の実施形態の１つ以上のチャンバ壁は、チャンバの近位点に向かって傾斜した１つ以上の内壁面を備え得、その結果、それらは、培養チャンバ内において器具または細胞の配置を誘導するよう構成されている。

好ましい実施形態では、本発明の態様の１つ以上のチャンバ壁は、培養チャンバ内の器具の配置を誘導するよう構成された、湾曲した内壁面を有する近位壁を備える。

ある特定の実施形態では、近位壁は、階段状、くぼみ状であり得、または、それ以外の、培養チャンバ内において器具の配置を誘導するよう構成され得る。

好ましい実施形態では、本発明の態様の細胞培養チャンバは、上から開口しており、チャンバベースは、湾曲した内面を備える。

本発明の態様における境界は、好ましくは、上部開口部および誘導アパチュアと反対側の湾曲した近位壁を有する実質的に箱型の形状であり、これにより、取り扱い中に細胞材料に方向性および安定性を提供することができる。細胞培養チャンバは、好ましくは、湾曲した近位壁の表面および培養ベースの表面の両方に流体交換アパチュアを備える。代替的には、細胞培養チャンバのフットプリントは、フットプリントの位置において実質的に三角形またはＶ字形であり、近位点に向かって傾斜し得る。

代替的な実施形態では、本発明の態様における境界は、実質的に円筒形、球形、三角形、非対称、または階段状であり得る。

好ましい実施形態では、本発明の態様の１つ以上のチャンバ壁は、培養チャンバ内への器具の配置を誘導するよう構成された、湾曲した内壁面を有する近位壁と、遠位チャンバ境界を画定し、チャンバ壁を通過するよう形成されたアパチュアを有する、遠位壁であって、アパチュアが、細胞培養チャンバから外向きに突出して細胞培養チャンバに器具または流体を誘導する誘導面を提供する内部に形成されたチャネルを有する細長い誘導部分と連通して開口部を画定する、遠位壁と、を備える。

好ましくは、本発明の態様の１つ以上のチャンバ壁は、湾曲した近位壁と反対側の中間遠位壁を備える。中間遠位壁は、アパチュアを備え、細胞培養チャンバの外側で中間遠位壁に垂直に形成された導管を画定する誘導面を提供する。

好ましくは、中間遠位壁の内面は、チャンバから誘導面に向かって器具または流体を誘導するために、実質的に凹状である。代替的には、中間遠位壁の内面は、平坦であり得る。

好ましい実施形態では、本発明の態様の１つ以上のチャンバ壁は、少なくとも左側壁および右側壁を備え、それぞれがそれを通過するよう形成された左側アパチュアおよび右側アパチュアを有する。

好ましい実施形態では、本発明の態様の近位壁は、それを通過するよう形成された近位アパチュアを有し、それは、上記アパチュアと近位アパチュアとの間の細胞培養チャンバを通る流体の流れを緩和するよう、誘導面と水平に整列して構成されている。

好ましい実施形態では、本発明の態様のアパチュアは、それを通過する灌流のために構成されている。好ましくは、アパチュアは、チャンバベースを通過するよう位置決めされており、細胞がそこを通過できないようなサイズである。代替的には、アパチュアは、１つのチャンバ壁を通過するよう位置決めされているか、または境界の１つ以上の表面に分布するいくつかのアパチュアで構成されている。

好ましい実施形態では、本発明の態様の近位壁は、それを通過する流体灌流に適合された灌流入口開口部と、灌流チューブを灌流入口開口部に係合するよう構成されたチューブ継手とを備える。

代替的には、チューブ継手は、灌流マニホールドまたは灌流培地を供給する他の手段と係合するよう構成され得る。

流体交換アパチュアは、代替的に、他の表面上に位置決めされ得、他のアパチュアおよび開口部に統合され得、または、場合によっては、細胞材料の維持および培養のためには必要とされないこともあり得る。

好ましい実施形態では、本発明の態様の第１の細胞担体ユニットは、少なくとも１つの第２の細胞担体ユニット上の対応する外壁カップリングと係合するように適合された外壁カップリングを有する細胞チャンバ壁を備え、それによって細胞担体アレイを形成する。好ましくは、細胞担体アレイは、無制限の数の細胞担体ユニットを備え得、各々、別のものと係合するよう適合されている。好ましくは、細胞担体アレイは、水平面内の直線的なアレイであるが、代替的に垂直面内に積み重ねてもよく、または両方の混合体でもあり得る。好ましくは、細胞担体ユニットは、水平面でともにクリップし、垂直面で積み重なるか、または代替的に、水平面もしくは垂直面のいずれかで共に摺動可能に係合し得る。

ある特定の実施形態では、本発明の態様の細胞培養マイクロデバイスは、第１の細胞担体ユニットと一体的に形成された少なくとも１つの第２の細胞担体ユニットを備え、それによって細胞担体カートリッジを形成する。好ましくは、細胞担体カートリッジは、無制限の数の細胞担体ユニットを備え得、各々が別のものと一体的に接続している。好ましくは、細胞担体カートリッジは、水平面において直線的であるが、代替的に垂直面においてカートリッジを生成してもよく、または両方の混合体でもあり得る。好ましい実施形態では、細胞担体カートリッジは、別の細胞担体カートリッジを積み重ねるか、または別の細胞担体カートリッジと係合して、細胞担体カートリッジアレイを画定し得る。

代替的な実施形態では、細胞培養アレイおよび細胞培養カートリッジは、円形のアレイもしくはカートリッジとして、またはさらなる処理のためにアレイもしくはカートリッジを適合させ得る別の形態で、形成され得る。

好ましい実施形態では、本発明の態様の細胞培養マイクロデバイスは、第１の細胞カバーユニットおよび第１の細胞担体ユニットが接続されて細胞培養ユニットベースを形成するとき、細胞培養チャンバの開口部の少なくとも一部を上から覆うよう構成された第１のカバー壁を有する、第１の細胞カバーユニットをさらに備える。

好ましい実施形態では、細胞カバーユニットは、上面を含む３つの表面で細胞担体ユニットを実質的に囲み、上面に位置決めされたときに上部開口部を完全に覆うよう成形されている。

代替的な実施形態では、細胞カバーユニットは、細胞担体ユニットの少なくとも１つの表面を実質的に覆うよう成形され得る。

好ましくは、細胞カバーユニットは、本発明の態様の細胞担体ユニットと係合可能な部分で終端するよう構成された少なくとも１つのエッジを有する。好ましくは、細胞担体ユニットと係合可能な部分は、細胞担体ユニットのベースと係合するように適合され、それによって細胞培養ベースを形成する。さらに好ましい形態において、細胞カバーユニットは、細胞担体ユニットのベースと摺動可能に係合するよう構成されている。

好ましい実施形態では、本発明の態様の第１の細胞カバーユニットは、少なくとも１つの第２の細胞カバーユニット上の対応する外壁カップリングと係合するよう適合された外壁カップリングを備え、それによって細胞カバーアレイを形成する。好ましくは、細胞カバーアレイは、無制限の数の細胞カバーユニットを備え得、各細胞カバーユニットは、別のものと係合するよう適合されている。好ましくは、細胞カバーアレイは、水平面内の直線的なアレイであるが、代替的に垂直面内に積み重ねられてもよく、または両方の混合体でもあり得る。好ましくは、細胞カバーユニットは、水平面でともにクリップし、垂直面で積み重ねるか、または代替的に水平面もしくは垂直面のいずれかでともに摺動可能に係合し得る。

好ましい実施形態では、本発明の態様の細胞培養マイクロデバイスは、第１の細胞カバーユニットと一体的に形成された少なくとも１つの第２の細胞カバーユニットをさらに備え、それによって細胞カバーカートリッジを形成する。好ましくは、細胞カバーカートリッジは、無制限の数の細胞カバーユニットを備え得、各々が別のものと一体的に接続している。好ましくは、細胞カバーカートリッジは、水平面において直線的であるが、代替的に垂直面においてカートリッジを生成してもよく、または両方の混合体でもあり得る。好ましい実施形態では、細胞カバーカートリッジは、別の細胞カバーカートリッジを積み重ねるか、または別の細胞カバーカートリッジと係合して、細胞カバーカートリッジアレイを画定し得る。

好ましい実施形態では、本発明の態様の第１の細胞カバーユニットおよび第１の細胞担体ユニットは、細胞培養ユニットベースを画定する。好ましい実施形態では、細胞培養ユニットベースは、平らな底面上に終端する第１の細胞カバーユニットおよび第１の細胞担体ユニットによって画定され、安定した担持を提供する。代替的には、細胞培養ベースは、ある構成では第１の細胞担体ユニットまたは第１の細胞カバーユニットのうちの一方によって、別の構成では他方によって、画定され得る。

好ましい形態では、細胞培養ベースは、別の細胞培養カートリッジ、細胞担体ユニットまたは細胞カバーユニットと接続するよう適合されている。ベースは、好ましくは、表面上に配置されたとき、または別の構成要素もしくは装置と接続されたとき、細胞担体ユニットを物理的に安定させるよう構成されている。

好ましい実施形態では、本発明の態様の第１の細胞カバーユニットは、第１の細胞担体ユニットと摺動可能に係合するよう構成されている。好ましい実施形態では、第１の細胞カバーユニットは、近位－遠位軸に垂直な第１の細胞担体ユニットの２つの側面の各々と摺動可能に係合するよう成形されている。

ある特定の実施形態では、第１の細胞カバーユニットは、第１の細胞担体ユニット上のチューブ継手と係合し、灌流チューブをその上のチューブ継手に取り付けることを可能にするよう構成された培地入口を備える。代替的には、培地入口は、灌流マニホールドまたは灌流培地を供給する他の手段と係合するよう構成され得る。

好ましい実施形態では、第１の細胞カバーユニットは、それを通過するよう形成されたアクセスアパチュアをさらに備え、第１の細胞カバーユニットを通過するよう形成されたアクセスアパチュアは、第１の位置で開口部への上からのアクセスを可能にし、第２の位置で開口部の少なくとも一部分を上から覆うよう構成され、第１の位置から第２の位置まで、第１の細胞担体ユニットと摺動可能に係合するよう適合されている。

好ましい実施形態では、アクセスアパチュアは、上部開口部がアクセスアパチュアを通じて完全にアクセス可能となるように、上部開口部と同じサイズおよび形状である。代替的な実施形態では、アクセスアパチュアは、上部アパチュアよりも大きくてもよく、またアクセス用に構成されたときには、器具または細胞を細胞培養チャンバに誘導するため傾斜した形状であり得る。

ある特定の実施形態では、本発明の態様のチャンバベースの外面は、細胞担体ユニットまたは細胞カバーユニットから外向きに突出するラグを受容するよう構成されたノッチを備える。

本発明の態様の細胞培養マイクロデバイスの使用方法は、細胞培養マイクロデバイスの細胞培養チャンバ内に１つの細胞を簡便に配置するステップと、細胞を培養するステップと、を含む。

本発明の態様の細胞培養マイクロデバイスの使用方法は、細胞培養マイクロデバイスを構築するための指示を取得するステップと、指示を付加製造プロセスで実行するステップと、を含む。

本発明の態様の好ましい形態において、細胞培養ユニットは、少なくとも４つの壁と、内部に細胞培養チャンバを画定するベースとを備える。少なくとも４つの壁は、好ましくは、細胞培養チャンバを画定する湾曲した内面を有し、曲率が細胞取り扱い装置を配置するための基準点を提供する、近位壁と、左側壁と、右側壁と、中間遠位壁と、を備える。好ましい実施形態では、中間遠位壁は、それを通過するよう形成された開口部と、細胞培養チャンバを画定する内面と、それに対して実質的に垂直に形成されたチャネルを有する外面と、を備える。チャネルは、好ましくは、中間遠位壁を超えて遠位に延在し、内部を通過するよう形成された開口部を有する外側遠位壁に対して実質的に垂直に終端する、左側壁の内面および右側壁の内面によって形成される。

チャネルによって、中間遠位壁内、および外側遠位壁内に形成された開口部は、好ましくは、細胞培養担体の遠位端から細胞培養チャンバへの視線を提供できるよう整列されている。このアライメントは、好ましくは、胚培養士または他の使用者が、マイクロピペットなどの器具を慎重に細胞培養チャンバに導入して、細胞への干渉または破壊が少ない状態で細胞にアクセスするためのガイダンスを提供する。

例えば、移植のために細胞培養チャンバから胚を除去しようとする胚培養士は、外側遠位壁開口部を通じてマイクロピペットを導入することができ、その際、マイクロピペットが近位壁の湾曲した内面に到達するまで、チャネル上でマイクロピペットの先端を走らせ、かつ／または揺らす操作をし得る。近位壁の湾曲部は、マイクロピペットを細胞培養チャンバの中心に誘導し、その際、胚培養士は、マイクロピペットの真下において胚細胞および培地を穏やかに吸引または注入し得る。マイクロピペットなどの器具に物理的なサポートを提供する細胞培養担体の形状、および器具の位置決めまたは配置に関するガイダンスは、細胞に損傷を与え、細胞の最適な成長を妨げる可能性のある、オペレータによる誤操作の影響を低減する。したがって、細胞培養担体の立体構造は、培養技術を最適化し、細胞生存率を最適化し、ユーザの誤操作の影響を低減する。

好ましくは、左側および／または右側の壁は、それを通過するよう形成されたオーバーフロー開口部を備える。好ましくは、近位壁は、近位壁の外面に位置決めされた入口継手によって画定される入口開口部を備える。入口継手は、チューブまたは他の器具のコネクタとして機能し得る。灌流培養を実施するために、それを細胞培養ユニットに液体を移すために使用されるチューブと接続し得る。入口継手はまた、単に細胞培養ユニットを所定の位置に維持するために細胞培養ユニットまたはホルダーの位置の基準点として使用されるチューブなどと接続し得る。

さらなる好ましい形態では、入口開口部、中間遠位壁、チャネル、および外側遠位壁は、好ましくは、遠位壁から細胞培養担体を通じて、および入口開口部を通じて、視線を提供するよう整列される。細胞培養担体を通じた視線アライメントは、好ましくは、細胞が細胞培養ユニットを通じた培養培地の灌流中に培養されることを可能にするよう適合される。好ましくは、細胞培養チャンバのベースは、細胞培養担体を通る視線よりも少なくとも部分的に下にある。この構成は、流体灌流によって引き起こされる乱流または流れから培養中の細胞への物理的な混乱を最小限に抑える。

灌流技術は、特定の細胞型、特に、培養培地中の栄養素の枯渇または培養培地中の老廃物の増加から生じ得る培養培地中の生化学的変化に感受性のある細胞、または異なる成長フェーズを通じて培養されるときに様々な生化学的要件を有し得る細胞の成長のための条件を最適化し得る。ＩＶＦ手順のための胚培養は、灌流培養から利益を得ることができ、また、弁構造またはオルガノイド、皮膚、肝臓、腎臓、肺、または他の組織移植片などの複雑な構造、あるいは骨髄もしくは幹細胞などの複雑な細胞株、あるいは組織拒絶反応を受けやすい患者のための何らかの細胞株の培養においても同様であり得る。

ここで、本発明の広範な実施形態を、添付の図面を参照して、実施例および詳細な説明に開示される好ましい実施形態とともに説明する。本発明は、多くの異なる形態で具現化され得、本明細書に記載される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。これらの実施形態は、例示としてのみ提供されるものであるが、それにより、本開示が徹底的な、完全なものとなり、また本発明の全範囲および幅が伝授されるであろう。

本発明の実施形態による培養アレイまたはカートリッジの上面斜視図を示す。 本発明の実施形態による組み立てられた細胞培養アレイまたはカートリッジの前面図を示す。 本発明の実施形態による組み立てられた細胞培養アレイまたはカートリッジの背面図を示す。 本発明の実施形態による組み立てられた細胞培養アレイまたはカートリッジの底面斜視図を示す。 本発明の実施形態による組み立てられた細胞培養アレイまたはカートリッジの底面図を示す。 本発明の実施形態による組み立て前の細胞培養アレイまたはカートリッジの上面斜視図を示す。 本発明の実施形態による組み立て前の細胞培養アレイまたはカートリッジの背面図を示す。 本発明の実施形態による組み立て前の細胞培養アレイまたはカートリッジの底面斜視図を示す。 本発明の実施形態による細胞培養ユニット担体の細胞クレードル部分を示す。図９ａは上面斜視図を示す。 本発明の実施形態による細胞培養ユニット担体の細胞クレードル部分を示す。図９ｂは底面斜視図を示す。 組み立て前の細胞ユニットカバーおよび組み立て前の細胞培養アレイを示す。図９ｃは、拡張可能な細胞ユニットカバーの背面斜視図を示す。 組み立て前の細胞ユニットカバーおよび組み立て前の細胞培養アレイを示す。図９ｄは、拡張可能な細胞培養アレイの背面斜視図を示す。 組み立て前の細胞ユニットカバーおよび組み立て前の細胞培養アレイを示す。図９ｅは、拡張可能な細胞培養アレイの底面背面斜視図を示す。 本発明の実施形態による細胞培養ユニット担体を示す。図１０ａは上面前面斜視図を示す。 本発明の実施形態による細胞培養ユニット担体を示す。図１０ｂは上面背面斜視図を示す。 本発明の実施形態による細胞培養ユニット担体を示す。図１０ｃは、代替的な実施形態による、細胞培養ユニット担体の上面前面斜視図を示す。 細胞培養アレイと係合するための３つの位置にある、細胞培養ユニット担体の上面前面斜視図を提供する。 細胞培養アレイと係合するための３つの位置にある、細胞培養ユニット担体の上面前面斜視図を提供する。 細胞培養アレイと係合するための３つの位置にある、細胞培養ユニット担体の上面前面斜視図を提供する。 細胞を細胞培養ユニット担体に導入するための係合の２つの位置にある、細胞培養ユニット担体の上面斜視図を示す。 細胞を細胞培養ユニット担体に導入するための係合の２つの位置にある、細胞培養ユニット担体の上面斜視図を示す。 本発明の実施形態による、ユニット担体が中に位置付けられた細胞培養アレイまたはカートリッジを示す。図１１ａは背面図を示す。 本発明の実施形態による、ユニット担体が中に位置付けられた細胞培養アレイまたはカートリッジを示す。図１１ｂは正面角度図を示す。 本発明の実施形態による、ユニット担体が中に位置付けられた細胞培養アレイまたはカートリッジを示す。図１１ｃは底面斜視図を示す。 本発明の実施形態による細胞培養アレイまたはカートリッジの側面図を示す。 マイクロインジェクションピペットを受容している、本発明の実施形態による細胞培養アレイまたはカートリッジ内の細胞の側面図を示す。 マイクロインジェクションピペットを受容している、本発明の実施形態による細胞培養アレイまたはカートリッジ内の細胞の側面図を示す。 マイクロインジェクションピペットを受容している、本発明の実施形態による細胞培養アレイまたはカートリッジ内の細胞の側面図を示す。 本発明の実施形態による細胞培養マイクロデバイスのための原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）取り付けアセンブリを示す。 ３Ｄプリンターのポリマーの毒性試験の結果を提供する。図１５ａは、本発明によるマイクロデバイスおよびそれらの培地の存在下での胚発生のパーセンテージを示す。 ３Ｄプリンターのポリマーの毒性試験の結果を提供する。図１５ｂは、本発明によるマイクロデバイスの存在下での胚発生のパーセンテージを示す。 ３Ｄプリンターのポリマーの毒性試験の結果を提供する。図１５ｃは、ＤＮＡ修復のパーセンテージを示す。 実施形態による細胞培養ユニットの使用を介した組織の血管形成を示す概略図を提供する。 細胞培養最適化試験の結果を提供する。図１７ａ～１７ｃは、培地の種類および介入による、５日目までの各発生日における静的培養条件下での胚発生を示す。 細胞培養最適化試験の結果を提供する。図１７ａ～１７ｃは、培地の種類および介入による、５日目までの各発生日における静的培養条件下での胚発生を示す。 細胞培養最適化試験の結果を提供する。図１７ａ～１７ｃは、培地の種類および介入による、５日目までの各発生日における静的培養条件下での胚発生を示す。 細胞培養最適化試験の結果を提供する。培地の種類および介入による、５日目までの各発生日における静的培養条件下での胚発生を示す。 細胞培養最適化試験の結果を提供する。図１７ｅは、同じ群内のＤＮＡ修復のパーセンテージを示す。 細胞培養最適化試験の結果を提供する。図１７ｆは、同じ処理群の内部細胞質量を示す。 酸素最適化試験の結果を提供する。図１８ａ～１８ｄは、様々な酸素濃度に曝露されたときの経時的な胚発生の変化を示す。 酸素最適化試験の結果を提供する。図１８ａ～１８ｄは、様々な酸素濃度に曝露されたときの経時的な胚発生の変化を示す。 酸素最適化試験の結果を提供する。図１８ａ～１８ｄは、様々な酸素濃度に曝露されたときの経時的な胚発生の変化を示す。 酸素最適化試験の結果を提供する。図１８ａ～１８ｄは、様々な酸素濃度に曝露されたときの経時的な胚発生の変化を示す。 同じ群内のＤＮＡ修復のパーセンテージを示す。

本発明のいくつかの実施形態を、以下の実施例に記載する。

以下の実施形態に記載の細胞培養マイクロデバイスは、広義には、ユニット担体およびユニットカバーを有する単一の細胞培養ユニット、アレイ担体およびアレイカバーを有する、細胞培養アレイを形成するために係合された繰り返しユニットのアレイ、または、カートリッジ担体およびカートリッジカバーを有する、細胞培養カートリッジを形成するために統合された繰り返しユニットのカートリッジ、から構築される。これらの単一の単位、任意の形状もしくは数値の繰り返し単位のアレイ、または任意の形状もしくは数値の繰り返し単位のカートリッジとしてのいずれかの形態を採りうるとき、それらは各々、以下で広義に「担体」および「カバー」と称される。

当業者であれば、「担体」および「カバー」実施形態をユニットによるフォーマット、アレイに係合することができるフォーマット、および複数の「担体」または「カバー」を一体的に含むフォーマット、で製造する利点を理解するであろう。これらのフォーマットのうちの１つを、以下の実施形態のそれぞれにおいて参照し得るが、特定の状況下では他の形式に置換され得ることが理解されるべきである。

実施例１－細胞培養アレイ
図１は、アレイ担体１２０上に配置されたアレイカバー１１０を有する組み立てられた細胞培養アレイ１００を示す。図１は、並べて配置された５つの繰り返し細胞培養ユニット１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃ、１３０ｄ、および１３０ｅを有する直線的な細胞培養アレイを示す。直線的なアレイカバー１１０は、各ユニットカバーが、アレイカバー１１０の上部外部にわたって平坦な表面を形成し、各ユニットカバーの間にわずかな溝を有して次のユニットカバーに隣接するよう構成されている。カバーは、長方形の平面状の上部壁１４０を含む４つの壁から形成され、それは、上部壁１４０から９０度下向きに延在するよう形成された、平面状の左端壁１５０（図示せず）および平面状の右端壁１６０のいずれかの端部で終端する。一連の環状開口部１７０は、上部壁の長さにわたって上部壁１４０を通過するよう形成され、１つの開口部は、各ユニットカバーの上部壁を通通過するよう形成される。左端壁１５０（図示せず）および右端壁１６０は、左ベースフランジ１８０（図示せず）および右ベースフランジ１９０とともに、それらの底縁部において終端する。

左ベースフランジおよび右ベースフランジは、ロボット装置、培養皿、追加の細胞培養ユニットもしくは他の実験装置などの他の構成要素と係合するよう構成されていてもよく、またはそれらは、図１に図示されるように、細胞培養アレイ１００に上に置かれたときに単純に安定性を提供するよう構成されていてもよい。

上部壁、左端壁、および右端壁に加えて、アレイカバー１１０は、前壁をさらに備える。図２は、アレイカバー１２０の前壁２００を図示する。アレイカバー１２０の長方形の平面状の前壁２００は、上部壁１４０から約９０度下向きに延在し、左端壁１５０の前縁部と右端壁１６０の前縁部との間に延在する。前壁２００の下縁は、左端壁１５０の下縁および右端壁１６０の下縁と水平である。前壁２００内の垂直溝２１０は、次からの１つのユニットカバーを画定し、アレイカバーを通って延在して上壁内に連続する溝を形成する。一連の環状開口部２２０ａ、２２０ｂ、２２０ｃ、２２０ｄ、および２２０ｅは、１つの開口部が各ユニットカバーの前壁を通過するよう形成されるため、上部壁の幅にわたって前壁２００を通過するよう形成される。各環状開口部は、前壁の表面から突出する環状コネクタ２３０によって画定される。環状コネクタは、任意の数の異なる装置と接続するよう構成され得るが、最も一般的には、シリコンチューブによって流体のシールを生成できる単純なシリコンチューブコネクタである。

図３は、アレイ担体２５０が内部に位置決めされたアレイカバー１００の開放された背面を示す。アレイカバー内の各ユニットカバー間の垂直溝２１０は、内壁２６０間のアレイカバーを通って延在し、アレイカバー内の各ユニットカバーの形態を完成させる。図３に示されるように、各ユニットカバーを形成する内壁２６０は、ユニット担体とユニットカバーとの間のギャップを最小限に抑えるために、隣接するユニット担体との間の空間を埋めるような成形または形成され、その結果、ユニットカバーの形状は、ユニット担体の摺動的な配置を誘導することができ、また、各ユニットカバーの外壁表面との間のギャップを最小限にすることができる。アレイ内に形成されるとき、この構成の繰り返しを設けることにより、アレイ担体の各ユニット担体が、アレイカバーに関して所望の位置に容易にスライドし、その内部に確実に配置されることを確保する。

スライド機構２７０は、各ユニットカバー壁の下縁に設けられ、それにより１つのユニットカバーを次のユニットカバーと可逆的かつ確実に接続し、アレイカバーを形成する。スライド機構は、個々の細胞培養ユニットをアレイの形態で組み立てることができるだけでなく、また、培養中の細胞の（不必要な取り扱いから生じる）破壊または干渉を最小限に抑えつつ、ある細胞培養を別の細胞とは異なる方法で取り扱うことができるように、互いに容易に分離することができる。

図４および５は、細胞培養アレイのベースを示し、図４は斜視図による、図５は直接図による図示である。図は、アレイ担体の底面の構成を示し、個々のユニットカバーの内壁およびベースフランジ、すなわち左ベースフランジ１８０および右ベースフランジ１９０、の形状を示す。スライド機構２７０は、個々のユニットカバーの内壁の一部のみを通って延在する。

図６、７、および８は、アレイカバーおよびアレイ担体を別々に並べて示し、それぞれ上面斜視図、背面斜視図、および底面斜視図を提供する。図６を参照すると、アレイ担体１２０は、５つの繰り返しユニット担体２８０ａ、２８０ｂ、２８０ｃ、２８０ｄ、および２８０ｅを並べて配置した直線的な細胞培養アレイ担体から形成される。各ユニット担体は、ユニット担体の外側前面から突出する培地入口２９０と、ユニット担体内に形成される細胞クレードル３００と、細胞クレードルとユニット担体２８０の外側との間に形成される誘導チャネル３１０と、を備える。培地入口２９０は、担体内の細胞環境へのまたはそれを通る液体培地（または他の流体）の灌流を可能にする。流体はまた、誘導チャネル３１０を通って担体内の細胞環境から、チャネル出口３２０を通ってユニット担体の外側に流出することができる。図７は、チャネル出口３２０のベース、誘導チャネル３１０の底面、および培地入口２９０によって形成されるアパチュアのアライメントを示す。図７は、明確な視線がこれらの開口部を通して形成されることを示し、したがって、培地入口２９０を通る細胞灌流中に引き起こされる任意の乱流が細胞クレードル３００の細胞成長に影響を及ぼす可能性は低い。

図６および７は、アレイ担体１２０の培地入口２９０に対する、アレイカバー１１０の環状コネクタ２３０の相対サイズを示す。培地入口２９０の外面は、環状コネクタ２３０の内面よりもわずかに小さいように構成されている。したがって、アレイカバーがアレイ担体上にスライドすると、培地入口２９０の外面は、環状コネクタ２３０の内面にかなり密接に適合することができる。流体は、それによって、流体の漏れがこれらの接触点を通過することなく、環状コネクタおよび培地入口を通過し得る。

図６および８は、アレイ担体１２０に対してアレイカバー１１０を通る環状開口部１７０の配置を示す。図８を参照すると、スライド機構２７０は、アレイカバー１１０の個々のユニットカバーの間に位置決めされたランナー３３０からなり、アレイカバー１１０の後部に向かってアレイカバーの個々のユニットカバーの間のギャップ３４０の前に終端するものとしてさらに図示される。アレイカバー１１０のランナー３３０およびギャップ３４０は、ユニット担体１２０上のスライダー３５０と係合する。重なり合った方法で配置されるとき、スライダー３５０は、ランナー３３０上でスライドし、個々のユニットカバー間のスライダー３５０のスライドを可能にする空間によって誘導される。スライダー３５０がギャップ３４０に到達するとスライドが停止し、その中で閉鎖位置に置かれ得る。開放位置において、スライダー３５０は、ランナー３３０と接触する。この位置では、環状開口部１７０は、細胞クレードル３００の上に配置され、上からクレードルの中心に卵子または他の細胞を最適に配置するために、細胞クレードル３００の正しい位置に位置決めされる。閉鎖位置では、スライダー３５０は、ギャップ３４０内で移動および停止し、それにより、環状開口部１７０は、誘導チャネル３１０の完全に上に位置し、細胞クレードル３００は上から覆われる。クレードル出口３６０は、図８のアレイ担体１２０にも図示されている。この特徴は任意であるが、提供される場合、細胞クレードルへのさらなるアクセスが可能となり、胚またはその周辺培地の除去または移動が可能になる。

図は、直線的なアレイ構成を示すが、しかしながら、当業者にとって容易に理解できるように、アレイ構成は、５つのユニットを超えて拡張され得、また非直線的なアレイ構成にも容易に適合され得る。例えば、直線的なアレイ構成は、円形アレイに容易に適合され得、これは、自動化またはロボット処理技術により容易に調整可能であり得る。例えば、円形アレイは、顕微鏡または他の可視化装置内に順番に取り付けられたカルーセルに取り付けられ得る。カルーセル配置は、ピペッティング、真空マニホールドの導入、ポンプシステムの導入、または凍結保存プロセスの実施のために、オペレータ、ハンドヘルド装置、またはロボット装置により容易にアクセス可能であり得る。

実施例２－細胞培養ユニット
図９ａおよび図９ｂは、誘導チャネル３１０（図６に示される）の分離における単一の細胞ユニット担体の細胞クレードル３００の構成を図示し、図１０ａおよび図１０ｂは、完全な単一の細胞培養ユニット４００の内部構成を図示する。細胞ユニット担体４００は、長方形の平面状の左側壁４１０および長方形の平面状の右側壁４２０を含む５つの壁から形成され、各壁は、平面の後方出口壁４３０と９０度で結合するようにユニットの後方に向かって終端し、また平面の前方入口壁４４０と９０度で結合するようにユニットの前方に向かって終端する。図９ａおよび９ｂに示す細胞クレードルは、最も広いところで約０．２３ｍｍ、最も高いところで約０．２３ｍｍの測定サイズである。

入口壁４２０の外側前面からの環状突起は、環状コネクタ２３０（図６）の内面直径とほぼ等しい（ただしわずかに小さい）外面直径を有する培地入口２９０を形成する。前方入口壁４４０の内面は、水平的に湾曲し、チャネル出口３２０および誘導チャネル３１０を通して細胞クレードル領域に導入されるピペットが細胞クレードル領域の中心点を水平軸に位置決めすることを可能にする。左側壁４１０、右側壁４２０、および後方出口壁４３０の内面は、通常平坦である。左側壁４１０および右側壁４２０はそれぞれ、特に細胞灌流を実施するために使用されるとき、細胞クレードル３００からの培地のオーバーフローを可能にするためのオーバーフローアパチュア４５０を備える。図９ｂに示すように、オーバーフローアパチュア４５０の最低点は、誘導チャネル３１０の最低点と同じ高さにあり、これは、余分な流体が、誘導チャネル３１０を通過するのではなく、細胞培養ユニットの側面から優先的に細胞クレードル領域から離れて移動することを確保する。

実施例３－細胞カバー
図９ｃは、他の細胞カバーユニットとの直線的なアレイ組み立てのために、および単一の細胞クレードルを収容するために、構成された細胞カバーユニット６００を示す。図は、細胞カバーユニットの各々が無限の拡張性の直線的な配列で互いに係合することを可能にする、「パズルピース」クリップおよびロックシステム６１０ａおよび６１０ｂを示す。図９ｃはまた、細胞カバーユニットの一実施形態を示すが、そこでは、細胞カバーユニットは、細胞培養チャンバにアクセスするためのアパチュアを特徴とせず、むしろ、上から開口部の少なくとも一部分をカバーまたは露出させるための、細胞担体ユニットの内側の摺動可能な係合に依存する点が特徴である。細胞カバーユニットのこの実施形態は、細胞クレードルの入口チャネル４７０と整列するために使用されるノッチ６２０を示す。

図９ｄおよび９ｅは、３次元でアレイを形成するさらなる能力を有する、直線的な細胞カバーカートリッジ７００に一体的に配置された細胞カバーユニットを示す。細胞カバーカートリッジの左右には、後続ユニットとの配向を維持する「パズルピース」クリップおよびロックシステム７１０ａおよび７１０ｂがあり、これらの方向にアレイを形成することができる。またこのシステム７２０ａおよび７２０ｂにおける上の変形も細胞カバーカートリッジの前部および後部に図示するが、それらは、後続のユニットと同様に配向を維持し、アレイがこれらの方向に形成されることを可能にする。細胞カバーカートリッジの上には、その方向の積み重ねを可能にするために、細胞カバーカートリッジの下の反転形状のノッチ７３０ｂに受容されるよう構成されているラグ７３０ａが存在する。

図１０ａおよび１０ｂ（図９ａおよび９ｂ）は、誘導チャネル３１０（図１０ａおよび１０ｂ）から細胞クレードル３００を分割する内壁４６０の配置を示す。内壁４６０は、アレイカバー１２０（またはユニットカバー）が、ユニット担体の上部にわたって平坦になるように、前方入口壁４４０、左側壁４１０、右側壁４２０、および後方出口壁４３０に対して一貫した高さを維持し、そうでなければ上から開いている。内壁４６０は、そこを通って形成された長手方向入口チャネル４７０を有する。図１０ａおよび１０ｂに示されるように、入口チャネル４７０の最低点は、誘導チャネル３１０のベースのレベルにある。入口チャネル４７０は、ユニット担体の後部に向かっては、誘導チャネル３１０の方向に開き、ユニット担体の前部に向かっては、細胞クレードル３００の内面の方向に開いている。細胞クレードルの内面は、内部で細胞を培養および／または増殖させるための細胞培養キャビティ５１０を画定する。

細胞培養キャビティ５１０のサイズおよび形状は、その中に含まれる胚の物理的安定性を確保するために発生後の胚の最大サイズによって規定される。細胞クレードル３００のサイズは、約０．２３ｍｍ×０．２３ｍｍである。細胞クレードルを画定する表面の形状は、通常、細胞塊の一般的な形状に適合するよう丸みを帯びている。特に、壁の各々は、より丸みを帯びた内部形状を細胞クレードル３００に与えるよう下向きテーパー状である。

細胞培養キャビティ５１０の位置は、灌流流体の流れから離れている。培地入口、後方出口壁、誘導チャネル、長手方向出口チャネル、およびオーバーフローアパチュアによって画定されるアパチュアは、通常、水平に整列し、流体経路を画定する。細胞培養キャビティの位置は、流体経路よりも低く、これは、細胞クレードル内の細胞が液体培地に浸漬された状態を維持し、また流体経路に沿った流れによって物理的に撹乱されるか、または他の方法で破壊されないことを確保する。細胞培養キャビティの壁は、細胞クレードルベース５２０の位置で終端し、それは通常水平面に形成され、培地入口、後方出口壁、誘導チャネル、長手方向出口チャネル、またはオーバーフローアパチュアによって画定されるアパチュアよりも低い。細胞クレードルベース５２０はまた、細胞クレードル出口５３０を有し、それは使用中に閉鎖されているが、細胞クレードル３００内から流体を排出するために開放され得る。

図１０ｃは、細胞担体ユニット８００の特徴の代替的な実施形態を図示し、それは、狭い誘導チャネル８１０、丸みを帯びたチャネル入口８２０、および三角のフットプリント細胞培養チャンバ８４０を備える。狭い誘導チャネル８１０および丸みを帯びたチャネル入口８２０は、連動して機能して、器具が、狭い誘導チャネルを通じて移動または出ることなく、依然として、狭い誘導チャネルを通って移動するときに器具を視認することを可能にしつつ、細胞培養チャンバ８４０に誘導し、挿入することを可能にする。細胞培養チャンバ８４０の三角形のフットプリントは、湾曲した近位壁を必要とせずに細胞培養チャンバが採り得る他の形状を示す。

実施例４－細胞カバーおよび細胞担体
図１０ｄ、１０ｅ、１０ｆ、１０ｇ、および１０ｈは、実施形態による細胞カバーカートリッジ９００が実施形態による細胞担体ユニット９５０とどのように係合するかを示す。図１０ｄは、細胞担体ユニットを中央カバーユニットに挿入することを可能にする、組み立て前の形態の細胞カバーカートリッジ９００および細胞担体ユニット９５０の背面斜視図を示す。図１０ｄはさらに、上から開いた細胞培養チャンバ９６０、およびそれを通じてアクセスを可能にするよう構成された環状開口部９２０を示す。細胞培養チャンバ９６０のこの実施形態の各側面は、同様に位置決めされたカバーオーバーフローアパチュア９２５を通る細胞培養チャンバからの潜在的なオーバーフローを可能にする、オーバーフローアパチュア９６５を特徴とする。

図１０ｅおよび１０ｇは、第１の位置に部分的に係合した細胞カバーカートリッジ９００および細胞担体ユニット９５０を示し、そこにおいて、細胞培養チャンバ９６０は、細胞の堆積、取り扱い、および回収のために、環状開口部９２０を通して上からアクセス可能であり、誘導チャネル９８０は、上から、およびチャネル入口９７０の両方を介してアクセス可能である。

図１０ｆおよび１０ｇは、第２の位置で完全に係合した細胞カバーカートリッジ９００および細胞担体ユニット９５０を示し、そこにおいて、細胞培養チャンバ９６０は細胞カバーカートリッジ９００によって覆われ、培地入口９９０は細胞カバーカートリッジの前面を通じて露出している。この位置では、オーバーフローアパチュア９６５は、カバーオーバーフローアパチュア９２５と連続しており、オーバーフローがそこを通過することを可能にする。視線は、チャネル入口を通って細胞培養チャンバ９６０内に、および培地入口９９０を通って、維持される。

図１０ａおよび１０ｂに示される担体ユニット４００の外形については、左側壁４１０および右側壁４２０は、約１００度外向きにベース壁４８０に連結されている一方、後方出口壁４３０および前方入口壁４４０は、９０度でベース壁４８０に連結されている。図９ａ、９ｂ、１０ａ、および１０ｂは、ベース壁４８０から突出する左側スライドフランジ４９０および右側スライドフランジ５００を示す。左側フランジ４９０および右側フランジ５００は、別の物体の内部またはその上に、ユニット担体のベースを固定するか、または別の物体の上またはそれを通ってスライドするよう、成形されているか、あるいは構成されている。図１１ａ、１１ｂ、および１１ｃは、アレイカバー１１０内のユニット担体４００の配置を示す。図１１ａは、ユニット担体４００の背面図を提供し、チャネル出口３２０の位置決めを示す。図１１ｂは、ユニット担体４００の正面図を提供し、アレイカバー１１０の環状コネクタ２３０内の培地入口２９０の位置決めを示す。図１１ｃは、ランナー３３０上のスライド係合に位置決めされた、左側フランジ４９０および右側フランジ５００をそれぞれ有するユニット担体４００の底面斜視図を示す。

ある特定の実施形態では、図８に示されるスライダー３５０は、アレイ担体１２０の個々のユニット担体が個々のユニット担体に（専用ツールを用いてまたは用いずに）スナップまたは分解されることを可能にするように弱められ得る。アレイ担体１２０がこのようにして個々のユニット担体に分解されるよう構成されている場合、アレイは、分解時に左側フランジおよび右側フランジを提供するよう構成されている。

個々の細胞培養担体またはユニット担体をアレイから分離する能力は、凍結保存のための細胞の処理において利点をもたらし得る。例えば、個々のユニットは、細胞へのさらなる物理的操作なしに、アレイからユニットを分離した後に、凍結保存のために担体内で調製され、アリコートとして保存され得る。

上記細胞培養アレイの小バッチの製造は、生体適合性高分子材料を用いた３Ｄプリント技術を使用して実施できる。ある特定のポリマーは、プリント可能な生体適合性材料であることが示されており、例えば、ナノスクライブポリマーまたは結晶性ポリスチレン等は、凍結保存用に調製されたときに破砕耐性を有することが示されている。

実施例５－細胞培養アレイの使用
本明細書に記載される実施形態は、任意の種類の細胞培養に使用され得るが、特に哺乳類細胞株の培養において用途を見出し得る。本明細書に記載の実施形態は、胚発生を伴う細胞培養に特に有用であり、それにより、ＩＶＦ手順におけるそれらのその後の使用に特に有用である。

実施形態はまた、培養中の細胞の一般的な細胞培養、静的灌流、または動的灌流のためにも使用し得る。

図１２に示すように、単一の細胞培養ユニットをアレイ構成の外で個別に使用し得る。単一のシリコンチューブを、環状コネクタを介してユニットに取り付け得、それは必要に応じて、ユニットを配置または位置決めするために使用し得る。顕微鏡検査中に細胞を観察するために、またはマイクロピペットなどを使用してそれらを操作するために、ユニットを所定の位置に固定するために、チューブを使用し得る。チューブを使用して、静的または流動的であり得る液体培地内においてユニットの位置を固定し得る（例えば、より大きな容器内の培地中で、ユニットを保持し、継続的に灌流または補充し得る）。また、チューブをポンプまたは真空マニホールドに接続して、細胞培養ユニットを通じて流体を強制的に流し、その中に維持される細胞培養流体を灌流し得る。

図１３に示すように、アレイ内に５つの細胞培養ユニットを有する細胞培養アレイにおいて、内径１００μｍのシリコンチューブを、５つの細胞培養ユニットのうちの３つに取り付けた。各ユニット担体を介した培地の灌流は、細胞培養培地を３つの単位のそれぞれに通すことによって行ったが、他の２つのユニットは灌流しなかった。

図１４は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）取り付けアセンブリ内に細胞培養アレイを保持するためのアセンブリを提供する。このアセンブリのバリエーションは、自動化または他の装置内に細胞培養アレイを取り付けるために、例えば、レーザー、ピエゾ注入、マイクロポンプ、視覚的に「訓練された」ロボット装置、または細胞培養中に胚培養士による手技介入を減少または排除し得る他の装置の使用者のための、取り付けアセンブリを適合させるために、採用され得る。

図１４に示されるアセンブリは、図１２および１３に示される細胞培養アレイまたは細胞培養ユニットを内部に取り付けるための３５ｍｍ径×１ｍｍ厚のガラスディスクを有するペトリ皿ベースを保持する。ペトリ皿は、その上の図１２および１３のシリコンチューブを維持するように特に適合され得、またはそれらは単に所定の位置にクランプされ得る。ペトリ皿には、１２ｍｍまたは２５ｍｍの円形カバースリップを収納できる特別なマウントが取り付けられており、高ＮＡ反転光学顕微鏡を使用できる。アセンブリは、アレイまたはユニット内で維持された細胞を、ペトリ皿で培養し撮像することを可能にする。

図１４に示される閉鎖された組み立て体は、閉鎖された流体細胞クランプ上のペトリ皿のための継手を提供する。クランプは、膜ネジ付き（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｈｒｅａｄｅｄ）クランプに対して密封され、閉鎖された流体細胞皿上に固定される。皿への入口および出口アクセスは、閉鎖された流体細胞皿を通って提供されるポートプラグおよび入口／出口チューブを介して提供される。アセンブリは、閉鎖された流体細胞皿とガラスディスクとの間にＯリングを取り付けることによって、ＡＦＭに取り付けられたネジ付きボトムクランプに対して密封される。当業者であれば、追加のＯリングの交換または使用、または組み立てツール、ピンセット、およびクリーニングブラシの使用が、マウントを適切に実施するために必要であることは周知である。

細胞培養アレイは、ペトリ皿、顕微鏡スライド、または他の培養プレートに加えて使用するように設計されている。それはこれらのデバイスを置き換えるものではないが、これらの既存の培養デバイスとともに、そのようなデバイス内の細胞または細胞凝集体を位置決めし、細胞（複数可）を撹乱することなく細胞または細胞凝集体を取り扱い、細胞（複数可）をより容易に操作し、細胞（複数可）を保管するために使用される。上述のアセンブリは、あくまで例示であり、当業者によって特定の用途に容易に適合され得る。例えば、特定のユーザが、ペトリ皿の代わりに上述のアセンブリ内に容易に配置できるスライド上にマイクロデバイスを配置することを好むこともあり得る。

図１４のアセンブリを、封入され密封されたアレイの灌流のための灌流アセンブリに実装した。アクセスポートを使用し、シリンジ注入、重力供給、およびマイクロポンプシステムを介したアレイ灌流を行い、流体およびガス交換を行った。ＡＦＭマウントは、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）の有無による受精に加えて、タイムラプス顕微鏡検査、胚培養（灌流の有無にかかわらず）、およびガラス化にも採用し得る。ポリマー、使用材料、および特性（デバイスは、Ｎａｎｏｓｃｒｉｂｅ ＧＴ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｍａｃｈｉｎｅ （Ｎａｎｏｓｃｒｉｂｅ ＧｍｂＨ， Ｇｅｒｍａｎｙ）でマイクロファブリケーションした）。

実施例６－インビトロ試験のデザイン
すべての実験はアデレード大学動物倫理委員会（Ｍ－２０１９－００８）によって承認され、科学的目的のための動物の管理および使用のためのオーストラリアの行動規範（Ｔｈｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ）に従って実施された。９～１１ｇの思春期前のＣＢＡｘＣ５７Ｂｌ／６Ｆ１ハイブリッドおよびスイスアルビノメスマウス（３～４週齢）を、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（アデレード大学、オーストラリア）内に収容し、制御された温度、１２時間の夏時間サイクル（１２時間の明期：１２時間の暗期）、水および飼料の自由摂取下に置いた。

思春期前の雌マウスに５ＩＵのウマ絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ；Ｆｏｌｌｉｇｏｎ，Ｉｎｔｅｒｖｅｔ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を腹腔内投与し、４７時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ；Ｈｕｍａｇｏｎ，Ｏｒｇｅｎｏｎ）を腹腔内投与してマウスを誘発し、過剰排卵させた。

次いで、同じ系統の雄とマウスを交配させ（１雄：１雌）、交配栓を翌日の朝にチェックした。ｈＣＧ投与の２２時間後、マウスを頸部脱臼によりカリーニングし、推定接合子をアンプラから採取し、各処理群にランダムに割り当てた。

試験に使用（胚洗浄および分裂培地を含む）した培地は、ＡＲＴ Ｌａｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ａｄｅｌａｉｄｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から調達した。

マイクロファブリケーションデザインは、ＣＡＤにより開発し、製造業者が推奨するポリマー、材料、および設定を使用して、Ｎａｎｏｓｃｒｉｂｅ ＧＴ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ （Ｎａｎｏｓｃｒｉｂｅ ＧｍｂＨ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してマイクロファブリケーションした。

すべての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して行った。統計分析を行って、以下に記載されるように、標準的な胚培養における胚発生と、Ｇａｒａｇｅ内にドッキングしたＰｏｄ内の標準培養における胚発生とを、他の変数の存在下で比較した。パラメトリック試験とノンパラメトリック試験のどちらを用いるべきかを決定するために、最初に正規性試験を実施した。群間の平均値の差異の統計学的有意性は、正規分布データについては不対ｔ検定を、非正規分布データについてはＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を、用いて評価した。＜０．０５（未満）のＰ値を有意差とみなし、１０％の差を生物学的有意差とみなした。

実施例７－安全性の予備的分析
Ｎａｎｏｓｃｒｉｂｅによって提供され、細胞培養アレイおよびユニットを構築するために使用される３Ｄプリント可能なポリマーの毒性を調査し、胚発生へのその潜在的な影響を決定するために予備実験を行った。

以下の表は、処理後１日目（接合子）および２日目（２細胞）胚～５日目（胚盤胞）の胚発生の分析の反復第１回目の結果を示す。

以下の表は、胚発生の分析の反復第２回目の結果を提供する。

以下の表は、胚発生の分析の反復第３回目の結果を提供する。

さらに、４つの担体ユニットを２つのアレイ担体に挿入する試験を行った。胚培養を、２０μＬの分裂培地中で行った。超刺激に由来し、４週齢の雌性Ｆ１ ＣＢＡｘＣ５７Ｂｌ６マウスと交配させたマウス胚を、接合子から２細胞期まで、２４時間培養した。接合子を、４つの反復にて、胚盤胞になるまで４日間にわたって培養し、各々１群あたり４０回の複製を行わせた結果、担体ユニットで培養した細胞とペトリ皿で培養した細胞との間で生存率に統計学的に有意な差が示されなかった。

３Ｄプリンターのポリマーの毒性試験の結果を図１５ａに示すが、ここでは分裂胚からのＣＢＡＦ１マウス胚への発生率のパーセンテージを示す。簡潔に述べると、１０個の胚を、２０μＬの分裂培地中で培養した。処理群については、３Ｄ印刷技術を用いて製造した、２つのアレイカバーおよび２×５個のユニットアレイとして構成された１０個のユニット担体を備える装置で胚を培養した。１０個の胚を、２０μＬの分裂培地の滴内に配置した。培養液をパラフィン油で覆った。

群１に割り当てられた胚を、新鮮な分裂培地中で培養した（対照）。群２の胚を、事前に１０個のＰｏｄおよび２個のＧａｒａｇｅに曝露した分裂培地中で培養した。群３の胚を、新鮮な分裂培地で培養し、培養液１滴当たり１０個のＰｏｄおよび２個のＧａｒａｇｅで共培養した。群４の胚を、新鮮な分裂培地で培養し、１滴当たり１０個のＰｏｄおよび２個のＧａｒａｇｅと共培養した。

分裂胚からのＣＢＡＦ１マウス胚発生の割合を図１５ｂに示す。胚培養を、１０μＬの分裂培地中で行った。対照処理群に割り当てられた胚を標準的な培養条件下で培養し、試験処理群に割り当てられた胚を、ＧａｒａｇｅにドッキングしたＰｏｄ内の標準的な培養条件下で培養した。試験処理培養群は、１滴当たり５個のＰｏｄおよび１個のＧａｒａｇｅを有した（平均値±ＳＥＭ）。

ＣＢＡＦ１マウス胚発生におけるＤＮＡ修復の割合を、対照および試験処理群内の胚盤胞のγＨ２Ａ．Ｘ ＤＮＡ修復染色後の図１５ｃに示す。対照処理群に割り当てられた胚を標準培養条件下で培養し、治験処理群に割り当てられた胚を、ＧａｒａｇｅにドッキングしたＰｏｄｓ内の標準培養条件下で培養した（平均±ＳＤ）。

すべての試験において、処理群において有意差は観察されなかった。製造に使用した材料では毒性は示されず、マイクロデバイスの安全性の可能性が示された。

実施例８－細胞培養ユニット内の胚培養条件の最適化
図１６は、実施形態による、細胞培養ユニットの使用を介して達成可能な組織の血管形成を示す概略図を提供する。最適な条件下では、細胞培養チャンバ内でオルガノイドが正常に発達することが期待される。マトリゲルコーティングでコーティングされたチャンバは、接着細胞の増殖を促進するための足場環境を提供する。細胞塊の定方向性の直線的な成長が、細胞培養チャンバと外部環境との間のさらなるアパチュアを通して提供される。ユニット担体とユニットカバーを通るアパチュアの配置とサイズは、血管形成を促進してインサイチューでの成長をサポートする観点から選択される。これらは、細胞型およびオルガノイド型に依存し、当業者によって決定され得る。

胚発生のための細胞培養条件を最適化した。最適な培養培地および混合空気を、他の条件の最適化に適合され得る方法を使用して決定した。最適化された細胞培養条件は、他の細胞型の増殖に対しても転用可能であると予想される。推定接合子を採取し、５つの処理群にランダムに割り当てた。胚発生を観察し、毎日記録した。

胚を５つの群に割り当て、それぞれ異なる培養培地の処理を受けた。群１に割り当てられた胚の場合、時間通りに発生した胚を、同じ皿内で新鮮な分裂培地の滴に移動させた。群２の胚では、分裂培地に入れ、次いで、３日目に新しい分裂培地の滴を用いて新鮮な皿に移動させた。群３の胚では、Ｇ１＋培地に配置し、生存胚を、同じ皿内の新鮮なＧ１＋培地へ移動させた。群４の胚では、Ｇ１＋培地中に配置し、次いで、３日目に新鮮なＧ１＋培地へ移動させた。群５の胚では、Ｇ１＋培地で培養し、次いで、Ｇ２＋培地の滴を用いて新鮮な皿に移動させた。胚培養は、加湿させたオーブンスタイルの従来型のインキュベーターで、６％ＣＯ_２、５％Ｏ_２、および３７℃の温度で行った。

ペトリ皿に油を重層した標準的な１０μＬ培養液中で培養した胚の胚発生の結果の内訳パーセントを図１７に示す。群１の胚では、ＡＲＴ Ｌａｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓの胚分裂培地で、１日目から５日目まで培養した。群２の胚では、１日目から３日目までＡＲＴ Ｌａｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ胚分裂培地中で培養し、次いで、胚を新鮮なＡＲＴ Ｌａｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ胚分裂培地に移動させ、５日目まで培養した。群３の胚では、１日目から５日目まで、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地中で培養した。群４の胚では、１日目から３日目までＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地中で培養し、次いで、胚を新鮮なＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地に移動させ、５日目まで培養した。第５群の胚では、１日目から３日目までＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地中で培養し、次いで、新鮮なＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ２＋培地に移動させ、５日目まで培養した。

胚発生を毎日記録し、各処理群の胚発生パーセンテージを図１７に示す。図１７ａは、１日目から２日目までの胚発生のパーセンテージを示し、図１７ｂは、１日目から４日目までの胚発生のパーセンテージを示し、図１７ｃは、１日目から５日目までの胚発生のパーセンテージを示す（平均±ＳＤ）。５日目までに、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地、続いて３日目からのＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ２＋培地で培養した胚は、顕著な発生の改善が示された。

図１７ｄは、細胞を細胞ユニット担体内で培養し、細胞ユニットカバーによってカバーした、さらなる試験の結果を提供する。群１の胚では、１日目から５日目まで、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地中で培養した。第２群の胚では、１日目から３日目までＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地中で培養し、次いで、胚を新鮮なＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地に移動させ、５日目まで培養した。第３群の胚では、１日目から３日目までＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地中で培養し、次いで、新鮮なＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ２＋培地に移動させ、５日目まで培養した。図１７ｄは、細胞が本発明によるデバイス内で培養されたときの各処理群の１日目から５日目までの胚発生の％を示す。

図１７ｅは、ペトリ皿中で油を重層した標準的な１０μＬ培養液中で培養した胚におけるＤＮＡ修復を示すγＨ２ａ．ｘ染色の強度パーセンテージを示す（対照はインビボ胚盤胞とした）。群１の胚では、ＡＲＴ Ｌａｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓの胚分裂培地で、１日目から５日目まで培養した。群２の胚では、１日目から３日目までＡＲＴ Ｌａｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ胚分裂培地中で培養し、次いで、新鮮なＡＲＴ Ｌａｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ胚分裂培地に移動させ、５日目まで培養した。群３の胚では、１日目から５日目まで、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地中で培養した。群４の胚では、１日目から３日目までＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地中で培養し、次いで、新鮮なＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地に移動させ、５日目まで培養した。群５の胚では、１日目から３日目までＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地で培養し、次いで、新鮮なＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ２＋培地に移動させ、５日目まで培養した（平均±ＳＤ）。

図１７ｆは、ペトリ皿で油を重層した標準的な１０μＬ培養液滴で培養した胚における、総細胞数（ＴＣＮ）に対する内細胞質量（ＩＣＭ）のパーセントを示す（対照はインビボ胚盤胞とした）。群１の胚では、ＡＲＴ Ｌａｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓの胚分裂培地で、１日目から５日目まで培養した。群２の胚では、１日目から３日目までＡＲＴ Ｌａｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ胚分裂培地中で培養し、次いで、新鮮なＡＲＴ Ｌａｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ胚分裂培地に移動させ、５日目まで培養した。群３の胚では、１日目から５日目まで、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地中で培養した。群４の胚では、１日目から３日目までＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地中で培養し、次いで、新鮮なＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地に移動させ、５日目まで培養した。群５の胚では、１日目から３日目までＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地で培養し、次いで、新鮮なＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ２＋培地に移動させ、５日目まで培養した（平均±ＳＤ）。

同じ培地中で移動させなかったものと比較し、胚を移動させたすべての処理群では、ＤＮＡ修復および内細胞質量のパーセンテージが改善された。ＤＮＡ修復および内細胞質量のパーセンテージのいずれについても、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地、続いてＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ２＋培地で培養した胚は、３日目にＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地に移動させた胚よりも改善が示された。

Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地、続いてＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地で培養した胚で観察された不十分な発生は、細胞ユニット担体および細胞ユニットカバー内で培養した胚に同じ介入を配置したさらなる試験を行うことによって解決した。Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１＋培地、続いてＶｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ２＋培地では依然として最適な増殖培地条件を示したが、細胞ユニット担体および細胞ユニットカバー内で培養された細胞は、培地変化なしよりも培地変化を行った場合に改善を示した。結果は、細胞ユニット担体および細胞ユニットカバーが、同じ培地を５日間の成長期間にわたって維持することによる不十分な成長を改善したことを示す。

ペトリ皿に油を重層した標準的な１０μＬ培養液中で、６％ＣＯ_２、５％Ｏ_２、８９％Ｎ_２、または６％ＣＯ_２、２０％Ｏ_２、７４％Ｎ_２のいずれかの混合空気下、および３７℃の加湿条件下で培養した胚の胚発生の結果の内訳のパーセントを、図１８ａ～１８ｄに示す。図１８ａは、１日目から２日目までの胚発生のパーセンテージを示し、図１８ｂは、１日目から３日目までの胚発生のパーセンテージを示し、図１８ｃは、１日目から４日目までの胚発生のパーセンテージを示し、図１８ｄは、１日目から５日目までの胚発生のパーセンテージを示す（平均±ＳＤ）。図１８ｅは、ペトリ皿（対照はインビボ胚盤胞）中で油を重層した標準的な１０μＬ培養液滴で培養した胚における、混合空気中の酸素増加の有無におけるＤＮＡ修復を示す、γＨ２ａ．ｘ染色の強度のパーセンテージを示す。

胚発生のパーセンテージは、５％Ｏ_２ではなく２０％Ｏ_２で胚を培養した場合、５日目までにわずかな減少を示したが、この結果は、すべての培養日を通じて一貫していたわけではなかった。しかしながら、ＤＮＡ修復の割合は、細胞を２０％Ｏ_２の存在下で培養した場合、５日目までに顕著な改善を示した。

これらの結果は、細胞が発生中に撹乱されたときに受けた外傷にもかかわらず、培養培地の補充が、培養細胞の増殖および生存能において有意な改善をもたらすことを示す。この改善は、新鮮な培養培地を導入するために連続灌流を採用することによって、またさらに、灌流中に細胞が障害されないときに、増加することが予期される。発生および生存可能性の不整合に関する経時的な結果は、各成長段階における発生中の胚の様々な要求性を反映する。最適化された成長培地の存在下での静的灌流および成長段階毎の異なる培養条件は、さらに成長の結果を改善することが期待される。

本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの活用形は、記載された要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を包含することを意味するが、任意の他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の除外を意味するものではないことが理解されるであろう。

本明細書に記載される装置の様々な装置および構成要素は、必要に応じて様々なサイズおよび／または寸法で提供され得る。適切なサイズおよび／または寸法は、当業者によって選択され得る接続コンポーネントの仕様または使用分野に応じて変化するであろう。

本開示の一実施形態に関して説明される性質、要素および／または特徴は、必要に応じて本発明の他の実施形態とともに使用され得ることを理解されたい。

本開示の好ましい実施形態は、例示を目的として開示されているが、当業者であれば、本開示および添付の特許請求の範囲の範囲および趣旨から逸脱することなく、様々な修正、追加および置換が可能であることを理解するであろう。

要素または層が、別の要素または層上にある、または別の要素または層内にあると称される場合、その要素または層は、別の要素または層、または介在する要素もしくは層の、上に直接、またはその中、に存在することができることが理解されるであろう。対照的に、要素が別の要素または層上に「直接」または「直接内にある」と称される場合、介在する要素または層は存在しない。

本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、関連する列挙される項目のうちの１つ以上のいくつかおよびすべての組み合わせを含む。

第１、第２、第３、等の用語は、様々な要素、構成要素、領域、層、および／またはセクションを説明するために本明細書で使用され得るが、これらの要素、構成要素、領域、層、および／またはセクションは、これらの用語によって限定されるべきではないことが理解されるであろう。これらの用語は、１つの要素、コンポーネント、領域、層、またはセクションを、別の領域、層、またはセクションから区別するためにのみ使用される。したがって、第１の要素、構成要素、領域、層またはセクションは、本開示の教示から逸脱することなく、第２の要素、構成要素、領域、層またはセクションとも称され得る。

「下部」、「上部」、「上部」、「下部」、「左」、「右」などの空間的に相対的な用語は、図に示されるように、ある要素または特徴と別の要素または特徴（複数可）との関係の説明上、説明を容易にするために本明細書で使用され得る。空間的に相対的な用語は、図面に示される配向に加えて、使用または動作中の構造の異なる配向を包含することが意図されることが理解される。例えば、図示されるデバイスが裏返された場合、他の要素または特徴に対して「より低い」と記載された要素は、それにより、他の要素または特徴に対して「上部」に配向される。したがって、例示的な用語「低い」は、上方および下方の配向の両方を包含することができる。デバイスは別の方法で配向されてもよく（９０度回転されてもよく、または他の配向で回転されてもよく）、本明細書で使用される空間的に相対的な用語は、それに応じて解釈されるべきである。

本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本開示を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の形態も同様に含むことが意図される。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および／または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用される場合、明記された特徴、整数、ステップ、操作、要素、および／もしくは構成成分の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、構成成分、および／もしくはそれらの群の存在もしくは追加を排除するものではないことをさらに理解されたい。

発明の詳細な説明中の実施形態は、本明細書において、例えば、説明の好ましい実施形態（および中間構造）の概略図である図および／または断面図を参照して説明される。したがって、例示される形状とは異なる、例えば製造技術および／または許容差の結果としての変形が予想される。したがって、説明の実施形態は、本明細書に例示される構成要素の特定の形状に限定されると解釈されるべきではなく、例えば製造上生じる形状の逸脱が包含されるべきである。

別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本明細書が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。一般的に使用される辞書で定義される用語などの用語は、関連する技術分野の文脈においてそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書において明示的に定義されない限り、理想化されたまたは過度に形式的な意味で解釈されるべきではないことがさらに理解されるであろう。

本明細書における「一実施形態」、「ある実施形態」、「例示的な実施形態」などへの任意の言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、発明の詳細な説明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。本明細書の様々な場所でのそのような語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を参照しているわけではない。さらに、特定の性質、構造、または特徴が任意の実施形態との関連から記載されるとき、かかる特徴、構造、または特性を、その他の実施形態との関連から活用および／または使用することは、当業者の技量の範囲内である。

実施形態は、上記に開示された要素のうちのいずれかまたはすべてを使用する方法および製造する方法を含むか、あるいは網羅することを意図している。

本発明を、特定の実施形態に関して上記で説明したが、本発明は、これらの開示された実施形態に限定されないことを理解されたい。本開示の教示を読むことにより、本発明の多くの修飾および他の実施形態が、本発明に関連し、本開示および添付の特許請求の範囲の両方によって意図され、および網羅されることが、当業者には理解されるであろう。

本明細書において言及されるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文献、行為、材料、デバイス、物品等に関するいずれの考察も、本発明に対する前後関係を提供することのみを目的とする。これらの事項のいずれかまたはすべてが、本出願の各請求項の優先日以前にオーストラリアまたは他の国に存在したという理由から、従来技術の基礎の一部を形成していること、または本発明に関連する分野における一般的な知識であったこと、を認めるものではない。

本発明の範囲は、本明細書および添付の図面における開示に基づき当業者によって理解されるように、添付の特許請求の範囲の適切な解釈および構築、ならびにそれらの法的均等物によって決定されるべきであることが実際に意図される。

引用文献
１．Ｄａｔａ ｏｎ ＩＶＦ ｃｌｉｎｉｃｓ ｓｈｏｗ ｗｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ，ＢＭＪ ２００２；３２５ ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１３６／ｂｍｊ．３２５．７３６２．４６０／ｅ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ３１ Ａｕｇｕｓｔ ２００２）．

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Claims (16)

1. 内部において細胞を維持および培養するための細胞培養マイクロデバイスであって、
   内部に形成された細胞培養チャンバを画定する少なくとも１つの第１の細胞担体ユニットを有する細胞培養ユニットを備え、
   前記第１の細胞担体ユニットが、少なくとも、
   上部に前記細胞を担持するように成形されたチャンバベースと、
   チャンバ境界の周りで前記細胞培養チャンバを囲む１つ以上のチャンバ壁面を有する１つ以上のチャンバ壁と、から形成され、
   前記第１の細胞担体ユニットが、前記細胞培養チャンバに器具または流体を誘導するための、チャンバ壁を通過するアパチュアに位置決めされた誘導面をさらに提供し、
   前記細胞培養マイクロデバイスが、単一の細胞または細胞塊をその内部に実質的に囲むスケールで構成されている、細胞培養マイクロデバイス。
2. 前記１つ以上のチャンバ壁が、前記チャンバの近位点に向かって傾斜した１つ以上の内壁面を含み、前記培養チャンバ内の器具または細胞の配置を誘導するよう構成されている、請求項１に記載の細胞培養マイクロデバイス。
3. 前記細胞培養チャンバが、上方から開放され、前記チャンバベースが、湾曲した内面を備える、請求項１または２に記載の細胞培養マイクロデバイス。
4. 前記１つ以上のチャンバ壁が、近位壁と、遠位壁とを備え、
   前記近位壁は、前記培養チャンバ内への器具の前記配置を誘導するよう構成された、湾曲した内壁面を有しており、
   前記遠位壁は、遠位チャンバ境界を画定するものであり、かつ、チャンバ壁を通過するよう形成された前記アパチュアを有しており、前記アパチュアが、前記細胞培養チャンバから外向きに突出して前記細胞培養チャンバに器具または流体を誘導する前記誘導面を提供する内部に形成されたチャネルを有する細長い誘導部分と連通して開口部を画定する、請求項１または３に記載の細胞培養マイクロデバイス。
5. 前記１つ以上のチャンバ壁が、少なくとも左側壁および右側壁を備え、それぞれが、それを通過するよう形成された左側アパチュアおよび右側アパチュアを有する、請求項４に記載の細胞培養マイクロデバイス。
6. 前記近位壁が、それを通過するよう形成された近位アパチュアであって、前記誘導面と水平に整列して構成されて、前記アパチュアと前記近位アパチュアとの間の前記細胞培養チャンバを通る前記流体の流れを緩和する、近位アパチュアを有する、請求項２または４に記載の細胞培養マイクロデバイス。
7. 前記近位壁が、それを通過する流体灌流に適合された灌流入口開口部と、灌流チューブを前記灌流入口開口部に係合するよう構成されたチューブ継手とを備える、請求項６に記載の細胞培養マイクロデバイス。
8. 前記第１の細胞担体ユニットが、少なくとも１つの第２の細胞担体ユニット上の対応する外壁カップリングと係合するよう適合された外壁カップリングを有する細胞チャンバ壁を備え、それによって細胞担体アレイを形成する、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞培養マイクロデバイス。
9. 前記第１の細胞担体ユニットと一体的に形成され、それによって細胞担体カートリッジを形成する少なくとも１つの第２の細胞担体ユニットをさらに備える、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞培養マイクロデバイス。
10. 第１の細胞カバーユニットであって、前記第１の細胞カバーユニットおよび前記第１の細胞担体ユニットが接続されて細胞培養ユニットベースを形成するとき、前記細胞培養チャンバの前記開口部の少なくとも一部を上から覆うよう構成された第１のカバー壁を有する、第１の細胞カバーユニットをさらに備える、請求項３または９に記載の細胞培養マイクロデバイス。
11. 前記第１の細胞カバーユニットが、少なくとも１つの第２の細胞カバーユニット上の対応する外壁カップリングと係合するよう適合された外壁カップリングを備え、それによって細胞カバーアレイを形成する、請求項１０に記載の細胞培養マイクロデバイス。
12. 前記第１の細胞カバーユニットと一体的に形成され、それによって細胞カバーカートリッジを形成する少なくとも１つの第２の細胞カバーユニットをさらに備える、請求項１１に記載の細胞培養マイクロデバイス。
13. 前記第１の細胞カバーユニットが、それを通過するよう形成されたアクセスアパチュアをさらに備え、前記第１の細胞カバーユニットを通過するよう形成された前記アクセスアパチュアが、第１の位置で前記開口部への上からのアクセスを可能にし、第２の位置で前記開口部の少なくとも一部分を上から覆うよう構成され、前記第１の位置から前記第２の位置まで、前記第１の細胞担体ユニットと摺動可能に係合するよう適合されている、請求項１２に記載の細胞培養マイクロデバイス。
14. 前記チャンバベースの外面が、細胞担体ユニットまたは細胞カバーユニットから外向きに突出するラグを受容するよう構成されたノッチを備える、請求項１～１３のいずれか一項に記載の細胞培養マイクロデバイス。
15. 前記細胞培養マイクロデバイスの前記細胞培養チャンバ内に１つの細胞を簡便に配置するステップと、前記細胞を培養するステップとを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の細胞培養マイクロデバイスの使用方法。
16. 前記細胞培養マイクロデバイスを構築するための指示を取得するステップと、前記指示を付加製造プロセスで実行するステップとを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の細胞培養マイクロデバイスの使用方法。

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