CN113518818B - 细胞培养装置及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞培养装置，其包括至少具有至少一个细胞培养基入口和一个细胞培养基出口的流体通道，所述流体通道包括在所述细胞培养基入口和所述细胞培养基出口之间延伸的下壁，所述细胞培养装置还包括至少一个被配置为接收多个细胞的凹槽以及至少一个细胞阱，所述凹槽由所述下壁形成并限定了一个底表面，所述细胞阱被配置为捕获在流体通道中平流运送的细胞然后使所述细胞沉降到所述凹槽的底表面。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞培养装置和使用该装置的细胞培养方法，所述方法包括在装置中接种、洗涤、取样、分化、转导、扩增和/或收获细胞。根据本发明的装置目的是在同一装置中进行主要的细胞培养步骤，而不需要将培养的细胞转移到所述装置的不同腔室中或转移至所述装置外部的其他外部腔室，以便以高产量生产细胞用于细胞治疗。
背景技术
细胞治疗是一个将功能细胞施用至病人体内的过程。细胞的生产对监管机构、制造商、卫生保健提供者和参与其应用的病人来说是重大挑战，因为它需要从病人身上提取细胞，对细胞进行培养和/或重新编程，并将细胞导入病人体内。
通常，细胞培养至少可以包括在生物反应器中的接种步骤、处理步骤(例如细胞的转导步骤)、增殖或扩增步骤以及收获步骤。出于质量控制的目的，必须定期取样。在常规方法中，细胞通常在细胞培养皿中培养，如Petri培养皿、烧瓶、瓶子或袋子。一般来说，在扩增阶段必须使用多个培养皿，以保持细胞可存活的细胞密度(通常低于汇合密度)。细胞培养皿不适用于细胞环境的微调控制，例如营养物、代谢物和其他驱动分化和扩增的制剂的浓度。因此，使用细胞培养皿时，细胞培养的效率和产量是有限的。此外，在不同培养皿之间处理细胞，以及处理进出培养皿的细胞培养基，都会增加细胞培养污染的风险和细胞培养的成本。
因此，利用微流体技术制造的生物反应器已经被开发出来，以增加细胞培养的产量和/或增加每个步骤的控制和/或研究至少一个所述细胞培养步骤。
EP 3029135 A1描述了一种微流体细胞培养系统，其包括多个培养单元，每个培养单元包括至少一个培养区、一个细胞装载入口和一个培养基通道。培养单元通过在培养基通道与培养单元之间提供流体连接的结构与培养基通道分离，并保护细胞免于从细胞培养区域流出。因此，可以在紧密的空间中培养细胞，并且可以控制与细胞接触的培养基，而无需将细胞移动到不同的生物反应器中。而且，可以在细胞培养区域中维持培养细胞的聚集体。然而，该系统不适用于收获培养的细胞。
WO 2007024701 A3描述了一种适于细胞培养监测的细胞培养微流体装置。所述装置包括微流体通道，所述通道包括多个堰阱(weir-trap)。每个堰阱适于捕获细胞。每个细胞的粘附和分裂可以在微流体通道中的培养基的动态控制下被监测。然而，所述装置不适用于高通量细胞生产：每个堰阱中细胞群的增长仅限于两个细胞。此外，细胞的收获是不可控制的。
Rousset等人(Rousset,N.,Monet,F.,&Gervais,T.,2017,Simulation-assisteddesign of microfluidic sample traps for optimal trapping and culture of non-adherent single cells,tissues,and spheroids.Scientific reports,7(1),245)描述了一种用于非贴壁细胞培养的装置。所述装置包括一个微流体通道，所述通道包括多个凹槽。每个凹槽都适合于捕获单个细胞。当被捕获时，细胞受到凹槽的保护，不会在主流中上升，而营养或药物可以通过扩散从主流中提供给细胞。因此，不需要任何结构将凹槽中的细胞与微流体通道的其他部分分开，从而简化了细胞培养装置的制造。然而，所述装置并不适合于细胞的扩增或生产，因为每个凹槽都适合于捕获单个细胞。
发明内容
一种细胞培养装置已经被开发出来以至少部分地回应了现有技术的上述问题。
所述细胞培养装置具有至少一个限定了平面表面的表面部分，所述表面部分被配置用于平置在一个水平支撑物上，包括至少一个具有至少一个细胞培养基入口和一个细胞培养基出口的流体通道，所述流体通道包括在所述细胞培养基入口和细胞培养基出口之间延伸的下壁，所述细胞培养装置的特征在于，它进一步包括：
-至少一个凹槽，其被配置成接收多个细胞，所述凹槽由所述下壁形成并限定了底表面，和
-至少一个细胞阱(cell trap)，所述细胞阱被配置为捕获在流体通道中流动的细胞，然后使该细胞沉降到所述凹槽的底表面。
所述细胞阱包括障碍物，所述障碍物具有主延伸方向，所述主延伸方向限定了沉降轴，所述沉降轴与所述障碍物内的细胞的沉降方向平行，并且其中所述沉降轴与所述表面部分垂直。
在本发明的其他任选的方面：
-所述下壁还包括延伸到所述凹槽之外的上表面，并且所述障碍物从所述底表面延伸并延伸到所述凹槽之外，超过所述下壁的上表面，
-所述流体通道还包括上壁，并且所述障碍物至少从所述上壁延伸到所述凹槽，
-所述障碍物具有主延伸方向，所述主延伸方向限定了沉降轴，所述沉降轴与所述障碍物内细胞的沉降方向平行，并且其中所述沉降轴垂直于所述表面部分，
-每个障碍物都有一个孔，尤其是一个横穿孔，优选地是一个横穿狭缝，所述孔的宽度在3μm和30μm之间，并且优选地在5μm和20μm之间，
-所述流体通道的至少一部分被配置为根据在所述细胞培养基入口和细胞培养基出口之间延伸的主流方向接收液体流，并且所述流体通道包括细胞阱阵列，所述细胞阱阵列在与所述平面表面平行的平面内沿着与所述主流方向垂直的方向延伸，
-所述流体通道还包括在所述细胞培养基入口和所述细胞培养基出口之间延伸的侧面，其中，至少一个凹槽在所述流体通道的整个宽度上从一个侧面延伸到另一侧面，
-所述下壁还包括在所述凹槽一侧延伸的上表面，并且所述流体通道还包括上壁，所述流体通道的第一高度被限定为所述下壁的上表面与所述上壁之间的较短距离，所述凹槽的第二高度被限定为所述下壁的底表面与所述下壁的上表面之间的较短距离，所述第二高度为所述第一高度的0.15至0.85倍，优选为第一高度的0.20至0.70倍。
-所述下壁还包括在所述凹槽一侧延伸的上表面，并且所述流体通道的第二高度被限定为所述下壁的下表面和所述下壁的上表面之间的较短距离，并且所述第二高度在10μm和500μm之间，尤其在15μm和300μm之间，优选在15μm和200μm之间，
-两个细胞阱之间的最小距离在10μm和300μm之间，尤其在20μm和150μm之间，优选在25μm和100μm之间，
-所述细胞培养装置包括至少一个收获入口和一个收获出口，所述收获入口和收获出口不同于所述细胞培养基入口和细胞培养基出口，所述至少一个凹槽直接与收获入口和收获出口流体连接，
-所述细胞培养装置包括一个入口通道和一个出口通道，所述细胞培养装置包括多个流体通道，每个流体通道至少具有各自的细胞培养基入口和细胞培养基出口，所述入口通道流体连接每个流体通道的细胞培养基入口，并且所述出口通道流体连接每个流体通道的细胞培养基出口。
本发明的另一个方面是一种细胞培养方法，所述方法包括设置所述细胞培养装置，使所述表面部分位于水平支撑物上，并包括注入包含细胞的培养基的接种步骤a)，所述培养基被注入所述细胞培养装置的至少一个流体通道的细胞培养基入口，直到至少超过10％的细胞阱捕获了至少一个细胞，并且优选超过大多数的细胞阱捕获了至少一个细胞。
在本发明的其他任选的方面：
-所述方法在接种步骤a)之后还包括在所述细胞培养基入口注入包含活性培养剂的培养基的扩展步骤b)，其中所述培养基以第一预定流速注入，所述方法在接种步骤a)之后还包括任选的收获步骤e)，其中以预定的第二流速在细胞培养基入口注入培养基并从细胞培养基出口回收细胞，所述第二流速严格高于所述第一流速，所述方法在步骤a)之后还包括任选的取样步骤f)，其中以预定的第五流速在细胞培养基入口注入培养基，并从细胞培养基出口回收细胞样本，所述第五流速严格高于所述第一流速，所述注入时间和第五取样流速是在接种步骤a)之前计算的，以便回收凹槽中不到三分之一的细胞，
-所述方法在接种步骤a)之后还包括在细胞培养基入口处注入洗涤培养基的洗涤步骤c)，其中所述培养基任选地以第三预定流速注入，所述方法在接种步骤a)之后还包括任选的收获步骤e)，其中以预定的第二流速在细胞培养基入口处注入培养基并从细胞培养基出口回收细胞，所述第二流速严格高于所述第三流速，所述方法在步骤a)之后还包括任选的取样步骤f)，其中以预定的第五流速在细胞培养基入口注入培养基，并从细胞培养基出口回收细胞样本，所述第五流速严格高于所述第三流速，所述注入时间和第五取样流速在接种步骤a)之前计算，以便回收凹槽中不到三分之一的细胞，
-所述方法在接种步骤a)之后还包括，将包含至少分化因子的培养基注入细胞培养基入口的分化步骤d)，其中所述培养基任选地以第四预定流速注入，所述方法在接种步骤a)之后还包括任选的收获步骤e)，其中以预定的第二流速在细胞培养基入口注入培养基，并从细胞培养基出口回收细胞，所述第二流速严格高于所述第四流速，所述方法在步骤a)之后还包括任选的取样步骤f)，其中以预定的第五流速在细胞培养基入口注入培养基，并从细胞培养基出口回收细胞样本，所述第五流速严格高于所述第四流速，所述注入时间和第五取样流速在接种步骤a)之前计算，以便回收凹槽中不到三分之一的细胞，
-所述方法在接种步骤a)之后还包括优选地将培养基注入细胞培养基入口中，并从细胞培养基出口中回收至少80％的细胞的收获步骤e)。
-细胞培养装置至少包括一个收获入口和一个收获出口，所述收获入口和收获出口与所述细胞培养基入口和细胞培养基出口不同，至少一个凹槽与所述收获入口和收获出口直接流体连接，所述方法在步骤a)之后还包括将培养基注入所述收获入口中并从收获出口回收细胞的收获步骤e)，
-所述方法在接种步骤a)之后还包括注入包含转导因子的培养基的转导步骤，其中将所述培养基以预定流速注入细胞培养基入口，所述预定流速为所述第四预定流速的0.5至1.5倍。
定义
通道的术语“长度”在本文中将用于根据通过所述通道的流体的主流方向来指定通道的尺寸。
通道的术语“高度”在本文中用于表示通道在第一方向上的最小尺寸，所述第一方向横向于所述主流方向。
通道的术语“宽度”在本文中用于表示通道在第二方向上的最大尺寸，所述第二方向垂直于所述第一方向并且垂直于所述主流方向。
术语“微通道”或“微流体通道”在本文中用于表示包括至少一个入口和至少一个出口的通道，其高度在100nm至1mm之间。术语“流体通道”还包括一系列尺寸，包括但不限于纳米、微米、毫米、厘米尺寸。
附图说明
将参考附图通过示例的方式描述本发明，其中：
-图1展示了一种细胞培养装置，
-图2示意性地展示出了包括凹槽和细胞阱的流体通道的一部分，
-图3是细胞阱的俯视图，
-图4示意性地展示出了沿着主流方向的流体通道的截面，
-图5是流体通道的俯视图，
-图6是包括收获入口和收获出口的流体通道的俯视图，
-图7展示出了根据本发明可能的实施方案的细胞培养方法。
具体实施方式
细胞培养装置1的常规结构
参照图1，细胞培养装置1具有限定平面表面3的表面部分2，其被配置为平置在水平支撑物上。表面部分2位于图1中细胞培养装置1的所示部分的后面。根据细胞培养装置1的制造方法，表面部分2可以是，例如，载玻片的表面或网状聚合物(例如PDMS)中的平面表面。
细胞培养装置1至少包括流体通道4。流体通道4优选是微流体通道。流体通道4至少具有细胞培养基入口5。根据图1所示的本发明的可能实施方案，流体通道4具有八个细胞培养基入口5，其均匀地分布在流体通道4的一端。因此，可以在流体通道4中注入均匀浓度的细胞12和/或以相同的速度在流体通道4的一部分上注入液体培养基。
流体通道4至少包括细胞培养基出口6(图1中未示出)。所述细胞培养基出口在流体通道4的另一端。
第一方向8被定义为垂直于平面表面3，并且与从流体通道4朝向平面表面3的方向相反。在使用中，细胞培养装置1位于水平支撑物上，并且第一方向8对应于与重力方向相反的方向。
流体通道4包括在细胞培养基入口和细胞培养基出口之间延伸的下壁7。
参照图1和图2，流体通道4包括至少一个，并且优选多个凹槽10，每个凹槽10配置成接收多个细胞12。所述凹槽10由下壁7形成。根据图1和图2所示的本发明的可能的实施方案，凹槽10具有矩形长方体形状，并且例如但不限于通过两步光刻微制造技术来制造。凹槽10限定至少一个底表面11。在凹槽10具有圆形形状的情况下，底表面11可以限定整个凹槽10。底表面11是凹槽相对于第一方向8的最低表面。
细胞培养装置1包括至少一个、优选多个细胞阱13。每个细胞阱13适于捕获被流体通道4中的液体培养基流平流运送的细胞12，然后使捕获的细胞12沉降到凹槽10的底表面11上。细胞培养区9包括凹槽10和至少一个细胞阱13。
细胞阱13
参照图2，下壁7包括上表面23，其对应于在凹槽10的一侧延伸的表面。细胞阱13优选地是障碍物14。所述障碍物14可以布置在凹槽10与流体通道4的其余部分之间的边界上。优选地，细胞阱13包括障碍物14，所述障碍物从底表面11延伸至凹槽10之外，超过下壁7的上表面23。优选地，细胞阱13包括至少从上壁20延伸到凹槽10的障碍物14。障碍物14优选地是突起、隆起或凸起。障碍物14优选具有限定沉降轴的主延伸方向，所述沉降轴平行于所述障碍物14内的细胞12的沉降方向，所述沉降轴垂直于表面部分2。沉降轴可以对应于第一方向8。优选地，障碍物14全部相对于轴线沿整个流体通道4的一部分从凹槽10的底表面11延伸到流体通道4的上壁20。因此，提高了障碍物14对细胞12的捕获效率。
当细胞12被例如沿主流方向16流动的液体流平流运送时，细胞12可以遇到障碍物14并且被阻止沿主流方向16平流运送。然而，障碍物14被配置为使细胞12在凹槽10中沉降到底表面11。图2中的虚线箭头展示出了细胞12的捕获和沉降。因此，可以有效地捕获细胞12，而不会限制注入的包括细胞12的培养基的速度，以便细胞12在凹槽10中沉降。通过细胞阱13和凹槽10的组合，可以在流体通道4中以通常忽略沉降的速度控制包含细胞12的液体培养基，同时使用沉降在凹槽10中接种细胞12。与现有技术相比，细胞12的接种更简单且更有效。
障碍物14可以是一个堰阱。因此，指向障碍物14的细胞培养基流线并没有全部绕过障碍物14。一些流线经过障碍物14。因此，如果细胞12处于通过障碍物14的流线中，则细胞12可被障碍物14捕获。在捕获了细胞12之后，细胞12部分地挡住了堰阱的开口区域，并且通过栅阱(barred trap)的流线部分减少，导致阱的自密封。因此可以选择堰阱的尺寸，以便通过堰阱控制捕获的细胞12的数量。
图2和图3展示出了根据本发明的不同实施方案的细胞阱13，其具有横穿狭缝15。孔或狭缝15的宽度，即最小尺寸，优选地在3μm和30μm之间，并且优选地在5μm和20μm之间。因此，细胞阱13可以是堰阱，因为孔的宽度可以小于细胞12的大小，同时孔的宽度足够大以使流线通过该孔。
根据本发明的另一实施方案，障碍物14可以仅部分地从底表面延伸出凹槽10。因此，流线可以越过障碍物14，从而障碍物14可以捕获细胞并使其沉降。
障碍物14，优选堰阱，可以具有U形、杯形、月牙形、镂空月牙形、星形、半球形，具有三个或更多个顶点的任何多边形和/或空腔形状。
障碍物14的尺寸可以根据培养细胞的平均直径Dcell来选择。在整个说明书中，这样的参数Dcell被定义为平均培养细胞直径，细胞12处于悬浮状态以用于本发明的方法。Dcell可以通过不同的技术进行测量，例如阻抗细胞计数器检测(例如，但不限于，如美国专利2656508中所述的库尔特计数器或通过光学显微镜，然后进行图像分析)。根据细胞的来源，Dcell通常可以在3μm和150μm之间，尤其是在5μm和50μm之间。
障碍物14的宽度Wt，即在横向于主流方向16和第一方向8的第二方向19上的障碍物14的尺寸，优选大于Dcell，尤其大于10μm，优选大于20μm。
凹槽10
选择凹槽10的尺寸，使得细胞12可以在凹槽10中增殖。凹槽10被构造成接收多个细胞12。根据本发明的优选实施方案，在平面表面3上突出的凹槽的面积大于150μm2，尤其大于250000μm2，并且优选地大于500000μm2。
参照图3，可以设计凹槽10的几何形状，使得可以保护凹槽10中(例如在凹槽10的底表面11上)的细胞12在流体通道4中的预定流速下不被平流运送出凹槽10。换句话说，凹槽10的几何形状允许在预定的流速下，在凹槽10内有死水(dead water)，而在流体通道4的上部，即凹槽10的外面发生流动。术语“死水”或“空腔区”在本文中用于指定液体体积，其中存在的流速范围不足以将细胞12拖出凹槽10，并且优选流速不足以拖动细胞12。因此，可以通过以预定的流速注入洗涤培养基和/或包含活性化合物的培养基来洗涤，或将任何活性化合物带至凹槽10中的细胞12，而无需将细胞12拖出凹槽10。因此，与现有技术的设备相比，细胞培养装置1的制造可以例如，通过避免制造半透膜或壁来简化，以容纳细胞12使其不被培养基流拖动。
凹槽优选在第二方向19上延伸大于2Dcell的距离，尤其是大于15μm，并且优选地大于100μm。根据图1中的本发明的优选实施方案，每个凹槽10延伸大于流体通道的宽度W的一半，优选地为流体通道的整个宽度W。流体通道可包括在细胞培养基入口5和细胞培养基出口6之间延伸的侧面。凹槽10优选地在流体通道4的整个宽度上从一个侧面延伸到另一侧面。
优选地，所述凹槽10横向于主流方向16形成。因此，与其他凹槽10几何形状相比，对于流体通道4中较大的流速，有可能在所述凹槽10中出现死水。优选地，凹槽10的长度Ld小于凹槽10的宽度Wd，更优选地，凹槽10的长度Ld比凹槽10的宽度Wd低五倍。
流体通道4包括相对于第一方向8的上壁20。第一高度Hc被限定为下壁7的上表面23和上壁20之间的较短距离。凹槽10优选地具有相对于第一方向8的第二高度Ht，其相对于第一方向8被限定为在下壁7的底表面11与下壁7的上表面23之间的较短距离。特别地，所述第二高度Ht为所述第一高度Hc的0.25至0.85倍，并且优选地为所述第一高度Hc的0.40至0.70倍。如果凹槽10的第二高度Ht例如比第一高度Hc低几倍，那么在流体通道4中注入液体培养基时，凹槽10中就不会出现死水区，以保护培养中的细胞。另一方面，如果凹槽10的第二高度Ht比流体通道4的第一高度Hc大几倍，液体培养基在流体通道4中的流动就会发生在凹槽10之外，从而难以在凹槽10中形成涡流以将细胞12拖出凹槽10。根据本发明的实施方案所述的高度比Ht/Hc的优选范围使得，取决于注入流体通道4中的培养基的流速，可以选择凹槽10中的液体培养基是否明显稳定，或者凹槽10中是否会发生涡流。
优选地，凹槽10的第二高度Ht在10μm和1000μm之间，尤其在15μm和300μm之间，并且优选地在15μm和200μm之间。
细胞阱13的阵列
流体通道4包括多个细胞阱13。优选地，流体通道4包括至少一个细胞阱13的阵列，优选包括多个细胞阱13的阵列。细胞阱13的阵列可以是线性的，例如相对于第二方向19延伸，和/或二维的，例如在平行于平面表面3的平面中延伸。
细胞阱13阵列的参数和/或流体通道4中不同阵列的排列方式决定了流体通道4各点的细胞捕获率。
两个细胞阱13之间的最小距离，优选两个障碍物14之间的最小距离，是流体通道4中包含细胞12的液体培养基灌注过程中细胞捕获率的一个参数。两个障碍物14之间的最小距离被限定为一个障碍物14的壁与最近的障碍物14的壁之间的最小距离。根据本发明的一个优选实施方案，两个障碍物14之间的最小距离包括在10μm和300μm之间，尤其在20μm和150μm之间，优选在25μm和100μm之间。因此，在灌注过程中细胞12捕获可以足够高效以在10分钟以内，优选在1分钟以内将细胞12在流体通道4中接种，同时又足够低来避免在流体通道4的入口处形成细胞阻塞。
根据本发明的一个优选实施方案，障碍物14排列成规则的二维格子，其中格子相对于主流方向16倾斜。两个连续的障碍物14相对于主流方向16限定了格子与主流方向16的倾斜角，所述倾斜角不为零，优选地在2°至20°之间，尤其是在2°和10°之间，更优选在2°和5°之间。
根据本发明的一个可能实施方案，障碍物可以被安排在流体通道4中，以便在平面表面3中突出的障碍物14的表面密度沿着流体通道的长度变化。优选地，障碍物14的表面密度相对于主流方向16增加。因此，可以沿着流体通道4以均匀或恒定的浓度接种细胞12。
收获
参考图5和图6，可以收获细胞12，特别是在细胞培养装置1的凹槽10中培养的细胞12，例如用于进一步的治疗用途。
根据图5所示的本发明的实施方案，可通过冲洗凹槽10并从流体通道4的细胞培养基出口6回收细胞12来收获细胞12。
根据图6所示的本发明的另一实施方案，流体通道4可包括至少一个收获入口17和至少一个收获出口18，它们分别不同于细胞培养基入口5和细胞培养基出口6。布置收获入口17和收获出口18，使得在收获入口17和收获出口18之间受控的流可以使凹槽10中的细胞12平流运送以便收获它们。与在细胞培养基入口5和细胞培养基出口6之间受控的流相反，在收获入口17和收获出口18之间受控的流被配置为使得在凹槽10中不出现死水。根据图6所示的本发明的实施方案，收获入口17和收获出口18被配置为允许相对于第二方向19的流动，并且凹槽10沿着同一方向延伸。
在本发明的一个优选实施方案中，每个凹槽10都与一个收获入口17和一个收获出口18流体连接。因此，在控制收获入口17和收获出口18之间的流时，可以避免在凹槽10中出现死水。凹槽10可以与同一个共同的收获入口17和共同的收获出口18进行流体连接，和/或由不同的收获入口17和收获出口18单独连接。
并行化
细胞培养适合于细胞疗法，即所述细胞培养装置1适合于收获超过105个细胞12，尤其是超过106个细胞12，优选超过1010个细胞12。所述流体通道4可以并行化以增加细胞培养装置1的通量。根据本发明的一个优选实施方案，所述细胞培养装置1包括一个入口通道21和一个出口通道22。所述入口通道21在流体连接细胞培养基入口5，所述出口通道22流体连接细胞培养基出口6。因此，细胞12的生产可以并行化。例如，不同的流体通道4可以叠加。不同的流体通道4也可以安排在同一堆叠的同一平面内。
表面处理
可以在细胞培养装置1中培养不同类型的细胞12，例如贴壁细胞12或非贴壁细胞12。凹槽10的底表面11，尤其是凹槽10，以及优选的流体通道4的壁的表面，可以用适合于在细胞培养装置1中培养的细胞12的类型的表面处理进行涂层。通常，表面处理可以包括在培养装置中注入和循环适合表面处理的液体培养基的步骤。所述液体培养基可以通过细胞培养基入口5和细胞培养基出口6或通过收获入口17和收获出口18引入到流体通道4，其中表面处理被动地被吸附在培养表面，即在凹槽10的壁上，特别是在底表面11上。这特别适用于细胞外基质涂层。其他步骤可以包括等离子体聚合和化学诱导的吸附，例如但不限于聚合物接枝。
细胞培养
上述细胞培养装置1适于培养例如用于细胞疗法的细胞12。
图7展示出了根据本发明实施方案的细胞培养方法。所述方法可以包括设置细胞培养装置1以使表面部分2位于水平支撑物上的步骤61。因此，凹槽10相对于第一方向8被安排在流体通道4的其余部分之下，并且细胞阱13适于使细胞12沉降到凹槽的底表面11。作为替代方案，表面部分2可以被倾斜，并且流体通道4也被倾斜，以便凹槽10相对于第一方向8被安排在流体通道4的其余部分之下。
细胞培养的方法包括接种步骤62。至少一个细胞12可以通过细胞阱13被带至一个凹槽10，尤其是带至大多数凹槽10，优选是带至80％以上的凹槽10。将包含细胞12的液体培养基注入细胞培养基入口，直至至少直至10％以上的细胞阱13捕获了至少一个细胞12，特别是三分之一以上的细胞阱13捕获了至少一个细胞12，优选直至大多数的细胞阱13捕获了至少一个细胞12。因此，通过以与重力对细胞12的作用无关的速度注入包含细胞12的培养基，可以将细胞12接种在细胞培养装置1中。因此，细胞培养装置1可以被有效地和均匀地接种。接种细胞12的数量和/或被细胞阱13捕获的细胞12的数量可以在注射过程中通过常规显微镜方法测量，例如通过使用倒置显微镜记录流体通道4的图像。然后可以通过自动图像处理和/或手动对捕获的细胞12进行计数。注射时间可以预先确定。
在接种步骤62之后，所述方法可以包括扩增步骤65或增殖步骤65。合适的培养环境对于细胞12的扩增至关重要：扩增步骤65包括在细胞培养基入口中注入包含至少一种活性剂的培养基。术语“活性剂”在本文中是指对于细胞12的扩增是必需的或有益的任何化学或生物化合物。培养基的注入被控制在一个足够低的流速，以避免将细胞12拖出凹槽10，并且优选地不会在凹槽10中引起涡流。液体流动基本上发生在流体通道4的其余部分中。因此，活性剂可以通过从流体通道4的其余部分扩散至凹槽10而被运输至细胞12，而不会移动或平流运送在凹槽10中扩增的细胞12。
在接种步骤62之后，所述方法可以进一步包括洗涤步骤64。为了精确地控制对细胞12的化学或生物处理，可能需要洗涤流体通道4。所述洗涤步骤64包括注入洗涤培养基，所述洗涤培养基不含待洗涤的化合物。洗涤培养基的注入被控制在足够低的流速下，以避免将细胞12拖出凹槽10，并且优选地不会在凹槽10中引起涡流。液体流动基本上发生在流体通道4的其余部分中。因此，待通过稀释洗涤的化合物或可通过扩散从凹槽10输送到流体通道4的其余部分，而不会移动或平流运送凹槽10中的细胞12。
在接种步骤62之后，所述方法可以进一步包括分化步骤63。术语“分化”在本文中是指细胞从较不特化的细胞类型变为较特化的细胞类型的过程。所述分化步骤63包括注入包含分化剂的液体培养基。包含分化剂的培养基的注入被控制在足够低的流速下，以避免将细胞12拖出凹槽10，并且优选地不会在凹槽10中引起涡流。液体流动基本上发生在流体通道4的其余部分中。因此，分化剂可以通过从流体通道4的其余部分扩散到凹槽10而被运输到细胞12，而不会移动或平流运送凹槽10中的细胞12。
所述方法可以进一步包括收获步骤66。收获步骤66可包括在细胞培养基入口5中注入培养基，并从细胞培养基出口中回收细胞。细胞2的收获可以通过注入培养基来处理，其流速足够高以在凹槽10中产生涡流，并将超过大部分的细胞12从凹槽10中拖出至流体通道4的其余部分。然后，细胞12可以通过液体培养基的流动而被平流运送并且被输送到细胞培养基出口6，在那里它们可以被回收。
细胞培养基入口5和细胞培养基出口6之间的阈值流速将以下分开：
-一种操作模式，其中凹槽10中的液体流动明显地局部为零(死水)，或者其中施加在凹槽10中的细胞12上的拖曳力不足以将细胞12提升至凹槽10之外，和
-另一种操作模式，其中凹槽10中的液体流与涡流有关，涡流对细胞12的拖曳力足够高可以将细胞提升至凹槽10之外。
可以根据流体通道4的几何形状和培养的细胞12的类型来确定阈值流速，例如通过分析或通过使用有限元方法的计算机模拟来确定。一种合适的方法可以是例如确定在细胞培养基入口5和细胞培养基出口6之间以何种流速，细胞12上的局部拖曳力可以抵消同一细胞12上的重力。在收获步骤66中注入培养基的流速，即第二流速，大于扩增步骤65和/或洗涤步骤64和/或分化步骤63的第一预定流速。
可选地，所述收获步骤66可以包括在收获入口17注入培养基，并从收获出口18回收细胞12。
所述方法还可以包括取样步骤67。在细胞培养期间，对培养的细胞12进行取样可以是必要的，以确定，例如，细胞12的活性、效力、活力、选择性、形态和/或更普遍的不同特征。取样步骤67可以包括以大于第一流速的第三流速在流体通道4中注入培养基。所述第三流速可以例如在阈值流速和1.5倍阈值流速之间选择。通过在取样步骤67中调整灌注时间，凹槽10中少于三分之一的细胞12被回收，优选少于10％的细胞12被回收。取样步骤67还可以包括对微通道4中的液体培养基进行取样，以进一步分析细胞培养液和环境的无菌性和组成。
Claims (18)
1.一种细胞培养装置(1)，其具有至少一个限定了平面表面(3)的表面部分(2)，所述表面部分被配置为平置在水平支撑物上，所述细胞培养装置包括至少一个流体通道(4)，其具有至少一个细胞培养基入口(5)和一个细胞培养基出口(6)，所述流体通道包括一个在所述细胞培养基入口和所述细胞培养基出口之间延伸的下壁(7)，
所述细胞培养装置的特征在于，其还包括：
至少一个凹槽(10)，其被配置成接收多个细胞(12)，所述凹槽(10)由所述下壁(7)形成并限定了底表面(11)，以及
至少一个细胞阱(13)，所述细胞阱(13)被配置成捕获在流体通道中平流运送的细胞(12)，然后使所述细胞沉降至所述凹槽(10)的底表面(11)，
所述细胞阱包括障碍物(14)，所述障碍物具有限定了沉降轴的主延伸方向，所述沉降轴平行于所述障碍物内的细胞的沉降方向，并且其中所述沉降轴垂直于所述表面部分(2)；
每个障碍物都有一个孔，所述孔的宽度在3μm和30μm之间；
其中，所述流体通道(4)包括细胞阱阵列(13)，所述细胞阱阵列(13)沿垂直于在所述细胞培养基入口(5)和所述细胞培养基出口(6)之间延伸的主流方向(16)的方向延伸；
其中，所述下壁(7)包括在所述凹槽(10)的一侧延伸的上表面，并且其中所述流体通道包括上壁(20)，其中，所述流体通道(4)的第一高度被限定为所述下壁(7)的上表面与所述上壁(20)之间的最短距离，凹槽(10)的第二高度被限定为所述下壁的底表面(11)和所述下壁的上表面之间的最短的距离，并且其中所述第二高度为所述第一高度的0.15至0.85倍；
并且其中所述第二高度在10μm和500μm之间。
2.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其中，所述下壁(7)进一步包括在所述凹槽(10)一侧延伸的上表面，所述障碍物(14)从底表面(11)延伸至超出所述下壁(7)的上表面的凹槽(10)之外。
3.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其中，所述流体通道还包括上壁(20)，所述障碍物(14)至少从所述上壁(20)延伸至所述凹槽(10)。
4.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其中，所述孔是一个横穿孔。
5.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其中，所述孔是横穿狭缝(15)。
6.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其中，所述孔的宽度在5μm和20μm之间。
7.根据权利要求1-6任一项所述的细胞培养装置，其中，所述流体通道(4)的至少一部分被配置为根据主流方向(16)接收液体流。
8.根据权利要求7所述的细胞培养装置，其中，所述流体通道还包括在细胞培养基入口(5)和细胞培养基出口(6)之间延伸的侧面，并且其中至少一个凹槽在所述流体通道的整个宽度上从一个侧面延伸到另一侧面。
9.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其中所述第二高度为所述第一高度的0.20至0.70倍。
10.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其中，所述第二高度在15μm和300μm之间。
11.根据权利要求10所述的细胞培养装置，其中，所述第二高度在15μm和200μm之间。
12.根据权利要求8-11中的任一项所述的细胞培养装置，其包括至少一个收获入口(17)和一个收获出口(18)，所述收获入口和收获出口与所述细胞培养基入口和细胞培养基出口不同，至少一个凹槽直接与收获入口(17)和收获出口(18)流体连接。
13.一种细胞培养的方法，所述方法包括：
-设置根据权利要求1-12中任一项所述的细胞培养装置，使所述表面部分(2)位于水平支撑物上，
-接种步骤a)，其中注入包含细胞的培养基，所述培养基被注入所述细胞培养装置的至少一个流体通道的细胞培养基入口，直至至少超过10％的细胞阱捕获了至少一个细胞。
14.根据权利要求13所述的细胞培养的方法，所述培养基被注入所述细胞培养装置的至少一个流体通道的细胞培养基入口，直至超过大多数的细胞阱捕获了至少一个细胞。
15.根据权利要求13或14所述的细胞培养方法，所述方法在接种步骤a)之后还包括将包含活性培养剂的培养基注入所述细胞培养基入口的扩增步骤b)，其中所述培养基以第一预定的流速注入，所述方法在接种步骤a)之后包括任选的收获步骤e)，其中将培养基以预定的第二流速注入所述细胞培养基入口并从所述细胞培养基出口回收细胞，所述第二流速严格高于所述第一流速，所述方法还包括在步骤a)之后的任选的取样步骤f)，其中将培养基以预定的第五流速注入所述细胞培养基入口，并从所述细胞培养基出口回收细胞样本，所述第五流速严格高于所述第一流速，注入时间和第五取样流速是在接种步骤a)之前计算的，使得凹槽中少于三分之一的细胞被回收。
16.根据权利要求15所述的细胞培养方法，所述方法在接种步骤a)之后还包括将洗涤培养基注入所述细胞培养基入口的洗涤步骤c)，其中所述培养基任选地以第三预定流速注入，所述方法在接种步骤a)之后还包括任选的收获步骤e)，其中将培养基以预定的第二流速注入所述细胞培养基入口并从所述细胞培养基出口回收细胞，所述第二流速严格高于所述第三流速，所述方法在步骤a)之后还包括任选的取样步骤f)，其中将培养基以预定的第五流速注入所述细胞培养基入口，并从所述细胞培养基出口回收细胞样本，所述第五流速严格高于所述第三流速，注入时间和第五取样流速在接种步骤a)之前计算，使得凹槽中少于三分之一的细胞被回收。
17.根据权利要求16所述的细胞培养方法，其在接种步骤a)之后还包括将至少包含分化因子的培养基注入所述细胞培养基入口中的分化步骤d)，其中所述培养基任选地以第四预定流速注入，所述方法在接种步骤a)之后还包括任选的收获步骤e)，其中将培养基以预定的第二流速注入所述细胞培养基入口，并从所述细胞培养基出口回收细胞，所述第二流速严格高于所述第四流速，所述方法在步骤a)之后还包括任选的取样步骤f)，其中将培养基以预定的第五流速注入所述细胞培养基入口，并从所述细胞培养基出口回收细胞样本，所述第五流速严格高于所述第四流速，注入时间和第五取样流速在接种步骤a)之前计算，使得凹槽中少于三分之一的细胞被回收。
18.根据权利要求16或17所述的细胞培养方法，所述方法在接种步骤a)之后还包括将培养基注入所述细胞培养基入口，并从实施细胞培养基出口回收细胞的收获步骤e)。
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