ITPD20130220A1

ITPD20130220A1 - Metodo per la riprogrammazione e programmazione cellulare mediante l'impiego di tecnologia microfluidica

Info

Publication number: ITPD20130220A1
Application number: IT000220A
Authority: IT
Inventors: Nicola Elvassore; Stefano Giulitti; Camilla Luni
Original assignee: Univ Padova
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2015-02-03

Description

I0155344/VCR TITOLARE: UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA

DESCRIZIONE

Campo tecnico dell’invenzione

5 La presente invenzione riguarda una nuova metodologia per la riprogrammazione e programmazione in microscala di cellule differenziate.

Descrizione dell’arte nota

Sono noti nell’arte metodi per la riprogrammazione e 10 programmazione delle cellule.

In particolare, con il termine “riprogrammazione” si intende il processo mediante il quale cellule differenziate possono essere “de-differenziate” a cellule immature e pluripotenti, dette anche cellule 15 pluripotenti indotte (iPSc), e con il termine “programmazione” il processo mediante il quale cellule immature e pluripotenti possono essere differenziate in cellule derivate dai tre foglietti germinativi.

Attualmente, la riprogrammazione viene condotta in 20 laboratorio tramite l’impiego di dispositivi standard per la coltura cellulare, come piastre di Petri e multi-well, che tuttavia presentano diverse limitazioni.

Innanzitutto, allo scopo di sfruttare completamente le 25 potenzialità della riprogrammazione per scopi scientifici e terapeutici, è necessario impiegare cellule somatiche umane ottenute da paziente sano o malato, per cui è indispensabile poter eseguire il processo a partire da un numero ridotto di cellule.

5 D’altra parte, data l’elevata variabilità dei campioni biologici, è necessario riprogrammare un elevato numero di campioni per ottenere dati statisticamente significativi. Questo comporta l’utilizzo di consistenti volumi di reagenti chimici e biologici ed 10 elevati costi di manodopera non sostenibili economicamente su larga scala. Inoltre, le metodologie oggi applicate per la produzione di cellule iPSc e l’eventuale successiva produzione di cellule funzionalmente differenziate, previa espansione delle 15 iPSc, richiedono dei tempi tecnici di settimane, che non sono sostenibili.

Per “espansione” si intende una fase nella quale le cellule che compongono la colonia di iPSc originaria sono propagate: tipicamente, le colonie di iPSc vengono 20 sezionate manualmente e le cellule che compongono i frammenti riseminate in altre piastre, dove duplicandosi danno a loro volta luogo alla formazione di nuove colonie ecc.

Pertanto, è sentita l’esigenza di sviluppare nuove 25 metodologie e nuove tecniche per ottenere la riprogrammazione cellulare, ed eventualmente la programmazione cellulare, in modo ripetibile, rapido ed accettabile dal punto di vista economico.

La microfluidica è una recente scienza 5 multidisciplinare, che tratta piccoli volumi di liquidi, da microlitri giù a nanolitri, all’interno di dispositivi aventi almeno una dimensione su scala micrometrica.

Dal punto di vista pratico, a tale scala nanometrica i 10 fluidi possono mostrare un comportamento molto diverso rispetto a quello in “macroscala” e di questo fenomeno occorre tener presente durante la progettazione di dispositivi microfluidici o esperimenti che fanno uso di essi.

15 Per esempio, la tensione superficiale, l’elevato rapporto superficie-volume, la frequenza di perfusione in regime laminare possono influenzare largamente l'esito degli esperimenti.

Per queste ragioni, la traslazione di procedure dalla 20 “macro-scala” all’impiego con tecnologia microfluidica non è sempre possibile e fattibile.

Riassunto dell’invenzione

E’ stato sorprendentemente trovato dagli inventori della presente domanda di brevetto che i processi di 25 riprogrammazione e programmazione cellulari possono essere traslati alla tecnologia microfluidica ed in essa integrati.

Breve descrizione delle Figure

Fig. 1. Schema esemplificativo di un dispositivo 5 microfluidico per la riprogrammazione e programmazione cellulari.

Fig. 2. Immagini ottenute tramite microscopia in campo chiaro di una zona del canale microfluidico dopo 20 giorni di coltura di cellule BJ su diversi substrati 10 ottenuti per adsorbimento fisico o mediante legame chimico covalente: fibronectina (Fn), gelatina 0.1% (Gel 0.1%), amminopropil-tri-etossi-silano (APTES), APTES con gelatina 0.1%, trimetossi-silil-propil-metaacrilato (TMSPMA) e gelatina metacrilata (Gel MA).

15 Fig.3. Immagini al microscopio a fluorescenza di una zona del canale microfluidico contenente cellule BJ trasfettate con mRNA di EGFP (enhanced green fluorescent protein) nucleare: campo chiaro (a), marcatura dei nuclei con HOECHST 33342 (b), 20 fluorescenza della EGFP nucleare (c). Effetto di diverse concentrazioni di mRNA di EGFP, veicolato sulle cellule BJ per 4 h, sulla percentuale di cellule trasfettate, e quindi EGFP+, dopo 24 h in microfluidica, i risultati della trasfezione in statica 25 in una multi-well da 6 pozzetti sono inoltre riportati come riferimento (d). Effetto di diverse durate di trasfezione di mRNA di EGFP su cellule BJ in microfluidica alle due concentrazioni indicate.

Fig. 4. Colonie di iPSc formate e in espansione 5 all’interno di canali microfluidici; a) foto di un singolo canale con colonie iPSc marcate con fosfatasi alcalina; b) formazione ed espansione di una colonia iPSc nel canale dal giorno 16 (D16) del processo di riprogrammazione al 19 (D19). c) Ulteriore esempio di 10 colonia di iPSc nel canale microfluidico.

Fig. 5. Marcatori dello stato di pluripotenza delle iPSc formatesi nel canale microfluidico. Sono riportate le immagini di una colonia sia in coltura (live) sia dopo fissazione con paraformaldeide. Prima della 15 fissazione è stata verificata l’espressione di fosfatasi alcalina (AP-live) tramite una sonda fluorescente attivata dall’enzima. In seguito a fissazione è stata condotta una immunofluorescenza per i marcatori OCT3/4, NANOG. I nuclei cellulari positivi 20 a questi due marcatori di pluripotenza sono evidenziati tramite colorazione con HOECHST 33342.

Fig. 6. Analisi RT-PCR. L’RNA totale delle iPSc formate in microfluidica è stato estratto, retrotrascritto (RT) a DNA ed è stata verificata l’espressione di marcatori 25 di pluripotenza tramite PCR. Le colonie in microfluidica sono positive a NANOG, OCT4, SOX2 in maniera analoga a colonie iPSc ottenute in modo convenzionale (statica) e sottoposte a espansione.

Fig. 7. Analisi dei marcatori di pluripotenza dopo una 5 fase di espansione. Le iPSc generate in microfluidica (B) possono essere espanse come quelle generate in modo convenzionale (A), mantenendo le caratteristiche di cellule pluripotenti. Sono riportate le analisi di immunofluorescenza dei marcatori OCT3/4, NANOG, TRA-1-10 60, SSEA-4 e il saggio colorimetrico con fosfatasi alcalina (AP). I nuclei sono evidenziati con HOECHST 33342.

Fig. 8. Metodi per l’estrazione delle colonie iPSc da dispositivo microfluidico: a) carotaggio; b) distacco 15 con sforzo di taglio.

Fig.9. Differenziamento diretto delle iPSc ottenute in microfluidica in modo aspecifico: immagine in campo chiaro di una singola colonia iPSc in fase di differenziamento e verifica dell’espressione di 20 marcatori dei tre foglietti germinativi via RT-PCR.

Fig. 10. Differenziamento diretto delle iPSc ottenute in microfluidica in modo specifico verso il fenotipo cardiaco: immagine in campo chiaro di una singola colonia iPSc in fase di differenziamento e verifica 25 dell’espressione dei marcatori indicati via RT-PCR.

Oggetto dell’invenzione

Un primo oggetto dell’invenzione è rappresentato da un metodo per la riprogrammazione e la programmazione cellulare impiegando la tecnologia microfluidica.

5 Un ulteriore oggetto è rappresentato da un kit utile per implementare il metodo dell’invenzione.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Per gli scopi della presente invenzione, con il termine “riprogrammazione cellulare” si intende il processo con 10 cui cellule differenziate sono riportate ad uno stadio embrionale, detto di cellule pluripotenti indotte (iPSc).

Per “stadio embrionale” si intende quello stato in cui le cellule sono cellule staminali pluripotenti.

15 Per gli scopi della presente invenzione le cellule differenziate da riprogrammare sono preferibilmente cellule somatiche adulte o neonatali, comprendono sia cellule provenienti da pazienti sani sia affetti o predisposti a patologie, ad esempio cancro, comprendono 20 sia cellule umane sia animali ed, in particolare, cellule di linee stabilizzate, immortalizzate o cellule primarie.

In un aspetto preferito dell’invenzione, le cellule differenziate sono linee primarie, quali fibroblasti 25 umani derivati da biopsie, cellule epiteliali derivate da campioni di urina e cellule nucleate derivate da sangue periferico o cordonale.

Secondo la presente invenzione è inoltre descritto un metodo per la “programmazione cellulare”, intendendosi 5 con ciò che cellule indifferenziate e, in particolare, iPSc sono differenziate preferenzialmente verso un determinato fenotipo.

Preferibilmente, le cellule sono sottoposte ad un processo di programmazione aspecifico e danno luogo a 10 cellule appartenenti a tutti e tre i foglietti germinativi.

Alternativamente, le cellule sono sottoposte a processo di programmazione specifico, dando luogo ad una popolazione arricchita in determinati tipi cellulari. 15 Come sopra descritto, per gli scopi della presente invenzione sono impiegati dei dispositivi microfluidici (chip microfluidici) noti nell’arte.

Ad esempio, sono utili quelli del tipo avente fondo in vetro e circuito stampato su gomma di poli-20 dimetilsilossano (PDMS) assemblato con sigillatura al plasma ad ossigeno e sterilizzabile, ad esempio, in autoclave.

In particolare, si tratta di dispositivi prodotti mediante tecniche note, quali ad esempio le cosiddette 25 foto-litografia e soft-litografia, ed aventi una geometria adatta alle diverse necessità.

Ad esempio, possono essere previste una o più camere di coltura indipendenti fra loro, ognuna delle quali, preferibilmente ciascuna, servita da canali 5 microfluidici di ingresso e di uscita.

Il dispositivo microfluidico può essere in configurazione trasparente per consentire l’accessibilità a misure di tipo ottico in linea, ad esempio nel caso in cui il dispositivo sia composto da 10 un supporto in vetro e da un circuito stampato in materiale siliconico.

Il dispositivo microfluidico può essere in configurazione chiusa, nel momento in cui l’ingresso e l’uscita sono collegati direttamente o indirettamente a 15 delle riserve sigillate, realizzando così un sistema (chiuso) che previene contaminazioni di varia natura in entrata o uscita dal dispositivo.

In un aspetto preferito, il dispositivo è nella configurazione chiusa.

20 Dato che la superficie della camera rappresenta la superficie di coltura, questa deve consentire l’adesione cellulare per la durata complessiva di programmazione e riprogrammazione (tipicamente 4-8 settimane) e quindi sarà in un materiale opportuno come 25 il vetro, il poli-dimetilsilossano o il polistirene trattato, ad esempio, e può essere rivestita con substrati, mediante funzionalizzazione per adsorbimento fisico o tramite legame chimico covalente, come gelatina (Gel 0,1%), fibronectina (Fn), 5 amminopropil-tri-etossi-silano (APTES), APTES con gelatina 0,1%, trimetossi-silil-propil-metacrilato (TMSPMA), TMSPMA con gelatina metacrilata (Gel MA), etc, oppure idrogeli (a base ad esempio di poliacrilammide, acido ialuronico, acido polilattico, 10 acido poliacrilico, etc) o altri polimeri o biopolimeri o molecole inorganiche o organiche.

In particolare, i substrati preferiti sono fibronectina e TMSPMA con gelatina metacrilata (Gel MA).

Il metodo per la riprogrammazione cellulare secondo la 15 presente invenzione comprende in particolare la fase di ottenere cellule allo stadio embrionale a partire da cellule differenziate coltivate in un dispositivo microfluidico.

In particolare, le cellule sono seminate all’interno 20 delle camere del dispositivo microfluidico secondo una densità ed in condizioni che dipendono dal tipo di cellula di partenza.

Inoltre, insieme a queste possono essere seminate anche cellule che non sono in grado di riprodursi e fungono 25 da supporto (il cosiddetto feeder layer), come ad esempio fibroblasti neonatali non replicanti umani (Nuff) e fibroblasti embrionali non replicanti murini (MEF), etc.

La riprogrammazione è condotta grazie all’induzione 5 diretta o indiretta di particolari fattori di regolazione intracellulare, come ad esempio OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, MYC, LIN28.

Eventualmente, a tale scopo le cellule possono essere anche trattate con molecole che direttamente o 10 indirettamente fungano da modificatori epigenetici, come l’acido valproico e il butirrato di sodio, alcuni ormoni o citochine, composti chimici organici o inorganici etc, per un periodo adatto, allo scopo di incrementare l’efficienza della riprogrammazione.

15 Le tecniche che possono essere impiegate per gli scopi della presente invenzione per ottenere la riprogrammazione possono includere l’impiego di vettori.

Vettori che possono essere impiegati per indurre 20 l’espressione di geni nelle cellule dell’esperimento sono vettori integranti o non integranti il DNA della cellula ospite, laddove per “integrante” si intende il vettore che a seguito dell’integrazione con il DNA della cellula ospite si duplica insieme a quest’ultimo 25 ed è trasferito ad entrambe le cellule figlie ad ogni divisione cellulare, mentre per “non integrante” si intende il vettore che non influisce sull’integrità genetica del DNA cellulare.

I vettori non integranti vengono ripartiti fra le due 5 cellule figlie in seguito alla divisione cellulare e, pertanto, dopo un certo numero di duplicazioni risultano diluiti al punto da essere eliminati.

Vettori integranti comprendono:

� retrovirus;

10 � lentivirus;

� virus adeno-associati (AAV);

� PiggyBac;

mentre alcuni vettori non integranti sono:

� adenovirus;

15 � plasmidi;

� virus Sendai;

� mRNA o altre molecole a base di acidi nucleici; � proteine;

� composti chimici che inducano da soli o in 20 combinazione ad altri vettori la riprogrammazione e che possano anche esser metabolizzati dalla cellula.

Inoltre, fra i vettori non integranti si distinguono vettori aventi una breve emivita, cioè poco stabili in 25 quanto permangono fino a 96 ore circa prima di essere degradati dalla cellula, e vettori non integranti caratterizzati da una più lunga emivita (>96 ore).

In un aspetto preferito dell’invenzione, sono utilizzati vettori non integranti il DNA ed aventi 5 breve emivita, come ad esempio RNA o proteine, laddove l’RNA è il vettore ancor più preferito.

Per quanto concerne l’ottenimento di iPSc, questo è verificato mediante marcatura con fosfatasi alcalina, analisi di immunofluorescenza o RT-PCR per individuare 10 marcatori della pluripotenza come, ad esempio, NANOG e OCT4, e analisi di differenziamento nei tre foglietti germinativi.

A seguito della riprogrammazione, le cellule pluripotenti (iPSc) ottenute possono essere estratte 15 dal sistema microfluidico per impieghi esterni ad esso.

Tecniche note per l’estrazione delle cellule includono il carotaggio (Fig. 8A), in cui, grazie alla possibilità di forare la parte superiore del dispositivo microfluidico in silicone con opportuni 20 strumenti, la colonia può essere prelevata ed aspirata.

Alternativamente è possibile distaccare le iPSc tramite portate elevate rispetto a quelle normalmente utilizzate nella fase di coltura, che producono uno sforzo di taglio alla superficie di coltura in grado di 25 staccare preferenzialmente le iPSc che possono essere prelevate nel fluido in uscita dal dispositivo microfluidico (Fig. 8B).

In accordo con l’ulteriore aspetto dell’invenzione, una volta ottenute cellule pluripotenti (iPSc), queste 5 possono essere programmate mediante opportuni protocolli.

Ad esempio, possono esser somministrati RNA, citochine e terreni contenenti composti che indirizzino in modo specifico la programmazione.

10 Durante la fase di riprogrammazione e/o di programmazione è possibile mantenere, anche in maniera non continuativa, uno stato di ipossia (condizioni ipossiche: <21% di pressione parziale di ossigeno) al fine di ottimizzare l’efficienza dei processi.

15 Durante la fase di riprogrammazione e/o di programmazione è possibile impiegare substrati opportuni come quelli sopra descritti con particolari caratteristiche di topologia, proprietà chimiche e/o fisico-meccaniche per favorire questi processi.

20 In particolare, secondo la presente invenzione a seguito della riprogrammazione e prima della fase di programmazione è possibile effettuare una fase di espansione.

Tale fase di espansione è in particolare impiegata per 25 l’eliminazione dalla coltura di vettori non integranti con lunga emivita (> 96 h).

In un aspetto preferito dell’invenzione, come sopra detto, sono impiegati vettori non integranti ed aventi 5 breve emivita e la fase di programmazione è eseguita immediatamente dopo la fase di riprogrammazione senza che sia condotta la fase di espansione.

Ancor più preferibilmente, la fase di programmazione può essere eseguita, e preferibilmente lo è, nello 10 stesso dispositivo microfluidico nel quale è condotta la riprogrammazione ed anche addirittura nella stessa camera di coltura, senza procedere prima ad una fase di estrazione e/o di espansione.

Alternativamente, è possibile prelevare selettivamente 15 le cellule riprogrammate e veicolarle in un'altra camera microfluidica dello stesso o di un altro dispositivo microfluidico, per poi procedere con la programmazione.

E' altresì possibile effettuare, in situ o 20 alternativamente all’esterno del dispositivo microfluidico, una fase di purificazione delle cellule iPSc da quelle che non si sono riprogrammate, prima di procedere alla fase di programmazione.

Viceversa, nel caso in cui i vettori utilizzati hanno 25 un’elevata stabilità nell’ambiente intracellulare come il virus Sendai o i plasmidi, è necessario un periodo di espansione prolungato (che può essere anche di alcune settimane).

L'avvenuta programmazione delle cellule è poi valutata 5 mediante verifica di morfologia ed espressione di opportuni marcatori, come ad esempio la β-tubulina, Ncam, Gata4, VEcad, Pecam, Flk1, Gata2, AFP, Nestin, Brachyury.

A seguito della programmazione, le cellule ottenute 10 differenziate in modo specifico o aspecifico possono essere estratte mediante tecniche note nel settore dal sistema microfluidico oppure purificate.

In un aspetto particolare, il metodo dell’invenzione è attuato in un processo attuato secondo Good 15 Manufacturing Practice (GMP).

Secondo un ulteriore oggetto dell’invenzione è descritto un kit per effettuare la riprogrammazione ed eventualmente la programmazione cellulare comprendente un dispositivo microfluidico a sua volta comprendente 20 una preparazione di cellule differenziate (da riprogrammare), pluripotenti (iPSc) o programmate.

Tale preparazione di cellule è preferibilmente adesa alla superficie di un canale microfluidico, la quale può essere eventualmente rivestita con un opportuno 25 substrato oppure opportunamente funzionalizzata per adsorbimento fisico o tramite legame covalente con idrogeli o altri polimeri o biopolimeri o molecole inorganiche o organiche.

Il kit può ulteriormente comprendere un sistema 5 integrato al dispositivo microfluidico che consenta di eseguire una o più delle fasi del metodo in condizioni ipossiche.

Inoltre, il dispositivo può essere in configurazione chiusa e/o trasparente secondo quanto sopra descritto.

10 Secondo un ulteriore aspetto, il kit della presente invenzione può trovare applicazione per analisi farmacologiche, biologiche, fisiologiche e patofisiologiche.

ESEMPIO

15 Un chip microfluidico con fondo in vetro e circuito stampato su gomma di poli-dimetilsilossano (PDMS) è stato assemblato con sigillatura al plasma e sterilizzato in autoclave.

In particolare, lo strato di PDMS è stato ottenuto 20 tramite soft-litografia, avente 10 camere di coltura indipendenti, ognuna servita da un ingresso e un'uscita costituiti da canali microfluidici.

Gli estremi dei canali di uscita e di entrata sono stati forati in modo meccanico con fori da 1 mm e 3 mm 25 Di diametro, rispettivamente, per l'intera altezza del blocco di PDMS.

Un vetrino porta-oggetto da microscopia e il circuito di PDMS stampato sono stati trattati al plasma ad ossigeno per 2 min e posti in contatto per 30 min a 5 80°C per la sigillatura definitiva.

Ogni canale è stato lavato con isopropanolo e acqua distillata per rimuovere i residui di lavorazione.

Il complesso vetro-PDMS è stato sterilizzato in autoclave per almeno 20 min a 121°C.

10 Un sistema di aghi e tubi sterili è stato collegato sotto cappa a flusso laminare ai fori di uscita dei canali microfluidici, per consentire la movimentazione del fluido all'interno dei canali operata da pompe a siringa in aspirazione.

15 La superficie interna dei canali è stata funzionalizzata tramite adsorbimento di fibronectina (0,01 mg/mL) per 30 min in incubatore biologico a 37°C e 5% CO2.

Fibroblasti neonatali non replicanti umani (Nuff) sono 20 stati seminati a confluenza nelle camere (260 cellule/mm2).

A distanza di 12 h, fibroblasti umani replicanti (BJ) sono stati seminati a bassa densità nelle stesse camere (10 cellule/mm2).

25 A partire da 24 h dall'ultima semina, è stata veicolata giornalmente per 16 giorni una sospensione di liposomi e mRNA modificati di OCT4, SOX2, KLF4, MYC, NANOG, LIN28 preparati freschi e caricati nelle riserve in ingresso alle camere di coltura.

5 La sospensione è stata introdotta in camera mediante perfusione a 12 μL/min tramite le pompe e ivi mantenuta per 4 h.

Le stesse pompe sono state impiegate per provvedere automaticamente al cambio del terreno di coltura ogni 10 12 h.

Le cellule BJ sono andate incontro a cambiamento morfologico (giorno 8) ed hanno formato colonie iPSc a partire dal giorno 10 e successivi, verificate mediante marcatura con fosfatasi alcalina senza compromettere la 15 vitalità cellulare.

Nei giorni seguenti di trasfezione, nuove colonie si sono formate, contestualmente all'espansione delle precedenti.

Le colonie ottenute sono state trattate nei seguenti 20 modi:

� alcune sono state analizzate in situ via immunofluorescenza (Nanog, Oct4, Sox2, SSEA4, Tra-1-60, Tra-1-81);

� altre via RT-PCR (NANOG, OCT4, SOX2) dopo 25 estrazione di RNA;

� altre sono state estratte dalla camera microfluidica per mezzo di carotaggi dello strato di PDMS o tramite perfusione ad elevata portata (con sforzo di taglio sulla superficie cellulare 5 di 100 dyne/cm2);

� altre colonie sono state differenziate/programmate in modo aspecifico direttamente all'interno delle camere microfluidiche con un mezzo a base di Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) e 10% 10 siero bovino fetale (FBS) e dopo 10 giorni in condizioni di differenziamento è stata verificata la presenza di cellule dei tre foglietti germinativi tramite RT-PCR (β-tubulina, Ncam, Gata4, VEcad, Pecam, Flk1, Gata2, AFP, Nestin). 15 � altre colonie sono state differenziate/programmate in modo specifico verso il fenotipo cardiaco mediante inibitori del pathway di Wnt o attivatori come ad esempio Activina A e BMP4 e, al termine del protocollo, è stata verificata la presenza 20 preferenziale di cellule di tipo cardiaco tramite RT-PCR (c-TnT, Nkx2.5, etc).

� le colonie estratte sono state seminate su MEF inattivi a confluenza in comuni piastre di coltura e analizzate dopo essere state espanse per 10 25 passaggi mediante osservazione microscopica della morfologia, immunofluorescenza (Nanog, Oct4, Sox2, SSEA4, Tra-1-60, Tra-1-81) e RT-PCR (NANOG, OCT4, SOX2). Alcune sono state impiegate per la produzione di corpi embrioidi (EB) ed analizzate 5 via RT-PCR per i marker di differenziamento (βtubulina, Ncam, Gata4, VEcad, Pecam, Flk1, Gata2, AFP, Nestin).

Dalla descrizione sopra fornita saranno evidenti al tecnico del settore i vantaggi del metodo 10 dell’invenzione.

In primo luogo, vi sono vantaggi legati all'utilizzo della tecnica microfluidica, la quale consente una buona maneggevolezza ed un miglior controllo del microambiente cellulare (concentrazione e interazioni 15 molecolari, ad esempio). In particolare si è verificato un incremento dell’efficienza di trasfezione di vettori nelle cellule a parità di materiale utilizzato grazie all’elevato rapporto superficie-volume. Anche aumentando la concentrazione di RNA impiegata di 4 20 volte, il quantitativo totale è ancora almeno 2,5 volte inferiore a quello dei protocolli nei dispositivi convenzionali secondo l’arte nota (Fig. 3).

Inoltre, grazie al minor utilizzo di reagenti ed alla conseguente minore produzione di reflui e prodotti di 25 scarto, sono vantaggiosamente ridotti i costi operativi.

L’abbattimento significativo dei costi in fase di riprogrammazione ottenibile effettuando il processo in microfluidica rende economicamente sostenibile 5 affrontare le fasi seguenti di programmazione senza la necessità di effettuare l'espansione, con notevole riduzione anche della durata del processo complessivo, in quanto tale fase ha normalmente una durata di qualche settimana.

10 Ciò ha reso difficile in passato l’automazione a causa della variabilità del comportamento biologico delle iPSc durante la fase di espansione.

Dal punto di vista ambientale, poi, il metodo della presente invenzione ha certamente un più ridotto 15 impatto ambientale.

Un ancora ulteriore vantaggio del metodo descritto consiste nella possibilità di usare sistemi microfluidici chiusi. In questo modo è possibile operare secondo Good Manufacturing Practice (GMP), 20 specie per le applicazioni cliniche.

Inoltre, è resa così possibile la derivazione di cellule iPSc a partire da cellule esposte ad agenti patogeni o provenienti da organismi esposti ad agenti patogeni.

25 E’ da notare anche come il metodo dell’invenzione sia facilmente automatizzabile, aspetto molto interessante dal punto di vista industriale anche perché consente un maggior controllo e ripetibilità secondo le regole di GMP.

Claims

I0155344/VCR TITOLARE: UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA RIVENDICAZIONI: 1. Metodo in vitro per la riprogrammazione cellulare 5 che comprende la fase di ottenere cellule allo stadio embrionale a partire da cellule differenziate in cui dette cellule differenziate sono coltivate in un dispositivo microfluidico.
2. Metodo in vitro secondo la rivendicazione 1 in cui 10 dette cellule differenziate sono cellule somatiche adulte o neonatali.
3. Metodo in vitro secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui dette cellule differenziate sono cellule sane o derivate da pazienti affetti o predisposti a patologie. 15
4. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui dette cellule allo stadio embrionale sono cellule pluripotenti indotte (iPSc).
5. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle 20 rivendicazioni precedenti, in cui dette cellule allo stadio embrionale sono multipotenti o oligopotenti.
6. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta fase di riprogrammazione comprende l’induzione nelle cellule 25 differenziate dell’espressione di opportuni fattori di regolazione cellulare.
7. Metodo in vitro secondo la rivendicazione precedente, in cui detta induzione può avvenire mediante l’impiego di vettori integranti oppure non 5 integranti nel DNA della cellula ospite.
8. Metodo in vitro secondo la rivendicazione precedente, in cui detti vettori integranti sono scelti nel gruppo che comprende: retrovirus, lentivirus, virus adeno-associati, PiggyBac. 10
9. Metodo in vitro secondo la rivendicazione 7, in cui detti vettori non integranti sono scelti nel gruppo che comprende: adenovirus, plasmidi, RNA-virus come Sendai, RNA, proteine, composti chimici organici o inorganici.
10. Metodo in vitro secondo la rivendicazione 6, in cui 15 detta induzione avviene mediante l’impiego di vettori non integranti nel DNA e caratterizzati da una breve emivita.
11. Metodo in vitro secondo la rivendicazione precedente, in cui detti vettori non integranti 20 caratterizzati da una breve emivita hanno una emivita uguale o inferiore a circa 96 ore.
12. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7, 9, 10 o 11, in cui detto vettore è scelto fra RNA e proteine. 25
13. Metodo in vitro secondo la rivendicazione 6, in cui in detta fase di riprogrammazione le cellule differenziate sono trattate ulteriormente con modificatori epigenetici, diretti o indiretti, scelti nel gruppo che comprende acido valproico, butirrato di 5 sodio, ormoni, citochine, composti chimici organici o inorganici.
14. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui dopo la fase di riprogrammazione è eseguita una fase di estrazione 10 delle cellule riprogrammate dal dispositivo microfluidico.
15. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui dopo la fase di riprogrammazione è eseguita una fase di purificazione 15 in situ oppure esternamente al dispositivo microfluidico.
16. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui alla fase di riprogrammazione segue una fase di programmazione 20 cellulare, previa purificazione o meno.
17. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta fase di programmazione è condotta nello stesso dispositivo microfluidico oppure no, oppure nella stessa camera 25 oppure no, in cui è condotta la fase di riprogrammazione.
18. Metodo in vitro secondo la rivendicazione 16 o 17, in cui dopo la fase di riprogrammazione e prima della fase di programmazione è condotta una fase di 5 espansione.
19. Metodo in vitro per la riprogrammazione cellulare secondo la rivendicazione 16 o 17, in cui dopo la fase di riprogrammazione e prima della fase di programmazione non è condotta alcuna fase di espansione 10 delle cellule.
20. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 16 a 19 in cui dopo la fase di programmazione è eseguita una fase di purificazione in situ oppure esternamente al dispositivo microfluidico, 15 seguita eventualmente da una fase di estrazione delle cellule dal dispositivo.
21. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui una o più fasi sono condotte in condizioni ipossiche. 20
22. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui la superficie di coltura del dispositivo microfluidico è rivestita con substrati mediante funzionalizzazione per adsorbimento fisico o tramite legame chimico covalente con idrogeli 25 o altri polimeri o biopolimeri o molecole inorganiche o organiche.
23. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 22 in cui dette cellule somatiche sono fibroblasti di origine umana o animale. 5
24. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 22 in cui dette cellule somatiche adulte sono fibroblasti neonatali o adulti replicanti.
25. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 22 in cui dette cellule somatiche 10 adulte sono di natura epiteliale, derivate da urine.
26. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 22 in cui dette cellule somatiche adulte sono cellule nucleate derivate da sangue periferico o cordonale. 15
27. Un kit per la riprogrammazione cellulare comprendente un dispositivo microfluidico comprendente una preparazione di cellule differenziate oppure una preparazione di cellule iPSc oppure una preparazione di cellule programmate. 20
28. Il kit per la riprogrammazione cellulare secondo la rivendicazione precedente in cui detto dispositivo microfluidico comprende un sistema integrato per operare in condizioni ipossiche.
29. Il kit per la riprogrammazione cellulare secondo 25 la rivendicazione 27 o 28 in cui detto dispositivo microfluidico comprende una superficie rivestita con substrati mediante funzionalizzazione per adsorbimento fisico o mediante legame chimico covalente con idrogeli 5 o altri polimeri o biopolimeri o molecole inorganiche o organiche.
30. Il kit per la riprogrammazione cellulare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 27 a 29 in cui detto dispositivo microfluidico è in configurazione 10 trasparente.
31. Il kit per la riprogrammazione cellulare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 27 a 30, in cui detto dispositivo microfluidico è in configurazione chiusa. 15
32. Il kit per la riprogrammazione cellulare secondo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 27 a 31, in cui detta preparazione di cellule iPSc è ottenuta secondo il metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13 e da 21 a 26. 20
33. Il kit per la riprogrammazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 27 a 32, in cui detta preparazione di cellule programmate è stata ottenuta secondo il metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni da 14 a 25. 25
34. Uso di un dispositivo microfluidico in un processo per la riprogrammazione e programmazione cellulare.
35. Uso di un dispositivo microfluidico secondo la rivendicazione precedente, in cui detto dispositivo è in una configurazione chiusa. 5
36. Uso di un dispositivo microfluidico secondo la rivendicazione 34 o 35 che comprende la derivazione di cellule iPSc a partire da cellule esposte ad agenti patogeni o provenienti da organismi esposti ad agenti patogeni. 10
37. Uso di un dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 34 a 36 in un processo secondo GMP.
38. Uso di un dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 34 e 37 per analisi farmacologiche, biologiche, fisiologiche o patofisiologiche.