CN102439131A - 用于分离细胞的装置及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从样品中分离规定尺寸的细胞的装置以及包含该装置和其他组件的系统。该装置可包含不同的组件，如入口模块、中间模块、出口模块和微筛。本发明还涉及操作这些装置的方法及所述装置的用途。

Description

用于分离细胞的装置及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年3月20日提交的新加坡申请No.200901937-3的优先权，将其内容整体引入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及实验室装备领域，该实验室装备用于从患者的样品中分离特定的细胞。
背景技术
从液态样品中分离特定组分不仅对于研究的目的而言越来越重要，对于临床实验室中的诊断也越来越重要。对于临床应用而言，尤其需要这样的系统，该系统可以以快速而可靠的方式确定来自患者的样品中是否存在特定的组分，从而使临床医生作出诊断并确定患者的进一步疗法。
在研究型实验室中也需要这样的系统。
例如，循环肿瘤细胞(CTCs)在癌症患者的外周血中非常罕见，在患有转移癌的癌症患者的血液中，少至每109个血细胞中才有一个循环肿瘤细胞。已显示这些细胞的数量与疾病进展相互关联，并代表了对用于癌转移分析的侵入性活组织检查的潜在替代方式。现在已开发出了数种用于从癌症患者血液样品中分离循环肿瘤细胞的技术，如密度梯度离心、免疫磁性法(MACS)、铁磁流体法(CellSearchTM)和通过聚合物膜进行的细胞过滤。然而，这些方法或者需要持续很久的处理时间(＞30min)，或者提取效率有限。另外，利用特异性针对上皮抗原(EpCAM，细胞角蛋白)的缀合抗体的方法会得到假阳性结果。
因此，需要开发出用于从患者样品中分离特定组分的系统。
发明内容
第一方面，本发明涉及从样品中分离规定尺寸的细胞的装置。该装置包含下述组件或由下述组件组成：具有入口的入口模块、具有出口的出口模块、具有通孔并置于所述入口模块和所述出口模块间的中间模块以及具有微孔的、用于截留规定尺寸的细胞的微筛。该装置的组件可经过设计，使得所述入口模块、所述中间模块和所述出口模块可移除地相互连接，且该连接为流体连接(fluidly connected)。此外，所述微筛可置于所述中间模块和所述出口模块之间。所述出口模块可适于在其出口处施加负压。由贯穿微筛的微筛的各孔形成的通道(channel)的长度至少为50μm(或换言之，所述孔的长度为大约至少50μm)。在一个实施方式中，所述长度在约150μm-约250μm之间。
在一个实施方式中，所述入口模块可包含置于所述入口模块的入口的相对侧的突出部，其中，该突出部为所述入口的延伸，当处于组装状态时，所述突出部适于接触所述中间模块的通孔周围的中间模块的表面。
在一个实施方式中，该中间模块的形状可以为圆锥体形状。可将中间模块的通孔置于所述圆锥体的底部。具有通孔的圆锥体尖端可朝向微筛。
在另外的实施方式中，所述中间层可限定微筛上的过滤区(filteringarea)。所述中间层的通孔的尺寸限定所述过滤区的尺寸。
在另一个实施方式中，所述出口模块可包含具有凹部的顶面，所述凹部置于顶面内。所述凹部的尺寸可适于容纳(holding)微筛。此外，所述出口模块的出口可置于凹部的底部，如置于凹部的中心。
在另一个实施方式中，可将所述出口模块的凹部中的出口位于与所述中间层的开口相对的位置。
在另一个实施方式中，所述出口模块可包含具有孔口的侧壁。该孔口位于凹部外部，所述孔口与施加负压的装置是可连接的(connectable)。
在另一个实施方式中，所述出口模块的侧壁可适于与容器是可连接的。
另一方面，本发明涉及从样品中分离规定尺寸的细胞的装置。该装置包含下述组件或由下述组件组成：具有入口的入口模块、具有出口的出口模块、具有通孔的中间模块。可将所述中间模块置于所述入口模块和所述出口模块之间。该装置可进一步包含具有微孔的、用于截留规定尺寸的细胞的微筛。可将该微筛置于所述入口模块和所述中间模块之间。另外，所述入口模块、出口模块和中间模块可移除地相互连接，且该连接为流体连接。由贯穿微筛的微筛的各孔形成的通道的长度至少为50μm(或换言之，所述孔的长度为大约至少50μm)。在一个实施方式中，所述长度在约150μm-约250μm之间。
在一个实施方式中，该装置可包含含有通孔的垫片。可将该垫片置于所述微筛和所述入口模块之间。该垫片可限定微筛上的过滤区。垫片的通孔的尺寸可限定所述过滤区的尺寸。
所述中间模块可包含用于容纳微筛的凹部。另外，可设定该凹部的尺寸以容纳微筛和垫片。
本文所述的装置中的过滤区的最大直径可为约0.5-20mm之间、或约2-5mm之间。
本文所述的任意装置中使用的微筛的厚度可为约50μm-约1000μm之间、或为约150μm。
微筛的最大水平延展可为约1mm-约3cm之间、或为约1.5cm。另外，微孔可以以均一或非均一的式样(pattern)相互隔开。
在另一个实施方式中，各微孔的直径为约2μm-约20μm之间、或为约10μm。根据从液态样品中待分离的细胞，各微孔的直径适于待分离细胞的尺寸。
在另一个实施方式中，从一个微孔的中心到另一个微孔的中心的最大距离为约2μm-约100μm之间、或为约12μm。
在又一个实施方式中，本文所涉及的装置进一步包含置于模块间的接触区的定位器(positioners)，当组装模块时，所述定位器固定各模块间的相对位置。
另一方面，本发明涉及一种系统。该系统可包含本文所述的细胞分离装置；用于收集废物的、连接至该装置的出口模块的容器；和用于施加负压的设备。可将该用于施加负压的设备连接至该装置的孔口，所述孔口适于与该用于施加负压的设备是可连接的。该系统可进一步包含用于容纳液态样品的液体源(liquid source)，其中，所述液体源流体连接至该装置的入口。
又一方面，本发明涉及从液态样品中分离规定尺寸的细胞的方法。本方法可包括通过本文所述的一个装置的入口过滤可能含有待分离细胞的液态样品。在另一个实施方式中，该方法进一步包括从微筛移除分离的细胞。
在一个实施方式中，所述液态样品为血液样品，如全血样品。
在另一个实施方式中，待测细胞为循环肿瘤细胞(CTCs)。
另一方面，本发明涉及本文所述的装置用于过滤血液的用途，例如从血液(如全血液态样品)中分离循环肿瘤细胞(CTCs)。
附图说明
当与非限制性实施例和附图结合考虑时，参照详细的描述，将更好地理解本发明。附图中：
图1(A)到(C)显示了如本发明第一方面的细胞分离装置的组件。
图2显示了本文所述的细胞分离装置的入口模块1的技术图纸和示意图。图2中的尺寸以毫米(mm)计。
图3显示了本文所述的细胞分离装置的中间模块2的技术图纸和示意图。图3中的尺寸以毫米(mm)计。
图4显示了本文所述的细胞分离装置的出口模块3的技术图纸和示意图。图4中的尺寸以毫米(mm)计。
图5(A)到(D)显示了另一种包含入口模块4、垫片5、微筛6、中间模块7和出口模块8的细胞分离装置的组件。
图6(a)到(c)显示了SEM图：(a)具有均一的孔结构的硅微筛过滤器；(b)具有平滑的垂直通孔的硅微筛的横截面；(c)捕获了HepG2(肝细胞癌)细胞的、商购的玻璃毛细管阵列过滤器。该过滤器的孔尺寸为10μm，孔距为12μm。
图7(a)显示了用于流速测定的实验配置。(b)利用具有2-5mm的不同过滤区61直径的微筛6，得到的流速相对于滤过时间(以秒计)的图。垫片5的开口限定过滤区61。同时绘制了用掺入104个HepG2细胞的、未稀释的兔全血(5ml)测定的流速以用作参照。插图显示了起始阶段(＜15s)的流速谱。箭头示出全血接触微筛膜的时间点。
图8显示了阐释掺入1ml兔全血样品中的HepG2(10、50和100个细胞)的回收率的图。平均回收率＞90％。
图9显示了玻璃毛细管微筛膜上，对掺入的HepG2肿瘤细胞的捕获：(a)明场图像；(b)HepG2细胞的荧光图像(亮点)；(c)用DAPI对细胞核染色后的荧光图像(亮点)；(d)合并的荧光图像，该图像显示出HepG2的边界和孔阵列(背景的蜂窝状结构)。
图10显示了另一个阐释稀释在1×磷酸盐缓冲生理盐水中的HepG2(5到200个细胞/ml)的回收率的图。平均回收率＞94％。
图11显示了另一个患有肺癌的大鼠的滤过的全血样品的荧光图像：(A)用DAPI染色的循环肿瘤细胞的细胞核(图中的可见亮点)；(B)合并的明场图像和荧光图像，该图像示出循环肿瘤细胞的边界(明亮的六边形)和孔阵列(背景的蜂窝状结构)。
图12阐释了分离细胞的操作原理，如利用包含于本文所述的细胞分离装置中的微筛，对循环肿瘤细胞(CTCs)进行富集。
图13显示了包括本文所述的细胞分离装置的不同用途。
图14阐释了本文所述的细胞分离装置中所用的微筛的制造工艺。
具体实施方式
第一方面，本发明涉及从样品中分离规定尺寸的细胞的装置。该装置包含下述组件或由下述组件组成：具有入口14的入口模块1；具有出口35的出口模块3；具有通孔21的中间模块2，所述中间模块2置于入口模块1和出口模块3之间；以及具有微孔的、用于截留规定尺寸的细胞的微筛6。该装置的组件可经过设计，使得入口模块1、中间模块2和出口模块3可移除地相互连接，且该连接为流体连接。此外，可将微筛6置于中间模块2和出口模块3之间。出口模块3可适于在其出口施加负压。由贯穿微筛的微筛的各孔形成的通道长度604至少为50μm(或换言之，所述孔的长度为大约至少50μm)。这些通道的特定长度提供了类似于体内小动脉中的血液流动条件的流体流动条件。
例如，在图1-图4中阐释了该装置的示例的实施方式。在图1-图4中具体显示的细胞分离装置包含入口模块1、中间模块2及出口模块3。这三个不同的模块可以相互连接，以使得流体能够沿贯穿该细胞分离装置的自入口模块1至出口模块3的垂直直线流动。避免了转向和水平流动从而降低了流阻。因此，当处于组装状态时，不同模块1、2和3的开口11、21和35沿贯穿细胞分离装置的纵轴排列。
因此，液态样品经入口模块1的入口14的开口11流入中间模块2中。该液体从中间模块2经中间模块2的开口21流过微筛6(图1-图4中未示出)。液体经微筛过滤后，过滤后的液体通过出口模块3的出口35流出细胞分离装置。
为进一步提高通过图1-图4中所示的细胞分离装置的流速，入口模块1可包含突出部13，该突出部为入口14的延伸，并紧靠(abut)中间模块2的通孔21周围的中间模块2的表面。该突出部或者紧靠在通孔21周围的表面上，或者距离该表面很近(即在开口21周围的中间模块的表面上方约0.5-1.5mm)。该突出部避免了从入口模块1流向中间模块2的液态样品扩散开。该突出部13的开口11的内径可以为约1-10mm之间、或约2-6mm之间。
为进一步避免液态样品扩散开，细胞分离装置的中间模块2也可包含具有通孔21的圆锥体状物或漏斗状物22，该通孔21形成所述圆锥体或漏斗的中心点。圆锥体样形状是指这样的形状：中间模块的表面形成斜面，该斜面从中间模块2的圆锥体的较高的外沿开始延伸至较低的中心点。中间模块2的表面以至少5°、或约5°-20°之间的角度向包含通孔21的圆锥体的中心尖端倾斜。这意味着，对于突出部13的尺寸，突出部13的高度具有足够的长度以使突出部的末端紧靠在或几乎紧靠在通孔21周围的圆锥体表面上。
利用具有圆锥体的中间模块2，也避免了流过该装置的液体扩散开。即使液体扩散开，它也会通过重力和/或施加于该装置的真空吸力而被吸向中间模块2的中心点。中间模块的圆锥体形状可进一步使操作者在移去入口模块后，能够将该装置放置于光学显微镜下。可调整该扁平的圆锥体，使其与显微镜的物镜形状相配，以便更靠近过滤后载有分离的细胞的微筛，从而对那些细胞成像。直接将该微筛置于中间模块2的通孔21的下方。
可将微筛6置于中间模块2和出口模块3之间。可直接将微筛6置于出口模块3的表面或置于适于容纳该微筛的凹部31内。因此，凹部31的深度和最大深度适于装入微筛。此外，凹部31甚至可以更深，即比微筛的最大高度深，以使具有圆锥体22的中间模块2紧密装配至出口模块3上。如图3中所示，由于圆锥体22的存在，中间模块2可包含向出口模块3突出的延伸部24。该延伸部或突出部24也可被容纳在出口模块3的凹部31中。因此，出口模块3的凹部31能够适于容纳微筛6和中间模块的延伸部24。
如下文将详细描述的，微筛可包含有序排列的微孔阵列。所述微孔可覆盖整个微筛或仅覆盖其一部分。中间模块的通孔21的尺寸限定有效的过滤区61。因此，具有圆锥体形状和位于该圆锥体底部的中心开口的中间模块2也用于限定微筛表面的过滤区61。为避免液体在通过中间模块2的通孔21后扩散到整个微筛，具有通孔21的圆锥体22的尖端可紧靠在或几乎紧靠在微筛的表面上以限定过滤区61。因此，过滤区通过通孔21的尺寸自我限定，而与微筛的尺寸无关。在一个实施方式中，通孔的最大尺寸为约0.5-10mm之间。在另一个实施方式中，通孔的最大尺寸为约1-5mm之间。中间模块2的圆锥体22的直径可为约10-40mm之间，但是也可根据中间模块的总尺寸超出该范围。微筛6的通孔21可为任意形状。在一个实例中，该形状为正方形或矩形。在另一个实施方式中，该通孔的形状为椭圆形或圆形。不考虑通孔的形状，通孔21的尺寸能够覆盖约1-100mm2之间、或约10-50mm2之间、或约7-28mm2之间的面积。在一个实施方式中，通孔21的尺寸为约20mm2。也可根据所用的液态样品的体积来调整过滤区61的尺寸。
可将出口模块的出口置于凹部的中心内或偏离凹部的中心。如图4中所示，将出口35置于凹部的中心，所述凹部的中心位于由中间模块的通孔21限定的过滤区61的正下方。
出口模块可进一步包含孔口32，所述孔口32与在出口模块的出口35施加负压(即真空)的装置是可连接的。向出口模块3施加真空，提供了通过细胞分离装置更快地过滤液态样品的驱动力。可将孔口或连接头32置于出口模块的侧壁。
可以分别调整模块1、2和3的形状。只要它们能够相互连接以使液态样品贯穿所述细胞分离装置流动，它们就可以具有相同的形式或不同的形式。因此，模块1、2和3是相互流体连接的。如图1-图4中所示，模块1、2和3的外部形状为圆形。该形状也可为正方形样或矩形。细胞分离装置的各模块1、2和3的形状或至少出口模块3的形状可适于连接至容器，流过该装置的液体被收集在该容器中。
因此，出口模块可包含延伸侧壁33，所述延伸侧壁适于与容器是可连接的。例如，所述侧壁的内部可包含螺纹，该螺纹可使细胞分离装置拧紧至容器(如烧瓶或离心管(参见例如图13))。它也可包含替代螺纹的卡扣连接，这将使细胞分离装置能够装配至具有略微不同的开口尺寸的容器上。
细胞分离装置的模块1、2和3可通过连接头201、202和203(从细胞分离装置的模块1、2和3的侧壁突出)相互连接。可将连接头201、202和203置于各个模块1、2和3的相对侧并设置开口205、206和207用以嵌入现有技术中已知的固定工具，如螺钉。除了利用用于固定工具的开口外，模块1、2和3也可利用卡扣连接头卡住各自下方的模块而相互连接。
为确保不漏水的密封，模块1、2和3可进一步设置有围绕模块1、2和3外周的沟槽(trench)(例如，12和23)。当组装模块1、2和3时，可将防水隔离材料装入这些沟槽中以提供不漏水的闭合。这种隔离材料可以是任意可用材料，如聚合物O型圈或密封圈。
图5示出了细胞分离装置的另一个实施方式。图5中所示的细胞分离装置包含具有入口41的入口模块4、具有出口36的出口模块8和具有通孔71的中间模块7。可将中间模块7置于入口模块4和出口模块8之间。该装置可进一步包含具有微孔的、用于截留规定尺寸的细胞的微筛6。可将微筛6置于入口模块4和中间模块7之间。此外，入口模块4、出口模块8和中间模块7可移除地相互连接，且该连接为流体连接。
不同于图1-图4中所示的实施方式，微筛6被置于入口模块4和中间模块7之间。可通过置于入口模块4和微筛6之间的垫片对过滤区61进行限定。在图5所示的细胞分离装置中不含垫片的情况下，通过接触微筛61的入口41的开口42，对过滤区61进行限定。入口41可具有圆锥体形状，这使得朝向微筛的入口的开口尺寸可以不同。在圆形开口的情况下，这意味着入口41的可连接至液体源的第一开口比入口41的朝向微筛的第二开口的直径要大，或反之亦然。那么，圆形第二开口的直径将限定微筛表面的过滤区61的尺寸。
入口模块4也可包含类似于图1-图4中所示的装置的入口模块1的突出部13。在这种情况下，朝向微筛的突出部的开口将限定微筛6上的过滤区。如上所述，微筛中包含的微孔可超出过滤区，在一个实施方式中，微筛中包含的微孔延伸至微筛6的大约全部尺寸。
垫片5可具有与入口模块和/或中间模块的尺寸和形状相同的尺寸和形状。在另一个实施方式中，垫片5可具有与微筛61的尺寸和形状相同的尺寸和形状。只要垫片5设置有限定微筛6表面上的过滤区61的开口51，垫片5的尺寸也可比微筛的尺寸小。所述垫片可以为密封圈，并可由现有技术中已知的柔韧的聚合物材料制成。因此，所述垫片不仅限定了过滤区，还提供了液体的密封。
参照图5，所述细胞分离装置包含入口模块4，该入口模块4可以是已经用于描述图1-图4中所示的实施方式中的入口模块1的任意形状或形式。入口41可朝着入口模块的可连接至液体源的一侧延伸为连接头。图5中所示的细胞分离装置可进一步包含如刚刚所述的垫片5和微筛6。
还可进一步包含一侧与微筛6接触并且另一侧与出口模块8接触的中间模块7。所有的模块和组件，例如垫片和微筛，均以可移除的方式相互连接，换言之，它们相互之间可容易地分离，以用于装置的组装和拆卸。然而，如果愿意，可通过制造由单个部件制成的装置、或者通过制造后来被固定(如粘合)在一起的两个或三个不同的部件制成的装置，将本文所述的细胞分离装置的部分或所有模块和组件永久地相互固定。
如果以图5所示的可移除的方式相互连接，模块可包含开口301、302和303以用于嵌入固定工具，如螺钉或销钉。对于图1-图4中所示的装置，那些开口也可形成为附加在模块4、7和8外缘的连接头的一部分。可选地，通过整合(integrate)到模块自身中的开口301将组件连接在一起的方法也可用在图1-图4所示的实施方式中。
本文所述的细胞分离装置可进一步包含定位器，该定位器确保了在组装状态中模块4、7和8相对于彼此的规定取向。因此，模块可包含接收口400和402，用于接收装配至接收口400和402的定位器401和403。只要能以特定取向将入口模块4、出口模块8和中间模块7连接在一起，所述定位器可以为任意形状。在一个实施方式中，定位器401和403是圆顶形状，同时，接收口400和402具有相应的形状，以接收圆顶形状的定位器401和403。这些定位器还被设计成用于中间模块7在显微镜载物台上的自导引(self-guiding)，以用于进行一致的成像和检测。由此，中间模块7的定位器可确保中间模块7总是以相同的方式定位在检测装置(如显微镜)下，以确保总是对相同的预设区域成像。可将定位器置于入口模块4的外周、出口模块8的外周和中间模块7的外周。
此外，如图1-图4所示的实施方式中的出口模块3，图5中所示的实施方式中的中间模块7可包含凹部72，该凹部适于仅容纳微筛6、或者同时容纳微筛6和任选的垫片5。凹部72的特征与图1-图4中所示的装置的出口模块3中的凹部31的特征一样。
凹部72包含通孔71，已通过微筛的过滤后的样品通过该孔流向出口模块8的出口36。可通过出口模块的孔口81施加于出口模块的出口的负压或吸力驱动液态样品通过细胞分离装置。通孔61可具有与过滤区61相同的尺寸、或者在尺寸上可以更大并超出过滤区61的尺寸。所述通孔可与入口模块的开口、垫片(如果有)的开口和微筛的过滤区61的开口成直线定位，或可被置于中间模块7的表面的其它任何地方。如果有凹部的话，可将通孔置于凹部71限制的区域中的某处，或如图5所示，可将通孔置于凹部72的中心。如果液体不得不流过角落，或不得不沿着水平面而不是直的垂直路径通过一定距离时，将产生流阻，而中心位置确保了较低的流阻。
可从图5中所示的细胞分离装置中移出中间模块7，并将其放置在显微镜下用于对微筛6分离的细胞进行成像。对于这一目的，微筛6和垫片5(如果有)都不需要移出。可以借助显微镜通过垫片5的开口51分析位于微筛6表面上(未通过微筛6的孔)的细胞。与图1-图4中所示的实施方式不同，只需要将中间模块移出并放置在显微镜下。为了显微镜分析，中间模块7的厚度被选定为足够薄，以便容易地置于显微镜的位于物镜正下方的载物台上。
出口模块8可包含突出部(未在图5中示出)，该突出部朝向中间模块7，是出口36的延伸。因此，设定该突出部的尺寸以装配入中间模块的通孔。该突出部将紧靠在通孔71的壁上，可确保从中间模块7流到出口模块8的流体不会在中间模块7与出口模块8之间的接触区中扩散。
出口模块8的出口36可延伸通过出口模块的整个主体，但是也可通向构成出口模块的一部分的空腔37。空腔37可包含出口模块的孔口81。该空腔可具有任何形状。在一个实施方式中，所述空腔37适于提供空间以将出口模块8装配至容器，该容器与出口模块8是可连接的(如图13中示例的烧瓶)。图1所示的装置的实施方式中也可包含这样的空腔38。这样的空腔可包含用于使本文涉及的细胞分离装置装配至容器的螺纹或现有技术中已知的其他工具。
类似于图1-图4中所示的细胞分离装置，图5中所示的细胞分离装置也可包含沟槽和围绕模块4、7和8外周的隔离材料。当组装模块4、7和8时，可将防水隔离材料装入到那些沟槽中以提供不漏水的闭合。聚合物材料制成的O型密封圈可被用作隔离材料。
在本文所述的装置中，可以整合多个中间模块2和中间模块7以及多个微筛6，使得不同尺寸的细胞以及除细胞外可能包含在液态样品中的其他组分能够相互分离。例如，就图5中所示的分离装置而言，可以将两个、三个或甚至更多个中间模块7互相堆叠，每个中间模块都带有微筛6，所述微筛6具有适合从液态样品中过滤出特定尺寸的细胞或组分的孔尺寸。在使用多个微筛的情况下，第一微筛含有最大的孔尺寸，同时，孔尺寸随着接下来的每个带有微筛的中间模块而缩小。对于图1-图4中所示的实施方式而言，可能需要包含额外的中间模块2和出口模块3。为了使该装置的整体尺寸最小化，可以提供具有孔口32和侧壁33的额外的出口模块。同样地，该出口模块的出口35可延伸入类似于入口模块的突出部13的突出部中，以紧靠在或几乎紧靠在接下来的中间模块的开口21周围的表面。
通常，中间模块2和中间模块7可具有约1-5mm之间的厚度，因此比入口模块1和入口模块4及出口模块3和出口模块8的厚度要明显的薄。用于细胞分离的装置的不同组件的尺寸可自由的适应于必需的应用，换言之，没有特定的限制。在一个实施方式中，入口模块、出口模块和中间模块在水平方向上最大尺寸为约2-8cm之间、或约2-5cm之间。用于细胞分离的装置的最大厚度可为约5-15cm之间。
通常，本文所用的微筛根据图12所示的原理工作。所述微筛包含具有孔直径603的微孔，所述微孔具有适于分离规定尺寸的细胞607的尺寸，如从液态样品(如全血)中分离循环肿瘤细胞(CTCs)。当细胞被截留在微筛的表面时，其他组分穿过过滤器。所述微筛可具有过滤区域(filtration region)，该过滤区域由各孔形成的通道的长度和过滤区的尺寸所限定。由微筛中的孔形成的通道示于图6(B)中。例如，如图12所示，这些孔的长度可与微筛的整体厚度相同或稍短。微筛的厚度可为约50μm-约1000μm、或为约150μm。相比之下，孔的长度，即孔通道的长度可为约50μm-约250μm之间、或约50μm-约150μm之间。在一个实施方式中，厚度至少为50μm、或至少为100μm、或至少为150μm。由贯穿微筛6的微孔形成的通道长度604至少为50μm。这些通道的特定长度提供了一种接近于体内小动脉中的血液流动条件的流体流动条件。此外，通道内血液的粘性进一步依赖于孔直径603，该孔直径603具有10μm的最小圆形通道直径(minimum around channel diameter)。这些效应的结合提供了高的提取效率。现有的微筛是随机地将真空力或压力与微筛尺寸(孔直径、通道长度)结合在一起，因此达不到这种效果。例如，下表1阐释了利用本文所述的任意装置来过滤流体样品(在本例中为全血)，以分离分散于全血样品中的细胞所得到的流体参数。
表1：计算得到的微筛过滤流体参数
Figure BDA0000105232210000131
备注：Re为雷诺数，Re＝ρVma/μb，其中Vm为速度，μb＝3.8cps是血细胞比容为45％的血液的本体粘度，ρ＝1060Kg/m3是血液密度，a为孔直径(10μm)。Vm＝Q/AΦ，其中Q为血液刚与微筛接触时的起始体积流速，A为膜面积，Φ＝0.63是具有10μm孔直径和12μm孔距的微筛的孔隙率。τ＝Vm/a为剪切率。
*1利用了104个HepG2细胞。
*2微筛直径(mm)涉及可用于通过本文所述的任意装置进行液态样品过滤的过滤区。
微筛的最大水平延伸可为约1mm-约3cm之间、或为约1.5cm，或者对于圆形微筛，其直径可为约1mm-约3cm之间、或为约1.5cm。微孔可以均一的式样相互隔开，即，它们形成例如图6(A)和图6(C)中示例的正则矩阵。在这种均一的孔矩阵中，从一个微孔到另一个微孔间的最大距离可为约2μm-约100μm之间。在一个实施方式中，该距离约为12μm。正如之前提到的那样，孔尺寸取决于待过滤的细胞。通常，微孔的尺寸为约2μm-约20μm之间、或为约10μm。
例如，可在患者血液中发现的循环肿瘤细胞(CTCs)可具有约15-40μm间的尺寸，然而白细胞具有的尺寸≤10μm。因此，根据图12，为提取这些循环肿瘤细胞，孔直径603应该足够大以让白细胞606和其他较小的血液组分(如红细胞605)穿过微筛6的孔，但孔直径603还应该足够小，以滤出循环肿瘤细胞607。
微筛可由任意材料制得，如玻璃、二氧化硅、金属网和基于SU-8环氧树脂的负性光刻胶。
本发明还涉及用于细胞分离的系统。除了本文所述的装置外，该系统可包含连接至该装置的出口模块的容器。如上所述，本文所述的装置的出口模块可适于连接至诸如烧瓶的容器。图13(A)-(C)给出了装配至烧瓶开口上的装置的示例。此外，该系统还可包含在出口模块3和出口模块8的出口施加负压的设备。施加的真空力可为约2-40kPa之间。在一个实施方式中，该真空力约为10kPa、或20kPa、或30kPa。施加负压的设备可以为例如真空泵。
该系统可进一步包含容纳液体的源，如另一个容器或甚至是连接至泵的容器，该泵主动向细胞分离装置泵压液体，以进一步增加提高过滤速度。该系统还能够主动将流体样品泵压通过所述装置，而不是通过在所述装置的出口模块处施加负压驱使流体样品通过装置。
对于本文所涉及的装置，例如对于血液中的循环肿瘤细胞，已显示出约为94％的过滤效率。此外，根据微筛上的有效过滤区的尺寸，对于全血的平均过滤速度可为约1-3ml/min之间、或约1.4-2.5ml/min之间(例如，参见图7)。例如，在图7中，以直径为约2-5mm之间的不同的圆形过滤区为基础，测定全血的流速，所述全血具有高于例如水溶液(如PBS缓冲液)的粘度。利用兔全血校准该流速。比较起来，其他微流体装置的流速要低得多(约为＜0.1ml/min)。
本发明还涉及从液态样品中分离规定尺寸的细胞(如循环肿瘤细胞)的方法。循环肿瘤细胞的实例包含但不仅限于：作为肝癌起因的HepG2、作为乳腺癌起因的MCF-7、HIV的CD4+T细胞以及用于产前检查的胎儿细胞。其它可被过滤的细胞包括但不仅限于：来自裂解的癌组织的癌细胞或癌干细胞、尿样中包含的细胞或从细胞培养基中富集的细胞。对于该方法，将液态样品(如全血、或尿、或培养基、或裂解的组织液)导入本文所述的任意装置并通过本文所述的任意装置过滤。过滤后，分离的细胞可以用光学检测装置(如显微镜)直接进行检测和/或可从微筛上移除以进一步检测和处理。
这个简单、低成本且高效的装置及它们的相应的使用方法对推动癌症生物学研究和临床癌症管理(包括癌症的检测、诊断和监控)具有影响。
本文所述的发明可适宜地在缺少本文未特别公开的任意单个要素或多个要素、单个限制因素或多个限制因素时加以实施。因此，例如，术语“包含/包括/含有”(comprising/including/containing)等应该开放地及非限制性地理解。此外，本文使用的术语和表述被用作描述性的术语，而非限制性的术语，所述术语和表述的使用并不旨在排除这些术语和表述显示或记载的特征的任何等同特征或其一部分，但是应该认识到，在本发明请求保护的范围内的任何修改都是可以的。因此，应当明白，尽管已通过优选的实施方式和可选的特征具体公开了本发明，本领域技术人员仍可以采用此处所公开的其所包含的本发明的修改和变化，并且这些修改和变化被视为落入本发明的范围内。
本文已经对本发明进行了宽泛和一般性的描述。落入该一般性公开内容的每种范围较窄的形式和下位群组也构成本发明的一部分。这包括了利用但书和否定式限定从大类中排除了任何主题的本发明的上位说明，无论本文中是否对所排除的材料进行了具体叙述。
其它实施方式也落入下述权利要求和非限制性实施例内。此外，一旦本发明的特征和方面是以马库什组的方式进行描述，本领域技术人员将认识到，本发明也因此将以马库什组中任意的单个成员或成员亚组的方式进行描述。
实施例
微筛的制造
通过利用在4″直径的硅晶片上的深度反应离子蚀刻(DRIE)(图14)或通过利用商购的玻璃毛细管阵列制造示例的微筛过滤器。简言之，通过在4″-直径的硅晶片(300μm厚)上的单掩膜光刻和双面离子反应蚀刻方法制造该微筛过滤器。其中，由使用光致抗蚀剂/氧化物硬掩模的100或150μm的深硅蚀刻产生该微筛的图案(例如孔尺寸为：直径10μm；孔距15μm)；由随后的基于SF6的等向性回蚀刻(isotropic back etch)限定该微筛过滤器的膜区。
过滤区
在使用前，利用连接在装置和通风的全血储存器(包含含有抗凝剂EDTA的新鲜兔全血(5ml))之间的液体流速计(SLG1600-20，Sensirion)测定微筛过滤器的最理想面积(图7)。当向微筛过滤器施加5kPa(通常可使用5-40kPa)的真空力时，监控流速变化。图7示出微筛的直径(2-5mm)和作为时间的函数的流速。结果显示，本文所述的装置具有非常低的流阻，可直接施用于未稀释的全血。
图6显示了密集孔阵列(如，＞4000孔/mm2)的高度均一的孔结构和平滑的通孔表面。与由于横向流体结构(lateral fluidic structure)(几个厘米的通道长度和100μm的通道高度)的高流阻而仅具有有限的细胞提取速度的平面微筛不同，该垂直微筛具有低得多的流阻(孔或通道长度604为150μm，孔开口≥35％的装置面积)，使得循环肿瘤细胞能够快速分离。图1和图5表示装置的组装。在图5中，微筛6被夹在具有整合的流体连接头41的入口模块4和具有整合的流体连接头71的中间模块7中间。有效孔区或过滤区61由入口连接头41的开口自我限定。在另一个实施方式中，该装置可进一步整合有Millpore
Figure BDA0000105232210000161
过滤器单元，以提供随时可用的组件(图13(B))。
细胞的分离
使用图1或图5中所示的装置从全血样品中分离循环肿瘤细胞，这里是HepG2细胞。在该装置中使用的微筛利用癌细胞(直径为12-40μm)和白细胞(直径≤10μm但不为0μm)间截然不同的形态学和尺寸差异，从全血中提取循环肿瘤细胞。在该装置中使用的微筛包含具有10μm孔直径(图12中的603)的密集孔阵列(＞4000孔/mm2)。这样的微筛可以有效截留＞94％的各种癌细胞(图10)。在微筛上分离的HepG2细胞(肝癌)的SEM图像清楚地示出微筛和癌细胞的相对尺寸(图6(C))。
图13(C)表示在另一个实施例中用于分离循环肿瘤细胞的实验配置。通过以真空计(ITV2091-212BL5，SMC Phenumatics)连接至整合的微筛过滤器单元的吸力来控制全血的流体流动。通过离心管收集全血样品的过滤废物。相比于现有的利用备用熔融孔膜过滤器(spare fused poresmembrane filter)、抗体缀合的实验室-芯片装置、抗体缀合的磁珠和微加工聚对二甲苯膜过滤器的循环肿瘤细胞分离方法，该系统非常简单。已在癌细胞系(HepG2：肝癌；MCF-7：乳腺癌；以1-50个细胞/ml的量稀释在磷酸盐缓冲生理盐水中)和患有肺癌的大鼠的全血样品中(图11)成功进行了循环肿瘤细胞的分离。利用DAPI(细胞核)和EpCAM(上皮细胞标记)对捕获的细胞进行染色，并用荧光显微镜手动计数。当圆形过滤区的直径为2mm时，在体积为5ml的全血样品中的提取时间小于15min。在一个实施例中，5ml的血液在2min内就已滤过细胞分离装置。
在另一个实施例中，为测定捕获循环肿瘤细胞(如HepG2)的效率，将培养的肝癌细胞(HepG2/GFP)以10-100个细胞/ml的比例掺入到兔全血中，并利用上述的微筛捕获掺入的癌细胞。
通过用GFP报告质粒转化HepG2细胞，构建HepG2/GFP细胞系(在约509nm的激发峰下显示为绿色)，这使得可在荧光显微镜下对癌细胞进行可视计数。在过滤前，将所述HepG2/GFP细胞按标准的固定程序固定，并在血细胞计数器(Hausser Scientific，Horsham，PA，USA)上手动计数。利用DAPI对HepG2的细胞核染色，该细胞核在荧光图像中显示为蓝色(图9-11)(激发峰在约460nm)，而在细胞表面表达的绿色荧光蛋白(GFP)显示为绿色(约509nm)。利用IMAGE-PRO 6.0软件(MediaCybernetics，USA)，通过正置Lecia DM 5000B荧光显微镜对捕获的循环肿瘤细胞进行手动计数。灰度图是用软件人为着色的，以符合所用的过滤器的各自的颜色。此外，图8显示了掺入到1ml的兔全血样品中的HepG2(10-100个细胞)的回收率，平均回收率＞90％。
附图标记编号表
1、4      入口模块
2、7      中间模块
3、8      出口模块
5         垫片
6         微筛
11、42    入口的开口
12、23    沟槽
13        突出部
14        入口模块的入口
21                              中间模块的通孔
22                              中间模块的圆锥体或漏斗状物
24                              中间模块的延伸部
31                              凹部
32                              孔口
33                              出口模块的侧壁
35、36                          出口模块的出口
37、38                          空腔
41                              入口模块的入口
51                              垫片的通孔
61                              过滤区
71                              中间模块的通孔
72                              中间模块的凹部
81                              出口模块的孔口
201、202、203                   连接头
205、206、207、301、302、303    用于紧固工具的开口
400、402                        用于定位器的接收口
401、403                        定位器
600                             硅晶片
601                             Si02层
603                             孔直径的指示
604                             孔长度或深度的指示
605                             红细胞
606                             白细胞
607                             循环肿瘤细胞(CTC)

Claims (31)

1.用于从样品中分离规定尺寸的细胞的装置，其中，所述装置包含：
具有入口的入口模块；
具有出口的出口模块；
具有通孔的中间模块，其中，所述中间模块置于所述入口模块和所述出口模块之间；
具有微孔的、用于截留规定尺寸的细胞的微筛，所述微筛置于所述入口模块和所述中间模块之间；以及
其中，所述入口模块、所述出口模块和所述中间模块可移除地相互连接，且该连接为流体连接；并且
其中，由贯穿所述微筛的微筛的各微孔形成的通道的长度至少为50μm。
2.用于从样品中分离规定尺寸的细胞的装置，其中，所述装置包含：
具有入口的入口模块；
具有出口的出口模块；
具有通孔的中间模块，所述中间模块置于所述入口模块和所述出口模块之间；
具有微孔的、用于截留规定尺寸的细胞的微筛；
其中，所述入口模块、所述中间模块和所述出口模块可移除地相互连接，且该连接为流体连接；
其中，所述微筛置于所述中间模块和所述出口模块之间；并且
其中，由贯穿所述微筛的微筛的各微孔形成的通道的长度至少为50μm。
3.如权利要求2所述的装置，其中，所述入口模块包含置于所述入口模块的入口的相对侧的突出部；其中，所述突出部为所述入口的延伸，当处于组装状态时，所述突出部适于接触所述中间模块的通孔周围的所述中间模块的表面。
4.如权利要求2或3所述的装置，其中，所述中间模块具有圆锥体形状；其中，所述中间模块的通孔布置在所述圆锥体的底部。
5.如权利要求4所述的装置，其中，所述圆锥体的尖端朝向所述微筛。
6.如权利要求2-5任一项所述的装置，其中，所述中间层限定微筛上的过滤区；其中，所述中间层的通孔的尺寸限定所述过滤区的尺寸。
7.如权利要求2-6任一项所述的装置，其中，所述出口模块包含具有凹部的顶面，所述凹部置于所述顶面内；其中，所述凹部适于容纳微筛；其中，所述凹部包含所述出口模块的出口。
8.如权利要求7所述的装置，其中，所述出口模块的凹部中的出口位于与所述中间层的开口相对的位置。
9.如权利要求8所述的装置，其中，所述出口模块包含具有孔口的侧壁；其中，所述孔口位于所述凹部的外部；其中，所述孔口与施加负压的设备是可连接的。
10.如上述任一项权利要求所述的装置，其中，所述出口模块的侧壁与容器是可连接的。
11.如上述任一项权利要求所述的装置，其中，所述微筛的厚度为约50μm-约1000μm之间、或为约150μm。
12.如上述任一项权利要求所述的装置，其中，所述微筛的最大水平延展为约1mm-约3cm之间、或为约1.5cm。
13.如上述任一项权利要求所述的装置，其中，所述微孔以均一的式样相互隔开。
14.如上述任一项权利要求所述的装置，其中，所述各微孔的直径为约2μm-约20μm之间、或为约10μm。
15.如上述任一项权利要求所述的装置，其中，所述各微孔的直径适于待分离细胞的尺寸。
16.如上述任一项权利要求所述的装置，其中，从一个微孔的中心到另一个微孔的中心的最大距离为约2μm-约100μm之间、或约12μm。
17.如上述任一项权利要求所述的装置，其中，由贯穿所述微筛的微筛的各微孔形成的通道的长度在约50μm-约150μm之间、或在约150μm-约250μm之间。
18.如权利要求1所述的装置，所述装置进一步包含具有通孔的垫片，所述垫片置于所述微筛和所述入口模块之间；其中，所述垫片限定所述微筛上的过滤区；其中，所述垫片的通孔的尺寸限定所述过滤区的尺寸。
19.如权利要求1或18所述的装置，其中，所述中间模块包含用于容纳所述微筛的凹部。
20.如权利要求19所述的装置，其中，设定所述凹部的尺寸以容纳所述微筛和所述垫片。
21.如权利要求6以及18-20任一项所述的装置，其中，所述过滤区的最大尺寸为约0.5-20mm之间、或约2-5mm之间。
22.如上述任一项权利要求所述的装置，其中，所述出口模块适于在其出口处施加负压。
23.如上述任一项权利要求所述的装置，其中，所述模块包含置于模块间的接触区的定位器，当组装模块时，所述定位器固定各模块间的相对位置。
24.包含如下组件的系统：
如权利要求1-23任一项所述的装置；
连接至所述装置的出口模块的容器；和
用于施加负压的设备，所述设备连接至所述装置的孔口，所述孔口适于与所述用于施加负压的设备是可连接的。
25.如权利要求24所述的系统，所述系统进一步包含用于容纳液态样品的液体源；其中，所述液体源流体连接至所述装置的入口。
26.从液态样品中分离规定尺寸的细胞的方法，所述方法包含：通过上述任一项权利要求所述装置的入口过滤可能含有待分离细胞的液态样品。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述液态样品选自由血液、尿、培养基和裂解的组织液组成的组。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中，所述待测细胞选自由循环肿瘤细胞、来自裂解的癌组织的癌细胞或癌干细胞、尿样中含有的细胞以及从细胞培养基中富集的细胞组成的组。
29.如权利要求26-28任一项所述的方法，其中，将分离后的细胞从微筛上移除。
30.如权利要求1-23任一项所述的装置或权利要求24或25所述的系统用于过滤血液的用途。
31.如权利要求30所述的用途，该用途用于从血液中分离循环肿瘤细胞。
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