CN109563480A - 从血液中检测细胞的个体化微过滤方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种基于毛细管数的从个体的血液样本中分离循环稀有细胞的方法，所述方法利用基于血液样本的血液流变学参数测量结果而确定的过滤参数。本申请还提供了一种确定微流体弹性过滤过程中的过滤参数的方法，所述微流体弹性过滤过程用于从个体的血液样本中分离循环稀有细胞。本申请还提供了用于执行本申请描述的方法的从个体的血液样本中分离循环稀有细胞的设备以及非暂时性计算机存储介质。

Description

从血液中检测细胞的个体化微过滤方法

交叉引用

本申请要求2016年4月27日提交的美国临时专利申请62/328,171号和2016年8月29日提交的中国专利申请201610753136.9号的优先权，其中，2016年8月29日提交的中国专利申请201610753136.9号要求美国临时专利申请62/328,171号的优先权。通过援引方式将这两个申请整体并入本文。

发明背景

发明领域

本申请涉及从样本中分离和检测细胞。具体而言，本申请涉及对个体对象的循环稀有细胞(如循环肿瘤细胞(CTC))的个体化微过滤。

相关技术描述

癌症在全球范围内是首要死因，其中，癌症转移导致的死亡占癌症死亡总人数超过90％。循环肿瘤细胞(CTC)是指从实体瘤脱落并进入外周血液的癌细胞。从人类血液中检测CTC作为液体活检，相对非侵入式地进行癌症诊断和治疗监测。以CTC作为生物标志物，可以实现个体化治疗、理解转移过程、乃至靶向治疗方案。

已经针对CTC检测开发出多种基于膜的微过滤系统。尽管普遍认为，与正常血细胞相比，CTC通常较大并且形变能力差，但是现有的对于微过滤系统的报道仍然仅仅关注尺寸差异(G.Vona,et al.Am J Pathol,2000,156,57-63；I.Desitter,et al.Anticancer Res,2011,31,427-41；M.Hosokawa,et al.Analytical Chemistry,2010,82,6629-35；M.Hosokawa,et al.PLoS ONE,2013,8,e67466；S.Zheng,et al.J Chromatogr A,2007,1162,154-61；R.A.Harouaka,et al.Clin Chem,2014,60,323-33；L.S.Lim,et al.LabChip,2012,12,4388-96；S.J.Tan,et al.Biosens Bioelectron,2010,26,1701-5；C.T.Lim,et al.Biomed Microdevices,2009,11,883-92；H.Mohamed,et al.J ChromatogrA,2009,1216,8289-95)。CTC与正常血细胞在力学性质上的差异——在细胞刚度或弹性方面，尚未被用于设计CTC检测的微过滤系统。

包括对CTC微过滤捕获的理论建模、仿真以及实验研究在内的系统性研究对于开发优化的设计至关重要。然而，仅有少数研究致力于这样的基础性工作。一些实验研究展示了在具有不同的滤孔尺寸、孔隙率(open factor)、流量、血液稀释度与样本预处理的不同微过滤系统中的癌细胞捕获结果，但是并未给出明确的设计准则或生物力学研究(F.A.W.Coumans,et al.PLoS ONE,2013,8,e61774；F.A.W.Coumans,et al.PLoS ONE,2013,8,e61770；D.L.Adams,et al.RSC advances,2014,9,4334-42)。另一方面，有纯力学建模工作研究了CTC在穿过具有不同截面的五种滤孔时所受的压力，并突出说明圆形截面最适于高效分离CTC(Z.Zhang,et al.Lab Chip,2014)。Tai等提出了高效捕获具有高活性的癌细胞的方法，其中仅清楚地提供了实现高活性的定量方法，而没有给出具有高效率和高纯度的CTC捕获的清晰设计准则(Tai et al.,US 2012/0178097A1)。因此，仍然缺乏系统性研究来实现高效率和高纯度的CTC微过滤捕获。

现有所有用于从癌症患者进行CTC检测的微过滤系统对不同患者使用一系列的固定和恒定参数，而没有考虑个体差异。已经广泛报道了癌症患者与健康对照组在全血液粘度上存在差异(A.Pinkowski,et al.bioRxiv,2015；S.O.Elusoji,et al.Afr J ReprodHealth,2008,12,84-9；G.-F.von Tempelhoff,et al.Clin Hemorheol Microcirc,2001,26,55-61)。对癌症患者进行诸如手术和化疗的治疗也会改变他们的全血粘度(A.Pinkowski,et al.bioRxiv,2015；C.E.Omoti,et al.Pak J Med Sci,2007；M.Khan,etal.Clin Hemorheol Microcirc,1995,15,4)。血液粘度在确定微过滤系统的优化参数中起重要作用。但是，目前还没有提供考虑到个体差异的个体化微过滤系统。

因此，仍需要开发实现具有高效率和高纯度的通过微过滤的CTC捕获方法以及个体化微过滤方法来克服以上缺点。本发明满足这些要求以及其他要求。

发明概述

在一方面，本申请提供了一种从个体的血液样本中分离循环稀有细胞的方法，包括以下步骤：

任选地，对样本进行预处理以去除至少一部分红细胞(RBC)，

测量样本的血液流变学参数，

基于血液流变学参数的测量结果，确定过滤参数，以及

使用确定的过滤参数，对样本进行微过滤。

在一些实施方案中，循环稀有细胞是循环肿瘤细胞(CTC)。与循环肿瘤细胞相比，白细胞在存在于血液中的细胞中占比更高，并且尺寸更小。因此，本方法适用于将循环肿瘤细胞与白细胞分离。

在一些实施方案中，个体患有肿瘤或被怀疑患有肿瘤。在一些实施方案中，个体是哺乳动物，例如人。

在一些实施方案中，肿瘤选自乳腺癌、宫颈癌、肾癌、头颈癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、胆道癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、肾癌、尿路上皮癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、白血病、骨髓增生异常综合征、恶性淋巴瘤、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、皮肤癌、脑肿瘤、胸膜间皮瘤以及未知原发癌。

在一些实施方案中，预处理步骤包括使样本与RBC裂解缓冲液接触。应当理解，预处理步骤是任选的。在一些实施方案中，血液样本是全血样本。在这种情况下，尽可能多地从样本中除去红细胞是有利的。在一些实施方案中，血液样本已经过去除红细胞的步骤处理。在这种情况下，预处理步骤不是必需的。

本方法的目的之一是基于不同个体之间血液样本的不同血液流变学特性，提供从血液样本中对循环稀有细胞的有效分离。在一定程度上，本方法提供了基于来自指定个体的血液样本的独特血液流变学特性来分离循环稀有细胞的个体化策略。

在一些实施方案中，血液流变学参数包括样本粘度、循环稀有细胞的平均刚度、循环稀有细胞的平均直径、以及它们的任意组合。应该理解，在本领域中还存在其他可用且可测量的血液流变学参数。任何适用于本申请的方法的血液流变学参数都可以被选择。

基于血液流变学参数的测量结果而确定的过滤参数可包括多种形式的参数，包括但不限于流速、滤孔尺寸、孔隙率和尺寸，以及过滤通量。本领域技术人员能够理解，过滤参数可以通过各种参数并且以各种方式表征。一些参数是独立的，例如滤孔尺寸。一些参数，例如过滤通量，取决于一系列其它参数。因此，本申请中的过滤参数可以以一般方式理解，并且可以包括过滤过程中涉及的参数的任何适当组合。

本申请的发明人建立了如下所示的参数，即，毛细管数(Ca)，其可用于预测过滤效率：

其中V是微过滤步骤中的平均流速，单位为mm/s；μ是样本粘度，单位为mPa·s；σ是循环稀有细胞的平均刚度，单位为mN/m。V、μ和σ可以通过本领域中已知的方法确定，包括但不限于后文描述的示例性方法。

在一些实施方案中，确定过滤参数会使得毛细管数(Ca)为0.02-0.04，例如，0.020、0.021、0.022、0.023、0.024、0.025、0.026、0.027、0.028、0.029、0.030、0.031、0.032、0.033、0.034、0.035、0.036、0.037、0.038、0.039、0.040。

在一些实施方案中，确定过滤参数使得优化的毛细管数(Ca)为0.03-0.04。

如本领域技术人员所理解的，μ和σ可以是血液样本的血液流变学参数，以及可以从血液样本的血液流变学参数确定。在一些实施方案中，σ可以是预先决定的参数。因此，对于给定的Ca，可以计算得到V的值。所得的V值可以体现为其他过滤参数或参数组合，只要在过滤步骤中可以达到所得的V值。

本申请的发明人还建立了如下所示的另一个参数，即，归一化细胞直径d^*，其可用于预测过滤效率：

其中d_c是目标循环稀有细胞的平均直径，d_p是滤孔直径。d_c和d_p的单位相同。

在一些实施方案中，滤孔直径为循环稀有细胞平均直径的大约1/2，即d^*约为2。不受任何特定理论的约束，该配置有利于提高过滤效率。

在一些实施方案中，本方法还包括通过使用纳米尖端(Nano-spike)电极的电化学阻抗谱，以电学方式鉴定微过滤过程中捕获的细胞的步骤。该步骤可以通过现有技术中已知的方法完成，包括但不限于下文描述的示例性方法。

在一些实施方案中，本方法还包括通过使用纳米尖端电极的电化学阻抗谱，以电学方式检测外泌体中的蛋白质和/或miRNA的步骤，其中外泌体分离自微过滤步骤的滤液。该步骤可以通过现有技术中已知的方法完成，包括但不限于下文描述的示例性方法。

在一些实施方案中，本方法还包括去除来自样本的背景细胞(例如白细胞)的步骤。应该理解，该步骤可以在任何适当的时间进行，例如在预处理步骤之后、微过滤步骤之前、或是在微过滤步骤期间(参见图8的示例性实施方案)。

在一些实施方案中，去除背景细胞的步骤包括在过滤器上提供靶向于背景细胞的亲和性涂层，所述过滤器的孔径足够大使得循环稀有细胞能够流过。在一些具体实施方案中，亲和性涂层是基于抗体与存在于背景细胞表面上的抗原的结合。在一些具体实施方案中，背景细胞是白细胞，亲和性涂层包含抗CD45抗体。

在另一方面，本申请中提供了一种用于确定微过滤过程中的过滤参数的方法，所述微过滤过程用于从个体的血液样本中分离循环稀有细胞，所述方法包括：细胞微过滤中参数的归一化、微过滤中细胞捕获的理论建模与仿真、捕获效率的相图和微过滤中优化参数的确定。

在一些实施方案中，本方法实施于与循环稀有细胞为相同种类的细胞系的细胞。作为示例性实施方案，当待分离的循环稀有细胞为乳腺癌细胞时，本方法可以实施于来自已经建立的乳腺癌细胞系的细胞，以确定微过滤的优化参数，例如毛细管数(Ca)。然后，得到的微过滤参数，例如毛细管数(Ca)，可以用于从个体的血液样本中分离循环乳腺癌细胞的方法，或者作为其参考。

另一方面，本申请提供了一种用于从个体的血液样本中分离循环稀有细胞的设备，包括：

任选的预处理装置，用于对样本进行预处理以去除至少一部分红细胞(RBC)；

测量装置，用于对样本的血液流变学参数进行测量；

确定装置，用于基于血液流变学参数的测量结果来确定过滤参数；以及

微过滤装置，用于使用所确定的过滤参数对样本进行微过滤。

在另一方面，本申请中提供了一种非暂时性计算机存储介质，其存储计算机程序，当所述计算机程序由一个或多个处理器执行时，使所述一个或多个处理器执行包括以下的操作：

接收血液样本的血液流变学参数；

基于血液流变学参数的测量结果，确定过滤参数；以及

任选地，输出过滤参数。

另一方面，本申请中提供了一种从样本中分离癌细胞的方法，包括以下步骤：

测量样本的血液流变学参数；

基于血液流变学参数的测量结果，确定过滤参数；

使用所确定的过滤参数，对所述样本进行微过滤。

在一些实施方案中，本方法还包括：根据本申请描述的方法，确定癌细胞的临界毛细管数(Ca^*)的步骤。在一些实施方案中，临界毛细管数(Ca^*)是预先确定的。在一些实施方案中，基于血液流变学参数的测量结果确定过滤参数包括：选择过滤参数，使得本方法的Ca接近癌细胞的临界毛细管数(Ca^*)。

附图简要说明

图1显示为流程图，代表使用“基于毛细管数的微流体弹性过滤”从血液样本中分离循环稀有细胞的示例性方法中的步骤。

图2显示滤孔上细胞捕获过程的理论建模，其中细胞以质量-弹簧-阻尼系统进行建模。

图3显示归一化细胞形变量作为毛细管数Ca的函数的建模结果，其中增强癌细胞捕获的临界毛细管数值(Ca^*)鉴定为0.033-0.038的范围。

图4显示归一化白细胞形变量作为Ca的函数的模型结果，其中增强WBC捕获的毛细管数值Ca_LC鉴定为0.021。

图5显示利用具有不同孔尺寸的微过滤设备和不同粘度的细胞悬液，HeLa、HEK293和MCF-7细胞的捕获效率。每次测试中毛细管数的平方根，即sqrt(Ca)，标示于相应的柱上。

图6显示微过滤系统中癌细胞捕获效率的相图作为归一化的细胞直径和Ca的函数，这可以指导实现微过滤系统中的高捕获效率。

图7显示微过滤系统中WBC清除效率的相图作为归一化细胞直径和Ca的函数，这可以指导实现微过滤系统中WBC的高清除效率。

图8显示具有双层滤膜的微过滤系统设计图，用于在微过滤系统中对WBC进行双重清除，以从血液样本中分离CTC。

图9A到9E显示利用通过利用纳米尖端电极的电化学阻抗谱进行癌细胞鉴定。(A)显示实验装置；(B)和(C)显示浓度为10⁸细胞/毫升的癌细胞与非癌细胞的波特图结果，其中(B)显示阻抗幅值，(C)显示阻抗相位；(D)显示改进的Randle等效电路，用于拟合阻抗数据和提取参数；(E)显示细胞培养基以及癌细胞/非癌细胞的归一化电荷传递电阻R_ct。

图10显示为流程图，代表从血液样本中分离循环稀有细胞和外泌体的示例性方法。

图11显示在预先设计的个体化微过滤系统中对癌细胞或CTC的检测步骤，包括在个体化流速下进行血液过滤、芯片上免疫染色、荧光显微镜检查和图像处理。

图12A-B显示在具有优化的参数的微过滤系统中，对不同体积血液中添加的癌细胞的捕获效率。

图13显示基于广州市第一人民医院(F_C1至F_B7)和中山大学(SYSU)附属肿瘤医院(S_C1至S_P1)的癌症患者的个体血液粘度μ的pMFC操作的个体化流速。

图14显示在免疫荧光染色之后，具有8微米孔的pMFC中捕获到的CTC和WBC，所有比例尺均为20微米。

图15显示在pMFC技术(由2毫升归一化到7.5毫升)和分析中11例癌症患者的CTC计数值的比较。

图16中显示MCF-7细胞的捕获效率(η_c)和WBC的对数清除(η_w-log)被拟合为Ca的函数。

图17显示28名癌症患者中，CTC的捕获效率(η_c)和WBC的对数清除(η_w-log)的个体化效应。

发明详细描述

以下是贯穿本公开内容的若干定义。

本文中所用术语“循环稀有细胞”是指通常不存在于个体的循环系统(例如血液)中的细胞。作为实例，“循环稀有细胞”可以是患有肿瘤或疑似患有肿瘤的个体中的循环肿瘤细胞(CTC)。

本文中所用术语“红细胞”和“红血球”可互换使用，并且以本领域普通技术人员公认的方式理解。

本文中所用术语“白细胞”和“白血球”可互换使用，并且以本领域普通技术人员公认的方式理解。

在本申请中用于分离肿瘤细胞的一些模型中，术语“捕获效率”定义为在设备上捕获的肿瘤细胞数量与掺入的肿瘤细胞数量的百分比。

在一些实施方案中所使用的术语“纯度”可以指目标癌细胞在所有分离到的产物中所占的百分比，如CTC在所有分离到的细胞中所占百分比。由于该定义取决于目标癌细胞的数量，因此在一些实施方案中，术语“纯度”可以由白细胞的清除效率(η_LD)表示，其定义为η_LD＝log(Ni/Nt)；其中，Ni是注入的白细胞数量，Nt是捕获到的白细胞数量。例如，微过滤设备从10⁷个注入的白细胞中捕获了1000个白细胞，即表示4-log的清除效率。

图1是流程图，显示从血液样本中分离循环稀有细胞的示例性方法的过程100。在预处理101中，用红细胞(RBC)裂解缓冲液对抽取的血液样本进行稀释，以减少数量巨大的RBC。在一个实施方案中，使用1:1(v/v)的稀释比，实现高于70％的RBC裂解效率。然后，对稀释后的血液样本进行血液流变学测量102。在一个实施方案中，血液流变学测量102采用血液流变仪测量稀释后的全血的粘度。然后，基于测得的粘度值，通过本发明提供的步骤103确定过滤参数。然后，基于确定的过滤参数，实施血液样本微过滤104，以分离循环稀有细胞。在一个实施方案中，循环稀有细胞是CTC。可以通过过程105鉴定和检测分离得到的细胞。在一个实施方案中，通过免疫染色从背景白细胞中鉴定出分离得到的CTC。在另一个实施方案中，可以通过使用纳米尖端电极的电化学阻抗谱来鉴定捕获的癌细胞。

图2显示微过滤设备中细胞捕获的理论模型。在一个实施方案中，细胞是CTC。在另一个实施方案中，细胞是白细胞。在该简化的二自由度(2-DOF)模型中，细胞行为被建模为质量-弹簧-阻尼(m-c-k)系统以描述其质心的运动过程。

微过滤设备中的细胞捕获主要包含三个部分，即，滤膜、流体和细胞。图2中标示出了各个部分的特征，其中流体的粘性力与细胞刚度之间的竞争，以及细胞与滤孔之间的相互作用决定细胞在过滤之后是否能被膜上的滤孔捕获。来自流体的粘性力由平均流速V和粘度μ表征。细胞由细胞直径d_c和刚度σ表征。滤膜由其滤孔直径d_p表征。

为了使微过滤设备中细胞捕获的参数研究一般化，利用量纲分析将上述的主要参数进行归一化。两个用于表征细胞捕获的无量纲参数被鉴定为毛细管数Ca和归一化细胞直径d^*，其定义分别如公式1和2所示。

其中：

V是微过滤腔中的平均流速，可以以mm/s为单位；

μ是流体的粘度，可以以mPa·s为单位；

σ是细胞刚度，可以以mN/m为单位；

d_c是细胞直径；

d_p是滤孔直径；

d_c与d_p优选以相同的单位表示。

在图2中，细胞被简化为质量-弹簧-阻尼(m-c-k)系统。在x方向，垂直于流体的方向，细胞受到拉伸的剪切力F_剪切，

其中，R_c是细胞半径，x是质量-弹簧-阻尼系统的位移。将细胞的质心作为固定点，位移x代表半个白细胞的形变，可由以下常微分方程(ODE)表征。

在沿着流体流动的y方向，细胞受到跨滤膜的流体动力学压力载荷F_压力，

其中跨滤膜的压降ΔP为

其中h是滤膜的高度。将细胞与滤膜的接触面作为固定点，细胞的位移y方向可由以下ODE表征。

利用公式1中Ca的定义替换流体流速V与粘度μ，可以将剪切力F_剪切和压力载荷F_压力表达为Ca的函数。因此，通过对x和y方向的公式4和7两个ODE进行求解，可确定Ca对在滤孔上受到挤压的细胞的形变的影响。

三种细胞系被用于对微过滤设备中的癌细胞捕获进行理论建模。癌细胞的质量m由细胞的尺寸和水的密度进行估计，并且假设其在过滤过程中保持不变。为了估计细胞的阻尼系数c，细胞被模拟为与球形细胞具有相同体积的圆柱体。按照如下公式，从细胞的表观粘度μ_c估计阻尼系数c，

其中，A是与细胞具有相同体积的等同圆柱体的底面积，l是圆柱体的高度；癌细胞的弹性系数k被选择为细胞刚度σ的值。

以下表格总结了微过滤设备中癌细胞捕获的理论模型中使用的参数。

通过对x和y方向的公式4和7中两个ODE进行求解，可以得到细胞对应形变与Ca的函数。图3显示细胞形变Δx和Δy与Ca的函数。在此，当细胞的质心没有超过滤膜厚度h的中点时，则认为细胞被滤孔捕获，使得Δy/(R_c+0.5h)<1。在y方向上的归一化形变小于1时的Ca范围中，细胞仍然被滤孔捕获，同时在x方向的拉伸增强了细胞的捕获。因此，可以确定出对应于Δy/(R_c+0.5h)＝1时的增强癌细胞捕获的临界Ca值。从图3中可以看出，HeLa、HEK293和MCF-7细胞的临界Ca值分别为0.033、0.036和0.038。

通过微过滤设备中细胞捕获的理论模型也研究了白细胞的捕获。中性粒细胞占人体血液中白细胞总量超过60％，并与其他四类白细胞相比具有相对较大的尺寸，因此在理论模型中作为代表性的白细胞。下表总结了2-DOF模型中的参数，其中白细胞的平均直径由库尔特计数器(Z2，贝克曼库尔特公司)测得，为6.87±1.28微米。

图4显示白细胞的形变Δx和Δy与Ca的函数关系。在此，当白细胞的质心没有超过滤膜厚度h的中点时，认为白细胞被滤孔捕获，使得Δy/(R_c+0.5h)<1，其中R_c是白细胞半径。因此，对应于Δy/(R_c+0.5h)＝1，此时Δx/R_c＝0.5，可以确定出增强白细胞捕获的临界毛细管数，Ca_LC＝0.021。

在对微过滤系统的细胞捕获进行系统性实验研究时，使用三种癌细胞系，因为它们具有不同的皮质张力。细胞的培养采用高糖杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(Sigma-Aldrich，美国)，添加10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen，美国)和1％青霉素-链霉素(Invitrogen，美国)，在37℃、5％(v/v)二氧化碳的孵育箱中培养于10平方厘米的灭菌培养皿中。

在这组测试中，采用恒定流速5毫升/小时(雷诺数均小于0.1)。由于不同滤孔尺寸的滤膜的孔隙率不相同，导致了在设备中的平均流速V也不同。对于滤孔尺寸分别为5、8、10和12微米的滤膜，微过滤设备中的平均流速V的范围为1.6到3.2mm/s。

为了调整细胞悬液的粘度μ，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(Sigma-Aldrich，美国)被加到PBS，后续作为细胞稀释缓冲液。自20世纪50年代以来，PVP就已经被用作血浆扩容剂。近年来，由于其出色的生物相容性，PVP被用于很多生物学研究中来改变血浆粘度。在进行芯片上(on-chip)实验之前，根据荧光显微镜检查结果，PVP浓度为0、5、10和20(w/v％)的稀释缓冲液中细胞的尺寸和活力不受影响。用毛细管粘度计测量这些细胞稀释缓冲液的粘度。结果表明，在25℃下，粘度范围为0.9-23.6mPa·s。

因此，在本实验研究中，Ca从0.0005到0.5跨越三个数量级变化。为了使Ca更紧凑以及简化数值计算，引入Ca的平方根，即，(sqrt(Ca))，范围是0.02至0.7。下表显示测试微流体过滤设备的细胞捕获效率η_c中细胞系和参数的特征。

为了收获培养的细胞系，使用0.01％的胰酶(Sigma-Aldrich，美国)将亚融合的单层细胞解离下来。采用血细胞计数板对细胞浓度进行人工计数。然后将细胞以1000个细胞/毫升的浓度重悬到一定粘度的稀释缓冲液中。

用数字注射泵，将2毫升体积的细胞悬液(约2000个细胞)，以5毫升/小时的流速注入每个微过滤芯片中。将微过滤设备置于配备有CCD照相机的荧光显微镜下(BX41,奥林巴斯,日本)。过滤结束后，通过以相同流速注射吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)(Sigma-Aldrich，美国)荧光染料标记捕获的细胞。注入2微克/毫升的染料混合物(总体积可能为0.5毫升)，从而区分红色的凋亡细胞和绿色的活细胞。然后，以相同流速注入1毫升磷酸盐缓冲液(PBS)洗去多余的染料。洗涤过程后，获取图像以计数捕获的细胞。利用细胞图像分析工具进行计数。捕获效率确定为捕获的细胞数与注入细胞总数量的比。

图5显示了使用滤孔尺寸为5、8、10和12微米的微过滤设备，4个不同的粘度的悬液中三种细胞的捕获效率η_c。在具有8、10和12微米滤孔的滤膜的设备中，HeLa细胞的η_c随细胞悬液粘度的增加而增加，而HEK293和MCF-7细胞的η_c则是随细胞悬液粘度的增加而先增加再减小。这些结果表明，粘度差异不是决定滤孔上细胞捕获的唯一机制。由于细胞类型之间皮质张力的差异，粘性力与细胞皮质张力之间的对抗应该以Ca的形式进行考虑。

对于具有5微米滤孔的滤膜的设备，当粘度增加时，三种细胞的捕获效率没有显著改变。这是由于细胞的形变能力存在上限，表明即使细胞在非常高的粘度下剧烈变形，细胞仍然被滤膜上的5微米滤孔所捕获。此外，在相近的Ca值、具有相同的滤孔尺寸的设备，但使用不同种类细胞时，例如使用具有8微米滤膜的设备，MCF-7细胞在5.56mPa·s的粘度下以及HEK293细胞在23.63mPa·s的粘度下的sqrt(Ca)都等于0.35，但是发现捕获效率是不同的。因此，细胞与滤孔的尺寸都应该被纳入为影响整体η_c的参数。所以，以上对于实验结果的分析与前述的量纲分析一致，表明需要公式1和2所示的两个无量纲数对微过滤设备中的细胞捕获进行表征。

图6显示的是相图(Phase Diagram)，其总结了细胞捕获效率作为sqrt(Ca)和d^*的函数的结果。相图展示了捕获效率作为sqrt(Ca)和归一化细胞尺寸d^*的函数，其中捕获效率的值以不同色彩强度来表示。对于HeLa细胞，在测试的Ca范围内捕获效率持续增加。对于HEK293和MCF-7细胞，捕获效率先随Ca的增大而上升，但当Ca超过一定数值时，捕获效率降低。发现所有这些Ca值均大于全部三种细胞种类对应的sqrt(Ca^*)，说明当Ca超过有助于细胞捕获的临界值时，捕获效率才开始下降。因此，我们的模型与实验结果被证实是一致的。

理论上，更大的d^*一定会带来更高的捕获效率。但是，在处理人类的全血样本时，还应当考虑捕获的CTC的纯度。为了达到高的纯度，希望能够从滤膜完全去除血细胞，尤其是白细胞(直径在7到12微米)。因此，同时实现满意的捕获效率和纯度的一般指导原则为，在用于从血液样本捕获CTC的微过滤系统中设计d^*约为2，sqrt(Ca)约为0.2。

通过将相同的实验方法应用于人类白细胞，也可以获得关于白细胞捕获效率的指导原则。为了实现从全血中高纯度地分离CTC，白细胞的捕获效率应该降到最低。因此，在给出癌细胞捕获效率指导的同时，还可以得出对于高捕获效率和纯度的综合指导。

按照标准流程，从全血样本中提取白细胞。用EDTA涂覆管(阳普医疗科技有限公司，中国)采集血液。对于每3毫升血液，添加27毫升的红细胞(RBC)裂解缓冲液(Sigma-Aldrich，美国)，孵育20分钟。之后，对血液样本以2000rpm离心5分钟。离心后，吸出上清液。为了去除残余的红细胞，将白细胞团重悬于30毫升PBS中，再以2000rpm离心5分钟。吸出上清液后，将白细胞团重悬于具有一定粘度的稀释缓冲液中。

采用血球计数板(Hausser Scientific，美国)对白细胞浓度进行人工计数测定。为了模拟使用1毫升人类全血的临床检测，制备浓度为10⁷/毫升的白细胞悬液，其为人类血液中白细胞正常范围的上限。

下表总结了研究在微过滤设备中白细胞清除效率η_LD与Ca和归一化白细胞直径d^*的函数关系的实验参数。滤孔尺寸为5、8、10和12微米的四种滤膜被用于实验，d^*的范围为1.37-0.57。通过将流速固定为0.3mm/s并改变白细胞悬液的粘度值来调节Ca(雷诺数均小于0.1)。为了调节悬液粘度，将生物相容的聚合物聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(Sigma-Aldrich，美国)加到PBS溶液中。基于先前报道的在PBS中PVP浓度与相应溶液粘度之间的关系，将特定量的PVP加入PBS溶液中调节白细胞悬液的粘度，并得到0.01、0.015、0.021和0.038的Ca值。

为了测试白细胞清除的效率，用注射泵将1毫升白细胞悬液在选定的流速下注入微过滤设备。在过滤之前，采用荧光染料DAPI(4',6-二氨基-2-苯基吲哚)(Sigma-Aldrich，美国)对白细胞的核进行标记。白细胞过滤后，将MEF CTC芯片置于配备有CCD照相机的荧光显微镜(BX41，奥林巴斯，日本)。使用10倍物镜获得DAPI标记的白细胞的图像用于细胞计数。通过数字图像处理工具对微过滤设备中捕获的白细胞数量进行计数。

白细胞的清除效率η_LD定义为η_LD＝log(N_i/N_t)，其中N_i为注入的白细胞数，N_t为被捕获的白细胞数。例如，微过滤设备从10⁷个注入白细胞中捕获了1000个，表示有4-log的清除效率。在Ca和d^*的各种组合下，对应的白细胞清除效率经由实验测试。

在Ca和d^*的一系列实验组合下，微过滤设备中捕获的白细胞数量为约10³-约2×10⁴，使得η_LD的范围是4-2.7。当Ca接近Ca_LC时，在两个5微米滤孔的滤膜中发生堵塞。通过对滤膜上的孔的数量进行计数来估计这两次实验中的清除效率，得到

图7显示了将全部16个实验数据点进行拟合并展示为等高线图。对于给定的d^*，η_LD在Ca_LC＝0.021的附近达到最小值；该临界值在滤孔中白细胞捕获的分析中鉴定得到。因此，基于理论模型的计算看起来与实验研究结果一致。当Ca接近Ca_LC时，更多白细胞被捕获在微过滤设备中，白细胞清除降低。因此，当在设计用于CTC分离的微过滤系统时，将Ca调整为不同于Ca_LC～0.021是有利的，因为Ca_LC～0.021会将白细胞的清除降为最低水平。

另一方面，在增强癌细胞捕获的临界Ca^*＝0.038时，对于全部测试的d^*，η_LD增大到其最大值。因此，可以通过调整毛细管数来使癌细胞和白细胞的捕获得到区分。当时，癌细胞的捕获增强，同时白细胞清除也增强。因此，可以同时实现癌细胞分离的的高捕获效率和高纯度。对于具有8微米滤孔尺寸的微过滤设备，已经实现接近4-log的白细胞清除，这被认为能够满足对所捕获的CTC进行分子学表征的要求。

在另一方面，本发明提供了一种双滤膜微过滤系统801，用于在微过滤系统中对WBC进行双重清除以从血液样本中分离CTC，如图8所显示。在这种方法中，在具有较大滤孔尺寸的第一滤膜802首先涂覆有靶向于WBC的抗体单层803。基于上文用于优化CTC捕获效率的方法设计第二滤膜804。因此，通过在微过滤系统中施加双滤膜，RBC 805会穿过两层滤膜，而WBC 807将会粘附在第一滤膜802上，CTC 806被捕获在第二滤膜804上。该双滤膜微过滤系统801可以实现更高的CTC分离纯度，而不降低捕获效率。

在另一方面，本发明还提供了一种纳米尖端生物阻抗传感器(nBIS)，用于无标记地进行癌细胞与非癌细胞的检测与表型分型。采用纳米压痕、可扩展的电化学阳极氧化和蚀刻工艺，可在铝薄膜基底上制造3D自对准的纳米尖端阵列。在不需要表面功能化的情况下，通过利用细胞膜与纳米尖端的纳米级相互作用力，nBIS可以检测癌细胞与非癌细胞的阻抗。

图9A显示基于纳米尖端的生物阻抗传感器(nBIS)的示意图。采用纳米压痕、可扩展的电化学阳极氧化和蚀刻工艺，在低成本的铝薄膜基底上制造3D自对准的纳米尖端阵列。制造有纳米尖端的基底厚度为～250微米，面积为7×7平方毫米。在两个电极之间放置高度为100微米的间隔物，以形成加载细胞悬液的微腔，随后nBIS即被制造完成。采用双电极设置，在电化学分析仪(CHI 600D，CH Instruments Inc，美国)上进行电化学阻抗谱分析(EIS)。纳米尖端电极与工作电极相连，顶部电极与分析仪的对电极和参比电极相连。将调制电压为10mV的正弦信号和零偏置电位的10Hz-100kHz的扫描频率施加于nBIS。使用AC阻抗测量nBIS上癌细胞/非癌细胞的阻抗谱，并以波特图(Bode plot)来表示。

图9B显示癌细胞/非癌细胞可以通过阻抗谱明确区分。一般来说，对于特定的细胞类型，随着频率范围从低至高，阻抗幅值降低。相比癌细胞，正常细胞具有较高的阻抗。正常细胞与癌细胞的相位谱不同。相比正常细胞，癌细胞表现出较低的电容特性。此外，HeLa细胞的阻抗谱也不同于MCF-7细胞。

图9C显示在工作频率范围内的改进Randle等效电路。在等效电路中，R_ct是法拉第电荷传递电阻，R_s是两个电极之间的电解质阻抗，CPE是电极极化的恒相位元件(Z_CPE＝1/(Y₀jω)ⁿ)，Z_WAR是与扩散离子传输相关的Warburg阻抗。

图9D显示基于归一化R_ct的不同细胞类型的区分。相比于癌细胞，正常细胞归一化R_ct更高。还发现不同癌细胞系的归一化R_ct也不同，HeLa细胞高于MCF-7细胞。

在另一方面，本发明提供了从血液中分离和检测CTC和外泌体的方法，如图10所例示。通过过程100，可以个体化地从血液中捕获CTC。来自微过滤系统出口的液体含有外泌体。因此，分离外泌体1002后，可通过基于纳米尖端的生物阻抗传感器(nBIS)提取和检测外泌体蛋白质1002和/或者外泌体miRNA 1003。

实施例

实施例1

高效率、高纯度地捕获血液中掺入的癌细胞的例证

图11显示用于从血液样本中捕获癌细胞/CTC的微过滤系统的操作。具有预先设计的滤孔尺寸的滤膜1108被封装在过滤腔内，形成微过滤芯片1102。照片1101显示血液过滤过程中的微过滤芯片1102。过滤参数由上文所述方法确定。注射泵1103用于驱动样本进入微过滤芯片1102。过滤后，使用荧光染料对滤膜上捕获的细胞进行标记。然后，将滤膜1108从微过滤芯片1102中取出，置于载玻片1106和盖玻片1107之间。在荧光显微镜观察滤膜1108。然后，获得照片1104，用于通过图像处理工具1105进行细胞的鉴定和计数。

此处显示应用所提供的方法高效率、高纯度地捕获掺入血液样本中的MCF-7细胞的实例。MCF-7细胞的刚度为0.15mN/m，可以实现高效率、高纯度的Ca^*为0.038。测得稀释的血液样本的粘度为1.65mPa·s。基于公式1中Ca的定义，确定优化流速为3.45mm/s。然后，过滤流速Q可由以下计算

Q＝NS₀V (9)

其中N是滤膜上的滤孔数，S₀是每个滤孔的面积。

MCF-7细胞的直径大约为18微米。基于提供的方法，d^*应该在2左右。因此，使用8微米滤膜捕获MCF-7细胞。基于公式9，计算出优化流速为49毫升/小时。

图12显示使用我们先前的模型和实验研究得出的优化方案，对添加到全血中的两种癌细胞的捕获效率。对1毫升血液样本中添加的10和100个MCF-7细胞的捕获效率分别显示为90±16％和92±3.3％。此外，在共5次测试中，4次从1毫升血液样本分离到单个MCF-7细胞，说明1毫升血液中单个癌细胞的捕获概率高达98％。清除效率为(3.97±0.14)-log，可以满足对捕获的癌细胞进行进一步分子检测的要求。

此外，报道为EpCAM低表达型的MDA-MB-231癌细胞被添加到7.5毫升全血中。MDA-MB-231细胞的捕获效率高达94±5.6％。报道为EpCAM较高表达的MCF-7细胞的捕获效率也高达93±8％。因此，作为一个纯物理捕获方法，相比于基于亲和力的方法，微过滤芯片能从血液中捕获到更多的癌细胞。

下表显示本申请的系统(pMEF芯片)与一些商业化系统之间的各项指标的比较。如表中所示，在捕获效率、单个CTC捕获概率和纯度方面，pMEF芯片优于商业化系统。

实施例2

从癌症患者中捕获CTC的个体化微过滤芯片(pMFC)的例证

我们进行双中心临床试验来测试pMFC从癌症患者分离CTC的性能，包括中山大学(SYSU)附属肿瘤医院和广州市第一人民医院。本研究招募了28名I至IV期的结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌患者，以及5名健康对照。下表显示患者和健康对照的特征总结。

在中山大学附属肿瘤医院，经机构审查委员会批准，使用CellSave防腐管(Janssen Diagnostics，美国)从患者中抽取10毫升血液样本。在抽取后48小时内，取7.5毫升的每个样本用于测试，剩余的2.5毫升用于pMFC测试。在广州市第一人民医院，经机构审查委员会批准，使用EDTA包被管(阳普医疗有限公司，中国)从患者中抽取1.5mL血液样本，并在12小时内用于pMFC测试。同时，基于机构审查委员会批准的方案，使用EDTA涂覆管收集来自健康供体的血液样本。

在临床实验中，用红细胞(RBC)裂解缓冲液对血液样本进行1:1(v/v)的稀释，以最小化红细胞(RBC)的影响。然后，用血液粘度仪(天津唐宇公司)测量1毫升稀释后血液样本的粘度，所用粘度仪事先用已知粘度的一系列蔗糖溶液进行标定。基于提供的方法与测得的样本粘度，确定在8微米滤孔下微过滤芯片中的优化流速。图13显示了测量得到的来自招募的28名癌症患者的稀释血液样本的粘度。然后，基于测得的粘度和临界Ca^*，确定血液过滤的个体化流速。稀释血液样本的粘度范围为1.44至3.36mPa·s(中位数2.25mPa·s)，导致个体化流速的显著变化，范围为24.55至57.27mL/h(中位数36.7mL/h)。

在精确控制的优化个体化流速下，将剩余的稀释血液样本在pMFC中过滤。当血液样本通过pMFC后，用PBS以200微升/分钟的流速冲洗滤膜上捕获的细胞，冲洗流速比一般的过滤流速低10倍，以最小化冲洗过程中的CTC损失。对细胞以20微升/分钟的流速进行固定、破膜和封闭之后，用混合荧光染料对细胞进行染色，在4℃下孵育过夜或在37℃孵育1小时，混合荧光染料包括DAPI、与Alexa Fluor 488偶联的抗广谱细胞角蛋白(anti-Pan-CK)抗体(1:100，CST，美国)、以及与Alexa Fluor 594偶联的抗CD45(1:50，Novus，美国)。孵育后，用PBS以20微升/分钟的流速冲洗去除剩余染料。然后，拆开pMFC，从芯片上将滤膜取出，并将安装在载玻片和盖玻片之间。使用荧光显微镜检查，从WBC中鉴定捕获的CTC。与一致，CTC的鉴定标准为：(1)细胞角蛋白阳性(CK+)；(2)有核细胞(DAPI+)；(3)CD45阴性(CD45-)；(4)细胞直径大于4微米。

图14显示在免疫荧光染色后捕获的CTC和WBC的代表性显微照片，其中细胞被捕获在具有8微米滤孔的pMFC芯片中(所有比例尺为20微米)。

特别地，中山大学附属肿瘤医院的11名乳腺癌、结肠癌和前列腺癌患者的血液样本被用于在测试和pMFC方法之间进行对比研究。按照本申请所示方法，使用CellSave防腐管(Janssen Diagnostics，美国)从癌症患者抽取10毫升血液，在抽取后48小时内使用，其中将7.5毫升血液用于测试，0.5毫升用于粘度测量，剩余2毫升用于pMFC测试。

下表总结了使用pMFC对总共28名癌症患者的CTC检测结果。总体而言，在28名患者中，19名患者(67.9％)的1或2毫升血液样本中检测到多于1个CTC。特别是，对于有转移的癌症患者，16名患者中有14名(87.5％)检测到CTC；同时12名未检测到转移的患者中也有5名检测到CTC，检测灵敏度也高达41.7％。在5名健康志愿者中，血液样本未检测到一个CTC。这些数据提示pMFC芯片未检测到假阳性结果。pMFC方法还证实其能在相对较早期的癌症患者中检测到CTC，例如，两个IIB期乳腺癌患者。此外，pMFC对于早期癌症患者的CTC检测灵敏度也达到了28.6％。这样的表现提示pMFC不仅可用于监测转移性癌症的预后或复发，还具有早期检测癌症的潜力。

在中山大学附属肿瘤医院，对11名癌症患者进行和pMFC方法的在CTC检测性能之间的对比研究。CTC计数如图15所示，为能够直观比较，将pMFC CTC的计数值按比例扩大至7.5毫升的血液样本。利用pMFC，从11名癌症患者中的9名(～82％)的2毫升血液样本里检测到1～12个CTC(中值为2毫升血液样本中3个CTC)。按照测试，11名癌症患者中仅4名(～36％)的7.5毫升血液样本里检测到1～667个CTC(中值为7.5毫升血液样本中59个CTC)。此外，利用pMFC，从来自乳腺癌IIB期患者的血液样本中检测到了CTC。因此，在从较小血液样本中检测CTC的方面，pMFC技术成功地显示为比检测更灵敏(n＝11)。此外，由于高假阳性结果，发现这11名癌症患者中检测的CTC计数的变异度要高得多(变异系数(CV％)＝265.43>100)，并且通过格鲁布斯检验鉴定到异常值(α＝0.05)。

下表显示了利用pMFC测试和测试的CTC检测的灵敏度和特异性的比较。相比于FDA批准的测试，pMFC在检测来自对转移和未转移的癌症患者的CTC中均表现出更高的灵敏度以及100％的特异性。

^*W.J.Allard,et al.Clin Cancer Res,2004,10,6897-904.

^**L.M.Maestro,et al.Anticancer Res,2009,29,4839-43.

在pMFC中，基于测量得到的每位癌症患者的血液粘度，当Ca＝Ca^*时，可以确定个体化和优化的流速，并应用它以实现稳定且优异的捕获效率和纯度性能。但是，在非个体化MFC中，不对每个癌症患者的血液样本粘度μ进行测量。基于MFC最佳性能的优化Ca^*，通过以健康供体的血液样本的平均粘度μ_ref来估计每个癌症患者的μ，可以计算出统一的流速。在这种非个体化的情况下，MFC中每位患者实际的Ca值将会偏离Ca^*：

利用如下两个捕获效率(η_c)和WBC对数清除效率(η_w-log)与Ca函数关系的拟合方程式，如图16所示，可以基于实际Ca计算出实际η_c和η_w-log的值。

η_c＝-70328Ca²+5473.8Ca-14.683 (11)

η_w-log＝918.22Ca²-15.515Ca+3.1775 (12)

利用测得的每位患者的血液样本粘度，可以先用计算出实际Ca值，再利用公式(11)和(12)可以计算出实际η_c和实际η_w-log值，如下表所示。对于不同患者，η_c和η_w-log值存在较大差异。因此，如果没有个体化方案，则无法确保MFC的一致和优化性能。

图17清楚地显示了利用pMFC方法中个体化方案对于η_c和η_w-log的影响。在pMFC技术中，因为考虑了个体患者的血液粘度测量，通过应用个体化流速，可以将每名患者的实际Ca控制为等于优化的Ca^*值。因此，可以实现捕获效率和的高性能水平，而不受个体患者之间血液粘度变化的影响。

另一方面，当基于健康捐献者群体的平均血液粘度而不考虑血液粘度差异的情况下来确定MFC的流速时，MFC会在η_c和η_w-log值中存在较大变异。显而易见的是，这将显著降低MFC在临床应用中CTC检测的性能表现。因此，需要基于每位患者粘度提供个体化方案以确保MFC的优化性能。由此，对全部癌症患者，pMFC可以稳定地实现和

个体化检测不仅为不同的癌症患者和癌症类型，同时也为同一癌症患者在不同的治疗阶段，提供了更可靠的CTC检测性能。基于利用pMFC方法的CTC计数结果，可以更可靠地揭示CTC计数与转移过程、治疗结果和预后之间的相关性，而不受不同癌症患者、不同癌症类型或同一癌症患者的不同阶段的血液特征改变的影响。与其他技术相比，pMFC方法在广泛的血液样本中均能实现更高的CTC检测性能，从而实现在早期癌症患者的血液中进行CTC检测。

Claims (16)

1.一种从个体的血液样本中分离循环稀有细胞的方法，包括以下步骤：

任选地，对所述样本进行预处理以去除至少一部分红细胞(RBC)，

测量所述样本的血液流变学参数，

基于血液流变学参数的测量结果确定过滤参数，

使用确定的过滤参数，对所述样本进行微过滤。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述循环稀有细胞是循环肿瘤细胞(CTC)。

3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体患有肿瘤或疑似患有肿瘤。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预处理步骤包括使所述样本与RBC裂解缓冲液接触。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述血液流变学参数包括样本粘度、循环稀有细胞的平均刚度、循环稀有细胞的平均直径，以及上述的任何组合。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤参数被确定为使如下定义的毛细管数(Ca)为0.02-0.04，优选0.03-0.04：

其中V是微过滤步骤中的平均流速，单位为mm/s；μ是样本粘度，单位为mPa·s；σ是循环稀有细胞的平均刚度，单位为mN/m。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤参数包括滤孔直径，其为循环稀有细胞平均直径的大约1/2。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，还包括通过使用纳米尖端电极的电化学阻抗谱，以电学方式鉴定微过滤步骤捕获的细胞的步骤。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，还包括通过使用纳米尖端电极的电化学阻抗谱，以电学方式检测外泌体中的蛋白质和/或miRNA的步骤，其中所述外泌体分离自所述微过滤步骤的滤液。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，还包括从所述样本中去除背景细胞的步骤，所述背景细胞例如为白细胞。

11.如权利要求11所述的方法，其中所述去除背景细胞的步骤包括：在过滤器上提供靶向于所述背景细胞的亲和性涂层，所述过滤器的孔径足够大使得循环稀有细胞能够流过，优选地，所述亲和性涂层是基于抗体与存在于所述背景细胞表面上的抗原的结合。

12.一种确定微过滤过程中的过滤参数的方法，所述微过滤过程用于从个体的血液样本分离循环稀有细胞，所述方法包括：细胞微过滤中参数的归一化、微过滤中细胞捕获的理论建模与仿真、捕获效率的相图和微过滤中优化参数的确定。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述方法实施于与所述循环稀有细胞为相同种类的细胞系的细胞。

14.一种用于从个体的血液样本中分离循环稀有细胞的设备，包括：

任选的预处理装置，用于对样本进行预处理以去除至少一部分红细胞(RBC)；

测量装置，用于对样本的血液流变学参数进行测量；

确定装置，用于基于血液流变学参数的测量结果来确定过滤参数；以及

微过滤装置，用于使用所确定的过滤参数对样本进行微过滤。

15.一种非暂时性计算机存储介质，其存储计算机程序，当所述计算机程序由一个或多个处理器执行时，使所述一个或多个处理器执行包括以下的操作：

接收血液样本的血液流变学参数；

基于血液流变学参数的测量结果，确定过滤参数；以及

任选地，输出所述过滤参数。

16.一种从样本中分离癌细胞的方法，包括以下步骤：

测量所述样本的血液流变学参数；

基于所述血液流变学参数的测量结果，确定过滤参数；

使用所确定的过滤参数，对所述样本进行微过滤。