CN108728414A - 一种循环肿瘤细胞富集方法及太赫兹靶向CTCs搜索系统进行CTCs检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种循环肿瘤细胞富集方法及太赫兹靶向CTCs搜索系统进行CTCs检测的方法。本发明中，通过对CTCs过滤富集装置中的滤膜上滤孔的分布进行了优化，从而使得在后续利用太赫兹靶向CTCs搜索系统进行检测的过程中，可以使系统准确定位滤膜上固定的循环肿瘤细胞，达到准确获得单个循环肿瘤细胞太赫兹光谱的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种循环肿瘤细胞富集方法及太赫兹靶向CTCs搜索系统进行CTCs检测的方法。
背景技术
肿瘤已成为威胁人类健康的主因之一，恶性肿瘤的转移是导致肿瘤患者死亡的重要原因，但肿瘤转移的机制仍有许多未知之处。目前，临床上主要以影像学作为肿瘤转移检测的方法，但当通过影像发现肿瘤转移时，基本已经达到了肿瘤的晚期，难以实现肿瘤转移或复发的早期发现，也难以反映肿瘤治疗的效果。
近年来许多研究结果表明，存在于外周血中的循环肿瘤细胞(CTCs)在肿瘤转移过程中发挥着重要的作用，已有研究表明在影像学发现转移前已经有肿瘤细胞在循环中存在，因此检测循环肿瘤细胞可以更早地发现肿瘤细胞转移可能。
目前，CTCs的检测方法一般按照如下流程进行：选用临床肿瘤患者外周血样本(EDTA抗凝采血管采集)为样本，将其加入过滤器中，经过裂红，离心，固定之后使用真空泵抽空过滤器，使得过滤器中已经固定好的的CTCs吸附在过滤器中的滤膜上，后续使用荧光显微镜进行检测。
然而，现有的CTCs富集方法中，所使用的滤膜中固定CTCs的点位较为密集，在使用太赫兹靶向CTCs搜索系统进行检测时，无法准确进行细胞定位；同时，在定位单CTCs细胞时，附近密集的CTCs细胞会对定位实验造成很大程度上的干扰，影响到后续CTCs的太赫兹光谱检测。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种循环肿瘤细胞富集方法，所述的循环肿瘤细胞富集方法能够使得循环肿瘤细胞在滤膜上更为分散的固定，便于后续的循环肿瘤细胞定位和检测。
本发明的第二目的在于提供一种包含本发明循环肿瘤细胞富集方法的太赫兹靶向CTCs搜索系统进行CTCs检测的方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种循环肿瘤细胞富集方法，所述循环肿瘤细胞富集方法包括：
将采集的生物体液样本加入过滤器中，进行红细胞裂解，然后进行细胞固定和抽真空，使得固定的循环肿瘤细胞吸附在过滤器的滤膜上；
其中，所述滤膜上均匀设置有滤孔阵列。
优选的，本发明所述的循环肿瘤细胞富集方法中，每组滤孔阵列中，包含80～100个滤孔。
优选的，本发明所述的循环肿瘤细胞富集方法中，所述滤孔的直径为5～10μm，深度为20～30μm；
更优选的，所述膜孔的直径为6～8μm，深度为25～28μm。
优选的，本发明所述的循环肿瘤细胞富集方法中，所述滤膜为树脂滤膜；
更优选的，所述滤膜为聚酰亚胺滤膜。
优选的，本发明所述的循环肿瘤细胞富集方法中，所述生物体液样本为外周循环血。
优选的，本发明所述的循环肿瘤细胞富集方法中，所述红细胞裂解通过加入红细胞裂解液进行。
优选的，本发明所述的循环肿瘤细胞富集方法中，所述红细胞裂解液的原料包括：氯化铵、三羟甲基甲烷，以及水。
优选的，本发明所述的循环肿瘤细胞富集方法中，所述细胞固定通过加入细胞固定液进行。
优选的，本发明所述的循环肿瘤细胞富集方法中，所述细胞固定液包括多聚甲醛溶液；
更优选的，所述多聚甲醛溶液的浓度为2～5％。
同时，本发明还提供了一种太赫兹靶向CTCs搜索系统进行CTCs检测的方法，所述方法包括本发明所述的循环肿瘤细胞富集方法。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明中，通过对CTCs过滤富集装置中的滤膜上滤孔的分布进行优化，从而使得在后续利用太赫兹靶向CTCs搜索系统进行检测的过程中，可以使系统准确定位滤膜上固定的循环肿瘤细胞，达到准确获得单个循环肿瘤细胞太赫兹光谱的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明循环肿瘤细胞富集方法中所用滤膜结构示意图；
图2为核孔膜、传统滤膜以本发明滤膜结构示意图；
图3为采用传统滤膜进行太赫兹成像检测结果图；
图4为采用本发明滤膜进行太赫兹成像检测结果图。
其中，图1中，1-滤膜，2-滤孔阵列，3-滤孔组。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
有鉴于现有的CTCs检测方法中，由于固定CTCs的点位较为密集，进而会影响后续CTCs的太赫兹光谱检测等实际技术问题的存在，本发明特提供了一种新型循环肿瘤细胞富集方法，通过对于滤膜上滤孔分布的设计优化，从而解决了由于CTCs固定点位密集所导致的其进一步检测会受到影响的问题。
具体的，本发明中，主要是通过将滤孔以阵列的形式设置于滤膜之上，并且多组阵列在滤膜上均匀设置的方式，以解决固定CTCs点位过于密集的问题。通过采用本发明中的滤孔设置模式，可以更好的配合太赫兹靶向CTCs搜索系统进行检测，因为采用的搜索系统是按照一定的频率采集范围对样本进行光谱信号的收集，在收集光谱信号时，传统滤膜因点位无规律且过于密集，会对检测仪器所收集到的信号造成干扰，甚至无法获取有效的光谱信息。而本发明是针对太赫兹靶向CTCs搜索系统检测进行了滤膜的相关优化，矩阵点位可以方便对细胞进行精确定位检测，同时点位间的距离也是根据系统进行设计优化的，可以最大程度的排除不同点位间存在的细胞互相之间的信号干扰。
进一步的，本发明所提供滤膜结构上，包含6～8组滤孔阵列，相邻滤孔阵列的间距为10～20μm；
同时，每组滤孔阵列中所含滤孔数量相同或基本相当，每组滤孔阵列中包含滤孔的数量为80～100个；滤孔在每组滤孔阵列中均匀分布。
更进一步的，滤孔的直径为5～10μm，例如可以为，但不限于6、7、8，或者9μm等；滤孔的深度为20～30μm，例如可以为，但不限于21、22、23、24、25、26、27、28，或者29μm等；
同时，滤孔优选的可以为圆柱形、圆锥形，或者角锥形中的一种；
而且，同一滤膜中，各滤孔的直径和深度相同或基本相当，各滤孔的形状也基本相同或者相当。
进一步的，滤膜的材质为树脂，更优选的，滤膜的材质为聚酰亚胺滤膜。
本发明所提供的循环肿瘤细胞富集方法中，也主要是利用上述结构的滤膜，实现对于循环肿瘤细胞较为分散的富集和固定，以便于后续利用太赫兹靶向CTCs搜索系统进行检测。而本发明所提供的循环肿瘤细胞富集方法，实际上也是一种可用于太赫兹靶向CTCs搜索系统检测的CTCs富集方法。
具体的，本发明所提供的循环肿瘤富集方法包括如下步骤：
将采集的生物体液样本加入过滤器中；
此步骤中，所述生物体液样本可以为人或动物的外周循环血、腹腔积液、腹水、脐带血、羊水、骨髓，或者培养的人或动物细胞；
优选的，所述生物体液样本为外周循环血，特别是临床肿瘤患者的外周血样本；
临床瘤患者的外周血样本可以通过EDTA抗凝采血管进行采集；
此步骤中所用过滤器中，则包含如上所述滤膜(即表面具有多组滤孔阵列均匀分布结构的滤膜)。
然后，将向过滤器中，加入红细胞裂解液，进行红细胞裂解，以除去样本中的红细胞；
优选的，此步骤中，所用红细胞裂解液是由氯化铵、三羟甲基甲烷和水混合配制得到；
其中，氯化铵的浓度可以为6.75g/L；三羟甲基甲烷的浓度可以为2.6g/L。
然后，进行细胞固定(即CTCs固定)；
此步骤中，是通过加入细胞固定液的方式进行细胞固定，所用细胞固定液优选的为质量浓度2～5％的多聚甲醛溶液；
优选的，所用多聚甲醛固定液的浓度为4％。
最后，进行抽真空；
此步骤中，可以通过真空泵进行抽真空，从而使得生物体液样本中被固定的循环肿瘤细胞吸附在过滤器的滤膜上。
进一步的，本发明还提供了一种太赫兹靶向CTCs搜索系统进行CTCs检测的方法，该方法中，首先是基于如上的循环肿瘤富集方法，进行循环肿瘤细胞的富集和固定，然后再对滤膜上所吸附(固定)的循环肿瘤细胞进行太赫兹靶向CTCs搜索检测。
实施例1
请参考图1，本发明所提供的可用于太赫兹靶向CTCs搜索系统检测的CTCs富集方法中，所用使用过滤器中包含图1所示的滤膜1；
该滤膜1的表面平均分布有多组滤孔阵列2，滤孔阵列2的间距为15μm左右；
其中，每组滤孔阵列2包含100个滤孔3，滤孔3同样也在每组滤孔阵列2上均匀分布。
进一步的，滤膜1由聚酰亚胺材料制成；
同时，滤孔3为圆柱形，其直径为8μm，深度为25μm。
实施例2
本发明所提供的可用于太赫兹靶向CTCs搜索系统检测的CTCs富集方法包括如下步骤：
生物体液样本选用临床肿瘤患者外周血样本(EDTA抗凝采血管采集)。
将临床肿瘤患者外周血样本加入到以图1所示滤膜为过滤结构的过滤器中；
然后，加入由氯化铵、三羟甲基甲烷和水配置的红细胞裂解液进行裂红，以除去红细胞；
然后，以浓度为4％的多聚甲醛溶液进行CTCs细胞固定，最后使用真空泵进行抽真空，使得样本中固定的CTCs吸附在改进的滤膜上。
实施例3
本发明所提供的太赫兹靶向CTCs搜索系统检测CTCs的方法包括如下步骤：
生物体液样本选用临床肿瘤患者外周血样本(EDTA抗凝采血管采集)。
将临床肿瘤患者外周血样本加入到以图1所示滤膜为过滤结构的过滤器中；
然后，加入由氯化铵、三羟甲基甲烷和水配置的红细胞裂解液进行裂红，以除去红细胞；
然后，以浓度为4％的多聚甲醛溶液进行CTCs细胞固定，最后使用真空泵进行抽真空，使得样本中固定的CTCs吸附在改进的滤膜上。
然后，对吸附于滤膜上的CTCs进行太赫兹成像检测。
实验例1
请参考图2，图2中，a、d、e为核孔膜；b、e、h为传统滤膜(表面滤孔均匀分布)；c、f、i为本发明滤膜结构；
其中，图a、b、c为滤膜50倍放大结构图；图d、e、f为滤膜100倍放大结构图；图g、h、i为滤膜200倍放大结构图。
由图2中的对比可以明显得知的是，核孔膜中，滤孔结构和分布并不均匀，而这也导致了其所固定的CTCs容易产生固定点位密集，进而无法对单个CTCs进行有效定位和太赫兹成像检测；
而传统滤膜中，虽然其表面滤孔能够均匀分布，但是滤孔之间的间距无法满足太赫兹靶向CTCs搜索系统的检测条件，在检测单个滤孔所含的CTCs时，很有可能会被临近滤孔中含有的细胞或者杂质所干扰，影响系统的精确检测。
相反，本发明滤膜中，表面滤孔呈阵列(矩阵)式分布，滤孔间距根据检测仪器进行了相关优化，保证系统在进行单个CTCs检测时不会被周边点位所含细胞或者杂质所干扰，同时，点位呈矩阵型分布，在检测时，可以方便系统直接进行细胞的定位，不需要像传统滤膜那样耗费时间对整个滤膜的搜索检测，可以通过点位坐标进行CTCs的直接检测。
本实验例中，分别以图2所示传统滤膜，以及本发明滤膜为过滤器中的过滤装置，进行CTCs富集实验。
实验方法如下：
生物体液样本选用临床肿瘤患者外周血样本(EDTA抗凝采血管采集)。
将临床肿瘤患者外周血样本分为两份，并分别加入以图2中所示的传统滤膜以及本发明滤膜为过滤结构的过滤器中；
然后，加入由氯化铵、三羟甲基甲烷和水配置的红细胞裂解液进行裂红，以除去红细胞；
然后，以浓度为4％的多聚甲醛溶液进行CTCs细胞固定，最后使用真空泵进行抽真空，使得样本中固定的CTCs吸附在改进的滤膜上。
然后，对吸附于滤膜上的CTCs进行太赫兹成像检测，结果分别如图3和图4所示。
由图3的检测结果可知，采用传统滤膜检测时，由于其存在的相互感染等问题，无法获得有效的特征吸收峰和结果；
由图4的检测结果可知，采用本发明所进行的检测试验，可以获得较为准确的光谱信号
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述循环肿瘤细胞富集方法包括：
将采集的生物体液样本加入过滤器中，进行红细胞裂解，然后进行细胞固定和抽真空，使得固定的循环肿瘤细胞吸附在过滤器的滤膜上；
其中，所述滤膜上均匀设置有滤孔阵列。
2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，每组滤孔阵列中，包含80～100个滤孔。
3.根据权利要求2所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述滤孔的直径为5～10μm，深度为20～30μm；
优选的，所述膜孔的直径为6～8μm，深度为25～28μm。
4.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述滤膜为树脂滤膜；
优选的，所述滤膜为聚酰亚胺滤膜。
5.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述生物体液样本为外周循环血。
6.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述红细胞裂解通过加入红细胞裂解液进行。
7.根据权利要求6所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述红细胞裂解液的原料包括：氯化铵、三羟甲基甲烷，以及水。
8.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述细胞固定通过加入细胞固定液进行。
9.根据权利要求8所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述细胞固定液包括多聚甲醛溶液；
优选的，所述多聚甲醛溶液的浓度为2～5％。
10.一种太赫兹靶向CTCs搜索系统进行CTCs检测的方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1-9中任一项所述的循环肿瘤细胞富集方法。
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