CN105452471A - 使用光热平台向活细胞中的高通量运输物递送 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于递送试剂(例如，核酸、蛋白质、有机分子、细胞器、抗体或其它配体等)至活细胞和/或从所述细胞中提取所述试剂的方法、装置和系统。在不同的实施方案中，提供了允许有效地、高通量地将运输物递送至活细胞中的光热平台和并入有这种光热平台的系统。

Description

使用光热平台向活细胞中的高通量运输物递送
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月15日提交的USSN61/799,222的权益和优先权，其全文出于所有目的以引用的方式并入有本文。
关于联邦资助研究开发下完成的发明的权利声明
本发明在政府支持下进行，由国家健康协会授予的资助号EB014456支持。政府享有本发明的一定权利。
背景
将运输物(cargo)传递至宽尺寸范围的哺乳动物细胞中，包括蛋白质、DNA、RNA、染色体、细胞核以及无生命的颗粒，如量子点、表面增强拉曼散射(SERS)颗粒、以及微珠，在很多生物学领域中是非常需要的。递送方法如内吞作用能够使运输物内陷在核内体中，其中低pH微环境和裂解酶经常使得运输物降解(Luo和Saltzman(2000)Nat.Biotechnol.18：33-37)。病毒递送和化学物递送方法将运输物包裹在病毒内或形成增强摄取的化学复合物(Naldini等人(1996)Science,272：263-267；Felgner等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84：7413-7417)。然而，毒性、细胞类型特异性摄取以及更重要的是受限的运输物包裹能力对运输物尺寸和可传递的细胞类型施加重要的约束(Luo和Saltzman，同上。)。
物理传递方法包括电穿孔(Chu等人(1987)NucleicAcidsRes.15：1311-1326)和声致穿孔(Mitragotri(2005)Nat.Rev.DrugDiscovery,4：255-260)，这些是产生随机分布的纳米级孔的方法，以及光穿孔(Tirlapur和Konig(2002)Nature,418：290-291；Vogel等人(2005)Appl.Phys.B：LaserOpt.,81：1015-1047；Clark等人(2006)J.Biomed.Opt.,11：014034)，这是一种通过激光焦点在细胞膜上产生孔的方法。小的运输物通过热扩散或通过电场经由这些孔递送至细胞中。然而，由于随着孔径的增加运输物扩散速度降低且细胞活力降低，所以使用这些方法递送大的运输物具有较低的效率(Stevenson等人(2006)Opt.Express,14:7125-7133)。
微毛细管注射使用锐利的玻璃尖端来机械地穿透细胞膜用于递送(参见，例如，King(2004)Meth.Mo.Biol.,245：GeneDeliverytoMammalianCells1；HumanaPressInc.Totowa,NJ)。但是，为了维持细胞活力，来自膜穿透的机械性创伤将典型的移液管尖端直径限制在约0.5um(参见，例如，Han等人(2998)J.Nanomed.Nanotechnol.Biol.Med.,4：215-225)。
由于移液管堵塞和运输物剪切，所以大于移液管尖端的运输物不能被注射。电注射(一种将电穿孔与微毛细管注射结合的方法)已经证明了小分子如RNA和质粒DNA向活细胞中的递送(参见，例如，Boudes等人(208)J.Neurosci.Meth.,170：204-211；Kitamura等人(2008)Nat.Meth.,5:61-67等)以及细菌向人工脂囊泡中的递送(参见，例如Hurtig和Orwar(2008)SoftMatter,4：1515-1520)。电注射通过用电场弱化细胞膜，然后进行轻柔的机械穿透至细胞中而发挥作用。
简单的脂质辅助显微注射(SLAM)技术(Laffafian和Hallett(1998)Biophys.J.,75：2558-2563)在玻璃微毛细管的尖端处并入有合成的脂质分子。SLAM微量移液管与细胞膜的接触允许脂质分子与细胞膜融合以形成用于运输物递送的连续的和临时的路径。这一方法避免了微量移液管尖端穿过细胞膜造成的z字形刺穿动作的问题。然而，运输物与细胞膜之间的亲脂性相互作用会在细胞中产生不想要的生物效应，同样，在递送的运输物下，也将此方法限制于特定的细胞类型和运输物含量。
概述
在某些实施方案中，提供用于递送试剂(例如，核酸、蛋白质、有机分子、细胞器、抗体或其它配体等)至活细胞中和/或从所述细胞中提取这些试剂的方法、装置和系统。在不同的实施方案中，提供允许有效地、高通量地将运输物递送至活细胞中的光热平台和并入有这种光热平台的系统。
在不同的方面，本文设想的发明可包括但不限于，任何一个或多个以下实施方案：
实施方案1：一种用于递送试剂至细胞中的装置，所述装置包括多孔膜，其上沉积有当暴露于光学辐射时变热的材料的薄膜涂层，其中所述薄膜涂层基本上沉积在包括所述多孔膜的孔内并且所述多孔膜的表面基本上没有所述涂层。
实施方案2：如实施方案1所述的装置，其中在沉积所述薄膜之前，所述多孔膜的平均孔径在约100nm至约3μm的范围内。
实施方案3：根据实施方案1-2中任一个所述的装置，其中所述薄膜包含选自由以下组成的组的材料：金、银、钛(Ti)、TiN、TiCn以及TiAlN。
实施方案4：根据实施方案1-2中任一个所述的装置，其中所述薄膜包含钛。
实施方案5：根据实施方案1-4中任一个所述的装置，其中所述薄膜的厚度范围在约10nm至约1μm内。
实施方案6：根据实施方案1-5中任一个所述的装置，其中所述多孔膜包括多孔氧化铝(Al2O3)结构。
实施方案7：根据实施方案1-5中任一个所述的装置，其中所述多孔膜包括聚酯膜。
实施方案8：根据实施方案1-7中任一个所述的装置，其中所述多孔膜与多个细胞接触或并列相邻。
实施方案9：如实施方案8所述的装置，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
实施方案10：一种用于递送试剂至细胞中的装置，所述装置包括：刚性基底，其包括第一表面和在与所述第一表面相对侧上的第二表面以及微孔口阵列，其中所述微孔口从所述第一表面穿过所述基底至所述第二表面，其中所述微孔口具有小于约10μm的最大直径，并且多个所述微孔口的至少一部分壁或边缘和/或与所述微孔口相邻的所述第一表面的区域用当暴露于光学辐射时变热的材料的薄膜涂层涂覆；以及设置在邻近所述第二表面处的流体通道或流体贮存器，其中所述通道或贮存器与包括所述微孔口阵列的多个微孔口流体连通；并且其中所述第一表面的面被设置来接收并支持和/或容纳细胞。
实施方案11：如实施方案10所述的装置，其中所述微孔口具有约5μm或更小的最大直径。
实施方案12：如实施方案10所述的装置，其中所述微孔口具有约3μm或更小的最大直径。
实施方案13：根据实施方案10-12中任一个所述的装置，其中所述刚性基底由微光刻晶片形成。
实施方案14：根据实施方案10-13中任一个所述的装置，其中所述刚性基底由选自由以下组成的组的材料形成：硅、石英、刚性聚合物以及陶瓷。
实施方案15：根据实施方案10-13中任一个所述的装置，其中所述刚性基底由硅形成。
实施方案16：根据实施方案10-15中任一个所述的装置，其中所述刚性基底，其中所述第一表面包括被构造来容纳细胞并设置用于显微镜观察的腔室的表面。
实施方案17：如实施方案16所述的装置，其中所述腔室具有开放的顶部。
实施方案18：如实施方案16所述的装置，其中所述腔室具有封闭所述腔室的顶部。
实施方案19：根据实施方案10-18中任一个所述的装置，其中所述微孔口阵列包括至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少50个、至少100个、至少200个或至少500个微孔口。
实施方案20：如实施方案19所述的装置，其中所述孔口全部位于所述表面约2cm2或更小，或者约1.5cm2或更小，或者约1cm2或更小，或者约0.5cm2或更小，或者约0.1cm2或更小的面积内。
实施方案21：根据实施方案10-20中任一个所述的装置，其中所述薄膜沉积在所述微孔口的一部分壁和/或一部分边缘上。
实施方案22：根据实施方案10-21中任一个所述的装置，其中所述薄膜包括选自由以下组成的组的材料：半导体、金属、金属合金、金属氮化物以及金属氧化物。
实施方案23：如实施方案22所述的装置，其中所述薄膜包括选自由以下组成的组的材料：过渡金属、过渡金属合金、过渡金属氮化物以及过渡金属氧化物。
实施方案24：如实施方案22所述的装置，其中所述薄膜包括选自由以下组成的组的材料：金、银、钛(Ti)、TiN、TiCn以及TiAlN。
实施方案25：根据实施方案10-24中任一个所述的装置，其中所述流体通道或腔室装置容纳待递送至细胞中的试剂。
实施方案26：如实施方案25所述的装置，其中所述试剂选自由以下组成的组：核酸、核酶、蛋白质或肽、酶、抗体、细胞器、染色体、病原体以及微粒或纳米颗粒。
实施方案27：根据实施方案10-26中任一个所述的装置，其中所述通道或腔室被加压。
实施方案28：如实施方案27所述的装置，其中所述通道或腔室通过气体压力、泵或重力供料进行加压。
实施方案29：根据实施方案10-28中任一个所述的装置，其中所述装置被配置来替代倒置显微镜上的载物台。
实施方案30：根据实施方案10-29中任一个所述的装置，其中细胞设置在所述第一表面上。
实施方案31：如实施方案30所述的装置，其中所述细胞设置在所述基底的多个微孔口上或邻近所述多个微孔口。
实施方案32：根据实施方案30-31中任一个所述的装置，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
实施方案33：一种用于选择性地开放递送试剂至细胞中的系统，所述系统包括：根据实施方案1-9中任一个所述的装置和/或根据实施方案10-32中任一个所述的装置；以及能够加热所述薄膜的光能来源。
实施方案34：如实施方案33所述的系统，其中所述光能来源为激光或非相干光源。
实施方案35：如实施方案34所述的系统，其中所述光能来源为激光。
实施方案36：根据实施方案33-35中任一个所述的系统，其中所述系统包括透镜系统、系统和/或掩模，和/或引导光能至所述第一表面或所述多孔膜的特定区域的定位系统。
实施方案37：根据实施方案33-36中任一个所述的系统，其中所述系统包括被配置来将光能聚焦到所述第一表面或所述多孔膜上的物镜。
实施方案38：如实施方案37所述的系统，其中所述系统包括半波板。
实施方案39：根据实施方案37-38中任一个所述的系统，其中所述系统包括偏光镜。
实施方案40：如实施方案39所述的系统，其中所述偏光镜包括偏振分束立方体。
实施方案41：根据实施方案33-40中任一个所述的系统，其中所述系统包括调整以下至少一个的控制器：所述光能来源的照明模式、由所述光能来源发出的光脉冲的发生定时、由所述光能来源发出的光脉冲的发生频率、由所述光能来源发出的脉冲波长、由所述光能来源发出的脉冲能量以及由所述光能来源发出的脉冲目标或位置。
实施方案42：一种递送试剂至细胞中的方法，所述方法包括：在根据实施方案1-9或10-29中任一个所述的装置和/或在根据实施方案33-41中任一个所述的系统中提供细胞，其中所述细胞设置在所述第一表面上或者与所述多孔膜接触或并列相邻；使所述细胞与所述试剂接触；以及将所述表面区域或多孔膜暴露于光学辐射，从而引起所述薄膜的加热，其中所述加热形成空泡，所述空泡在加热的区域中或靠近加热的区域将开口引入细胞的膜中，从而使得将所述试剂递送到那些细胞中。
实施方案43：如实施方案42所述的方法，其中所述方法包括在根据实施方案1-9中任一个所述的装置上或在根据实施方案33-41中任一个所述的系统中提供细胞，所述装置和所述系统并入有所述多孔膜。
实施方案44：根据实施方案42-43中任一个所述的方法，其中通过在围绕细胞的培养基的中提供所述试剂，使所述细胞与所述试剂接触。
实施方案45：根据实施方案42-44中任一个所述的方法，其中使细胞放置或生长在所述多孔膜的顶部上并且加热处于或靠近所述细胞处的所述膜的表面。
实施方案46：根据实施方案42-44中任一个所述的方法，其中使细胞放置或生长在所述多孔膜的顶部上并且加热与所述细胞相对的所述膜的表面。
实施方案47：根据实施方案42-44中任一个所述的方法，其中使细胞放置或生长在单独的基底上并且将所述多孔膜定位在用于试剂递送的所述细胞的顶部上。
实施方案48：如实施方案47所述的方法，其中所述单独的基底包括选自由以下组成的组的物体的表面：盖玻片、微量滴定板、皮氏培养皿(petridish)以及培养容器。
实施方案49：如实施方案42所述的方法，其中所述方法包括在根据实施方案10-29中任一个所述的装置上或在根据实施方案33-41中任一个所述的系统中提供细胞，所述装置和所述系统并入有所述刚性基底。
实施方案50：根据实施方案42或49中任一个所述的方法，其中通过在存在于所述表面中的一个或多孔口中提供所述试剂，使所述细胞与所述试剂接触。
实施方案51：如实施方案50所述的方法，其中通过在与所述微孔口流体连通的腔室或通道中提供所述试剂，使所述细胞与所述试剂接触。
实施方案52：根据实施方案32-51中任一个所述的方法，其中所述暴露包括将所述表面的区域暴露于激光脉冲或非相干光源。
实施方案53：根据实施方案32-52中任一个所述的方法，其中所述试剂选自由以下组成的组：核酸、染色体、蛋白质、标记、细胞器以及小有机分子。
实施方案54：一种将试剂递送至细胞中的方法，所述方法包括：在基本上缺乏纳米颗粒或薄膜的基底上提供细胞；使所述细胞与所述试剂接触；以及将所述基底的区域暴露于光学辐射从而引起基底的加热，其中所述加热形成空泡，所述空泡在加热的区域或靠近加热的区域将开口引入细胞的膜中，从而使得将所述试剂递送至那些细胞中。
实施方案55：如实施方案54所述的方法，其中所述基底由选自由以下组成的组的材料形成：硅、石英、刚性聚合物、金属以及陶瓷。
实施方案56：如实施方案54所述的方法，其中所述基底由硅形成。
实施方案57：根据实施方案54-56中任一个所述的方法，其中所述基底包括被配置来容纳细胞的腔室的表面。
实施方案58：如实施方案57所述的方法，其中所述基底设置用于显微镜观察。
实施方案59：根据实施方案57-58中任一个所述的方法，其中所述腔室具有开放的顶部。
实施方案60：根据实施方案57-58中任一个所述的方法，其中所述腔室具有封闭所述腔室的顶部。
实施方案61：根据实施方案54-60中任一个所述的方法，其中所述试剂选自由以下组成的组：核酸、核酶、蛋白质或肽、酶、抗体、细胞器、染色体、病原体以及微粒或纳米颗粒。
实施方案62：根据实施方案54-61中任一个所述的方法，其中所述基底被配置来放置在倒置显微镜上的载物台上或替代倒置显微镜上的载物台。
定义
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指示氨基酸残基的聚合物。此术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物；以及天然存在的氨基酸聚合物。此术语还包括在传统的肽连接物上的变体，该肽连接物将氨基酸连接起来形成多肽。优选的“肽”、“多肽”和“蛋白质”是氨基酸链，其中α碳通过肽键连接。因此，在链的一端(氨基末端)处的末端氨基酸具有游离氨基，而在链的另一端(羧基末端)处的末端氨基酸具有游离羧基。如本文所使用，术语“氨基末端”(缩写为N-末端)是指在肽的氨基末端处的氨基酸上的游离α-氨基或肽内任何其它位置处的氨基酸的α-氨基(参与肽键中时为亚氨基)。同样地，术语“羧基末端”是指在肽的羧基末端上的游离羧基或肽内任何其它位置处的氨基酸的羧基。肽还包括基本上任何聚氨基酸，包括但不限于肽模拟物，如通过醚(与酰胺键相反)连接的氨基酸。
当关于待递送至细胞中的物质使用时，术语“试剂”包括待递送至(或提取自)细胞的任何物质。所述试剂包括但不限于核酸(包括，例如载体和/或表达盒)、抑制性RNA(例如，siRHA、shRNA、miRNA等)、核酶、蛋白质/肽、酶、抗体、造影剂、细胞器(例如细胞核、线粒体、核仁、溶酶体、核糖体等)、染色体、胞内病原体、无生命的颗粒，如量子点、表面增强的拉曼散射(SERS)颗粒、微珠等等。
附图简述
图1A和1B示意性地说明了用于高通量递送运输物至活的哺乳动物细胞中的微制造光热平台的一个实施方案。
图2说明了用于制造硅基光热平台的工艺流程的一个实施方案。
图3A和3B说明了光热递送平台。图3A：具有3μm孔口和50μm通道的硅基光热递送平台。图3B：由PDMS制成的可变形隔膜泵与用于活性流体抽吸和运输物递送的硅基光热平台成一体。
图4的图A-C说明了空泡生成和试剂递送。图A：硅基光热平台上的月牙形空泡生成。图B：1μm绿色荧光微珠向在所述平台上培养的HeLa细胞中的递送。图C：包含1μm绿色荧光珠的细胞的明视场和荧光图像。为了更易于观察，细胞在递送之后再次铺于细胞培养皿上。
图5A说明了用于通过将细胞在芯片上翻转使用所述微制造的光热平台来进行平行运输物递送的一种可选构造。细胞可在盖玻片(或其它透明的平坦基底)上生长。在盖玻片与硅芯片之间使用垫片以维持细胞膜与钛涂覆的孔口之间的适当接触。在激光脉冲和通过空泡气蚀切割细胞膜之后，运输物可使用可变形的PDMS隔膜泵被驱动至细胞中。图5B示出在玻璃盖玻片上培养的HeLa细胞，其中使用此构造递送200nm荧光微珠。
图6A和6B说明了基于多孔聚合物膜的递送平台的一个实施方案。图6A：平行的递送平台是通过在轨迹蚀刻的聚酯多孔膜上沉积钛薄膜而实现。以斜角使用脉冲激光烧蚀除去膜表面处的钛薄膜，从而保持孔内钛的完整性。在脉冲激光激励之后，为了在相邻的细胞膜中产生切口，将侧壁钛用作空泡引入位点。图6B：在多孔膜上生成的平均孔径分别为3μm和1μm的气蚀空泡。
图7的图A-C说明了使用基于多孔聚合物膜的光热平台的运输物递送的不同构造。显示了所有构造都可以进行荧光葡聚糖递送。图A：细胞在多孔膜的顶部上生长。在钛薄膜上生成的空泡切割接触的细胞膜以便于递送。图B：细胞在多孔膜的顶部上培养。钛薄膜沉积在多孔膜的相对(底)侧。一旦激光脉冲，空泡气蚀便引起流体流动穿过所述孔并且瞬时透化细胞膜。图C：细胞在单独的基底(例如盖玻片、塑料的皮氏培养皿)上生长。为了细胞膜穿孔和运输物递送，将钛涂覆的多孔膜定位在细胞的顶部上。
图8的图A：使用基于多孔聚合物膜的光热平台，编码GFP的质粒DNA被成功地递送至HeLa细胞并在其中表达。图8的图B：以高效递送荧光葡聚糖分子至在基质胶涂覆的多孔膜上培养的人胚胎干细胞(hESC)菌落中。
图9说明了基于裸硅晶片的递送平台的一个实施方案。所述硅晶片吸收脉冲激光并且在硅晶片表面上引发的瞬时加热和气蚀透化在晶片顶部上培养或定位的细胞。如所示显示了在非粘附的Ramos细胞和粘附的HeLa细胞中小分子如钙黄绿素的高通量的平行递送。
详述
在某些实施方案中，提供用于递送试剂(例如，核酸、蛋白质、有机分子、细胞器、抗体或其它配体等)至活细胞中和/或从所述细胞中提取这些试剂的方法、装置和系统。在不同的实施方案中，提供允许有效地、高通量地将运输物递送至活细胞中的光热平台和并入有这种光热平台的系统。
在不同的实施方案中，本文所述的光热平台利用光能来源加热流体和/或表面(或其组分或面积)并且由此形成迅速扩大的“气蚀”空泡。不受具体的理论限制，在不同实施方案中，本文所述的方法、平台和系统依赖于通过空泡气蚀施加的液动力和/或机械力以局部和瞬时地打开细胞膜用于递送。已发现这一物理机制可应用于广泛范围的细胞类型和运输物(试剂)类型。
另外，由空泡膨胀提供的超速细胞膜切割在细胞膜中打开微米尺寸的入口，以用于超级尺寸的运输物如微珠或细胞器的递送同时保持细胞活力。
在使用微制造技术的某些实施方案中，大于约106个光热递送位点可在光热平台中的1cm×1cm的面积上实现。运输物扩散或抽吸之前对大于约106个细胞的同时递送可通过在有效面积上照射单个光能(例如，激光)脉冲在几秒之内完成。
I.基于微制造表面的光热递送平台。
在某些实施方案中，提供一种基于微制造(例如，蚀刻和/或沉积)的表面的光热递送平台。图1说明了用于高通量递送运输物至活的哺乳动物细胞中的硅基的、微制造的光热平台的原理。如该图中所示，制造了具有明确限定的尺寸和间隔的微孔口的2D阵列。通常，微孔口的尺寸范围为约100nm至约4μm。在某些实施方案中，微孔口的尺寸范围为约100nm或约300nm或约500nm或约800nm至约1μm，或至约2μm，或至约3μm，或至约4μm，或至约5μm。在不同的实施方案中，微孔口之间的典型间隔范围为约1μm至约10μm。所述薄膜可包括任何可通过光能来源迅速加热的材料。说明性但非限制性的材料包括金属、半导体等。在某些实施方案中，所述材料包括金、银、钛(Ti)、TiN、TiCn和TiAlN。也可使用其它金属、金属合金、金属氧化物、金属氮化物等。
由暴露于高密度光能时升温的材料形成的薄膜沉积在多孔膜的内侧和/或边缘。在不同的实施方案中，所述薄膜的厚度范围为约10nm至1μm。
一旦用光能来源(例如，激光)产生脉冲，薄膜(例如，钛薄膜)便升温并引起月牙形蒸汽空泡。气蚀空泡切割相邻的细胞膜并且制造用于递送运输物至细胞胞液中的瞬时入口。不同尺寸的运输物可通过使用与激光脉冲同步的扩散或活性流体抽吸而被运输至细胞中。
在不同的实施方案中，包括光热基底的材料可由任何方便的材料制造，所述材料优选地对细胞无毒，能够运载所述薄膜涂层并且能够耐受由对表面和/或薄膜施加电磁能(例如，光能)而产生的局部热量。合适的材料包括但不限于玻璃/硅、锗、矿物(例如，石英)、陶瓷、塑料(例如，等)、金属、半导体等等。
在某些实施方案中，所述基底包括用于细胞筛选和/或用于细胞培养的容器的表面。这可包括，例如，用于粘附或悬浮细胞培养物的容器。这还可包括微量滴定板(例如，96、384、864、1536孔等)、微流体装置、高密度(微阵列)基底、显微镜载玻片或腔室等等。
在某些实施方案中，细胞转染基底使用在半导体产业中已知的技术来制造。图2示意性地说明了用于制造硅基光热递送平台的一个流程图。SiO2薄膜沉积在硅晶片的顶部和底部上。使用光刻和干法蚀刻，3微米孔洞的阵列被限定在顶部氧化物层中并且50至100微米的大的开口被限定在底部氧化物层中。钛薄膜沉积在顶部氧化物层上。使用深度反应性离子蚀刻，从晶片的后侧穿过其整个厚度来蚀刻硅通道直到顶部氧化物层中的3微米孔洞被连接，然后进行剥离工艺以显露侧壁钛涂层。
虽然所示的孔口是圆形的，但是它们不需要有此限制。使用标准方法(例如，蚀刻方法)可以产生基本上任何形状的孔口(例如，圆形、正方形、五边形、六边形、椭圆形、梯形、不规则形等)。同样地，孔口的图案可为基本上任何所需的图案。
图3A和3B示出了具有3μm孔口和50μm通道的一个说明性硅基光热递送平台。为了实现大的运输物的有效递送，在这种情况下，由PDMS制成的可变形的隔膜泵与硅基光热平台成一体用于活性流体抽吸和运输物递送。应当认识到的是其它弹性材料(例如，用于软光刻的各种塑料和/或其它材料)也可用于制造隔膜泵。
图4A示出了在激光脉冲之后在钛薄膜上用于细胞膜切割的月牙形空泡的产生。对于大于50次的操作来说钛涂层是坚固的。使用这一递送平台，大至1μm聚苯乙烯微球的运输物可被高效地递送至细胞中。图4B和4C示出了在这一平台的1cm×1cm的面积上1μm绿色荧光微珠向HeLa细胞中的高通量递送。
在图5A中说明了通过将细胞在芯片上翻转使用所述硅基光热平台的平行递送的一个说明性可选构造。细胞可在盖玻片(或其它透明的，优选平坦的基底)上生长。在盖玻片与硅芯片之间使用垫片以维持细胞膜与钛涂覆的孔口之间的适当接触。在激光脉冲和通过空泡气蚀切割细胞膜之后，运输物可使用可变形的PDMS隔膜泵(或其它抽吸系统)被驱动至细胞中。图5B示出在玻璃盖玻片上培养的HeLa细胞，其中使用这一构造递送200nm荧光微珠。
在某些实施方案中，对于超级尺寸的运输物如微米尺寸的颗粒、细胞器或甚至细菌的递送，所述微制造的光热平台可实现较高的递送效率和较高的细胞活力。在一个说明性的，但非限制性的实施方案中，细胞在芯片上培养。在递送之前，运输物从充满芯片的硅通道的后侧装载。在细胞膜通过激光脉冲打开之后立即启动PDMS泵以驱动运输物和流体至细胞中。
II.基于多孔聚合物膜的递送平台
在某些实施方案中，光热转染平台使用多孔膜来制造。多孔膜可从广泛范围的材料(例如，尼龙或尼龙网、过滤隔膜、聚四氟乙烯(PTFE)、膨体聚四氟乙烯(ePTFE)、聚醚醚酮(PEEK)、膨体聚醚醚酮(ePEEK)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、乙烯醋酸乙烯酯(EVA)、热塑性聚氨酯(TPU)、聚醚砜(PES)等等)中得到。在不同的实施方案中，还考虑了多孔刚性材料(例如，多孔陶瓷)。多孔膜对本领域的那些技术人员是熟知的并且可以多种孔尺寸从众多来源(参见，例如，Porex公司，FairburnGA等)购得。
在某些实施方案中，薄膜(例如，如上文所描述的)沉积在多孔膜上。在某些实施方案中，薄膜从与细胞接触的表面上蚀刻掉，并且同样从相对的表面上任选地蚀刻掉。因此，在某些实施方案中，与细胞接触的表面基本上不承载薄膜。
图6A示出了以多孔聚合物膜实现的平行递送平台。钛薄膜沉积在轨迹蚀刻的聚酯多孔膜上。以斜角使用脉冲激光烧蚀除去膜表面处的钛薄膜，从而保持孔内钛的完整。在脉冲激光激励之后，为了在相邻的细胞膜中产生切口，将侧壁钛用作空泡引入位点。
图6B示出了在多孔膜上生成的平均孔径分别为3μm和1μm的成像的气蚀空泡。此平台的制造是简单的并且聚合物膜可以低成本制得且是一次性使用的。如图7的图A-C所示，以三种不同的构造显示细胞膜切割和荧光葡聚糖递送。如图7的图A所说明，细胞可在多孔膜的顶部上沉积或生长。在钛薄膜上生成的空泡切割接触的细胞膜用于运输物(例如，在围绕细胞的培养基中提供的运输物)的递送。如图7的图B所说明，当钛薄膜存在(例如预先沉积)于多孔膜的相对(底)侧时，细胞可在多孔膜顶部上沉积或培养。一旦激光脉冲，空泡气蚀便引发流体流穿过所述孔并且瞬时透化细胞膜。图7的图C说明了细胞沉积或生长在单独的基底(例如玻璃盖玻片、塑料的皮氏培养皿、培养容器、微量滴定板等)上的一个实施方案。为了细胞膜造孔和运输物递送，将钛涂覆的多孔膜定位在细胞的顶部上。使用基于多孔聚合物膜的光热平台，编码GFP的质粒DNA被成功地递送至HeLa细胞并在其中表达。如图8所说明，以高效递送荧光葡聚糖分子至在基质胶涂覆的多孔膜上培养的人胚胎干细胞(hESC)菌落中。
应注意，所述多孔膜平台非常适用于大的运输物如质粒DNA、RNA和蛋白质的递送。
III.基于裸晶片的递送平台
令人惊奇的发现是没有沉积的薄膜或纳米颗粒(例如裸晶片)的基底也可用作光热递送基底。图9说明了基于裸硅晶片的平台。所述硅晶片吸收脉冲激光并且在硅晶片表面上诱导的瞬时加热和气蚀透化在晶片顶部上培养或定位的细胞。证明了在非粘附的Ramos细胞和粘附的HeLa细胞中小分子如钙黄绿素的高通量的、平行递送。
对于小分子如钙黄绿素和碘化丙啶，可使用裸硅晶片平台。在激光脉冲和运输物递送之后，细胞可被收获或继续在芯片上培养用于后续分析。
本文描述的实施方案意图为说明性的而非限制性的。使用本文所提供的教导，这种“光热递送基底”的构造可常规地变化，改变例如，基底的特性(例如，孔(孔口)尺寸、尺寸分布、空间分布)，薄膜的类型、微流体通道的分布和/或构造等等可改变。
能源和选择性照明。
取决于材料的选择，包括光热递送平台外科装置的基底和/或薄膜和/或本文所述的基底可通过应用多种方法中的基本上任一种来激活(加热)。这些方法包括但不限于微波、激光、非相干光学辐射(例如，红外辐射)、电加热、电子自旋共振(ESR)加热、电磁加热等的应用。在某些说明性的实施方案中，加热薄膜和/或基底是通过应用光能来源(例如，激光)完成的。
当基底待选择性地被加热(例如，基底的一部分)时，应理解的是可使用局部地/选择性地照明所述装置或基底的任何手段。因此，例如，在某些实施方案中，基底的特定区域的局部照明可通过使用例如聚焦的激光或聚焦的非相干光(例如，红外光)源完成。
在某些实施方案中，基底的一个或多个区域的选择性照明通过使用掩模(阴影掩模)完成。在某些实施方案中，局部照明可仅仅通过使用透镜和/或镜系统将照明能源(例如，激光)聚焦至特定的区域来完成。在某些实施方案中，能源可聚焦在固定区域处并且基底移动(例如，使用可移动的工作台或其它操纵器)以完成特定区域的局部照明。
在某些实施方案中，能量脉冲(例如，激光脉冲)不仅可通过如实施例中所示的静态阴影掩模成形，还可通过使用空间光调制器如TI的DMD微显示器或LCD显示器的动态掩模成形。这提供了对显微镜下注射至靶细胞中的实时和交互式控制。
颗粒/纳米颗粒/薄膜材料
在不同的实施方案中，包括本文所述的各种装置的薄膜由可通过施加适当的电磁能加热的金属、金属合金、半导体或其它材料制造。在不同的实施方案中，设想了半导体、金属、金属合金以及其氧化物和/或氮化物。取决于尺寸、纵横比、薄膜厚度和/或材料，所述金属很容易使用不同的能源(例如，激光、电场、RF场、磁场、超声源等)来加热。
虽然本文提供的大部分论述涉及半导体或金属薄膜，但描述钛薄膜、通过能源加热的材料的实施例不必限于此。在所形成的加热下吸收适当能量的基本上任何材料都可用于在本文所述的方法和装置中加热材料。因此，在某些实施方案中，设想了包括材料如金、银、钽、钯、铑或钛，或其氧化物、氮化物或合金的薄膜。
适用于包括本文所述装置和系统的薄膜中的一种重要材料为钛(Ti)和/或其氧化物、氮化物、合金或掺杂氧化物、掺杂氮化物或合金。在某些实施方案中，包括本文所述的系统和方法的薄膜包括钛和/或氮化钛(TiN)，所述钛和/或氮化钛(TiN)是一种非常硬的材料，具有比金高三倍的熔化温度。
TiN的其它变体为本领域技术人员所熟知。这些变体包括但不限于氮化碳钛(TiCN)和氮化钛铝(TiAlN)，它们可单独使用或以与TiN的交替层形式或以含有TiN颗粒的混和颗粒群体形式使用。这些涂层在耐蚀性和硬度以及不同的(甚至可调的)吸收特性方面提供相似或优越的提高。
如上所述，包括本文所述的装置和/或基底的薄膜不必限于包含金属的材料。
在不同的实施方案中，还设想了包含来自元素周期表第II、III、IV、V或VI族的一种或多种材料的薄膜，同样设想了其氧化物、氮化物、合金及掺杂形式和/或过渡金属、过渡金属氧化物、过渡金属氮化物、包含过渡金属的合金或复合物等。在某些优选实施方案中，纳米颗粒和/或薄膜包括第II族、第III族、第IV族、第V族材料(例如，碳、硅、锗、锡、铅)、掺杂的第II、III、IV、V及VI族元素、或纯的或掺杂的第II、III、IV、V或VI族元素的氧化物或过渡金属、过渡金属氧化物或过渡金属氮化物。在某些优选的实施方案中，颗粒和/或纳米颗粒和/或薄膜包括第III、IV或V族半导体。
从本教导中应理解，在某些实施方案中，薄膜包括一种或多种材料如Si、Ge、SiC、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W以及它们的氧化物和氮化物。
如上所述，在不同的实施方案中，包括第II、III、IV、V或VI族元素、过渡金属、过渡金属氧化物或氮化物的薄膜可为基本上纯的，或可为掺杂的(例如，p型或n型掺杂的)和/或合金的。P型和n型掺杂剂与第II-VI族元素一起使用，特别是与第III、IV和V族元素一起使用，更特别是与第IV族元素(例如，硅、锗等)一起使用，这为本领域技术人员所熟知。所述掺杂剂包括但不限于磷化合物、硼化合物、砷化合物、铝化合物等等。
在某些实施方案中，薄膜包括第IV族半导体，如硅、锗和碳化硅。用于所述半导体的最常用的掺杂剂包括来自第III族的受体或来自第V族元素的供体。所述掺杂剂包括但不一定限于硼、砷、磷及偶尔镓。
如上所述，在不同的实施方案中，薄膜包括半导体。许多掺杂的第II、III、IV、V或VI族元素为半导体且包括但不限于ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InP、InAs、InSb、AlS、AlP、AlSb、PbS、PbSe、Cd3Sb2、Zn3P2、Zn3As2、Zn3Sb2、TiO2、TiO2、TiO2、Cu2O、CuO、UO2、UO3、Bi2O3、SnO2、BaTiO3、SrTiO3、LiNbO3、La2CuO4、PbI2、MoS2、GaSe、SnS、Bi2S3、GaMnAs、InMnAs、CdMnTe、PbMnTe、La0.7Ca0.3MnO3、FeO、NiO、EuO、EuS、CrBr3、Cu(In,Ga)Se2、Cu2ZnSnS4、CuInSe2、AgGaS2、ZnSiP2、As2S3、PtSi、BiI3、HgI2、TlBr、Se、Ag2S、FeS2、Ge和Si以及其三元和四元混合物等等。
除了激光能之外，在某些实施方案中，磁场、电场和RF场也可容易地用于加热某些薄膜。因此，例如，美国专利公开号2007/0164250(以引用的方式整体并入有本文)提供了当置于磁场中时以磁场的某个频率选择性地加热的磁性材料。
在某些实施方案中，所述薄膜包括在暴露于足够强度的磁场时转换能量的磁性材料(如FerroV磁性颜料)。因此，例如，交变磁场将引起颗粒中的交流电流，从而产生热量。可以使用多种磁性材料。所述材料包括但不限于磁性材料，如Fe-O4、Fe2O3。同样，在某些实施方案中，金、铜、铂、钯等可包括用于本发明的装置的颗粒、纳米颗粒和/或薄膜。在某些实施方案中，所述颗粒、纳米颗粒和/或薄膜可包括TiO2、CeO2、Ag、CuO、钇铝榴石(YAG)、InO2、CdS、ZrO2或其组合物。在另一实施方案中，任何金属氧化物、金属合金、金属碳化物和/或过渡金属都可用于本发明。在一些实施方案中，可涂覆所述颗粒，从而使涂层不改变颗粒对所施加的场的各自的响应性。
在某些实施方案中，用于本发明的装置中的薄膜可由磁性材料制成，而在其它实施方案中，它们可由顺磁性和超顺磁性材料制成或包括顺磁性和超顺磁性材料。
因此，在某些实施方案中，薄膜可包括顺磁性或超顺磁性材料，这些材料可使用电子自旋共振吸收(SPM)和/或铁磁共振来加热。电子自旋共振(ESR)加热和铁磁共振(FMR)加热在美国专利公开号2006/0269612和2005/0118102中描述，该专利以引用的方式整体并入有本文。钇铁榴石Y3Fe5O12和γ-Fe2O3是两种公知的适用于ESR和/或FMR加热的材料。可添加不同的掺杂剂以便降低这些材料在不同应用中的自旋共振频率。磁性石榴石和尖晶石也是化学惰性的并且在正常环境条件下是不能破坏的。
还设想了包含来自元素周期表第II、III、IV和V族的材料的各种材料和/或半导体。
在某些实施方案中，在本文所述的装置中使用的薄膜的面积和/或厚度可被调节或优化并且反映了薄膜材料的选择、激发能的性质以及激发能的频率和/或强度。
在不同的实施方案中，如果存在的话，那么薄膜的厚度范围在约0.5、1、2、5、10、50、100、150、200、300、400或500nm至约800nm、1μm、5μm、10μm、50μm或100μm内。在某些实施方案中，金属薄膜的厚度范围在约2nm或5nm、10nm、20nm或30nm至约100nm、300nm、500nm、800nm或1μm内。在某些实施方案中，金属薄膜的厚度范围在1nm至150nm，优选约5nm至100nm，更优选约5nm、10nm或20nm至约50nm、75nm或100nm内。在某些实施方案中，金属薄膜的厚度为约30nm。
在不同的实施方案中，包括本文所述的装置的涂覆层可为连续的薄膜，或分解成多个结构域(例如，5nm、10nm、20nm、50nm、100nm、200nm、500nm的结构域)的薄膜。结构域的形状和薄膜的厚度将会影响材料的吸收光谱以及产生所需局部热量所要求的能源和强度。
通常，薄膜厚度影响由局部加热产生的空泡的尺寸和靠近空泡的微流体流的性质。这决定了在细胞中产生的剪应力和在细胞中产生的开口的尺寸。通常，薄膜越厚，在细胞中产生的空泡就越大且在细胞中产生的孔洞也越大。
向基底涂覆薄膜。
在表面上沉积薄膜的方法为本领域技术人员所熟知。
例如，薄膜可通过任何合适的方法沉积，包括但不限于溅射沉积、化学气相沉积(CVD)、分子束外延(MBE)、等离子体辅助的气相沉积、阴极电弧沉积或电弧PVD以及电子束蒸发沉积。在某些实施方案中，薄膜还可化学沉积在光热转染基底上。
制造TiN薄膜的最常用方法为物理气相沉积(PVD，通常是溅射沉积、阴极电弧沉积或电子束加热)和化学气相沉积(CVD)。在两种方法中，纯钛升华并与氮气在高能、真空环境中反应。
成块的陶瓷物品可通过将粉末状金属钛包装成所需的形状，将其压缩至合适的密度，然后在纯氮气的气氛中将其点燃来制造。由金属与气体之间的化学反应释放的热量足以将氮化物反应产物烧结成坚硬的成品。
上文描述的在表面上形成薄膜的方法是说明性的而非限制性的。使用本文提供的教导，其它薄膜涂覆的表面可使用最常规的实验产生。
细胞类型
据信本文所述的方法和装置可与基本上任何具有细胞膜的细胞一起使用。另外，所述方法和装置还可用于具有细胞壁的细胞。因此，在不同的实施方案中，设想了动物细胞(例如，哺乳动物细胞)和植物细胞及真菌细胞。
因此，例如，包括NIH3T3小鼠成纤维细胞、HEK293T胚胎肾成纤维细胞以及HeLa宫颈癌细胞的粘附细胞已使用本文所述的装置和方法注射了表达GFP的质粒。通常，据信，任何粘附的哺乳动物细胞类型可使用本文所述的装置和方法容易地被注射，因为：1)在有效的冲孔和维持细胞活力方面被确定为最佳的激光通量落在用于测试的所有细胞类型的相对较窄的范围；以及2)用于确定适当的注射位置(例如，核周或可能地核)的粘附细胞特征在视觉上很容易被鉴别。
淋巴细胞、各种类型的干细胞、生殖细胞以及其它细胞均是非粘附的，但是常常需要对所述细胞进行注射或进行其它“外科”手术。如本文所述的光镊子与细胞外科工具的集成使其成为可能。
另外，使用本文所述的方法和装置，向细胞团中注射单个细胞是如人胚胎干细胞的生长和维持多潜能性所要求的，所述操作尤其可在干细胞团的表面上使用本文所述的方法和装置完成。还据信可能在细胞团中立体定向地注射特定的细胞，这是出于多种原因(例如，发育跟踪、建立梯度等)所需的。
可递送的材料。
据信可能使用本文所述的方法和装置向细胞中递送基本上任何所需的材料。所述材料包括但不限于核酸、蛋白质、细胞器、药物递送纳米颗粒、探针、标记等等。如早已在至少三种粘附细胞类型中所显示，使用本文所述的方法将质粒DNA递送至细胞中。因此，任何质粒尺寸的基因材料通过本文所述的方法和装置很容易地传递。
BAC(细菌人工染色体)，一种难以转导细胞的所需目标以及用于递送具有尺寸限制(质粒、逆转录病毒、慢病毒)的载体、用于引入大的遗传异常或用于在发育过程中跟踪特定基因的调控表达。
因此，据信本文所述的装置和方法可用于递送全部或部分天然的或合成的染色体。与BAC类似，不能通过以前的方法转导至大多数细胞类型中的大型染色体或染色体片段可通过我们的方法传递至细胞中，例如，建立人类三体障碍(例如，唐氏(Down)和克兰费尔特(Klinefelter)综合征)的模型。
类似地，所述方法可用于细胞核的传递(例如，体内核传递)，或者其它细胞器(例如，线粒体或纳米工程结构)可容易地引入至细胞中。
在不同的实施方案中，可递送的材料包括试剂，包括但不限于选自由以下组成的组的试剂：核酸(包括，例如载体和/或表达盒)、抑制性RNA(例如，siRHA、shRNA、miRNA等)、核酶、蛋白质/肽、酶、抗体、造影剂、细胞器(例如，细胞核、线粒体、核仁、溶酶体、核糖体等)、染色体、胞内病原体、无生命的颗粒如量子点、表面增强的拉曼散射(SERS)颗粒、微珠等等。
模块化系统。
在某些实施方案中，本文所述的转染平台作为可容易地与现存的设备成一体的“模块”提供。例如，在某些实施方案中，转染基底在可添加至或可替代现存的显微镜上的载物台的形式中提供。在某些实施方案中，基底被格式化以替代以及在倒置显微镜(例如，蔡司(Zeis)倒置显微镜)上的x/y/z载物台。
在某些实施方案中，转染基底作为微流体系统(例如，芯片系统上的实验室)和/或作为可与微流体系统成一体的模块提供。
图案化转染系统。
在不同的实施方案中，本发明设想了向细胞(细胞转染)中有效的高通量的递送试剂(运输物)的系统。在某些实施方案中，包括一个或多个光热基底的系统包括如本文所述的细胞转染基底(例如，光热基底)。所述基底通常承载细胞和/或细胞培养物。所述系统可任选地包括用于递送试剂的装置、待转染至细胞中的试剂、用于从电磁能来源(例如，光能来源)遮蔽所述基底部分的装置等。
在某些实施方案中，所述系统任选地还包括电磁能来源以加热薄膜和/或光热基底。合适的来源包括但不限于激光、高强度的非相干光源、磁场发生器、RF场发生器等等。
在不同的实施方案中，所述系统可包括控制器(例如，激光控制器)。在某些实施方案中，所述控制器可被配置来控制照明源的强度和/或持续时间和/或波长和/或光热基底的照明的模式。在某些实施方案中，所述控制器检测和/或控制穿过微通道的试剂的流，所述微通道包括光热基底和/或其中设置了光热基底的微流体系统。当在显微镜(例如，倒置显微镜)上提供光热基底时，所述控制器可任选地控制显微镜载物台、显微镜聚焦和/或来自显微镜的图像采集。
试剂盒。
在另一实施方案中，提供用于向细胞中有效地、高通量地递送运输物的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包括包含如本文所述的光热递送装置的容器。在不同的实施方案中，所述试剂盒可额外任选地包括本文所述的任何试剂或装置(例如，试剂、缓冲剂、配管、指示器、操纵器等)以进行运输物向细胞中的递送。
另外，所述试剂盒任选地包括为使用本文所述的系统和装置递送运输物至细胞中提供指导的标签和/或说明材料。
虽然所述说明材料通常包含书写或印刷材料，但其并不限于此。本发明涵盖了能够存储这些说明并将其传达给终端用户的任何媒介。所述媒介包括但不限于电子存储媒介(例如，磁盘、磁带、磁片盒、芯片)、光学媒介(例如，CDROM)等等。所述媒介可包含提供这些说明材料的互联网站的网址。
应了解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的并且根据其产生的各种修改或变化将为本领域技术人员所想到并且欲包括于本申请的精神和权限以及随附权利要求的范围内。本文引用的所有公布、专利和专利申请出于所有目的据此以引用的方式整体并入有本文。

Claims (62)

1.一种用于递送试剂至细胞中的装置，所述装置包括多孔膜，其上沉积有当暴露于光学辐射时变热的材料的薄膜涂层，其中所述薄膜涂层基本上沉积在包括所述多孔膜的孔内并且所述多孔膜的表面基本上没有所述涂层。
2.根据权利要求1所述的装置，其中在沉积所述薄膜之前，所述多孔膜的平均孔径在约100nm至约3μm的范围内。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的装置，其中所述薄膜包含选自由以下组成的组的材料：金、银、钛(Ti)、TiN、TiCn以及TiAlN。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的装置，其中所述薄膜包含钛。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的装置，其中所述薄膜的厚度在约10nm至约1μm内的范围内。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的装置，其中所述多孔膜包括多孔氧化铝(Al2O3)结构。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的装置，其中所述多孔膜包括聚酯膜。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的装置，其中所述多孔膜与多个细胞接触或并列相邻。
9.根据权利要求8所述的装置，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
10.一种用于递送试剂至细胞中的装置，所述装置包括：
刚性基底，其包括第一表面和在与所述第一表面相对侧上的第二表面以及微孔口阵列，其中所述微孔口从所述第一表面穿过所述基底至所述第二表面，其中所述微孔口具有小于约10μm的最大直径，并且多个所述微孔口的至少一部分壁或边缘和/或与所述微孔口相邻的所述第一表面的区域用当暴露于光学辐射时变热的材料的薄膜涂层涂覆；以及
设置在邻近所述第二表面处的流体通道或流体贮存器，其中所述通道或贮存器与包括所述微孔口阵列的多个微孔口流体连通；并且
其中所述第一表面的面被设置来接收并支持和/或容纳细胞。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述微孔口具有约5μm或更小的最大直径。
12.根据权利要求10所述的装置，其中所述微孔口具有约3μm或更小的最大直径。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的装置，其中所述刚性基底由微光刻晶片形成。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的装置，其中所述刚性基底由选自由以下组成的组的材料形成：硅、石英、刚性聚合物以及陶瓷。
15.根据权利要求10-13中任一项所述的装置，其中所述刚性基底由硅形成。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的装置，其中所述刚性基底，其中所述第一表面包括被构造来容纳细胞并设置用于显微镜观察的腔室的表面。
17.根据权利要求16所述的装置，其中所述腔室具有开放的顶部。
18.根据权利要求16所述的装置，其中所述腔室具有封闭所述腔室的顶部。
19.根据权利要求10-18中任一项所述的装置，其中所述微孔口阵列包括至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少50个、至少100个、至少200个或至少500个微孔口。
20.根据权利要求19所述的装置，其中所述孔口全部位于所述表面约2cm2或更小，或者约1.5cm2或更小，或者约1cm2或更小，或者约0.5cm2或更小，或者约0.1cm2或更小的面积内。
21.根据权利要求10-20中任一项所述的装置，其中所述薄膜沉积在所述微孔口的一部分壁和/或一部分边缘上。
22.根据权利要求10-21中任一项所述的装置，其中所述薄膜包含选自由以下组成的组的材料：半导体、金属、金属合金、金属氮化物以及金属氧化物。
23.根据权利要求22所述的装置，其中所述薄膜包含选自由以下组成的组的材料：过渡金属、过渡金属合金、过渡金属氮化物以及过渡金属氧化物。
24.根据权利要求22所述的装置，其中所述薄膜包含选自由以下组成的组的材料：金、银、钛(Ti)、TiN、TiCn以及TiAlN。
25.根据权利要求10-24中任一项所述的装置，其中所述流体通道或腔室装置容纳待递送至细胞中的试剂。
26.根据权利要求25所述的装置，其中所述试剂选自由以下组成的组：核酸、核酶、蛋白质或肽、酶、抗体、细胞器、染色体、病原体以及微粒或纳米颗粒。
27.根据权利要求10-26中任一项所述的装置，其中所述通道或腔室被加压。
28.根据权利要求27所述的装置，其中所述通道或腔室通过气体压力、泵或重力供料进行加压。
29.根据权利要求10-28中任一项所述的装置，其中所述装置被配置来替代倒置显微镜上的载物台。
30.根据权利要求10-29中任一项所述的装置，其中细胞被设置在所述第一表面上。
31.根据权利要求30所述的装置，其中所述细胞被设置在所述基底的多个微孔口上或邻近所述多个微孔口。
32.根据权利要求30-31中任一项所述的装置，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
33.一种用于选择性地开放递送试剂至细胞中的系统，所述系统包括：
根据权利要求1-9中任一项所述的装置；和/或
根据权利要求10-32中任一项所述的装置；以及
能够加热所述薄膜的光能来源。
34.根据权利要求33所述的系统，其中所述光能来源为激光或非相干光源。
35.根据权利要求34所述的系统，其中所述光能来源为激光。
36.根据权利要求33-35中任一项所述的系统，其中所述系统包括透镜系统、镜系统和/或掩模，和/或引导光能至所述第一表面或所述多孔膜的特定区域的定位系统。
37.根据权利要求33-36中任一项所述的系统，其中所述系统包括被配置来将光能聚焦到所述第一表面或所述多孔膜上的物镜。
38.根据权利要求37所述的系统，其中所述系统包括半波板。
39.根据权利要求37-38中任一项所述的系统，其中所述系统包括偏光镜。
40.根据权利要求39所述的系统，其中所述偏光镜包括偏振分束立方体。
41.根据权利要求33-40中任一项所述的系统，其中所述系统包括调整以下至少一个的控制器：所述光能来源的照明模式、由所述光能来源发出的光脉冲的发生定时、由所述光能来源发出的脉冲的发生频率、由所述光能来源发出的脉冲的波长、由所述光能来源发出的脉冲的能量以及由所述光能来源发出的脉冲目标或位置。
42.一种递送试剂至细胞中的方法，所述方法包括：
在根据权利要求1-9或10-29中任一项所述的装置中和/或在根据权利要求33-41中任一项所述的系统中提供细胞，其中所述细胞设置在所述第一表面上或接触或并列靠近所述多孔膜；
使所述细胞与所述试剂接触；以及
将所述表面或多孔膜的区域暴露于光学辐射从而诱导所述薄膜加热，其中所述加热形成空泡，所述空泡在加热的区域中或靠近加热的区域将开口引入细胞的膜中，从而使得将所述试剂递送至那些细胞中。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述方法包括在根据权利要求1-9中任一项所述的装置上或在根据权利要求33-41中任一项所述的系统中提供细胞，所述装置和所述系统并入有所述多孔膜。
44.根据权利要求42-43中任一项所述的方法，其中通过在围绕实施细胞的培养基中提供所述试剂，使所述细胞与所述试剂接触。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中使细胞放置或生长在所述多孔膜的顶部上并且加热处于或靠近所述细胞处的所述膜的表面。
46.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中使细胞放置或生长在所述多孔膜的顶部上并且加热与所述细胞相对的所述膜的表面。
47.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中使细胞放置或生长在单独的基底上并且将所述多孔膜定位在用于试剂递送的所述细胞的顶部上。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述单独的基底包括选自由以下组成的组的物体的表面：盖玻片、微量滴定板、皮氏培养皿以及培养容器。
49.根据权利要求42所述的方法，其中所述方法包括在根据权利要求10-29中任一项所述的装置上或在根据权利要求33-41中任一项所述的系统中提供细胞，所述装置和所述系统并入有所述刚性基底。
50.根据权利要求42或49中任一项所述的方法，其中通过在存在于所述表面中的一个或多个孔口中提供所述试剂，使所述细胞与所述试剂接触。
51.根据权利要求50所述的方法，其中通过在与所述微孔口流体连通的腔室或通道中提供所述试剂使所述细胞与所述试剂接触。
52.根据权利要求32-51中任一项所述的方法，其中所述暴露包括将所述表面的区域暴露于激光脉冲或非相干光源。
53.根据权利要求32-52中任一项所述的方法，其中所述试剂选自由以下组成的组：核酸、染色体、蛋白质、标记、细胞器以及小有机分子。
54.一种递送试剂至细胞中的方法，所述方法包括：
在基本上缺乏纳米颗粒或薄膜的基底上提供细胞；
使所述细胞与所述试剂接触；以及
将所述基底的区域暴露于光学辐射从而引起基底的加热，其中所述加热形成空泡，所述空泡在加热的区域中或靠近加热的区域将开口引入细胞的膜中从而使得将所述试剂递送至那些细胞中。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述基底由选自由以下组成的组的材料形成：硅、石英、刚性聚合物、金属以及陶瓷。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述基底由硅形成。
57.根据权利要求54-56中任一项所述的方法，其中所述基底包括被配置来容纳细胞的腔室的表面。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述基底被设置用于显微镜观察。
59.根据权利要求57-58中任一项所述的方法，其中所述腔室具有开放的顶部。
60.根据权利要求57-58中任一项所述的方法，其中所述腔室具有封闭所述腔室的顶部。
61.根据权利要求54-60中任一项所述的方法，其中所述试剂选自由以下组成的组：核酸、核酶、蛋白质或肽、酶、抗体、细胞器、染色体、病原体以及微粒或纳米颗粒。
62.根据权利要求54-61中任一项所述的方法，其中所述基底被配置来放置在倒置显微镜上的载物台上或替代倒置显微镜上的载物台。
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