JP6606058B2 - 光熱プラットフォームを使用する生細胞への高スループットカーゴ送達 - Google Patents

光熱プラットフォームを使用する生細胞への高スループットカーゴ送達 Download PDF

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Description

関連出願の参照
本願は、すべての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる、2013年3月15日に出願されたUSSN61/799,222に対する利益及び優先権を主張する。
連邦政府によって資金援助された研究開発の下でなされた発明に対する権利に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された補助金番号EB014456の下で政府の援助で行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
タンパク質、DNA、RNA、染色体、核、ならびに、量子ドット、表面増強ラマン散乱(SERS)粒子、及びマイクロビーズなどの無生物粒子を含む広いサイズ範囲にわたる、哺乳動物細胞への導入カーゴは、生物学の多くの分野において高度に所望されている。エンドサイト−シスなどの送達方法は、エンドソーム中にカーゴを包括することができ、ここでは、低pH微小環境及び溶解酵素が、しばしば、カーゴの分解に導く(Luo and Saltzman(2000)Nat.Biotechnol.18:33−37)。ウイルス及び化学的送達方法はウイルス内部にカーゴをパッケージし、または取り込みを増強する化学複合体を形成する(Naldini et al.(1996) Science,272:263−267;Felgner et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413−7417)。しかし、毒性、細胞型特異的な取り込み、及びより重要には、限定的なカーゴパッケージ能力は、カーゴサイズ及び移入可能な細胞型にかなりの制限を課す(Luo and Saltzman、前出)。
物理的移入方法には、ランダムに分布するナノスケール孔を生じる方法である、エレクトロポレーション(Chu,et al.(1987)Nucleic Acids Res.15:1311−1326)及びソノポレーション(Mitragotri(2005)Nat.Rev.Drug Discovery,4:255−260)、ならびに、レーザー焦点で細胞膜上に孔を生成する方法であるオプトポレーション(Tirlapur and Konig(2002)Nature,418:290−291;Vogel,et al.(2005)Appl.Phys.B:Laser Opt.,81:1015−1047;Clark et al.(2006)J.Biomed.Opt.,11:014034)が挙げられる。小さなカーゴは、熱拡散または電場によってこれらの孔を通して細胞に送達される。しかし、これらの方法を用いる大きなカーゴの送達は、カーゴ拡散のゆっくりした速度と、孔サイズの増加に伴う細胞生存度の減少に起因して、低い効率であった(Stevenson et al.(2006)Opt.Express,14:7125−7133)。
マイクロキャピラリーインジェクションは、送達のために細胞膜を機械的に貫通する鋭いガラス先端を使用する(例えば、King(2004)Meth.Mo.Biol.,245:Gene Delivery to Mammalian Cells 1;Humana Press Inc.Totowa,NJを参照のこと)。しかし、膜貫通からの機械的外傷は、細胞生存度を維持するために、典型的なピペットチップを約0.5μm直径に限定する(例えば、Han et al.(2998)J.Nanomed.Nanotechnol.Biol.Med.,4:215−225を参照のこと)。
ピペットチップよりも大きなカーゴは、ピペットの詰まり及びカーゴの剪断に起因して注入ができない。エレクトロポレーションをマイクロキャピラリーインジェクションと組み合わせる方法であるエレクトロインジェクションは、RNA及びプラスミドDNAなどの小分子の生細胞への送達(例えば、Boudes et al.(208)J.Neurosci.Meth.,170:204−211;Kitamura et al.(2008)Nat.Meth.,5:61−67などを参照のこと)及び人工脂質ベシクルへの細菌送達(例えば、Hurtig and Orwar(2008)Soft Matter,4:1515−1520を参照のこと)を実証してきた。エレクトロインジェクションは、電場を用いて細胞膜を弱めること、続いて、細胞への穏やかな機械的貫通によって機能する。
単純脂質アシストマイクロインジェクション(SLAM)技術(Laffafian and Hallett(1998)Biophys.J.,75:2558−2563)は、ガラスマイクロキャピラリーの先端に合成脂質分子を組み込む。SLAMマイクロピペットの細胞膜との接触は、脂質分子が細胞膜と融合することを可能にして、カーゴ送達のための連続的及び一時的な経路を形成する。この方法は、細胞膜を通してのマイクロピペットチップの問題となるジグザグ突き刺し動作を回避する。しかし、カーゴ及び細胞膜との親油性相互作用は、細胞中で、望ましくない生物学的効果を生じ、ならびに送達カーゴを用いるとこの方法を特定の細胞型及びカーゴ内容物に限定する可能性がある。
Luo and Saltzman(2000)Nat.Biotechnol.18:33−37 Naldini et al.(1996) Science,272:263−267 Felgner et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413−7417 Chu,et al.(1987)Nucleic Acids Res.15:1311−1326 Mitragotri(2005)Nat.Rev.Drug Discovery,4:255−260 Tirlapur and Konig(2002)Nature,418:290−291 Vogel,et al.(2005)Appl.Phys.B:Laser Opt.,81:1015−1047 Clark et al.(2006)J.Biomed.Opt.,11:014034 Stevenson et al.(2006)Opt.Express,14:7125−7133 King(2004)Meth.Mo.Biol.,245:Gene Delivery to Mammalian Cells 1;Humana Press Inc.Totowa,N Han et al.(2998)J.Nanomed.Nanotechnol.Biol.Med.,4:215−225 Boudes et al.(208)J.Neurosci.Meth.,170:204−211 Kitamura et al.(2008)Nat.Meth.,5:61−67 Hurtig and Orwar(2008)Soft Matter,4:1515−1520 Laffafian and Hallett(1998)Biophys.J.,75:2558−2563
特定の実施形態において、生細胞への薬剤(例えば、核酸、タンパク質、有機分子、オルガネラ、抗体、または他のリガンドなど)の送達及び/または前記細胞からの薬剤の抽出のための方法、デバイス、及びシステムが提供される。様々な実施形態において、生細胞への効率的な、高スループットカーゴ送達を可能にする光熱プラットフォーム及びこのような光熱プラットフォームを組み込むシステムが提供される。
様々な態様において、本明細書において意図される本発明は、以下の実施形態の任意の1つ以上を含んでもよいがこれらに限定されない。
実施形態1:細胞に薬剤を送達するためのデバイスであって、前記デバイスは、光学的放射に暴露されたときに加熱する材料をコートしている薄膜をその上に蒸着している多孔質膜を含み、前記薄膜コーティングは、前記多孔質膜を備える孔の中に実質的に蒸着され、前記多孔質膜の表面には前記コーティングが実質的にない、デバイス。
実施形態2:前記薄膜の蒸着の前に、前記多孔質膜の平均細孔径が約100nmから約3μmまでの範囲である、実施形態1に記載のデバイス。
実施形態3:前記薄膜が、金、銀、チタン(Ti)、TiN、TiCn、及びTiAlNからなる群より選択される材料を含む、実施形態1〜2のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態4:前記薄膜がチタンを含む、実施形態1〜2のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態5:前記薄膜の厚みが、約10nmから約1μmまでの範囲である、実施形態1〜4のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態6:前記多孔質膜が多孔質アルミナ(Al)構造を備える、実施形態1〜5のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態7:前記多孔質膜がポリエステル膜を備える、実施形態1〜5のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態8:前記多孔質膜が複数の細胞と接触されるか、または複数の細胞と隣接して並置される、実施形態1〜7のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態9:前記細胞が哺乳動物細胞である、実施形態8に記載のデバイス。
実施形態10:細胞に薬剤を送達するためのデバイスであって、前記デバイスは、第1の表面及び前記第1の表面の反対側の第2の表面及び微小開口部のアレイを備える硬質基材であって、ここで、前記微小開口部は前記基材を通して前記第1の表面から前記第2の表面まで貫通しており、前記微小開口部は約10μm未満の最大直径を有し、複数の前記微小開口部の壁または縁の少なくとも一部、及び/または前記微小開口部に隣接する前記第1の表面の領域が、光学的放射に露出されたときに加熱する材料の薄膜コーティングでコートされている、硬質基材を備え、ならびに前記第2の表面に隣接して配置されている液体チャネルまたは液体リザーバーであって、前記チャネルまたはリザーバーは、前記微小開口部のアレイを備える複数の微小開口部と液体で連絡している、チャネルまたはリザーバーを備え、ならびに前記第1の表面の面は、細胞を受容及び支持するように、ならびに/または細胞を含有するように配置されている、デバイス。
実施形態11:前記微小開口部が約5μm以下の最大直径を有する、実施形態10に記載のデバイス。
実施形態12:前記微小開口部が約3μm以下の最大直径を有する、実施形態10に記載のデバイス。
実施形態13:前記硬質基材がマイクロリソグラフィーウェハから形成される、実施形態10〜12のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態14:前記硬質基材が、シリコン、石英、硬質ポリマー、及びセラミックからなる群より選択される材料から形成される、実施形態10〜13のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態15:前記硬質基材が、シリコンから形成される、実施形態10〜13のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態16:前記硬質基材が、前記第1の表面が、細胞を含有するように構成されたチャンバーの表面を備え、顕微鏡を用いて観察するために配置されている、実施形態10〜15のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態17:前記チャンバーがふたなしである、実施形態16に記載のデバイス。
実施形態18:前記チャンバーが、前記チャンバーを閉じるふたを有する、実施形態16に記載のデバイス。
実施形態19:前記微小開口部のアレイが、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、または少なくとも500の微小開口部を備える、実施形態10〜18のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態20:前記微小開口部が、前記表面の約2cm以内、または約1.5cm以内、または約1cm以内、または約0.5cm以内、または約0.1cm以内の領域内にすべて配置されている、実施形態19に記載のデバイス。
実施形態21:前記薄膜が、前記微小開口部の壁の部分及び/または縁の部分に蒸着されている、実施形態10〜20のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態22:前記薄膜が、半導体、金属、金属合金、金属窒化物、及び金属酸化物からなる群より選択される材料を備える、実施形態10〜21のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態23:前記薄膜が、遷移金属、遷移金属合金、遷移金属窒化物、及び遷移金属酸化物からなる群より選択される材料を備える、実施形態22に記載のデバイス。
実施形態24:前記薄膜が、金、銀、チタン(Ti)、TiN、TiCn、及びTiAlNからなる群より選択される材料を備える、実施形態22に記載のデバイス。
実施形態25:前記液体チャネルまたはリザーバーデバイスが細胞に送達される試薬を含有する、実施形態10〜24のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態26:前記試薬が、核酸、リボザイム、タンパク質もしくはペプチド、酵素、抗体、オルガネラ、染色体、病原体、及び微粒子もしくはナノ粒子からなる群より選択される、実施形態25に記載のデバイス。
実施形態27:前記チャネルまたはチャンバーが加圧される、実施形態10〜26のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態28:前記チャネルまたはチャンバーが、ガス圧、ポンプ、または重力送りによって加圧される、実施形態27に記載のデバイス。
実施形態29:前記デバイスが倒立顕微鏡上のステージを置き換えるように構成されている、実施形態10〜28のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態30:細胞が前記第1の表面に配置されている、実施形態10〜29のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態31:前記細胞が、前記基材における複数の微小開口部上またはそれに隣接して配置されている、実施形態30に記載のデバイス。
実施形態32:前記細胞が哺乳動物細胞である、実施形態30〜31のいずれか1つに記載のデバイス。
実施形態33:細胞に薬剤を送達するために選択的に開口するためのシステムであって、前記システムは、実施形態1〜9のいずれか1つに記載のデバイス、及び/または実施形態10〜32のいずれか1つに記載のデバイス、及び前記薄膜を加熱することが可能である光学的エネルギーの供給源を備える、システム。
実施形態34:前記光学的エネルギーの供給源がレーザーまたは非コヒーレント光源である、実施形態33に記載のシステム。
実施形態35:前記光学的エネルギーの供給源がレーザーである、実施形態34に記載のシステム。
実施形態36:前記システムが、前記第1の表面または前記多孔質膜の特定の領域に、光学的エネルギーを方向付けるためにレンズシステム、ミラーシステム、及び/またはマスク、及び/またはポジショニングシステムを備える、実施形態33〜35のいずれか1つに記載のシステム。
実施形態37:前記システムが、光学的エネルギーを前記第1の表面または前記多孔質膜に焦点を合わせるように構成されている対物レンズを備える、実施形態33〜36のいずれか1つに記載のシステム。
実施形態38:前記システムが半波長板を備えている、実施形態37に記載のシステム。
実施形態39:前記システムが偏光子を備えている、実施形態37〜38のいずれか1つに記載のシステム。
実施形態40:前記偏光子が偏光ビームスプリッターキューブを備えている、実施形態39に記載のシステム。
実施形態41:実施形態33〜40のいずれか1つに記載のシステムであって、前記システムは、前記光学的エネルギーの供給源による放射のパターン、前記光学的エネルギーの供給源によって放射される光パルスの発生のタイミング、前記光学的エネルギーの供給源によって放射されるパルスの発生の周波数、前記光学的エネルギーの供給源によって放射されるパルスの波長、前記光学的エネルギーの供給源によって放射されるパルスのエネルギー、及び前記光学的エネルギーの供給源によって放射されるパルスの照準または位置の少なくとも1つを調整するコントローラーを備える、システム。
実施形態42:細胞に試薬を送達する方法であって、前記方法は、実施形態1〜9もしくは10〜29のいずれか1つに記載のデバイス、及び/または実施形態33〜41のいずれか1つに記載のシステムにおいて細胞を供給することであって、前記細胞は、前記第1の表面に配置されるか、または前記多孔質膜に接触されるかもしくはその近傍に並置されていること、前記細胞を前記試薬と接触させること、ならびに前記表面または多孔質膜の領域を光学的放射に露出し、それによって、前記薄膜の加熱を誘導し、ここで、前記加熱は、前記試薬のこれらの細胞への送達を生じる加熱領域中またはその近傍で細胞の膜において開口を導入する泡を形成することを備える、方法。
実施形態43:前記多孔質膜を組み込んでいる、実施形態1〜9のいずれか1つに記載のデバイス、または実施形態33〜41のいずれか1つに記載のシステムにおいて細胞を供給することを備える、実施形態42に記載の方法。
実施形態44:細胞の周囲を取り囲む培養培地中に前記試薬を供給することによって、前記細胞が前記試薬と接触される、実施形態42〜43のいずれか1つに記載の方法。
実施形態45:細胞が前記多孔質膜の上端に配置されるかまたはそこで増殖され、かつ前記細胞またはその近傍の前記膜の表面が加熱される、実施形態42〜44のいずれか1つに記載の方法。
実施形態46:細胞が前記多孔質膜の上端に配置されるかまたはそこで増殖され、かつ前記細胞の反対側の前記膜の表面が加熱される、実施形態42〜44のいずれか1つに記載の方法。
実施形態47:細胞が別個の基材上で配置または増殖され、前記多孔質膜は試薬の送達のために前記細胞の上端に位置する、実施形態42〜44のいずれか1つに記載の方法。
実施形態48:前記別個の基材が、カバースリップ、マイクロタイタープレート、ペトリディッシュ、及び培養容器からなる群より選択される物体の表面を備える、実施形態47に記載の方法。
実施形態49:前記硬質基材を組み込んでいる、実施形態10〜29のいずれか1つに記載のデバイス、または実施形態33〜41のいずれか1つに記載のシステムにおいて細胞を供給することを備える、実施形態42に記載の方法。
実施形態50:前記表面に存在している1つ以上の開口部に前記試薬を供給することによって、前記細胞が前記試薬と接触される、実施形態42または49のいずれか1つに記載の方法。
実施形態51:前記微小開口部と液体で連絡されているチャンバーまたはチャネルに前記試薬を供給することによって、前記細胞が前記試薬と接触される、実施形態50に記載の方法。
実施形態52:前記表面の領域を、レーザーパルスまたは非コヒーレント光源に露出することを備える、実施形態32〜51のいずれか1つに記載の方法。
実施形態53:前記試薬が、核酸、染色体、タンパク質、標識、オルガネラ、及び小有機分子からなる群より選択される、実施形態32〜52のいずれか1つに記載の方法。
実施形態54:試薬を細胞に送達する方法であって、前記方法は、ナノ粒子または薄膜を実質的に欠く基材上に細胞を供給すること、前記細胞を前記試薬と接触させること、及び前記基材の領域を光学的放射に露出し、それによって、基材の加熱を誘導し、ここで、前記加熱が、加熱された領域またはその近傍での細胞の膜に開口を導入するバブルを形成し、前記試薬のこれらの細胞への送達を生じることを備える、方法。
実施形態55:前記基材が、シリコン、石英、硬質ポリマー、金属、及びセラミックからなる群より選択される材料から形成される、実施形態54に記載の方法。
実施形態56:前記基材がシリコンから形成される、実施形態54に記載の方法。
実施形態57:前記基材が細胞を含有するように構成されたチャンバーの表面を備える、実施形態54〜56のいずれか1つに記載の方法。
実施形態58:前記基材が顕微鏡で観察するために配置されている、実施形態57に記載の方法。
実施形態59:前記チャンバーがふたなしである、実施形態57〜58のいずれか1つに記載の方法。
実施形態60:前記チャンバーが、前記チャンバーを閉じるふたを有する、実施形態57〜58のいずれか1つに記載の方法。
実施形態61:前記試薬が、核酸、リボザイム、タンパク質もしくはペプチド、酵素、抗体、オルガネラ、染色体、病原体、及び微粒子もしくはナノ粒子からなる群より選択される、実施形態54〜60のいずれか1つに記載の方法。
実施形態62:前記基材が倒立顕微鏡上のステージ上に配置されるか、またはそのステージを置き換えるように構成されている、実施形態54〜61のいずれか1つに記載の方法。
定義
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーをいうために、本明細書中では交換可能に使用される。この用語は、1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学アナログであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。この用語はまた、ポリペプチドを作り上げるアミノ酸を結合する従来的なペプチド結合の改変体もまた含む。好ましい「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸のα炭素がペプチド結合を通して連結されているアミノ酸の鎖である。従って、この鎖の末端の末端アミノ酸(アミノ末端)は遊離のアミノ基を有するのに対して、この鎖の他の端の末端アミノ酸(カルボキシ末端)は遊離のカルボキシル基を有する。本明細書で使用される場合、「アミノ末端」(N末端と略される)とは、ペプチドのアミノ末端のアミノ酸のαアミノ酸、またはペプチド中の任意の他の位置のアミノ酸のαアミノ基(ペプチド結合に加わっている場合にはイミノ基)をいう。同様に、「カルボキシ末端」という用語は、ペプチドのカルボキシ末端の遊離のカルボキシル基、またはペプチド中の任意の他の位置のアミノ酸のカルボキシル基をいう。ペプチドにはまた、本質的に、アミド結合とは対照的に、エーテルによって結合されたアミノ酸などのペプチド模倣物を含むがこれに限定されない、任意のポリアミノ酸も含まれる。
「試薬」という用語は、細胞に送達される物質に関して使用される場合、細胞に送達される(または細胞から抽出される)任意の物質を含む。このような試薬には、核酸(例えば、ベクター、及び/または発現カセット、阻害RNA(例えば、siRHA、shRNA、miRNAなど)を含む)、リボザイム、タンパク質/ペプチド、酵素、抗体、イメージング試薬、オルガネラ(例えば、核、ミトコンドリア、核小体、リソソーム、リボソームなど)、染色体、細胞内病原体、量子ドット、表面増強ラマン散乱(SERS)粒子、及びマイクロビーズなどの無生物粒子などが挙げられるがこれらに限定されない。
図1Aは、哺乳動物の生細胞への高スループットカーゴ送達のための微小製造光熱プラットフォームの1つの実施形態を模式的に図示する。 図1Bは、哺乳動物の生細胞への高スループットカーゴ送達のための微小製造光熱プラットフォームの1つの実施形態を模式的に図示する。 図2は、シリコンベースの光熱プラットフォームの製造を可能にするプロセスの1つの実施形態を図示する。 図3Aおよび3Bは、光熱送達プラットフォームを図示する。図3A:3μm開口部および50μmチャネルを有するシリコンベースの光熱送達プラットフォーム。図3B:PDMS製の変形可能な膜ポンプが、活発な液体ポンピングおよびカーゴ送達のためにシリコンベースの光熱プラットフォームと統合された。 図4、パネルA〜Cは、バブル生成試薬送達を図示する。パネルA:シリコンベースの光熱プラットフォーム上での三日月形状のバブル形成。パネルB:プラットフォーム上で培養されたHeLa細胞への1μm緑色蛍光マイクロビーズの送達。パネルC:複数の1μm緑色蛍光マイクロビーズを含有する細胞の明視野及び蛍光画像。容易な観察のために、送達後に細胞は細胞培養ディッシュに再プレートされた。 図5Aは、細胞をチップに反転させることによって、微小製造光熱プラットフォームを使用する並行カーゴ送達の1つの代替構成を図示する。細胞は、カバースリップ(または他の透明な平面基材)上で増殖できる。スペーサーがカバースリップとシリコンチップの間で使用されて、チタンコートされた開口部と細胞膜の適切な接触を維持する。レーザーパルス及びバブルキャビテーションによる細胞膜切断の後、カーゴは変形可能なPDMS膜ポンプを使用して細胞まで駆動できる。図5Bは、この構成を使用して200nm蛍光マイクロビーズが送達された、ガラスカバースリップ上で培養されたHeLa細胞を示す。 図6A及び6Bは、多孔質ポリマー膜ベースの送達プラットフォームの1つの実施形態を図示する。図6A:並行送達プラットフォームは、トラックエッチドポリエステル多孔質膜にチタン薄膜を蒸着させることによって実現された。斜角でのパルスレーザー切断を使用して、膜表面上でのチタン薄膜は除去され、孔内部のチタンはインタクトなままであった。側壁のチタンは、隣接する細胞膜の切断を生じるために、パルスレーザー励起後のバブル導入部位として働く。 図6B:キャビテーションバブルは、それぞれ、3μmと1μmの平均孔直径で多孔質膜上で生成した。 図7、パネルA〜Cは、多孔質ポリマー膜ベースの光熱プラットフォームを使用するカーゴ送達の様々な構成を図示する。蛍光デキストラン送達は、すべての構成について実証された。パネルA:細胞は多孔質膜の上端で増殖される。チタン薄膜上で生成したバブルは、送達のために接触している細胞膜を切断する。パネルB:細胞は多孔質膜の上端で培養される。チタン薄膜は、多孔質膜の反対(底面)側に蒸着される。レーザーパルスの際に、バブルキャビテーションは、孔を通した液体流を誘導し、一時的に細胞膜を貫通する。パネルC:細胞は基材(例えば、カバースリップ、プラスチックペトリディッシュ)上で培養される。チタンコートされた多孔質膜は、細胞膜ポレーション及びカーゴ送達のために、細胞の上端に配置される。 図8、パネルA:多孔質ポリマー膜ベースの光熱プラットフォームを使用して、GFPをコードするプラスミドDNAは、HeLa細胞に首尾よく送達され、発現された。図8、パネルB:蛍光デキストラン分子は、マトリゲルコートされた多孔質膜上で培養されたヒト胚性幹細胞(hESC)コロニーに高い効率で送達された。 図9は、シリコンウェハベースの送達プラットフォームの1つの実施形態を図示する。シリコンウェハは、パルスレーザー光を吸収し、シリコンウェハ表面上で誘導された一時的な加熱およびキャビテーションは、ウェハの上端で培養されまたはウそこに配置された細胞を貫通する。カルセインなどの小分子の高スループット、並行送達は、示されるように、非接着Ramos細胞及び接着HeLa細胞において実証された。
詳細な説明
特定の実施形態において、生細胞への薬剤(例えば、核酸、タンパク質、有機分子、オルガネラ、抗体、または他のリガンドなど)の送達及び/または前記細胞からの薬剤の抽出のための方法、デバイス、及びシステムが提供される。様々な実施形態において、生細胞への効率的な、高スループットカーゴ送達を可能にする光熱プラットフォーム及びこのような光熱プラットフォームを組み込むシステムが提供される。
様々な実施形態において、本明細書に記載される光熱プラットフォームは、液体及び/または表面(またはその成分または領域)を加熱するために光学的エネルギー源を利用し、それによって、急速に拡大する「キャビテーション」バブルを形成する。特定の理論に束縛されることはないが、様々な実施形態において、本明細書に記載される方法、プラットフォーム、及びシステムは、送達のために細胞膜を局所的かつ一時的に開くために、バブルキャビテーションによって発揮される流体力及び/または機械力に頼っている。この物理的メカニズムが、広い範囲の細胞型及びカーゴ(試薬)型に適用できることが発見された。
加えて、バブル拡大による超高速細胞膜切断は、細胞生存度を維持しながら、マイクロビーズまたはオルガネラなどのスーパーサイズのカーゴ送達のために、細胞膜にマイクロサイズの入口を開く。
微小製造技術を使用する特定の実施形態において、約10よりも多い光熱送達部位が、光熱プラットフォーム中の1cm×1cmの面積にわたって実現できる。約10よりも多い細胞への同時送達は、有効領域への単一光学的エネルギー(例えば、レーザー)パルス、続いて、カーゴ拡散またはポンピングによって、数秒以内に行うことができる。
I.微小製造表面ベース光熱送達プラットフォーム
特定の実施形態において、微小製造(例えば、エッチング及び/または蒸着)表面ベース光熱送達プラットフォームが提供される。図1は、哺乳動物の生細胞への高スループットカーゴ送達のためのシリコンベースの微小製造光熱プラットフォームの原理を図示する。この図面に図示されるように、十分に規定され、間隔のあいた微小開口部の2Dアレイが製造される。典型的には、微小開口部のサイズは、約100nmから約4μmまでの範囲である。特定の実施形態において、微小開口部のサイズは、約100nmから、または約300nmから、または約500nmから、または約800nmから、約1μmまで、または約2μmまで、または約3μmまで、または約4μmまで、または約5μmまでの範囲である。様々な実施形態において、典型的な微小開口部の間の間隔は、約1μmから約10μmまでの範囲である。薄膜は、光学的エネルギー源によって急速に加熱できる任意の材料を含むことができる。例示的であるが、非限定的な材料には、金属、半導体などが挙げられる。特定の実施形態において、この材料には、金、銀、チタン(Ti)、TiN、TiCn、及びTiAlNが挙げられる。他の金属、金属合金、金属酸化物などもまた使用できる。
高強度光学エネルギーに露出されたときに加熱する材料から形成される薄膜は、微小開口部の内側及び/または縁に蒸着される。様々な実施形態において、薄膜の厚みは約10nmから約1μmまでの範囲である。
光学エネルギー源(例えば、レーザー)を用いるパルスの際に、薄膜(例えば、チタン薄膜)は加熱し、三日月形状の蒸気バブルを誘導する。キャビテーションバブルは隣接する細胞膜を切断し、細胞質ゾルへのカーゴ送達のために一時的な入口を作る。レーザーパルスと同期した拡散または能動的液体ポンピングによって、様々なサイズのカーゴが細胞に輸送できる。
様々な実施形態において、光熱基材を含む材料は、好ましくは細胞に対して非毒性である任意の便利な材料から製造でき、これは、薄膜コーティングを有することができ、そして表面及び/または薄膜への電磁エネルギー(例えば、光エネルギー)の適用によって産生される局所的加熱に耐えることができる。適切な材料には、ガラス及び/またはシリコン(silicion)、ゲルマニウム、ミネラル(例えば、石英)、セラミック、プラスチック(例えば、DELRIN(登録商標)、TEFLON(登録商標)など)、金属、半導体などが挙げられるがこれらに限定されない。
特定の実施形態において、基材は、細胞スクリーニング及び/または細胞培養のために使用される容器の表面を備える。これは、例えば、接着または懸濁細胞培養のための容器が含むことができる。これはまた、マイクロタイタープレート(96ウェル、384ウェル、864ウェル、1536ウェルなど)、微小流体デバイス、高密度(マイクロアレイ)基材、顕微鏡スライドまたはチャンバーなども含むことができる。
特定の実施形態において、細胞トランスフェクション基材は、半導体工業において公知である技術を使用して製造される。図2は、シリコンベースの光熱送達プラットフォームを製造するための1つのプロセスフローを図示する。SiO薄膜は、シリコンウェアの上端及び下端に蒸着される。フォトリソグラフィー及びドライエッチングを使用して、3ミクロン穴のアレイが上端酸化物層に規定され、50〜100ミクロンの大きな開口が下端の酸化物層に規定される。チタン薄膜は、上端酸化物層に蒸着される。深掘り反応性イオンエッチングを使用して、シリコンチャネルは、上端酸化物層における3ミクロン穴が接続されるまでウェハの全体の厚みを通して裏側からエッチングされ、続いて、側壁チタンコーティングを浮き彫りにするためにリフトオフプロセスを行った。
図示された開口部は環状であるが、これらはそのように限定される必要はない。標準的な方法(エッチング方法)を使用して、本質的に任意の形状の開口部(例えば、丸形、四角形、五角形、六角形、楕円形、台形、不規則型など)が製造できる。同様に、開口部のパターン形成は本質的に任意の所望のパターンであり得る。
図3A及び3Bは、3μm開口部及び50μmチャネルを有する1つの例示的なシリコンベースの光熱送達プラットフォームを示す。大きなカーゴの効率的な送達を達成するために、この場合は、PDMSで作られた変形可能な膜ポンプが、活発な液体ポンピングおよびカーゴ送達のためにシリコンベースの光熱プラットオームと統合された。他の弾性材料(例えば、様々なプラスチック及び/またはソフトリソグラフィーのために使用される他の材料)が膜ポンプを製造するために使用できることが認識される。
図4Aは、細胞膜切断のためにチタン薄膜へのレーザーパルス後の三日月形状バブルの生成を示す。チタンコーティングは、50回より多い操作で堅固であった。この送達プラットフォームを使用して、1μmポリスチレンミクロスフェアまでの大きさのカーゴは、高い効率で細胞に送達できる。図4B及び4Cは、このプラットフォーム上での1cm×1cmの面積にわたる、HeLa細胞に1μm緑色蛍光マイクロビーズの高スループット送達を示す。
細胞をチップに反転させることによって、シリコンベースの光熱プラットフォームを使用する並行送達の1つの例示的な代替構成が図5Aに図示される。細胞は、カバースリップ(または他の透明な、好ましくは平面基材)上で増殖できる。スペーサーがカバースリップとシリコンチップの間で使用されて、チタンコートされた開口部と細胞膜の適切な接触を維持する。レーザーパルス及びバブルキャビテーションによる細胞膜切断の後、カーゴは変形可能なPDMS膜ポンプ(または他のポンピングシステム)を使用して細胞まで駆動できる。図5Bは、この構成を使用して200nm蛍光マイクロビーズが送達された、ガラスカバースリップ上で培養されたHeLa細胞を示す。
マイクロサイズの粒子、オルガネラ、または細菌さえなどのスーパーサイズのカーゴ送達のための特定の実施形態において、微小製造光熱プラットフォームは、高い送達効率及び高い細胞生存度を達成できる。1つの例示的であるが、非限定的な実施形態において、細胞はチップ上で培養される。送達前に、カーゴはシリコンチャネルを満たしたチップの裏側から負荷された。PDMSポンプは、レーザーパルスによって細胞膜を開いた直後にカーゴおよび液体を駆動するように作動される。
II.多孔質ポリマー膜ベースの送達プラットフォーム
特定の実施形態において、トランスフェクションプラットフォームは、多孔質膜を使用
して製造される。多孔質膜は、広範な種々の材料の中で利用できる(例えば、ナイロン及
びナイロンメッシュ、フィルター膜、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、発泡ポリテトラフルオロエチレン(ePTFE)、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)、発泡ポリエーテルエーテルケトン(ePEEK)、ポリエチレン(PE)、ポリプロピレン(PP)、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)、エチルビニルアセテート(EVA)、熱可塑性ポリウレタン(TPU)、ポリエーテルスルホン(PESなど)。様々な実施形態において、多孔質硬質材料(例えば、多孔質セラミック)もまた意図される。多孔質膜は当業者に公知であり、多数の供給源から様々な孔径で商業的に利用可能である(例えば、Porex Corp.Fairbum GAなどを参照のこと)。
特定の実施形態において、薄膜(例えば、上記のような)は多孔質膜に蒸着される。特定の実施形態において、薄膜は、細胞と接触される表面からエッチング加工され、同様に、任意に反対の表面からエッチング加工される。従って、特定の実施形態において、細胞に接触される表面は、実質的に薄膜を有さない。
図6Aは、多孔質ポリマー膜中で実現された並行送達プラットフォームを示す。チタン薄膜は、トラックエッチドポリエステル多孔質膜に蒸着された。斜角でのパルスレーザー切断を使用して、膜表面上でのチタン薄膜は除去され、孔内部のチタンはインタクトなままであった。側壁のチタンは、隣接する細胞膜の切断を生じるために、パルスレーザー励起後のバブル導入部位として働く。
図6Bは、それぞれ、3μmと1μmの平均孔直径で多孔質膜上で生成したキャビテーションバブルのイメージである。このプラットフォームの製造は単純であり、ポリマー膜は低コストで作製可能であり、1回の使用後に廃棄可能である。細胞膜切断および蛍光デキストラン送達は、図7、パネルA〜Cに示されるような3つの異なる構成で実証された。図7、パネルAに示されるように、細胞は、多孔質膜の上端に沈着でき、またはそこで増殖できる。チタン薄膜上で生成したバブルは、カーゴ(例えば、細胞を取り囲む培地中に供給されたカーゴ)の送達のために接触している細胞膜を切断する。図7、パネルBに図示されるように、細胞は、多孔質膜の上端に沈着でき、またはそこで培養でき、一方、チタン薄膜は、多孔質膜の反対(底面)側に存在している(例えば、事前に蒸着される)。レーザーパルスの際に、バブルキャビテーションは、孔を通した液体流を誘導し、一時的に細胞膜を貫通する。図7、パネルCは、細胞が基材(例えば、カバースリップ、プラスチックペトリディッシュ、培養容器、マイクロタイタープレートなど)上に沈着され、またはそこで培養される実施形態を図示する。チタンコートされた多孔質膜は、細胞膜ポレーション及びカーゴ送達のために、細胞の上端に配置される。多孔質ポリマー膜ベースの光熱プラットフォームを使用して、GFPをコードするプラスミドDNAは、HeLa細胞に首尾よく送達され、発現された。図8に図示されるように、蛍光デキストラン分子は、マトリゲルコートされた多孔質膜上で培養されたヒト胚性幹細胞(hESC)コロニーに高い効率で送達された。
多孔質膜プラットフォームは、プラスミドDNA、RNA、及びタンパク質などの大きなカーゴの送達のために十分に適していることが注目される。
III.空のウェハベースの送達プラットフォーム
蒸着フィルムまたはナノ粒子を含まない基材(例えば、空のウェハ)もまた、光熱送達プラットフォームとして使用できることは驚くべき発見であった。図9は、空のシリコンウェハベースのプラットフォームを図示する。シリコンウェハは、パルスレーザー光を吸収し、シリコンウェハ表面上で誘導された一時的な加熱およびキャビテーションは、シリコンウェハの上端で培養されまたはそこに配置された細胞を貫通する。カルセインなどの小分子の高スループット、並行送達は、非接着Ramos細胞及び接着HeLa細胞において実証された。
カルセインおよびヨウ化プロピジウムなどの小分子については、空のシリコンウェハプラットフォームが使用できる。レーザーパルスおよびカーゴ送達の後に、細胞は、引き続く分析のために、収集でき、またはチップ上で培養することを継続できる。
本明細書に記載される実施形態は、例示であり、非限定的であることを意図する。本明細書に提供される教示を使用して、このような「光熱送達基材」の構成は、例えば、基材の特徴(例えば、孔(開口部)サイズ、サイズ分布、空間分布が変化できる)、フィルムの型、微小流動チャネルの分布及び/または構成などを変化させることによって日常的に変動できる。
エネルギー源および選択的照射
材料の選択に依存して、光熱送達プラットフォーム外科デバイスを含む基材及び/または薄膜及び/または本明細書に記載される基材が、本質的に様々な方法のいずれかの適用によって励起(加熱)できる。このような方法には、マイクロ波、非コヒーレント光学放射(例えば、赤外放射)、電気的加熱、電子スピン共鳴(ESR)加熱、磁気加熱などが挙げられるがこれらに限定されない。特定の例示的な実施形態において、薄層及び/または基材の加熱は、光学エネルギー源(例えば、レーザー)の適用によって達成される。
基材が選択的に加熱される場合(例えば、基材の一部)、デバイスまたは基材に局所的に/選択的に放射する任意の手段が使用できる。従って、例えば、特定の実施形態において、基材の特定の領域への局所放射は、例えば、集束レーザーまたは集束非コヒーレント光(例えば、赤外)源を使用することにより達成できる。
特定の実施形態において、基材の1つ以上の領域の選択的照射は、マスク(シャドウマスク)によって達成される。特定の実施形態において、局所照射は、レンズ及び/またはミラーシステムを使用して特定の領域に照射エネルギー源(例えば、レーザー)を単に焦点を合わせることによって達成できる。特定の実施形態において、エネルギー源は、特定の領域の局所照射を達成するために、固定された領域および移動された基材(例えば、移動可能なステージまたは他の操作器具を使用して)焦点を合わせることができる。
特定の実施形態において、エネルギーパルス(例えば、レーザーパルス)は、実施例に実証されるような静的シャドウマスクによってのみならず、TIのDMDマイクロディスプレイまたはLCDディスプレイなどの空間光モジュレーターを使用する動的マスクによってもまた、形作ることができる。
粒子/ナノ粒子/薄膜材料
様々な実施形態において、本明細書に記載される様々なデバイスを備える薄膜は、適切な電磁エネルギーの適用によって加熱できる、金属、金属合金、半導体、または他の材料から製造される。様々な実施形態において、金属、金属合金、半導体、その酸化物、及び/またはその窒化物が意図される。サイズ、アスペクト比、フィルム厚、及び/または材料に依存して、このような金属は、様々な供給源(例えば、レーザー光、電場、RFフィールド、磁場、超音波の供給源など)を使用して容易に加熱される。
本明細書に提供される議論の多くは半導体または金属フィルムに関し、実施例はチタンフィルムを説明しているが、エネルギー源によって加熱される材料はそのように限定される必要はない。生じる加熱に伴う適切なエネルギーを吸収する本質的に任意の物質が、本明細書に記載される方法およびデバイスにおいて材料を加熱するために使用できる。従って、特定の実施形態において、金、銀、タンタル、白金、パラジウム、ロジウム、またはチタン、またはその酸化物、窒化物、または合金などの材料を含むフィルムが意図される。
本明細書に記載される薄膜を含むデバイスおよびシステムを含むにおいて有用な1つの重要な材料はチタン(Ti)及び/またはその酸化物、窒化物、合金またはドープ酸化物、ドープ窒化物、または合金である。特定の実施形態において、本明細書に記載される薄膜を含むシステムおよび方法は、チタン及び/または窒化チタン(TiN)を含み、これは、金よりも3倍高い融点を有する非常に硬い物質である。
TiNの他のバリアントは当業者に周知である。これらには、窒化炭素(TiCN)および窒化チタンアルミニウム(TiAlN)が挙げられるがこれらに限定されず、これらは、個別に、またはTiNとの交互の層で、またはTiN粒子との混合粒子集団中で使用できる。
上記に示されるように、本明細書に記載されるフィルムを含むデバイス及び/または基材は、金属を含む材料に限定される必要はない。
様々な実施形態において、周期表のII族、III族、IV族、V族、またはVI族からの1つ以上の物質を含む薄膜もまた意図され、ならびに、その酸化物、窒化物、合金、及びドープ型、及び/または遷移金属、遷移金属酸化物、遷移金属窒化物、遷移金属を含む合金または複合体などが意図される。特定の好ましい実施形態において、ナノ粒子及び/またはフィルムには、II族、III族、IV族、V族の物質(例えば、炭素、ケイ素、ゲルマニウム、スズ、鉛)、ドープされたII族、III族、IV族、V族、およびVI族元素、または純粋なまたはドープされたII族、III族、IV族、V族、およびVI族元素の酸化物または遷移金属、遷移金属酸化物、または遷移金属窒化物が含まれる。特定の好ましい実施形態において、粒子/ナノ粒子及び/または薄膜には、III族、IV族、またはV族の半導体が含まれる。
特定の実施形態において、薄膜は、Si、Ge、SiC、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、Wなどの1つ以上の物質、及びそれらの酸化物及び窒化物を含むことが本明細書に教示から理解される。
上記に示されるように、様々な実施形態において、II族、III族、IV族、V族、またはVI族の元素、遷移金属、遷移金属酸化物または窒化物を含む薄層は、本質的に純粋であるか、またはドープされ得(例えば、p−またはn−ドープされる)及び/または合金にされる。II−V族元素を用いる使用のため、特に、III族、IV族、およびV族元素を用いる使用のため、より特定には、IV族元素(例えば、ケイ素、ゲルマニウムなど)を用いる使用のためのp−またはn−ドーパントは、当業者に周知である。このようなドーパントには、リン化合物、ホウ素化合物、ヒ素化合物、アルミニウム化合物などが挙げられるがこれらに限定されない。
特定の実施形態において、フィルムは、ケイ素、ゲルマニウム、および炭化ケイ素などのIV族半導体を含む。このような半導体のための最も一般的なドーパントには、III族元素からのアクセプター、またはV族元素からのドナーが挙げられる。このようなドーパントには、ホウ素、ヒ素、リン、および時折、ガリウムが挙げられるがこれらに限定されない。
上記に示されたように、様々な実施形態において、薄膜は半導体を含む。多くのドープされたII族、III族、IV族、V族、またはVI族の元素が半導体であり、これらには、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InP、InAs、InSb、AIS、AlP、AlSb、PbS、PbSe、CdSb、Zn、ZnAs、ZnSb、Ti0、Ti0、Ti0、Cu0、CuO、U0、U0、Bi、Sn0、BaTi0、SrTi0、LiNb0、LaCuC4、Pbl、MoS、GaSe、SnS、Bi、GaMnAs、InMnAs、CdMnTe、PbMnTe、La0.7Ca0.3Mn0、FeO、NiO、EuO、EuS、CrBr、Cu(In,Ga)Se、CuZnSnS4、CuInSe、AgGaS、ZnSiP、As、PtSi、Bil、Hgl、TIBr、Se、AgS、FeS、Ge、およびSi、およびこれらの三元および四元混合物などが挙げられるがこれらに限定されない。
レーザーエネルギーに加えて、特定の実施形態において、磁場、電場、およびRF場もまた、特定の薄膜を加熱するために容易に使用できる。従って、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第2007/0164250号は、磁場の中に置かれたときに特定の周波数の磁場で選択的に加熱される磁気材料を提供する。
様々な実施形態において、このようなフィルムは、十分な強度の磁場に露出されたときにエネルギーを変換する磁気材料(フェロV磁気色素など)を含む。従って、例えば、交互の磁場は粒子中で交互の電流を誘導し、熱を生じる。様々な磁気材料が使用できる。このような材料には、Fe−O、Feなどの磁気材料が挙げられるがこれらに限定されない。また、特定の実施形態において、銀、銅、白金、パラジウムなどは、本発明のデバイスにおいて使用される粒子、ナノ粒子、及び/または薄膜を含むことができる。特定の実施形態において、粒子、ナノ粒子、及び/または薄膜は、Ti0、Ce0、Ag、CuO、イットリウム・アルミニウム・ガーネット(YAG)、In0、CdS、ZrO、またはこれらの組み合わせをを含むことができる。別の実施形態において、任意の金属酸化物、金属合金、金属炭化物、及び/または遷移金属が本発明において使用されてもよい。ある実施形態において、粒子は、コーティングが適用された場に対するそれらのそれぞれの応答性を変化させないように、コートできる。
特定の実施形態において、本発明のデバイスにおいて使用される薄膜は磁気材料で作ることができるのに対して、他の実施形態において、これらは、常磁性材料または超常磁性材料から作ることができるか、またはこれらを含むことができる。
従って、特定の実施形態において、薄層は、電子スピン共鳴吸収(SPM)及び/または強磁性共鳴を使用して加熱できる。電子スピン共鳴(ESR)加熱及び強磁性共鳴(FMR)加熱は、US特許公開第2006/0269612号及び同第2005/0118102号に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。イットリウム−鉄ガーネットYFC12及びγ−Feは、ESR及び/またはFMR加熱に適切である2つのよく知られた材料である。ESR及び/またはFMR加熱異なるドーパントは、これらの材料様々な適用のスピン共鳴周波数を低下させるために加えることができる。磁気ガーネット及びスピネルもまた、正常な環境条件下で、化学的に不活性かつ破壊できない。
周期表のII族、III族、IV族、及びV族からの物質を含む様々な材料及び/または半導体もまた意図される。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるデバイスにおける使用のための薄膜の面積及び/または厚さは、調整または最適化でき、フィルム材料、励起エネルギーの性質、ならびに励起エネルギーの周波数及び/または強度の選択を反映できる。
様々な実施形態において、存在する場合、薄膜の厚さは、約0.5、1、2、5、10、50、100、150、200、300、400、または500nmから約800nm、1μm、5μm、10μm、50μm、または100μmの範囲である。特定の実施形態において、金属フィルムの厚さは、約2nmまたは5nm、10nm、20nm、または30nmから約100nm、300nm、500nm、800nmまたは1μmの範囲である。特定の実施形態において、金属フィルムの厚さは、1nm〜150nm、好ましくは、約5nm〜100nm、より好ましくは、約5nm、10nm、または20nm〜約50nm、75nm、または100nmの範囲である。特定の実施形態において、金属フィルムは、約30nmの厚さである。
様々な実施形態において、コートされた層を含む本明細書に記載されるデバイスは、連続する薄膜、または複数のドメイン(例えば、5nm、10nm、20nm、50nm、100nm、200nm、500nmのドメイン)に分割された薄膜であり得る。ドメインの形状および薄膜の厚さは、材料の吸収スペクトル、エネルギーの供給源、及び所望の局所的加熱を生じるために必要とされる強度に影響を与える。
一般的に、フィルムの厚さは、局所的加熱によって産生されるバブルのサイズ及びバブルの近傍の微小流動の性質に影響を与える。このことは、産生される剪断ストレス及び細胞中で産生される開口のサイズを決定する。一般的に、フィルムがより厚くなれば、産生されるバブルがより大きくなり、細胞中で産生される穴がより大きくなる。
基材に対するフィルムの適用
表面上に薄膜を蒸着する方法は当業者に周知である。
例えば、薄膜は、スパッタリング蒸着、化学蒸着(CVD)、分子ビームエピタキシー(MBE)、プラズマアシスト蒸着、陰極アーク蒸着すなわちArc−PVD、および電子ビーム蒸着を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法によって蒸着できる。特定の実施形態において、薄膜はまた、光熱トランスフェクション基材上に化学的に蒸着できる。
TiN薄膜作製の最も一般的な方法は、物理蒸着(PVD、通常はスパッタ蒸着、陰極アーク蒸着、または分子ビーム加熱)および化学蒸着(CVD)である。両方の方法において、純粋なチタンが昇華させられ、高エネルギー、真空環境で窒素と反応される。
バルクセラミック物体は、粉末金属チタンを所望の形状に充填すること、それを適切な密度まで圧縮すること、次いで、純粋な窒素の雰囲気中でそれに着火することによって製造できる。金属とガスの間の化学反応によって放出される熱は、窒化物反応生成物を焼成して、硬い、仕上がった品目にするために十分である。
上記の表面上で薄膜を形成する方法は、例示であって限定を意図するものではない。本明細書に提供される教示を使用して、他の薄膜コート表面は、多くても日常的な実験を使用して産生できる。
細胞型
本明細書に記載される方法及びデバイスは、細胞膜を有する本質的に任意の細胞とともに使用できると考えられている。加えて、これらの方法及びデバイスはまた、細胞壁を有する細胞に対して使用できる。従って、様々な実施形態において、動物細胞(例えば、哺乳動物細胞)及び植物細胞及び真菌細胞が意図される。
従って、例えば、NIH3T3マウス線維芽細胞、HEK293T胚腎臓線維芽細胞、およびHeLa子宮頸癌細胞を含む接着細胞が、本明細書に記載されるデバイス及び方法を使用してGFP発現プラスミドを注入された。一般的に、任意の接着哺乳動物細胞型が、本明細書に記載されるデバイス及び方法を使用して容易に注入できると考えられている。なぜなら、1)効果的な細胞穿孔および細胞生存度の維持によって最適であると決定されるレーザーフルエンスは、試験されたすべての細胞型について比較的狭い範囲で存在し、そして2)適切な注入位置(例えば、核周囲またはおそらく核)を決定するために使用された接着細胞の特徴は容易に視覚的に同定されるからである。
リンパ球、様々な型の幹細胞、生殖細胞、およびその他の細胞は非接触であるが、しばしば、このような細胞に対して他の「外科的な」手順を注入または実施することが望ましい。本明細書に記載されるような細胞外科ツールを用いる光ピンセットの組み込みは、このことを可能にする。
加えて、本明細書に記載される方法およびデバイスを使用して、ヒト胚性幹細胞を増殖させ、多能性を維持するために必要とされるような、細胞クラスター中に個別の細胞を注入することは、本明細書に記載される方法及びデバイスを使用して、とりわけ、幹細胞クラスターの表面上に達成可能である。様々な理由のために(例えば、発生トラッキング、勾配の確立など)所望されている、クラスター内に特定の細胞を定位的に注入することもまた可能であると考えられている。
送達可能な物質
本明細書に記載される方法及びデバイスを使用して、細胞に本質的に任意の所望の物質を送達することが可能であると考えられている。このような物質には、核酸、タンパク質、オルガネラ、薬物送達ナノ粒子、プローブ、標識などが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載される方法を使用する細胞へのプラスミドDNAの送達は、少なくとも3種の接着細胞型においてすでに実証されている。従って、任意のプラスミドサイズの遺伝物質は、本明細書に記載される方法及びデバイスによって、容易に移入されるはずである。
BAC(細菌人工染色体)は、細胞を形質導入が困難な場合のため、サイズ制限を有する送達ビヒクル(プラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス)のため、大きな遺伝的な異常を導入するため、または発生の間の特定の遺伝子の規則的な発現を追跡するために、望ましい目的である。
従って、本明細書に記載される方法及びデバイスは、全体的または部分的な天然または合成の染色体を送達するために使用できると考えられている。BACと同様に、以前の方法によって多くの細胞に導入できない大きな染色体または染色体フラグメントは、本発明者らの方法によって細胞に導入でき、例えば、ヒトのトリソミー障害(例えば、ダウン症候群及びクラインフェルター症候群)のモデルを確立する。
同様に、これらの方法は、核の移入のために(例えば、体細胞核移入において)使用でき、または他のオルガネラ(例えば、ミトコンドリア、またはナノ操作された構造)が容易に細胞に導入できる。
様々な実施形態において、送達可能な物質には試薬が含まれ、この試薬には、核酸(例えば、ベクター、及び/または発現カセット、阻害RNA(例えば、siRHA、shRNA、miRNAなど)を含む)、リボザイム、タンパク質/ペプチド、酵素、抗体、イメージング試薬、オルガネラ(例えば、核、ミトコンドリア、核小体、リソソーム、リボソームなど)、染色体、細胞内病原体、量子ドット、表面増強ラマン散乱(SERS)粒子、及びマイクロビーズなどの無生物粒子などからなる群より選択される試薬が挙げられるがこれらに限定されない。
モジュラーシステム
特定の実施形態において、本明細書に記載されるトランスフェクションプラットフォームは、既存の設備と容易に統合できる「モジュール」として提供される。例えば、特定の実施形態において、トランスフェクション基材は、既存の顕微鏡上のステージに加えることができるか、またはそれを置き換えることができる形式で提供される。特定の実施形態において、基材は、倒立顕微鏡(例えば、Zeis倒立顕微鏡)のx/y/zステージを置き換えるように形式付けられる。
特定の実施形態において、トランスフェクション基材は、微小流体システム(例えば、チップ上実験室システム)として、及び/または微小流体システムと統合できるモジュールとして提供される。
パターン化されたトランスフェクションシステム
様々な実施形態において、本発明は、試薬(カーゴ)の細胞への効率的な高スループット送達(細胞トランスフェクション)のシステムを意図する。特定の実施形態において、1つ以上の光熱基材を備えるシステムは、本明細書に記載されるような細胞トランスフェクション基材(例えば、光熱基材)を備える。この基材は、典型的には、細胞及び/または細胞培養を有する。このシステムは、試薬を送達するための手段、細胞にトランスフェクトされる薬剤、電磁エネルギー源(例えば、光学的エネルギー源)から基材の部分をマスクするための手段などを任意に備えることができる。
特定の実施形態において、システムは、薄膜及び/または光熱基材を加熱するための電磁エネルギー源をさらに任意に含む。適切なエネルギー源には、レーザー、高強度非コヒーレント光源、磁場発生装置、RF場発生装置などが挙げられるがこれらに限定されない。
様々な実施形態において、システムは、コントローラー(例えば、レーザーコントローラー)を含むことができる。特定の実施形態において、コントローラーは、照射の供給源の強度及び/もしくは期間及び/もしくは波長ならびに/または光熱基材の照射のパターンを制御するために構成できる。特定の実施形態において、コントローラーは、光熱基材を備えるマイクロチャネルを通して、及び/または光熱基材が配置されている微小流体システムを通して、試薬の流れを検出し、及び/またはそれを制御する。光熱基材が顕微鏡(例えば、倒立顕微鏡)上に供給される場合、コントローラーは、顕微鏡のステージ、顕微鏡の焦点、及び/または顕微鏡からのイメージ獲得を任意に制御できる。
キット
別の実施形態において、細胞へのカーゴの効率的な高スループット送達のためのキットが提供される。特定の実施形態において、これらのキットは、本明細書に記載されるような光熱送達デバイスを含有する容器を含む。様々な実施形態において、これらのキットは、細胞へのカーゴ送達を実施するための本明細書に記載された任意の試薬またはデバイス(例えば、試薬、緩衝剤、チュービング、指示試薬、マニピュレーターなど)をさらに任意に含むことができる。
加えて、これらのキットは、ラベル材料、及び/または細胞にカーゴを送達するための本明細書に記載されたシステム及びデバイスの使用のための指示を提供する指示資料(すなわち、プロトコール)を任意に含む。
指示資料は、典型的には、手書きまたは印刷された資料を含むが、これらはそのようなものに限定されない。このような指示を保存でき、エンドユーザーにこれらを情報伝達できる任意の媒体が本発明によって意図される。このような媒体には、電子保存媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えば、CD−ROM)などが挙げられるがこれらに限定されない。このような媒体は、このような指示資料を提供するインターネットサイトのアドレスを含んでもよい。
本明細書に記載される実施例および実施形態は、例示目的のみのためであり、それを考慮した様々な修飾または変更が当業者に示唆され、そして本願の技術思想および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることが理解される。本明細書において引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のために、それらの全体が参照によりそれによって組み込まれる。

Claims (30)

  1. 細胞に薬剤を送達するためのデバイスであって、前記デバイスは、光学的放射に暴露されたときに加熱する材料をコートしている薄膜をその上に蒸着している多孔質ポリマー膜を備え、前記薄膜コーティングは、前記多孔質ポリマー膜を備える孔の内側に実質的に蒸着され、前記多孔質ポリマー膜の表面には前記コーティングがない、デバイス。
  2. 前記薄膜の蒸着の前に、前記多孔質ポリマー膜の平均細孔径が100nmから3μmまでの範囲である、請求項1に記載のデバイス。
  3. 前記多孔質ポリマー膜が、ナイロン若しくはナイロンメッシュ、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリエステル、発泡ポリテトラフルオロエチレン(ePTFE)、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)、発泡ポリエーテルエーテルケトン(ePEEK)、ポリエチレン(PE)、ポリプロピレン(PP)、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)、エチルビニルアセテート(EVA)、熱可塑性ポリウレタン(TPU)及びポリエーテルスルホン(PES)から成る群から選択される膜材料を含む、請求項1または2に記載のデバイス。
  4. 前記薄膜が、金、銀、チタン(Ti)、TiN、TiCn、及びTiAlNからなる群より選択される材料を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のデバイス。
  5. 前記薄膜がチタンを含む、請求項4に記載のデバイス。
  6. 前記薄膜の厚みが、10nmから1μmまでの範囲である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のデバイス。
  7. 前記多孔質ポリマー膜が多孔質アルミナ(Al)構造を備えるか、または、前記多孔質ポリマー膜がポリエステル膜を備える、請求項1〜6のいずれか1項に記載のデバイス。
  8. 前記多孔質ポリマー膜が複数の細胞と接触されるか、または複数の細胞と隣接して並置される、請求項1〜7のいずれか1項に記載のデバイス。
  9. 細胞に薬剤を送達するためのデバイスであって、前記デバイスは、第1の表面及び前記第1の表面の反対側の第2の表面及び微小開口部のアレイを備える硬質基材であって、ここで、前記微小開口部は前記基材を通して前記第1の表面から前記第2の表面まで貫通しており、前記微小開口部は10μm未満の最大直径を有し、前記微小開口部の内側が、光学的放射に露出されたときに加熱する材料の薄膜コーティングでコートされており、前記基材の表面には前記薄膜がない、硬質基材を備え、ならびに
    前記第2の表面に隣接して配置されている液体チャネルまたは液体リザーバーであって、前記チャネルまたはリザーバーは、前記微小開口部のアレイを備える複数の微小開口部と液体で連絡している、チャネルまたはリザーバーを備え、ならびに
    前記第1の表面の面は、細胞を受容及び支持するように、ならびに/または細胞を含有するように配置されている、
    デバイス。
  10. 前記微小開口部が5μm以下の最大直径を有するか、または、3μm以下の最大直径を有する、請求項9に記載のデバイス。
  11. 前記硬質基材がマイクロリソグラフィーウェハ並びに/またはシリコン、石英、硬質ポリマー、及びセラミックからなる群より選択される材料から形成される、請求項9または10に記載のデバイス。
  12. 前記第1の表面が、細胞を含有するように構成されたチャンバーの表面を備え、顕微鏡を用いて観察するために配置されている、請求項9〜11のいずれか1項に記載のデバイス。
  13. 前記微小開口部のアレイが、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、または少なくとも500の微小開口部を備える、請求項9〜12のいずれか1項に記載のデバイス。
  14. 前記微小開口部が、前記表面の2cm以内、または1.5cm以内、または1cm以内、または0.5cm以内、または0.1cm以内の領域内にすべて配置されている、請求項13に記載のデバイス。
  15. 前記薄膜が、金、銀、チタン(Ti)、TiN、TiCn、及びTiAlNからなる群より選択される材料を備える、請求項9〜14のいずれか1項に記載のデバイス。
  16. 前記チャネルまたはリザーバーが加圧される、請求項9〜15のいずれか1項に記載のデバイス。
  17. 前記デバイスが倒立顕微鏡上のステージを置き換えるように構成されている、請求項9〜16のいずれか1項に記載のデバイス。
  18. 細胞が前記第1の表面に配置されている、および/または、
    細胞が、前記基材における複数の微小開口部上またはそれに隣接して配置されている、請求項9〜17のいずれか1項に記載のデバイス。
  19. デバイスに統合されて液体チャネルまたは液体リザーバーの部分を形成し、前記微小開口部のアレイを通じて、試薬を能動的に送り出して細胞に送達させるように構成された、変形可能な膜ポンプを含み、前記第1の表面の面は細胞を受容及び支持するように配置されている、ならびに/または細胞を含有するように配置されている微小開口部が配置されている、請求項9〜18のいずれか一項に記載のデバイス。
  20. 細胞に薬剤を送達するために選択的に開口するためのシステムであって、前記システムは、
    請求項1〜8のいずれか1項に記載のデバイス、及び/または
    請求項9〜19のいずれか1項に記載のデバイス、及び
    前記薄膜を加熱することが可能である光学的エネルギーの供給源
    を備える、システム。
  21. 前記光学的エネルギーの供給源がレーザーまたは非コヒーレント光源である、請求項20に記載のシステム。
  22. 前記システムが、前記第1の表面または前記多孔質ポリマー膜の特定の領域に、光学的エネルギーを方向付けるためにレンズシステム、ミラーシステム、及び/またはマスク、及び/またはポジショニングシステムを備える、請求項20または21に記載のシステム。
  23. 前記システムが、光学的エネルギーを前記第1の表面または前記多孔質ポリマー膜に焦点を合わせるように構成されている対物レンズを備える、請求項20〜22のいずれか1項に記載のシステム。
  24. 請求項20〜23のいずれか1項に記載のシステムであって、前記システムは、前記光学的エネルギーの供給源による放射のパターン、前記光学的エネルギーの供給源によって放射される光パルスの発生のタイミング、前記光学的エネルギーの供給源によって放射されるパルスの発生の周波数、前記光学的エネルギーの供給源によって放射されるパルスの波長、前記光学的エネルギーの供給源によって放射されるパルスのエネルギー、及び前記光学的エネルギーの供給源によって放射されるパルスの照準または位置の少なくとも1つを調整するコントローラーを備える、システム。
  25. 細胞に試薬を送達する方法であって、前記方法は、請求項1〜8もしくは9〜20のいずれか1項に記載のデバイス、及び/または請求項20〜24のいずれか1項に記載のシステムにおいて細胞を供給することであって、前記細胞は、前記第1の表面に配置されるか、または前記多孔質ポリマー膜に接触されるかもしくはその近傍に並置されていること、
    前記細胞を前記試薬と接触させること、ならびに
    前記表面または多孔質ポリマー膜の領域を光学的放射に露出し、それによって、前記薄膜の加熱を誘導し、ここで、前記加熱は、前記試薬のこれらの細胞への送達を生じる加熱領域中またはその近傍で細胞の膜において開口を導入する泡を形成すること
    を備える、方法。
  26. 細胞の周囲を取り囲む培養培地中に前記試薬を供給することによって、前記細胞が前記試薬と接触される、請求項25に記載の方法。
  27. 細胞が前記多孔質ポリマー膜の上端に配置されるかまたはそこで増殖され、かつ前記細胞またはその近傍の前記膜の表面が加熱されるか、または、
    細胞が前記多孔質ポリマー膜の上端に配置されるかまたはそこで増殖され、かつ前記細胞の反対側の前記膜の表面が加熱されるか、または、
    細胞が別個の基材上で配置または増殖され、前記多孔質ポリマー膜は試薬の送達のために前記細胞の上端に位置する、請求項25または26に記載の方法。
  28. 前記硬質基材を組み込んでいる、請求項9〜18のいずれか1項に記載のデバイスに、または請求項20〜24のいずれか1項に記載のシステムに細胞を供給することを備え、
    前記表面に存在している1つ以上の開口部に前記試薬を供給することによって、前記細胞が前記試薬と接触されるか、または、
    前記微小開口部と液体で連絡されているチャンバーまたはチャネルに前記試薬を供給することによって、前記細胞が前記試薬と接触される、請求項25に記載の方法。
  29. 前記表面の領域を、レーザーパルスまたは非コヒーレント光源に露出することを備える、請求項25〜28のいずれか1項に記載の方法。
  30. 前記試薬が、核酸、染色体、タンパク質、標識、オルガネラ、及び小有機分子からなる群より選択される、請求項25〜28のいずれか1項に記載の方法。
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