JP6606058B2 - 光熱プラットフォームを使用する生細胞への高スループットカーゴ送達 - Google Patents
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Description
本願は、すべての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる、2013年3月15日に出願されたUSSN61/799,222に対する利益及び優先権を主張する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された補助金番号EB014456の下で政府の援助で行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーをいうために、本明細書中では交換可能に使用される。この用語は、1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学アナログであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。この用語はまた、ポリペプチドを作り上げるアミノ酸を結合する従来的なペプチド結合の改変体もまた含む。好ましい「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸のα炭素がペプチド結合を通して連結されているアミノ酸の鎖である。従って、この鎖の末端の末端アミノ酸(アミノ末端)は遊離のアミノ基を有するのに対して、この鎖の他の端の末端アミノ酸(カルボキシ末端)は遊離のカルボキシル基を有する。本明細書で使用される場合、「アミノ末端」(N末端と略される)とは、ペプチドのアミノ末端のアミノ酸のαアミノ酸、またはペプチド中の任意の他の位置のアミノ酸のαアミノ基(ペプチド結合に加わっている場合にはイミノ基)をいう。同様に、「カルボキシ末端」という用語は、ペプチドのカルボキシ末端の遊離のカルボキシル基、またはペプチド中の任意の他の位置のアミノ酸のカルボキシル基をいう。ペプチドにはまた、本質的に、アミド結合とは対照的に、エーテルによって結合されたアミノ酸などのペプチド模倣物を含むがこれに限定されない、任意のポリアミノ酸も含まれる。
特定の実施形態において、生細胞への薬剤(例えば、核酸、タンパク質、有機分子、オルガネラ、抗体、または他のリガンドなど)の送達及び/または前記細胞からの薬剤の抽出のための方法、デバイス、及びシステムが提供される。様々な実施形態において、生細胞への効率的な、高スループットカーゴ送達を可能にする光熱プラットフォーム及びこのような光熱プラットフォームを組み込むシステムが提供される。
特定の実施形態において、微小製造(例えば、エッチング及び/または蒸着)表面ベース光熱送達プラットフォームが提供される。図1は、哺乳動物の生細胞への高スループットカーゴ送達のためのシリコンベースの微小製造光熱プラットフォームの原理を図示する。この図面に図示されるように、十分に規定され、間隔のあいた微小開口部の2Dアレイが製造される。典型的には、微小開口部のサイズは、約100nmから約4μmまでの範囲である。特定の実施形態において、微小開口部のサイズは、約100nmから、または約300nmから、または約500nmから、または約800nmから、約1μmまで、または約2μmまで、または約3μmまで、または約4μmまで、または約5μmまでの範囲である。様々な実施形態において、典型的な微小開口部の間の間隔は、約1μmから約10μmまでの範囲である。薄膜は、光学的エネルギー源によって急速に加熱できる任意の材料を含むことができる。例示的であるが、非限定的な材料には、金属、半導体などが挙げられる。特定の実施形態において、この材料には、金、銀、チタン(Ti)、TiN、TiCn、及びTiAlNが挙げられる。他の金属、金属合金、金属酸化物などもまた使用できる。
特定の実施形態において、トランスフェクションプラットフォームは、多孔質膜を使用
して製造される。多孔質膜は、広範な種々の材料の中で利用できる(例えば、ナイロン及
びナイロンメッシュ、フィルター膜、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、発泡ポリテトラフルオロエチレン(ePTFE)、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)、発泡ポリエーテルエーテルケトン(ePEEK)、ポリエチレン(PE)、ポリプロピレン(PP)、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)、エチルビニルアセテート(EVA)、熱可塑性ポリウレタン(TPU)、ポリエーテルスルホン(PESなど)。様々な実施形態において、多孔質硬質材料(例えば、多孔質セラミック)もまた意図される。多孔質膜は当業者に公知であり、多数の供給源から様々な孔径で商業的に利用可能である(例えば、Porex Corp.Fairbum GAなどを参照のこと)。
蒸着フィルムまたはナノ粒子を含まない基材(例えば、空のウェハ)もまた、光熱送達プラットフォームとして使用できることは驚くべき発見であった。図9は、空のシリコンウェハベースのプラットフォームを図示する。シリコンウェハは、パルスレーザー光を吸収し、シリコンウェハ表面上で誘導された一時的な加熱およびキャビテーションは、シリコンウェハの上端で培養されまたはそこに配置された細胞を貫通する。カルセインなどの小分子の高スループット、並行送達は、非接着Ramos細胞及び接着HeLa細胞において実証された。
材料の選択に依存して、光熱送達プラットフォーム外科デバイスを含む基材及び/または薄膜及び/または本明細書に記載される基材が、本質的に様々な方法のいずれかの適用によって励起(加熱)できる。このような方法には、マイクロ波、非コヒーレント光学放射(例えば、赤外放射)、電気的加熱、電子スピン共鳴(ESR)加熱、磁気加熱などが挙げられるがこれらに限定されない。特定の例示的な実施形態において、薄層及び/または基材の加熱は、光学エネルギー源(例えば、レーザー)の適用によって達成される。
様々な実施形態において、本明細書に記載される様々なデバイスを備える薄膜は、適切な電磁エネルギーの適用によって加熱できる、金属、金属合金、半導体、または他の材料から製造される。様々な実施形態において、金属、金属合金、半導体、その酸化物、及び/またはその窒化物が意図される。サイズ、アスペクト比、フィルム厚、及び/または材料に依存して、このような金属は、様々な供給源(例えば、レーザー光、電場、RFフィールド、磁場、超音波の供給源など)を使用して容易に加熱される。
表面上に薄膜を蒸着する方法は当業者に周知である。
本明細書に記載される方法及びデバイスは、細胞膜を有する本質的に任意の細胞とともに使用できると考えられている。加えて、これらの方法及びデバイスはまた、細胞壁を有する細胞に対して使用できる。従って、様々な実施形態において、動物細胞(例えば、哺乳動物細胞)及び植物細胞及び真菌細胞が意図される。
本明細書に記載される方法及びデバイスを使用して、細胞に本質的に任意の所望の物質を送達することが可能であると考えられている。このような物質には、核酸、タンパク質、オルガネラ、薬物送達ナノ粒子、プローブ、標識などが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載される方法を使用する細胞へのプラスミドDNAの送達は、少なくとも3種の接着細胞型においてすでに実証されている。従って、任意のプラスミドサイズの遺伝物質は、本明細書に記載される方法及びデバイスによって、容易に移入されるはずである。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるトランスフェクションプラットフォームは、既存の設備と容易に統合できる「モジュール」として提供される。例えば、特定の実施形態において、トランスフェクション基材は、既存の顕微鏡上のステージに加えることができるか、またはそれを置き換えることができる形式で提供される。特定の実施形態において、基材は、倒立顕微鏡(例えば、Zeis倒立顕微鏡)のx/y/zステージを置き換えるように形式付けられる。
様々な実施形態において、本発明は、試薬(カーゴ)の細胞への効率的な高スループット送達(細胞トランスフェクション)のシステムを意図する。特定の実施形態において、1つ以上の光熱基材を備えるシステムは、本明細書に記載されるような細胞トランスフェクション基材(例えば、光熱基材)を備える。この基材は、典型的には、細胞及び/または細胞培養を有する。このシステムは、試薬を送達するための手段、細胞にトランスフェクトされる薬剤、電磁エネルギー源(例えば、光学的エネルギー源)から基材の部分をマスクするための手段などを任意に備えることができる。
別の実施形態において、細胞へのカーゴの効率的な高スループット送達のためのキットが提供される。特定の実施形態において、これらのキットは、本明細書に記載されるような光熱送達デバイスを含有する容器を含む。様々な実施形態において、これらのキットは、細胞へのカーゴ送達を実施するための本明細書に記載された任意の試薬またはデバイス(例えば、試薬、緩衝剤、チュービング、指示試薬、マニピュレーターなど)をさらに任意に含むことができる。
Claims (30)
- 細胞に薬剤を送達するためのデバイスであって、前記デバイスは、光学的放射に暴露されたときに加熱する材料をコートしている薄膜をその上に蒸着している多孔質ポリマー膜を備え、前記薄膜コーティングは、前記多孔質ポリマー膜を備える孔の内側に実質的に蒸着され、前記多孔質ポリマー膜の表面には前記コーティングがない、デバイス。
- 前記薄膜の蒸着の前に、前記多孔質ポリマー膜の平均細孔径が100nmから3μmまでの範囲である、請求項1に記載のデバイス。
- 前記多孔質ポリマー膜が、ナイロン若しくはナイロンメッシュ、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリエステル、発泡ポリテトラフルオロエチレン(ePTFE)、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)、発泡ポリエーテルエーテルケトン(ePEEK)、ポリエチレン(PE)、ポリプロピレン(PP)、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)、エチルビニルアセテート(EVA)、熱可塑性ポリウレタン(TPU)及びポリエーテルスルホン(PES)から成る群から選択される膜材料を含む、請求項1または2に記載のデバイス。
- 前記薄膜が、金、銀、チタン(Ti)、TiN、TiCn、及びTiAlNからなる群より選択される材料を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記薄膜がチタンを含む、請求項4に記載のデバイス。
- 前記薄膜の厚みが、10nmから1μmまでの範囲である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記多孔質ポリマー膜が多孔質アルミナ(Al2O3)構造を備えるか、または、前記多孔質ポリマー膜がポリエステル膜を備える、請求項1〜6のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記多孔質ポリマー膜が複数の細胞と接触されるか、または複数の細胞と隣接して並置される、請求項1〜7のいずれか1項に記載のデバイス。
- 細胞に薬剤を送達するためのデバイスであって、前記デバイスは、第1の表面及び前記第1の表面の反対側の第2の表面及び微小開口部のアレイを備える硬質基材であって、ここで、前記微小開口部は前記基材を通して前記第1の表面から前記第2の表面まで貫通しており、前記微小開口部は10μm未満の最大直径を有し、前記微小開口部の内側が、光学的放射に露出されたときに加熱する材料の薄膜コーティングでコートされており、前記基材の表面には前記薄膜がない、硬質基材を備え、ならびに
前記第2の表面に隣接して配置されている液体チャネルまたは液体リザーバーであって、前記チャネルまたはリザーバーは、前記微小開口部のアレイを備える複数の微小開口部と液体で連絡している、チャネルまたはリザーバーを備え、ならびに
前記第1の表面の面は、細胞を受容及び支持するように、ならびに/または細胞を含有するように配置されている、
デバイス。 - 前記微小開口部が5μm以下の最大直径を有するか、または、3μm以下の最大直径を有する、請求項9に記載のデバイス。
- 前記硬質基材がマイクロリソグラフィーウェハ並びに/またはシリコン、石英、硬質ポリマー、及びセラミックからなる群より選択される材料から形成される、請求項9または10に記載のデバイス。
- 前記第1の表面が、細胞を含有するように構成されたチャンバーの表面を備え、顕微鏡を用いて観察するために配置されている、請求項9〜11のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記微小開口部のアレイが、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、または少なくとも500の微小開口部を備える、請求項9〜12のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記微小開口部が、前記表面の2cm2以内、または1.5cm2以内、または1cm2以内、または0.5cm2以内、または0.1cm2以内の領域内にすべて配置されている、請求項13に記載のデバイス。
- 前記薄膜が、金、銀、チタン(Ti)、TiN、TiCn、及びTiAlNからなる群より選択される材料を備える、請求項9〜14のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記チャネルまたはリザーバーが加圧される、請求項9〜15のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記デバイスが倒立顕微鏡上のステージを置き換えるように構成されている、請求項9〜16のいずれか1項に記載のデバイス。
- 細胞が前記第1の表面に配置されている、および/または、
細胞が、前記基材における複数の微小開口部上またはそれに隣接して配置されている、請求項9〜17のいずれか1項に記載のデバイス。 - デバイスに統合されて液体チャネルまたは液体リザーバーの部分を形成し、前記微小開口部のアレイを通じて、試薬を能動的に送り出して細胞に送達させるように構成された、変形可能な膜ポンプを含み、前記第1の表面の面は細胞を受容及び支持するように配置されている、ならびに/または細胞を含有するように配置されている微小開口部が配置されている、請求項9〜18のいずれか一項に記載のデバイス。
- 細胞に薬剤を送達するために選択的に開口するためのシステムであって、前記システムは、
請求項1〜8のいずれか1項に記載のデバイス、及び/または
請求項9〜19のいずれか1項に記載のデバイス、及び
前記薄膜を加熱することが可能である光学的エネルギーの供給源
を備える、システム。 - 前記光学的エネルギーの供給源がレーザーまたは非コヒーレント光源である、請求項20に記載のシステム。
- 前記システムが、前記第1の表面または前記多孔質ポリマー膜の特定の領域に、光学的エネルギーを方向付けるためにレンズシステム、ミラーシステム、及び/またはマスク、及び/またはポジショニングシステムを備える、請求項20または21に記載のシステム。
- 前記システムが、光学的エネルギーを前記第1の表面または前記多孔質ポリマー膜に焦点を合わせるように構成されている対物レンズを備える、請求項20〜22のいずれか1項に記載のシステム。
- 請求項20〜23のいずれか1項に記載のシステムであって、前記システムは、前記光学的エネルギーの供給源による放射のパターン、前記光学的エネルギーの供給源によって放射される光パルスの発生のタイミング、前記光学的エネルギーの供給源によって放射されるパルスの発生の周波数、前記光学的エネルギーの供給源によって放射されるパルスの波長、前記光学的エネルギーの供給源によって放射されるパルスのエネルギー、及び前記光学的エネルギーの供給源によって放射されるパルスの照準または位置の少なくとも1つを調整するコントローラーを備える、システム。
- 細胞に試薬を送達する方法であって、前記方法は、請求項1〜8もしくは9〜20のいずれか1項に記載のデバイス、及び/または請求項20〜24のいずれか1項に記載のシステムにおいて細胞を供給することであって、前記細胞は、前記第1の表面に配置されるか、または前記多孔質ポリマー膜に接触されるかもしくはその近傍に並置されていること、
前記細胞を前記試薬と接触させること、ならびに
前記表面または多孔質ポリマー膜の領域を光学的放射に露出し、それによって、前記薄膜の加熱を誘導し、ここで、前記加熱は、前記試薬のこれらの細胞への送達を生じる加熱領域中またはその近傍で細胞の膜において開口を導入する泡を形成すること
を備える、方法。 - 細胞の周囲を取り囲む培養培地中に前記試薬を供給することによって、前記細胞が前記試薬と接触される、請求項25に記載の方法。
- 細胞が前記多孔質ポリマー膜の上端に配置されるかまたはそこで増殖され、かつ前記細胞またはその近傍の前記膜の表面が加熱されるか、または、
細胞が前記多孔質ポリマー膜の上端に配置されるかまたはそこで増殖され、かつ前記細胞の反対側の前記膜の表面が加熱されるか、または、
細胞が別個の基材上で配置または増殖され、前記多孔質ポリマー膜は試薬の送達のために前記細胞の上端に位置する、請求項25または26に記載の方法。 - 前記硬質基材を組み込んでいる、請求項9〜18のいずれか1項に記載のデバイスに、または請求項20〜24のいずれか1項に記載のシステムに細胞を供給することを備え、
前記表面に存在している1つ以上の開口部に前記試薬を供給することによって、前記細胞が前記試薬と接触されるか、または、
前記微小開口部と液体で連絡されているチャンバーまたはチャネルに前記試薬を供給することによって、前記細胞が前記試薬と接触される、請求項25に記載の方法。 - 前記表面の領域を、レーザーパルスまたは非コヒーレント光源に露出することを備える、請求項25〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試薬が、核酸、染色体、タンパク質、標識、オルガネラ、及び小有機分子からなる群より選択される、請求項25〜28のいずれか1項に記載の方法。
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