KR102108023B1

KR102108023B1 - 이작용성 나노자임 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102108023B1
Application number: KR1020180116082A
Authority: KR
Inventors: 최원용; 장팽
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2020-05-07
Also published as: WO2020067647A1; KR20200036452A

Abstract

본 발명은 글루코스 산화효소 및 퍼옥시다제(peroxidase) 활성을 나타내는 이작용성 조성물 및 이의 제조방법, 상기 이작용성 조성물을 포함하는 미세유체 장치 및 글루코스 검출 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 이작용성 조성물은 나노자임(nanozyme) 형태일 수 있다.

Description

이작용성 나노자임 및 이의 용도{Bifunctional nanozyme and use thereof}

천연 효소는 높은 기질 특이성 및 촉매 활성을 가지고 온화한 반응 조건하에서 생물체의 생물학적 과정을 매개한다. 대게 특정한 반응에 대하여만 촉매 작용을 하므로 부산물의 생성이 적으며, 반응되지 않는 성분은 변환 없이 배출되고, 화학적 약품을 사용하지 않기 때문에 환경오염이 발생되지 않는 이점을 가지고 있다. 그러나, 이러한 천연 효소는 생산 비용이 높아 생산단가 절감이 절대적으로 요구되고 있으며, 또한 천연 효소는 안정성이 약하기 때문에 반복 사용이 곤란하여 이러한 문제 해결에 대한 요구가 계속되고 있다.

또한, 천연 효소 기반의 글루코스 검출은 대체로 우수한 선택성을 나타내고 있으나, 효소의 본질적 특성에 기인한 불안정성 및 극소량 검출에 있어서의 민감도에 한계를 나타내고 있어, 전기화학 촉매적 효율의 증가 등을 통한 민감도 향상을 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.

한국공개특허 제10-2018-0049602호 한국공개특허 제10-2014-0106199호

본 발명의 목적은 알칼리화 변형, 칼륨화 변형 또는 알칼리화 및 칼륨화 변형된 탄소 질화물(carbon nitride, C₃N₄)을 포함하고, 글루코스 산화효소 및 퍼옥시다제(peroxidase) 활성을 나타내는 이작용성 조성물 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 이작용성 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 알칼리화 및 칼륨화 변형된 탄소 질화물(carbon nitride, C₃N₄)을 포함하는 이작용성 조성물로 코팅된 유로를 포함하는 미세유체 장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 알칼리화 및 칼륨화 변형된 탄소 질화물(carbon nitride, C₃N₄)을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 글루코스의 검출방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 알칼리화 변형, 칼륨화 변형 또는 알칼리화 및 칼륨화 변형된 탄소 질화물(carbon nitride, C₃N₄)을 포함하고, 글루코스 산화효소 및 퍼옥시다제(peroxidase) 활성을 나타내는 이작용성 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 이작용성 조성물은 나노자임(nanozyme) 형태일 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 알칼리화 변형은 탄소 질화물 및 수산화칼륨의 반응을 통해 이루어진 것이고, 상기 칼륨화 변형은 탄소 질화물 및 염화칼륨의 반응을 통해 이루어진 것이고, 상기 알칼리화 및 칼륨화 변형은 탄소 질화물과 수산화칼륨 및 염화칼륨의 반응을 통해 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 탄소 질화물은 흑연질(graphitic )인 것일 수 있다.

본 발명에서, '글루코스 산화효소(glucose oxidase; GOx)'는 2 분자의 플라빈(flavin)을 포함하는 볼모양의 당단백으로서 글루코스를 산소와 반응시켜 산화시키는 촉매효소이다.

본 발명에서, '퍼옥시다제(peroxidase)'란 과산화수소(H₂O₂)가 기질로부터 수소를 제거하는 반응인 탈수소반응(dehydrogenation)을 일으킬 때 촉매 역할을 하는 효소로서, 과산화수소는 높은 활성산소를 갖지만 상대적으로 반응성이 낮기 때문에 퍼옥시다제와 같은 촉매의 존재 하에서 산화제로서의 역할을 원활히 수행할 수 있다.

본 발명에서, '이작용성(bifunctional)'이란, 하나의 조성물이 두 가지의 기능을 동시에 발휘하는 것을 말하며, 구체적으로 2 개의 효소 역할을 동시에 수행할 수 있음을 말한다. 더욱 구체적으로는 본 발명의 이작용성 조성물은 상기 글루코스 산화효소 및 퍼옥시다제의 기능을 모두 수행할 수 있는 것으로 볼 수 있으며, 이러한 이작용성 기능 수행에 있어 효소, 나노자임 형태일 수 있으나 상기와 같은 이작용성 기능을 수행할 수 있는 형태라면 제한없이 적용될 수 있다.

태양광에 의한 과산화수소 생성 (총 반응식 1)의 이상적인 원자 효율은 효율적인 물 산화 (식 2)와 산소의 선택적 두 전자 환원 (식 3)을 결합함으로써 최대 100 %가 될 수 있다. 그러나 과산화수소의 광촉매 생산은 수증기 산화(식 2)가 비효율적이기 때문에 알코올을 전자공여체로 사용하는 연구가 이루어져 왔다.

본 발명에서는 알코올 대신 글루코스를 전자 공여체로 사용하였으며, 가시광선 하에서 글루코스 산화효소의 역할을 모방한 광효소(photoenzyme)으로서 탄소 질화물(carbon nitride, C₃N₄)을 사용하였으며, 이를 CN이라 명명하고, 이를 알칼리화 변형(ACN으로 명명), 칼륨화 변형(KCN으로 명명) 또는 알칼리화 및 칼륨화 변형(AKCN으로 명명)을 한 이작용성 나노자임 광촉매를 개발하였다.

또한, 상기 변형 이작용성 나노자임 광촉매가 현저히 증가된 수준의 과산화수소 생성량을 나타내는 것을 확인하였으며(도 3), 글루코스에 대해 높은 선택성을 가지며 글루코스 산화 효울이 증가된 것을 확인하였다(도 5).

본 발명의 다른 일 측면은 탄소 질화물을 알칼리화 변형, 칼륨화 변형 또는 알칼리화 및 칼륨화 변형하는 단계를 포함하는, 글루코스 산화효소 및 퍼옥시다제(peroxidase) 활성을 나타내는 이작용성 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 이작용성 조성물은 나노자임 형태일 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 알칼리화 변형은 탄소 질화물과 수산화칼륨을 반응시키는 것이고, 상기 칼륨화 변형은 탄소 질화물과 염화칼륨을 반응시키는 것이고, 상기 알칼리화 및 칼륨화 변형은 탄소 질화물과 수산화칼륨 및 염화칼륨을 반응시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 탄소 질화물은 흑연질(graphitic )인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 알칼리화 및 칼륨화 변형된 탄소 질화물(carbon nitride, C₃N₄)을 포함하는 이작용성 조성물로 코팅된 유로를 포함하는 미세유체 장치에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 상기 이작용성 조성물은 글루코스 산화효소 및 퍼옥시다제(peroxidase) 활성을 나타내는 것일 수 있으며, 나노자임 형태인 것일 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 알칼리화 및 칼륨화 변형은 탄소 질화물과 수산화칼륨 및 염화칼륨을 반응시키는 것일 수 있다.

또한, 상기 미세유체 장치는 글루코스를 검출하기 위한 것일 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 알칼리화 및 칼륨화 변형된 탄소 질화물(AKCN)을 유로에 코팅한 미세유체 장치 내에서 글루코스 및 과산화수소의 생성 사이의 상관 관계를 확인하였으며, 글루코스 산화효소- 퍼옥시다제 결합 효소 시스템과 유사하게 상기 장치 내에서 효소 캐스캐이드 반응을 통해 높은 민감도를 가지고 글루코스를 검출할 수 있음을 확인하였다(도 7). 특히 상기 미세유체 장치는 혈액을 모니터링하여 건강한 사람(3 ~ 8 mM)과 당뇨병 환자(9 ~ 40 mM)를 구별하기에 충분히 민감함이 입증되었다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 알칼리화 및 칼륨화 변형된 탄소 질화물(carbon nitride, C₃N₄)을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 글루코스의 검출방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 알칼리화 및 칼륨화 변형된 탄소 질화물은 나노자임 형태로서 글루코스 산화효소 및 퍼옥시다제 활성을 나타내는 이작용성인 것일 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 알칼리화 및 칼륨화 변형된 탄소 질화물의 글루코스 산화효소 및 퍼옥시다제 이중 활성이 매우 우수하며, 소량의 글루코스의 검출이 가능함을 확인하였는 바, 상기 알칼리화 및 칼륨화 변형된 탄소 질화물을 시료와 결합하여 시료 내에 포함된 글루코스를 검출할 수 있다. 특히, 상기 글루코스 검출에 대한 검출한계는 0.8 mM 로서, 민감도가 매우 우수하여 현장 진단(point-of-care) 또는 임상적인 용도로 상기 글루코스 검출방법이 활용될 수 있다.

본 발명의 글루코스 산화효소 및 퍼옥시다제(peroxidase) 활성을 나타내는 이작용성 조성물은 글루코스 산화효소 및 퍼옥시다제 활성을 나타내는 이작용성 생체모방효소로서, 단백질 효소에 비해 주위 환경에 높은 안정성을 나타내며, 글루코스에 대한 높은 민감도로 인하여 글루코스의 검출에 효과적으로 활용될 수 있다.

도 1은 캐스캐이드 반응에서 글루코스 검출 모델의 모식도를 나타낸 것이다(a. 글루코스 산화효소 및 호스래디쉬 퍼옥시다제를 이용한 글루코스의 비색검출; b. 합성 이작용성 나노자임을 이용한 글루코스 검출)
도 2는 본 발명에서 제조된 이작용성 나노자임의 특성을 확인한 결과를 나타내는 것이다(a. XRD 패턴결과, b. FTIR 스펙트럼; c. CN, ACN, KCN 및 AKCN의 Cl 2p, K2p, C1s 및 N1s XPS 스펙트럼; d. AKCN의 원자분포 맵핑 TEM 이미지(C (d1), N (d2), K (d3) and Cl (d4)).
도 3은 변형된 CN(ACN, KCN 및 AKCN)의 광촉매 과산화수소 생성 특성을 나타낸 것이다(a. 과산화수소 생성에서의 알코올 산화 반응을 동반하는 광촉매 반응 모식도; b. pH 3에서의 시간에 따른 과산화수소 광생성량; c. 파장에 따른 CN 및 AKCN의 광활성 및 AQY; d. 1 시간 광조사 동안 CN 및 변형된 CN들의 과산화수소 광생성 시의 pH 영향 측정 결과; e. 0.12 V의 연속적인 산소 퍼징과 함께 pH 13의 수산화칼륨 용액에서의 RDE 측정을 통한 Koutecky-Levich 플롯)
도 4는 CN, ACN, KCN 및 AKCN의 광전기화학적 특성을 확인한 결과를 나타낸 것이다(a. 일시적 광전류 반응 측정 결과; b. 전기화학적 임피던스 스펙트럼 결과(Electrochemical impedance spectra (EIS)); c. 시간 변화에 따른 광전류 측정 결과; d. 일시적 개방 회로 전압 감쇠(OCVD) 측정 결과).
도 5는 과산화수소 생성에 동반된 글루코스의 광촉매 산화 반응을 나타낸 것이다(a. AKCN의 글루코스 산화효소 유사 반응의 모식도; b. 글루코스 농도에 따른 과산화 수소 생성량; c. 0.1 M 글루코스에서 아르곤가스, 일반 공기, 산소가스 하에서의 AKCN의 과산화수소 생성량 및 0.1 M 글루코스, 과당, 유당 및 맥아당 하에서의 AKCN의 과산화수소 생성량).
도 6은 어둠 속에서 AKCN의 퍼옥시다제의 동역학을 나타낸 것이다(a. 퍼옥시다제 유사반응 모식도; b. 과산화수소 농도에 따른 AKCN의 반응률; c. TMB 농도에 따른 AKCN의 반응률)
도 7은 글루코스 검출을 위한 글루코스 산화효소 및 퍼옥시다제로서 작용하는 AKCN의 효소 캐스캐이드 반응을 나타낸 것이다(a. 배치모드에서의 캐스캐이드 반응 모식도; b. 회분식 반응기(batch reactor)에서의 글루코스 농도에 따른 농도-반응 커브 및 색상 변화; c. 미세유치 장치 및 실제 장치에서의 캐스캐이드 반응 모식도; d. 미세유체 채널에서의 AKCN의 TMB 기질 산화; e. 글루코스 농도에 따른 TMB 산화의 선형 상관관계).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

모든 화학 물질은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 또는 알파-아에사(Alfa-Aesar)에서 최고 순도로 구입하여 추가 처리 없이 사용했다. 멜라민, 알칼리 염화물, 칼륨 염화물, 및 3,3 ', 5,5 테트라 메틸 벤지딘 디 하이드로 클로라이드(TMB)를 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용했다. 준세이(Junsei)에서 과산화수소(35 wt %)를 구입하였으며, Milli-Q 물을 모든 실험에 사용하였다.

실시예 1. 이작용성 나노자임의 설계 및 특성 규명

1-1. 광촉매 제조

「Li, Y. et al. Constructing solid-gas-interfacial Fenton reaction over alkalinized-C₃N₄ photocatalyst to achieve apparent quantum yield of 49% at 420 nm. J. Am. Chem . Soc . 138, 13289-13297, (2016)」 등에서 보고된 방법에 따라 g-C₃N₄ (CN)를 합성하였다. 구체적으로, 1.5 g의 멜라민을 마개가 달린 도자기 컵에 넣고 2.2 ℃/분의 상승 속도로 4 시간 동안 550 ℃에서 하소시켰다. 가열 후, 생성된 생성물을 부드럽게 연마하고 수용액 (1 g/L)으로서 3 시간 동안 초음파 처리 하였다. 그 후 분말을 여과하고, 세척하고, 추가 시험을 위해 80 ℃에서 건조시켰다.

알칼리화 된 g-C₃N₄(ACN)은 CN과 유사한 방법으로 합성하였으며, 다만 수산화칼륨 0.3, 1.0, 2.0, 3.0 및 4.0 mmol을 각각 멜라민과 혼합하고 소성 과정 전에 함께 분쇄하였다. 또한, 알칼리 금속으로부터의 효과를 더 비교하기 위해 수산화칼륨 대신에 2.0 mmol의 수산화 나트륨 또는 2.0 mL의 수산화 바륨을 각각 멜라민과 혼합하였다.

칼륨과 결합된 g-C₃N₄(KCN) 역시 CN과 유사한 방법으로 합성하였으며, 다만 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1, 0.15 및 0.2 mol의 염화칼륨을 각각 멜라민과 혼합하고 소성 전에 함께 분쇄하였다.

알칼리 금속과의 효과를 비교하기 위해, 알칼리 염화물(염화 암모늄, 염화나트륨 및 염화 바륨) 0.08 mol 또는 할로겐화 칼륨(불화 칼륨, 브롬화 칼륨, 요오드화 칼륨 및 황산 칼륨) 0.08 mol을 염화칼륨 대신 멜라민과 혼합하였다.

최적화 된 g-C₃N₄(AKCN)을 CN과 유사한 방법으로 합성하였으며, 적절한 양의 수산화칼륨(2.0 mmol)과 염화칼륨(0.08 mol)을 멜라민과 혼합하고 소성 과정 전에 함께 분쇄하였다.

상기와 같이 제조된 본 발명의 이작용성 나노자임 광촉매는 각각 ACN, KCN 및 AKCN으로 명명되었으며, 변형되지 않은 순수 CN은 비교예로 사용되었다.

1-2. 광촉매의 특성 분석

구조는 ZnSe 결정에 Cu Kα 라인(1253.6eV) 및 ATR-FTIR 분광기(Thermo Scientific Nicolet iS50 FT-IR / ATR)를 사용하는 X'Celerator 검출기가 있는 PANalytical X'Pert 회절계로 특성을 분석하였다. 적분구가 부착된 Shimadzu UV-2600를 이용하여 확산 반사 UV/가시광선 흡수 스펙트럼(DR-UVS)을 측정하였으며, 측정 전 BaSO₄를 기준 물질로 사용하였다. 전기 영동 광산란 분광 과염소산(HClO₄) 및 수산화칼륨으로 pH를 변화시키면서 각 샘플의 수성 현탁액(10 mM NaNO3)의 제타 전위를 광도계 (ELS 8000, Otsuka)를 이용하여 측정하였다. 표면 원자성은 KBSI 부산 센터에서 단색 Al Kα (h

= 1486.6 eV)를 사용하는 X 선 광원을 갖춘 Theta Probe AR-XPS System(Thermo Fisher Scientific, 영국)의 X 선 광전자 분광기 (XPS)로 분석하였으며, 시료의 투과 전자 현미경(TEM)과 전자 에너지 손실 스펙트럼(EELS) 맵핑은 NINT(포항, 한국)의 Cs 보정 JEM-2200F 현미경(JEOL)을 이용하여 수행하였다.

도 2a에 나타난 바와 같이, 생성된 AKCN은 XRD 스펙트럼에서 CN의 주요 상을 나타내었다. 도 2a 내의 (002) 피크가 (100) 피크의 소멸과 함께 이동한다는 사실은 층간 및 평면 내에서의 K 상호 작용의 존재를 나타내는 것이다. 또한, 도 2b에 나타난 바와 같이, FTIR 스펙트럼에서 1000, 1158 및 2152 cm-1에서 추가적인 밴드가 나타남을 확인함으로써 AKCN의 표면에 수산기(-C-OH)가 결합되었음을 확인하였으며, ACN, KCN 및 AKCN 시료에서 2180 cm-1 부근의 새로운 밴드가 강하게 나타난 것은 말단 -C-NH₂ 가 시아노 그룹(-C≡N)으로 변형된 것으로 볼 수 있다. AKCN에서의 K와 Cl의 결합은 XPS 스펙트럼에서 명확하게 나타난다(도 3c).

또한, AKCN 구조 내에서의 K 및 Cl 원소의 분포는 C 및 N 백본(backbone)과 함께 EDS 맵핑 결과로 나타났다(도 2d).

상기와 같이 나타난 특성을 통해 CN 프레임에 K 및/또는 Cl의 도입이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였다.

실시예 2. 과산화수소의 광생성 확인

2-1. 과산화수소 광생성 측정

산소의 과산화수소로의 환원 전환율을 측정하기 위해, 탈이온수(또는 0.1M 완충 용액)와 에탄올(10 vol%)의 혼합 용액에 0.5 g/L의 촉매를 분산시켰다. 상기 용액을 10 분 동안 초음파 처리하고, pH를 과염소산 또는 수산화칼륨표준 용액으로 조정하였다. 이후 30 분 동안 산소 퍼징(purging)을 통해 용액을 포화시킨 후 광조사를 시작하였다. 광 반응 테스트는 연속 산소 퍼징 및 10-cm IR 워터 필터와 롱 패스 컷오프 필터 (=≥= 420 nm)로 필터링 된 300 W Xe 아크 램프 (Oriel)의 조사 하에서 수행하였다. 과산화수소의 농도는 N,N-디에틸-1,4-페닐렌-디아민 설페이트(DPD, 97 %, Aldrich) 시약을 사용하는 비색법을 사용하여 측정하였다. 각 시간에 용액의 분취액을 수집하고 90 초 동안 격렬히 교반하여 인산염 완충액, DPD 용액 및 과산화효소(POD, 호스래디쉬, Aldrich)와 혼합한 후 UV/가시 분광 광도계로 흡광도를 551 nm에서 측정하였다(Libra S22, Biochrom). 자세한 방법은 「Moon, G.-h. et al. Eco-Friendly photochemical production of H₂O₂ through O₂ reduction over carbon nitride frameworks incorporated with multiple heteroelements. ACS Catal. 7, 2886-2895, (2017).」에 따라 수행하였다. 명백한 양자수율(AQY)은 단색화 기(Newport, Oriel 77250)로 입사 파장을 조정한 방정식 Φ_AQY (%) = (생성된 H₂O₂ 분자 수) Х 2 / (입사 광자 수) Х 100을 이용하여 계산하였으며, 광 강도는 저전력 검출기(Newport, 818-UV)로 측정하였다.

상기와 같은 방법을 이용하여 CN, ACN, KCN 및 AKCN의 에탄올 존재 하에서의 글루코스 산화와 결합된 과산화수소 생성량을 확인하였다. 상기 반응의 모식도는 도 3a에 나타난 바와 같다. 도 3b에 나타난 바와 같이, 변형되지 않은 순수 CN은 3 시간 동안 0.14 mM의 과산화수소 생성량을 나타내었으나, ACN 및 KCN은 각각 0.85 mM 및 1.58 mM 의 과산화수소 생성량을 나타내어 CN에 비해 현저히 증가된 과산화수소 생성 효과를 나타냄을 확인하였다. 나아가, AKCN은 동일 시간 동안 순수 CN, ACN 및 KCN 에 비해 각각 2배, 4배 및 24 배 증가된 과산화수소 생성량을 나타내었다. 특히 상기와 같이 높은 활동성을 나타내는 AKCN의 S_BET 가 가장 작은 것을 확인하였는 바(표 1), 이는 AKCN 광촉매의 활성이 표면적에 영향을 받은 것이 아님을 나타내는 것이다.

상기와 같은 결과로부터 본 발명에서 제조한 나노자임들(ACN, KCN, AKCN)의 과산화수소 광생성 효과가 현저히 우수함을 확인하였다.

샘플	시약의 몰비	S _BET (m²/g)	V _p (cm³/g)	E _g (eV)
CN	멜라민	7.6	0.05	2.79
ACN	멜라민+KOH (1:0.002)	4.8	0.03	2.77
KCN	멜라민+KCl (1:0.08)	3.0	0.02	2.74
AKCN	멜라민+KOH+KCl (1:0.002:0.08)	2.2	0.01	2.70

또한, 파장에 따른 활성을 확인한 결과, AKCN의 광활성이 흡수 스펙트럼의 프로파일과 일치하는 반면, 비교예 CN의 광활성은 동일한 파장 범위에서의 가시광선 흡수에도 불구하고 무시될 수 있는 수준임을 확인하였다(도 3c). 특히, 도 3c에 나타난 바와 같이 AKCN은 350 내지 420 nm 범위의 파장에서 100 %에 가까운 명백한 양자 수율(AQY, Apparent quantum yield)을 보였으며, 450 nm에서는 56 %의 AQY를 나타내었다. 상기와 같은 수치는 가시광선 영역에서 보고된 과산화수소 생성의 AQY 중 가장 높은 수치에 해당한다.

또한, 도 3d에 나타난 바와 같이 pH 변화에도 불구하고 모든 변형 CN(ACN, KCN 및 AKCN)의 과산화수소 광생성량이 변형되지 않은 순수 CN에 비해 현저히 우수함을 확인하였다. 그 중에서도 AKCN은 pH 3-11의 범위 전체에서 일관되게 가장 많은 양의 과산화수소를 생성시켰다. 특히, AKCN은 pH 7의 중성 인산 완충 용액 하에서 가장 높은 활성을 나타내었으며, 이는 통상의 글루코스 산화효소 작용의 최적 조건과 일치한다.

또한, Koutecky-Levich 플롯의 기울기 값으로부터 산소로 이동 된 전자 (n)의 수를 추정 할 수 있는 회전 디스크 전극(RDE) 분석에 의해 AKCN 상의 산소로의 전자 이동의 특성을 조사하였다. 그 결과, 도 3e에 나타난 바와 같이 CN 및 AKCN 모두 기울기 n 값이 2에 가까운 것을 확인하였으며, 이는 산소가 2 전자 이동에 의해서만 환원됨을 나타내는 것이다.

2-2. 과산화수소 광생성 전기화학 분석

스핀 코팅을 통해 ITO 유리에 코팅된 촉매를 이용하여 과도 광전류 및 전기 화학 임피던스 분광법을 수행하였으며, Potentiostat(Gamry, eference 600)에서 상대 전극으로 백금(Pt) 와이어, 참조 전극으로 은(Ag)/염화은(AgCl), 작동 전극으로 ITO에 코팅된 촉매의 세 가지 전극 시스템으로 측정하였다. 0.2 M 황산나트륨(Na₂SO₄)을 전해질로 사용하고 연속 아르곤(Ar) 퍼지(purging)하에 pH를 3으로 조정하였다. 슬러리 광전류 측정은 작업 전극, 카운터 전극 및 참조 전극으로서 각각 백금 와이어, 흑연로드 및 은(Ag)/염화은(AgCl)으로 구성된 세 전극 시스템에서 수행되었다. 1 g/L 의 광촉매를 은/염화은 대비 0.7V의 바이어스로 pH 1.7에서 전해질인 1mM 과염소산나트륨(NaClO₄) 및 전자셔틀인 1mM Fe³ ⁺ 로 이루어진 수용액에 현탁시켰다. 산화환원반응(ORR) 촉매의 전기 촉매적 특성은 산소가 퍼징된 0.1M 수산화칼륨 용액에서 선형 스위프 볼타메트리(LSV) 방법(Gamry Reference 600 potentiostat)을 이용하여 측정하였다. 촉매 슬러리는 나피온(Nafion^®) 이오노머를 함유한 물 및 2-프로판올(부피비 = 1 : 1)의 공용매에 촉매를 분산시킴으로써 제조하였다. Nafion^® 이오노머를 바인더로 사용하였고 Nafion^® 이오노머와 촉매의 중량비는 0.5가 되도록 하였다. 상기와 같이 제조된 촉매 슬러리를 유리상 탄소 디스크 전극(기하 면적: 0.19625 cm²) 상에 로딩하였다. 면적 당 촉매 담지량은 815 μg/cm²이다. LSV는 10 mV/s의 스캔 속도와 음극 방향으로 수행되었다. 포화 염화칼륨 중 은/염화은 전극 및 백금 와이어를 기준 전극 및 대극으로 각각 사용 하였다. 회전 속도는 400 rpm에서 1600 rpm으로 다양하게 하였다. 전자 이동 수는 Koutecky-Levich 방정식을 기반으로 구성된 Koutecky-Levich 플롯의 기울기를 통해 확인하였다.

j : 전류밀도 (mA/cm²)

j _d : 확산제한 전류밀도(mA/cm²)

j _k : 운동 전류밀도(mA/cm²)

w: 디스크 전극의 각속도(rad/s)

n : 전자전달 수(n)

F : 패러데이 상수(96485 C/mol)

C ₀ : 0.1 M 수산화칼륨에서의 용해산소 농도 (1.2 * 10^- ³ mol/L)

D ₀ : 수산화칼륨에서의 용해산소 확산계수 (1.9 * 10^-5 cm/s)

v : 0.1 M 수산화칼륨의 동점도(0.01 cm²/s^-1)

과도기의 개방회로 전압감소(OCVD, open-circuit voltage decay) 측정은 쵸핑(chopping)한 광조사 하에서 수행하였다. 광생성된 캐리어의 평균 수명(nn)은 다음의 방정식에 따라 OCVD로부터 얻어졌다.

여기서 k _B 는 볼츠만 상수, T는 켈빈 온도, k _B T는 열에너지, q는 전자의 부호없는 전하, d_Voc/d_t는 개방 회로 과도 전압의 미분 값이다.

광 흡수와 관련하여, KCN, ACN 및 AKCN의 흡수 가장자리는 변형되지 않은 CN과 비교해 점차적으로 적색 변위를 나타내며, 이는 상기 표 1에 나타난 바와 같이 Taut 플롯 결정에 따라 2.79 eV에서 2.70 eV 로의 밴드 갭 이동에 해당된다.

광생성 전기화학 특성을 확인하기 위하여 준비된 전극을 사용하여 쵸핑된 광전류 반응(chopped photocurrent response) 및 전기 화학적 임피던스 스펙트럼 측정을 수행하였다. 그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, CN에 비해 변형된 형태인 ACN, KCN 및 AKCN가 높은 광전류를 나타내었다. 특히, AKCN은 모든 CN 전극 중 가장 높은 광전류를 나타내었으며, 이는 전하 분리에 있어서 표면 알칼리화 및 K 와의 결합에 따른 시너지 효과에 의한 것이다.

또한, 도 4b에 나타난 바와 같이 나이퀴스트(Nyquist) 플롯 분석에 있어서도 변형되지 않은 CN의 반경이 가장 크게 나타났으며, ACN, KCN 및 AKCN의 반경이 감소되었음을 확인하였다. 특히, AKCN의 반경이 가장 작은 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 도 4a의 AKCN의 광전류가 가장 높은 것과 일치하는 것이다.

도 4c에 나타난 바와 같이, 시간 변화에 따른 광전류 측정에 있어서도 변형되지 않은 CN에 비해 ACN, KCN 및 AKCN의 광전류가 높게 나타났으며, 특히 AKCN의 광전류가 현저히 높게 나타났다.

아울러, 일시적 개방 회로 전압 감쇠(OCVD, open-circuit voltage decay) 측정에서 AKCN은 변형되지 않은 CN 보다 더 높은 개방 회로 전압과 느린 광 전압 감쇠를 나타냈으며(도 4d), 이는 AKCN에서 전하 운반체의 수명이 길어짐에 따라 방해 받음을 나타내는 것이다.

실시예 3. 글루코스 산화 확인

글루코오스 산화 반응은 0.01, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1 및 2 M의 글루코스 용액과 4 mg 인산염 완충액 중 2 mg의 광촉매를 함유하는 석영 큐벳 0.1 M, pH 7)에서 수행되도록 하였다. 광반응 시험은 30 분의 조사로 연속적으로 산소 퍼징하여 수행하였다. 여과 후, 광생성 글루코스 산화 검출을 위해 과산화수소의 비색을 분석하였다. 추가적으로 선택성의 비교를 위해, 글루코스를 0.1 M 과당, 유당 및 맥아당으로 대체하여 동일한 광반응을 수행하였다.

AKCN은 중성 인산 버퍼 용액(0.1 M, pH 7)에서 과산화수소 생성에 대해 우수한 광활성을 나타내었으며, 이는 글루코스 산화효소(GOx)의 통상적인 작동 조건과 일치한다. 전자 및 양성자 공여체로서의 알코올이 글루코스로 대체되면 AKCN의 GOx와 유사한 활성은 글루코스 산화로부터 과산화수소 및 글루콘산(gluconic acid )을 생성하기 위해 가시광선 하에서 나타날 수 있다(도 5a).

이와 관련하여, AKCN이 글루코스의 농도가 0.1 M이 될 때까지 비례하여 in-situ 과산화수소를 광생성 시키는 것을 확인하여 AKCN이 광촉매 글루코스 산화효소와 유사하게 행동하는 것을 확인하였다(도 5b).

또한, AKCN의 0.1M 글루코스 하에서 광촉매적 과산화수소 생성은 아르곤 가스에서는 매우 적었으며, 공기 및 산소 포화 상태에서는 상대적으로 높게 나타나고, 특히 포화 산소 하에서 현저히 높게 나타남을 확인하였다(도 5c). 이는 과산화수소의 생성은 글루코스의 광산화에서 결합되는 산소의 2 전자 환원에 의해 기인한 것임을 나타내는 것이다.

또한, 0.1 M 과당, 유당 및 맥아당 하에서는 글루코스에 비해 과산화수소의 생성량이 현저히 적게 나타났는 바, AKCN이 글루코스에 대해 높은 선택성을 나타냄을 확인하였다(도 5c)

실시예 4. 퍼옥시다제 유사 활성 확인

전형적인 과산화 반응에서, 3 mM 과산화수소 및 0.5 mg/mL 광효소를 함유하는 3.8 mL 아세테이트 완충액(0.1 M, pH 4)에 200 μL의 기질(TMB, 4 mM)을 첨가하였다. 25 ℃에서 10 분간 인큐베이션 하는 동안, 여과 후 652 nm에서의 흡광도를 모니터링함으로써 퍼옥시다제 유사 활성의 동역학을 측정하였다. 정상 상태에서의 동역학을 측정하기 위해 3 mM의 과산화수소 및 4 mM의 TMB를 별도로 사용하였다. 과산화수소의 비색 검출을 위해, 0.5 mg/mL의 광효소 및 과산화수소를 함유하는 3.8 mL 아세테이트 완충 용액(0.1 M, pH 4)에 4 mM TMB 기질 200 μL를 여러 농도로 첨가하였다. 어둠 속에서 10 분 동안 배양한 후, UV-Vis 분광법을 통해 652 nm에서 농도에 따라 달라지는 파란색을 기록하였다. 운동 파라미터는 Michaelis-Menten 방정식을 사용하여 계산하였다: V = V_max[S]/(K_m + [S]), 여기서 [S]는 기질의 농도이다.

도 6a의 모식도에 나타난 바와 같이 AKCN의 내재적 퍼옥시다제 유사 활성은 TMB의 발색 기질이 어두운 조건 하에서 확인하였다. 생성된 ox-TMB는 청색을 나타내었으며, 이로부터 (1) AKCN은 가시광선 하에서 과산화수소의 동시 생성으로 글루코스를 산화시키는 글루코스 산화효소를 모방하는 광효소의 역할을 하고,(2) AKCN은 발색 TMB를 산화시켜 암흑에서 청색을 유도하는 HRP를 모방하였음을 입증하였다.

AKCN의 퍼옥시다제 모방 활성은 과산화수소 및 TMB 기질의 시험 농도 범위에서 전형적인 Michaelis-Menten 모델에 따른 결과를 나타내었다(도 6b 및 도 6c). 과산화수소에 대한 AKCN (0.79)의 낮은 Km 값은 과산화수소에 대한 높은 결합 친화성을 나타내며 V_max의 최대 활성에 도달하는 데 필요한 과산화수소의 농도가 더 낮다는 것을 나타낸다. 대조적으로, TMB에 대한 AKCN의 Km 값은 TMB 산화와 과산화수소 감소 사이의 전하 이동의 조정을 통해 최대 활성을 달성하는 데 요구되는 높은 TMB 농도와 일치하여 HRP의 Km 값보다 현저히 높았다. 그래핀으로부터 과산화수소로의 전자 이동의 경우와 마찬가지로, 그래핀과 같은 구조를 갖는 AKCN은 또한 고유의 퍼옥시다제와 같은 활성을 위한 TMB (TMBOx / TMB 1.13 V)로부터 과산화수소(H₂O₂ / H₂O 1.776 V)로 근위 전자 전달을 용이하게 한다.

실시예 5. 효소 캐스캐이드 반응 확인

5-1. 효소 캐스캐이드 반응

석영 큐벳 내에서 광촉매 2mg을 포도당 농도가 다른 인산염 완충 용액 (0.1M, pH 7) 2mL에 넣었다. 연속 산소 퍼징을 20 분간 진행한 후, 4 mM의 TMB 200 ㎕ 및 아세테이트 완충액(0.1 M, pH 4.0) 1.8 ㎖를 상기 반응액에 첨가한 다음, 어두운 곳에서 10 분간 더 배양하였다. 최종 반응 용액을 여과 후 UV-Vis 분광법으로 기록하였다.

5-2. 미세유체 광반응기에서의 효소 캐스캐이드 반응

AKCN 나노자임을 그림자-마스크로부터 3-글리시독시프로필 트리메톡시실란(GLYMO) 브러시로 폴리(디메틸실록산)(PDMS) 벽에 고정시키고 마지막으로 압축 슬라이드 유리로 밀봉시켰다. 미세유체 장치는 실리카 섬유를 통해 광원 및 주사기-펌프 연결로 체계적으로 설치하였다. 분리된 챔버 내에서의 산화환원 결합 효소 모방을 위해, 칩은 필수 영역에서 광조사를 제어하도록 home-built 홀더에 위치시켰다. 반응 부피는 길이 30 mm, 단면으로부터 0.044 mm의 깊이 및 5 mm의 폭으로 구성되도록 하였다. 미세유체 광*?*반응기에서의 효소 캐스캐이드 반응은 상기 효소 캐스캐이드 반응과 동일한 조건으로 수행되도록 하였다. 글루코스의 다양한 농도를 포함하는 인산 완충용액(0.1 M, pH 7)을 입구에서 미세유체 채널로 펌핑하였다(12 μL 분^-1). 또한, 산소는 교차점에서 글루코스 용액과 혼합되도록 인접한 가스 입구로부터의 유동 채널로 연속적으로 펌핑하였다(12 μL/분). 산소 용액이 평행 반응 챔버 내로 유입됨에 따라, AKCN (0.25 g 챔버 ^- ¹)의 글루코스 산화 효소의 모방이 후방 조사하에서 나타났다. 글루코스의 실시간 검출을 위해, 광조사 없이 4 mM TMB 용액을 개별 챔버(0.25 g 챔버 ^-1, AKCN)의 하류 유입구로부터 펌핑하였다(12 μL 분^-1). 반응액을 유출구에서 유출시켜 비색법을 통해 ox-TMB 검출을 위해 수집하였다. TMB 주입이 없는 동일한 과정으로서, 누출된 용액 중의 과산화수소의 농도는 DPD 방법으로 측정하였다. 플로우 챔버 및 배치 시스템의 회전율 빈도(TOF)는 모든 샘플의 활성 사이트의 추정 뿐 아니라 각 지속 기간의 과산화수소 발생량을 기반으로 계산하였고, 모든 실험은 상온에서 수행하였다. vi 값은 방정식 [TMB] = vi Х t를 실험 데이터에 맞추는 최소 제곱에 의해 계산하였으며, k _obs 는 방정식 vi = k _obs Х [글루코스 농도]를 맞추어 계산하였다.

상기와 같은 글루코스 산화효소 및 퍼옥시다제 유사 활성에 기초하여 이작용성 AKCN의 효소 캐스캐이드 반응을 확인하였다. 연속적인 산소 퍼징을 하는 회분식 반응기에서 가시 광선 조사 (λ ≥ 420 nm) 하에서 20 분 동안 AKCN / 글루코스의 광촉매 작용을 통해 과산화수소가 생성되었으며, 광 스테이지에서 생성된 과산화수소는 다음 TMB가 AKCN에서 과산화수소에 의해 산화되는 암흑 스테이지에서 소비되었으며, 반응기에서 광 단계 이후 [글루코스]와 [과산화수소] 생성 사이의 상관 관계는 성공적으로 확인되었다.

TMB 주입 후 인-시츄에서 생성된 과산화수소는 AKCN의 퍼옥시다제 유사 활성에 의해 소비되면서 ox-TMB의 생성되며 청색을 나타내었다(도 7b). 글루코스 산화효소- 퍼옥시다제 결합 효소 시스템과 유사하게 캐스캐이드 효소 모방은 (1) AKCN / 글루코스 / hv와 과산화수소 및 (2) AKCN / H₂O₂ / TMB (어둠)의 인-시츄 생산 시스템의 결합에서 성공적으로 나타났다. 그 결과, 글루코스 농도가 0.01 M에서 1 M까지 증가함에 따라 ox-TMB (652 nm에서의 흡수에 의해 모니터링 됨)의 생성이 점차 증가하였고, 이는 0.01M < 혈액을 모니터하여 건강한 사람(3 ~ 8 mM)과 당뇨병 환자(9 ~ 40 mM)를 구별하기에 충분히 민감함을 확인하였다(도 7b).

상기와 같은 효소 모방 캐스캐이드 반응은 연속적인 유동 미세유체 반응기에서 물질 전달을 향상시킴으로써 보다 용이해질 수 있어 휴대용 실시간 모니터링 플랫폼으로 시스템을 소형화 할 수 있다. 이를 위해 슬라이드 글라스 위에 AKCN이 코팅된 유로(5 mm 폭, 높이 0.044 mm, 길이 30 mm)가 있는 PDMS 기판을 쌓아서 소량의 글루코스 검출을 위한 미세유체 장치를 제작하였다(도 7c).

캐스캐이드 반응은 30 mm 길이의 채널과 직렬로 연결된 2 개의 유동 채널을 따라 수행되었으며, 하나는 가시광선 조사 하에 AKCN이 코팅된 채널이고(글루코스 산화효소 유사 부분), 다른 하나는 상기 채널에서 발생된 과산화수소와 주입된 TMB 가 혼합되도록 하였다(HRP 유사 부분). 혼합된 글루코스-산소는 시린지 펌프(syringe-pump)에 의해 유동 채널로 옮겨지고, 채널 벽에 고정된 AKCN(챔버 당 0.25mg)이 가시광선 조사 하에서 과산화수소의 생성의 촉매로 작용하였다.

제 1 채널로부터의 유출 흐름은 AKCN의 후속적인 퍼옥시다제 유사반응을 위해 제 2 유동 채널로 연속적으로 공급된다(조사로부터 차폐됨). 또한, TMB는 제 2 유동 채널의 헤드에서 별도의 유입구를 통해 도입된다. 두 번째 유동 채널의 용액은 ox-TMB의 형성으로 인해 즉시 파란색으로 바뀌었고, 채널에서 유출된 유출물에 대해서는 652 nm에서 실시간으로 흡광도를 분석하였다. 초기 반응 속도(vi)는 시간의 함수로서 ox-TMB 흡광도의 플롯으로부터 계산하였다(도 7d).

도 7e에 나타난 바와 같이, 초기 반응 속도는 계산된 k _obs(1.7 Abs. s^-1 mM^-1)에서 글루코스 농도의 정량화를 가능하게 하는 [글루코스]와 선형으로 상관 관계가 있다. 상기 초기 반응 속도를 측정하여 광자 미세유체 캐스캐이드 반응(photonic microfluidic cascade reaction)을 기반으로 30 초 이내에 검량선으로부터 알려지지 않은 글루코스 농도를 검출하는데 사용할 수 있다(Abs = εcl, ε = 39000 L * mol^-1 * cm^-1, TMB).

민감한 미세유체 장치에서의 글루코스 검출한계는 약 0.8 M 정도로서, 1 mM 이상의 농도를 나타내는 임상적 글루코스의 측정이 가능하여, 임상에 적용할 수 있다. 미세유체 생체유사 촉매(microfluidic biomimetic catalysis)의 회전율(turnover) 빈도는 9.1 h^- ¹ 로서, 1.7 h^- ¹을 나타내는 배치 공정의 5.3 배로 높게 나타냈다. 이는 효율적인 물질전달 및 높은 표면 대비 부피 비율과 같은 마이크로 유체 반응기의 본질적 특성에 기인한 것이라 할 수 있다.

기존에 보고된 모든 이작용성 나노자임은 글루코스 검출에 수 시간이 필요하였지만, 본 발명 미세유체 장치에 사용된 AKCN 기반 나노자임은 훨씬 빠른 캐스캐이드 촉매 작용(약 30 초) 및 낮은 검출 한계(0.8 mM)를 나타낸다. 또한, 미세 유체 장치의 검출 한계는 배치 반응기의 검출 한계보다 훨씬 낮은 바, 본 발명의 나노자임-마이크로 유체 센서는 현장 진단(point-of-care)에 매우 바람직하다.

상기와 같이 본 발명의 미세유체 장치는 글루코스의 빠르고 쉬운 실시간 모니터를 위한 소형화 도구로서 생체 모방 캐스캐이드 촉매 반응에 활용될 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

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알칼리화 및 칼륨화 변형된 탄소 질화물(carbon nitride, C₃N₄)을 포함하고,
글루코스 산화효소 및 퍼옥시다제(peroxidase) 활성을 나타내는 이작용성 조성물로 코팅된 유로를 포함하는 미세유체 장치로서,
상기 미세유체 장치는 글루코스 검출용인 것인, 미세유체 장치.
삭제
제9항에 있어서, 상기 이작용성 조성물은 나노자임 형태인 것인, 미세유체 장치.
제9항에 있어서, 상기 알칼리화 및 칼륨화 변형은 탄소 질화물과 수산화칼륨 및 염화칼륨을 반응시키는 것인, 미세유체 장치.
삭제
알칼리화 및 칼륨화 변형된 탄소 질화물(carbon nitride, C₃N₄)을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 글루코스의 검출방법.