CN105420278A - 采用光致穿孔的方式制备负载有外源分子细胞的方法及制备该细胞用的基材及该细胞 - Google Patents

采用光致穿孔的方式制备负载有外源分子细胞的方法及制备该细胞用的基材及该细胞 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种采用光致穿孔的方式制备负载有外源分子细胞的方法及制备该细胞用的基材及该细胞，属于医疗器械改性领域和纳米材料领域，具体涉及一种在细胞培养基材（包括细胞培养板等可用于细胞培养的基材）表面修饰金纳米材料（包括金纳米粒子聚集体、金纳米棒、金纳米锥等）的试剂盒，利用近红外波段激光辅助，实现对其上培养细胞进行外源大分子传输的目的。该体系利用金纳米粒子在近红外波段大量吸收激光能量，用于对其上培养细胞膜通透性的提高；通过优化激光功率和照射时间，可以很好地维持细胞活性；该试剂盒具有简单直接、快速、高效的特点，可应用于不同细胞系进行不同种类的外源大分子传输。

Description

采用光致穿孔的方式制备负载有外源分子细胞的方法及制备该细胞用的基材及该细胞
技术领域
本发明属于医疗器械改性领域以及纳米材料领域，具体涉及一种在细胞培养基材（包括细胞培养板和其他可用于细胞培养的基材）表面修饰金纳米材料（包括金纳米粒子聚集体、金纳米棒、金纳米锥等）的试剂盒，利用近红外波段激光辅助，实现对其上培养细胞进行外源大分子传输的目的。该试剂盒具有简单直接、快速、高效的特点，并且可应用于不同细胞系进行外源大分子的传输。
背景技术
基因治疗和药物传输可以应用于对许多重大疾病的治疗中，包括癌症、神经退行性疾病、血液疾病和遗传疾病等。基因治疗和药物传输的关键在于能否有效地将外源治疗性分子（比如DNA、RNA、蛋白质、药物分子等）导入到目的细胞中。病毒载体虽然具有很高的传递效率，但安全性制约了其进一步的应用。目前，通常采用的手段是用阳离子脂质体或聚合物包裹治疗性大分子，通过胞吞将其传递到细胞中。然而，这种方法传递效率低，同时面临细胞毒性的问题，并且负载的大分子进入细胞后不能完全被载体释放进一步降低了其最终效率。
光致穿孔近年来受到广泛关注，其最简单的形式是用高强度的飞秒级激光脉冲照射单个细胞以提高细胞膜的通透性，但这种形式的效率很低。然而研究者发现，通过在细胞膜上吸附金纳米粒子不仅可以大大提高效率，并且可以减低所需的激光强度。这主要是因为吸附在细胞膜上的金纳米粒子在激光照射下可以产生很大的能量，这种能量可以用来提高细胞膜的通透性。此外，金纳米粒子具有优异的生物相容性和化学反应活性，这都为金纳米粒子在光致穿孔中的广泛应用奠定了基础。
在此专利中，我们研发了一种新型的基于金纳米材料的光致穿孔试剂盒，该试剂盒能够利用激光能量提高细胞膜通透性以实现外源分子的高效细胞传输。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的基于金纳米材料的光致穿孔体系，该体系可以实现外源大分子简单直接、快速、高效的细胞运输。
为达到上述目的，本发明采用的第一种技术方案为：一种采用光致穿孔的方式制备负载有外源分子的细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）采用纳米金结构修饰细胞培养基材；
2）在修饰过的细胞培养基材中培养细胞；
3）用近红外波段的激光光源照射细胞适当时间；
4）向细胞中添加需要传递的外源分子，然后培养一段时间。
本发明一个较佳实施例中，在步骤1）中，在细胞培养基材上修饰的所述纳米金结构是采用向所述细胞培养基材中加入镀金液静置的方法实现的。
本发明一个较佳实施例中，所述镀金液为先配制成的含有弱碱溶质、还原剂，氯金酸的溶液，然后用碱溶液将所述溶液pH值调节至弱碱性，即得所述镀金液。
本发明一个较佳实施例中，在步骤1）中，所述镀金液的配制是在0-10℃条件下进行的，所述镀金液在所述细胞培养基材内的静置是在20-60℃条件下进行的。
本发明一个较佳实施例中，所述弱碱溶质为碳酸氢钾，所述还原剂为葡萄糖。
本发明一个较佳实施例中，所述镀金液中的碳酸氢钾、葡萄糖、氯金酸的浓度依次为：0.1-1M，10-30mM，5-20mM。
本发明一个较佳实施例中，步骤2）中的细胞培养基材为培养板，在48孔培养板中，每个所述培养孔内的种植细胞的密度为4-5×104/培养孔。
本发明一个较佳实施例中，在步骤2）和步骤4）中，细胞培养均采用向所述培养孔中注入含血清的细胞培养基的方式进行。
本发明一个较佳实施例中，在步骤2）进行前还需要对细胞培养基材进行清洗和消毒。
本发明一个较佳实施例中，在步骤3）中，清洗细胞采用无菌PBS溶液。
本发明一个较佳实施例中，步骤4）中添加的外源分子是混合在无血清的细胞培养基试剂内后添加的。
本发明一个较佳实施例中，步骤3）和步骤4）中的激光照射与添加外源分子的顺序可以是：
先进行激光照射，再进行添加外源分子；或
先进行添加外源分子，再进行激光照射。
本发明一个较佳实施例中，还包括使用胰蛋白酶溶液消化收获载有外源分子的细胞的步骤。
本发明采用的第二种技术方案为：一种用于制备纳米金结构的镀金液，其特征在于：所述镀金液是由将弱碱溶质、还原剂，氯金酸三种溶质配制成的。
本发明一个较佳实施例中，所述弱碱溶质为碳酸氢钾，所述还原剂为葡萄糖，所述镀金液中的碳酸氢钾、葡萄糖、氯金酸的浓度依次为：0.1-1M，10-30mM，5-20mM。
本发明一个较佳实施例中，所述镀金液稳定的溶液状态条件为保持0-10℃的温度，所述镀金液容易形成金纳米粒子聚集体的条件为保持20-60℃的温度。
本发明采用的第三种技术方案为：一种使用金纳米粒子聚集体修饰的细胞培养基材：所述基材为带有若干个培养孔的培养板，其特征在于，所述培养板的培养孔内表面沉降有一层稳定的金纳米粒子聚集体。
本发明一个较佳实施例中，所述金纳米粒子聚集体是由存放在所述培养孔内的镀金液在20-60℃的条件下自然沉降形成的。
本发明采用的第四种技术方案为：一种载有外源分子的细胞，其特征在于，所述细胞包括：细胞本体和进入细胞本体内部的外源分子，所述细胞可以是外源分子直接透过细胞膜进入到细胞本体内形成的细胞，也可以是通过内部存在有外源分子细胞的裂变产生的细胞。
本发明一个较佳实施例中，所述外源分子可以是糖分子或/和蛋白质或/和RNA或/和DNA。
本发明采用的第五种技术方案为：一种载有外源分子细胞的细胞检测筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）在第一种技术方案的步骤4）中，将标记试剂与所述外源分子充分混合后再向细胞添加，然后继续培养一段时间，即得载有外源分子的细胞；
b）通过倒置荧光显微镜观察标记试剂进入细胞的情况。
本发明一个较佳实施例中，所述标记试剂为荧光素四甲基异硫氰酸罗丹明标记的右旋糖酐分子，可以简称为罗丹明-右旋糖酐。
一种采用光致穿孔的方式制备负载有外源分子的细胞的方法，包括以下步骤：
（1）在0-10℃条件下，配制含有碳酸氢钾、葡萄糖，氯金酸的水溶液，然后用碱溶液将溶液pH调节至弱碱性；最终所得溶液中，碳酸氢钾、葡萄糖、氯金酸的终浓度依次为：0.1-1M，10-30mM，5-20mM；以每孔300μL的量，将所得溶液加入到48孔细胞培养板的孔中，然后于20-60℃下静置3-6h，弃去孔中溶液，再用去离子水冲洗至少2次后，即制得稳定的金纳米粒子聚集体修饰的多孔板。
（2）通过试剂1（主要成分为乙醇）浸泡对细胞培养板进行消毒，之后将目的细胞以4-5×104个/孔的密度种植到48孔板的孔中，利用试剂2（主要成分为含血清的细胞培养基）培养6-12h使细胞在板中充分铺展。
（3）用试剂3（主要成分为无菌PBS）清洗细胞，加入试剂4（主要成分为无血清培养基）。用近红外波段的激光光源在1-10W/cm2功率密度范围内对孔中细胞照射0.5-10min。
（4）激光照射完毕后，在培养基中迅速加入试剂4（主要成分为含一定浓度的待传递外源分子的无血清培养基），继续培养20min，加入试剂5（主要成分为血清）和试剂4至1mL体积，继续培养细胞24-48h。（当然此步骤中，也可以是先在培养基中加入试剂4，然后在进行激光照射）
（5）利用试剂6（主要成分为0.25%的胰蛋白酶溶液）消化收获细胞。
上述技术方案中，碳酸氢钾、葡萄糖，氯金酸粉末均为分析纯，所用溶剂水为去离子水。所述碱溶液为本领域技术人员公知的中强碱，不与反应体系中物质发生反应且能将最终溶液的pH值调节到弱碱性即可，如氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钠。
上述技术方案中，激光的功率密度和照射时间可根据不用细胞系和待传递分子进行优化筛选。
上述技术方案中，细胞经激光照射、外源大分子添加、血清补加后的继续培养时间根据不同外源分子发挥功能所需的时间而定。
本发明的原理是：采用化学还原的方法生成金纳米粒子并通过物理沉降作用吸附在多孔板表面形成稳定、形貌均一的金纳米粒子聚集体，这种纳米金聚集层保留了金纳米粒子对近红外波段激光能量大量吸收的性质，吸收的激光能量可用于对提高其上培养细胞的膜通透性，实现外源分子简单直接、快速、高效的细胞运输；并且阻止了游离金纳米粒子进入细胞可能引发的潜在危害。
由于上述技术方案的应用，与现有技术相比，本发明具有以下突出特点：
1．外源大分子不进行阳离子脂质体或聚合物包裹，进入细胞后可快速发挥功能，避免了传统方法中外源分子进入细胞后不能完全被载体释放的缺点，具有简单直接的特点。
2．金纳米粒子聚集体由大量的金纳米粒子组成，具有巨大的比表面积和独特的三维结构，可大量吸收近红外波段的激光能量，用以快速提高其上细胞膜的通透性，实现外源分子的有效细胞传输。
3．通过优化激光的功率和照射时间，可以很好地维持细胞活性。
4.该方法通过由大量金纳米粒子组成的金纳米粒子聚集体的辅助，大大降低了所需要的激光强度。激光光源不再仅局限于飞秒级脉冲式激光光源，也可用低强度连续式激光光源，显著降低了实验成本。
5．该体系适用于多种外源大分子的细胞运输，包括天然或/和人工合成的糖分子/或/和蛋白质或/和RNA或/和DNA或/和药物大分子等等。并且可针对不同种类的细胞系进行传递，包括用常规方法很难实现有效转染的细胞系。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为实施例一中没有激光光源照射条件下，细胞照片；
图2为实施例一中利用808nm连续式激光光源在功率密度分别为2.3W/cm2的条件下分别照射金纳米粒子聚集体上的Hela细胞30sec，45sec和2min，观察荧光糖分子的细胞传递效率，同时检测相应条件下的细胞活性。
图3为实施例一中利用808nm连续式激光光源在功率密度分别为5.1W/cm2的条件下分别照射金纳米粒子聚集体上的Hela细胞30sec，45sec和2min，观察荧光糖分子的细胞传递效率，同时检测相应条件下的细胞活性。
图1-3均是采用倒置荧光显微镜拍摄的照片。
图1，活细胞染料是Calcein-AM染料，罗丹明-右旋糖酐的全称是荧光素四甲基异硫氰酸罗丹明标记右旋糖酐分子（分子量为4.4kDa）。
图1-3组图中右下角一张图片的白色框代表图片尺寸，白色框长度均为100微米。通过活细胞染色，可以表征细胞活性，着色细胞数目越多，并且显示绿色荧光，表明细胞活性越好。罗丹明-右旋糖酐发红色荧光，图中呈现红色荧光的细胞数目越多，表明荧光糖分子进入细胞的效率越高。合成图片可以同时看出细胞活性和荧光分子的传递情况。
具体实施方式
现在结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例提供了一种采用光致穿孔的方式制备负载外源分子的细胞的方法，是通过化学方法在普通细胞培养板表面形成三维的金纳米颗粒聚集层，再以这种经过修饰的多孔板培养细胞，通过808nm连续式激光光源照射实现外源分子的细胞传输。
实施例一，如图1-3所示：
（1）将0.8g碳酸氢钾（分子量100），0.08g葡萄糖（分子量198），80mg氯金酸粉末溶解于16mL去离子水中，并用氢氧化钠溶液将pH值调节到9.0。
（2）吸取该工作溶液300μL加入48孔细胞培养板中，再将多孔板置于25℃烘箱中反应6h。弃去孔中反应液，再用去离子水冲洗3次即制得金纳米粒子聚集体修饰的细胞培养板。
（3）用试剂1分别浸泡培养板20min和10min对孔板进行消毒。Hela细胞以5×104个/孔的密度种植到48孔细胞培养板的孔中，加入试剂2在细胞培养箱中培养12h。
（4）弃除培养基，用试剂3清洗孔中细胞，之后每孔加入250μL试剂4，试剂4中含有1mg/mL的荧光素罗丹明标记的右旋糖酐分子（分子量为4.4kDa）。
（5）功率可调节的808nm激光光源电流和功率密度的对应关系通过功率密度仪进行测定。分别在低功率密度2.3W/cm2和高功率密度5.1W/cm2的条件下用光源垂直照射孔板中的细胞，照射时间分别为30sec，45sec和2min。
（6）照射结束后，立即用试剂3清洗细胞，加入4，继续在培养箱中培养细胞30min后，通过倒置荧光显微镜观察荧光分子进入细胞的情况。同时用活细胞染色观察细胞活性。对照组中，细胞只添加荧光糖分子，不进行激光照射，其他条件与实验组一致。
实验结果如图1-3所示，没有激光的照射的情况下，外源分子不能自发进入细胞（图1）。当功率密度2.3W/cm2时（图2），照射2min后，GNPL表面较好地实现了外源分子的细胞运输，而当功率密度提高到5.1W/cm2时（图3），在照射45sec时便实现了很好地效果，并且这两种情况下都很好地维持了细胞活性。
一种用于制备金纳米粒子聚集体的镀金液，包括：将弱碱溶质、还原剂，氯金酸三种溶质配制成的镀金液，其中弱碱溶质为碳酸氢钾，还原剂为葡萄糖，镀金液中的碳酸氢钾、葡萄糖、氯金酸的浓度依次为：0.1-1M，10-30mM，5-20mM。镀金液稳定的溶液状态条件为保持0-10℃的温度，所述镀金液容易形成金纳米粒子聚集体的条件为保持20-60℃的温度。
一种使用纳米金修饰的细胞培养基材，包括金纳米粒子聚集体、金纳米棒、金纳米锥等修饰的细胞培养基材。对于金纳米粒子修饰的细胞培养板来说，培养板的培养孔内表面沉降有一层稳定的金纳米粒子聚集体，金纳米粒子聚集体由存放在培养孔内的镀金液在20-60℃的条件下自然沉降形成的。
一种载有外源分子的细胞，包括：细胞本体和进入细胞本体内部的外源分子，细胞可以是外源分子直接透过细胞膜进入到细胞本体内形成的细胞，也可以是通过内部存在有外源分子的细胞的裂变产生的细胞。其中外源分子可以天然或/和人工合成的糖分子或/和蛋白质或/和RNA或/和DNA或/和药物大分子。
以上依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定技术性范围。

Claims (14)

1.一种采用光致穿孔的方式制备负载有外源分子的细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用纳米金结构修饰细胞培养基材；
在修饰过的细胞培养基材中培养细胞；
3）用近红外波段的激光光源照射细胞适当时间；
4）向细胞中添加需要传递的外源分子，然后培养一段时间。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤1）中，在细胞培养基材上修饰的所述纳米金结构是采用向所述细胞培养基材中加入镀金液静置的方法实现的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述镀金液为先配制成的含有弱碱溶质、还原剂，氯金酸的溶液，然后用碱溶液将所述溶液pH值调节至弱碱性，即得所述镀金液。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述镀金液的配制是在0-10℃条件下进行的，所述镀金液在所述细胞培养基材内的静置是在20-60℃条件下进行的。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述弱碱溶质为碳酸氢钾，所述还原剂为葡萄糖。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述镀金液中的碳酸氢钾、葡萄糖、氯金酸的浓度依次为：0.1-1M，10-30mM，5-20mM。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤2）和步骤4）中，细胞培养均采用注入含血清的细胞培养基的方式进行。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）中添加的外源分子是混合在无血清的细胞培养基试剂内后添加的。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外源分子可以是糖分子或/和蛋白质或/和RNA或/和DNA。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）和步骤4）中的激光照射与添加外源分子的顺序可以是：
先进行激光照射，再进行添加外源分子；或
先进行添加外源分子，再进行激光照射。
11.根据权利要求1或10所述的方法，其特征在于：还包括使用胰蛋白酶溶液消化收获载有外源分子的细胞的步骤。
12.一种根据权利要求1所述使用纳米金结构修饰的细胞培养基材，所述基材为带有若干个培养孔的培养板，其特征在于，所述培养板的培养孔内表面沉降有一层稳定的金纳米粒子聚集体。
13.根据权利要求12所述的细胞培养基材，其特征在于：所述金纳米粒子聚集体是由存放在所述培养孔内的镀金液在20-60℃的条件下自然沉降形成的。
14.一种采用如权利要求1所述方法制成的载有外源分子的细胞，其特征在于，所述细胞包括：细胞本体和进入细胞本体内部的外源分子，所述细胞可以是外源分子直接透过细胞膜进入到细胞本体内形成的细胞，也可以是通过内部存在有外源分子的细胞裂变产生的细胞。
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