CN1653185A - 通过激光辐射向活细胞中转移分子的方法以及实施该方法的设置 - Google Patents
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Abstract
本发明包括通过激光辐射向活细胞中靶向转移分子的光学方法，优选为DNA、RNA、肽、氨基酸和蛋白质，以及实施该方法的设置。本发明的任务在于发现一种向活细胞内部靶向转移分子的新的可能性，特别是转移DNA、RNA、肽、氨基酸和蛋白质，该发现达到高的转移效率并尽量消除了破坏性的副作用，例如对于经处理的细胞的致死作用，这是通过下列过程来进行的，即用位于微焦耳范围之内或更小的并且对于分子转移来说瞬时的多次激光脉冲来打开细胞膜，由此每次将在毫微微秒范围内的脉冲宽度的脉冲式近红外激光束对准活细胞的膜的亚微米位点，并持续少于1秒的辐射时间。
Description
本发明包括通过激光辐射向活细胞中靶向转移分子的光学方法，所述分子优选为DNA、RNA、肽、氨基酸和蛋白质，以及实施该方法的设置。
该方法优选地适合于转染植物、动物和人的细胞，例如以用于生产药物如合成的疫苗。
借助于根据本发明的设置，该方法能够有效地用于向单个细胞中的基因转染，并开辟出在植物和动物材料的生产、基因疗法以及特殊药物(特别是合成的疫苗)的生产施用的领域中的应用。
靶向分子转移(Der gezielte Molekültransfer)此外还在疫苗的生产中起着重要的作用。疫苗在人和动物的主动免疫范围内用于刺激免疫系统抗病原微生物和病原物质。通常使用仍然具有免疫原性的失活或减毒的细菌。在单个减毒的细菌的活化中存在有微小的健康风险。这特别地能够对于免疫防御减弱的患者带来致命的后果。然而本质上更重要的是这样的事实，即对于大量的疾病(包括AIDS)来说现在还没有疫苗可供使用。基因技术方法将开创通过DNA转移而生产有效的、高纯的合成疫苗的可能性。讨论了将外源DNA装配入植物和动物中以在食品中表达疫苗。原则上能够获得抗完全确定的氨基酸序列的特异免疫性。
外源DNA向靶细胞的转运可以通过特殊载体来进行，例如胶粒如纳米球体和微球体、乳浊液和脂质体。因此，目前研究了病毒样聚集体(VLA)，在其中待转运的分子由两层膜围绕。
如果这种胶粒例如进行静脉内施用，那么这些微粒通常会被网状内皮系统(铜细胞等等)以较高的效率截获，因此就不能导致向原本目标的转移。为了防止这种非特异性的吸收，微粒的表面例如通过某些加涂层过程以及通过借助昂贵的微粒工艺的合适粒度而加以改变。虽然或多或少的微粒最后有效和有选择性地到达靶器官中的靶细胞，但是在微粒吸收上存在问题和存在被溶酶体酶和核酸酶破坏的危险。
因此，很希望在细胞质或直接在特异靶细胞的细胞核中出现有效的外源DNA的积聚。
迄今，向活细胞中靶向转移分子(优选为DNA)以下列方法来进行：
(1)用机械方法，例如微注射和用“基因枪”的轰击，
(2)借助于生物的(病毒、细菌等等)和合成的载体分子，或者
(3)通过借助于电场(电穿孔)或化学试剂(例如用毒素链球菌溶血素-O)的膜通透。
鉴于分子转移的效率和不想要的致死作用的高度可能性，在所有三种方法中都存在有问题，如在下面提及的现有技术中存在的问题。
借助于合成的载体分子和生物载体系统(病毒等等)来向活细胞中转移分子(优选为DNA)是已知的(例如D.J.Stephens，R.Pepperkok：The many ways to cross the plasma membrane，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，
89(2001)4295-4298；D.Luo，W.M.Saltzman：Synthetic DNAdelivery systems，Nature Biotechnol.
18(2000)33-37；L. Bildirici，P.Smith，C.Tzavelas，E.Horefti，D.Rickwood：Transfection of cells byimmunoporation，Nature
405(2000)298)。
通过机械方法如微注射和用“基因枪”的轰击使得能够靶向转移分子同样是已知的(例如M.Knoblauch等人：A galinstan expansionfemtosyringe for microinjection of eukaryotic organelles andprokaryotes，Nature Biotechnol.
17(1999)906-909)。
此外，通过借助于电场(电穿孔)或化学试剂(例如毒素链球菌溶血素-O)的膜通透而向活细胞中转移分子也是已知的。
在常规的基因技术疫苗生产中，通常在采取高度安全措施的情况下用病毒作为目标DNA的载体来侵染生物反应器中的细胞培养物，随后将病毒失活或减毒。
只有借助于使用细的玻璃针头(一般的末端直径：0.5mm)的机械微注射而通过细胞膜的侵入性破坏才可能向特别挑选出的单个细胞中直接转移单个分子，然而这种转移是以低效率和具有高度损害风险来进行的。借助于手动微注射的机械基因转移需要经特殊培训的人员，并且在向非粘附细胞、植物细胞(由于有坚固的细胞壁)和分离的原生质体中的转移遇到巨大的困难。此外，由于细胞内分子如某些蛋白质的附着，玻璃在细胞内部的存在造成巨大的问题。所出现的机械力引起附加的破坏作用。
迄今，基于聚焦激光辐射而通过微消融膜段的靶向分子转移的光学方法借助于具有纳秒范围内的脉冲宽度和微焦耳范围与毫焦耳范围内的高能量的紫外激光源来进行。具有如此长的脉冲宽度的激光脉冲通过强烈的光破坏作用而引起附带的破坏性机械效应。此外，使用紫外辐射由于细胞毒性效应和诱变效应而是有争议的。UV辐射还在焦点范围之外被大量的内源分子所吸收。因此，这种光学转染的成功率是微小的。对于依靠激光的基因转移的尝试自1984年起就已经进行了(Tsukakoshi等人：Appl.Phys.B35(1984)135-140)。通常使用具有相对较高的μJ范围内的脉冲能量的紫外(UV)纳秒激光和单发射击运行。因此转染率是非常微小的，这正如在专业文献中Tsukakoshi等人(在Appl.Phys.B35(1984)135-140中)和Kurato等人(在Exp.Cell Res.
162(1986)372-378中)一致地记载了最大0.6％的转染效率。在此，Tsukakoshi等人还描述了用于转移基因的设置，其基于位于355nm工作波长的且频率变为三倍的10Hz Nd:YAG纳秒激光，其此外仍配备了He-Ne激光作为引导激光，并使得能够通过使用两个检流扫描仪而进行光束偏转。借助于所谓的透照装置并使用UV带阻滤波器可在TV监视器上描绘出样品的图像，并借助于录像仪记录下图像。在此使用具有1mJ的高脉冲能量的单发射击用于细胞膜的穿孔。
在向植物细胞中的基因转移中也使用具有337nm的发射波长的氮激光(Weber等人：Naturwissenschaften 75(1988)36)。在依靠UV激光的向植物胚胎中的基因转移之中报道了0.5％的转化效率(Greulich：Micromanipulation by light in biology and medicine，Birkhuser出版社，1999)。
在Tao等人的进一步的公开内容(在PNAS
84(1987)4180-4184中)中，报道了在使用带有32×物镜的倒置ZEISS显微镜的情况下，用具有10ns的脉冲时间的μJ脉冲在2.0μm直径的相对较大的辐射区域内施行UV曝光。在这种放大中，数字孔径一般为小于0.8。由此相联系的相对较大的辐射位点可能在同样数量级的膜中造成显著的穿孔。在使用人细胞的情况下，这些试验中的转化效率总计低于0.3％。
所有这些全部都表明，在实践中还没有可使用的方法和装置，用于有效和高效地以及不会对活细胞造成损害地向特别挑选出的单个细胞中转移分子，特别是用于生产合成疫苗。
本发明是以这一任务为基础的，即发现向活细胞内部靶向转移分子的新的可能性，特别是转移DNA、RNA、肽、氨基酸和蛋白质，该任务要到达更高的转移效率和尽量消除破坏性的副作用，例如对于经处理的细胞的致死作用。
根据本发明通过下列过程来解决关于借助于激光辐射向活细胞中转移分子的方法的任务，优选为向活细胞中靶向转移DNA、RNA、肽、氨基酸和蛋白质，以及转染植物、动物和人的细胞，特别是以用于生产药物如合成疫苗，该过程为通过位于微焦耳范围之内或更小的并且对于分子转移来说瞬时的多次激光脉冲来打开细胞膜，由此将具有毫微微秒范围内的脉冲宽度的脉冲式近红外激光束每次对准活细胞的膜的亚微米位点，并持续少于1秒的辐射时间。
有利的是使用具有MHz范围内或更高的脉冲重复频率的多次激光脉冲用于激光辐射。
优选地，使用具有纳焦耳范围内的能量的激光脉冲。合适的是这样调整激光脉冲，以致于在靶细胞的膜上的激光点中获得位于TW/cm2范围内的平均光强度。
将激光束以限制衍射的方式聚焦于亚微米位点上经证实对于用于分子转移的瞬时膜通透性的精确性和空间限制是有利的。
此外，上述任务是为了根据本发明在用于借助于激光束向活细胞中靶向瞬时转移分子的设置之中施行方法的技术转化，特别是用于转移DNA、RNA、肽、氨基酸或蛋白质，在这一转移过程中，用激光将分子从细胞外环境通过膜的经光学增加的通透性而递送至单个细胞的内部，该激光的激光束以短的脉冲时间聚焦于细胞上，这一任务通过下列条件而得以解决，即激光为发射波长在700nm-1200nm范围之内的模式同步化的固体激光，在此所述激光作为脉冲激光用于产生具有少于500fs的脉冲时间和位于微焦耳范围之内或更小的脉冲能量的多次毫微微秒脉冲；存在用于提供衍射限制性亚微米位点的聚焦光学仪器，由此在该位点上，在靶细胞的生物膜上可以调节出位于TW/cm2范围内的光强度；在激光之前放置用于产生从微秒直至1秒的处理时间的光栅；和存在有用于调整和观察靶细胞的装置，在此将附加的照明光源、成像光学仪器、特种滤波器和CCD照相机(以便找寻和调整靶细胞以及记录下激光引起的高度局部化的瞬时膜变化)对齐于被激光照射的位点，并且存在有一个三维可移动式样品台，以用于对于激光点的具有亚微米精确度的靶细胞定位，和用于通过z-调整单元进行的聚焦。
联合了成像光学仪器和CCD照相机而用于目标搜寻、目标位置调节和观察瞬时膜变化的照明光源有利地为用于透射光照明的辐射，优选为白光。
在另一个有利变化形式中，照明光源具有用于荧光激发的辐射，因此可激发内源性荧光团(自身荧光)或者优选地可激发外源性(给予的)荧光团(例如荧光性膜标记)。
此外经证实合适的是，如果同时使用激光束用于荧光性膜标记的双光子激发荧光。
在靶细胞上的激光点中的激光束有利地具有小于100nm的脉冲能量。
对于将激光点对准单个靶细胞和挑选出的膜表面方面的样品操作来说，要将激光束聚焦在一个固定的点上，在此通过样品台而确定靶膜上的激光束定位，和经过物镜的z-调整单元而用于焦点控制。
有利地，光栅可转换地位于两种开放状态之间，第一种开放状态用于提供用于膜处理的纳焦耳脉冲，第二种开放状态用于提供用于观察辐射位置的皮焦耳脉冲。
为了检测关于靶细胞的激光束的位置，CCD照相机有利地配备有一个滤波器，以致于在滤波器上较少地描绘出由靶细胞或其载体所反射或透射的激光束的部分，此外，其具有用于描绘激光点组份的计算和控制元件，并同时描绘了通过附加的照明光源的照射所产生的靶细胞的图像。
放置于CCD照相机之后的图像处理单元合适地具有带有特殊图像处理软件的计算机以用于鉴定靶细胞。
在此，该计算机有利地同时与用于操控样品台的控制和调整单元相结合，在此将对于靶细胞的目标鉴定而获得的信息用于选择和定位靶细胞以及用于激光聚焦。
基于由计算机所提供的目标鉴定，将控制和调整单元合适地用于在激光焦点中定位挑选出的靶细胞膜。
此外，图像处理单元有利地具有图像处理软件，用该软件可记录下瞬时膜变化的过程。因此，可以检测到卓有成效的分子转移，并可以自动开始下一个靶细胞的搜寻和处理。
本发明的基本思想在于，通过激光照射而打开活靶细胞(原核生物、真核生物)的膜，该激光照射在亚微米位点中使用位于毫焦耳或纳焦耳能量范围内的多次激光脉冲，并持续对于分子转移来说瞬时的小于1秒的辐射时间。由此，除了外部的细胞膜之外，进一步的细胞内的膜例如核膜也可以进行靶向处理。
已经表明，通过使用这种特殊的激光辐射，在激光点的范围中消除屏障功能的情况下，激光引起的高度局部化的瞬时膜变化使得能够向细胞中短时和高效地转移分子，因此使得能够有效地进行转染，而这种分子转移没有伴随有破坏性的副作用。不会出现在文端提及的干扰性副作用如光毒性作用以及微小的转染效率。
本发明将在下面借助于实施例而进行更详细的解释。附图表明：
图1：根据本发明的设置的原理图
图2：CHO细胞用pEGFP-N1的卓有成效的转染的图解说明，其形式为在用密集的毫微微秒脉冲进行辐射之后几个小时，使用单光子和双光子荧光成像的CCD照相以及NIR透射成像来以图解的方式记录该表达。
本发明在其方法过程中通过参考图1中示意性描绘的设置(没有一般性的限制)而进行描述。
该设置在其基本构造中由下列部分组成，即具有前置的光栅2和辐射扩展器3的激光1；物镜5；安装了发动机的样品台6，在其上存在有靶细胞7，该样品台通过物镜5的z-调整单元8和x-y-z-调整单元9而对于由物镜5产生的激光点可移动地安置靶细胞；附加的照明光源10；以及CCD照相机13，其用于记录由照明光源10产生的经处理的靶细胞7的图像。
将模式同步化的80MHz钛-蓝宝石激光作为激光1连接入激光扫描显微镜中，并借助于具有1.3的高数字孔径的40×物镜5以限制衍射的方式聚焦于亚微米位点上。大约200fs的脉冲宽度的平均功率接近几个微瓦，以用于观察和靶细胞搜寻。借助于扫描仪首先铺置上CHO细胞(中国仓鼠细胞)的细胞层、PTK细胞(鼠袋鼠细胞)的细胞层和成熟人DPSC干细胞的细胞层，并借助于透射辐射形成图像，和借助于光倍增器进行检测。在个别情况下，还可以使用荧光性膜标记的双光子激发的荧光信号用于图像绘制。细胞通常存在于小型化无菌细胞室中，该细胞室含有0.5ml培养基和0.2ug质粒DNA载体pEGFP-N1(4.7kb)。该质粒引起绿色荧光蛋白的合成。
随后，将激光束聚焦于挑选出的亚微米区域上，该区域位于单个挑选出的细胞的膜上(点辐射模式的扫描仪)，并将功率增加至50mW-100mW。该区域借助于快速光栅而照射16ms。随后在减小的平均微瓦功率中的扫描表明，在挑选出的由激光点所击中的靶细胞膜区域的范围内存在瞬时的膜变化(膜外翻)。这种辐射可能引起细胞膜的短时微穿孔，通过这一微穿孔过程质粒能够侵入细胞中。
该辐射模式在200个细胞上重复进行测试。用于通过细胞搜寻、光束聚焦和辐射的转染的时间消耗总计为10-15秒。
DNA质粒的整合和绿色荧光蛋白的表达在原位上通过静止的且时间上分开的双光子荧光成像来检测，该双光子荧光成像位于＜1mW的平均激光功率并持续72h的时间。卓有成效的激光引起的EGFP的表达通过测量～2.4ns的平均荧光持续时间来加以确认。不依赖于细胞类型而能够获得高于90％的转染率以及表达率，这正如图2的图解说明所印象深刻地证明的。
根据本发明的用于向单个活细胞中有效地转移分子的设置优选地含有具有高脉冲频率的模式同步化毫微微秒激光，该激光在700nm-1200nm的波长范围(NIR)内发射出来，并经过具有高数字孔径(大于0.8)的物镜5提供了固定不变的且以限制衍射的方式聚焦于亚微米位点上的激光束，该激光束由多次纳焦耳激光脉冲构成并具有位于TW/cm2范围内的光强度，以便在激光点的范围内瞬时消除生物膜的屏障功能。此外，该设置还由下列部分组成，即快速光栅2，其可在使用纳焦耳脉冲以及皮焦耳脉冲的情况下实现微秒和毫秒范围内的辐射时间以用于目标的调节；附加的照明光源10，成像光学仪器11，特种滤波器12和CCD照相机13，以用于找寻和调整目标以及记录下激光引起的高度局部化的瞬时膜变化；优选地安装了发动机的具有亚微米精确度的样品台6，z-调整单元8，具有目标鉴定和控制模块的图像处理单元15，以用于向活的单个细胞中自动转移DNA、RNA和蛋白质。
优选地使用毫微微秒激光扫描显微镜，这正如已知其在细胞生物学范围内使用一样(见例如，Denk等人，Science 248(1990)73)。与通常经过(成本密集型)检流扫描仪实现的光束偏转(使用特殊的扫描光学仪器、光束导向器和控制器)不同，根据本发明借助于光束扩展器3、偏转单元4和物镜5将毫微微秒激光的光束局限于一个固定的点上以便对于样品进行彻底扫描。扫描和聚焦规程可单独通过安装了发动机的样品台6以及调整单元8和9来实现。
在图1的一个优选的实施方案中，使用脉冲式固体激光作为用于有效分子转移的激光1，其具有发射波长为800nm的高光束性能(TEM00模式)、高脉冲频率(具有80 MHz左右的典型值)、小于300fs的脉冲时间和几个纳焦耳(＜100nJ)的脉冲能量。在激光束到达扩展器3之前，可以用具有微秒范围内的最小转换时间的快速光栅几乎无损失地释放激光束以用于处理靶细胞7，或者阻断95％-99％的激光束以便检测靶细胞7中的激光束位置。然后，经过随后的偏转镜4(具有90％-99％的NIR反射能力)而将光束转向具有大于0.8(通常为1.2)的数字孔径的聚焦光学仪器5，并经此聚焦于衍射限制性亚微米位点上，该位点位于存在于样品台6之上的样品7的内部。
样品例如活细胞(简化为目标物体：靶细胞7)合适地存在于具有至少一个大约170μm厚的玻璃窗的小型细胞室中。靶细胞7通常由培养基所围绕，该培养基还含有待转化的分子例如某些DNA质粒。激光束通过玻璃窗而聚焦于靶细胞7的膜段上。这种膜段可以为细胞膜、细胞壁、细胞器膜或核膜。
聚焦平面可以借助于压力驱动的z-调整单元8而在深度(z-方向)上以小于100nm的精确度进行变化。定位台6上的所有三个方向x、y、z可以用附属的调整单元9以亚微米的精确度(例如用整合的操纵杆)进行调整。
具有微小的光强度的照明光源10还在激光辐射期间通过联合成像光学仪器11、引起激光束强烈减弱的短通路滤波器12和CCD照相机13而保证靶细胞7的成像。除了照明光源10的透射光的显影之外，可如此记录下激光点的真正位置，即在靶细胞7和/或其玻璃载体上反射的具有高空间精度的激光束在监视器14的中心部分中描绘为与由照明光源10产生的靶细胞7的图像在一起的、明亮的、未照射的激光点。计算机优选为PC，其作为具有控制和调节单元以及用于目标鉴定的图像分析程序(图案识别系统)的图像处理单元15而使得能够识别靶膜，以及能够如此地自动移动样品台6和z-调整单元8，即使得靶膜的一部分和激光焦点相一致。在完全或部分自动运行中，在目标调整之后紧接着控制光栅2，和将大量的纳焦耳激光脉冲应用于靶细胞7的膜上并持续小于1秒的辐射时间。在辐射的同时和辐射之后很短的时间内，于卓有成效的激光辐射中，能够在监视器14上观察到以外翻形式出现的瞬时膜变化。这种膜变化通常持续几秒钟至几分钟。在辐射之后紧接着，膜对于分子是通透的，从而使得能够特别有效地转移DNA、RNA和蛋白质。一旦通过图像分析程序记录下瞬时变化，就借助于控制模块并通过调整单元9的操作而自动调准一个新目标，通常为一个新的靶细胞7，并且重复所述过程。如果在辐射场的范围内没有识别出瞬时的膜变化，那么随后调准同一个细胞的邻近膜区域，并进行再次激光辐射。照射光源10在最简单的情况下以发白光的形式进行工作。但是，其还可以发射荧光激发辐射来代替白光，这种辐射使得能够用CCD照相机13来检测荧光性膜标记。在此，激光1本身可以通过双光子效应而用作荧光激发光源。此外，还可以将所述的设置整合入显微镜中。
不仅可以将细胞膜或细胞壁理解为靶膜，而且可以将细胞内的膜如核膜和线粒体膜理解为靶膜。
图2表明了，CHO细胞用pEGFP-N1的卓有成效的转染，以及在用密集毫微微秒脉冲进行辐射之后几个小时的表达的图像记录，这是通过NIR透射成像、双光子荧光成像和CCD照相来实现的。在此，这些部分图像(比例尺：Bar＝25μm)显示出：
a：在单光子蓝色激发之后借助于CCD照相机获得的真实EGFP荧光图像。在卓有成效的激光转染之后可以明显地识别出大量的发荧光的细胞。
b：带有箭头的NIR透射图像，该箭头指明了单个经激光处理的细胞。
和
c：双光子荧光持续时间图像，在该图中可以明显地识别出单个在激光处理之后发荧光的细胞。周围的没有用密集激光脉冲进行照射的细胞所发的荧光不明显。计算出的2.4ns的荧光持续时间与对于绿色荧光蛋白(GFP)的预期值相符。
参考标记列表
1 激光
2 光栅
3 扩展器
4 偏转镜
5 物镜
6 样品台
7 靶细胞(样品)
8 z-调整单元
9 调整单元
10 (附加的)照明光源
11 成像光学仪器
12 短通路滤波器
13 CCD照相机
14 监视器
15 图像处理单元
Claims (17)
1.通过激光辐射向活细胞中转移分子的方法，优选为向活细胞中靶向转移DNA、RNA、肽、氨基酸和蛋白质，以及转染植物、动物和人的细胞，特别是用于生产药物如合成的疫苗，其特征在于，用位于微焦耳范围之内或更小的并且对于分子转移来说瞬时的多次激光脉冲来打开细胞膜，由此每次将在毫微微秒范围内的脉冲宽度的脉冲式近红外激光束对准活细胞的膜的亚微米位点，并持续少于1秒的辐射时间。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，使用具有MHz范围内或更高的脉冲重复频率的多次激光脉冲。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，使用具有纳焦耳范围内的能量的多次激光脉冲。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，使用具有TW/cm2范围内的光强度的激光脉冲。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，将激光束以限制衍射的方式聚焦于亚微米位点上。
6.用于借助于激光束向活细胞中靶向瞬时转移分子的设置，特别是用于转移DNA、RNA、肽、氨基酸或蛋白质，在这一转移过程中，用激光将分子从细胞外环境通过膜的增加的通透性而递送至细胞的内部，该激光的激光束以短脉冲时间聚焦于细胞上，该设置的特征在于
-激光为在700nm-1200nm波长范围之内具有发射的模式同步化的固体激光，由此形成激光作为脉冲激光以用于产生具有少于500fs的脉冲时间和位于微焦耳范围之内或更小的脉冲能量的多次毫微微秒脉冲，
-存在用于提供衍射限制性亚微米位点的聚焦光学仪器，由此在该位点上，在靶细胞的生物膜上可以调节出位于TW/cm2范围内的光强度，
-在激光之前放置用于产生从微秒直至1秒的处理时间的光栅，和
-存在有用于调整和观察靶细胞的装置，由此对齐附加的照明光源、成像光学仪器、特种滤波器和CCD照相机，以便找寻和调整靶细胞以及记录下在被激光照射的位点上的激光引起的高度局部化的瞬时膜变化，并且存在有一个样品台，以用于对于激光点的具有亚微米精确度的靶细胞定位，和用于通过z-调整单元进行聚焦。
7.根据权利要求6的设置，其特征在于，联合了成像光学仪器和CCD照相机而用于目标搜寻、目标位置调节和观察瞬时膜变化的照明光源具有用于透射光照明的辐射，优选为白光。
8.根据权利要求6的设置，其特征在于，照明光源具有用于荧光激发的辐射，因此可激发内源性荧光团(自身荧光)或者优选地可激发外源性(给予的)荧光团(例如荧光性膜标记)。
9.根据权利要求6的设置，其特征在于，同时用激光束用于外源性荧光团优选为荧光性膜标记的双光子激发荧光。
10.根据权利要求6的设置，其特征在于，将激光束聚焦在一个固定的点上，由此通过样品台而用于靶膜上的位点定位，和经过样品台的z-调整单元而用于焦点控制。
11.根据权利要求6的设置，其特征在于，在靶细胞上的激光点中的激光束具有小于100nm的脉冲能量。
12.根据权利要求11的设置，其特征在于，光栅可转换地位于两种开放状态之间，第一种开放状态用于提供用于膜处理的纳焦耳脉冲，第二种开放状态用于提供用于观察辐射位置的皮焦耳脉冲。
13.根据权利要求6的设置，其特征在于CCD照相机配备有一个滤波器，以致于在滤波器上描绘出少量的由靶细胞或靶细胞的载体所反射或透射的激光束的部分，并且其具有用于描绘激光点的图像处理单元，并同时描绘了通过附加的照明光源的照射所产生的靶细胞的图像。
14.根据权利要求6的设置，其特征在于放置于CCD照相机之后的图像处理单元是具有特殊图像处理软件的计算机用于鉴定靶细胞。
15.根据权利要求14的设置，其特征在于，计算机与用于操控样品台的控制和调整单元相连接，由此将图像处理和目标鉴定的信息用于选择和定位靶细胞以及用于激光聚焦。
16.根据权利要求15的设置，其特征在于，基于由计算机所提供的目标鉴定，将控制和调整单元用于在激光焦点中定位挑选出的靶细胞膜。
17.根据权利要求14的设置，其特征在于，图像处理单元具有图像处理软件，用该软件可记录下瞬时膜变化的过程。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100505 Termination date: 20180522 |
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