CN112239768B - 一种向t细胞内传递外源性分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种向T细胞内传递外源性分子的方法。所述方法包括将T细胞和含有外源性分子的试剂混合，将获得的细胞悬液滴加至光热基材表面，用近红外波段的激光光源照射细胞。所述方法通用性强、传递效率和转染效率高、细胞毒性小、改造细胞收获率高、一次性细胞处理通量大。采用本发明制备得到的CAR‑T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率可高达95％。

Description

一种向T细胞内传递外源性分子的方法
技术领域
本发明涉及生物医学和医疗器械领域，具体涉及一种向T细胞内传递外源性分子的方法。
背景技术
免疫细胞疗法包括细胞因子治疗、免疫检查点封锁方法、获得性免疫治疗和嵌合抗原受体修饰T细胞免疫治疗(CAR-T)。
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor)，是人工合成的T细胞受体，结构上是由胞外靶向连接区以及T细胞的激活信号结构域(铰链区、跨膜区、胞内信号转导区)组成。嵌合抗原受体T细胞是最具前景的肿瘤细胞免疫治疗方式之一。通过将患者的T细胞“重编码”，使其可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖T细胞的信号传递至细胞内，引起T细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。通过这种靶向治疗可以有效治疗肿瘤甚至达到治愈的效果。相比于传统的治疗方法，CAR-T治疗展现出巨大的优势，如对肿瘤的特异性杀伤，只要表达它所针对的靶点就能杀伤，杀瘤范围广，并且对转移性和复发性肿瘤都有效。近几年，CAR-T细胞疗法作为一种新型的免疫细胞疗法在癌症治疗领域大放异彩，对急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗有显著疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。
在CAR-T细胞疗法领域，安全和有效的T细胞改造技术的开发将标志着这类疗法开发进程上的一个转折点。CAR-T作为活细胞药物，与传统药物的开发具有很大的区别。基于CAR-T细胞的疗法是一种极为个性化的治疗方法，从患者的供血中分离T细胞，运用基因工程技术在体外给T细胞加入一个嵌合抗原受体基因，使其可以将这个嵌合抗原受体表达到T细胞的表面，从而使T细胞特异性的识别肿瘤细胞表面的特异性抗原分子，最终杀死肿瘤细胞，在体外扩增后将改性的T细胞(CAR-T)注入患者体内，达到清除癌细胞的效果。其中，如何安全有效的向T细胞内传输目的基因是关键步骤和主要挑战，寻找合适的免疫细胞改造技术对CAR-T细胞疗法的实现至关重要。
目前T细胞改造技术包括病毒感染、电穿孔和微流控传递。通过慢病毒感染的方式对原代T细胞进行基因改造是最为成熟的一种CAR-T细胞制备方法，但是该方法中病毒载体的制备成本高，而且存在诸多不确定因素，包括基因插入位点不明确、存在潜在的致瘤风险等。电穿孔技术不太适用于核酸以外的物质，比如蛋白质等，更有研究表明电穿孔会改变细胞的基因表达图谱，从而造成正常细胞功能出现长期缺陷。微流控基因传递技术在传递效率和产量方面具有一定的局限性。另外，也有文献报道利用金纳米颗粒采用光热法将小干扰RNA传递到T细胞上，但是大量金纳米粒子进入细胞导致该方法的细胞毒性大，且其传递效率也较低。
虽然全球CAR-T细胞疗法需求巨大，但是以上所述T细胞改造技术上的现状和瓶颈造成目前基因疗法制造速度相对慢，成本较高，而且制造方面不可扩展，无法满足市场需求。安全、有效并且可以扩大化的细胞操作技术成为开发成功细胞疗法的先决条件，现在改造细胞仍需要新技术以增加速度、效率、容量、降低突变风险。
发明内容
发明要解决的问题
为解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种能够高效的向T细胞内传递外源性分子如编码CAR蛋白的基因的方法，该方法传递效率和转染效率高而且改造细胞收获率高。
用于解决问题的方案
在一个技术方案中，本发明提供了一种向T细胞内传递外源性分子的方法，所述方法包括将T细胞和含有外源性分子的试剂混合，将获得的细胞悬液滴加至光热基材表面，用近红外波段的激光光源照射细胞。
在一个实施方式中，所述光热基材选自表面沉积有聚多巴胺的基材。
在另一个实施方式中，所述基材为金片、硅片、云母片、聚氨酯(PU)片、聚二甲基硅氧烷(PDMS)片、玻璃片或细胞培养板、酶标板、微流道装置，进一步优选地，所述基材为金片。
在另一个实施方式中，所述外源性分子包括多糖分子、蛋白质、DNA、RNA、药物、细胞内探针、纳米材料、适配体、细菌、人造染色体或细胞器中的一种或多种，进一步优选地所述外源性分子选自多糖分子、蛋白质或质粒RNA。
在另一个实施方式中，所述光热基材通过以下方法制备：配制多巴胺的水溶液，将基材浸没于所述水溶液中，置于烘箱静置。
在另一个实施方式中，所述T细胞密度为15～30万/cm2。
在另一个实施方式中，所述激光光源的功率在1-10W/cm2，进一步优选功率为1-6W/cm2，照射时间为0.5-10min，进一步优选照射时间为0.5-4min。
在另一个实施方式中，本发明所述方法用于制备CAR-T细胞。
在另一个技术方案中，本发明提供了表面沉积有聚多巴胺层的基材在向T细胞内传递外源性分子过程中用途，所述外源性分子选自多糖分子、蛋白质或质粒DNA。
发明的效果
本发明提供了一种向T细胞内传递外源性分子的方法，其通过对基材进行表面改性可以大幅度提高传递效率和细胞收获率。与现有的向T细胞内传递外源性分子技术相比，本发明的有益效果包括：
一方面，本发明中所述的方法的通用性强。利用本发明中所述的方法，理论上可以向T细胞内传递一切需要传递的物质，包括但不局限于多糖分子(如右旋糖酐)、蛋白质(如基因编辑酶、抗体、抗原)、DNA(如pDNA)、RNA(如mRNA、向导RNA、miRNA、siRNA)、治疗性药物、细胞内探针(如量子点)、纳米材料(如纳米粒子、纳米装置)、适配体、细菌、人造染色体、细胞器(如线粒体)等。
另一方面，本发明的方法对细胞毒性小。通过调控照射激光的功率和照射时间，可以在获得较高传递效率的基础上，保持较高的细胞活性。同时细胞收获率高。当采用本发明所述的方法用于制备CAR-T细胞时，传递效率可达到90％以上，且传递48小时后的细胞活性仍能保持在90％以上。制备得到的CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率可高达95％。
另一方面，当采用本发明所述的方法用于制备CAR-T细胞时，还可以大幅提高制备速度，同时也能降低成本，容易扩大化。同时，本发明所述方法可对细胞进行高通量处理。利用本发明所述方法在表面改性基材上照射一次激光可处理至少上万个细胞，可在短时间内实现高效、大量的细胞处理。
附图说明
图1为利用本发明中制备的光热基材向T细胞中传递外源性分子的传递效率柱状图以及传递48h后的细胞活性柱状图，其中外源性分子分别为糖分子、蛋白质和质粒DNA。
图2为利用Luciferase-Luciferin化学发光检测法测试CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。其中CAR基因代表向T细胞内传递该类物质之后所制得的CAR-T细胞。
图3为利用表面沉积有聚多巴胺的金片(PDA)、金纳米粒子沉积层(纳米金膜，GNPL)和金纳米粒子(GNP)作为光热基材向T细胞中传递CAR基因的转染效率柱状图以及处理后的细胞收获效率柱状图。
具体实施方式
以下将参考附图详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
定义
除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
术语“试剂”包括要递送进细胞中的任意物质。这样的试剂包括但不限于含有外源性分子的无血清细胞培养基。
术语“蛋白质”在本文中用于表示氨基酸残基的聚合物。该术语适用于：其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。该术语也包括在传统肽键上的变体，所述传统肽键连接组成多肽的多个氨基酸。
术语“传递”是表示从细胞外到细胞内的过程，术语“转染”是从细胞外到细胞核，而后再翻译表达成蛋白质的过程，一般专指将核酸物质传递至细胞中，并成功进行表达的过程。
术语“外源性分子”是指产生在有机体、细胞、组织或系统外的被引入有机体、细胞、组织或系统中的任何材料。
术语“CAR基因”是指编码有CAR蛋白的质粒DNA。
<光热基材的制备>
本发明首先制备一种光热传递基材，其表面沉积有聚多巴胺层。本发明所述的表面沉积有聚多巴胺层的基材可以用于向T细胞内传递外源性分子。
多巴胺(dopamine，DA，化学结构式：C6H3(OH)2-CH2-CH2-NH2，CAS号：62-31-7)作为儿茶酚衍生物中的一种，是一种神经传导物质，用来帮助细胞传送脉冲的化学物质。近年来因多巴胺对基材表面具有较强的粘附性，使得其在生物医学及生物材料学方面广为应用。多巴胺在水溶液中很容易被溶解氧氧化，继而引发自聚交联反应，可以在几乎任何一种固体材料表面形成紧密附着的聚多巴胺复合层。聚多巴胺是一种类黑色素物质，其不仅有良好的粘附力，而且具有突出的光吸收性能，能够吸收可见光到近红外光波段的光，在基体中产生光热效应，使材料局部快速有效的升温。但是由于聚多巴胺结构和粘附机理的复杂性，目前尚未见到将利用聚多巴胺的光热效应制备向T细胞内传递外源性分子的光热基材以提高培养于聚多巴胺上T细胞的细胞膜通透性。
在一个技术方案中，本发明先在基材上沉积聚多巴胺，具体方法包括配制多巴胺的水溶液，将基材浸没于所述水溶液中，置于烘箱静置。
本发明的基材即基底材料为金片、硅片、云母片、聚氨酯(PU)片、聚二甲基硅氧烷(PDMS)片、玻璃片或细胞培养板、酶标板、微流道装置，进一步优选地，所述基材为金片。
在另一个技术方案中，配制多巴胺的水溶液的浓度控制在1-3mg/mL，若浓度过低，则基材表面的聚多巴胺沉积层将太薄，其光热效应不足以用于细胞内分子传递；若浓度过高，则聚多巴胺沉积层表面的粗糙度将增大，促进细胞在其表面的牢固黏附，使后续细胞脱附困难；进一步地，用碱溶液(如Tris碱(三羟甲基氨基甲烷))调节配制得到的水溶液体系的pH值，优选地，pH调至8-9，更优选地，pH调至8.5；进一步地，将基材浸没于溶液中，置于30-40℃的烘箱中静置20-30小时，即得表面沉积聚多巴胺层的基材。
<向T细胞内传递外源性分子的方法>
本发明提供了一种向T细胞内传递外源性分子的方法，所述方法包括将T细胞和含有外源性分子的试剂混合，将获得的细胞悬液滴加至光热基材表面，用近红外波段的激光光源照射细胞。在本发明的一个技术方案中，所述光热基材选自表面沉积有聚多巴胺的基材。
因聚多巴胺具有较强的光热转化能力采用本发明所述方法可以降低激光强度，激光光源可以使用低强度连续式激光光源，显著降低实验成本。
本发明所述的方法可以用来向T细胞内传递多种不同尺寸的物质，而且对物质的性质没有特殊要求。比如所述外源性分子包括天然和或人工合成的多糖分子(如右旋糖酐)、蛋白质(如基因编辑酶、抗体、抗原)、DNA(如pDNA)、RNA(如mRNA、向导RNA、miRNA、siRNA)、治疗性药物、细胞内探针(如量子点)、纳米材料(如纳米粒子、纳米装置)、适配体、细菌、人造染色体、细胞器(如线粒体)等。优选地，所述外源性分子选自多糖分子、蛋白质或质粒DNA。在本发明的一个具体实施方案中，多糖分子为荧光标记的右旋糖酐，是用于初步检测分子传递效率的模型分子。CAR中文全称为嵌合抗原受体。CAR基因进入细胞后能使细胞膜上表面产生这种嵌合抗原受体，从而使处理后的细胞具有特异性识别带特定抗原的细胞，如癌细胞。其中，CAR基因是编码有CAR蛋白的质粒DNA。
在本发明的一个技术方案中，首先将T细胞与外源性分子按照一定比例混合于无血清细胞培养基中获得细胞悬液，T细胞密度为15～30万/cm2，如传递糖或蛋白质，则糖或蛋白质的终浓度为0.5-1.5mg/mL，如传递DNA或RNA，则DNA或RNA的终浓度为0.003-0.008μg/mL。终浓度指照激光前样品表面溶液的浓度。溶液中外源性分子浓度过低将减少其与细胞的接触概率，导致传递效率低。然后对光热基材进行消毒，比如可采用乙醇(如75％浓度乙醇)进行消毒，将上述细胞悬液滴加至光热基材表面，形成微米级液体薄层。接着，用近红外波段的激光光源对样品上细胞进行照射。激光照射完毕后，收集细胞悬液并加入正常的含血清的细胞培养基培养T细胞。
近红外波段是指780～3000纳米的波段，由于采用了表面沉积有聚多巴胺的基材，在本发明的具体实施方式中，可使用低功率、短时的激光照射，比如激光光源在1-10W/cm2功率密度范围内对基材上细胞照射0.5-10min即可。在激光照射完毕后，将有外源性分子的细胞培养基更换为正常的带血清的细胞培养基继续恢复正常培养细胞，优选在37℃下进行培养。
当外源性分子选自CAR基因时，利用本发明所述的方法可以制备得到的CAR-T细胞，进一步地，可以利用体外实验证明制备所得的CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。细胞杀伤检测采用的是Luciferase(荧光素酶)-Luciferin(荧光素)化学发光检测法，其中所采用的靶细胞为过表达CD19抗原和萤光素酶(Luciferase)的Hela细胞。通过比较杀伤前后靶细胞的化学发光检测值，检测CAR-T细胞的杀伤能力。具体实验步骤包括：
(1)将上述Hela细胞以5×104的密度种植于48孔板中。
(2)分别向不同的孔中加入未处理的T细胞和制备得到的CAR-T细胞，其中对照组不加T细胞。置于细胞培养箱中培养10-20h。
(3)收集培养的细胞。用PBS清洗三次后，将细胞重悬于100μL PBS中，并将悬浮液转移至荧光检测酶标板中，加入100μL浓度为150μg/mL的D-荧光素(D-luciferin)，用酶标仪检测560nm处的发光值。
(4)计算T细胞的杀伤能力。记空白对照的读数为A0，未加T细胞的对照组的读数为A，实验组读数为A1，则T细胞的杀伤效率＝1-(A1-A0)/(A-A0)×100％。
通过对比可知，本发明制备得到的CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率可高达95％。
实施例
以下将结合具体的实施例来进一步阐述本发明中的技术方案。应当理解的是，下列实施例仅用于解释和说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。
实施例1
步骤一：制备CAR-T细胞
(1)将0.08g多巴胺盐酸盐溶解于40mL去离子水中，用碱溶液将pH值调节到8.5。将金片浸没于上述溶液中，37℃下静置24h，得沉积有聚多巴胺沉积层的基材。
(2)将T细胞与CAR基因(编码有CAR蛋白的质粒DNA，Lenti-EF1a-CD19(FMC63)-2nd-CAR(4-1BB)-EGFRt，爱康得生物)按一定比例混合于无血清细胞培养基中，T细胞密度为20万/cm2，其中CAR基因的终浓度为0.006μg/mL。
(3)用75％乙醇对光热基材进行消毒，将上述细胞悬液滴加至光热基材表面，形成微米级液体薄层。
(4)用近红外波段的激光光源在1W/cm2功率密度范围内对样品上细胞照射3min。
(5)激光照射完毕后，收集细胞悬液并加入正常的含血清的细胞培养基培养T细胞。
(6)激光照射完毕48h后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚对细胞核进行染色，再用荧光显微镜观察CAR基因进入细胞的情况。蓝色的细胞为被染色的细胞核，绿色的细胞为成功表达绿色荧光蛋白的细胞，代表被成功转染的细胞。通过荧光显微镜照片进行定量化处理，对蓝色细胞的细胞数和绿色细胞的细胞数进行计数，后者除以前者乘以100％即得转染效率。细胞活性通过CCK-8(cell counting kit)对细胞活性进行检测。转染效率和细胞活性分别为95.1％±1.5％和85.4％±1.6％。
步骤二：利用体外实验证明CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。
(1)将靶向Hela细胞以5×104的密度种植于48孔板中。
(2)分别向不同的孔中加入未处理的T细胞和步骤一获得的CAR-T细胞，其中对照组不加T细胞。置于细胞培养箱中培养10-20h。
(3)收集培养的细胞。用PBS清洗三次后，将细胞重悬于100μL PBS中，并将悬浮液转移至荧光检测酶标板中，加入100μL浓度为150μg/mL的D-荧光素(D-luciferin)，用酶标仪检测560nm处的发光值。
(4)计算T细胞的杀伤能力。记空白对照的读数为A0，未加T细胞的对照组的读数为A，实验组读数为A1，则T细胞的杀伤效率＝1-(A1-A0)/(A-A0)×100％。杀伤效率为95.0％±1.2％，结果参见图2。
步骤三：测试光热基材表面的细胞回收率
(1)完成步骤一后，收集细胞悬液并用血球计数板对细胞数量进行计数。
(2)计算细胞回收率。公式如下：
细胞回收率(％)＝(细胞悬液中细胞数量/细胞总数)×100％
细胞回收率为97.8％±1.3％，结果参见图3。
实施例2
将实施例1步骤一(2)中的CAR基因替换为罗丹明标记的右旋糖酐(分子量4.4kDa)，步骤一的(1)、(3)-(5)以及步骤二均同实施例1。
将实施例1步骤一的(6)替换为：激光照射完毕30min后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚对细胞核进行染色，再用荧光显微镜观察右旋糖酐进入细胞的情况。蓝色的细胞为被染色的细胞核，红色为罗丹明标记的右旋糖酐所发出的颜色，代表被成功传递的细胞。通过荧光显微镜照片进行定量化处理，得到传递效率。另外，在激光照射完毕48h后通过CCK-8对细胞活性进行检测。传递效率和细胞活性柱状图，参见图1。
实施例3
将实施例2步骤一(2)中的右旋糖酐替换为罗丹明标记的牛血清白蛋白(BSA)，其余步骤均同实施例2。
传递效率和细胞活性柱状图，参见图1。
实施例4
将实施例2步骤一(2)中的右旋糖酐替换为编码有绿色荧光蛋白的质粒DNA(pGFP)，步骤一的(1)、(3)-(5)以及步骤二均同实施例2。
将实施例2步骤一的(6)替换为：激光照射完毕30min后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚对细胞核进行染色，再用荧光显微镜观察右旋糖酐进入细胞的情况。蓝色的细胞为被染色的细胞核，绿色为成功表达的绿色荧光蛋白所发出的颜色，代表被成功传递的细胞。通过荧光显微镜照片进行定量化处理，得到传递效率。另外，在激光照射完毕48h后通过CCK-8对细胞活性进行检测。传递效率和细胞活性柱状图，参见图1。
对比例1
步骤一：利用GNPL作为光热基材制备CAR-T细胞
(1)将0.8g碳酸氢钾、0.08g葡萄糖和80mg氯金酸粉末溶解于16mL去离子水中，并用氢氧化钠溶液将上述溶液的pH值调至9.0，得镀金液。吸取300μL镀金液于48孔板中，并将其置于37℃烘箱中静置6h。反应结束后，弃去孔中反应液，并用去离子水冲洗3次即制得金纳米粒子沉积层表面(纳米金膜，GNPL)
(2)将T细胞与CAR基因(同实施例1)按一定比例混合于无血清细胞培养基中，T细胞密度为20万/cm2，其中CAR基因的终浓度为0.006μg/mL。
(3)用75％乙醇对GNPL进行消毒，将上述细胞悬液滴加至光热基材表面，形成微米级液体薄层。
(4)用近红外波段的激光光源在1W/cm2功率密度范围内对样品上细胞照射3min。
(5)激光照射完毕后，收集细胞悬液并加入正常的含血清的细胞培养基培养T细胞。
(6)激光照射完毕48h后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚对细胞核进行染色，再用荧光显微镜观察CAR基因进入细胞的情况。蓝色的细胞为被染色的细胞核，绿色的细胞为成功表达绿色荧光蛋白的细胞，代表被成功转染的细胞。通过荧光显微镜照片进行定量化处理，对蓝色细胞的细胞数和绿色细胞的细胞数进行计数，后者除以前者乘以100％即得转染效率。转染效率结果参见图3。
步骤二：测试光热基材表面的细胞回收率
(1)完成步骤一后，收集细胞悬液并用血球计数板对细胞数量进行计数。
(2)计算细胞回收率。公式如下：
细胞回收率(％)＝(细胞悬液中细胞数量/细胞总数)×100％
细胞回收率为50.5％±1.6％，结果参见图3。
对比例2
步骤一：利用GNP作为光热基材制备CAR-T细胞
(1)将T细胞、CAR基因(同实施例1)与金纳米粒子(GNP，自己合成，粒径约20nm，Zeta电位约-15mV)按一定比例混合于无血清细胞培养基中，T细胞密度为20万/cm2，CAR基因的终浓度为0.006μg/mL，金纳米粒子的终浓度为1mg/mL。
(2)用近红外波段的激光光源在1W/cm2功率密度范围内对样品溶液照射3min。
(3)激光照射完毕后，收集细胞悬液并加入正常的含血清的细胞培养基培养T细胞。
(4)激光照射完毕48h后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚对细胞核进行染色，再用荧光显微镜观察CAR基因进入细胞的情况。蓝色的细胞为被染色的细胞核，绿色的细胞为成功表达绿色荧光蛋白的细胞，代表被成功转染的细胞。通过荧光显微镜照片进行定量化处理，对蓝色细胞的细胞数和绿色细胞的细胞数进行计数，后者除以前者乘以100％即得转染效率。转染效率结果参见图3。
步骤二：测试细胞回收率
(1)完成步骤一后，收集细胞悬液并用血球计数板对细胞数量进行计数。
(2)计算细胞回收率。公式如下：
细胞回收率(％)＝(细胞悬液中细胞数量/细胞总数)×100％
细胞回收率为97.6％±1.2％，结果参见图3。
从图1可以看出，利用本发明的方法对于糖分子、蛋白质和质粒RNA这三种外源性分子的传递效率均达到90％以上，且传递48h后的细胞活性仍然保持在90％以上。从图2可以看出，利用本发明的方法制备得到的CAR-T细胞相对于T细胞而言杀伤效率提高了近一倍，杀伤效率可高达95％。从图3可以看出，利用二维平面表面沉积有聚多巴胺的金片(PDA)和金纳米粒子沉积层即纳米金膜GNPL作为光热基材的转染效率远高于游离态的金纳米粒子。但是GNPL表面处理后的细胞回收率较低，仅仅50％左右。可能是因为GNPL表面粗糙度较高，悬液中靠近表面的那部分T细胞接触到GNPL后便被嵌在其中，难以被回收用于后续研究。
除上述实施例外，本发明还包括有其他实施方式，凡采用等同变换或者等效替换方式形成的技术方案，均应落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种向T细胞内传递外源性分子的方法，其特征在于，所述方法包括将T细胞和含有外源性分子的试剂混合，将获得的细胞悬液滴加至光热基材表面，用近红外波段的激光光源照射细胞；
其中，所述光热基材选自表面沉积有聚多巴胺的基材；
所述基材为金片、硅片、云母片、聚氨酯(PU)片、聚二甲基硅氧烷(PDMS)片、玻璃片或细胞培养板、酶标板或微流道装置。
2.根据权利要求1所述的一种向T细胞内传递外源性分子的方法，其特征在于，所述基材为金片。
3.根据权利要求1或2所述的一种向T细胞内传递外源性分子的方法，其特征在于，所述外源性分子包括多糖分子、蛋白质、DNA、RNA、药物、细胞内探针、纳米材料、适配体或人造染色体中的一种或多种。
4.根据权利要求1或2所述的一种向T细胞内传递外源性分子的方法，其特征在于，所述外源性分子选自多糖分子、蛋白质或质粒DNA。
5.根据权利要求1或2所述的一种向T细胞内传递外源性分子的方法，其特征在于，所述光热基材通过以下方法制备：配制多巴胺的水溶液，将基材浸没于所述水溶液中，置于烘箱静置。
6.根据权利要求1或2所述的一种向T细胞内传递外源性分子的方法，其特征在于，所述T细胞密度为15～30万/cm2。
7.根据权利要求1或2所述的一种向T细胞内传递外源性分子的方法，其特征在于，所述激光光源的功率在1-10W/cm2，照射时间为0.5-10min。
8.根据权利要求1或2所述的一种向T细胞内传递外源性分子的方法，其特征在于，所述方法用于制备CAR-T细胞。
9.表面沉积有聚多巴胺层的基材在向T细胞内传递外源性分子过程中用途，其特征在于，所述外源性分子选自多糖分子、蛋白质或质粒DNA；所述基材为金片、硅片、云母片、聚氨酯(PU)片、聚二甲基硅氧烷(PDMS)片、玻璃片或细胞培养板、酶标板或微流道装置。
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