KR20200035107A - 나노 전기천공법 및 다른 비-세포 내 섭취 세포 형질 감염으로부터 치료용 엑소좀(exosome)을 생성하는 방법 - Google Patents
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Abstract
기능성 핵산과 다른 생체 분자들의 다량의 복제본을 포함하는 치료용 세포 외 소포(EV)는 칩 표면에 공여 세포를 놓고, 다양한 플라스미드, 다른 형질 감염 벡터 및 이들의 조합을 칩의 완충액에 첨가하고, 칩 표면 위에 놓인 세포와 칩 표면 아래의 플라스미드/벡터 완충 용액에 펄스형 전기장을 인가하고, 형질 감염된 세포에 의해 분비된 상기 EV를 수집함으로써 대량으로 생산된다. 칩 표면에는 3차원(3D) 나노 채널 전기 천공(NEP) 바이오칩이 형성되어 공여 세포를 대량으로 처리할 수 있다. 완충액은 플라스미드 및 다른 형질 감염 벡터를 수용하기에 적합하다.
Description
본 발명은 공여 세포(donor cell) 내부로 DNA 플라스미스(plasmid)와 다른 벡터(vector)를 비-내 세포성 전달하여 치료용 세포 외 소포(EVs), 특히 기능성 메신저 RNAs(mRNAs), 마이크로 RNAs(miRs), 짧은 헤어핀 RNA(shRNAs), 단백질 및 기타 생체 분자를 포함하는 엑소좀을 생성하는 방법에 관한 것으로, 전달에 의해 야기된 강한 자극이 공여 세포가 세포 내에서 다수의 소포를 생성하도록 유발하는 반면, DNA 플라스미스와 다른 벡터의 비-세포 내 섭취 전달은 세포질 내에서 RNA의 빠른 전사와 단백질의 번역을 이끌고, 이러한 기능성 생체 분자는 공여 세포로부터 EV로 분비되기 전에 내생적으로 소포에 캡슐화되는 방법에 관한 것이다.
엑소좀, 미세소포 및 다른 소포들을 포함하는 세포 외 소포(EVs)는 수많은 유형의 세포에 의해 분비된다. 인체에는 1mL 혈액에 10의 12승 보다 많은 EV가 있으며 다양한 체액에도 존재한다. 엑소좀은 나노 소포(40-150nm)인 반면, 미세 소포의 크기는 100nm에서 1미크론(micron)까지 다양하다. 그들은 번역 RNA 및 비번역 RNA 및 이들의 단편, DNA 단편, 단백질 및 생체 분자와 관련된 다른 세포들을 포함한다. EV 및 이들을 포함한 생체 분자는 질병 진단을 위한 바이오 마커(biomarker)로 제안되어왔다. 게다가 EV는 종양 미세 환경 및 순환에서 세포-세포 간 통신에 중요한 역할을 한다.
또한, 기능성 RNA 및 단백질이 탑재된 EV는 치료적 적용을 위한 약물 및 약물 운반체로서 제안되어 왔다. 시험관 내와 생체 내에서 조직 또는 세포 유형을 표적화하기 위해 특정 핵산 및/또는 단백질을 전달하는 것은 내인성 또는 외인성 치료 화물을 둘 다 갖는 EV를 생산할 수 있는 방법을 필요로 한다.
최근에 기존 벌크 전기천공법(BEP; bulk electroporation)에 의해 기존재하는 엑소좀에 외인성 짧은 간섭 RNA(siRNA)와 shRNA 플라스미드의 사후 삽입이 개발되었다. 비록 이들의 치료 기능이 암과 비암 질환에 대한 몇몇 마우스 모델에서 성공적으로 입증되었지만, 이 접근법은 많은 한계에 직면하고 있다. 첫째, 나노 크기의 엑소좀에 있는 DNA 플라스미드, mRNA 및 단백질과 같은 큰 생체 분자의 사후 삽입은 비효율적이다. 둘째, BEP에 의해 생성된 강한 전기장은 많은 엑소좀을 분해하여 치료용 엑소좀의 낮은 수율을 초래한다. 더욱이, mRNA 및 단백질과 같은 많은 큰 생체 분자는 외인적으로 합성되기 어려우며 고가이다.
치료용 RNA 및 단백질 표적을 내생적으로 포함하는 다수의 엑소좀 또는 다른 EV를 생성하기 위해 공여 세포를 DNA 플라스미드 또는 다른 벡터로 형질 주입시키는 새로운 방법이 개발될 수 있다면 매우 바람직할 것이다.
종래의 미국 특허 출원 14/282630에서, 본 발명자들은 우수하게 투여량을 제어하면서 비-세포 내 섭취로 DNA 플라스미드 또는 다른 하전된 미립자와 분자를 개별 세포 내로 전달할 수 있는 나노 채널 전기천공(NEP) 바이오칩을 개발하였다. 여기에서, 우리는 NEP가 기능성 mRNA 및 microRNA 표적의 다량의 복제본을 포함하는 많은 치료용 엑소좀을 생산할 수 있으나, 전술한 사후 삽입 방법으로는 달성할 수 없다는 것을 입증한다. 또한 적절한 세포 자극과 빠른 플라스미드/벡터 전달을 제공할 수만 있다면, NEP 뿐만 아니라, 유전자 총, 마이크로/나노-주사 등과 같은 다른 비-세포 내 섭취 전달 방법은 유사한 성능을 달성할 수 있다.
본 발명은 다수의 소포와 전사된 RNA뿐만 아니라 번역된 단백질이 형질 감염된 세포 내에 형성되도록 하기 위해 DNA 플라스미드와 다른 벡터들이 강한 세포 자극을 통해 비-세포 내 섭취로 공여 세포 내로 전달될 수 있는 새로운 개념 및 방법의 개발에 관한 것이다. 세포는 치료 기능을 갖는 특정 RNA와 단백질 표적을 포함하는 많은 세포 외 소포(EV)를 분비할 것이다.
전술한 개념을 입증하기 위해, 3차원(3D) NEP 바이오칩이 제조되며, 3D NEP 바이오칩은 형질 감염되지 않은 공여 세포로부터 분비된 EV의 엑소좀보다 최대 수 천배의 많은 손상되지 않은 mRNA와 miR 표적들의 다량의 복제본을 포함하는 엑소좀을 포함한 EV를 10 ~ 100배 더 많이 분비하기 위해 미리 지정된 DNA 플라스미드로 많은 공여 세포들을 형질 감염시킬 수 있다.
본 발명의 일부 측면은 기능성 핵산과 다른 생체 분자들의 다량의 복제본을 포함하는 다수의 치료용 세포 외 소포(EV)를 생성하는 방법에 의해 달성될 수 있으며, 이러한 방법은, 3차원(3D) 나노 채널 전기천공(NEP) 바이오칩이 형성된 칩의 표면에 공여 세포를 놓는 단계; 다양한 플라스미드, 다른 형질 감염 벡터 및 이들의 조합을 칩의 완충액에 첨가하는 단계; 칩 표면 위에 놓인 세포와 칩 표면 아래의 플라스미드/벡터 완충 용액에 펄스형 전기장을 인가하여, 세포를 강하게 자극하고 비-세포 내 섭취로 세포 내로 플라스미드/벡터를 전달하는 단계; 및 형질 감염된 세포에 의해 분비된 EV를 수집하는 단계를 포함한다.
이러한 방법 중 일부에서, 나노 채널의 직경은 50 내지 900nm이다.
이러한 방법 중 일부에서, 플라스미드와 벡터는 mRNA, 마이크로 RNA, shRNA 및 다른 RNA를 전사하고, 형질 감염된 세포에서 단백질과 다른 생체 분자의 번역을 유도한다.
상기 방법의 일부 실시 예에서, 형질 감염된 세포에 의해 분비된 EV는 전사된 mRNA, 마이크로 RNA, shRNA, 다른 RNA, 및 번역된 단백질과 다른 생체 분자를 포함한다.
상기 방법의 일부 실시 예에서, 형질 감염된 세포에서 소포 형성 및 세포 외 이입을 촉진하는 열 충격 단백질과 다른 단백질의 발현을 증가시키는 수단이 시스템에 더 포함되고, 상기 수단은 세포의 열 충격 요법, 또는 세포 배양액에 열 충격 단백질의 첨가를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 예에서, 형질 감염된 세포에서 엑소좀 형성을 촉진하는 단백질의 발현을 증가시키는 수단이 시스템에 더 포함되고, 상기 수단은 CD63, CD9 및 다른 DNA 플라스미드의 공동-형질 감염을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 예에서, 다중 DNA 플라스미드 및 다른 벡터는 형질 감염된 세포에 순차적으로 전달되어 RNA/단백질 표적의 공동 국소화 및 EV 분비를 촉진한다.
본 발명의 일부 실시 예에서, DNA 플라스미드, 다른 형질 감염 벡터, RNA, 단백질/펩티드, 소분자 약물과 같은 외인성 생체 분자는 세포의 소포 내에 캡슐화되고 NEP에 의한 공여 세포의 순차적 형질 감염에 의해 치료용 EV를 분비한다. 이러한 경우 중 일부에서, NEP 뿐만 아니라, 빠른 RNA 전사와 단백질 번역을 위한 EV 분비 및 비-세포 내 섭취 플라스미드/벡터 전달을 가능하게 하기 위해 공여 세포에 강력한 자극을 주는 다른 세포 형질 감염 방법들은 유사한 효능을 갖는 치료용 EV를 생성하는데 사용된다. 이러한 경우에서 더 나아가, 다른 세포 형질 감염 방법은 유전자 총 및 마이크로- 또는 나노 주입을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 예에서, 플라스미드 및/또는 다른 벡터는 나노- 또는 마이크론-크기의 금 또는 다른 고체 입자에 묶이고, 상기 입자들은 강한 세포 자극 및 비-세포 내 섭취 플라스미드/벡터 전달을 유발하기 위해 유전자 총을 사용하여 공기 압력 하에서 공여 세포에 주입된다.
본 발명의 일부 실시 예에서, 플라스미드 및/또는 다른 벡터는 나노- 또는 마이크론-크기 팁 어레이(tip array)에 묶이고, 공여 세포는 강한 세포 자극을 유발하고, 공여 세포 내로 비-세포 내 섭취 플라스미스/벡터 전달을 유발하기 위해 상기 팁에 의해 인발된다.
본 발명의 다른 측면은 기능성 핵산과 다른 생체 분자들의 다량의 복제본을 포함하는 다수의 치료용 세포 외 소포(EV)를 생성하는 장치에 의해 수행되며, 상기 장치는 3차원(3D) 나노 채널 전기천공(NEP) 바이오칩을 포함하는 칩 및 상기 칩 위에 형성된 완충액을 포함하고, 완충액은 플라스미드 및 다른 형질 감염 벡터를 수용하기에 적합하다.
본 발명의 다른 측면은 상기 방법 중 어느 하나에 의해 형질 감염된 세포를 포함한다.
본 발명의 많은 실시예는 다음 도면을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 도면의 구성 요소는 반드시 축척대로 도시 된 것은 아니며, 대신 본 발명의 원리를 명확하게 설명하기 위함이다.
도 1은 공여 세포 형질 감염을 위한 3D 나노 채널 전기천공(NEP) 바이오칩의 개략도이며,
도 2는 Yoyo-1 형광 표지된 신경 관련 유전자인 Achaete-Scute Complex Like-1(Ascl1) DNA 플라스미드를 사용하여 형질 감염된 1시간 후 BEP 및 NEP 기반의 세포 형질 감염 비교를 나타낸 것이고,
도 3은 DNA 플라스미드의 유무에 따른 NEP 세포 형질 감염이 리포펙타민(Lipo; Lipoectamine)과 BEP 기반의 세포 형질 감염보다 형질 감염된 쥐 배아 섬유 아세포(MEF)로부터 EV 분비를 훨씬 우수한 성능으로 상당히 자극하는 것을 보여준다. 대조군은 감염되지 않은 MEF 세포를 의미하며; NEP는 DNA 플라스미드로 NEP 세포 형질 감염을 의미하며; NEP-PBS는 PBS 완충제로만 NEP 세포 형질 감염된 것을 의미한다. 사용된 DNA 플라스미드는 Achaete-Scute Complex Like-1(Ascl1), Pou Domain Class 3 Transcession factor 2 (Pou3f2 또는 Brn2) 및 Myelin Transcession Factor 1 Like (Myt1l)가 2/1/1의 무게비율을 이룬다. 이러한 DNA 플라스미드의 혼합물은 공여 세포를 유도 신경세포(iN)로 재프로그래밍하는 것으로 알려져 있고,
도 4는 NEP 형질 감염된 MEF 세포로부터의 EV 분비에 대한 열 충격 단백질 70 (HSP70) 및 열 충격 단백질 90 (HSP90) 억제제의 효과를 보여준다. NEP 형질 감염 후, 세포 배양액은 HSP70 억제제 (VER 155008, 50μM), HSP90 억제제 (NVP-HSP990, 1μM) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 새로운 배지로 교체된다. 배지는 형질 감염 24시간 후에 수집되고, 동적 광 산란(DLS; dynamic light scattering) 각도 측정법으로 EV 수가 검출되고,
도 5는 MEF 세포로부터의 EV 분비에 대한 CD63 DNA 플라스미드의 NEP 형질 감염의 효과를 보여준다. 세포는 NEP에 의한 CD63 플라스미드의 유무에 따라 형질 감염되었다. 세포 배양 배지는 4시간마다 수집되고 새로운 배지로 교체되었다. EV 번호는 DLS 각도 측정법으로 검출되었고,
도 6은 세포 형질 감염 24시간 후 NEP 배양 유무에 따라 DLS에 의해 측정된 EV의 크기 분포를 나타내며,
도 7은 형질 감염 24시간 후에 다양한 기술을 사용하여 2/1/1의 비로 Ascl1/Brn2/Myt1l DNA 플라스미드에 의해 형질 감염된 MEF 세포로부터 qRT-PCR에 의해 결정된 EV Ascl1 mRNA 발현을 나타내고,
도 8은 형질 감염 24시간 후에 다양한 기술을 사용하여 2/1/1의 비로 Ascl1/Brn2/Myt1l DNA 플라스미드에 의해 형질 감염된 MEF 세포로부터 qRT-PCR에 의해 결정된 EV Brn2 mRNA 발현을 나타내고;
도 9는 형질 감염 24시간 후에 다양한 기술을 사용하여 2/1/1의 비율로 Ascl1/Brn2/Myt1l DNA 플라스미드에 의해 형질 감염된 MEF 세포로부터 qRT-PCR에 의해 결정된 EV Myt1l mRNA 발현을 나타내며,
도 10은 오직 NEP에 의해 수득된 EV만이 시험관 내 번역에 의해 결정된 기능성 mRNA를 포함하는 것을 보여주고,
도 11은 NEP로부터의 EV-mRNA가 미세소포가 아닌 엑소좀에서 발견됨을 보여주며,
도 12는 NEP 세포 형질 감염으로부터 미세소포-RNA가 아닌 엑소좀-mRNA가 단백질을 번역할 수 있음을 보여주고,
도 13은 NEP 형질 감염된 MEF 세포로부터의 EV-mRNA 분비 모습을 보여주고,
도 14는 패치 클램프(patch clamp)에 의한 활동 전위 검출은 NEP로부터 수득된 EV를 포함하는 Ascl1/Brn2/Myt1l mRNA를 통해 격일 단위로 형질 감염된 MEF 세포가 24일 후에 기능적 유도 신경세포(iN)로 재프로그래밍될 수 있음을 보여주며,
도 15는 형질 감염 24시간 후에 다양한 기술을 사용하여 miR-128 DNA 플라스미드에 의해 형질 감염된 MEF 세포로부터 qRT-PCR에 의해 결정된 EV miR-128 발현을 나타내고,
도 16은 MEF 세포에서 DNA 플라스미드의 NEP 형질 감염에 의한 miR-128을 포함하는 분비된 EV와 BEP 사후 삽입에 의해 사전 수집된 miR-128로 로딩된 기존 EV에 대한 비교이고,
도 17은 MEF 세포에서 DNA 플라스미드의 NEP 형질 감염에 의한 Brn2 mRNA를 포함하는 분비된 EV와 BEP 사후 삽입에 의해 사전 수집된 Brn2 mRNA로 로딩된 기존 EV를 비교한 것이며,
도 18은 순차적-NEP에 의해 동일한 EV에서 증가된 mRNA 공동 국소화를 보여준다. NEP 형질 감염을 위해, Ascl1, Brn2 및 Myt1l 플라스미드를 전술한 것처럼 동시에 형질 감염시켰다. 순차적-NEP를 위해, Myt1l 플라스미드를 먼저 형질 감염시키고, Brn2 플라스미드는 4시간 후에 형질 감염시킨 반면, Ascl1 플라스미드는 Brn2 형질 감염 4시간 후에 형질 감염시켰다. Myt1l 형질 감염 24시간 후에, TLN 분석을 위해 배양 배지는 수집되었다. EV-mRNA을 검출하기 위해 동일한 양의 FAM-Ascl1, Cy3-Brn2 및 Cy5-Myt1l MB는 묶인 지질 유전자 결합체 나노 입자에 캡슐화되었다. 노란색 화살표: 3 mRNA를 포함하는 EV; 파란색 화살표: 2 mRNA를 포함하는 EV; 및 분홍색 화살표: 1 mRNA를 포함하는 EV를 도시한다.
도 1은 공여 세포 형질 감염을 위한 3D 나노 채널 전기천공(NEP) 바이오칩의 개략도이며,
도 2는 Yoyo-1 형광 표지된 신경 관련 유전자인 Achaete-Scute Complex Like-1(Ascl1) DNA 플라스미드를 사용하여 형질 감염된 1시간 후 BEP 및 NEP 기반의 세포 형질 감염 비교를 나타낸 것이고,
도 3은 DNA 플라스미드의 유무에 따른 NEP 세포 형질 감염이 리포펙타민(Lipo; Lipoectamine)과 BEP 기반의 세포 형질 감염보다 형질 감염된 쥐 배아 섬유 아세포(MEF)로부터 EV 분비를 훨씬 우수한 성능으로 상당히 자극하는 것을 보여준다. 대조군은 감염되지 않은 MEF 세포를 의미하며; NEP는 DNA 플라스미드로 NEP 세포 형질 감염을 의미하며; NEP-PBS는 PBS 완충제로만 NEP 세포 형질 감염된 것을 의미한다. 사용된 DNA 플라스미드는 Achaete-Scute Complex Like-1(Ascl1), Pou Domain Class 3 Transcession factor 2 (Pou3f2 또는 Brn2) 및 Myelin Transcession Factor 1 Like (Myt1l)가 2/1/1의 무게비율을 이룬다. 이러한 DNA 플라스미드의 혼합물은 공여 세포를 유도 신경세포(iN)로 재프로그래밍하는 것으로 알려져 있고,
도 4는 NEP 형질 감염된 MEF 세포로부터의 EV 분비에 대한 열 충격 단백질 70 (HSP70) 및 열 충격 단백질 90 (HSP90) 억제제의 효과를 보여준다. NEP 형질 감염 후, 세포 배양액은 HSP70 억제제 (VER 155008, 50μM), HSP90 억제제 (NVP-HSP990, 1μM) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 새로운 배지로 교체된다. 배지는 형질 감염 24시간 후에 수집되고, 동적 광 산란(DLS; dynamic light scattering) 각도 측정법으로 EV 수가 검출되고,
도 5는 MEF 세포로부터의 EV 분비에 대한 CD63 DNA 플라스미드의 NEP 형질 감염의 효과를 보여준다. 세포는 NEP에 의한 CD63 플라스미드의 유무에 따라 형질 감염되었다. 세포 배양 배지는 4시간마다 수집되고 새로운 배지로 교체되었다. EV 번호는 DLS 각도 측정법으로 검출되었고,
도 6은 세포 형질 감염 24시간 후 NEP 배양 유무에 따라 DLS에 의해 측정된 EV의 크기 분포를 나타내며,
도 7은 형질 감염 24시간 후에 다양한 기술을 사용하여 2/1/1의 비로 Ascl1/Brn2/Myt1l DNA 플라스미드에 의해 형질 감염된 MEF 세포로부터 qRT-PCR에 의해 결정된 EV Ascl1 mRNA 발현을 나타내고,
도 8은 형질 감염 24시간 후에 다양한 기술을 사용하여 2/1/1의 비로 Ascl1/Brn2/Myt1l DNA 플라스미드에 의해 형질 감염된 MEF 세포로부터 qRT-PCR에 의해 결정된 EV Brn2 mRNA 발현을 나타내고;
도 9는 형질 감염 24시간 후에 다양한 기술을 사용하여 2/1/1의 비율로 Ascl1/Brn2/Myt1l DNA 플라스미드에 의해 형질 감염된 MEF 세포로부터 qRT-PCR에 의해 결정된 EV Myt1l mRNA 발현을 나타내며,
도 10은 오직 NEP에 의해 수득된 EV만이 시험관 내 번역에 의해 결정된 기능성 mRNA를 포함하는 것을 보여주고,
도 11은 NEP로부터의 EV-mRNA가 미세소포가 아닌 엑소좀에서 발견됨을 보여주며,
도 12는 NEP 세포 형질 감염으로부터 미세소포-RNA가 아닌 엑소좀-mRNA가 단백질을 번역할 수 있음을 보여주고,
도 13은 NEP 형질 감염된 MEF 세포로부터의 EV-mRNA 분비 모습을 보여주고,
도 14는 패치 클램프(patch clamp)에 의한 활동 전위 검출은 NEP로부터 수득된 EV를 포함하는 Ascl1/Brn2/Myt1l mRNA를 통해 격일 단위로 형질 감염된 MEF 세포가 24일 후에 기능적 유도 신경세포(iN)로 재프로그래밍될 수 있음을 보여주며,
도 15는 형질 감염 24시간 후에 다양한 기술을 사용하여 miR-128 DNA 플라스미드에 의해 형질 감염된 MEF 세포로부터 qRT-PCR에 의해 결정된 EV miR-128 발현을 나타내고,
도 16은 MEF 세포에서 DNA 플라스미드의 NEP 형질 감염에 의한 miR-128을 포함하는 분비된 EV와 BEP 사후 삽입에 의해 사전 수집된 miR-128로 로딩된 기존 EV에 대한 비교이고,
도 17은 MEF 세포에서 DNA 플라스미드의 NEP 형질 감염에 의한 Brn2 mRNA를 포함하는 분비된 EV와 BEP 사후 삽입에 의해 사전 수집된 Brn2 mRNA로 로딩된 기존 EV를 비교한 것이며,
도 18은 순차적-NEP에 의해 동일한 EV에서 증가된 mRNA 공동 국소화를 보여준다. NEP 형질 감염을 위해, Ascl1, Brn2 및 Myt1l 플라스미드를 전술한 것처럼 동시에 형질 감염시켰다. 순차적-NEP를 위해, Myt1l 플라스미드를 먼저 형질 감염시키고, Brn2 플라스미드는 4시간 후에 형질 감염시킨 반면, Ascl1 플라스미드는 Brn2 형질 감염 4시간 후에 형질 감염시켰다. Myt1l 형질 감염 24시간 후에, TLN 분석을 위해 배양 배지는 수집되었다. EV-mRNA을 검출하기 위해 동일한 양의 FAM-Ascl1, Cy3-Brn2 및 Cy5-Myt1l MB는 묶인 지질 유전자 결합체 나노 입자에 캡슐화되었다. 노란색 화살표: 3 mRNA를 포함하는 EV; 파란색 화살표: 2 mRNA를 포함하는 EV; 및 분홍색 화살표: 1 mRNA를 포함하는 EV를 도시한다.
실시예 1- 3D NEP 바이오칩 개략도 및 상이한 형질 감염 방법을 사용한 EV 분비 및 EV mRNA 함량 비교.
도 1은 칩 표면에 놓인 단일 층의 공여 세포를 갖는 3D NEP 바이오칩의 개략도를 도시한다. 밤새 세포 배양 후, PBS 완충액에 미리 로딩된 DNA 플라스미드는 나노 채널에 걸쳐 220 볼트 전기장을 사용하는 나노 채널을 통해 개별 공여 세포에 주입된다. 전압 레벨, 펄스(pulse) 수 및 펄스 길이와 같은 다양한 전기천공 조건이 선택될 수 있다.
Yoyo-1 형광 염료로 표지된 Achaete-Scute Complex Like-1(Ascl1) DNA 플라스미드를 사용하여, 도 2는 488 nm의 파장에서 BEP 또는 NEP에 의한 형질 감염 1시간 후에 형광 현미경을 사용하여 이미지화 된 형질 감염된 세포를 보여준다. 형광 세기는 NIS 소프트웨어에 의해 계산된다. 이러한 두 그룹에서의 형광 세기 비교는 막대 차트로 나타난다. 결과는 제조업체가 권장하는 최상의 조건에서 BEP가 5개의 10ms 펄스로 220V에서의 NEP보다 거의 3배 더 많은 플라스미드를 MEF 세포에 전달할 수 있음을 보여준다. 그러나, 대부분의 플라스미드는 BEP 형질 감염 1시간 후에도 여전히 세포 표면에 근접한 반면, NEP에 의해 주사된 플라스미드는 이미 동시에 세포질 내에서 균일하게 확산된다. 이는 BEP 기반의 세포 형질 감염이 주로 전기천공-매개성 세포 내 섭취에 의존하는 반면, NEP 기반 세포 형질 감염은 비-세포 내 섭취임을 의미한다.
도 3은 리포펙타민(Lipo)과 BEP 또는 NEP에 의해 2/1/1의 비율로 Ascl1/Brn2/Myt1l DNA 플라스미드로 형질 감염된 동일한 수의 MEF 세포(5E6 세포)로부터 분비된 EV 수를 비교한다. 형질 감염 24시간 후의 세포 배양 배지로부터 모든 EV가 수집되고, 총 EV 수는 나노 입자 분석기(NanoSightTM)에 의해 결정된다. BEP의 경우, 형질 감염 전압은 하나의 30ms 펄스에서 1250v이다. NEP의 경우, 형질 감염 전압은 5개의 10ms 펄스에서 220v이다. 사용된 플라스미드의 농도는 Ascl1/Brn2/Myt1 = 200/100/100 ng/㎕이다. 리포펙타민 형질 감염의 경우, 제조업자의 지시에 따라 5㎍ 플라스미드 혼합물(Ascl1/Brn2/Myt1l = 2/1/1)이 사용되었다. EV는 1500g에서 10분 동안 단순 원심 분리하여 세포 배양 배지로부터 수집되었다. 결과는 리포펙타민(Lipo) 기반의 세포 형질 감염이 EV 분비를 변화시키지 않는 것으로 나타난다. EV 농도는 형질 감염의 유무에 관계없이 약 2E9/ml이다. 분명히, 나노 입자 운반체에 의한 느린 플라스미드 엔도시토시스 과정은 형질 감염된 세포를 많이 자극하지 않았으며, 결과적으로 EV 분비에는 거의 변화가 없다. 이에 비해, BEP 기반 세포 형질 감염은 최대 6E9/ml로 더 많은 EV 분비를 유도한다. 플라스미드를 첨가하거나 첨가하지 않은 NEP 세포 형질 감염에 의해 EV 분비는 1.3E11/ml으로 엄청난 증가를 보임이 관찰되었다. 이는 형질 감염된 세포가 BEP에 의해서는 다소 자극되었지만, NEP에 의한 강한 자극은 상당한 EV의 증가를 야기함을 의미한다.
전기천공을 하는 동안, 인가된 전기장에 의해 야기된 저항 발열은 세포 온도를 잠정적으로 증가시켜 형질 감염된 세포에 열 충격을 일으킬 수 있다. 열충격은 세포에서 열충격 단백질의 증가로 인한 샤페론(chaperone) 매개성 오토파지(autophage)로 인해 EV의 세포 분비를 증가시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(8-10). 실제로, NEP가 형질 감염되지 않은 MEF 세포(Ctrl)에 비교하여 형질 감염된 MEF 세포에서 열 충격 단백질 70(HSP70)은 13.8배 발현이 증가하고 열 충격 단백질 90(HSP90)은 4.2배 발현이 증가하여, 두 단백질 모두의 발현이 실질적으로 증가될 수 있음이 발견되었다. 전기천공 후 세포 배양 배지에 HSP 억제제가 첨가될 때, EV 분비가 억제될 수 있다. 도 4는 HSP 70 억제제(VER 155008,, 50μM), HSP 90 억제제(NVP-HSP990, 1μM) 및 이들의 혼합물에 의해 NEP 형질 감염된 MEF 세포의 EV 분비가 각각 50%, 40% 및 70% 감소되는 것을 보여준다. 여기서, 세포 배양액은 NEP 형질 감염 직후 HSP 70 억제제(VER 155008), HSP 90 억제제(NVP-HSP990) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 새로운 배지로 교체된다. 형질 감염 24시간 후에 배지를 수집하고, 동적 광 산란(DLS) 각도 측정법으로 EV 수가 검출된다. 이러한 결과는 열 충격 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는 임의의 세포 자극이 EV 분비를 향상시킬 것이라는 것을 암시한다.
이와 유사하게, 세포에서 후기 엔도솜 다중 소포체(MVB; multi-vescular body) 형성에 필요한 단백질의 증가는 또한 엑소좀 분비를 향상시킬 수 있다. 도 5는 MEF 세포로부터 EV 분비에 대한 CD63 DNA 플라스미드의 NEP 형질 감염의 효과를 보여준다. 세포는 CD63 DNA 플라스미드가 있는 경우와 없는 경우 NEP로 형질 감염되었다. 세포 배양 배지는 4시간마다 수집되어 새로운 배지로 교체되었다. EV 번호는 DLS 각도 측정법에 의해 검출되었다. 결과는 두 경우 모두 NEP 형질 감염 후 처음 16시간 동안 유사한 EV 분비 양상을 보여준다. 그러나, CD63 DNA 플라스미드로 NEP 형질 감염 후 16 내지 44시간 사이에 더 많은 EV가 분비되었다. CD63 단백질은 엑소좀 분비의 전구체인 테트라스파닌(tetraspanin) 집적된 마이크로도메인(microdomain)으로 엔도솜 막을 재구성하는데 필수적이다.
도 6은 MEF (대조군) 및 NEP 형질 감염된 MEF에 대한 DLS 각도 측정법에 의해 측정된 EV 크기 분포를 도시한다. NEP 자극은 더 큰 EV(주로 미세소포) 분포를 크게 변화시키지 않았지만, 40 내지 110nm 범위의 크기를 갖는 엑소좀의 분비를 실질적으로 증가시켰다.
도 8 내지 9는 Ascl1, Brn2 및 Myt1l DNA 플라스미드의 NEP 세포 형질 감염으로부터 분비된 EV가 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하도록 결정된 바와 같이 상당량의 Ascl1, Brn2 및 Myt1l mRNAs 또는 그것들의 파편을 포함하고 있음을 보여준다. EV 번호와 마찬가지로, 리포펙타민(Lipo) 기반의 세포 형질 감염은 mRNA 발현을 크게 변화시키지 않았지만, BEP 기반의 세포 형질 감염은 mRNA 발현을 수 배 증가시킬 수 있었다. 이에 비해, NEP 기반 세포 형질 감염은 수천 배의 표적 mRNA의 증가를 초래했다. 여기서, 동일한 양의 총 RNA가 획득되고, 제조업자의 지시에 따라 qRT-PCR에 의한 역전사가 수행되었다.
도 10은 일부 EV mRNA가 Ascl1, Brn2 및 Myt11 단백질을 번역할 수 있으므로 온전하고 기능적임을 보여준다. 여기에서, 제조사의 지시에 따라 각각의 형질 감염 방법으로부터의 동일한 양의 총 RNA(1㎍)를 토끼 망상 적혈구 용해 시스템(Promega)을 이용하여 시험관 내 단백질 번역에 적용하였다. 샘플은 SDS-PAGE에 의해 분리되었고 단백질은 웨스턴 블로팅 플롯(western blotting plot)에 나타낸 바와 같이 다양한 항체로 검출되었다.
수집된 전체 EV에 대해, 큰 미세소포는 30분 동안 10,000g에서 초원심분리에 의해 분류되었다. 작은 엑소좀을 수집하기 위해 상층액은 2시간 동안 100,000g에서 추가로 원심 분리되었다. 전술한 바와 같이 이 두 부분으로부터 총 RNA가 수집되었다. 총 mRNA 농도는 NanodropTM에 의해 측정되었고, Ascl1, Brn2 및 Myt11 mRNA의 ABM 발현은 qRT-PCR에 의해 측정되었다. 도 11은 RNA가 미세소포에서보다 엑소좀에서 2배 이상의 존재하지만, 대부분의 Ascl1, Brn2 및 Myt11 mRNA는 오직 엑소좀에서만 나타나는 것을 보여준다. 도 12는 또한 기능성 Ascl1, Brn2 및 Myt11 mRNA가 엑소좀에서 나타나고, 이 엑소좀은 전형적인 엑소좀 단백질 표지자인 CD9, CD63 및 Tsg101을 보유한다는 것을 보여준다. 이에 비해, 큰 미세소포는 전형적인 단백질 표지자인 Arf6을 지닌다.
도 13은 Ascl1, Brn2 및 Myt11 DNA 플라스미드로 NEP 형질 감염된 후의 시간 함수로서 EV 분비 및 함량 모습을 보여준다. Ascl1 플라스미드는 3개 중에서 가장 작은 것(7k bp)이며, Myt1l 플라스미드가 가장 크고(9k bp) Brn2 플라스미드는 중간(8k bp)이다. 세포 배양 배지의 EV는 지정된 시점에서 수집되었고, 배양 배지는 새로운 배지로 교체되었다. EV 번호는 DLS 각도 측정법에 의해 검출되는 반면, EV mRNA 발현은 전술한 바와 같이 qRT-PCR에 의해 검출되었다. 결과는 형질 감염 후 4시간 내에 EV 분비의 빠른 증가를 보였고, 24시간 이상 동안 연속적인 EV 분비하며 8시간에서 정점을 찍었다. Ascl1 및 Brn2 mRNA를 포함하는 EV는 또한 형질 감염 후 4시간 이내에 EV 분비 모습과 잘 일치하는 모습을 보인다. Myt11 mRNA를 포함하는 EV는 나중에 나타났지만, 그러나 여전히 24시간 이내에 나타났다. 이는 EV 분비 시간 및 mRNA 전사 시간은 NEP 기반의 세포 형질 감염에 의한 세포에서 매칭되어야 함을 의미한다.
내인성 mRNA를 포함하는 NEP로 생성된 EV가 치료 기능을 가지는 것을 입증하기 위해, 우리는 100,000 세포 당 1㎍의 총 EV RNA 농도로 MEF 세포를 이틀마다 EV로 처리하였다. 며칠 후, 처리된 MEF 세포는 뉴런-유사 형태를 나타내기 시작했고, 도 14에 나타낸 바와 같이 24일째, 처리된 세포는 유도된 활동 전위를 수용력에 의해 입증된 전기 생리학적 활성을 나타냈다. 이에 비해, 또한 NEP-형질 감염된 MEF 세포는 21일에 유사한 전기 생리학적 활성을 나타냈다. 세포는 활동 전위를 발생시키는데 필요한 전압 게이트 전류를 나타냈다. 탈분극 전압 시뮬레이션에 응답하여 과도 내부 전류 및 지속 외향 전류가 모두 관찰되었다. 도 14는 20pA 전류 주입에 대한 전형적인 반응을 도시하며, 세포가 탈분극 전류에 반응하여 발생되는 활동 전위를 나타낸다.
전세포 패치 클램프 기록법을 사용하여 흥분성을 측정했다. 세포는 115mM NaCl, 2mM KCl, 1.5mM MgCl2, 3mM CaCl2, 10mM HEPES 및 10mM Glucose(pH 7.4)를 포함하는 세포 외 배스용액에 지속적으로 과융해되었다. 유리 전극(3-4MΩ)은 115mM K-gluconate, 10mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-Ethanesulfonic Acid(HEPES), 4mM NaCl, 0.5mM ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA), 1.5mM MgCl2, (pH 7.3)를 포함하는 피펫 용액으로 채워졌다. 세포는 전세포 접근이 확보된 후 패치 저항이 100MOhm에 달했고, 직렬 저항은 40-50% 보상되었다. 데이터는 Axopatch 200B 증폭기, Digidata 1322A 디지털화 장치 및 Clampex 9 소프트웨어(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 수집되었다. 전압-게이팅된 전류의 분석을 위해, 기저 유지 전위는 -70mV이고, 세포는 400ms 동안 -120mV에서 80mV까지 10mV 단위로 단계적으로 상승했다. 전압-게이팅 된 나트륨 채널의 활성으로 인한 과도 내부 전류는 피크 진폭 측정에서 격리되었다. 전압-게이팅 된 칼륨 전류를 반영한 일관된 플래토 전류(plateau currents)는 전류의 고조기에서 전압 단계의 마지막 50ms의 평균으로 측정되었다. 활동 전위 유도는 전류 클램프를 사용하여 측정되었다. 전류를 0pA로 유지되다가 1초 동안 20pA 간격으로 상승했다.
실시 예 2 : 상이한 형질 감염 방법을 사용한 EV MicroRNA 함량.
보다 광범위한 치료적 적용성을 입증하기 위해, 또한 본 출원인은 세포에서 마이크로 RNA 표적을 전사하는 DNA 플라스미드로 MEF 세포를 형질 감염시켰다. 도 15는 다양한 기술에 의해 형질 감염(miR-128 플라스미드) 24시간 후에 세포 배양 배지로부터 수확된 EV에 대한 EV miR-128 발현을 나타낸다. 총 RNA는 제조업체의 지시에 따라 획득되었다. 동일한 양의 총 RNA(30ng)가 전술한 절차를 이용하여 qRT-PCR에 의한 miR-12를 검출하는데 사용되었다. 다시, NEP 기반 형질 감염은 BEP 또는 리포펙타민 기반 세포 형질 감염으로는 달성할 수 없는 다량의 miR-128(4,500배 이상 증가)을 포함하는 EV를 생성할 수 있다.
실시 예 3 : MEF 세포에서 DNA 플라스미드의 NEP 형질 감염에 의한 내인성 RNA를 포함하는 EV와 BEP 사후 삽입에 의해 사전 수집된 RNA가 로딩된 기존 EV의 비교.
여기에서, 우리는 우리의 NEP 기반 세포 형질 감염과 여러 연구원에 의해 사용되는 BEP 사후 삽입 접근 방식을 사용하여 치료용 EV를 생산하는 효능을 비교했다. 전자의 경우, 전술한 절차에 따라 miR-128을 포함하는 EV를 생성하기 위해서 miR-128 플라스미드는 CDE-GFP 플라스미드와 함께 NEP에 의한 MEF 세포로 공동 형질 감염되었다. 후자의 경우, 블랭크 EV는 NEP한 지 24시간 후에 CD63-GFP 플라스미드로 형질 감염된 MEF 세포로부터 먼저 수확되었다. 이와 동시에, miR-128은 NEP에 의해 형질 감염된 지 24시간 후에 miR-128 플라스미드로 형질 감염된 MEF 세포로부터 수집되었다. 수집된 miR-128(1㎍)을 블랭크 EV(10E6)와 혼합하고 다른 연구자들이 사용하는 조건(1250V, 30ms)에 따라 BEP로 전기 천공시켰다. 두 가지 접근 방식의 EV는 전반사형광(TIRF; total internal reflection fluorescence) 현미경에 연결된 리포플렉스 나노입자 (TLN; tethered lipoplex nanoparticle) 바이오칩을 사용하여 시험되었다. 도 16A는 TLN-TIRF 분석 회로도(2, 11)를 나타낸다. 간략하게, RNA 표적을 위한 분자비콘(MB)은 양이온성 리포솜 나노 입자로 설계되고 캡슐화된다. 이들 양이온성 리포플렉스(lipoplex) 나노 입자는 유리 슬라이드 상에 결합되며, 더 큰 나노 규모 복합체를 형성하기 위해 전기 정적 상호 작용에 의해 음으로 하전된 EV를 포착할 수 있다. 리포플렉스-EV 융합은 바이오칩 인터페이스 근처의 나노 스케일 속박 내에서 RNA와 MB의 혼합을 일으킨다. TIRF 현미경은 단일 생체 분자를 검출할 수 있으며 결합된 리포좀 나노 입자가 위치하는 경계면 근처에서 300nm 이하의 신호를 측정한다.
도 16B는 포착된 EV의 대표적인 TLN-TIRF 이미지를 도시한다. 녹색 형광은 CD63-GFP를 포함하는 EV에서 나온 반면, 적색 형광은 포착된 EV에서 miR-128 분자와 Cy5-miR128 MB의 혼성으로부터 나온 것이다. NEP 방식이 BEP 사후 삽입 방식보다 miR-128의 더 많은 복제본을 포함하는 EV를 더 많이 생산할 수 있다는 것은 분명하다. 도 16C 내지 도 16E는 이들 두 접근법의 정량적 비교를 보여준다. 두 방법 모두 miR-128을 포함하는 EV를 생산할 수 있지만(포착된 전체 EV의 ~80%), EV의 EV miR-128 농도(MB 형광 세기의 3배)는 BEP 기반 마이크로 RNA 사후 삽입보다 NEP 기반 직접 세포 형질 감염에서 훨씬 높다. 게다가, BEP 사후 삽입은 블랭크 EV의 거의 절반을 파괴하여 치료용 EV의 매우 낮은 수율을 초래하는 경향이 있다.
miR-128과 동일한 접근법을 사용하여 훨씬 더 큰 RNA, Brn2 mRNA (Brn2 mRNA의 6272염기 대 miR-128의 21염기)에 대해서도 유사한 비교를 실시했다. 그림 17은 우리의 NEP 방법은 Brn2 mRNA를 포함하는 EV를 70% 이상 생성할 수 있음을 보여주는 반면, 극소수의 기존 EV는 동일한 mRNA를 BEP 사후 삽입 방법으로 로딩시킬 수 있음을 보여준다. NEP에서 생산된 EV의 Brn2 mRNA의 농도는 높지만, BEP 사후 삽입에서 생산된 EV의 Brn2 mRNA의 농도는 매우 낮다.
실시 예 4 : MEF 세포에서 DNA 플라스미드의 순차적 NEP 형질 감염에 의해 분비된 동일한 EV에서 공동 국소화된 다수 mRNA의 개량.
도 13은 플라스미드의 크기 차이 또는 다른 이유로 인해 다수의 DNA 플라스미드가 동시에 세포로 전달되더라도, 상이한 mRNA 표적이 형질 감염된 세포에서 상이한 시간 및 속도로 전사될 수 있음을 의미한다. 이는 단지 하나 또는 소수의 mRNA 표적을 포함하는 개별 EV로 이어질 수 있다. 더 나은 치료 효능을 위해, 더 많은 또는 모든 mRNA 표적이 분비된 동일한 EV에 캡슐화될 수 있다면 유용할 것이다. 전사 시간을 기반으로 한 NEP를 사용하여 각각의 DNA 플라스미드를 MEF 세포에 순차적으로 전달함으로써, 도 18은 우리가 iN를 재프로그래밍하는데 필요한 mRNA, Ascl1, Brn2 및 Myt1l(>50% 대 <25%) 3개 모두를 포함하는 분비된 EV를 실질적으로 증가시킬 수 있음을 보여준다. NEP 형질 감염을 위해, 전술한 바와 같이 Ascl1, Brn2 및 Myt1l 플라스미드는 동시에 형질 감염되었다. 순차적-NEP의 경우, Myt1l 플라스미드가 먼저 형질 감염되고, Brn2 플라스미드를 4시간 후에 형질 감염되었으며, Ascl1 플라스미드는 Brn2 형질 감염 후 4시간 후에 형질 감염되었다. Myt1l 형질 감염 24시간 후, TLN 분석을 위해 배양 배지가 수집되었다. EV-mRNA 검출을 위해 동일한 양의 FAM-Ascl1, Cy3-Brn2 및 Cy5-Myt1l MB는 연결된 리포플렉스 나노입자에 캡슐화되었다. 그림에서 노란색 화살표는 3개의 mRNA를 모두 포함하는 EV를 의미하고 파란색 화살표는 2개의 mRNA를 포함하는 EV를 의미하며 분홍색 화살표는 1개의 mRNA만 포함하는 EV를 의미한다.
본 발명은 바람직한 실시 예와 관련하여 설명되었지만, 본 명세서를 읽고 해당 기술 분야의 당업자에게 다양한 변형이 명백한 부분을 포함하는 것으로 이해된다. 그러므로, 본 명세서에 개시된 본 발명은 첨부된 청구 범위에 속하는 그러한 수정을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
Claims (14)
- 기능성 핵산과 다른 생체 분자들의 다량 복제본을 포함하는 다수의 치료용 세포 외 소포(EV)를 생성하는 방법으로서,
3차원(3D) 나노 채널 전기천공(NEP) 바이오칩이 형성된 칩의 표면에 공여 세포를 놓는 단계;
다양한 플라스미드, 다른 형질 감염 벡터 및 이들의 조합을 칩의 완충액에 첨가하는 단계;
칩 표면 위에 놓인 세포 및 칩 표면 아래의 플라스미드/벡터 완충 용액에 펄스형 전기장을 인가하여, 세포를 강하게 자극하고 비-세포 내 섭취 방법으로 세포 내로 플라스미드/벡터를 전달하는 단계; 및
형질 감염된 세포에 의해 분비된 EV를 수집하는 단계를 포함하는 생산 방법. - 제 1 항에 있어서,
나노 채널의 직경은 50 내지 900 nm인 것을 특징으로 하는 생산 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
플라스미드와 벡터는,
mRNA, 마이크로 RNA, shRNA 및 다른 RNA를 전사하고, 형질 감염된 세포에서 단백질과 다른 생체 분자의 번역을 유도하는 것을 특징으로 하는 생산 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
형질 감염된 세포에 의해 분비된 EV는,
전사된 mRNA, 마이크로 RNA, shRNA, 다른 RNA, 및 번역된 단백질과 다른 생체 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
형질 감염된 세포에서 소포 형성 및 세포 외 이입(exocytosis)을 촉진하는 열 충격 단백질과 다른 단백질의 발현을 증가시키는 수단이 시스템에 더 포함되고,
상기 수단은 세포의 열 충격 요법, 또는 세포 배양액에 열 충격 단백질의 첨가를 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
형질 감염된 세포에서 엑소좀 형성을 촉진하는 단백질의 발현을 증가시키는 수단이 시스템에 더 포함되고,
상기 수단은 CD63, CD9 및 다른 DNA 플라스미드의 공동-형질 감염을 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법. - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
다중 DNA 플라스미드 및 다른 벡터는 형질 감염된 세포에 순차적으로 전달되어 RNA/단백질 표적의 공동 국소화 및 EV 분비를 촉진하는 것을 특징으로 하는 생산 방법. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
DNA 플라스미드, 다른 형질 감염 벡터, RNA, 단백질/펩티드, 소분자 약물과 같은 외인성 생체 분자는 세포의 소포 내에 캡슐화되고 NEP에 의한 공여 세포의 순차적 형질 감염에 의해 치료용 EV를 분비하는 것을 특징으로 하는 생산 방법. - 제 8 항에 있어서,
NEP 뿐만 아니라, 빠른 RNA 전사와 단백질 번역을 위한 EV 분비 및 비-세포 내 섭취 플라스미드/벡터 전달을 가능하게 하기 위해 공여 세포에 강력한 자극을 주는 다른 세포 형질 감염 방법들이 유사한 효능을 갖는 치료용 EV를 생성하는 것을 특징으로 하는 생산 방법. - 제 9 항에 있어서,
다른 세포 형질 감염 방법은,
유전자 총, 및 마이크로- 또는 나노 주입을 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법. - 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
플라스미드 및/또는 다른 벡터는 나노- 또는 마이크론-크기의 금 또는 다른 고체 입자에 묶이고, 상기 입자들은 강한 세포 자극 및 비-세포 내 섭취 플라스미드/벡터 전달을 유발하기 위해 유전자 총을 사용하여 공기 압력 하에서 공여 세포에 주입되는 것을 특징으로 하는 생산 방법. - 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
플라스미드 및/또는 다른 벡터는 나노- 또는 마이크론-크기 팁 어레이(tip array)에 묶이고, 공여 세포는 강한 세포 자극을 유발하고, 공여 세포 내로 비-세포 내 섭취 플라스미스/벡터 전달을 유발하기 위해 상기 팁에 의해 인발되는 것을 특징으로 하는 생산 방법. - 기능성 핵산 및 다른 생체 분자들의 다량의 복제본을 포함하는 다수의 치료용 세포 외 소포(EV)를 생성하는 장치로서,
3차원(3D) 나노 채널 전기천공(NEP) 바이오칩을 포함하는 칩 및 상기 칩 위에 형성된 완충액을 포함하여 구성되고, 상기 완충액은 플라스미드 및 다른 형질 감염 벡터를 수용하기에 적합한 것을 특징으로 하는 생산 장치. - 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 방법으로 형질 감염된 세포.
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|---|---|---|---|---|
| WO2022245098A1 (ko) * | 2021-05-18 | 2022-11-24 | 주식회사 바이오솔루션 | 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이를 활용한 면역 항암요법 |
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