KR102202742B1 - 광열 플랫폼을 이용한 살아있는 세포 내로의 고속대량 주입물 전달 - Google Patents

광열 플랫폼을 이용한 살아있는 세포 내로의 고속대량 주입물 전달 Download PDF

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Abstract

살아있는 세포 내로 제제(예, 핵산, 단백질, 유기 분자, 세포소기관, 항체 또는 다른 리간드 등)의 전달 및/또는 상기 세포로부터 이의 추출을 위한 방법, 장치, 및 시스템이 제공된다. 다양한 구현예에서, 살아있는 세포 내로 효율적인 고속대량 주입물 전달을 허용하는 광열 플랫폼 및 이러한 광열 플랫폼을 포함하는 시스템이 제공된다.

Description

광열 플랫폼을 이용한 살아있는 세포 내로의 고속대량 주입물 전달{HIGH-THROUGHPUT CARGO DELIVERY INTO LIVE CELLS USING PHOTOTHERMAL PLATFORMS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2013. 3. 15.에 출원된 USSN 61/799,222의 이익과 우선권을 청구하며, 그 전문이 모든 목적을 위해 참조로 본원에 도입된다.
연방 지원 연구 개발 하에 수행된 발명에 대한 권리 진술
본 발명은 국립 위생 연구소(NIH)에서 수여하는 승인 번호 EB014456 하에 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 대해 일정 권리를 갖는다.
단백질, DNA, RNA, 염색체, 핵 및 무생물 입자, 예컨대 양자점(Quantum dot), 표면 강화 라만 산란(SERS) 입자 및 마이크로비드를 포함하는 광범위한 크기에 걸친 주입물(cargo)을 포유류 세포 내로 전달하는 것은 많은 생물학 분야에서 매우 바람직하다. 전달 방법, 예컨대 세포내 섭취는 주입물을 엔도솜 내에 트랩핑할 수 있고, 여기서 낮은 pH의 미세환경과 용해성 효소가 종종 주입물 분해를 일으킨다(Luo and Saltzman(2000) Nat. Biotechnol . 18: 33-37). 바이러스성 및 화학적 전달 방법은 주입물을 바이러스 내부에 포장하거나 흡수를 증강시키는 화학적 복합체를 형성한다(Naldini et al.(1996) Science, 272: 263-267; Feigner et al.(1987)Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 84: 7413-7417). 그러나 독성, 세포-유형 특이적인 흡수, 및 보다 중요하게는 제한된 주입물 충전능력은 주입물 크기 및 수송 가능한 세포 유형에 대해 상당한 제약을 부여한다(Luo and Saltzman, 상기 문헌).
물리적 수송 방법에는 무작위 분포된 나노수준 세공을 생성하는 방법들인 전기천공(Chu, et al.(1987) Nucleic Acids Res. 15: 1311-1326) 및 음파천공(Mitragotri(2005) Nat. Rev. Drug Discovery, 4: 255-260), 및 레이저 초점 부위에서 세포막 상에 세공을 생성하는 방법인 광천공(Tirlapur and Konig(2002) Nature, 418: 290-291; Vogel, et al.(2005) Appl . Phys. B: Laser Opt., 81: 1015-1047; Clark et al.(2006) J. Biomed . Opt., 11: 014034)이 포함된다. 작은 주입물은 열 확산 또는 전기장에 의해 이들 세공을 통해 세포 내로 전달된다. 그러나 이러한 방법을 이용한 큰 주입물의 전달은 세공 크기 증가에 따른 느린 주입물 확산 속도 및 세포 활성도 감소로 인해 낮은 효율을 갖는다(Stevenson et al.(2006) Opt. Express, 14: 7125-7133).
미세모세관 주입은 전달을 위해 세포막을 기계적으로 관통하기 위한 예리한 유리 끝(tip)을 이용한다(예, King(2004) Meth . Mo . Biol ., 245: Gene Delivery to Mammalian Cells 1; Humana Press Inc. Totowa , NJ 참고). 그러나 막 관통으로부터 기계적 외상은 세포 활성도를 유지하기 위해 전형적인 피펫 끝을 약 0.5um 지름까지로 제한한다(예, Han et al.(2998) J. Nanomed . Nanotechnol . Biol . Med ., 4: 215-225 참고).
피펫 끝보다 큰 주입물은 피펫 응고 및 주입물 전단으로 인해 주입할 수 없다. 전기천공과 미세모세관 주입을 조합하는 방법인 전기주입은 소분자, 예컨대 RNA 및 플라스미드 DNA의 살아있는 세포 내로의 전달(예, Boudes et al.(208) J. Neurosci. Meth ., 170: 204-211; Kitamura et al.(2008) Nat. Meth ., 5:61-67 등 참고) 및 인공 지질 소포 내로의 박테리아 전달(예, Hurtig and Orwar(2008) Soft Matter, 4: 1515-1520 참고)을 보여주었다. 전기 주입은 전기장을 이용한 세포막 약화에 이어 세포 내로의 온화한 기계적 관통에 의해 일어난다.
단순 지질 보조 미세주입(SLAM) 기법(Laffafian and Hallett(1998) Biophys . J., 75: 2558-2563)에서는 유리 미세모세관의 끝에 합성 지질 분자를 혼입한다. SLAM 마이크로피펫과 세포막의 접촉은 지질 분자가 세포막과 융합하여 주입물 전달을 위해 연속적이고 일시적인 경로를 형성할 수 있도록 한다. 상기 방법은 세포막을 통한 마이크로피펫 끝의 문제가 되는 지그재그식 찌르는 운동을 회피한다. 그러나 주입물 및 세포막의 친지성 상호작용은 세포에서뿐만 아니라 전달 주입물에서와 같이 세포에서 원치 않는 생물학적 효과를 일으킬 수 있어서, 상기 방법은 특정 세포 유형 및 적하 내용물을 제한시킨다.
요약
특정 구현예에서, 살아있는 세포 내로 제제(예, 핵산, 단백질, 유기 분자, 세포소기관, 항체 또는 다른 리간드 등)의 전달 및/또는 상기 세포로부터 이의 추출을 위한 방법, 장치, 및 시스템이 제공된다. 다양한 구현예에서, 살아있는 세포 내로 효율적인 고속대량 주입물 전달을 허용하는 광열 플랫폼 및 이러한 광열 플랫폼을 포함하는 시스템이 제공된다.
다양한 측면에서, 본원에서 고려되는 발명(들)에는 하기 구현예 중 임의의 하나 이상이 포함될 수 있지만, 이에 제한될 필요는 없다:
구현예 1: 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치로서, 상기 장치가, 광학 조사에 노출되는 경우 가열되는 물질의 박막 코팅 상에 침착되게 하는 다공성 막을 포함하며, 상기 박막 코팅은 상기 다공성 막을 포함하는 세공 내에 실질적으로 침착되고, 그리고 상기 다공성 막의 표면에는 상기 코팅이 실질적으로 없는 것인, 장치.
구현예 2: 구현예 1에 있어서, 상기 다공성 막의 평균 세공 크기가 상기 박막의 침착 전에 약 100nm 내지 약 3㎛까지의 범위인 장치.
구현예 3: 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 박막이 금, 은, 티타늄(Ti), TiN, TiCn, 및 TiAlN으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 장치.
구현예 4: 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 박막이 티타늄을 포함하는 장치.
구현예 5: 구현예 1 내지 제4항 중 어느 하나에 있어서, 상기 박막이 약 10nm 내지 약 1㎛까지의 두께 범위인 장치.
구현예 6: 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 다공성 막이 다공성 알루미나(Al2O3) 구조를 포함하는 장치.
구현예 7: 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 다공성 막이 폴리에스테르 막을 포함하는 장치.
구현예 8: 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 다공성 막이 복수의 세포에 접촉되거나 인접하여 배치되는 장치.
구현예 9: 구현예 8에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인 장치.
구현예 10: 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치로서, 상기 장치가, 제1 표면 및 상기 제1 표면 반대쪽의 제2 표면 및 마이크로-오리피스 배열을 포함하는 강성 기재(rigid substrate)로서, 상기 마이크로-오리피스는 상기 기재를 통하여 상기 제1 표면으로부터 상기 제2 표면까지 관통하고, 상기 마이크로-오리피스는 약 10㎛ 미만의 최대 지름을 가지며, 복수의 상기 마이크로-오리피스의 벽 또는 테두리(lip)의 적어도 일부 및/또는 상기 마이크로-오리피스에 인접한 상기 제1 표면 영역은 광학 조사에 노출되는 경우 가열되는 물질의 박막 코팅으로 코팅되는, 강성 기재; 및
상기 제2 표면에 인접하여 배치된 유체 채널 또는 유체 저장소로서, 상기 채널 또는 저장소는 상기 마이크로-오리피스 배열을 포함하는 복수의 마이크로-오리피스와 유체 전달하는, 유체 채널 또는 유체 저장소를 포함하고; 그리고
상기 제1 표면의 겉면은 세포를 수용하며 지지하고/하거나 함유하도록 배치되는 것인, 장치.
구현예 11: 구현예 10에 있어서, 상기 마이크로-오리피스가 약 5㎛ 이하의 최대 지름을 갖는 장치.
구현예 12: 구현예 10에 있어서, 상기 마이크로-오리피스가 약 3㎛ 이하의 최대 지름을 갖는 장치.
구현예 13: 구현예 10 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 강성 기재가 마이크로리소그래피 웨이퍼로 형성되는 장치.
구현예 14: 구현예 10 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 강성 기재가 규소, 석영, 강성 중합체, 및 세라믹으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질로 형성되는 장치.
구현예 15: 구현예 10 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 강성 기재가 규소로 형성되는 장치.
구현예 16: 구현예 10 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 강성 기재에서 상기 제1 표면이 세포를 함유하도록 구성되고 현미경으로 보이도록 배치된 챔버 표면을 포함하는 장치.
구현예 17: 구현예 16에 있어서, 상기 챔버가 개방 최상부(top)를 갖는 장치.
구현예 18: 구현예 16에 있어서, 상기 챔버가 챔버를 밀폐하는 최상부를 갖는 장치.
구현예 19: 구현예 10 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이크로-오리피스 배열이 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 또는 적어도 500 마이크로-오리피스를 포함하는 장치.
구현예 20: 구현예 19에 있어서, 상기 오리피스가 약 2㎠ 이하 또는 약 1.5㎠ 이하, 또는 약 1㎠ 이하, 또는 약 0.5㎠ 이하, 또는 약 0.1㎠ 이하의 상기 표면적 내에 모두 위치하는 장치.
구현예 21: 구현예 10 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 박막이 상기 마이크로-오리피스(들)의 벽의 일부 및/또는 테두리의 일부 상에 침착되는 장치.
구현예 22: 구현예 10 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 박막이 반도체, 금속, 금속 합금, 금속 질화물, 및 금속 산화물로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 장치.
구현예 23: 구현예 22에 있어서, 상기 박막이 전이 금속, 전이 금속 합금, 전이 금속 질화물, 및 전이 금속 산화물로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 장치.
구현예 24: 구현예 22에 있어서, 상기 박막이 금, 은, 티타늄(Ti), TiN, TiCn, 및 TiAlN으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 장치.
구현예 25: 구현예 10 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 유체 채널 또는 챔버 장치가 세포 내로 전달될 시약을 함유하는 장치.
구현예 26: 구현예 25에 있어서, 상기 시약이 핵산, 리보자임, 단백질 또는 펩티드, 효소, 항체, 세포소기관(organelle), 염색체, 병원체, 및 마이크로입자 또는 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 장치.
구현예 27: 구현예 10 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 채널 또는 챔버가 가압되는 장치.
구현예 28: 구현예 27에 있어서, 상기 채널 또는 챔버가 기체압, 펌프 또는 중력 공급에 의해 가압되는 장치.
구현예 29: 구현예 10 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 장치가 도립 현미경 상에서 스테이지를 대체하도록 구성되는 장치.
구현예 30: 구현예 10 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 세포가 상기 제1 표면 상에 배치되는 장치.
구현예 31: 구현예 30에 있어서, 상기 세포가 상기 기재에서 복수의 마이크로-오리피스 상이나 이에 인접하여 배치되는 장치.
구현예 32: 구현예 30 또는 31에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인 장치.
구현예 33: 세포 내로 제제를 전달하는 선택적 개방을 위한 시스템으로서, 상기 시스템이 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 장치; 및/또는
구현예 10 내지 32 중 어느 하나에 따른 장치; 및
상기 박막을 가열할 수 있는 광학 에너지원을 포함하는 것인, 시스템.
구현예 34: 구현예 33에 있어서, 상기 광학 에너지원이 레이저 또는 비간섭성 광원인 시스템.
구현예 35: 구현예 34에 있어서, 상기 광학 에너지원이 레이저인 시스템.
구현예 36: 구현예 33 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 시스템이 상기 제1 표면 또는 상기 다공성 막의 특정 영역으로 상기 광학 에너지를 보내기 위한 렌즈 시스템, 미러 시스템, 및/또는 마스크, 및/또는 위치측정(positioning) 시스템을 포함하는 시스템.
구현예 37: 구현예 33 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 시스템이 상기 제1 표면 또는 상기 다공성 막 상에 광학 에너지를 집중시키도록 구성된 대물 렌즈를 포함하는 시스템.
구현예 38: 구현예 37에 있어서, 상기 시스템이 반파장 판을 포함하는 시스템.
구현예 39: 구현예 37 또는 38에 있어서, 상기 시스템이 편광자를 포함하는 시스템.
구현예 40: 구현예 39에 있어서, 상기 편광자가 편광 빔 분배기(splitter) 큐브를 포함하는 시스템.
구현예 41: 구현예 33 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 시스템이 상기 광학 에너지원에 의한 조명 패턴, 상기 광학 에너지원에 의해 방출되는 광 펄스의 발생 시점, 상기 광학 에너지원에 의해 방출되는 펄스의 발생 주파수, 상기 광학 에너지원에 의해 방출되는 펄스의 파장, 상기 광학 에너지원에 의해 방출되는 펄스의 에너지, 및 상기 광학 에너지원에 의해 방출되는 펄스의 조준 또는 위치 중 적어도 하나를 조정하는 제어기를 포함하는 시스템.
구현예 42: 세포 내로 시약을 전달하는 방법으로서, 상기 방법이 구현예 1 내지 9, 또는 구현예 10 내지 29 중 어느 하나에 따른 장치내에 그리고/또는 구현예 33 내지 41 중 어느 하나에 따른 시스템내에 세포를 제공하는 단계로서, 상기 세포는 상기 제1 표면 상에 배치되거나 상기 다공성 막에 접촉되거나 이에 인접하여 배치되는, 단계;
상기 세포를 상기 시약과 접촉시키는 단계; 및
상기 표면 또는 다공성 막의 영역을 광학 조사에 노출시킴으로써 상기 박막의 가열을 유도하는 단계로서, 상기 가열은 상기 가열 영역이나 근처에서 상기 세포막에 개구부를 도입하는 버블을 형성하여 상기 시약의 이들 세포 내로의 전달을 일으키는, 단계를 포함하는 것인, 방법.
구현예 43: 구현예 42에 있어서, 상기 방법이 상기 다공성 막을 포함하는 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 장치 상이나, 구현예 33 내지 41 중 어느 하나에 따른 시스템에 세포를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 44: 구현예 42 또는 43에 있어서, 상기 세포가 상기 세포 주변의 배양 배지 중에 상기 시약을 제공함으로써 상기 시약과 접촉되는 방법.
구현예 45: 구현예 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 세포가 상기 다공성 막의 최상부 상에 배치되거나 성장되며 그리고 상기 세포에서 또는 그 근처에서 상기 막의 표면이 가열되는 방법.
구현예 46: 구현예 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 세포가 상기 다공성 막의 최상부 상에 배치되거나 성장되며 그리고 상기 세포 반대쪽의 상기 막의 표면이 가열되는 방법.
구현예 47: 구현예 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 세포가 별도 기재 상에 배치되거나 성장되며 그리고 상기 다공성 막이 시약 전달을 위해 상기 세포(들)의 최상부 상에 배치되는 방법.
구현예 48: 구현예 47에 있어서, 상기 별도 기재가 커버슬립, 미세적정 판, 페트리 접시, 및 배양 용기로 구성된 군으로부터 선택되는 물체의 표면을 포함하는 방법.
구현예 49: 구현예 42에 있어서, 상기 방법이 상기 강성 기재를 포함하는 구현예 10 내지 29 중 어느 하나에 따른 장치 상에, 또는 구현예 33 내지 41 중 어느 하나에 따른 시스템 내에 세포를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 50: 구현예 42 또는 49항에 있어서, 상기 세포가 상기 표면에 존재하는 하나 이상의 오리피스에 상기 시약을 제공함으로써 상기 시약과 접촉되는 방법.
구현예 51: 구현예 50에 있어서, 상기 세포가 상기 마이크로-오리피스와 유체 전달하는 챔버 또는 채널에 상기 시약을 제공함으로써 상기 시약과 접촉되는 방법.
구현예 52: 구현예 32 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 노출 단계가 레이저 펄스 또는 비간섭성 광원에 상기 표면 영역을 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
구현예 53: 구현예 32 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 시약이 핵산, 염색체, 단백질, 표지, 세포소기관, 및 유기 소분자로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
구현예 54: 세포 내로 시약을 전달하는 방법으로서, 상기 방법이 나노입자 또는 박막이 실질적으로 부족한 기재 상에 세포를 제공하는 단계;
상기 세포를 상기 시약과 접촉시키는 단계; 및
상기 기재 영역을 광학 조사에 노출시킴으로써 기재의 가열을 유도하는 단계로서, 상기 가열은 가열된 영역이나 그 근처에서 상기 세포막에 개구부를 도입하는 버블을 형성하여 상기 시약의 이들 세포 내로의 전달을 일으키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
구현예 55: 구현예 54에 있어서, 상기 기재가 규소, 석영, 강성 중합체, 금속, 및 세라믹으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질로 형성되는 방법.
구현예 56: 구현예 54에 있어서, 상기 기재가 규소로 형성되는 방법.
구현예 57: 구현예 54 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 기재가 세포를 함유하도록 구성된 챔버 표면을 포함하는 방법.
구현예 58: 구현예 57에 있어서, 상기 기재가 현미경으로 보이도록 배치되는 방법.
구현예 59: 구현예 57 또는 58에 있어서, 상기 챔버가 개방 최상부를 갖는 방법.
구현예 60: 구현예 57 또는 58에 있어서, 상기 챔버가 챔버를 밀폐하는 최상부를 갖는 방법.
구현예 61: 구현예 54 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 시약이 핵산, 리보자임, 단백질 또는 펩티드, 효소, 항체, 세포소기관, 염색체, 병원체, 및 마이크로입자 또는 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
구현예 62: 구현예 54 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 기재가 도립 현미경 상에 위치하도록 구성되거나 스테이지를 대체하도록 구성되는 방법.
정의
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 상호 교환적으로 이용된다. 이 용어는 하나 이상 아미노산 잔기가 천연 생성 아미노산 중합체뿐만 아니라 대응하는 천연 생성 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 이 용어에는 또한 폴리펩티드를 제조하기 위해 아미노산을 연결하는 전통적인 펩티드 결합 상의 변이체가 포함된다. 바람직한 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 그 α 탄소가 펩티드 결합을 통해 연결되는 아미노산 사슬이다. 따라서 사슬의 한 말단(아미노 말단)에서의 말단 아미노산은 자유 아미노기를 갖는 반면, 사슬의 다른 말단(카르복시 말단)에서의 말단 아미노산은 자유 카르복실기를 갖는다. 본원에서 이용되는 용어 "아미노 말단"(N-말단으로 약칭)은 펩티드의 아미노 말단에서 아미노산 상의 자유 α-아미노기 또는 펩티드 내의 임의의 다른 위치에서 아미노산의 α-아미노기(펩티드 결합에 참여하고 있는 경우 이미노기)를 나타낸다. 유사하게, 용어 "카르복시 말단"은 펩티드의 카르복시 말단 상의 자유 카르복실기 또는 펩티드 내의 임의의 다른 위치에서 아미노산의 카르복실기를 나타낸다. 펩티드에는 또한 비제한적으로 펩티드 모사체, 예컨대 아미드 결합에 배치되어 에테르에 의해 연결된 아미노산을 포함하는 본질적으로 임의의 폴리아미노산이 포함된다.
세포 내로 전달될 물질에 대해 사용되는 용어 "시약(들)"에는 세포 내로 전달될(또는 이로부터 추출될) 임의 물질이 포함된다. 이러한 시약에는 비제한적으로 핵산(예를 들어, 벡터 및/또는 발현 카세트, 저해 RNA(예, siRHA, shRNA, miRNA 등), 리보자임, 단백질/펩티드, 효소, 항체, 조영 시약, 세포소기관(예, 핵, 미토콘드리아, 인, 리소좀, 리보솜 등), 염색체, 세포내 병원체, 무생물 입자, 예컨대 양자점, 표면-강화 라만 산란(SERS) 입자, 마이크로비드 등이 포함된다.
도 1a 및 1b는 살아있는 포유류 세포 내로의 고속대량 주입물 전달을 위한 미세제작된 광열 플랫폼의 한 구현예를 도식적으로 예시한다.
도 2는 실리콘 기반 광열 플랫폼의 제작을 위한 공정 유동의 한 구현예를 예시한다.
도 3a 및 3b는 광열 전달 플랫폼을 예시한다. 도 3a: 3㎛ 오리피스 및 50㎛ 채널을 갖는 실리콘 기반 광열 전달 플랫폼. 도 3b: PDMS로 제조된 변형 가능한 막 펌프가 활성 유체 펌핑 및 주입물 전달을 위한 실리콘 기반 광열 플랫폼과 통합되었다.
도 4, 패널 A-C는 시약 전달의 버블 생성을 예시한다. 패널 A: 실리콘 기반 광열 플랫폼 상의 초승달 모양 버블 생성. 패널 B: 플랫폼 상에서 배양된 HeLa 세포 내로의 1㎛ 녹색 형광 마이크로비드의 전달. 패널 C: 여러 1㎛ 녹색 형광 비드를 함유하는 세포의 명시 및 형광 이미지. 더 쉬운 관찰을 위해 전달 후 세포 배양 접시 상에 세포를 재접종하였다.
도 5a는 칩 상에서 세포를 도립시킴으로써 미세제작된 광열 플랫폼을 이용한 병렬 주입물 전달을 위한 하나의 대안적 구성을 예시한다. 세포는 커버슬립(또는 다른 투명한, 평면 기재) 상에서 성장시킬 수 있다. 세포막과 티타늄-코팅된 오리피스의 적절한 접촉을 유지하기 위해 커버슬립 및 실리콘 칩 간에 스페이서를 이용한다. 레이저 펄스화 및 버블 공동화(cavitation)에 의한 세포막 절단 후, 변형 가능한 PDMS 막 펌프를 이용해서 주입물을 세포 내로 밀어넣을 수 있다. 도 5b는 상기 구성을 이용하여 전달된 200nm 형광 마이크로비드를 갖는 유리 커버슬테두리 상에서 배양된 HeLa 세포를 나타낸다.
도 6a 및 6b는 다공성 중합체 막 기반 전달 플랫폼의 한 구현예를 예시한다. 도 6a: 병렬 전달 플랫폼을 트랙-에칭된 폴리에스테르 다공성 막 상에 티타늄 박막을 침착시켜 구현하였다. 경사각으로 펄스화된 레이저 절제를 이용해서 막 표면에서 티타늄 박막을 제거하고 세공 내부의 티타늄을 온전히 놔두었다. 측벽 티타늄은 인접 세포막에서 절단을 일으키기 위해 펄스화된 레이저 여기(excitation) 후 버블 유도 부위로 작용한다. 도 6b: 공동화 버블을 각각 3㎛ 및 1㎛의 평균 세공 지름을 갖는 다공성 막 상에 생성하였다.
도 7, 패널 A-C는 다공성 중합체 막 기반 광열 플랫폼을 이용한 상이한 구성의 주입물 전달을 예시한다. 모든 구성에 대해 형광 덱스트란 전달을 나타내었다. 패널 A: 세포를 다공성 막의 최상부 상에서 키운다. 티타늄 박막 상에 생성된 버블은 전달을 위해 접촉 세포막을 절단한다. 패널 B: 세포를 다공성 막의 최상부 상에서 배양한다. 티타늄 박막을 다공성 막의 반대(저부)쪽에 침착하였다. 레이저 펄스화 시, 버블 공동화는 세공을 통해 유체 유동을 유도하고 일시적으로 세포막을 투과화한다. 패널 C: 세포를 별도 기재(예, 커버슬립, 플라스틱 페트리 접시) 상에 키운다. 티타늄 코팅된 다공성 막을 세포막 천공 및 주입물 전달을 위해 세포 최상부 상에 배치하였다.
도 8, 패널 A: 다공성 중합체 막 기반 광열 플랫폼을 이용하여, GFP 인코딩 플라스미드 DNA를 HeLa 세포에 성공적으로 전달하고 발현시켰다. 도 8, 패널 B: 형광 덱스트란 분자를 고효율로 매트리겔 코팅된 다공성 막 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포(hESC) 콜로니 내로 전달하였다.
도 9는 베어(bare) 실리콘 웨이퍼 기반 전달 플랫폼의 하나의 구현예를 예시한다. 실리콘 웨이퍼는 펄스화된 레이저 광을 흡수하고 실리콘 웨이퍼 표면 상에서 유도된 일시적 가열 및 공동화는 웨이퍼의 최상부 상에서 배양되거나 배치된 세포를 투과화한다. 소분자, 예컨대 칼세인의 고속대량, 병렬 전달을 나타낸 바와 같이 비부착성 Ramos 세포 및 부착성 HeLa 세포에서 보여주었다.
특정 구현예에서, 살아있는 세포 내로 제제(예, 핵산, 단백질, 유기 분자, 세포소기관, 항체 또는 다른 리간드 등)의 전달 및/또는 상기 세포로부터 이의 추출을 위한 방법, 장치, 및 시스템이 제공된다. 다양한 구현예에서, 살아있는 세포 내로 효율적인 고속대량 주입물 전달을 허용하는 광열 플랫폼 및 이러한 광열 플랫폼을 포함하는 시스템이 제공된다.
다양한 구현예에서, 본원에 기재된 광열 플랫폼은 유체 및/또는 표면(또는 이들의 성분 또는 영역)을 가열하고, 이에 따라 신속 팽창하는 "공동화" 버블을 형성하기 위해 광학 에너지원을 이용한다. 특정 이론에 구애받지 하지 않고, 다양한 구현예에서 본원에 기재된 방법, 플랫폼, 및 시스템은 전달을 위해 세포막을 국소적이고 일시적으로 개방하기 위한 버블 공동화에 의해 야기되는 수력학적 및/또는 기계적 힘에 의존한다. 상기 물리적 기전이 광범위한 세포 유형 및 주입물(시약) 유형에 적용될 수 있음이 발견되었다.
추가적으로, 버블 팽창에 의해 제공되는 초고속 세포막 절단은 세포 활성도를 유지하면서 대단한-크기의(super-sized) 주입물 전달, 예컨대 마이크로비드 또는 세포소기관을 위해 세포막에 마이크론-크기의 통로를 개방한다.
미세제작 기법을 이용한 특정 구현예에서, 약 106 초과의 광열 전달 부위를 광열 플랫폼에서 1cm x 1cm의 면적에 걸쳐 구현할 수 있다. 약 106 초과의 세포에 대한 동시 전달을 유효 면적에 걸쳐 단일 광학 에너지(예, 레이저) 펄스를 조명한 뒤 주입물 확산 또는 펌핑에 의해 수 초 내에 수행할 수 있다.
I. 미세제작된 표면-기반 광열 전달 플랫폼.
특정 구현예에서, 미세제작된(예, 에칭된 그리고/또는 침착된) 표면 기반 광열 전달 플랫폼이 제공된다. 도 1은 살아있는 포유류 세포 내로 고속대량 주입물 전달을 위한 실리콘 기반, 미세제작된 광열 플랫폼의 원리를 예시한다. 상기 도에 예시된 바와 같이, 명확한 크기 및 간격을 갖는 마이크로 오리피스의 2D 배열을 제작한다. 전형적으로 마이크로-오리피스는 약 100nm 내지 약 4㎛까지의 크기 범위이다. 특정 구현예에서, 마이크로-오리피스는 약 100nm 또는 약 300nm, 또는 약 500nm, 또는 800nm부터 약 1㎛까지, 또는 약 2㎛까지, 또는 약 3㎛까지, 또는 약 4㎛까지, 또는 약 5㎛까지의 크기 범위이다. 다양한 구현예에서, 마이크로-오리피스 간의 전형적 간격은 약 1㎛ 내지 약 10㎛ 범위이다. 박막은 광학 에너지원에 의해 신속 가열될 수 있는 임의 물질을 포함할 수 있다. 예시적인, 그러나 비제한적인 물질에는 금속, 반도체 등이 포함된다. 특정 구현예에서, 물질은 금, 은, 티타늄(Ti), TiN, TiCn, 및 TiAlN을 포함한다. 다른 금속, 금속 합금, 금속 산화물, 금속 질화물 등도 이용할 수 있다.
고강도 광학 에너지에 노출되는 경우 가열되는 물질로부터 형성되는 박막은 마이크로 오리피스의 내측 및/또는 테두리 상에 침착된다. 다양한 구현예에서, 박막은 약 10nm 내지 1㎛의 두께 범위이다.
광학 에너지원(예, 레이저)을 이용한 펄스화 시, 박막(예, 티타늄 박막)이 가열되고 초승달-모양 증기 버블을 유도한다. 공동화 버블은 인접 세포막을 절단하고 세포의 세포질 내로 주입물 전달을 위한 일시적 통로를 생성한다. 다양한 크기의 주입물을 레이저 펄스화와 동시에 확산 또는 활성 유체 펌핑에 의해 세포 내로 수송할 수 있다.
다양한 구현예에서, 광열 기재를 포함하는 물질은 바람직하게는 세포(들)에 독성이 없고, 박막 코팅을 수반할 수 있고, 표면 및/또는 박막으로 전자기적 에너지(예, 광학 에너지)의 적용에 의해 생성되는 국소 가열을 허용할 수 있는 임의의 편리한 물질로 제작될 수 있다. 적합한 물질에는 비제한적으로 유리/실리콘, 게르마늄, 미네랄(예, 석영), 세라믹, 플라스틱(예, DELRIN®, TEFLON® 등), 금속, 반도체 등이 포함된다.
특정 구현예에서, 기재는 세포 스크리닝 및/또는 세포 배양용으로 이용되는 용기 표면을 포함한다. 여기에는, 예를 들어 부착성 또는 현탁 세포 배양용 용기가 포함될 수 있다. 여기에는 또한 미세적정 판(예, 96, 384, 864, 1536 웰 등), 미세유체 장치, 고밀도(미세배열) 기재, 현미경 슬라이드 또는 챔버 등이 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포 형질주입(transfection) 기재는 반도체 산업에서 공지된 기법을 이용하여 제작된다. 도 2는 실리콘 기반 광열 전달 플랫폼을 제작하기 위한 하나의 공정 유동을 도식적으로 예시한다. SiO2 박막을 실리콘 웨이퍼의 최상부측 및 저부측 상에 침착시켰다. 포토리소그래피 및 건식 에칭을 이용하여, 3 마이크론 홀의 배열이 최상부 산화물층에 한정되었고, 50 내지 100 마이크론의 큰 개구부가 저부 산화물층에 한정되었다. 티타늄 박막을 최상부 산화물층 상으로 침착시켰다. 심부 반응성 이온 에칭을 이용하여, 실리콘 채널을 전체 웨이퍼 두께에 걸쳐 후면으로부터, 최상부 산화물층에서 3 마이크론 홀이 연결된 후 박리(lift-off) 공정에 의해 측벽 티타늄 코팅을 드러낼 때까지 에칭하였다.
예시된 오리피스는 원형이지만, 이렇게 제한될 필요는 없다. 표준 방법(예, 에칭 방법)을 이용하여, 본질적으로 임의의 형태(예, 원형, 사각형, 오각형, 육각형, 타원형, 사다리꼴형, 불규칙형 등)의 오리피스를 생성할 수 있다. 유사하게, 오리피스 패턴화는 본질적으로 임의의 원하는 패턴일 수 있다.
도 3a 및 3b는 3㎛ 오리피스 및 50㎛ 채널을 갖는 하나의 예시적 실리콘 기반 광열 전달 플랫폼을 나타낸다. 큰 주입물의 효율적 전달을 달성하기 위해, 변형 가능한 막 펌프, 이 경우 PDMS로 제조된 것이 활성 유체 펌핑 및 주입물 전달을 위한 실리콘 기반 광열 플랫폼과 통합되었다. 다른 탄성중합체 물질(예, 다양한 플라스틱 및/또는 연성 리소그래피를 위해 이용되는 다른 물질)가 막 펌프를 제작하기 위해 이용될 수 있음이 인식될 것이다.
도 4a는 세포막 절단을 위한 티타늄 박막 상의 레이저 펄스화 후 초승달-모양 버블 생성을 나타낸다. 티타늄 코팅은 50 초과 공정 동안 견고하다. 상기 전달 플랫폼을 이용하여, 1㎛ 폴리스티렌 마이크로스피어만큼 큰 주입물이 고효율로 세포 내로 전달될 수 있다. 도 4b 및 4c는 상기 플랫폼의 1cm x 1cm 면적에 걸친 1㎛ 녹색 형광 마이크로비드의 HeLa 세포 내로의 고속대량 전달을 보여준다.
칩 상에서 세포를 도립시킴으로써 실리콘 기반 광열 플랫폼을 이용한 병렬 전달의 하나의 예시적인 대안적 구성을 도 5a에 예시한다. 세포를 커버슬립(또는 다른 투명한, 바람직하게는 평면 기재) 상에서 성장시킬 수 있다. 세포막과 티타늄-코팅된 오리피스의 적절한 접촉을 유지하기 위해 커버슬립 및 실리콘 칩 간에 스페이서가 이용된다. 레이저 펄스화 및 버블 공동화에 의한 세포막 절단 후, 주입물을 변형 가능한 PDMS 막 펌프(또는 다른 펌핑 시스템)를 이용해서 세포 내로 밀어넣을 수 있다. 도 5b는 상기 구성을 이용해서 전달된 200nm 형광 마이크로비드를 갖는 유리 커버슬테두리 상에서 배양된 HeLa 세포를 나타낸다.
대단한-크기의 주입물 전달, 예컨대 마이크론-크기의 입자, 세포소기관 또는 심지어 박테리아에 대한 특정 구현예에서, 미세제작된 광열 플랫폼은 높은 전달 효율 및 높은 세포 활성도를 달성할 수 있다. 하나의 예시적인, 그러나 비제한적인 구현예에서, 세포를 칩 상에 배양한다. 전달 전에, 주입물을 실리콘 채널을 충전하는 칩의 후면으로부터 적재한다. PDMS 펌프를 구동하여 레이저 펄스화에 의한 세포막 개방 직후 주입물 및 유체를 세포 내로 밀어넣는다.
II. 다공성 중합체 막 기반 전달 플랫폼
특정 구현예에서, 광열 형질주입 플랫폼을 다공성 막을 이용해서 제작한다. 다공성 막은 광범위한 물질(예, 나일론 또는 나일론 메시, 여과막, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 팽창 폴리테트라플루오로에틸렌(ePTFE), 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 팽창 폴리에테르에테르케톤(ePEEK), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 에틸 비닐 아세테이트(EVA), 열가소성 폴리우레탄(TPU), 폴리에테르설폰(PES) 등)로 이용 가능하다. 다양한 구현예에서, 다공성 강성 물질(예, 다공성 세라믹)도 고려된다. 다공성 막은 당분야 숙련가에게 잘 공지되어 있고, 여러 공급원(예, Porex Corp. Fairburn GA 등 참고)에서 다양한 세공 크기로 시판된다.
특정 구현예에서, 박막(예, 상술된 것)을 다공성 막 상에 침착시킨다. 특정 구현예에서, 박막을 세포와 접촉될 표면에서 에칭해서 벗겨내고, 마찬가지로 선택적으로 반대 표면도 벗겨낸다. 따라서 특정 구현예에서, 세포에 접촉된 표면은 실질적으로 박막을 보유하지 않는다.
도 6a는 다공성 중합체 막에서 구현된 병렬 전달 플랫폼을 나타낸다. 티타늄 박막을 트랙-에칭된 폴리에스테르 다공성 막 상에 침착시켰다. 경사각으로 펄스화된 레이저 절제를 이용해서, 막 표면의 티타늄 박막을 제거하여 세공 내부의 티타늄은 온전히 두었다. 측벽 티타늄은 인접 세포막에서 절단을 일으키기 위해 펄스화된 레이저 여기 후 버블 유도 부위로 작용한다.
도 6b는 각각 3㎛ 및 1㎛의 평균 세공 지름을 갖는 다공성 막 상에 생성된 이미지화된 공동화 버블을 나타낸다. 상기 플랫폼의 제작은 단순하고, 중합체 막은 저비용으로 제조되고 1회 이용 후 폐기될 수 있다. 세포막 절단 및 형광 덱스트란 전달을 도 7, 패널 A-C에 나타낸 바와 같이 3 상이한 구성으로 나타내었다. 도 7, 패널 A에 예시된 바와 같이, 세포를 다공성 막의 최상부 상에 침착시키거나 성장시킬 수 있다. 티타늄 박막 상에 생성된 버블은 주입물(예, 세포 주변 배지에 제공되는 주입물) 전달을 위해 접촉 세포막을 절단한다. 도 7, 패널 B에 예시된 바와 같이, 티타늄 박막이 다공성 막의 반대(저부)측에 존재하는(예, 이전에 침착된) 동안, 세포를 다공성 막의 최상부 상에 침착시키거나 배양할 수 있다. 레이저 펄스화 시, 버블 공동화는 세공을 통해 유체 유동을 유도하고 세포막을 일시적으로 투과화한다. 도 7, 패널 C는 세포가 별도 기재(예 유리 커버슬립, 플라스틱 페트리 접시, 배양 용기, 미세적정 판 등) 상에 침착되거나 성장된 구현예를 예시한다. 티타늄 코팅된 다공성 막을 세포막 천공 및 주입물 전달을 위해 세포 최상부 상에 배치하였다. 다공성 중합체 막 기반 광열 플랫폼을 이용해서, GFP 인코딩 플라스미드 DNA를 HeLa 세포에서 성공적으로 전달하고 발현시켰다. 형광 덱스트란 분자를 도 8에 예시된 바와 같이, 고효율로 매트리겔 코팅된 다공성 막 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포(hESC) 콜로니 내로 전달하였다.
다공성 막 플랫폼은 큰 주입물, 예컨대 플라스미드 DNA, RNA 및 단백질의 전달을 위해 매우 적합하는 것이 알게된다.
III. 베어 웨이퍼 기반 전달 플랫폼
침착된 막 또는 나노입자가 없는 기재(예, 베어 웨이퍼)도 광열 전달 기재로 이용될 수 있다는 것은 놀라운 발견이었다. 도 9는 베어 실리콘 웨이퍼 기반 플랫폼을 예시한다. 실리콘 웨이퍼는 펄스화된 레이저 광을 흡수하고 실리콘 웨이퍼 표면 상에서 유도된 일시적 가열 및 공동화는 웨이퍼 최상부 상에 배양되거나 배치된 세포를 투과화할 수 있다. 소분자, 예컨대 칼세인의 고속대량, 병렬 전달이 비부착성 Ramos 세포 및 부착성 HeLa 세포에서 나타났다.
소분자, 예컨대 칼세인 및 프로피디움 요오다이드에 있어서, 베어 실리콘 웨이퍼 플랫폼을 이용할 수 있다. 레이저 펄스화 및 주입물 전달 후, 세포를 채취하거나 후속 분석을 위해 칩 상 배양을 계속할 수 있다.
본원에 기재된 구현예는 예시적이고 비제한적인 것으로 의도된다. 본원에 제공된 교시를 이용해서, 이러한 "광열 전달 기재"의 구성은, 예를 들어 변경될 수 있는 기재 상 특성(예, 세공(오리피스) 크기, 크기 분포, 공간 분포), 막 유형, 미세유체 채널의 분포 및/또는 구성 등을 변경함으로써 일상적으로 변화시킬 수 있다.
에너지원 및 선택적 조명
물질 선택에 따라, 본원에 기재된 기재(substrate) 및/또는 광열 전달 플랫폼 수술 장치 및/또는 기재를 포함하는 박막(들)은 본질적으로 임의의 다양한 방법의 적용에 의해 여기될(가열될) 수 있다. 이러한 방법에는 비제한적으로 마이크로파, 레이저, 비간섭성 광학 조사(예, 적외선 조사), 전기적 가열, 전자 회전 공명(ESR) 가열, 자기적 가열 등의 적용이 포함된다. 특정한 예시적 구현예에서, 박막 및/또는 기재 가열은 광학 에너지원(예, 레이저)의 적용에 의해 달성된다.
기재가 선택적으로(예, 기재의 일부가) 가열되는 경우, 장치 또는 기재를 국소적으로/선택적으로 조명하는 임의 수단이 이용될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서 예를 들어, 특정 구현예에서, 기재의 특정 영역의 국소 조명은, 예로 집중 레이저 또는 집중 비간섭성 광(예, 적외선)원을 이용하여 달성될 수 있다.
특정 구현예에서, 기재의 하나 이상의 영역의 선택적 조명은 마스크(섀도우 마스크)를 이용해서 달성된다. 특정 구현예에서, 국소 조명은 단순히 렌즈 및/또는 미러 시스템을 이용해서 특정 영역에 조명 에너지원(예, 레이저)을 집중하여 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 에너지원이 고정 영역에서 집중되고 기재가 이동되어(예, 이동식 스테이지 또는 다른 조작장치 이용) 특정 영역의 국소 조명을 달성할 수 있다.
특정 구현예에서, 에너지 펄스(예, 레이저 펄스)는 실시예에 나타낸 바와 같이 정적 섀도우 마스크뿐만 아니라 공간적 광 조절장치, 예컨대 TI의 DMD 마이크로디스플레이 또는 LCD 디스플레이를 이용하여 동적 마스크에 의해 형상화될 수 있다. 이는 표적 세포 내 마이크로주입의 실시간 및 쌍방향 제어를 제공한다.
입자/나노입자/박막 물질
다양한 구현예에서, 본원에 기재된 다양한 장치를 형성하는 박막(들)은 적절한 전자기적 에너지의 적용에 의해 가열될 수 있는 금속, 금속 합금, 반도체, 또는 다른 물질로 제작된다. 다양한 구현예에서, 반도체, 금속, 금속 합금, 및 이들의 산화물 및/또는 질화물이 고려된다. 크기, 종횡비, 막 두께, 및/또는 물질에 따라, 이러한 금속은 다양한 에너지원(예, 레이저 광, 전기장, RF장, 자기장, 초음파원 등)을 이용해서 쉽게 가열된다.
본원에 제공된 대부분의 논의가 반도체 또는 금속 막에 대한 것이며, 실시예가 티타늄 막을 설명하지만, 에너지원에 의해 가열된 물질이 이에 제한될 필요는 없다. 발생되는 가열로 적절한 에너지를 흡수하는 본질적으로 임의의 물질이 본원에 기재된 방법 및 장치에서 물질 가열을 위해 이용될 수 있다. 따라서 특정 구현예에서, 물질, 예컨대 금, 은, 탄탈, 백금, 팔라듐, 로듐, 또는 티타늄, 또는 이들의 산화물, 질화물, 또는 합금을 포함하는 막이 고려된다.
본원에 기재된 장치 및 시스템을 형성하는 박막(들)에서 유용한 하나의 중요한 물질은 티타늄(Ti) 및/또는 산화물, 질화물, 합금 또는 도핑된 산화물, 도핑된 질화물, 또는 이들의 합금이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 시스템 및 방법을 형성하는 박막(들)은 티타늄 및/또는 티타늄 질화물(TiN)을 포함하며, 이는 금보다 3배 더 높은 융점을 갖는 매우 단단한 물질이다.
TiN의 다른 변이체는 당분야 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 이들에는 비제한적으로 티타늄 탄소 질화물(TiCN) 및 티타늄 알루미늄 질화물(TiAIN)이 포함되며, 이는 개별적으로 또는 TiN을 갖는 교대 층으로 또는 TiN 입자를 갖는 혼합 입자군으로 이용될 수 있다. 이들 코팅은 부식 내성 및 경도, 그리고 상이한(심지어 조정 가능한) 흡수 특성에서 유사하거나 더 우수한 증강을 제공한다.
상기 나타낸 바와 같이, 본원에 기재된 장치 및/또는 기재를 포함하는 막이 금속을 포함하는 물질에 제한될 필요는 없다.
다양한 구현예에서, 주기율표의 II, III, IV, V, 또는 VI족의 하나 이상의 물질을 포함하는 박막이 고려될 뿐만 아니라 이들의 산화물, 질화물, 합금, 및 도핑된 형태 및/또는 전이 금속, 전이 금속 산화물, 전이 금속 질화물, 전이 금속을 포함하는 합금 또는 복합재 등도 고려된다. 특정한 바람직한 구현예에서, 나노입자 및/또는 막은 II족, III족, IV족, V족 물질(예, 탄소, 규소, 게르마늄, 주석, 납), 도핑된 II, III, IV, V 및 VI족 원소, 또는 순수하거나 도핑된 II, III, IV, V, 또는 VI족 원소의 산화물 또는 전이 금속, 전이 금속 산화물 또는 전이 금속 질화물을 포함한다. 특정한 바람직한 구현예에서, 입자/나노입자 및/또는 박막은 III, IV, 또는 V족 반도체를 포함한다.
특정 구현예에서, 박막에는 하나 이상의 물질, 예컨대 Si, Ge, SiC, Au, Ag, Cu, Al, Ta, Ti, Ru, Ir, Pt, Pd, Os, Mn, Hf, Zr, V, Nb, La, Y, Gd, Sr, Ba, Cs, Cr, Co, Ni, Zn, Ga, In, Cd, Rh, Re, W, 및 이들의 산화물 및 질화물이 포함됨이 본원의 교시로부터 이해될 것이다.
상기 나타낸 바와 같이 다양한 구현예에서, 박막을 형성하는 II, III, IV, V, 또는 VI족 원소, 전이 금속, 전이 금속 산화물 또는 질화물은 본질적으로 순수할 수도 있고, 또는 도핑(예, p- 또는 n-도핑)되고/되거나 합금될 수 있다. II-VI족 원소와 함께 이용하기 위한, 특히 III, IV 및 V족 원소와 함께 이용하기 위한, 보다 구체적으로 IV족 원소(예, 규소, 게르마늄 등)와 함께 이용하기 위한 P- 및 n-도판트는 당분야 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 이러한 도판트에는 비제한적으로 인 화합물, 붕소 화합물, 비소 화합물, 알루미늄 화합물 등이 포함된다.
특정 구현예에서, 막은 IV족 반도체, 예컨대 규소, 게르마늄, 및 탄화 규소 를 포함한다. 이러한 반도체에 대해 가장 일반적인 도판트에는 III족의 수용체, 또는 V족 원소로부터 공여체가 포함된다. 이러한 도판트에는 비제한적으로 붕소, 비소, 인, 그리고 때때로 갈륨이 포함된다.
상기 나타낸 바와 같이, 다양한 구현예에서 박막은 반도체를 포함한다. 여러 도핑된 II, III, IV, V, 또는 VI족 원소는 반도체이며, 비제한적으로 ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, MgS, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe, GaN, GaP, GaAs, GaSb, InP, InAs, InSb, AlS, AlP, AlSb, PbS, PbSe, Cd3Sb2, Zn3P2, Zn3As2, Zn3Sb2, TiO2, TiO2, TiO2, Cu2O, CuO, UO2, UO3, Bi2O3, SnO2, BaTiO3, SrTiO3, LiNbO3, La2CuO4, Pbl2, MoS2, GaSe, SnS, Bi2S3, GaMnAs, InMnAs, CdMnTe, PbMnTe, La0 . 7Ca0 . 3MnO3, FeO, NiO, EuO, EuS, CrBr3, Cu(In,Ga)Se2, Cu2ZnSnS4, CuInSe2, AgGaS2, ZnSiP2, As2S3, PtSi, Bil3, HgI2, TlBr, Se, Ag2S, FeS2, Ge 및 Si 그리고 이들의 삼차 및 사차 혼합물 등이 포함된다.
레이저 에너지에 부가하여, 특정 구현예에서 자기장, 전기장, 및 RF장이 또한 특정 박막을 가열하기 위해 쉽게 이용될 수 있다. 따라서 예를 들어, 본원에 참조로 인용되는 U.S. 특허 공보 번호 2007/0164250은 자기장에 놓이는 경우, 자기장의 특정 주파수에서 선택적으로 가열되는 자성 물질을 제공한다.
다양한 구현예에서, 이러한 막은 충분한 강도의 자기장에 노출되는 경우 에너지를 변환하는 자성 물질(예컨대 강자성 V 안료)를 포함한다. 따라서 예를 들어, 교대 자기장은 입자에서 교류를 유도하여 열을 생성할 것이다. 다양한 자성 물질을 이용할 수 있다. 이러한 물질에는 비제한적으로 자성 물질, 예컨대 Fe-O4, Fe2O3가 포함된다. 또한 특정 구현예에서, 은, 구리, 백금, 팔라듐 등은 본 발명의 장치에서 이용되는 입자, 나노입자, 및/또는 박막을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 입자, 나노입자, 및/또는 박막은 TiO2, CeO2, Ag, CuO, 이트륨 알루미늄 가닛(YAG), InO2, CdS, ZrO2, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 임의의 금속 산화물, 금속 합금, 금속 탄화물, 및/또는 전이 금속을 본 발명에서 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, 입자는 코팅이 적용된 장에 대한 이들 각각의 반응성을 변경하지 않도록 코팅될 수 있다.
특정 구현예에서 본 발명의 장치에서 이용되는 박막은 자성 물질로 제조될 수 있는 반면, 다른 구현예에서 이들은 상자성 또는 초상자성 물질로 제조되거나 이를 포함할 수 있다.
따라서 특정 구현예에서, 박막은 전자 스핀 공명 흡수(SPM) 및/또는 강자성 공명을 이용하여 가열될 수 있는 상자성 또는 초상자성 물질을 포함할 수 있다. 전자 스핀 공명(ESR) 가열 및 강자성 공명(FMR) 가열은 US 특허 공보 2006/0269612 및 2005/0118102에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 인용된다. 이트륨-철 가닛 Y3FC5O12 및 γ-Fe2O3는 ESR 및/또는 FMR 가열에 적합한 두 가지 널리 공지된 물질이다. 이들 물질의 다양한 적용의 스핀 공명 주파수를 낮추기 위해 상이한 도판트를 첨가할 수 있다. 자성 가닛 및 스피넬은 또한 일반적 환경 조건 하에서 화학적으로 불활성이며 파괴할 수 없다.
또한 주기율표의 II, III, IV, 및 V족 물질을 포함하는 다양한 물질 및/또는 반도체가 고려된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 장치에서 이용하기 위한 박막(들)의 면적 및/또는 두께는 조정하거나 최적화될 수 있고 막 물질의 선택, 여기 에너지의 성질, 및 여기 에너지의 주파수 및/또는 강도를 반영할 수 있다.
다양한 구현예에서, 존재하는 경우 박막은 약 0.5, 1, 2, 5, 10, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500nm 내지 약 800nm, 1㎛, 5㎛, 10㎛, 50㎛, 또는 100㎛의 두께 범위이다. 특정 구현예에서, 금속 막은 약 2nm 또는 5nm, 10nm, 20nm, 또는 30nm 내지 약 100nm, 300nm, 500nm, 800nm 또는 1㎛ 두께 범위이다. 특정 구현예에서, 금속 막은 1nm 내지 150nm, 바람직하게는 약 5nm 내지 100nm, 보다 바람직하게는 약 5nm, 10nm, 또는 20nm 내지 약 50nm, 75nm, 또는 100nm 두께 범위이다. 특정 구현예에서, 금속 막은 약 30nm 두께이다.
다양한 구현예에서, 본원에 기재된 장치를 포함하는 코팅된 층은 연속 박막, 또는 여러 도메인(예, 5nm, 10nm, 20nm, 50nm, 100nm, 200nm, 500nm 도메인)으로 나뉜 박막일 수 있다. 도메인의 형태 및 박막의 두께는 물질의 흡수 스펙트럼 및 원하는 국소 가열을 일으키기 위해 필요한 에너지원 및 강도에 영향을 미칠 것이다.
일반적으로, 막 두께는 국소 가열에 의해 생성되는 버블(들)의 크기 및 버블 근처 미세유체 유동의 성질에 영향을 미친다. 이는 세포에서 생성되는 전단 응력 및 개구부(들)의 크기를 결정한다. 일반적으로 막이 두꺼워질수록 생성되는 버블이 커지고 세포(들)에서 생성되는 홀(들)이 커진다.
기재에 대한 막의 적용
표면 상에 박막을 침착하는 방법은 당분야 숙련가에게 널리 공지되어 있다.
예를 들어, 박막은 비제한적으로 스퍼터링 침착, 화학 증착(CVD), 분자 빔 에피택시(MBE), 플라즈마-보조 증착, 음극 아크 침착 또는 Arc-PVD, 및 전자 빔 증발 침착을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 침착될 수 있다. 특정 구현예에서, 박막은 또한 광열 형질주입 기재 상에 화학적으로 침착될 수 있다.
TiN 박막 생성의 가장 일반적인 방법은 물리적 증착(PVD, 보통 스퍼터링 침착, 음극 아크 침착 또는 전자 빔 가열) 및 화학적 증착(CVD)이다. 두 방법 모두에서, 순수한 티타늄이 승화되고 고에너지 진공 환경에서 질소와 반응한다.
벌크 세라믹 물체는 분말화된 금속 티타늄을 원하는 형태로 패킹하고, 이를 적절한 밀도로 압축한 뒤 이를 순수 질소 분위기에서 점화하여 제작될 수 있다. 금속 및 기체 간 화학 반응에 의해 방출되는 열은 질화물 반응 산물을 단단한 마감 물품으로 소결하기 충분하다.
상술된 표면 상에서의 박막 형성 방법은 예시적이며, 제한하는 것이 아니다. 본원에 제공된 교시를 이용하여, 다른 박막 코팅된 표면을 가장 일상적인 실험을 이용하여 생성할 수 있다.
세포 유형
본원에 기재된 방법 및 장치는 세포막을 갖는 본질적으로 임의의 세포와 함께 이용할 수 있는 것으로 여겨진다. 또한, 방법 및 장치는 세포벽을 갖는 세포 상에서도 이용할 수 있다. 따라서 다양한 구현예에서, 동물 세포(예, 포유류 세포) 및 식물 세포 그리고 진균 세포가 고려된다.
따라서 예를 들어, NIH3T3 마우스 섬유아세포, HEK293T 배아 신장 섬유아세포, 및 HeLa 경부암종 세포를 포함하는 부착성 세포에 본원에 기재된 장치 및 방법을 이용하여 GFP-발현 플라스미드를 주입하였다. 일반적으로, 하기 이유로 인해 본원에 기재된 장치 및 방법을 이용해서 임의의 부착성 포유류 세포 유형에 쉽게 주입할 수 있는 것으로 여겨진다: 1) 효과적인 홀-천공 및 유지되는 세포 활성도의 관점에서 최적으로 결정된 레이저 영향이 평가된 모든 세포 유형에 대해 상대적으로 좁은 범위 내에 놓인다는 것; 2) 적절한 주입 위치(예, 핵 주위 또는 가능하게는 핵)를 결정하기 위해 이용되는 부착성 세포 특성이 시각적으로 쉽게 확인된다는 것.
림프구, 다양한 유형의 줄기 세포, 생식 세포 등은 비부착성이지만, 이러한 세포 상에 주입하거나 다른 "수술적" 절차를 수행하는 것이 종종 바람직하다. 본원에 기재된 바와 같은 세포 수술 도구와 광학 핀셋의 통합으로 이것이 가능해진다.
또한, 본원에 기재된 방법 및 장치를 이용하여, 인간 배아 줄기 세포를 성장시키고 전분화능을 유지하기 위해 필요한 바와 같은 세포 클러스터 내 개별 세포의 주입은 특히 본원에 기재된 방법 및 장치를 이용하여 줄기 세포 클러스터의 표면 상에서 달성 가능하다. 이는 또한 다양한 이유(예, 발생과정 추적, 구배 구축 등)를 위해 바람직한, 클러스터 내 특정 세포를 주촉성이 있도록(stereotactically) 주입할 수 있는 것으로 여겨진다.
전달 가능한 물질
본원에 기재된 방법 및 장치를 이용하여 세포 내로 본질적으로 임의의 원하는 물질을 전달할 수 있는 것으로 여겨진다. 이러한 물질에는 비제한적으로 핵산, 단백질, 세포소기관, 약물 전달 나노입자, 탐침, 표지 등이 포함된다. 본원에 기재된 방법을 이용한 세포 내로의 플라스미드 DNA의 전달이 이미 적어도 3 부착성 세포 유형에서 보여주었다. 따라서 임의의 플라스미드-크기의 유전 물질은 본원에 기재된 방법 및 장치에 의해 쉽게 수송되어야 한다.
BAC(박테리아 인공 염색체) - 큰 유전적 기형(anomaly)을 도입하거나 발생 동안 특정 유전자의 조절된 발현을 추적하기 위해 크기 제약을 갖는 전달 운반체(플라스미드, 레트로바이러스, 렌티바이러스) 및 형질도입하기 어려운 세포를 위한 바람직한 목표.
따라서, 본원에 기재된 장치 및 방법은 전체적 또는 부분적 천연 또는 합성 염색체를 전달하기 위해 이용할 수 있다고 여겨진다. BAC와 유사하게, 종전 방법에 의해 대부분의 세포 유형으로 형질도입될 수 없는 큰 염색체 또는 염색체 단편이 본 발명자들의 방법에 의해, 예를 들어 인간 삼중염색체 장애(예, 다운 및 클라인펠터 증후군) 모델을 구축하기 위해 세포 내로 수송될 수 있다.
유사하게, 본 방법은 핵 수송을 위해(예, 체세포 핵 수송에서) 이용할 수 있고, 또는 다른 세포소기관(예, 미토콘드리아, 또는 나노가공 구조)을 세포 내로 쉽게 도입할 수 있다.
다양한 구현예에서, 전달 가능한 물질은 비제한적으로 핵산(예를 들어, 벡터 및/또는 발현 카세트, 저해성 RNA(예, siRHA, shRNA, miRNA 등), 리보자임, 단백질/펩티드, 효소, 항체, 조영 시약, 세포소기관(예, 핵, 미토콘드리아, 인, 리소좀, 리보솜 등), 염색체, 세포내 병원체, 무생물 입자, 예컨대 양자점, 표면-강화 라만 산란(SERS) 입자, 마이크로비드 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 시약을 포함한다.
모듈형 시스템
특정 구현예에서, 본원에 기재된 형질주입 플랫폼은 기존 설비와 쉽게 통합될 수 있는 "모듈"로 제공된다. 예를 들어 특정 구현예에서, 형질주입 기재는 기존 현미경 상에서 있는 스테이지에 추가되거나 스테이지를 대체할 수 있는 형식으로 제공된다. 특정 구현예에서, 기재는 도립 현미경(예, Zeis 도립 현미경) 상에서 스테이지를 대체하고 x/y/z 스테이지를 전재시키는 형식이다.
특정 구현예에서, 형질주입 기재는 미세유체 시스템(예, 랩온어칩(lap on a chip) 시스템)으로 및/또는 미세유체 시스템과 통합될 수 있는 모듈로 제공된다.
패턴화된 형질주입 시스템
다양한 구현예에서, 본 발명은 세포 내로 시약(주입물)의 효율적인 고속대량 전달(세포 형질주입) 시스템을 고려한다. 특정 구현예에서, 하나 이상 광열 기재를 포함하는 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 세포 형질주입 기재(예, 광열 기재)를 포함한다. 기재는 전형적으로 세포 및/또는 세포 배양물을 보유한다. 시스템은 시약 전달 수단, 세포(들) 내로 형질주입될 제제, 전자기적 에너지원(예, 광학 에너지원)으로부터 기재 일부의 차단 수단 등을 선택적으로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 시스템에는 선택적으로 박막 및/또는 광열 기재를 가열하기 위한 전자기적 에너지원이 추가로 포함된다. 적합한 공급원에는 비제한적으로 레이저, 고강도 비간섭성 광원, 자기장 발생장치, RF장 발생장치 등이 포함된다.
다양한 구현예에서, 시스템에는 제어기(예, 레이저 제어기)가 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, 제어기는 조명원의 강도 및/또는 기간 및/또는 파장 및/또는 광열 기재의 조명 패턴을 제어하도록 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 제어기는 광열 기재을 포함하는 마이크로채널 및/또는 내부에 광열 기재가 배치되는 미세유체 시스템을 통해 시약 유동을 검출하고/하거나 제어한다. 광열 기재가 현미경(예, 도립 현미경) 상에 제공되는 경우, 제어기는 현미경 스테이지, 현미경 초점, 및/또는 현미경으로부터의 이미지 획득을 선택적으로 제어할 수 있다.
키트
다른 구현예에서, 세포 내로 주입물의 효율적인 고속대량 전달을 위한 키트가 제공된다. 특정 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 광열 전달 장치를 함유하는 용기를 포함한다. 다양한 구현예에서, 키트에는 세포 내로의 주입물 전달을 수행하기 위해 본원에 기재된 임의의 시약 또는 장치(예, 시약, 완충액, 관, 표시장치, 조작장치 등)가 선택적으로 추가로 포함될 수 있다.
또한, 키트에는 세포 내로 주입물을 전달하기 위해 본원에 기재된 시스템 및 장치를 이용하기 위한 지침(즉, 프로토콜)을 제공하는 표지 및/또는 지시 자료가 선택적으로 포함된다.
지시 자료는 문서 또는 인쇄 자료를 전형적으로 포함하지만, 이들은 여기에 제한되지 않는다. 이러한 지침을 저장하고 이들을 최종 사용자와 소통할 수 있는 임의의 매체가 본 발명에 의해 고려된다. 이러한 매체에는 비제한적으로 전자 저장 매체(예, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체(예, CD ROM) 등이 포함된다. 이러한 매체에는 이러한 지시 자료를 제공하는 인터넷 사이트에 대한 주소가 포함될 수 있다.
본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 이의 견지에서 다양한 변형 및 변화가 당분야 숙련가에게 암시될 것이고 본 출원의 요지 및 권한 그리고 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 포함되는 것임이 이해된다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위하여 이들의 전문이 참조로 본원에 인용된다.

Claims (62)

  1. 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치로서, 상기 장치가,
    복수의 세공을 포함하는 트랙-에칭된 다공성 막으로서, 금속 또는 금속 합금의 박막 코팅은 상기 다공성 막의 세공 내에 있고, 상기 다공성 막의 표면에는 상기 코팅이 없으며, 사용하는 동안에 상기 다공성 막이, 세포 배지 및 상기 세포 배지 내 배치된 하나 이상의 세포를 함유하도록 구성된 용기 내에 배치되고, 하나 이상의 세포 및 세포 배지가 상기 용기에 존재할 때 상기 다공성 막이 상기 하나 이상의 세포를 지지하거나 기대도록 구성되는 것인 다공성 막; 및
    상기 다공성 막의 최상부 표면에 집중된 펄스 레이저로서, 상기 레이저는 상기 세포 배지 내 공동화 버블을 생성시키기 위하여 상기 박막 코팅을 가열할 수 있고, 상기 공동화 버블이 상기 제제를 상기 하나 이상의 세포에 전달하기 위해 상기 하나 이상의 세포의 세포막을 일시적으로 개방할 수 있는 것인 펄스 레이저
    를 포함하는, 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세공의 평균 세공 크기가 상기 박막의 침착 전에 100nm 내지 3㎛까지의 범위인, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 금속 또는 상기 금속 합금이 금, 은, 티타늄(Ti), TiN, TiCn, 및 TiAlN으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 박막이 10nm 내지 1㎛까지의 두께 범위인, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 다공성 막이 다공성 알루미나(Al2O3) 구조 또는 폴리에스테르 막인, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 다공성 막이 상기 하나 이상의 세포에 배치되는, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 장치가 상기 펄스 레이저에 의한 조명 패턴, 펄스 레이저에 의해 방출되는 광 펄스의 발생 시점, 펄스 레이저에 의해 방출되는 펄스의 발생 주파수, 펄스 레이저에 의해 방출되는 펄스의 파장, 펄스 레이저에 의해 방출되는 펄스의 에너지, 및 펄스 레이저에 의해 방출되는 펄스의 조준 또는 위치 중 적어도 하나를 조정하는 제어기를 추가로 포함하는, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 장치가 초승달-모양 공동화 버블을 제조하도록 구성되는, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치.
  11. 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치로서, 상기 장치가,
    제1 표면 및 상기 제1 표면 반대쪽의 제2 표면 및 마이크로-오리피스 배열을 포함하는 강성 기재(rigid substrate)로서, 상기 마이크로-오리피스는 상기 기재를 통하여 상기 제1 표면으로부터 상기 제2 표면까지 관통하고, 상기 마이크로-오리피스는 10㎛ 미만의 최대 지름을 가지며, 복수의 상기 마이크로-오리피스의 벽 또는 테두리의 적어도 일부는 광학 조사에 노출되는 경우 가열되는 물질의 박막 코팅으로 코팅되는 것인, 강성 기재; 및
    상기 제2 표면에 인접하여 배치된 유체 채널 또는 유체 저장소로서, 상기 채널 또는 저장소는 상기 마이크로-오리피스 배열을 포함하는 복수의 마이크로-오리피스와 유체 전달하는 것인, 유체 채널 또는 유체 저장소; 그리고
    상기 제1 표면의 겉면은 세포 배지에서 하나 이상의 세포를 수용하며 지지하고/하거나 함유하도록 배치됨; 및
    상기 제1 표면에 집중된 펄스 레이저로서, 상기 레이저는 상기 세포 배지 내 공동화 버블을 생성시키기 위하여 상기 박막 코팅을 가열할 수 있고, 상기 공동화 버블이 상기 제제를 상기 하나 이상의 세포에 전달하기 위해 상기 세포 중 하나 이상의 세포막을 일시적으로 개방할 수 있는 것인, 펄스 레이저
    를 포함하는, 장치.
  12. 제11항에 있어서, 상기 마이크로-오리피스가 5㎛ 이하, 또는 3㎛ 이하의 최대 지름을 갖는, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치.
  13. 제11항에 있어서, 상기 강성 기재가 마이크로리소그래피 웨이퍼로 형성되는, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치.
  14. 제11항에 있어서, 상기 강성 기재가 규소, 석영, 강성 중합체, 및 세라믹으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질로 형성되는, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치.
  15. 제11항에 있어서, 상기 제1 표면이 세포를 함유하도록 구성되고 현미경으로 보이도록 배치된 챔버 표면을 포함하는, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치.
  16. 제11항에 있어서, 상기 마이크로-오리피스 배열이 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 또는 적어도 500 마이크로-오리피스를 포함하고/하거나;
    상기 마이크로-오리피스가 2㎠ 이하 또는 1.5㎠ 이하, 또는 1㎠ 이하, 또는 0.5㎠ 이하, 또는 0.1㎠ 이하의 상기 제1 표면 및 상기 제2 표면의 면적 내에 모두 위치하는, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치.
  17. 삭제
  18. 제11항에 있어서, 상기 박막이 반도체, 금속, 금속 합금, 금속 질화물, 및 금속 산화물로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 포함하거나;
    상기 박막이 전이 금속, 전이 금속 합금, 전이 금속 질화물, 및 전이 금속 산화물로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 포함하거나;
    상기 박막이 금, 은, 티타늄(Ti), TiN, TiCn, 및 TiAlN으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하기 위한 장치.
  19. 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하는 방법으로서, 상기 방법이
    제1항에 따른 장치의 다공성 막의 최상부 또는 아래에 배치된 배양물 중 하나 이상의 세포를 제공하거나 (상기 세포는 세포 배지에 배치됨); 제11항에 따른 장치의 제1 표면 상에 배치된 배양물 중 하나 이상의 세포를 제공하는 단계;
    제제를 세포 배지에 도입함으로써 하나 이상의 세포를 상기 제제와 접촉시키는 단계; 및
    강성 기재 또는 다공성 막의 영역 및 하나 이상의 세포를 펄스 레이저에 노출시킴으로써 조사된 영역에서의 세공에서 박막의 가열을 유도하는 단계로서, 가열은 가열 영역이나 그 근처에서 하나 이상의 세포의 막에 개구부를 도입하는 세포 배지 중 공동화 버블을 형성하여 제제의 하나 이상의 세포 내로의 전달을 일으키는 것인 단계
    를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 방법이 다공성 막의 최상부에서 하나 이상의 세포를 위치시키거나 성장시키는 것을 포함하며 세포에서 또는 그 근처에서 다공성 막의 표면이 가열되거나;
    상기 방법이 다공성 막의 최상부에서 하나 이상의 세포를 위치시키거나 성장시키는 것을 포함하며 세포 반대편의 다공성 막의 표면이 가열되거나;
    상기 방법이 별도 기재 상에 하나 이상의 세포를 위치시키거나 성장시키는 것을 포함하며 다공성 막이 세포의 최상부에 위치하는, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 세포가 상기 표면에 존재하는 하나 이상의 마이크로-오리피스에 상기 제제를 제공함으로써 상기 제제와 접촉되는, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하는 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 세포가 상기 마이크로-오리피스와 유체 전달하는 챔버 또는 채널에 상기 제제를 제공함으로써 상기 제제와 접촉되는, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하는 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 제제가 핵산, 염색체, 단백질, 표지, 세포소기관(organelle), 및 유기 소분자로 구성된 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 세포 내로 제제를 전달하는 방법.
  24. 세포 내로 시약을 전달하는 방법으로서, 상기 방법이
    나노입자 또는 박막이 결핍된 기재 상에 세포를 제공하는 단계;
    상기 세포를 상기 시약과 접촉시키는 단계; 및
    상기 기재 영역을 펄스 레이저에 노출시킴으로써 기재의 가열을 유도하는 단계로서, 상기 가열은 가열된 영역이나 그 근처에서 세포막에 개구부를 도입하는 버블을 형성하여 상기 시약의 이들 세포 내로의 전달을 일으키는 것인 단계
    를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 기재가 규소, 석영, 강성 중합체, 금속, 및 세라믹으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질로 형성되는, 세포 내로 시약을 전달하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 기재가 세포를 함유하도록 구성된 챔버 표면을 포함하고/하거나
    상기 기재가 현미경으로 보이도록 배치되는, 세포 내로 시약을 전달하는 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 시약이 핵산, 리보자임, 단백질 또는 펩티드, 효소, 항체, 세포소기관, 염색체, 병원체, 및 마이크로입자 또는 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는, 세포 내로 시약을 전달하는 방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 기재가 도립 현미경 상에 위치하도록 구성되거나 스테이지를 대체하도록 구성되는, 세포 내로 시약을 전달하는 방법.
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