JP2006515758A

JP2006515758A - 高度に制御可能な電気穿孔法及びその応用

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Publication number: JP2006515758A
Application number: JP2006500899A
Authority: JP
Inventors: ファリス，サデグ，エム．
Original assignee: レビオインコーポレーティッド
Priority date: 2003-01-10
Filing date: 2004-01-12
Publication date: 2006-06-08
Also published as: US20040241859A1; TW200413525A; US6962816B2; WO2004063350A3; CN1759172A; WO2004063350A2; EP1615988A2; US20060073597A1; KR20050095607A

Abstract

ここで述べる制御可能な電気穿孔システム及び方法は水孔の寸法、個数、場所、及び分布の制御を可能にし、こうして使用の柔軟性を増加させる。ここで述べる制御可能な電気穿孔システム及び方法は一般に最低二つの作動サブシステム及びサブプロセスを使用する。一つのサブシステム及びサブプロセスは細胞膜を弱めるための比較的広い効果を使用する(広い効果のサブシステム)。別のサブシステム及びサブプロセスは細胞膜の孔の位置を決定するための比較的狭い効果を使用する(狭い効果のサブシステム)。

Description

細胞膜はその外部環境より分子内容物を区分する重要な機能を果たす。細胞膜は主に両親媒性脂質からなり、これは非常に隔離した構造へ自己集合し、こうして細胞膜を貫くイオン移送への大きなエネルギー障壁を提示する。

しかし脂質母体は電気穿孔法として知られる有名な現象である細胞膜を貫く導電率及び拡散透磁率の増加へ導く強力な外部電界により崩壊できる。これらの効果は細胞膜の水孔形成の結果である。特に電気穿孔プロセスは伝統的に比較的大きな平面電極(ノイマン他バイオエレクトロケミストリーバイオエナジー４８、３−１６（１９９９）、ホー他クリトレビューバイオテクノロジー１６、３４２−６２（１９９６）間で短時間の電界パルスを印加した場合の細胞膜の透過を含む。

例えば図２Ａ及び２Ｂは従来の電気穿孔システム２０を示し、これにより電界の印加(例えば回路２２を閉じることにより示される)が細胞膜２４にランダムな孔２６を生成させる。寸法と個数の点のみでは、このような孔の分布は印加される電界の強度及び期間により決定される。印加される電界がより強くかつより長い程、孔の個数は多くなり寸法は大きくなる。しかしそのような孔の正確な場所は制御できず、このように孔の最終的分布は幾分ランダムである。研究者は生化学経路でしばしば重要な成分である化合物が細胞内の母体へ取り込まれる場所の制御ができない。このように研究者は利用するには遥かにより遅くそして困難な細胞自身の自然のメカニズムにしばしば依存しなければならない。

電気穿孔法はＤＮＡ，ＲＮＡ，染料、タンパク質及び色々な化学薬品を含む高分子を細胞内へ取り込むために使用される。大きな外部電界は孔(例えば20〜120nmの範囲の直径を有する)の形成に至る高い細胞膜を貫く電位を誘発する。電気パルスの印加中にＤＮＡを含む荷電高分子はこれらの孔を通して細胞膜を横切り電気泳動法により活発に移送される(ノイマン他バイオフィジックスジャ−ナル７１２８６８−７７（１９９６）)。無電荷分子も又受動的拡散により孔を通って進入する。パルス終了時、孔は正常な細胞膜伝導値(ホー1996上記)の復活により測定される数百ミリ秒を超えて再び封じられる。

この手順は、化学上及び生物学上の化合物を細胞に注入し、細胞自身のタンパク質レセプター及び細胞膜を横切る移送のための細胞膜貫通チャンネルに依存することを避けるために研究室環境でしばしば使用される。これは研究者がそれが潜在的に命を救う癌治療薬であれ又は致死の生物学上の毒素であれ、化合物の生物学的影響を容易に研究することを可能にする。しかし現在の電気穿孔技術は限界がある。

従って従来の電気穿孔法のこれらの及び他の限界に打ち勝つための方法とシステムを提供することが望まれる。

従来技術の上で議論したこと及び他の問題や欠点は制御可能な電気穿孔法のためのこの発明のいくつかの方法及び装置により克服されるか又は緩和される。制御可能な電気穿孔システム及び方法は水孔の寸法、個数、場所及び分布の制御を可能にし、こうして使用の柔軟性を増加させる。制御可能な電気穿孔法のここで述べるシステム及び方法は一般に最低二つの作動するサブシステム及びサブプロセスを使用する。一つのサブシステム及びサブプロセスは細胞膜を弱めるための比較的広い効果を使用する(広い効果のサブシステム)。別のサブシステム及びサブプロセスは細胞膜の孔の位置を決定するための比較的狭い効果を使用する(狭い効果のサブシステム)。

この発明の上述及び他の特徴や利点は以下の詳細説明及び図面よりこの技術に精通する人々により高く評価されそして理解されるだろう。

発明の詳細説明

ここで述べるのは水孔の寸法、個数、場所、及び分布の制御を提供し、こうして使用の柔軟性を増加させる電気穿孔システム及び方法である。概して図１Ａ及び１Ｂに関して、細胞膜１２の制御可能な電気穿孔のためのここで述べるシステム１０及び方法は一般に最低二つの作動するサブシステム及びサブプロセスを使用する。図１Ａは細胞膜１２の一部を示し、そして図１Ｂはここで述べる制御可能な電気穿孔システム１０を示す。

ここで留意すべきは一般に作動するサブシステムの一つだけでは細胞膜に孔１４を開口し又は生成するには十分でなく、両方の作動するサブシステムが使用され、それにより論理の「アンド」ゲートに似た方法で機能することである。広い効果のサブシステム１６は細胞膜を弱めるため比較的広い効果を使用し、そして狭い効果のサブシステム１８は細胞膜１２の孔１４の位置を決定するため比較的狭い効果を使用する。広い効果のサブシステム１６及び狭い効果のサブシステム１８の両方を使用することが高度に位置決めされ、かつ制御された電気穿孔従って孔１４の開口を可能にする。

従って例えば従来の電気穿孔技術の印加電界に加え、背景の項及び図２Ａと２Ｂに関して述べた細胞膜の従来の電気穿孔プロセスに比較して、この中で開示される電気穿孔システム及び方法は細胞膜上の特定の場所に向けた狭い効果のサブシステム１８を使用し、孔１４の位置決め制御を可能にする。狭い効果のサブシステム１８はリン脂質分子を励起し、こうして水孔を生成するための広い効果のサブシステム１６より要求されるエネルギー量を削減させる。こうして例えば一般に電気穿孔が起こらないような非常に弱い電界がシステムに印加される。しかしこの弱い電界が既にレーザービームにより励起された細胞膜の場所に水孔を開口することができる。

広い効果のサブシステム又はサブプロセス１６は適切な細胞膜を弱めるシステムそして又はプロセスより選択される。このような弱めるシステムそしてまたはプロセスは電界(ある好適な実施例で一様な電界)、マイクロ波エネルギー、他の電磁放射、比較的低エネルギーのレーザービーム(即ちランダムな電気穿孔を始めるのに必要なエネルギーより低い)、又は最低一つの先の弱めるシステムそしてまたはプロセスを含む組み合わせより構成されるグループより選択される。広い効果のサブシステム又はプロセス１６のエネルギーの大きさは一般にランダムな孔の開口が起こる従来の電気穿孔システムのエネルギーの大きさより一般に低い。更に弱めるシステムそしてまたはプロセス１６の領域(例えば断面領域)は一般に所要の孔寸法より大きな領域を包含する。ある実施例でこの領域は全細胞又は細胞膜配列を包含する。他の実施例ではこの領域は細胞膜の部分である。

狭い効果のサブシステム又はサブプロセス１８は適切な細胞膜穿孔位置決めシステムそして又はプロセスより選択される。このような位置決めシステムそして又はプロセスはレーザービーム、電極チップ又は最低一つの先の位置決めシステムそして又はプロセスよりなる組み合わせで構成されるグループより選択される。位置決めシステムそして又はプロセス１８の領域（例えば断面領域）は一般に、例えば孔開口の所要寸法に一致するように狭い。このように例えば現存及び開発中のレーザー及び電極チップ技術はこのようなサブミクロンスケール及びナノスケールの寸法が可能であるので、サブミクロン又はナノメ−トル(例えば１~１００nm)の大きさを有する制御された孔開口が可能である。

応用‐細胞注入

ここで述べる制御可能な電気穿孔システム及びプロセスはＤＮＡ、ＲＮＡ、染料、タンパク質及び色々な化学薬品を含む高分子を制御された方法で注入するために使用される。この制御可能な電気穿孔システムの応用を限定する意図はなく、図３Ａ〜５Ｂは制御可能な穿孔システムを使用する細胞孔開口システムの色々な実施例を示す。

今度は図３Ａ〜３Ｄに関して、細胞への制御可能な高分子注入のためのシステム３０を示す。図３Ａは細胞２４を保持するためのメカニズム３２を含むシステム３０を描写する。メカニズム３２はバイオ技術では一般に有名な関連するマイクロシステムを含む適切な微小ロボット装置である。装置３２のようなものは個々の細胞又は細胞の制御されたグループを保持出来ることが望ましい。更にメカニズム３２は又細胞２４より生物学、電気、光の又は他のデーターを得るために使用される。

今度は図３Ｂに関して細胞２４を保持するメカニズム３２を含むシステム３０、及び広い効果のサブシステム１６及び狭い効果のサブシステム１８を含む制御可能な電気穿孔システムを示し、孔３４の開口を引き起こすため狭い効果のサブシステム１８が細胞２４上のある場所へ集中される。

今度は図３Ｃに関して高分子３８は例えばナノノズル又は他の適切な注入装置３６により取り込まれる。狭い効果のサブシステム１８そして又は広い効果のサブシステム１６が除去された場合、孔は閉じ細胞２４'がその中に高分子３８を有する結果になる。

図４Ａ及び４Ｂは例えば上述のように高分子を取り込むための細胞２４に制御可能な孔３４の開口を導入するための制御可能な電気穿孔システム４０の一実施例を示す。システム４０は電界発生装置４２、４４、４６より形成される広い効果のサブシステム及び適切な発生源(表示なし)よりのレーザービーム４８を含む。電界発生装置は切り替え可能(スイッチ４４により)な電圧源４６へ結合された電極板４２より形成される。示されているように上述のように論理の「アンド」回路に類似してレーザービームは焦点を合わされそして孔開口メカニズムを活性化するために電界が印加される。

図３Ａ〜３Ｄ及び４Ａ〜４Ｂに関して記述したシステム及び方法について研究者は細胞組織構造中の二三の細胞を生物学的化合物へさらせただけでそして信号が近くの細胞にいかに伝わって行くかを観察できた。代わって研究者は神経細胞や胃腸粘膜細胞のような非対称細胞が色々な場所で注入された化合物に色々に反応するかどうかを研究できた。

今度は図５Ａ及び５Ｂに関して、細胞２４の配列５２に関連して図３Ａ~３Ｄ又は４Ａ~４Ｂのそれに似た動作をするシステム５０を示す。広い効果のサブシステム１６および狭い効果のサブシステム１８が操作される場合、孔３４が細胞２４に形成される。このような孔は細胞２４への高分子の選択的な取り込みに使用される。

応用‐分離装置

今度は図６~１０に関して、ろ過分離装置の色々な実施例がここに制御可能な電気穿孔システムを使用して提供される。

図６はシステム６０、例えば分子ふるいの一つの実施例を描写する。システム６０は複数細胞膜層６２、例えば二層のリン脂質を含む。各細胞膜層６２は広い効果のサブシステムの適用の間に、狭い効果のサブシステムに支配され、代わって例えば適当なマイクロ又はナノレベルの欠陥の孔６４の場所は組み立て又は製造の時点で予め決められているか又は各層の色々な電圧レベルが孔寸法を決めたのと同一である。各層の色々な電圧(例えばＶ１、Ｖ２及びＶ３)の印加は大きな孔６４から小さな孔６４へのろ過勾配を生成し、適切な層を通る分子６６の通過を可能にする。

非常に安価に製造できる二層リン脂質を使用して同じフィルター６０が繰り返し使用できそして電気穿孔を使用しそして印加される電界を注意深く制御し、いかなる寸法要求にも適合できる。多重フィルターに依存する代わりに単一フィルターをいかなる状況にも使用でき、かつ構成できる。

図７に関してそこにチャンネル７４を有する生体素子配列７２に関連する図６のそれに似た機能の分子ふるいを有するシステム７０を示す。チャンネル７４は寸法に基づく各レベルの高分子及び分子を集めるのに役立つ。更にチャンネル７４は高分子及び分子を配列７２状態に誘導させるため、例えば圧力、熱的、電気的、又は他の勾配のような勾配システムを組み込むか又は関連させる。配列７２は適切な微小流体装置又は超微細流体装置でよい。例えばこのような装置を製造する方法はこの中に参考として組み込まれているレベオ社ＰＣＴ申請番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／３７３０４、２００３年１１月３０日提出、表題「三次元装置の組み立て及びその製造方法」に述べられている。

図８はレーザー配列が孔開口に位置制御を提供するダイナミックろ過装置の別例を示す。図８０は広い効果のサブシステム１６及び狭い効果のサブシステム１８に関連する細胞膜層８２を含むろ過システム８０を示す。例えば狭い効果のサブシステム１８はレーザー配列８８で発生する。代わってレーザー配列８８の代わりにビ−ム操縦装置が組み込まれ、一つだけのレーザー光源の使用が可能になる。細胞膜層８２上のある位置に関連した配列よりのレ−ザ−が励起される場合、孔８４が開口する。孔の寸法は予め決められた細胞膜特性、狭い効果のエネルギーサブシステムの領域や大きさ又は広い効果のエネルギーサブシステムの大きさにより制御される。

細胞、タンパク質、酵素、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び他の高分子又は分子は例えば適切な微小流体装置上の容器８６の配列により集められる。こうして分離装置８０は非常にコンパクトにそして如何なる目的にも非常に柔軟に製作される。

図9はここで示す色々な実施例で広い効果のエネルギーサブシステムを提供するのに適した電極の例を示す。格子状の電極を提供することにより適切な電界発生システムが狭い効果のサブシステム、高分子取り込み、ろ過又は他のいかなる目的をも含む色々な目的への接近を可能とするために提供される。

寸法に基づくろ過に加え先に述べた分離装置は、又印加電圧は細胞膜を横切る一つの型のイオンしか駆動しないため、イオン電荷に基づき分離を行う。

好適な実施例は示されそして記述された一方、色々な修正及び置換が本発明の精神及び範囲より離れることなくそれに対し行われるかもしれない。従ってこの発明は図解によりそして限定でなく記述されていることを理解すべきである。

はここで述べる制御可能な電気穿孔システムの動作を示す。は従来の電気穿孔システムを示す。は細胞注入システムの一般的な実施例を示す。は細胞注入システムの一例を示す。は細胞配列のための細胞注入の一例を示す。は多層リン脂質及び電気穿孔法を使用する分離装置を示す。は多層、電気穿孔法及び微小流体配列を使用する分離装置を示す。は色々な場所に色々な孔を有することができる単層を使用する分離装置を示す。はここで述べる色々な実施例で使用される典型的な電極格子を示す。

符号の説明

図１Ａ、１Ｂ
１０：電気穿孔システム
１２：細胞膜
１４：孔
１６：広い効果のサブシステム
１８：狭い効果のサブシステム
図２Ａ、２Ｂ（従来技術）
２０：電気穿孔システム
２２：電界印加スイッチ
２４：細胞
２６：孔
図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ
１６：広い効果のサブシステム
１８：狭い効果のサブシステム
２４、２４'：細胞
３０：細胞への高分子注入
３２：細胞保持メカニズム
３４：孔
３６：注入装置
３８：高分子
図４Ａ、４Ｂ
２４：細胞
３４：孔
４０：電気穿孔システム
４２：電極板
４４：電界印加スイッチ
４６：電圧源（Ｖ）
４８：レーザービーム
図５Ａ、５Ｂ
１６：広い効果のサブシステム
１８：狭い効果のサブシステム
２４：細胞
３４：孔
５０：電気穿孔システム
５２：細胞配列
図６、７
６０：電気穿孔システム
６２：細胞膜層
６４：孔
６６：分子
７０：電気穿孔システム
７２：生体素子配列
７４：チャンネル
Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３：印加電圧
図８
１６：広い効果のサブシステム
１８：狭い効果のサブシステム
８０：電気穿孔システム
８２：細胞膜層
８４：孔
８６：容器
８８：レーザー配列

Claims

孔は狭いエネルギーの位置に対応した位置に開口され又は生成され、細胞膜へ広いエネルギーを提供するための広い効果のサブシステム及び細胞膜へ狭いエネルギーを提供するための狭い効果のサブシステムよりなる細胞膜の制御可能な電子穿孔のためのシステム。
広い効果のサブシステムは、電界、マイクロ波エネルギー、他の電磁放射、低エネルギーレーザービーム又は最低一つの先の弱めるシステムよりなる組み合わせで構成される弱めるシステムのグループより選択される請求項１のようなシステム。
広い効果のサブシステムのエネルギーの大きさは狭い効果のサブシステムなしにランダムな孔開口が起こる電気穿孔システムのエネルギーの大きさより低い請求項１のようなシステム。
広い効果のサブシステムの領域は要求する孔寸法より大きい領域を包含する請求項１のようなシステム。
広い効果のサブシステムの領域は細胞膜を包含する請求項１のようなシステム。
広い効果のサブシステムの領域は細胞配列の膜を包含する請求項１のようなシステム。
広い効果のサブシステムの領域は細胞膜の部分を包含する請求項１のようなシステム。
狭い効果のサブシステムはレーザービーム、電極チップ又は最低一つの先の位置決めシステムよりなる組み合わせで構成される位置決めシステムのグループより選択される請求項1のようなシステム。
狭い効果のサブシステムの領域は孔開口の寸法に一致する請求項1のようなシステム。
孔はサブミクロンの寸法を有する請求項1のようなシステム。
孔は約１００ナノメートル以下の寸法を有する請求項1のようなシステム。
広い効果のサブシステム及び狭い効果のサブシステムの両方が作動する場合孔が開口され、細胞膜へ広いエネルギーを提供するための広い効果のサブシステム及び細胞膜に狭いエネルギーを提供するための狭い効果のサブシステムよりなる制御可能な電気穿孔システム。
孔は狭いエネルギーの位置に対応する場所に開口され又は生成され、細胞膜へ広いエネルギーを向けそして細胞膜へ狭いエネルギーを向けることよりなる細胞膜へ孔を制御可能なように開口するための方法。
広いエネルギーは電界、マイクロ波エネルギー、他の電磁放射、低エネルギーレーザービーム、又は最低一つの先のエネルギーシステムよりなる組み合わせで構成されるエネルギーシステムのグループより選択される請求項１３のような方法。
広いエネルギーの大きさは狭い効果のサブシステムなしにランダムな孔開口が起こる電気穿孔システムのエネルギーの大きさより低い請求項１３のような方法。
広いエネルギーの領域は要求する孔寸法より広い領域を包含する請求項１３のような方法。
広いエネルギーの領域は細胞膜を包含する請求項１３のような方法。
広いエネルギーの領域は細胞配列の細胞膜を包含する請求項１３のような方法。
広いエネルギーの領域は細胞膜の部分を包含する請求項１３のような方法。
狭いエネルギーはレーザービーム、電極チップ、又は最低一つの先の位置決めエネルギーシステムよりなる組み合わせで構成される位置決めエネルギーシステムのグループより選択される請求項１３のような方法。
狭いエネルギーの領域は孔開口寸法に一致する請求項１３のような方法。
孔はサブミクロンの寸法を有する請求項１３のような方法。
孔は約１００ナノメートル以下の寸法を有する請求項１３のような方法。
細胞を保持するための微小ロボット装置及び細胞に孔を制御可能なように開口するための請求項1のようなシステムよりなる細胞孔開口システム。
広い効果のサブシステムは電極板及び切り換え可能な電圧源よりなる請求項２４のような細胞孔開口システム。
狭い効果のサブシステムはレーザーよりなる請求項２４のような細胞孔開口システム。
細胞を保持するための微小ロボット装置、細胞に孔を制御可能なように開口するための請求項1のようなシステム及び孔により細胞へ高分子を注入するための高分子注入装置よりなる細胞孔高分子システム。
細胞を保持し、そして細胞へ孔を制御可能なように開口するための請求項１３の方法を適用することよりなる細胞孔開口方法。
細胞を保持し細胞へ孔を制御可能なように開口するための請求項１３の方法を適用しそして孔により細胞へ高分子を取り込むことよりなる細胞へ高分子を取り込む方法。
各細胞膜層は細胞へ孔を制御可能なように開口するための請求項1のようなシステムを含み、孔寸法勾配を生成するため色々な寸法に開口され、多くの細胞膜層よりなる分子又は高分子をろ過するためのシステム。
前記位置は広い効果のサブシステムの作動がなければ閉鎖され、そして前記位置は広い効果のサブシステムの作動で開口され、各層が欠陥を有する位置を含み、多くの細胞膜層、各細胞膜層に関連する広い効果のサブシステムよりなる分子又は高分子をろ過するためのシステム。
各層の前記欠陥は孔寸法を制御する請求項３１のようなシステム。
広い効果のサブシステムのエネルギーの大きさは孔寸法を制御する請求項３１のようなシステム。
狭い効果のエネルギーサブシステムは狭い効果のエネルギーサブシステムの配列よりなり、細胞へ孔を制御可能なように開口するための請求項1のようなシステムを含む細胞膜層よりなる分子又は高分子ろ過のためのシステム。
狭い効果のエネルギーサブシステムはレーザー配列よりなり、細胞へ孔を制御可能なように開口するための請求項1のようなシステムを含む細胞膜層よりなる分子又は高分子ろ過のためのシステム。
狭い効果のエネルギーサブシステムは電磁エネルギー源に関連したビーム操縦装置よりなり、細胞へ孔を制御可能なように開口するための請求項1のようなシステムを含む細胞膜層よりなる分子又は高分子ろ過のためのシステム。
孔開口場所を決定するためレーザービーム源よりのレーザービームが二層細胞膜上のある場所へ照射され、そして電界源よりの電界が孔を開口するために印加され、二層細胞膜、レーザービーム源及び電界源よりなる制御可能な孔開口装置。
二層細胞膜はリン脂質よりなる請求項３７のような制御可能な孔開口装置。
電界はレーザービームのないときに孔を開口するのに必要な電界値より弱く、レーザービームはその場所の分子を励起し、これにより孔開口のために電界より要求されるエネルギー量を削減する請求項３７のような制御可能な孔開口装置
請求項３７~３９のいずれかのように制御可能な孔開口装置よりなるろ過装置。
各フィルターへ印加され、これにより孔寸法を異ならせる色々な電圧と共に積み重ねられた請求項４０のような多重フィルターよりなる分離装置。
レーザービーム源は細胞膜上の多数の場所へレーザービームを向けることができ、それにより電界が印加された場合、孔開口のための色々な場所を決定する請求項４０のようなろ過装置。
孔寸法は細胞膜特性又は電界レベルの変動により変化し、更にレーザービームの照射のため細胞膜上の所要の場所に関連した多くの容器よりなる請求項４２のようなろ過装置。
二層細胞膜を備え、細胞膜上のある場所へレーザービームを向け、孔寸法より小さい粒子は分離され、細胞膜上のその場所へ孔を開口するために電界を印加することよりなる粒子分離方法。
積み重ねた多くの二層細胞膜を備え、細胞膜上のある場所へレーザービームを向け、各細胞膜へ孔を開口するため各細胞膜へ別個の電界を印加することよりなる粒子分離方法。
多くの細胞膜の最低一つへの電界を開口寸法を変更するために変化させる請求項４５のような方法。
二層細胞膜を備え、細胞膜上の第一の場所へレーザービームを向け、第一の孔寸法より小さい粒子が第一の容器で分離されそして集められ、細胞膜上の第一の場所へ孔を開口するために電界を印加し、第二の孔寸法より小さい粒子が第二の容器で分離されそして集められ、細胞膜の第二の場所へレーザービームを向け、細胞膜上の第二の場所に孔を開口するため電界を印加することよりなる粒子分離方法。