TW200413525A - Highly controllable electroporation and applications thereof - Google Patents

Description

200413525 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於高度可控制性電穿孔法以及其應用。 t iltr 3 5 發明背景 細胞膜扮演間隔細胞内外環境分子之重要功能。細胞 膜大部分由兩親脂質組成，其可自行組裝成高度絕緣構 造，因此對於膜間之離子傳輸表現一高能屏障。 然而’脂質基質可因強大之外來電場而破壞，造成膜 10間導電性與擴散通透性增加，亦即所謂電穿孔之現象。這 些現象係因細胞膜形成水性膜孔的結果。較特別的是，電 牙孔步驟涉及細胞膜針對短期電場脈衝之通透作用，傳統 上係介於較大盤電極之間（Neumann，et al，Bi〇electr〇chem

Bioenerg 48, 3-16 (1999)； H〇5 et al. Grit Rev Biotechnol 16? 15 349-62 (1996)) 〇 舉例而a，第2A與2B圖顯示傳統電穿孔系統2〇，以 迅場作用（例如圓ί展22所示）會在一細胞膜24上產生隨機 膜孔26。這些膜孔的分佈，僅就大小與數目而言，取決 施加電場㈣度與相。施加電場越強且越長，則膜孔 20

多且越大。然而，這賴_確減置無法掌握，所以, 孔最終的分佈有日枝隨機的。研究人員無法控制化合物 導入細胞之位置’而這常常是生化反應途徑的重要部位 因此研究人員常需要依賴細胞本身的自然機制，但是在 用上卻是緩慢且困難。 5 、 電穿孔法用於導引巨分子進入細胞，包括DNA、RNA、 、則、蛋白質與各種藥劑。外圍的大量電場能引發高膜間 彳古 、 而導致膜孔形成（例如，具有直徑20-120 nm範圍）。在 包力°電脈衝時，帶電巨分子，包括DNA，可以電泳方式主 動地經由膜孔穿 入細胞膜（Neumann，et al·，Biophys J 712 868、77 (1996))。不帶電分子亦可藉由主動運輸進入膜孔。 在脈衝終止時，膜孔於上百毫秒時間内關閉，其可由恢復 後之傳導值檢測出（Ho, 1996，前述） 此方法常用於實驗室中化合物與生物分子之注入細 1〇 胞’並避免使用細胞本身的蛋白質受體與膜間通道之傳 輸。可使研究人員易於研究化合物之生物效應，判斷是否 可為抗癌藥物或致死之毒物。然而，現有的電穿孔技術有 其限制。 因此，必須提供一種方法與系統以克服傳統電穿孔法 15的一些及其他限制。 【聲明内容】 發明概要 上述及其他先前技藝之問題與缺失可以本發明之可控 制性電穿孔法之數種方法與設備加以克服或改進。本發明 20之可控制性電穿孔系統與方法允許控制水性膜孔之大小、 數目、位置與分佈，因此增加了適用性。此處所述之可控 制性電穿孔系統與方法大致上運用至少兩種子系統與子方 法。其中一種子系統與子方法係運用較廣泛之效用以削弱 細胞膜，稱為廣效性子系統。另一種子系統與子方法係運 6 200413525 用較侷限之效用以定位細胞膜上之膜孔，稱為侷效性子系 統。 本發明之上述與其他之特色及優點，可藉由以下之詳 細敘述與圖示而為熟知習知技藝者所領會與瞭解。 5 圖式簡單說明 第1A與1B圖顯示本發明所述之可控制性電穿孔系統 之操作。 第2A與2B圖顯示傳統電穿孔系統之操作。 第3 A、3 B、3 C與3 D圖顯示一細胞注射系統之一般實施 10 例。 第4A與4B圖顯示一細胞注射系統之範例。 第5 A與5 B圖顯示一陣列細胞之細胞注射系統之範例。 第6圖顯示一利用多重磷脂質膜層與電穿孔法之分離 裝置。 15 第7圖顯示一利用多重磷脂質膜層、電穿孔法與一微流 體陣列之分離裝置。 第8圖顯示一利用單膜層之不同位置具有不同膜孔之 分離裝置。 第9圖顯示一電極板網柵之範例。 20 【實施方式】 較佳實施例之詳細說明 本發明所述之可控制性電穿孔系統與方法允許控制水 性膜孔之大小、數目、位置與分佈，因此增加了實用性。 參照第1A與1B圖，本發明所述之細胞膜12可控制性電穿孔 7 200413525 系統10與方法，一般而言運用至少兩個子系統與子方法。 第1A圖顯示細胞膜12之一部份，而第1B圖顯示本發明所述 之可控制性電穿孔系統10。

值得注意的是，僅存在其中一種子系統將不足以在膜 5 上開啟或產生一膜孔14一必須運用兩種子系統，以類似之 邏輯“與”開啟方式運作。其中一種廣效性子系統16運用較 廣泛之效用以削弱細胞膜，而另一種侷效性子系統18則運 用較侷限之效用以定位細胞膜12上之膜孔14。同時運用廣 效性子系統16與侷效性子系統18可高度定位且控制電穿孔 10 法，因而開啟膜孔14。

因此，舉例而言，相較於傳統的細胞膜電穿孔法，其 描述於先前技術部分與第2A與2B圖，除了傳統電穿孔技術 所使用之電場以外，本發明所揭示之電穿孔系統與方法運 用一種侷效性子系統18導入細胞膜上之特定位置，以控制 15 膜孔14之位置。侷效性子系統18會激發磷脂質分子，因而 降低廣效性子系統16產生水性膜孔所需之能量。因此，舉 例而言，一極弱之電場可施加於一系統，其不發生電穿孔 現象。然而，此弱電場可於雷射光激發過之細胞膜部位開 啟膜孔。 20 廣效性子系統或子方法16可選自任何適用之細胞膜削 弱系統與/或方法。此弱系統與/或方法可選自一群組包含電 場(在某些較佳之實施例中為統一之電場）、微波能量、其他 電磁輻射、低能雷射光（亦即低於隨機電穿孔法所需之能 量）、或任何包含前述之弱系統與/或方法組合之至少一者。 8 之區城(例二^切面區域），—般而言大於所欲膜孔之涵蓋區 威。在某些實施例中，此區域涵蓋全部細胞膜或一陣列之 細胞勝。在其他實施例中，此區域為細胞膜部位。 10 褐效性子系統或子方法18可選自任何適用之膜孔定點 部位系、洗/、/或方法。此定點部位系統與/或方法可選自一群 組包含雷射光、電極衫、或任何包含前述之定點部位系 統/MM合之至少—者。定點部位系統/或方法18之區域 (例如横切面區域），一般而言較侷限，例如，相當於所欲膜 孔之開、，面積。因此，舉例而言，使受控制之膜孔開口具 有次微米或奈米（例如；M〇〇 nm)大小，因為現今及開發中的 雷射與電極管尖技術能達到此次微米與奈米之面積。 15 細胞漆射 2〇 2效性子方法16之能量大小，—般而言低於傳統隨 钱開啟膜孔之曾空了丨、l 曰 包牙孔法之此置。另外，弱系統與/或方法16 本發明所述之可控制性電穿孔系統與方法，在控制條 件下，可用於注射巨分子，包括DNA、RNA、染劑、蛋白 質與各種藥劑。在不侷限本發明申請案之可控制性電穿孔 系統之'丨月况下，第3 A-5B圖顯示運用可控制性電穿孔系统之 細胞勝孔開口糸統之各貫施例。 參照第3A_3D圖，一系統30顯示可控制性地將巨分子 注入細胞。弟3 A圖顯示系統3〇包括一機構32以固定一細月巧 24。機構32為適用之微機械裝置包括相關微系統，其為習 知之生物技術。此機構32較佳為可固定個別之細胞或控制 9 200413525 之細胞圑。另外，機構32亦可用於由細胞24中獲取生物學、 電學、光學或其他之數據。 參照第3B圖，系統30顯示包括機構32以固定細胞24, 且一可控制性電穿孔系統包括廣效性子系統16與侷效性子 5 系統18，其中侷效性子系統18針對細胞24的某一位置以引 發一膜孔34開口。

參照第3C圖，導入一巨分子38，舉例而言，藉由一奈 喷嘴或其他適用之注射裝置36。當移除侷效性子系統18與/ 或廣效性子系統16時，膜孔會關閉，使細胞24’内具有巨分 10 子38 〇

第4A與4B圖顯示以可控制性電穿孔系統40開啟細胞 24上一膜孔34之一實施例，例如，導入前述之巨分子。系 統40包括一個電場產生配備42、44、46形式之廣效性子系 統，以及一個適當光源之雷射光48 (未列出）。電場產生配 15 備之形式為一電極板4 2連接一可切換（藉由一開關4 4)電源 46。如所示，雷射光可聚焦，而電場施加以啟動膜孔開口 機制，其類似前述之邏輯“與”回路方式。 有關第3A-3D圖與第4A-4B圖之系統及方法之描述，研 究人員僅需以少量組織細胞接觸於生物藥劑，並觀察其傳 20 導至鄰近細胞之訊號。或者，研究人員可研究是否非對稱 性細胞如神經元與腸胃黏膜細胞對於處理藥物之不同反 應。 參照第5A與5B圖，顯示系統50為類似第3A-3D圖或第 4A-4B圖並結合一細胞24陣列52之操作。當啟動廣效性子系 10 200413525 統16與偈效性子系統18時，細胞24上可形成膜孔34。此膜 孔可用於選擇性地將巨分子導人細胞24之中。 分離裝置 > ’、、、第6 1GS] ’其為利用本發明之可控制性電穿孔系 統所提供之喊/分離|置之各種實施例。 ίο 15 第6圖描述系統6G之—實施例，例如，-分子篩。系統 6〇包括複數個膜層62，例如，磷脂質雙層膜。每-膜層62 在運用廣生子系統時可受制於—侷效性子系統，或者膜 孔64之位置可於組合與/或製造時事先決定，例如，藉由適 當之微-或奈缺陷，或可能—致，以使每—膜層之電壓強度 決定其膜孔大小。每-臈層所施加之不同電壓(例如 與V3)可經大膜孔64至小膜祕而職—據膜梯度，允許分 子66通過適當膜層。 ’而濾膜60可重複 ’以小心控制施加 使用一磷脂質雙層膜，其成本極低 使用且適用於電穿孔法所需之任何大小 電場。 參知第7圖’系統70顯示一分子篩，其功用類似第6圖 中之具備通道74之生物晶片陣列72。通道π可作為巨分子 與分子大小之篩選之用。另外，通道74可配合梯度系統， 20例如壓力、熱力、電力或其他系統以引導巨分子與分子至 陣列72。陣列72可為任何適用之微流體或奈流體裝置。舉 例而言，製造此類裝置之方法如登錄於2〇〇3年11月3〇日之

Reveo Inc. PCT申請案No. PCT/US03/37304所述，其標題為

Three Dimensional Device Assembly and Production 11 200413525

Methods Thereof，，其於本發明中為參考資料。 第8圖顯示另一動態過濾裝置之範例，其中—雷射户 提供膜孔開π之定位。第8圖顯示—過濾系物，:括: 和連接於-廣效性子系統16與—触性子系仙。舉例 而a，侷效性子系統18可配合—雷射陣列抑。或者，除 雷射陣觸，可接上_光導裝置之唯—雷射源1雷= 列接觸細胞膜82上的某個位置時，膜孔％會開啟。膜 小受至於細賴本身之特性、侷錄子系、纟純域或大 或者廣效性子系統之大小。 ίο 15

細胞、蛋白質、酵素、DNA分子、職分子與其他巨 分子或分子可受制於—容器86陣列，例如位於—適當 流體裝置。因此’分離裝謂無論如何必須更實用。 第9圖顯示本發明之各實施例中，適於提供k性子系 、，充之電極之-|&例。藉由提供電極網栅之方式，可供應^ 用之電場產生系統以符合各種錢，包括倾性子系^ 巨分子導引、過濾或任何其他目的。

除了依據大小之過渡，前述之分離裝置亦可基於離子 價而分離’因為施加電壓僅能驅使—種離子類型通過細胞 膜0 2〇 知親本說明書’其目的在於描述本發明之較佳實施 =，而非侷限本發明於任—實施例或特定用途。熟習此技 藝人士應可體認到，依照本發明所揭露，所示範之實施例 可作各種不脫離本發明之修飾與改良。所有此種修飾斑改 良皆包含於本發明揭示内容之範轉巾。 、 12 200413525 【圖式簡單說明3 第1A與1B圖顯示本發明所述之可控制性電穿孔系統 之操作。 第2A與2B圖顯示傳統電穿孔系統之操作。 5 第3A、3B、3C與3D圖顯示一細胞注射系統之一般實施 例。 第4A與4B圖顯示一細胞注射系統之範例。 第5 A與5 B圖顯示一陣列細胞之細胞注射系統之範例。 第6圖顯示一利用多重磷脂質膜層與電穿孔法之分離 10 裝置。 第7圖顯示一利用多重磷脂質膜層、電穿孔法與一微流 體陣列之分離裝置。 第8圖顯示一利用單膜層之不同位置具有不同膜孔之 分離裝置。 15 第9圖顯示一電極板網栅之範例。 【圖式之主要元件代表符號表】 10、40···可控制性電穿孔系統 30、50…系統 12…細胞膜 32…機構 14、26、34、64、84···膜孔 36···注射裝置 16…廣效性子系統 38…巨分子 18···侷效性子系統 42…電極板 20…傳統電穿孔系統 44…開關 22…圓環 46…可切換電源 24、24’···細月包 48…雷射光 13 200413525 52…陣列 60…濾膜系統 66···分子 70…分子筛系統 72…生物晶片陣列 74···通道 80…過濾系統 82···膜層 86···容器 88…雷射陣列

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Claims (1)

1. 拾、申請專利範圍： 1· -種用於膜之可控制性電穿孔系統，其包含有： 廣效性子系統，以提供廣泛能量至該膜；以及 侷效性子系統，以提供侷限能量至該膜， /、中在一對應於該侷限能量位置之位置處開 產生一孔。 〆 2.,申請專利範圍第旧之系統，其中該廣效性子系統係 選自於由電場、微波能量、其他電磁輻射、低能雷射光、 或包含前述弱系統中之至少一者的任一組合 弱系統群組中。 3.如申請專利範圍第丨項之系統，其中該廣效性子系統之 能量大小低於不具有該偏效性子系統之電穿孔系統之 能量大小，藉此，產生任意膜孔。 4·如:請專利範圍第1項之㈣，其中該廣效性子系統所 /函盍之區域大於所欲之膜孔大小。 5.如:請專利範圍第旧之系統，其中該廣效性子系統之 ’函蓋區域包令--細胞之膜。 5’如申請專利範圍第！項之系統，其中該廣效性子系統之 /函盍區域包含一細胞陣列之膜。 如切專利範圍第！項之系統，其中該廣效性子系統之 /函蓋區域包含一膜之一部位。 •如申請專利範圍第！項之系統，其中該侷效性子系統係 選自於由雷射光、電極管尖、或前述定點部位系統中之 至少-者的任-組合所構成之定點部位系統群組中。 15 9.200413525 統之 如申請專利範圍第丨項之系統，其中_效性子系 區域對應於該膜孔之開口大小。 /、 其中該膜孔具有次微米 10·如申請專利範圍第1項之系統， 大小。 5 11_如申請專利範圍第丨項之系統， 米或更小之尺寸。 其中該膜孔具有約100奈 12·—種可控制性電穿孔系統，其包含有： 一廣效性子㈣，以提供廣泛能量至膜；以及 10

   一侷效性子純，以提供侷限能量至該膜， 、其中當該廣效性子系統與該侷效性子系統二者均 被啟動時，會開啟一孔。 13· -種用於可控制性地開啟—位在膜上之孔的方法，其勺 含有： I 導引廣泛能量至該膜；以及 導引侷限能量至該膜， 其中在-對應於該侷限能量位置之位置處開啟或

   產生一孔。 14.如申請專利範圍第13項之方法，其中該廣泛能量係選自 於由電％、Μ波能$、其他電磁_射、低能雷射光、或 前述弱系統組合中之至少一者的任一組合所構成之能 量系統群組中。 15 ·如申請專利範圍第i 3項之方法，其中該廣泛能量之能量 大小低於不具有該侷效性子系統之電穿孔系統之能 量，藉此，產生任意膜孔。 16 200413525 16·如申請專利範圍第13項之方法，其中該廣泛能量所涵蓋 之區域包含一大於所欲之膜孔大小之區域。 17.如申請專利範圍第13項之方法，其中該廣泛能量之涵蓋 區域包含一細胞之膜。 18·如申晴專利範圍第13項之方法，其中該廣泛能量之涵蓋 區域包含一細胞陣列之膜。 19.如申請專利範圍第13項之方法，其中該廣泛能量之涵蓋 區域包含一膜之一部位。 1〇 2〇·如申凊專利範圍第13項之方法，其中該侷限能量係選自 於由雷射光、電極管尖、或前述定點部位系統中之至少 一者的任一組合所構成之定點部位系統群組中。 21. 如申凊專利範圍第13項之方法，其中該侷限能量之區域 對應於該膜孔之開口大小。 22. 如巾請專利範圍第13項之方法，其中該孔具有次微米大 15 小。 23·如申請專利範圍第13項之方法，其中該孔具有大約1〇〇 示米或更小之面積。 24· —種細胞膜開孔系統，其包含有： 一微機械裝置以固定一細胞；以及 20 一如申請專利範圍第1項之系統，以可控制性地於 該細胞上開啟一孔。 25. 如申請專利範圍第24項之細胞膜開孔系統，其中該廣效 性子系統包含一電極板與一可切換電壓源。 26. 如申請專利範圍第24項之細胞膜開孔系統，其中該侷效 17 200413525 性子系統包含一雷射。 27. —種細胞膜孔巨分子系統，其包含有： 一微機械裝置，以固定一細胞； 一如申請專利範圍第1項之系統，以可控制性地於 5 該細胞上開啟一孔；以及 一巨分子注射裝置，以經由該孔將一巨分子注入該 細胞。

   28. —種開啟細胞膜孔之方法，其包含有： 固定一細胞；以及 10 應用如申請專利範圍第13項之方法，以可控制性地 於該細胞上開啟一孔。 29. —種用以將一巨分子導入一細胞内之方法，其包含有： 固定一細胞； 應用如申請專利範圍第13項之方法，以可控制性地 15 於該細胞上開啟一孔；以及

   經由該孔將該巨分子導入該細胞内。 30. —種用於過濾分子或巨分子之系統，其包含有： 複數個膜層，各膜層包括一如申請專利範圍第1項 之可控制性地於細胞上開啟一孔之系統，各膜層被開啟 20 成具有不同的孔徑，以產生一孔大小梯度。 31. —種過濾分子或巨分子之系統，其包含有： 數個膜層；以及 一廣效性子系統，其與各膜層相結合， 其中各膜層包括一具有缺陷之位置，藉此，該位置 18 關閉而不啟動該廣效性子系統，且藉由啟動該廣效性子 系統而開啟該位置。 32·如申睛專利範圍第31項之系統，其中位於各膜層之缺陷 控制該孔之大小。 33·如申請專利範圍第31項之系統，其中該廣效性子系統之 能量大小控制該孔之大小。 •種用以過濾分子或巨分子之系統，其包含有： 膜層’其包括如申請專利範圍第1項之可控制性 地開啟一位於細胞上之孔的系統， 其中違侷效性能量子系統包含一侷效性能量次子 系統之陣列。 35· 一種用以過濾分子或巨分子之系統，其包含有： 一膜層，其包括如申請專利範圍第1項之可控制性 地開啟一位於細胞上之孔的系統， 15 其中該侷效性能量子系統包含一雷射陣列。 36· —種用以過濾分子或巨分子之系統，其包含有： 膜層’其包括如申請專利範圍第1項之可控制性 地開啟一位於細胞上之孔的系統， 其中该侷效性能量子系統包含一與電磁能源相連 20 結之光導裝置。 37. —種可控制性開孔裝置，其包含有： 一雙層細胞膜； 一雷射光源；以及 一電場來源， 19 200413525 其中將由該雷射光源發出之一雷射光施用於該雙 層細胞膜的一個位置上，以界定出一開孔部位，並施加 該電場來源發出之一電場而開啟該孔。 38. 如申請專利範圍第37項之可控制性開孔裝置，其中該雙 5 層細胞膜包含有磷脂質。

   39. 如申請專利範圍第37項之可控制性開孔裝置，由該雷射 光激發局部之分子，藉此減少開孔所需之電場能量，其 中該電場可相較於雷射光不存在時之開啟該孔所需之 電場值為弱。 10 40.—種濾膜裝置，其包含如申請專利範圍第37、38與39項 之可控制性開孔裝置。 41. 一種分離裝置，其包含數個如申請專利範圍第40項之濾 膜裝置，其等被堆疊一起並有不同電壓施加於各濾膜， 藉此使孔之大小有所區別。 15 42.如申請專利範圍第40項之濾膜裝置，其中一雷射光源能

   導引一雷射光至膜上之數個部位，藉此界定出於施加電 場時供開孔用之不同位置。 43. 如申請專利範圍第42項之濾膜裝置，其中孔之大小因膜 之特性而變或因電場位準而不同，其更包含數個與膜上 20 雷射光施加部位相連之容器。 44. 一種用以分離顆粒之方法，其包含有： 提供一雙層膜； 導引一雷射光至膜上之一位置；以及 施加一電場以開啟位於該膜上之該位置之一孔，藉 20 200413525 此，顆粒小於該孔大小者將被分離。 45. —種用以分離顆粒之方法，其包含有： 提供數個雙層膜之堆疊體； 導引一雷射光至該膜上之一位置；以及 5 施加一分離電場至各膜層，以開啟位於各膜層之 子L 。 46. 如申請專利範圍第45項之方法，其中該電場施加至數個 膜層中之至少一者被變化，以改變開口大小。 47. —種分離顆粒之方法，其包含有： 10 提供一雙層膜； 導引雷射光至該膜上之第一位置； 施加一電場以開啟位於該膜上第一位置之膜孔，則 顆粒小於第一膜孔者將被分離，且收集於一第一容器； 導引該雷射光至位於該膜上之第二位置；以及 15 施加一電場以開啟位於該膜上第二位置之膜孔，則 顆粒小於第二膜孔者將被分離，且收集於一第二容器。 21