CN112135627A - 细胞内递送生物分子以修饰免疫应答 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了包含抗原和佐剂的T细胞、制造此类T细胞的方法、以及使用此类T细胞诸如用于调节个体的免疫应答的方法。

Description

细胞内递送生物分子以修饰免疫应答
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年3月12日提交的美国临时申请号62/641,987、2018年9月28日的美国临时申请号62/738,941、2019年1月18日提交的美国临时申请号62/794,516的优先权；将所述临时申请通过引用以其整体特此并入。
ASCII文本文件序列表的提交
将以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：750322001540SEQLIST.TXT，记录日期：2019年3月11日，大小：14KB)。
技术领域
本公开文本总体上涉及包含抗原和/或佐剂的T细胞、制造此类T细胞的方法、以及使用此类T细胞诸如用于调节个体的免疫应答的方法。
背景技术
免疫疗法可分为两种主要干预类型：被动干预或主动干预。被动方案包括给予预激活和/或工程化细胞、疾病特异性治疗性抗体、和/或细胞因子。主动免疫疗法策略涉及体内刺激免疫系统效应子功能。当前的若干种主动方案包括用疾病相关肽、裂解物或同种异体全细胞进行疫苗接种策略；输注作为肿瘤抗原递送的媒介物的自体DC；以及输注免疫检查点调节剂。参见Papaioannou,Nikos E.等人Annals of translational medicine 4.14(2016)。
通过疾病相关抗原刺激的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4+辅助T(Th)细胞具有靶向和破坏患病细胞的潜力，然而，目前用于诱导内源性T细胞应答的方法面临挑战。
本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)均通过引用以其整体并入。
发明内容
在一些方面，本发明提供了一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原对于所述经修饰的T细胞是外源的并且包含免疫原性表位，并且其中所述佐剂存在于细胞内。在一些实施方案中，本发明提供了一种经修饰的T细胞，其包含抗原，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供了一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原包含免疫原性表位，所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；以及b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞；从而产生包含所述抗原和佐剂的所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间和/或与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的抗原与佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
在一些方面，本发明提供了一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原包含免疫原性表位，所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含所述佐剂，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使所述抗原通过以形成扰动的输入T细胞；以及b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
在一些方面，本发明提供了一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原包含免疫原性表位，所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含所述抗原，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；以及b)将所述扰动的输入T细胞与所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
在一些实施方案中，当所述输入T细胞通过所述缩窄部时向所述输入T细胞施加变形力，从而引起所述输入T细胞的扰动。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：将所述输入T细胞和/或经修饰的T细胞与一种药剂一起孵育，与在没有所述进一步孵育步骤的情况下制备的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述药剂是增强内吞作用或充当稳定剂或辅助因子的化合物。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径小于所述输入T细胞的直径。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约60％。
在一些实施方案中，所述抗原和/或佐剂存在于所述经修饰的T细胞的细胞质液和/或囊泡中。在一些实施方案中，所述囊泡是胞内体。在一些实施方案中，所述抗原和/或所述佐剂存在于所述经修饰的T细胞的多个隔室中。在一些实施方案中，所述抗原或免疫原性表位结合至所述经修饰的T细胞的表面。
在一些实施方案中，所述佐剂是CpG寡聚脱氧核苷酸(ODN)、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、或聚I:C。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN是A类CpG ODN、B类CpG ODN、或C类CpG ODN。
在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自疾病相关抗原。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自从患病细胞分离的肽或mRNA。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自非自身抗原。在一些实施方案中，其中所述免疫原性表位源自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、或真菌抗原。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自人乳头瘤病毒(HPV)抗原。在一些实施方案中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施方案中，所述抗原包含源自HPVE6和/或E7的HLA-A2限制性肽。在一些实施方案中，所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:1-4中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含多种抗原，所述多种抗原包含多种免疫原性表位。在一些实施方案中，在向个体给予包括包含所述多种免疫原性表位的所述多种抗原的所述经修饰的T细胞之后，所述多种免疫原性表位均不降低所述个体对任何其他免疫原性表位的免疫应答。在一些实施方案中，所述抗原是多肽并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。在一些实施方案中，所述免疫原性肽表位与N末端侧翼多肽和/或C末端侧翼多肽融合。在一些实施方案中，所述抗原是包含免疫原性肽表位和一个或多个异源肽序列的多肽。在一些实施方案中，所述抗原是包含免疫原性肽表位的多肽，所述免疫原性肽表位在N末端和/或C末端侧接异源肽序列。在一些实施方案中，所述侧翼异源肽序列源自疾病相关免疫原性肽。在一些实施方案中，N末端侧接多肽包含SEQ ID NO:5-10中任何一个的氨基酸序列和/或C末端侧接多肽包含SEQ ID NO:11-17中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原与所述佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含复合物，所述复合物包含：a)所述抗原，b)所述抗原和至少一种其他抗原，和/或c)所述抗原和所述佐剂。
在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。在一些实施方案中，所述药剂是白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。在一些实施方案中，所述药剂包含小鼠血清白蛋白(MSA)。
在一些实施方案中，将所述细胞进一步修饰以增加一种或多种共刺激分子的表达。在一些实施方案中，所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、或CD112。在一些实施方案中，所述细胞包含导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。
在一些实施方案中，与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。在一些实施方案中，与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经修饰的T细胞在被给予所述经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期增加。
在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、或自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、或γδ-T细胞。
在一些方面，本发明提供了一种组合物，其包含本文描述的任何一种经修饰的T细胞。在一些方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本文描述的经修饰的T细胞和药学上可接受的载体。
在一些方面，本发明提供了一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：向所述个体给予如本文描述的经修饰的T细胞、如本文描述的组合物、或如本文描述的药物组合物。
在一些方面，本发明提供了一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)向所述个体给予经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包含抗原，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列；以及b)向所述个体给予佐剂。
在一些方面，本发明提供了一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原和佐剂通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和佐剂的经修饰的T细胞；以及c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间和/或与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的抗原与佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
在一些方面，本发明提供了一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含佐剂，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的经修饰的T细胞；以及c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
在一些方面，本发明提供了一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含抗原，其中所述抗原包含免疫原性表位，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；b)将所述扰动的输入T细胞与所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的经修饰的T细胞；以及c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述抗原。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。在一些实施方案中，经修饰的T细胞中的所述抗原与所述佐剂的比率在约10000:1与约1:10000之间。
在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含复合物，所述复合物包含：a)所述抗原，b)所述抗原和至少一种其他抗原，和/或c)所述抗原和所述佐剂。
在一些方面，本发明提供了一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原的经修饰的T细胞；c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞；以及d)向所述个体给予佐剂。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
在一些实施方案中，当所述输入T细胞通过所述缩窄部时向所述输入T细胞施加变形力，从而引起所述输入T细胞的扰动。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：将所述输入T细胞和/或经修饰的T细胞与一种药剂一起孵育，与在没有所述进一步孵育步骤的情况下制备的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。在所述方法的一些实施方案中，所述免疫应答增强。在一些实施方案中，所述增强的免疫应答是针对所述抗原的。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径小于所述输入T细胞的直径。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约60％。
在一些实施方案中，所述抗原和/或佐剂存在于所述经修饰的T细胞的细胞质液和/或囊泡中。在一些实施方案中，所述囊泡是胞内体。在一些实施方案中，所述抗原和/或所述佐剂存在于所述经修饰的T细胞的多个隔室中。在一些实施方案中，所述抗原或免疫原性表位结合至所述经修饰的T细胞的表面。
在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、或聚I:C。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN是A类CpGODN、B类CpG ODN、或C类CpG ODN。
在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自疾病相关抗原。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自从患病细胞分离的肽或mRNA。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自非自身抗原。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、或真菌抗原。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自人乳头瘤病毒(HPV)抗原。在一些实施方案中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施方案中，所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。在一些实施方案中，所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:1-4中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含多种抗原，所述多种抗原包含多种免疫原性表位。在一些实施方案中，所述多种免疫原性表位的任一个不降低所述个体对任何其他免疫原性表位的免疫应答。在一些实施方案中，所述抗原是多肽并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。在一些实施方案中，所述免疫原性肽表位与N末端侧翼多肽和/或C末端侧翼多肽融合。在一些实施方案中，所述免疫原性肽表位与所述N末端侧翼多肽融合和/或所述C末端侧翼多肽是非天然存在的序列。在一些实施方案中，所述N末端和/或C末端侧翼多肽源自免疫原性合成长肽(SLP)。在一些实施方案中，所述N末端和/或C末端侧翼多肽源自疾病相关免疫原性SLP。在一些实施方案中，N末端侧接多肽包含SEQ ID NO:5-10中任何一个的氨基酸序列和/或C末端侧接多肽包含SEQ ID NO:11-17中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。在一些实施方案中，所述药剂是白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。
在一些实施方案中，与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经修饰的T细胞而在所述个体中产生的先天性免疫应答降低。在一些实施方案中，与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经修饰的T细胞在被给予所述经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期增加。
在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、或自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、或γδ-T细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞对所述个体而言是同种异体的。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞对所述个体而言是自体的。在一些实施方案中，将所述个体预调理以调节炎症和/或免疫应答。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述个体给予第二佐剂。在一些实施方案中，所述第二佐剂是IFN-α或CpG ODN。在一些实施方案中，并行地或同时给予所述经修饰的T细胞和所述第二佐剂。在一些实施方案中，依序给予所述经修饰的T细胞和所述第二佐剂。在一些实施方案中，在给予所述第二佐剂之前给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，在给予所述第二佐剂之后给予所述经修饰的T细胞。
在一些实施方案中，在给予免疫检查点抑制剂之前、并行地或之后给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的任何一种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、和TIM-3。在一些实施方案中，向所述个体给予所述经修饰的T细胞导致对所述抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。在一些实施方案中，向所述个体给予所述经修饰的T细胞导致对所述抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。在一些实施方案中，给予所述个体的所述经修饰的T细胞的量在约1x 106个与约1x 1012个细胞之间。
在一些实施方案中，所述方法包括多次给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，在两次相继给予所述经修饰的T细胞之间的时间间隔在约1天与约30天之间。
在一些方面，本发明提供了一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：向所述个体给予与抗原缔合的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：
a)将输入T细胞与抗原和/或佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原与所述输入T细胞的细胞表面缔合，其中所述抗原包含免疫原性表位，从而产生与所述抗原缔合的经修饰的T细胞；以及b)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，所述佐剂是CpGODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
附图说明
图1A示出了治疗组和时间表的代表性示意图。图1B示出了在图1A中概述的来自未治疗组(无T细胞的过继转移)的小鼠与来自治疗组B-E的小鼠之间比较如通过式((长度x宽度2)/2)测量的肿瘤生长。
图2A示出了用于评估E7抗原的代表性示意图。图2B示出了SLP序列对响应于TAPC疫苗接种而产生的产生IFN-γ的CD8+ T细胞的影响。
图3是示出了在体外人模型中E6 SLP在E6应答T细胞中诱导抗原特异性免疫应答的能力的图。
图4示出了E7 SLP在E711-20应答T细胞中诱导抗原特异性免疫应答的能力以及在体外人模型中SLP序列对SQZ T细胞APC(Tapc)激活的影响。
图5示出了在体外人模型中评估用于SQZ T细胞APC的抗原的剂量的研究结果。
图6示出了确定在体外人模型中SQZ T细胞APC的供体变异性的研究结果。
图7A是比较使用不同佐剂的免疫应答的稳健性的实验示意图。图7B示出了比较使用聚I:C和CpG ODN的免疫应答的稳健性的实验结果。
图8A是评估CpG ODN浓度对免疫应答的影响的实验示意图。图8B示出了评估CpGODN浓度对免疫应答的影响的实验结果。
图9A是评估CpG ODN的给药时间表对于免疫应答的实验示意图。图9B示出了评估CpG ODN的给药时间表对于免疫应答的实验结果。
图10A是评估细胞内和全身佐剂给予的组合对TAPC抗肿瘤功能的实验示意图。图10B示出了每个实验组的T细胞应答，并且图10C示出了每个实验组的肿瘤生长。图10D示出了相对于未治疗的动物，在用SQZ(E7+CpG)治疗的动物中再激发后的肿瘤生长。
图11A是评估组合多种HPV抗原对TAPC抗肿瘤功能的影响的实验示意图。图11B示出了每个实验组的T细胞应答，并且图11C示出了每个实验组的肿瘤生长。
图12A示出了评估CpG佐剂的给予途径对E7特异性TAPC抗肿瘤作用的重要性的实验结果。提供了给药时间表。图12B示出了每个治疗组中的个体小鼠的随时间变化的肿瘤体积。
图13示出了评价共给予的佐剂导致E7特异性T细胞肿瘤浸润的能力的实验示意图。T细胞应答在下图中示出。
图14A是确定用于负载有E7合成长肽(SLP)+CpG的TAPC的初免和加强两者的疫苗接种时间表的实验示意图。图14B示出了每个实验组的肿瘤生长。
图15示出了实验结果，其显示SQZ的TAPC可以直接呈递抗原。
图16示出了佐剂的SQZ递送在体外不显著改变T细胞细胞因子水平。
图17示出了抗原+/-佐剂的SQZ递送在体内不显著改变血清细胞因子水平。
图18A示出了直方图，其代表具有相对量的在MHC-I上呈递的最小表位的细胞群体。图18B示出了通过平均荧光强度测量的抗原呈递量/细胞。
图19示出了在体外模型中，负载有CMV pp65抗原的T细胞在pp65应答T细胞中诱导抗原特异性免疫应答的能力。
图20示出了相对于在共给予或不共给予佐剂的情况下给予用SQZ负载有HPV16 E7SLP的TAPC的肿瘤，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)募集的相对量。
图21示出了对于较短期(右侧腹肿瘤，在第0天注射)以及较长期保护(左侧腹肿瘤，在第60天注射)两者，在用于确定SQZ负载的T细胞充当APC用于预防性治疗HPV相关肿瘤的能力的实验中随时间变化的肿瘤体积。
图22示出了在用于确定T细胞剂量、共给予佐剂以及给予次数(初免与初免/加强)对SQZ负载的T细胞充当APC用于治疗性治疗HPV相关肿瘤的能力的影响的实验中随时间变化的肿瘤体积。在图22中，“P”指示初免，并且“B”指示加强。
具体实施方式
抗原呈递细胞(APC)在诱导CTL的内源性激活中起关键作用。在这项工作中，描述了实施
Figure BDA0002763166550000121
平台以工程化T细胞APC(TAPC)，用于调节对多种适应症(包括癌症和感染性疾病)的免疫应答。通过使得能够高效地将靶抗原和/或佐剂经细胞质液递送至T细胞，此平台证明了体内诱导靶抗原的有效MHC-I呈递和CTL的刺激的能力。
在一些方面，本申请提供了经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原包含免疫原性表位，并且其中所述佐剂存在于细胞内。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞通过以下方式制备：a)使输入T细胞通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述输入T细胞输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；以及b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞；从而产生包含所述抗原和佐剂的所述经修饰的T细胞。还提供了使用经修饰的T细胞调节个体的免疫应答，例如增强个体的免疫应答的方法。在一些实施方案中，所述增强的免疫应答是针对所述抗原的。在一些实施方案中，所述细胞变形缩窄部被包含在微流体通道(诸如本文描述的任何微流体通道)内。
在其他方面，提供了一种调节个体的免疫应答的方法，其包括向所述个体给予a)包含抗原的经修饰的T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；以及b)佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞通过以下方式制备：a)使输入T细胞通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述输入T细胞输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使所述抗原通过以形成扰动的输入T细胞；以及b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞；从而产生包含所述抗原的所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述免疫应答增强。在一些实施方案中，所述增强的免疫应答是针对所述抗原的。在一些实施方案中，所述细胞变形缩窄部被包含在微流体通道(诸如本文描述的任何微流体通道)内。
通用技术
本领域技术人员通常很好理解并且通常使用常规方法来使用本文描述或引用的技术和程序，例如像描述在以下项中的广泛使用的方法：Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Sambrook等人,第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,2003)；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2:APractical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑,1995)；Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow和Lane编辑,1988)；Culture of Animal Cells:A Manualof Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney,第6版,J.Wileyand Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Methods inMolecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑,Academic Press,1998)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,J.Wiley and Sons,1993-8)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,1996)；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；PCR:ThePolymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑,1994)；Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑,J.Wiley and Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等人,2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；ntibodies:A Practical Approach(D.Catty编辑,IRLPress,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,Harwood Academic Publishers,1995)；和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人编辑,J.B.LippincottCompany,2011)。
定义
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用并且在适当时，以单数形式使用的术语也包括复数并且反之亦然。在下文列出的任何定义与通过引用并入本文的任何文献发生冲突的情况下，应该以列出的定义为准。
如本文所使用，除非另外指示，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。
应理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“包含多个方面和实施方案”、“由多个方面和实施方案组成”和“基本上由多个方面和实施方案组成”。
如本文所用的术语““约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。
如本文所用的术语“孔”是指开口，包括但不限于材料内的洞、撕裂、腔、孔口、断裂、间隙或穿孔。在一些例子中，(在指示的情况下)所述术语是指本公开文本的表面内的孔。在其他例子中，(在指示的情况下)孔可以是指细胞膜中的孔。
如本文所用的术语“膜”是指含有孔的选择性屏障或薄片。所述术语包括充当边界或衬里的柔韧的片状结构。在一些例子中，所述术语是指含有孔的表面或过滤器。所述术语不同于术语“细胞膜”。
如本文所用的术语“过滤器”是指允许选择性通过孔的多孔制品。在一些例子中，所述术语是指含有孔的表面或膜。
如本文所用的术语“不均匀的”是指在结构或组成上是混合的或不均一的物质。在一些例子中，所述术语是指在给定表面内具有不同尺寸、形状或分布的孔。
如本文所用的术语“均匀的”是指在整个结构或组成上一致或均一的物质。在一些例子中，所述术语是指在给定表面内具有一致尺寸、形状或分布的孔。
术语“异源的”当其涉及核酸序列(诸如编码序列和控制序列)时表示通常不连接在一起和/或通常不与特定细胞缔合的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区域是在另一个核酸分子内或与其附接的核酸区段，所述核酸区段在自然界中未发现与另一分子缔合。例如，核酸构建体的异源区域可以包括如下编码序列，其侧接在自然界中未发现与所述编码序列缔合的序列。异源编码序列的另一个例子是其中编码序列本身在自然界中找不到的构建体(例如，具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。类似地，出于本发明的目的，被细胞中通常不存在的构建体转化的细胞将被认为是异源的。如本文所用，等位基因变异或自然发生的突变事件不产生异源DNA。
术语“异源的”当其涉及氨基酸序列(诸如肽序列和多肽序列)时表示通常不连接在一起和/或通常不与特定细胞缔合的序列。因此，肽序列的“异源”区域是在另一个氨基酸分子内或与其附接的氨基酸区段，所述氨基酸区段在自然界中未发现与另一分子缔合。例如，肽构建体的异源区域可以包括侧接这样的序列的肽的氨基酸序列，所侧接的序列在自然界中未发现与所述肽的氨基酸序列缔合。异源肽序列的另一个例子是其中编码序列本身在自然界中找不到的构建体(例如，具有与天然基因编码的不同的氨基酸的合成序列)。类似地，出于本发明的目的，被表达在细胞中通常不存在的氨基酸构建体的载体转化的细胞将被认为是异源的。如本文所用，等位基因变异或自然发生的突变事件不产生异源肽。
术语“外源”在涉及细胞时用于指诸如抗原或佐剂的药剂时，是指从细胞外部(即，从细胞外部)递送的药剂。细胞可能具有或可能不具有已经存在的药剂，并且在已递送外源药剂之后可能产生或可能不产生所述药剂。
如本文所用，术语“抑制”可以指阻断、减少、消除或以其他方式拮抗特定靶标的存在或活性的行为。抑制可以指部分抑制或完全抑制。例如，抑制免疫应答可以指导致对免疫应答的阻断、减少、消除或任何其他拮抗作用的任何行为。在其他例子中，对核酸表达的抑制可以包括但不限于核酸转录的降低、mRNA丰度的降低(例如，沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制等。
如本文所用，术语“阻抑”可以指降低、减少、禁止、限制、减低、或以其他方式削弱特定靶标的存在或活性的行为。阻抑可以指部分阻抑或完全阻抑。例如，阻抑免疫应答可以指导致降低、减少、禁止、限制、减低、或以其他方式削弱免疫应答的任何行为。在其他例子中，对核酸表达的阻抑可包括但不限于核酸转录的降低、mRNA丰度的降低(例如，沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制等。
如本文所用，术语“增强”可以指提高、加强、强化或以其他方式增加特定靶标的存在或活性的行为。例如，增强免疫应答可以指导致提高、加强、强化或以其他方式增加免疫应答的任何行为。在一个示例性例子中，增强免疫应答可以指使用抗原和/或佐剂来提高、加强、强化或以其他方式增加免疫应答。在其他例子中，增强核酸的表达可以包括但不限于核酸转录的增加、mRNA丰度的增加(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的增加、mRNA翻译的增加等。
如本文所用，术语“调节”可以指变化(changing)、改变、变化(varying)或以其他方式修饰特定靶标的存在或活性的行为。例如，调节免疫应答可以指导致变化(changing)、改变、变化(varying)或以其他方式修饰免疫应答的任何行为。在其他例子中，调节核酸的表达可以包括但不限于核酸转录的改变、mRNA丰度的改变(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的相应改变、mRNA翻译的改变等。
如本文所用，术语“诱导”可以指引发、激励、刺激、建立或以其他方式产生结果的行为。例如，诱导免疫应答可以指导致引发、激励、刺激、建立或以其他方式产生所希望的免疫应答的任何行为。在其他例子中，诱导核酸表达可以包括但不限于引发核酸转录、引发mRNA翻译等。
如本文使用的术语“同源的”是指源自相同生物体的分子。在一些例子中，所述术语是指在给定生物体内通常发现或表达的核酸或蛋白质。
如本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的聚合物形式的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。因此，所述术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA；基因组DNA；cDNA；DNA-RNA杂合体；或者包括嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学修饰的或生化修饰的核苷酸碱基、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的主链可以包含糖和磷酸基团(正如典型地可在RNA或DNA中所见的)或者经修饰或取代的糖或磷酸基团。可替代地，多核苷酸的主链可以包含合成亚基(诸如氨基磷酸酯和硫代磷酸酯)的聚合物，并且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。另外，双链多核苷酸可以从化学合成的单链多核苷酸产物，通过合成互补链并且在适当的条件下使所述链退火或者是通过使用DNA聚合酶用适当的引物从头合成互补链来获得。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。氨基酸残基的此类聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖全长蛋白质及其片段两者。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指这样的蛋白质，其包括对天然序列的修饰(诸如缺失、添加和取代)(在本质上通常是保守的)，只要所述蛋白质保持所希望的活性即可。这些修饰可以是故意的(如通过定点诱变)，或者可以是偶然的(诸如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。
如本文所用，术语“佐剂”是指直接或间接调节和/或产生免疫应答的物质。通常，与单独的抗原相比，将佐剂与抗原结合给予以实现针对抗原的免疫应答的增强。本文描述了各种佐剂。
术语“CpG寡聚脱氧核苷酸”和“CpG ODN”是指DNA分子，其含有被磷酸酯隔开的胞嘧啶和鸟嘌呤的二核苷酸(在本文中也称为“CpG”二核苷酸或“CpG”)。本公开文本的CpGODN含有至少一种未甲基化的CpG二核苷酸。即，CpG二核苷酸中的胞嘧啶未被甲基化(即，不是5-甲基胞嘧啶)。CpG ODN可以具有部分或完全的硫代磷酸酯(PS)主链。
如本文所用，“药学上可接受的”或“药理学上相容的”意指不是生物学上或在其他方面不希望的材料，例如所述材料可以掺入给予患者的药物组合物中而不引起任何显著的不希望的生物学作用或以有害方式与其所处组合物的任何其他组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选满足毒理学和制造测试的要求标准和/或包括在美国食品和药物管理局编写的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)中。
对于本文描述的任何结构和功能特征，确定这些特征的方法是本领域已知的。
经修饰的T细胞
在某些方面，提供了一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原对于所述经修饰的T细胞是外源的并且包含免疫原性表位，并且其中所述佐剂存在于细胞内。外源性抗原是从T细胞外部的来源引入到待修饰的T细胞中的一种或多种抗原，并且包括在引入外源性抗原之前或之后可能存在于T细胞中的抗原(即内源性)，并且因此可以由T细胞产生(例如，由T细胞的基因组编码)。例如，在一些实施方案中，经修饰的T细胞包含两个抗原集合，第一集合包含抗原的内源性来源，并且第二集合包含抗原的外源性来源，其在T细胞外部产生并且被引入待修饰的T细胞中。在一些实施方案中，抗原在个体的疾病细胞中异位表达或过表达，并且经修饰的T细胞源自个体并且包含抗原的外源性来源或其中所含的免疫原性表位，其在待修饰的T细胞外部产生并且被引入所述待修饰的T细胞中。在一些实施方案中，抗原是包含新表位的新抗原(例如，自身改变的蛋白质或其一部分)，并且经修饰的T细胞包含抗原的外源性来源或包含新表位的其片段，其在待修饰的T细胞外部产生并且被引入所述待修饰的T细胞中。在一些实施方案中，所述佐剂所述经修饰的T细胞而言是外源性的。在一些实施方案中，所述抗原和/或所述佐剂存在于所述经修饰的T细胞的多个隔室中。在一些实施方案中，所述抗原和/或佐剂存在于所述经修饰的T细胞的细胞质液和/或囊泡中。在一些实施方案中，所述囊泡是胞内体。在一些实施方案中，所述抗原或免疫原性表位结合至所述经修饰的T细胞的表面。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、或自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、或γδ-T细胞。
在某些方面，提供了一种经修饰的T细胞，其包含抗原，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原存在于所述经修饰的T细胞的多个隔室中。在一些实施方案中，所述抗原存在于所述经修饰的T细胞的细胞质液和/或囊泡中。在一些实施方案中，所述囊泡是胞内体。在一些实施方案中，所述抗原或其中所含的免疫原性表位结合至所述经修饰的T细胞的表面。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、和自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、和γδ-T细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞进一步包含佐剂。
在一些实施方案中，根据本文描述的任何一种经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包含佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG寡聚脱氧核苷酸(ODN)、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、或聚I:C。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN的长度不超过约50(诸如不超过约以下中的任何一个：45、40、35、30、25、20、或更少)个超过在一些实施方案中，所述CpG ODN是A类CpG ODN、B类CpG ODN、或C类CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN包含SEQ ID NO:26-37中任何一个的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述CpG ODN包含核苷酸序列SEQ ID NO:30。在一些实施方案中，所述CpG ODN包含核苷酸序列SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含多种不同的CpGODN。例如，在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含多种不同的CpG ODN，其选自A类、B类和C类CpG ODN。
在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂。在具体实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN是A类CpG ODN、B类CpG ODN、或C类CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN佐剂包含来自以下的组的选择：CpG ODN 1018、CpG ODN 1585、CpG ODN2216、CpG ODN 2336、CpG ODN 1668、CpG ODN 1826、CPG ODN 2006、CpG ODN 2007、CpG ODN BW006、CpG ODN D-SL01、CpG ODN2395、CpG ODN M362、CpG ODN D-SL03。在一些实施方案中，所述CpG ODN佐剂是CpG ODN1826(SEQ:TCCATGACGTTCCTGACGTT)或CpG ODN 2006(也称为CpG ODN 7909)(SEQ:TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)寡核苷酸。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN 7909。在一些实施方案中，所述RIG-I激动剂包含聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。可以结合抗原使用多种佐剂以增强免疫应答的引发。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含多于一种佐剂。可以结合抗原使用多种佐剂以增强免疫应答的引发。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含多于一种佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含佐剂CpG ODN、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂的任何组合。
在一些实施方案中，根据本文描述的任何一种经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包含抗原，所述抗原包含免疫原性表位。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自疾病相关抗原。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自从患病细胞分离的肽或mRNA。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自在患病细胞中异位表达或过表达的蛋白质。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自新抗原，例如癌症相关新抗原。在一些实施方案中，所述免疫原性表位包含新表位，例如癌症相关新表位。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自非自身抗原。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自突变的或以其他方式改变的抗原。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、或真菌抗原。在一些实施方案中，所述抗原包含与异源肽序列融合的免疫原性表位。在一些实施方案中，所述抗原包含多种免疫原性表位。在一些实施方案中，所述多种免疫原性表位中的一些源自相同来源。例如，在一些实施方案中，所述多种免疫原性表位中的一些源自相同的病毒抗原。在一些实施方案中，全部所述多种免疫原性表位源自相同来源。在一些实施方案中，所述多种免疫原性表位均不源自相同来源。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含多种不同的抗原。
在一些实施方案中，根据本文描述的任何一种包含免疫原性表位的抗原，所述抗原是多肽，并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。在一些实施方案中，所述免疫原性肽表位与N末端侧翼多肽和/或C末端侧翼多肽融合。在一些实施方案中，所述免疫原性肽表位与所述N末端侧翼多肽融合和/或所述C末端侧翼多肽是非天然存在的序列。在一些实施方案中，所述N末端和/或C末端侧翼多肽源自免疫原性合成长肽(SLP)。在一些实施方案中，所述N末端和/或C末端侧翼多肽源自疾病相关免疫原性SLP。在一些实施方案中，N末端侧接多肽包含SEQ ID NO:5-10中任何一个的氨基酸序列和/或C末端侧接多肽包含SEQ ID NO:11-17中任何一个的氨基酸序列。
在一些实施方案中，根据本文描述的任何一种包含免疫原性表位的抗原，所述抗原或其中所含的免疫原性表位源自人乳头瘤病毒(HPV)抗原。在一些实施方案中，所述抗原或其中所含的免疫原性表位源自以下中的任何一种：HPV-16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、和82。在一些实施方案中，所述抗原或其中所含的免疫原性表位源自HPV-16抗原或HPV-18抗原。在进一步的实施方案中，所述抗原或其中所含的免疫原性表位源自HPV E6抗原(例如，HPV-16或HPV-18E6抗原)或HPV E7抗原(例如，HPV-16或HPV-18E7抗原)。在一些实施方案中，所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。在一些实施方案中，所述抗原包含残基29与38之间的HPV-16E6蛋白片段(即，HPV-16E629-38)。在一些实施方案中，所述抗原包含残基48与57之间的HPV-16E6蛋白片段(即，HPV-16E648-57)。在一些实施方案中，所述抗原包含残基11与20之间的HPV-16E7蛋白片段(即，HPV-16E711-20)。在一些实施方案中，所述抗原包含残基49与57之间的HPV-16E7蛋白片段(即，HPV-16E749-57)。在一些实施方案中，所述抗原包含SEQ ID NO:1-4中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原包含侧接N末端多肽和C末端多肽的SEQ ID NO:1-4中任何一个的氨基酸序列，所述N末端多肽包含SEQ ID NO:5-10中任何一个的氨基酸序列，所述C末端多肽包含SEQ ID NO:11-17中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
在一些实施方案中，根据本文描述的任何一种包含免疫原性表位的抗原，所述抗原或其中所含的免疫原性表位源自人巨细胞病毒(HCMV)抗原。在一些实施方案中，所述抗原或其中所含的免疫原性表位源自以下中的任何一种：Merlin、Toledo、Davis、Esp、Kerr、Smith、TB40E、TB40F、AD169或Towne HCMV菌株。在一些实施方案中，所述抗原或其中所含的免疫原性表位源自菌株AD169 HCMV抗原或菌株Merlin HCMV抗原。在进一步的实施方案中，所述抗原或其中所含的免疫原性表位源自pUL48、pUL47、pUL32、pUL82、pUL83、和pUL99、pUL69、pUL25、pUL56、pUL94、pUL97、pUL144或pUL128。在一些实施方案中，所述抗原包含源自HCMV pUL83的HLA-A2限制性肽。
在一些实施方案中，根据本文描述的任何一种包含免疫原性表位的抗原，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施方案中，所述HPV抗原能够被加工成MHCII类限制性肽。在一些实施方案中，所述抗原包含多种免疫原性表位，并且能够被加工成MHC I类限制性肽和MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，所述多种免疫原性表位中的一些源自相同来源。在一些实施方案中，全部所述多种免疫原性表位源自相同来源。在一些实施方案中，所述多种免疫原性表位均不源自相同来源。
在一些实施方案中，根据本文描述的任何一种经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包含多种抗原，所述多种抗原包含免疫原性表位。在一些实施方案中，在向个体给予包括包含所述多种免疫原性表位的所述多种抗原的所述经修饰的T细胞之后，所述多种免疫原性表位均不降低所述个体对任何其他免疫原性表位的免疫应答。
在一些实施方案中，根据本文描述的任何一种经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包含抗原和佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含浓度在约1pM与约10mM之间的所述佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含浓度在约0.1μM与约10mM之间的所述佐剂。例如，在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中的佐剂的浓度是以下中的任何一个：小于约1pM、约10pM、约100pM、约1nM、约10nM、约100nM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中的佐剂的浓度大于约10mM。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中抗原的浓度是以下中任何一个：在约1pM与约10pM之间、在约10pM与约100pM之间、在约100pM与约1nM之间、在约1nM与约10nM之间、在约10nM与约100nM之间、在约100nM与约1μM之间、在约1μM与约10μM之间、在约10μM与约100μM之间、在约100μM与约1mM之间、或在1mM与约10mM之间。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中的抗原与佐剂的摩尔比率是以下中任何一个：在约10000:1至约1:10000之间。例如，在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中的抗原与佐剂的摩尔比率约为以下中的任何一个：10000:1、约1000:1、约200:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1000、或约1:10000。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中的抗原与佐剂的摩尔比率是以下中的任何一个：在约10000:1与约1000:1之间、在约1000:1与约100:1之间、在约100:1与约10:1之间、在约10:1与约1:1之间、在约1:1与约1:10之间、在约1:10与约1:100之间、在约1:100与约1:1000之间、在约1:1000与约1:10000之间。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含复合物，所述复合物包含：a)所述抗原，b)所述抗原和至少一种其他抗原，和/或c)所述抗原和所述佐剂。
在一些实施方案中，根据本文描述的任何一种经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述药剂是稳定剂或辅助因子。在一些实施方案中，所述药剂是白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，所述经修饰的T细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的对应的多种经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂在冷冻-解冻循环后增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述药剂是冷冻保存剂和/或低温保存剂。在一些实施方案中，在任何冷冻-解冻循环之前，与不包含所述药剂的相应经修饰的T细胞相比，冷冻保存剂和低温保存剂均不会引起包含所述药剂的经修饰的T细胞中多于10％或20％的细胞死亡。在一些实施方案中，在高达1、2、3、4、5个冷冻-解冻循环之后，至少约70％、约80％、或约90％的经修饰的T细胞是有活力的。在一些实施方案中，所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。在一些实施方案中，所述药剂是白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是以下中的一种或多种：二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。在一些实施方案中，所述二价金属阳离子是Mg2+、Zn2+或Ca2+中的一种或多种。在一些实施方案中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、DMSO、HEPES、甘油、谷胱甘肽、肌苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、钠金属离子、钾金属离子、镁金属离子、氯化物、乙酸盐、葡糖酸盐、蔗糖、氢氧化钾或氢氧化钠。在一些实施方案中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、
Figure BDA0002763166550000241
海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、
Figure BDA0002763166550000242
CS2、
Figure BDA0002763166550000243
CS5、
Figure BDA0002763166550000244
CS10、
Figure BDA0002763166550000245
CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、
Figure BDA0002763166550000246
在一些实施方案中，根据本文描述的任何一种经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以降低MHC I类表达。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以增加MHC I类表达。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以降低MHC II类表达。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以增加MHC II类表达。在一些实施方案中，与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。在一些实施方案中，与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经修饰的T细胞在被给予所述经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期增加。
在某些方面，提供了一种经修饰的T细胞，其包含抗原，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原存在于所述经修饰的T细胞的多个隔室中。在一些实施方案中，所述抗原存在于所述经修饰的T细胞的细胞质液和/或囊泡中。在一些实施方案中，所述囊泡是胞内体。在一些实施方案中，所述抗原或其中所含的免疫原性表位结合至所述经修饰的T细胞的表面。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、或自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、或γδ-T细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞进一步包含佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使所述抗原通过以形成扰动的输入T细胞；以及b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞；从而产生包含所述抗原的所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约1pM-10mM之间。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞进一步包含佐剂，诸如本文描述的任何佐剂。
在某些方面，提供了一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原包含免疫原性表位，所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；以及b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞；从而产生包含所述抗原和佐剂的所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约1pM-10mM之间和/或与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约1pM-10mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM-10mM之间和/或与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约0.1μM-10mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的抗原与佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
在某些方面，提供了一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原包含免疫原性表位，所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含所述佐剂，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使所述抗原通过以形成扰动的输入T细胞；以及b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约1pM-10mM之间。
在某些方面，提供了一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原包含免疫原性表位，所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含所述抗原，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；以及b)将所述扰动的输入T细胞与所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约1pM-10mM之间。
在一些实施方案中，本文描述的经修饰的T细胞是通过采用输入T细胞从其中通过的细胞变形缩窄部的方法制备的。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径小于所述输入T细胞的直径。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约60％。在一些实施方案中，所述细胞变形缩窄部被包含在微流体通道(诸如本文描述的任何微流体通道)内。微流体通道可以包含在本文描述的任何微流体装置中，诸如在以下标题为微流体装置的部分中所描述的。因此，在一些实施方案中，根据本文描述的任何经修饰的T细胞通过采用包括输入T细胞从其中通过的细胞变形缩窄部的微流体通道的方法制备，所述方法包括使所述输入T细胞通过微流体通道，所述微流体通道包括本文描述的任何微流体系统中包含的细胞变形缩窄部。在一些实施方案中，当所述输入T细胞通过所述缩窄部时向所述输入T细胞施加变形力，从而引起所述输入T细胞的扰动。
输入T细胞可以从多种来源获得，所述来源包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织、和肿瘤。在本发明的一些实施方案中，可以使用本领域可用的任何数量的T细胞系。在本发明的一些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的许多技术(诸如FicollTM分离)从受试者收集的单位血液中获得T细胞。在一些实施方案中，来自个体的循环血液的细胞通过单采术获得。单采术产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中，可以将通过单采术收集的细胞洗涤，以除去血浆级分并且将细胞置于适当的缓冲液或介质中进行后续加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺少钙，并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。如本领域普通技术人员将容易理解的，可以通过本领域技术人员已知的方法，诸如通过使用半自动“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞加工器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver 5)根据制造商的说明来实现洗涤步骤。洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，诸如不含Ca2+、不含Mg2+的PBS，PlasmaLyte A、或含或不含缓冲液的其他盐溶液。可替代地，可以除去单采术样品的不希望组分，并且将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，通过裂解红细胞并且消耗单核细胞，例如通过经由PERCOLLTM梯度的离心或通过对流离心洗脱从外周血淋巴细胞中分离出T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定子群体，诸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、CD45RO+ T细胞、和γδ-T细胞。例如，在一些实施方案中，通过以下方式分离T细胞：与抗CD3/抗CD28(即，3×28)缀合的珠粒(诸如
Figure BDA0002763166550000281
M-450CD3/CD28 T)一起孵育足以阳性选择所希望的T细胞的时间段。在一些实施方案中，所述时间段是约30分钟。在一些实施方案中，所述时间段的范围为从30分钟至36小时或更长以及其之间的所有整数值。在一些实施方案中，所述时间段是至少1、2、3、4、5、或6小时。在一些实施方案中，所述时间段是10至24小时。在一些实施方案中，孵育时间段是24小时。为了从患有白血病的患者中分离出T细胞，使用更长的孵育时间(诸如24小时)可以增加细胞产率。在与其他细胞类型相比存在很少T细胞的任何情况下，诸如从肿瘤组织或免疫受损的个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)时，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以增加捕获CD8+ T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞结合至CD3/CD28珠粒的时间和/或通过增加或降低珠粒与T细胞的比率，可以对于或针对培养开始或过程中的其他时间点优先选择T细胞子群体。另外，通过增加或降低珠粒或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以对于或针对培养开始或其他希望的时间点优先选择T细胞子群体。技术人员应认识到，在本发明的上下文中也可以使用多轮选择。在一些实施方案中，可能希望执行选择程序并且在激活和扩增过程(阴性选择)中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以经受进一步的多轮选择。
可以用针对对于阴性选择细胞而言独特的表面标记物的抗体的组合来实现通过阴性选择对T细胞群体的富集。一种方法是经由负磁免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述负磁免疫粘附或流式细胞术使用针对在阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物典型地包含针对CD 14、CD20、CD11b、CD 16、HLA-DR、和CD8的抗体。在一些实施方案中，可能希望富集或阳性选择典型地表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。可替代地，在一些实施方案中，通过抗CD25缀合的珠粒或其他类似的选择方法来消耗T调节性细胞。
为了通过阳性或阴性选择分离希望的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如颗粒，诸如珠粒)的浓度。在一些实施方案中，可能希望显著降低珠粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。例如，在一些实施方案中，使用约20亿个细胞/mL的浓度。在一些实施方案中，使用约10亿个细胞/mL的浓度。在一些实施方案中，大于约1亿个细胞/mL。在一些实施方案中，使用约以下中的任何一个的细胞浓度：0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、或0.50亿个细胞/mL。在一些实施方案中，使用约以下中的任何一个的细胞浓度：0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、或1亿个细胞/mL。在一些实施方案中，使用约1.25或约1.50亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可以导致细胞产率增加、细胞激活和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，诸如CD28阴性T细胞，或者来自存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血、肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群体可能具有治疗性价值，并且是希望获得的。例如，使用高细胞浓度允许更高效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
组合物
在某些方面，提供了一种组合物(例如，药物组合物)，其包含根据本文描述的任何实施方案的包含抗原和佐剂的经修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述组合物是包含经修饰的T细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。
用于调节免疫应答的方法
在某些方面，提供了一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：向所述个体给予根据本文描述的任何实施方案的经修饰的T细胞、根据本文描述的任何实施方案的组合物、或根据本文描述的任何实施方案的药物组合物。
在某些方面，提供了一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原和佐剂通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和佐剂的经修饰的T细胞；以及c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约1pM-10mM之间和/或与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约1pM-10mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的抗原与佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约0.1μM与约10mM之间。例如，在一些实施方案中，与所述扰动的T细胞一起孵育的佐剂的浓度是以下中的任何一个：小于约1pM、约10pM、约100pM、约1nM、约10nM、约100nM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，与所述扰动的T细胞一起孵育的佐剂的浓度大于约10mM。在一些实施方案中，与所述扰动的T细胞一起孵育的抗原的浓度是以下中的任何一个：在约1pM与约10pM之间、在约10pM与约100pM之间、在约100pM与约1nM之间、在约1nM与约10nM之间、在约10nM与约100nM之间、在约100nM与约1μM之间、在约1μM与约10μM之间、在约10μM与约100μM之间、在约100μM与约1mM之间、或在1mM与约10mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的T细胞一起孵育的抗原与佐剂的摩尔比率是以下中的任何一个：在约10000:1至约1:10000之间。例如，在一些实施方案中，与所述扰动的T细胞一起孵育的抗原与佐剂的摩尔比率约为以下中的任何一个：10000:1、约1000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1000、或约1:10000。在一些实施方案中，与所述扰动的T细胞一起孵育的抗原与佐剂的摩尔比率是以下中的任何一个：在约10000:1与约1000:1之间、在约1000:1与约100:1之间、在约100:1与约10:1之间、在约10:1与约1:1之间、在约1:1与约1:10之间、在约1:10与约1:100之间、在约1:100与约1:1000之间、在约1:1000与约1:10000之间。在一些实施方案中，所述抗原和/或佐剂被封装在纳米颗粒中。
在某些方面，提供了一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含佐剂，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的经修饰的T细胞；以及c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约1pM-10mM之间。在一些实施方案中，所述抗原被封装在纳米颗粒中。
在某些方面，提供了一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含抗原，其中所述抗原包含免疫原性表位，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；b)将所述扰动的输入T细胞与所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的经修饰的T细胞；以及c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约1pM-10mM之间。在一些实施方案中，所述佐剂被封装在纳米颗粒中。
在一些实施方案中，根据用于采用经修饰的T细胞调节免疫应答的任何一种方法，所述经修饰的T细胞包含抗原和佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含浓度在约1pM与约10mM之间的所述抗原。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含浓度在约1pM与约10mM之间的所述佐剂。在一些实施方案中，经修饰的T细胞中的所述抗原与所述佐剂的比率在约10000:1与约1:10000之间。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含复合物，所述复合物包含：a)所述抗原，b)所述抗原和至少一种其他抗原，和/或c)所述抗原和所述佐剂。
在某些方面，提供了一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)向所述个体给予经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包含抗原，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列；以及b)向所述个体给予佐剂。在一些实施方案中，与所述经修饰的T细胞并行地或同时给予所述佐剂。在一些实施方案中，依序给予所述佐剂和所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，在给予所述经修饰的T细胞之前给予所述佐剂。在一些实施方案中，在给予经修饰的T细胞之后给予所述佐剂。在一些实施方案中，全身(例如，静脉内)给予所述佐剂。在一些实施方案中，局部(例如，瘤内)给予所述佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂不包含在细胞中，例如，所述佐剂是在溶液中游离的。在一些实施方案中，所述佐剂不包含在细胞(诸如T细胞)中。在一些实施方案中，根据本文描述的任何一种细胞内递送方法将所述佐剂递送至T细胞。在一些实施方案中，包含抗原的经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：c)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使所述抗原通过以形成扰动的输入T细胞；以及d)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原的所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约1pM-10mM之间。在一些实施方案中，所述抗原被封装在纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞进一步包含佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中所含的佐剂和步骤b)的佐剂是相同的化合物。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中所含的佐剂和步骤b)的佐剂是不同的化合物。
在某些方面，提供了一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原的经修饰的T细胞；c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞；以及d)向所述个体给予佐剂。在一些实施方案中，与所述经修饰的T细胞并行地或同时给予所述佐剂。在一些实施方案中，依序给予所述佐剂和所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，在给予所述经修饰的T细胞之前给予所述佐剂。在一些实施方案中，在给予经修饰的T细胞之后给予所述佐剂。在一些实施方案中，全身(例如，静脉内)给予所述佐剂。在一些实施方案中，局部(例如，瘤内)给予所述佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂不包含在细胞中，例如，所述佐剂是在溶液中游离的。在一些实施方案中，所述佐剂不包含在细胞(诸如T细胞)中。在一些实施方案中，根据本文描述的任何一种细胞内递送方法将所述佐剂递送至T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约1pM-10mM之间。在一些实施方案中，所述抗原被封装在纳米颗粒中。
在一些实施方案中，根据本文描述的用于调节个体的免疫应答的任何方法，免疫应答增强。在一些实施方案中，所述增强的免疫应答是针对所述抗原的。
在一些实施方案中，根据本文描述的用于调节个体的免疫应答的任何方法，所述方法采用输入T细胞从其中通过的细胞变形缩窄部。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径小于所述输入T细胞的直径。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约60％。在一些实施方案中，所述细胞变形缩窄部被包含在微流体通道(诸如本文描述的任何微流体通道)内。微流体通道可以包含在本文描述的任何微流体装置中，诸如在以下标题为微流体装置的部分中所描述的。因此，在一些实施方案中，根据本文描述的用于采用包括输入T细胞从其中通过的细胞变形缩窄部的微流体通道调节个体的免疫应答的任何方法，所述方法包括使所述输入T细胞通过微流体通道，所述微流体通道包括本文描述的任何微流体系统中包含的细胞变形缩窄部。在一些实施方案中，当所述输入T细胞通过所述缩窄部时向所述输入T细胞施加变形力，从而引起所述输入T细胞的扰动。
在一些实施方案中，根据本文描述的用于调节个体的免疫应答的任何方法，所述方法采用包含抗原和佐剂的经修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述抗原和/或佐剂存在于所述经修饰的T细胞的细胞质液和/或囊泡中。在一些实施方案中，所述囊泡是胞内体。在一些实施方案中，所述抗原和/或所述佐剂存在于所述经修饰的T细胞的多个隔室中。在一些实施方案中，所述抗原或免疫原性表位结合至所述经修饰的T细胞的表面。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、或自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、或γδ-T细胞。
在一些实施方案中，根据本文描述的用于调节个体的免疫应答的任何方法，所述方法采用包含佐剂的经修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG寡聚脱氧核苷酸(ODN)、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、或聚I:C。在一些实施方案中，所述佐剂是CpGODN。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN的长度不超过约50(诸如不超过约以下中的任何一个：45、40、35、30、25、20、或更少)个超过在一些实施方案中，所述CpG ODN是A类CpG ODN、B类CpG ODN、或C类CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN包含SEQ ID NO:26-37中任何一个的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述CpG ODN包含核苷酸序列SEQ ID NO:30。在一些实施方案中，所述CpG ODN包含核苷酸序列SEQ IDNO:31。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含多种不同的CpG ODN。例如，在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含多种不同的CpG ODN，其选自A类、B类和C类CpG ODN。
示例性佐剂包括但不限于干扰素基因刺激因子(STING)激动剂，视黄酸诱导基因I(RIG-I)激动剂，以及针对TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9的激动剂。示例性佐剂包括但不限于CpG ODN、干扰素-α(IFN-α)、聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)、咪喹莫特(R837)、瑞喹莫德(R848)、或脂多糖(LPS)。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂。在具体实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN是A类CpG ODN、B类CpG ODN、或C类CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN佐剂包含来自以下的组的选择：CpG ODN 1018、CpG ODN 1585、CpG ODN2216、CpG ODN2336、CpG ODN 1668、CpG ODN 1826、CPG ODN 2006、CpG ODN 2007、CpG ODN BW006、CpGODN D-SL01、CpG ODN 2395、CpG ODN M362、CpG ODN D-SL03。在一些实施方案中，所述CpGODN佐剂是CpG ODN 1826(SEQ:TCCATGACGTTCCTGACGTT)或CpG ODN 2006(也称为CpG ODN7909)(SEQ:TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)寡核苷酸。在一些实施方案中，所述佐剂是CpGODN 7909。在一些实施方案中，所述RIG-I激动剂包含聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。可以结合抗原使用多种佐剂以增强免疫应答的引发。在一些实施方案中，经修饰的PBMC包含多于一种佐剂。可以结合抗原使用多种佐剂以增强免疫应答的引发。在一些实施方案中，经修饰的PBMC包含多于一种佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的PBMC包含佐剂CpG ODN、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂的任何组合。
在本文描述的任何实施方案中，除非另有指示，否则佐剂可以指(a)与扰动的输入T细胞一起孵育和通过的佐剂，或(b)与经修饰的T细胞一起共给予个体的佐剂。
在一些实施方案中，根据本文描述的用于调节个体的免疫应答的任何方法，所述方法采用经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包含抗原，所述抗原包含免疫原性表位。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自疾病相关抗原。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自从患病细胞分离的肽或mRNA。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自在疾病细胞中异位表达或过表达的蛋白质。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自新抗原，例如癌症相关新抗原。在一些实施方案中，所述免疫原性表位包含新表位，例如癌症相关新表位。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自非自身抗原。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自突变的或以其他方式改变的抗原。在一些实施方案中，所述免疫原性表位源自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、或真菌抗原。在一些实施方案中，所述抗原包含多种免疫原性表位。在一些实施方案中，所述多种免疫原性表位中的一些源自相同来源。例如，在一些实施方案中，所述多种免疫原性表位中的一些源自相同的病毒抗原。在一些实施方案中，全部所述多种免疫原性表位源自相同来源。在一些实施方案中，所述多种免疫原性表位均不源自相同来源。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含多种不同的抗原。
在一些实施方案中，根据本文描述的用于采用包括包含免疫原性表位的抗原的经修饰的T细胞调节个体的免疫应答的任何方法，所述抗原是多肽，并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。在一些实施方案中，所述免疫原性肽表位与N末端侧翼多肽和/或C末端侧翼多肽融合。在一些实施方案中，所述免疫原性肽表位与所述N末端侧翼多肽融合和/或所述C末端侧翼多肽是非天然存在的序列。在一些实施方案中，所述N末端和/或C末端侧翼多肽源自免疫原性合成长肽(SLP)。在一些实施方案中，所述N末端和/或C末端侧翼多肽源自疾病相关免疫原性SLP。在一些实施方案中，N末端侧接多肽包含SEQ ID NO:5-10中任何一个的氨基酸序列和/或C末端侧接多肽包含SEQ ID NO:11-17中任何一个的氨基酸序列。
在一些实施方案中，根据本文描述的用于采用包括包含免疫原性表位的抗原的经修饰的T细胞调节个体的免疫应答的任何方法，所述抗原或其中所含的免疫原性表位源自人乳头瘤病毒(HPV)抗原。在一些实施方案中，所述抗原或其中所含的免疫原性表位源自以下中的任何一种：HPV-16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、和82。在一些实施方案中，所述抗原或其中所含的免疫原性表位源自HPV-16抗原或HPV-18抗原。在进一步的实施方案中，所述抗原或其中所含的免疫原性表位源自HPV E6抗原(例如，HPV-16或HPV-18E6抗原)或HPV E7抗原(例如，HPV-16或HPV-18E7抗原)。在一些实施方案中，所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。在一些实施方案中，所述抗原包含残基29与38之间的HPV-16E6蛋白片段(即，HPV-16E629-38)。在一些实施方案中，所述抗原包含残基48与57之间的HPV-16E6蛋白片段(即，HPV-16E648-57)。在一些实施方案中，所述抗原包含残基11与20之间的HPV-16E7蛋白片段(即，HPV-16E711-20)。在一些实施方案中，所述抗原包含残基49与57之间的HPV-16E7蛋白片段(即，HPV-16E749-57)。在一些实施方案中，所述抗原包含SEQ ID NO:1-4中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原包含侧接N末端多肽和C末端多肽的SEQ ID NO:1-4中任何一个的氨基酸序列，所述N末端多肽包含SEQ IDNO:5-10中任何一个的氨基酸序列，所述C末端多肽包含SEQ ID NO:11-17中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
在一些实施方案中，根据本文描述的用于采用包括包含免疫原性表位的抗原的经修饰的T细胞调节个体的免疫应答的任何方法，所述抗原或其中所含的免疫原性表位源自人巨细胞病毒(HCMV)抗原。在一些实施方案中，HCMV是菌株AD169或菌株Merlin HCMV。在一些实施方案中，所述抗原包含源自HCMV pUL83的HLA-A2限制性肽。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含多种抗原，所述多种抗原包含多种免疫原性表位。在一些实施方案中，在向个体给予包括包含所述多种免疫原性表位的所述多种抗原的所述经修饰的T细胞之后，所述多种免疫原性表位均不降低所述个体对任何其他免疫原性表位的免疫应答。在一些实施方案中，所述抗原是多肽并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。在一些实施方案中，所述免疫原性肽表位与N末端侧翼多肽和/或C末端侧翼多肽融合。在一些实施方案中，所述抗原是包含免疫原性肽表位和一个或多个异源肽序列的多肽。在一些实施方案中，所述抗原是包含免疫原性肽表位的多肽，所述免疫原性肽表位在N末端和/或C末端侧接异源肽序列。在一些实施方案中，所述侧翼异源肽序列源自疾病相关免疫原性肽。
在一些实施方案中，根据本文描述的用于采用包括包含免疫原性表位的抗原的经修饰的T细胞调节个体的免疫应答的任何方法，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施方案中，所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，所述抗原包含多种免疫原性表位，并且能够被加工成MHC I类限制性肽和MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，所述多种免疫原性表位中的一些源自相同来源。在一些实施方案中，全部所述多种免疫原性表位源自相同来源。在一些实施方案中，所述多种免疫原性表位均不源自相同来源。
在一些实施方案中，根据本文描述的用于采用经修饰的T细胞调节个体的免疫应答的任何方法，所述经修饰的T细胞包含多种抗原，所述多种抗原包含免疫原性表位。在一些实施方案中，所述多种免疫原性表位的任一个不降低所述个体对任何其他免疫原性表位的免疫应答。
在一些实施方案中，根据本文描述的用于采用经修饰的T细胞调节个体的免疫应答的任何方法，所述经修饰的T细胞包含抗原和佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含浓度在约1pM与约10mM之间的所述佐剂。例如，在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中的佐剂的浓度是以下中的任何一个：小于约1pM、约10pM、约100pM、约1nM、约10nM、约100nM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中的佐剂的浓度大于约10mM。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中抗原的浓度是以下中任何一个：在约1pM与约10pM之间、在约10pM与约100pM之间、在约100pM与约1nM之间、在约1nM与约10nM之间、在约10nM与约100nM之间、在约100nM与约1μM之间、在约1μM与约10μM之间、在约10μM与约100μM之间、在约100μM与约1mM之间、或在1mM与约10mM之间。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中的抗原与佐剂的摩尔比率是以下中任何一个：在约10000:1至约1:10000之间。例如，在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中的抗原与佐剂的摩尔比率约为以下中的任何一个：10000:1、约1000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1000、或约1:10000。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中的抗原与佐剂的摩尔比率是以下中的任何一个：在约10000:1与约1000:1之间、在约1000:1与约100:1之间、在约100:1与约10:1之间、在约10:1与约1:1之间、在约1:1与约1:10之间、在约1:10与约1:100之间、在约1:100与约1:1000之间、在约1:1000与约1:10000之间。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含复合物，所述复合物包含：a)所述抗原，b)所述抗原和至少一种其他抗原，和/或c)所述抗原和所述佐剂。
在一些实施方案中，根据本文描述的用于采用经修饰的T细胞调节个体的免疫应答的任何方法，所述经修饰的T细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述药剂是稳定剂或辅助因子。在一些实施方案中，所述药剂是白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。
在一些实施方案中，根据本文描述的用于采用经修饰的T细胞调节个体的免疫应答的任何方法，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以降低MHC I类表达。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以增加MHC I类表达。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以降低MHC II类表达。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以增加MHC II类表达。在一些实施方案中，与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。在一些实施方案中，与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经修饰的T细胞在被给予所述经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期增加。
在一些实施方案中，根据用于采用本文描述的经修饰的T细胞调节个体的免疫应答的任何方法，所述方法包括向所述个体给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞对所述个体而言是同种异体的。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞对所述个体而言是自体的。在一些实施方案中，将所述个体预调理以调节炎症和/或免疫应答。在一些实施方案中，将所述个体预调理以降低炎症和/或免疫应答。在一些实施方案中，将所述个体预调理以增加炎症和/或免疫应答。在一些实施方案中，向所述个体给予所述经修饰的T细胞导致对所述抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。在一些实施方案中，向所述个体给予所述经修饰的T细胞导致对所述抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。在一些实施方案中，给予所述个体的所述经修饰的T细胞的量在约1x 106个与约1x 1012个细胞之间。在一些实施方案中，给予所述个体的所述经修饰的T细胞的量小于约以下中的任何一个：1x 106、1x 107、1x 108、1x 109、1x1010、1x 1011和约1x1012个细胞。在一些实施方案中，给予所述个体的所述经修饰的T细胞的量在约以下中任何一个：在1x 106与1x 107之间、在1x 107与1x 108之间、在1x 108与1x 109之间、在1x 109与1x 1010之间、在1x 1010与1x 1011之间和在1x 1011与1x 1012个细胞。在一些实施方案中，所述方法包括多次给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述方法包括约2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于约10次中的任何一个的给予。在一些实施方案中，在两次相继给予经修饰的T细胞之间的时间间隔在约1个天与约1个月之间。在一些实施方案中，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每两周或每月给予。在一些实施方案中，相继给予为给予高达一年或更久。
在一些实施方案中，根据用于采用本文描述的经修饰的T细胞调节个体的免疫应答的任何方法，所述方法还包括向所述个体给予第二佐剂。在一些实施方案中，全身(例如，静脉内)给予第二佐剂。在一些实施方案中，局部(例如，瘤内)给予第二佐剂。在一些实施方案中，第二佐剂不包含在细胞中，例如，第二佐剂是在溶液中游离的。在一些实施方案中，所述第二佐剂是IFN-α或CpG ODN。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中所含的佐剂和所述第二佐剂是相同的化合物。例如，在所述实施方案中，经修饰的T细胞包含CpG ODN，并且第二佐剂也是CpG ODN。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞中所含的佐剂和所述第二佐剂是不同的化合物。例如，在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包含CpG ODN，并且第二佐剂是IFN-α。在一些实施方案中，并行地或同时给予所述经修饰的T细胞和所述第二佐剂。在一些实施方案中，依序给予所述经修饰的T细胞和所述第二佐剂。在一些实施方案中，在给予所述第二佐剂之前给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，在给予所述第二佐剂之后给予所述经修饰的T细胞。
在一些实施方案中，根据用于采用本文描述的经修饰的T细胞调节个体的免疫应答的任何方法，所述方法还包括向所述个体给予免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，并行地向个体给予经修饰的T细胞和免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，同时向个体给予经修饰的T细胞和免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，依序向个体给予经修饰的T细胞和免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，在向个体给予免疫检查点抑制剂之后向个体给予经修饰的T细胞。在一些实施方案中，在向个体给予免疫检查点抑制剂之前向个体给予经修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的任何一种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、和TIM-3。示例性免疫检查点抑制剂靶向但不限于PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是以下中的一种或多种：与PD-1结合的抗体、与PD-L1结合的抗体、与CTLA-4结合的抗体、与LAG3结合的抗体、或与TIM-3结合的抗体。在进一步的实施方案中，所述抗体可以是全长抗体或任何变体，例如但不限于抗体片段、单链可变片段(ScFv)、或片段抗原结合(Fab)。在进一步的实施方案中，所述抗体可以是双特异性的、三特异性的或多特异性的。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合至和/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3中的一种或多种的一种或多种化学化合物。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合至和/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3中的一种或多种的一种或多种肽。
其他示例性免疫检查点抑制剂靶向但不限于TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一种或多种。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是以下中的一种或多种：与TIGIT结合的抗体、与VISTA结合的抗体、与TIM1结合的抗体、与B7-H4(VTCN1)结合的抗体或与BTLA结合的抗体。在进一步的实施方案中，所述抗体可以是全长抗体或任何变体，例如但不限于抗体片段、单链可变片段(ScFv)、或片段抗原结合(Fab)。在进一步的实施方案中，所述抗体可以是双特异性的、三特异性的或多特异性的。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合至和/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一种或多种的一种或多种化学化合物。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合至和/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一种或多种的一种或多种肽。
可以将化学疗法与本文描述的任何一种经修饰的T细胞组合使用以实现针对癌症(例如，HPV相关癌症)的累加或协同作用。在一些实施方案中，将包含所述经修饰的T细胞的组合物的给予与化学疗法的给予组合。在一些实施方案中，同时给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和所述化学疗法。在一些实施方案中，依序给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和所述化学疗法。在一些实施方案中，将包含所述经修饰的T细胞的组合物的给予与化学疗法的给予组合以及与免疫检查点抑制剂组合。
在一些实施方案中，在给予化学疗法之前给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予化学疗法之后给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。例如，在给予化学疗法之前从约1小时至约1周给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，在给予化学疗法之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予化学疗法之前在约1小时与约2小时之间、在约2小时与约3小时之间、在约3小时与约4小时之间、在约4小时与约6小时之间、在约6小时与约8小时之间、在约8小时与约10小时之间、在约10小时与约12小时之间、在约12小时与约14小时之间、在约14小时与约16小时之间、在约16小时与约18小时之间、在约18小时与约20小时之间、在约20小时与约24小时之间、在约24小时与约30小时之间、在约30小时与约36小时之间、在约36小时与约42小时之间、在约42小时与约48小时之间、在约48小时与约60小时之间、在约60小时与约3天之间、在约3天与约4天之间、在约4天与约5天之间、在约5天与约6天之间、在约6天与约7天之间给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。
在一些实施方案中，在给予化学疗法之后给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。例如，在给予化学疗法之后从约1小时至约1周给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，在给予化学疗法之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予化学疗法之后在约1小时与约2小时之间、在约2小时与约3小时之间、在约3小时与约4小时之间、在约4小时与约6小时之间、在约6小时与约8小时之间、在约8小时与约10小时之间、在约10小时与约12小时之间、在约12小时与约14小时之间、在约14小时与约16小时之间、在约16小时与约18小时之间、在约18小时与约20小时之间、在约20小时与约24小时之间、在约24小时与约30小时之间、在约30小时与约36小时之间、在约36小时与约42小时之间、在约42小时与约48小时之间、在约48小时与约60小时之间、在约60小时与约3天之间、在约3天与约4天之间、在约4天与约5天之间、在约5天与约6天之间、在约6天与约7天之间给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述方法包括多次给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和/或多次给予化学疗法。例如，在一些实施方案中，所述方法包括两次给予、三次给予、四种给予、五次给予、六次给予、七次给予、八次给予、九次给予、十次给予、十一次给予、十二次给予、十三次给予、十四次给予或十五次给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和/或所述化学疗法。例如，在一些实施方案中，所述方法包括少于五次给予、少于十次给予、少于十五次给予、少于二十次给予、少于二十五次给予、少于三十次给予、少于五十次给予、少于七十次-五次给予、少于一百次、或少于两百次给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和/或所述化学疗法。
示例性化学疗法可以是细胞周期依赖性的或不依赖细胞周期的。在一些实施方案中，所述化学疗法包含一种或多种化学治疗剂。在一些实施方案中，化学治疗剂可以靶向癌症的细胞分裂、DNA或代谢中的一种或多种。在一些实施方案中，化学治疗剂是基于铂的药剂，诸如但不限于顺铂、奥沙利铂或卡铂。在一些实施方案中，化学治疗剂是紫杉烷(诸如多西他赛或紫杉醇)。在一些实施方案中，化学治疗剂是5-氟尿嘧啶、阿霉素、或伊立替康。在一些实施方案中，化学治疗剂是以下的一种或多种：烷基化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂或有丝分裂抑制剂。在一些实施方案中，化学疗法包含顺铂。
可以将放射疗法与本文描述的任何一种经修饰的T细胞组合使用以实现针对癌症(例如，HPV相关癌症)的累加或协同作用。在一些实施方案中，将包含所述经修饰的T细胞的组合物的给予与放射疗法的给予组合。在一些实施方案中，同时给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和所述放射疗法。在一些实施方案中，依序给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和所述放射疗法。在一些实施方案中，将包含所述经修饰的T细胞的组合物的给予与放射疗法的给予组合，与化学疗法组合，和/或与免疫检查点抑制剂组合。
在一些实施方案中，在给予放射疗法之前给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予放射疗法之后给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。例如，在给予放射疗法之前从约1小时至约1周给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，在给予放射疗法之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予放射疗法之前在约1小时与约2小时之间、在约2小时与约3小时之间、在约3小时与约4小时之间、在约4小时与约6小时之间、在约6小时与约8小时之间、在约8小时与约10小时之间、在约10小时与约12小时之间、在约12小时与约14小时之间、在约14小时与约16小时之间、在约16小时与约18小时之间、在约18小时与约20小时之间、在约20小时与约24小时之间、在约24小时与约30小时之间、在约30小时与约36小时之间、在约36小时与约42小时之间、在约42小时与约48小时之间、在约48小时与约60小时之间、在约60小时与约3天之间、在约3天与约4天之间、在约4天与约5天之间、在约5天与约6天之间、在约6天与约7天之间给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。
在一些实施方案中，在给予放射疗法之后给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。例如，在给予放射疗法之后从约1小时至约1周给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，在给予放射疗法之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予放射疗法之后在约1小时与约2小时之间、在约2小时与约3小时之间、在约3小时与约4小时之间、在约4小时与约6小时之间、在约6小时与约8小时之间、在约8小时与约10小时之间、在约10小时与约12小时之间、在约12小时与约14小时之间、在约14小时与约16小时之间、在约16小时与约18小时之间、在约18小时与约20小时之间、在约20小时与约24小时之间、在约24小时与约30小时之间、在约30小时与约36小时之间、在约36小时与约42小时之间、在约42小时与约48小时之间、在约48小时与约60小时之间、在约60小时与约3天之间、在约3天与约4天之间、在约4天与约5天之间、在约5天与约6天之间、在约6天与约7天之间给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述方法包括多次给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和/或多次给予放射疗法。例如，在一些实施方案中，所述方法包括两次给予、三次给予、四种给予、五次给予、六次给予、七次给予、八次给予、九次给予、十次给予、十一次给予、十二次给予、十三次给予、十四次给予或十五次给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和/或所述放射疗法。例如，在一些实施方案中，所述方法包括少于五次给予、少于十次给予、少于十五次给予、少于二十次给予、少于二十五次给予、少于三十次给予、少于五十次给予、少于七十次-五次给予、少于一百次、或少于两百次给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和/或所述放射疗法。
在某些方面，提供了一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：向所述个体给予与抗原缔合的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：a)将输入T细胞与i)抗原或ii)以及抗原和佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原与所述输入T细胞的细胞表面缔合，其中所述抗原包含免疫原性表位，从而产生与所述抗原缔合的经修饰的T细胞；以及b)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。
在某些方面，提供了一种经修饰的T细胞，其用于医学治疗方法，所述方法包括：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含抗原，其中所述抗原包含免疫原性表位，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；b)将所述扰动的输入T细胞与所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的经修饰的T细胞；以及c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约1pM-10mM之间。在一些实施方案中，所述佐剂被封装在纳米颗粒中。
在某些方面，提供了一种经修饰的T细胞，其用于治疗个体的癌症、感染性疾病或病毒相关疾病，所述方法包括：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含抗原，其中所述抗原包含免疫原性表位，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；b)将所述扰动的输入T细胞与所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的经修饰的T细胞；以及c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述抗原与癌症、感染性疾病或病毒相关疾病相关。在一些实施方案中，与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约1pM-10mM之间。在一些实施方案中，所述佐剂被封装在纳米颗粒中。
在一些实施方案中，本发明的经修饰的T细胞不诱导个体的耐受性。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞不阻抑个体的免疫应答。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞不包含致耐受性因子。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞的给予不与致耐受性因子组合。在一些实施方案中，在给予致耐受性因子之前、同时或之后不给予所述经修饰的T细胞。
抗原
在一些实施方案中，本发明采用抗原的递送来调节免疫应答，其中通过本文描述的任何方法将抗原递送至T细胞。在一些实施方案中，所述抗原是单抗原。在一些实施方案中，所述抗原是抗原混合物。抗原是刺激特定免疫应答(诸如细胞或抗体介导的免疫应答)的物质。抗原结合至由对特定抗原具有特异性的免疫细胞表达的受体(诸如T细胞受体(TCR))。抗原受体结合随后触发细胞内信号传导通路，其导向下游免疫效应子通路，诸如细胞激活、细胞因子产生、细胞迁移、细胞毒性因子分泌和抗体产生。
在一些实施方案中，所述抗原是多肽抗原。在一些实施方案中，所述抗原是疾病相关抗原。在一些实施方案中，抗原源自外来来源，诸如细菌、真菌、病毒或过敏原。在一些实施方案中，抗原源自内部来源，诸如自身蛋白(即自身抗原)或自身蛋白的一部分。在一些实施方案中，所述抗原是突变的或以其他方式改变的抗原。在一些实施方案中，所述抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述抗原在细胞裂解物中。自身抗原是在生物体自身细胞上或中存在的抗原。自身抗原通常不会刺激免疫应答，但在自身免疫性疾病(诸如I型糖尿病或类风湿性关节炎)的背景下或当过表达或异常/异位表达时可能会。
在一些实施方案中，所述抗原与病毒相关。在一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原。示例性病毒抗原包括HPV抗原、HCMV抗原、SARS-CoV抗原、和流感抗原。
在一些实施方案中，所述抗原与微生物；例如细菌相关。在一些实施方案中，经调节的免疫应答包括针对微生物(例如细菌)增加的病原体免疫应答。
在某些方面，本发明采用用于将抗原递送至T细胞的方法，所述方法包括使包含T细胞的细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使T细胞变形，从而引起细胞的扰动，使得抗原进入细胞，其中使所述细胞悬浮液与抗原接触。在一些实施方案中，将抗原在体外、离体或体内递送至T细胞。
在一些实施方案中，待递送的抗原是纯化的。在一些实施方案中，所述抗原是按重量(干重)计至少约60％的目的抗原。在一些实施方案中，纯化的抗原是至少约75％、90％、或99％的目的抗原。在一些实施方案中，纯化的抗原是至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％、或100％(w/w)的目的抗原。通过任何已知方法确定纯度，所述已知方法包括但不限于柱色谱法、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、核磁共振(NMR)谱、质谱法、或SDS-PAGE凝胶电泳。经纯化的DNA或RNA被定义为不含外源核酸、碳水化合物和脂质的DNA或RNA。
佐剂
佐剂可以用于加强免疫细胞应答(例如，T细胞应答)，诸如针对抗原的免疫应答。多种佐剂也可以用于增强免疫应答，并且与单独的针对抗原的免疫应答相比，可以与抗原结合使用，例如以增强针对抗原的免疫应答。在一些实施方案中，本发明采用佐剂的递送来增强免疫应答，其中通过本文描述的任何方法将佐剂递送至T细胞。在一些实施方案中，所述佐剂增强针对抗原的免疫应答。例如，佐剂可以促进抗原呈递细胞对抗原的免疫原性呈递。在一些实施方案中，与抗原同时引入佐剂。在一些实施方案中，依序引入佐剂和抗原。在一些实施方案中，在引入抗原之前引入佐剂。在一些实施方案中，在引入抗原之后引入佐剂。在一些实施方案中，与不存在佐剂的情况下的T细胞归巢相比，佐剂改变T细胞归巢(例如，T细胞归巢到靶组织，诸如肿瘤)。在一些实施方案中，与不存在佐剂的情况下的T细胞增殖相比，佐剂增加T细胞增殖。
在某些方面，本发明采用用于从输入T细胞产生包含抗原的免疫原性抗原呈递T细胞的方法，其中使输入T细胞通过缩窄部，其中所述缩窄部使输入T细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得抗原进入输入T细胞，从而产生包含所述抗原的免疫原性抗原呈递T细胞。
在某些方面，本发明采用用于将佐剂递送到T细胞中的方法，所述方法包括使包含T细胞的细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使所述T细胞变形，从而引起所述T细胞的扰动，使得所述佐剂进入所述细胞，其中使所述细胞悬浮液与佐剂接触。在一些实施方案中，将佐剂在体外、离体或体内递送到T细胞中。
微流体系统及其部件
用于提供细胞变形缩窄部的微流体通道
在一些实施方案中，本发明提供了用于通过使包含T细胞的细胞悬浮液通过缩窄部来调节免疫应答的方法，其中所述缩窄部使所述T细胞变形，从而引起所述T细胞的扰动，使得抗原和/或佐剂进入所述T细胞，其中缩窄部包含在微流体通道内。在一些实施方案中，可以在微流体通道内平行和/或串联放置多个缩窄部。用于在本文公开的方法中使用的含有细胞变形缩窄部的示例性微流体通道描述于WO 2013059343中。用于在本文公开的方法中使用的具有孔的示例性表面描述于WO 2017041050中。
在一些实施方案中，微流体通道包括内腔并且被配置成使得悬浮在缓冲液中的T细胞可以通过，其中所述微流体通道包括缩窄部。微流体通道可由多种材料中的任何一种制成，所述材料包括硅、金属(例如，不锈钢)、塑料(例如，聚苯乙烯)、陶瓷、玻璃、结晶基底、无定形基底、或聚合物(例如，聚-甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PDMS、环烯烃共聚物(COC)等)。微流体通道的制造可以通过本领域已知的任何方法进行，包括干法蚀刻、湿法蚀刻、光刻、注射模制、激光烧蚀或SU-8掩模。
在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部包括入口部分、中心点和出口部分。在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部的长度、深度和宽度可以变化。在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部的直径是T细胞的直径的函数。在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部的直径是T细胞的直径的约20％至约99％。在一些实施方案中，缩窄部尺寸为T细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。在一些实施方案中，缩窄部尺寸是T细胞的最小截面距离的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。在一些实施方案中，通道包括在约2μm与约10μm之间的缩窄部宽度或在其之间的任何宽度或宽度范围。例如，缩窄部宽度可以是以下中的任何一个：约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、或约7μm。在一些实施方案中，通道包括约10μm的缩窄部长度和约4μm的缩窄部宽度。通道的截面、入口部分、中心点和出口部分也可以变化。例如，截面的形状可以是环形、椭圆形、细长狭缝、正方形、六边形或三角形。入口部分限定缩窄部角度，其中所述缩窄部角度被优化以减少通道的堵塞并且被优化以增强化合物向T细胞中的递送。出口部分的角度也可以变化。例如，出口部分的角度被配置成减小可导致非层流的湍流的可能性。在一些实施方案中，入口部分和/或出口部分的壁是线性的。在其他实施方案中，入口部分和/或出口部分的壁是弯曲的。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，所述缩窄部的直径是T细胞直径的函数。在一些实施方案中，通过T细胞的最小截面距离来测量T细胞的直径。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是以下中的任何一个：所述输入T细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、或约30％至约45％。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是以下中的任何一个：所述输入T细胞的平均直径的约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、或约90％至约99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是以下中的任何一个：所述输入T细胞的平均直径的约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，缩窄部的直径是约1.5μm至约10μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是约2μm至约8μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是约2.5μm至约6μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是约3μm至约5μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是约3μm至约4μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是以下中的任何一个：约1.5μm至约10μm、约1.75μm至约9μm、约2μm至约8μm、约2.25μm至约7μm、约2.5μm至约6μm、约2.75μm至约5.5μm、约3μm至约5μm、约3μm至约4μm、约3.1μm至约3.9μm、约3.2μm至约3.8μm、约3.3μm至约3.7μm、或约3.4μm至约3.6μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是以下中的任何一个：约1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm、2.0μm、2.2μm、2.4μm、2.6μm、2.8μm、3.0μm、3.2μm、3.4μm、3.6μm、3.8μm、4.0μm、4.2μm、4.4μm、4.6μm、4.8μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、8.0μm、9.0μm或约10.0μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是约3.5μm。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，所述缩窄部的直径是约3μm至约15μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是约3μm至约10μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是约4μm至约10μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是约4.2μm至约6μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是约4.2μm至约4.8μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是以下中的任何一个：约2μm至约14μm、约4μm至约12μm、约6μm至约9μm、约4μm至约6μm、约4μm至约5μm、约3.5μm至约7μm、约3.5μm至约6.3μm、约3.5μm至约5.6μm、约3.5μm至约4.9μm、约4.2μm至约6.3μm、约4.2μm至约5.6μm、或约4.2μm至约4.9μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是以下中的任何一个：约2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、10.5μm、11μm、11.5μm、12μm、12.5μm、13μm、13.5μm、14μm、14.5μm或15μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是以下中的任何一个：约4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、4.7μm、4.8μm、4.9μm、或5.0μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是约4.5μm。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，使输入T细胞以在约0.001mL/min至约200mL/min之间的流速或其之间的任何速率或速率范围通过缩窄部。在一些实施方案中，流速在约0.001mL/min至约175mL/min、约0.001mL/min至约150mL/min、约0.001mL/min至约125mL/min、约0.001mL/min至约100mL/min、约0.001mL/min至约50mL/min、约0.001mL/min至约25mL/min、约0.001mL/min至约10mL/min、约0.001mL/min至约7.5mL/min、约0.001mL/min至约5.0mL/min、约0.001mL/min至约2.5mL/min、约0.001mL/min至约1mL/min、约0.001mL/min至约0.1mL/min或约0.001mL/min至约0.01mL/min之间。在一些实施方案中，流速在约0.001mL/min至约200mL/min、约0.01mL/min至约200mL/min、约0.1mL/min至约200mL/min、约1mL/min至约200mL/min、约10mL/min至约200mL/min、约50mL/min至约200mL/min、约75mL/min至约200mL/min、约100mL/min至约200mL/min、约150mL/min至约200mL/min、约0.5mL/min至约200mL/min、约1mL/min至约200mL/min、约2.5mL/min至约200mL/min、约5mL/min至约200mL/min、约7.5mL/min至约200mL/min、约10mL/min至约200mL/min、约25mL/min至约200mL/min、或约175mL/min至约200mL/min之间。在一些实施方案中，使输入T细胞以在约10mL/min至约200mL/min之间的流速通过缩窄部。在一些实施方案中，使输入T细胞以约100mL/min的流速通过缩窄部。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，所述缩窄部可以具有本领域已知的任何形状；例如，3维形状或2维形状。缩窄部的2维形状(诸如截面形状)可以是但不限于环状、椭圆形、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形或八边形。缩窄部的3维形状可以是但不限于圆柱形、圆锥形或立方形。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是矩形。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是狭缝。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是包括约2.5μm至约10μm的宽度和/或约1μm至约200μm的深度的狭缝。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是包括约3μm至约6μm的宽度和/或约40μm至约120μm的深度的狭缝。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是包括约3.2μm至约4μm的宽度和/或约20μm至约80μm的深度的狭缝。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是包括约3.5μm的宽度和/或约80μm的深度的狭缝。在其他实施方案中，缩窄部的截面形状是包括约4μm至约10μm的宽度和/或约1μm至约200μm的深度的狭缝。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是包括约4.2μm至约6μm的宽度和/或约40μm至约120μm的深度的狭缝。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是包括约4.2μm至约6μm的宽度和/或约20μm至约80μm的深度的狭缝。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是包括约4.5μm的宽度和/或约80μm的深度的狭缝。在一些实施方案中，狭缝包括约10μm至约30μm的长度。在一些实施方案中，狭缝包括约2μm至约50μm的长度。在一些实施方案中，狭缝包括以下中任何一个的长度：约2μm至约5μm、约5μm至约10μm、约10μm至约15μm、约15μm至约20μm、约20μm至约25μm、约25μm至约30μm、约30μm至约35μm、约35μm至约40μm、约40μm至约45μm、或约45μm至约50μm。在一些实施方案中，狭缝包括约10μm的长度。
用于提供细胞变形缩窄部的具有孔的表面
在一些实施方案中，本发明提供了用于通过使包含T细胞的细胞悬浮液通过缩窄部来调节免疫应答的方法，其中所述缩窄部使所述T细胞变形，从而引起所述T细胞的扰动，使得抗原和/或佐剂进入所述T细胞，其中缩窄部是孔或包含在孔内。在一些实施方案中，孔包含在表面中。用于在本文公开的方法中使用的具有孔的示例性表面描述于WO2017041050中。
如本文公开的表面可由许多材料中的任何一种制成，并且采取许多形式中的任何一种。在一些实施方案中，表面是过滤器。在一些实施方案中，表面是膜。在一些实施方案中，过滤器是切向流动过滤器。在一些实施方案中，表面是海绵或海绵状基质。在一些实施方案中，表面是基质。
在一些实施方案中，该表面是曲折路径表面。在一些实施方案中，曲折的路径表面包含醋酸纤维素。在一些实施方案中，表面包含一种材料，所述材料选自但不限于合成或天然的聚合物、聚碳酸酯、硅、玻璃、金属、合金、硝酸纤维素、银、醋酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚丙烯腈(PAN)、聚丙烯、PVDF、聚四氟乙烯、混合的纤维素酯、瓷和陶瓷。
本文公开的表面可以具有本领域已知的任何形状；例如3维形状。表面的2维形状可以是但不限于环形、椭圆形、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形或八边形。在一些实施方案中，表面的形状是圆形。在一些实施方案中，表面3维形状是圆柱形、圆锥形或立方形的。
表面可以具有各种截面宽度和厚度。在一些实施方案中，表面截面宽度在约1mm与约1m之间或在其之间的任何截面宽度或截面宽度范围。在一些实施方案中，表面具有限定的厚度。在一些实施方案中，表面厚度是均一的。在一些实施方案中，表面厚度是可变的。例如，在一些实施方案中，表面的一些部分比表面的其他部分更厚或更薄。在一些实施方案中，表面厚度变化约1％至约90％或在其间的任何百分比或百分比范围。在一些实施方案中，表面的厚度在约0.01μm至约5mm之间或在其之间的任何厚度或厚度范围。
在一些实施方案中，缩窄部是孔或被包含在孔内。孔的截面宽度与待处理的T细胞的类型有关。在一些实施方案中，孔径是待处理的T细胞或T细胞簇的直径的函数。在一些实施方案中，孔径使得T细胞在通过孔时被扰动。在一些实施方案中，孔径小于T细胞的直径。在一些实施方案中，孔径是T细胞直径的约10％至约99％。在一些实施方案中，孔径是T细胞直径的约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、或约99％。最佳孔径或孔截面宽度可以基于应用和/或T细胞类型而变化。在一些实施方案中，孔径是约2μm至约14μm。在一些实施方案中，孔径是约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm、或约14μm。在一些实施方案中，截面宽度是约2μm至约14μm。在一些实施方案中，孔截面是约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm、或约14μm。
孔通道的入口和出口可以具有各种角度。可以选择孔角度以在T细胞通过时使孔的堵塞最小化。在一些实施方案中，通过表面的流速在约0.001mL/cm2/sec至约100L/cm2/sec之间或在其之间的任何速率或速率范围。例如，入口或出口部分的角度可以在约0度与约90度之间。在一些实施方案中，入口或出口部分可以大于90度。在一些实施方案中，孔具有相同的入口角度和出口角度。在一些实施方案中，孔具有不同的入口角度和出口角度。在一些实施方案中，孔边缘是光滑的，例如圆形的或弯曲的。光滑的孔边缘具有连续、平坦且均匀的表面，没有凸起、脊或不平整部分。在一些实施方案中，孔边缘是尖锐的。尖锐的孔边缘具有锐利的或锐角的薄边缘。在一些实施方案中，孔通道是直的。直的孔通道不含有曲线、弯曲、角度或其他不规则性。在一些实施方案中，孔通道是弯曲的。弯曲的孔通道是弯曲的或偏离直线。在一些实施方案中，孔通道具有多条曲线，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多条曲线。
孔可以具有本领域已知的任何形状，包括2维或3维形状。孔形状(例如，截面形状)可以是但不限于环状、椭圆形、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。在一些实施方案中，孔的截面的形状是圆形。在一些实施方案中，孔的3维形状是圆柱形或圆锥形。在一些实施方案中，孔具有带凹槽的入口和出口形状。在一些实施方案中，在给定表面内的孔之间，孔形状是均匀的(即，一致的或规则的)。在一些实施方案中，在给定表面内的孔之间，孔形状是不均匀的(即，混合的或变化的)。
本文描述的表面可以具有一系列总孔数。在一些实施方案中，孔涵盖总表面积的约10％至约80％。在一些实施方案中，所述表面含有约1.0x 105至约1.0x 1030个总孔或其之间的任何数量或数量范围。在一些实施方案中，表面包括在约10个与约1.0x 1015个之间的孔/mm2表面积。
孔可以在给定表面内以多种方式分布。在一些实施方案中，孔在给定表面内平行分布。在一个这样的实施方案中，孔在相同方向上并排分布并且在给定表面内以相同的距离分开。在一些实施方案中，孔分布是有序的或均匀的。在一个这样的实施方案中，孔以规则的系统的图案分布或在给定表面内以相同的距离分开。在一些实施方案中，孔分布是随机的或不均匀的。在一个这样的实施方案中，孔以不规则的、无序的图案分布或在给定表面内以不同的距离分开。在一些实施方案中，多个表面串联分布。多个表面的表面尺寸、形状和/或粗糙度可以是均匀的或不均匀的。多个表面可以进一步含有具有均匀或不均匀的孔径、形状和/或数量的孔，从而使得能够将一系列化合物同时递送到不同T细胞类型中。
在一些实施方案中，单独的孔具有均一的宽度尺寸(即沿着孔通道的长度具有恒定的宽度)。在一些实施方案中，单独的孔具有可变的宽度(即沿着孔通道的长度渐增或渐减的宽度)。在一些实施方案中，在给定表面内的孔具有相同的单独的孔深度。在一些实施方案中，在给定表面内的孔具有不同的单独的孔深度。在一些实施方案中，孔彼此紧邻。在一些实施方案中，孔彼此之间分开一段距离。在一些实施方案中，孔彼此之间分开约0.001μm至约30mm的距离或在其之间的任何距离或距离范围。
在一些实施方案中，表面涂覆有材料。所述材料可以选自本领域已知的任何材料，包括但不限于特氟隆(Teflon)、粘合剂涂层、表面活性剂、蛋白质、粘附分子、抗体、抗凝血剂、调节细胞功能的因子、核酸、脂质、碳水化合物或跨膜蛋白。在一些实施方案中，表面涂覆有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些实施方案中，材料共价附接于表面。在一些实施方案中，材料非共价附接或吸附于表面。在一些实施方案中，表面分子在T细胞通过孔时被释放。
在一些实施方案中，表面具有经修饰的化学特性。在一些实施方案中，表面是极性的。在一些实施方案中，表面是亲水的。在一些实施方案中，表面是非极性的。在一些实施方案中，表面是疏水的。在一些实施方案中，表面是带电荷的。在一些实施方案中，表面带正电荷和/或带负电荷。在一些实施方案中，表面可以在一些区域带正电荷并且在其他区域带负电荷。在一些实施方案中，表面具有总体正电荷或总体负电荷。在一些实施方案中，表面可以是以下中的任何一种：光滑的、电解抛光的、粗糙的或经等离子体处理。在一些实施方案中，表面包含两性离子化合物或偶极化合物。在一些实施方案中，表面是经等离子体处理的。
在一些实施方案中，表面被包含在较大的模块内。在一些实施方案中，表面被包含在注射器(诸如塑料或玻璃注射器)内。在一些实施方案中，表面被包含在塑料过滤器支架内。在一些实施方案中，表面被包含在移液管器吸头内。
细胞扰动
在一些实施方案中，本发明提供了用于通过使包含T细胞的细胞悬浮液通过缩窄部来调节免疫应答的方法，其中所述缩窄部使所述T细胞变形，从而引起所述T细胞的扰动，使得抗原和/或佐剂进入所述T细胞，其中所述T细胞中的扰动是所述T细胞中的缺口(例如，洞、撕裂、腔、孔口、孔、断裂、间隙或穿孔)，所述缺口允许来自所述T细胞外部的材料移动到所述T细胞中。变形可以由例如机械应变和/或剪切力引起。在一些实施方案中，扰动是T细胞膜内的扰动。在一些实施方案中，扰动是瞬时的。在一些实施方案中，T细胞扰动持续从约1.0x 10-9秒至约2小时或在其之间的任何时间或时间范围。在一些实施方案中，T细胞扰动持续约1.0x 10-9秒至约1秒、约1秒至约1分钟、或约1分钟至约1小时。在一些实施方案中，T细胞扰动持续在以下中任何一个之间：约1.0x10-9之约1.0x10-1、约1.0x10-9至约1.0x10-2、约1.0x10-9至约1.0x10-3、约1.0x10-9至约1.0x10-4、约1.0x10-9至约1.0x10-5、约1.0x10-9至约1.0x10-6、约1.0x10-9至约1.0x10-7、或约1.0x10-9至约1.0x10-8秒。在一些实施方案中，T细胞扰动持续以下中任何一个：约1.0x10-8至约1.0x10-1、约1.0x10-7至约1.0x10-1、约1.0x10-6至约1.0x10-1、约1.0x10-5至约1.0x10-1、约1.0x10-4至约1.0x10-1、约1.0x10-3至约1.0x10-1、或约1.0x10-2至约1.0x10-1秒。由本文描述的方法产生的T细胞扰动(例如，孔或洞)不是由于蛋白质亚基组装形成多聚体孔结构(诸如由补体或细菌溶血素产生的)的结果而形成。
当T细胞通过缩窄部时，所述缩窄部暂时对T细胞膜造成损伤，其允许通过扰动使材料被动扩散。在一些实施方案中，使T细胞变形仅持续大约100μs的短暂时间段，以使通过细胞信号传导机制激活凋亡途径的机会最小化，但是其他持续时间是可能的(例如，从纳秒到数小时的范围)。在一些实施方案中，使T细胞变形持续约1.0x 10-9秒至约2小时或在其之间的任何时间或时间范围。在一些实施方案中，使T细胞变形持续约1.0x 10-9秒至约1秒、约1秒至约1分钟、或约1分钟至约1小时。在一些实施方案中，使T细胞变形持续在以下中任何一个之间：约1.0x10-9至约1.0x10-1、约1.0x10-9至约1.0x10-2、约1.0x10-9至约1.0x10-3、约1.0x10-9至约1.0x10-4、约1.0x10-9至约1.0x10-5、约1.0x10-9至约1.0x10-6、约1.0x10-9至约1.0x10-7、或约1.0x10-9至约1.0x10-8秒。在一些实施方案中，使T细胞变形持续以下中任何一个：约1.0x10-8至约1.0x10-1、约1.0x10-7至约1.0x10-1、约1.0x10-6至约1.0x10-1、约1.0x10-5至约1.0x10-1、约1.0x10-4至约1.0x10-1、约1.0x10-3至约1.0x10-1、或约1.0x10-2至约1.0x10-1秒。在一些实施方案中，使T细胞变形包括使T细胞变形持续一段时间，所述时间的范围是但不限于约1μs至至少约750μs，例如至少约1μs、10μs、50μs、100μs、500μs、或750μs。
在一些实施方案中，抗原和/或佐剂进入T细胞的过程与T细胞通过缩窄部和/或T细胞的扰动同时发生。在一些实施方案中，化合物进入T细胞的过程在T细胞通过缩窄部之后发生。在一些实施方案中，化合物进入T细胞的过程在T细胞通过缩窄部之后大约几分钟发生。在一些实施方案中，化合物进入T细胞的过程在T细胞通过缩窄部之后从约1.0x 10-2秒至至少约30分钟发生。例如，化合物进入T细胞的过程在T细胞通过缩窄部之后从约1.0x10-2秒至约1秒、约1秒至约1分钟、或约1分钟至约30分钟发生。在一些实施方案中，化合物进入T细胞的过程在T细胞通过缩窄部之后约1.0x 10-2秒至约10分钟、约1.0x 10-2秒至约5分钟、约1.0x 10-2秒至约1分钟、约1.0x 10-2秒至约30秒、约1.0x 10-2秒至约10秒、约1.0x10-2秒至约1秒、或约1.0x 10-2秒至约0.1秒发生。在一些实施方案中，化合物进入T细胞的过程在T细胞通过缩窄部之后约1.0x 10-1秒至约10分钟、约1秒至约10分钟、约10秒至约10分钟、约50秒至约10分钟、约1分钟至约10分钟、或约5分钟至约10分钟发生。在一些实施方案中，在T细胞通过缩窄部之后的T细胞扰动在免疫细胞通过缩窄部之后约5分钟左右内被纠正。
在一些实施方案中，通过缩窄部之后的细胞活力是约5％至约100％。在一些实施方案中，通过缩窄部之后的细胞活力是至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。在一些实施方案中，在T细胞通过缩窄部之后从约1.0x 10-2秒至至少约10天测量细胞活力。例如，在T细胞通过缩窄部之后从约1.0x 10-2秒至约1秒、约1秒至约1分钟、约1分钟至约30分钟、或约30分钟至约2小时测量细胞活力。在一些实施方案中，在T细胞通过缩窄部之后约1.0x 10-2秒至约2小时、约1.0x 10-2秒至约1小时、约1.0x 10-2秒至约30分钟、约1.0x 10-2秒至约1分钟、约1.0x 10-2秒至约30秒、约1.0x 10-2秒至约1秒、或约1.0x 10-2秒至约0.1秒测量细胞活力。在一些实施方案中，在T细胞通过缩窄部之后约1.5小时至约2小时、约1小时至约2小时、约30分钟至约2小时、约15分钟至约2小时、约1分钟至约2小时、约30秒至约2小时、或约1秒至约2小时测量细胞活力。在一些实施方案中，在T细胞通过缩窄部之后约2小时至约5小时、约5小时至约12小时、约12小时至约24小时、或约24小时至约10天测量细胞活力。
递送参数
许多参数可能影响通过本文描述的方法将化合物向用于调节免疫应答的T细胞的递送。在一些实施方案中，在通过缩窄部之前、同时或之后使细胞悬浮液与化合物接触。T细胞可以通过悬浮在包含待递送的化合物的溶液中的缩窄部，但是可以在T细胞通过缩窄部之后将化合物添加到细胞悬浮液中。在一些实施方案中，将待递送的化合物涂覆在缩窄部上。
可影响化合物向T细胞中递送的参数的例子包括但不限于缩窄部的尺寸、缩窄部的入口角度、缩窄部的表面特性(例如，粗糙度、化学修饰、亲水性、疏水性等)、操作流速(例如，通过缩窄部的细胞传输时间)、T细胞浓度、细胞悬浮液中化合物的浓度，并且T细胞在通过缩窄部之后恢复或孵育的时间量可以影响被递送的化合物进入T细胞中的过程。影响化合物向T细胞中递送的另外的参数可以包括T细胞在缩窄部中的速度、在缩窄部中的剪切速率、细胞悬浮液的粘度、垂直于流速的速度分量、以及在缩窄部中的时间。可以设计此类参数以控制化合物的递送。在一些实施方案中，T细胞浓度范围为从约10个到至少约1012个细胞/mL或在其之间的任何浓度或浓度范围。在一些实施方案中，递送化合物浓度的范围可以为从约10ng/mL至约1g/mL或在其之间的任何浓度或浓度范围。在一些实施方案中，递送化合物浓度的范围可以为从约1pM到至少约2M或在其之间的任何浓度或浓度范围。
可以调整本公开文本的方法中使用的温度以影响化合物递送和细胞活力。在一些实施方案中，所述方法在约-5℃与约45℃之间进行。例如，所述方法可以在室温(例如，约20℃)、生理温度(例如，约37℃)、高于生理温度(例如，大于约37℃至45℃或更高)、或降低的温度(例如，约-5℃至约4℃)、或在这些示例性温度之间的温度下进行。
可以利用各种方法来驱动T细胞通过缩窄部。例如，可以在入口侧通过泵(例如，压缩机)施加压力，可以在出口侧通过真空泵施加真空，可以通过管施加毛细管作用，和/或系统可以重力进给。也可以使用基于位移的流动系统(例如，注射泵、蠕动泵、手动注射器或移液器、活塞等)。在一些实施方案中，T细胞通过正压或负压通过缩窄部。在一些实施方案中，T细胞通过恒定压力或可变压力通过缩窄部。在一些实施方案中，使用注射器施加压力。在一些实施方案中，压力是使用气体(例如，来自气瓶)施加的正压。在一些实施方案中，使用泵施加压力。在一些实施方案中，泵是蠕动泵或隔膜泵。在一些实施方案中，使用真空施加压力。在一些实施方案中，通过重力使T细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，通过离心力使T细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，通过毛细管压力使T细胞通过缩窄部。
在一些实施方案中，流体流动引导T细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，在T细胞通过缩窄部之前，流体流动是湍流。湍流是这样的流体流动，其中在给定点的速度在大小和方向上不规律地变化。在一些实施方案中，流过缩窄部的流体是层流。层流包括在固体边界附近的流体中的非中断流，其中在每个点的流动方向保持恒定。在一些实施方案中，在T细胞通过缩窄部之后，流体流动是湍流。T细胞通过缩窄部的速度可以变化。在一些实施方案中，T细胞以均一的细胞速度通过缩窄部。在一些实施方案中，T细胞以波动的细胞速度通过缩窄部。
在其他实施方案中，使用组合治疗以通过使包含T细胞的细胞悬浮液通过缩窄部来调节免疫应答，其中所述缩窄部使T细胞变形，从而引起所述T细胞的扰动，使得抗原和/或佐剂进入T细胞，例如本文描述的方法，然后暴露于在缩窄部下游的电场中。在一些实施方案中，在通过缩窄部之后，使T细胞通过由至少一个电极产生的电场。在一些实施方案中，电场有助于将化合物递送至在T细胞内部的第二位置，诸如T细胞核。例如，细胞变形缩窄部和电场的组合将编码抗体的质粒递送至T细胞(例如，细胞核)中，导致从头产生抗体。在一些实施方案中，一个或多个电极靠近细胞变形缩窄部以产生电场。在一些实施方案中，电场在约0.1kV/m至约100MV/m之间或在其之间的任何数量或数量范围。在一些实施方案中，使用集成电路提供电信号以驱动电极。在一些实施方案中，将T细胞暴露于电场中，其脉冲宽度在约1ns至约1s之间、以及时间在约100ns至约10s之间或在其之间的任何时间或时间范围。
用于向T细胞中递送的细胞悬浮液
细胞悬浮液可以是混合的或纯化的T细胞群体。在一些实施方案中，细胞悬浮液是混合细胞群体，诸如全血。在一些实施方案中，细胞悬浮液是纯化的细胞群体，诸如纯化的T细胞群体。
细胞悬浮液的组成(例如，克分子渗透浓度、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)可以影响调节用于免疫应答的化合物的递送。在一些实施方案中，悬浮液包含全血。可替代地，细胞悬浮液是细胞在生理盐水溶液或除血液之外的生理介质中的混合物。在一些实施方案中，细胞悬浮液包含水性溶液。在一些实施方案中，水性溶液包含细胞培养基、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、盐、金属离子、糖、生长因子、动物来源产品、增量材料、表面活性剂、润滑剂、脂质、维生素、氨基酸、蛋白质、细胞周期抑制剂、和/或影响肌动蛋白聚合的药剂。在一些实施方案中，细胞培养基是DMEM、
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IMDM、RPMI、X-Vivo 10、和X-Vivo 15。另外，溶液缓冲液可以包含一种或多种润滑剂(普朗尼克(pluronic)或其他表面活性剂)，其可以设计例如用于减少或消除缩窄部或孔的堵塞并且提高细胞活力。示例性表面活性剂包括但不限于泊洛沙姆、聚山梨醇酯、糖或糖醇(诸如甘露醇)、动物来源的血清、和白蛋白。
在用某些类型的T细胞的一些配置中，可以在一种或多种有助于将化合物递送到所述T细胞内部的溶液中孵育所述T细胞。在一些实施方案中，水性溶液包含影响肌动蛋白聚合的药剂。在一些实施方案中，影响肌动蛋白聚合的药剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。例如，可以在递送之前将T细胞在解聚溶液诸如拉春库林A(0.lμg/mL)中孵育1小时以使肌动蛋白细胞骨架解聚。作为另外的例子，可以在递送之前将T细胞在10μM秋水仙碱(Sigma)中孵育2小时以使微管网络解聚。
在一些实施方案中，在用于所公开的方法中之前将细胞群体富集。例如，从体液(例如外周血)获得细胞，并且任选地将其富集或纯化以浓缩T细胞。可以通过本领域已知的任何方法来富集细胞，所述方法包括但不限于磁性细胞分离、荧光激活细胞分选(FACS)、或密度梯度离心。
细胞悬浮液的粘度也可以影响本文公开的方法。在一些实施方案中，细胞悬浮液的粘度的范围为从约8.9x10-4 Pa·s至约4.0x10-3 Pa·s或其之间的任何值或值范围。在一些实施方案中，粘度范围在以下任何一个之间：约8.9x10-4 Pa·s至约4.0x10-3 Pa·s、约8.9x10-4 Pa·s至约3.0x10-3 Pa·s、约8.9x10-4 Pa·s至约2.0x10-3 Pa·s、或约8.9x10-3 Pa·s至约1.0x10-3 Pa·s。在一些实施方案中，粘度范围在以下任何一个之间：约0.89cP至约4.0cP、约0.89cP至约3.0cP、约0.89cP至约2.0cP、或约0.89cP至约1.0cP。在一些实施方案中，观察到剪切稀化作用，其中细胞悬浮液的粘度在剪切应变条件下降低。可以通过本领域已知的任何方法来测量粘度，所述方法包括但不限于粘度计(诸如玻璃毛细管粘度计)或流变仪。粘度计在一种流动条件下测量粘度，而流变仪用于测量随流动条件变化的粘度。在一些实施方案中，测量剪切稀化溶液(诸如血液)的粘度。在一些实施方案中，在约-5℃与约45℃之间测量粘度。例如，在室温(例如，约20℃)、生理温度(例如，约37℃)、高于生理温度(例如，大于约37℃至45℃或更高)、降低的温度(例如，约-5℃至约4℃)、或在这些示例性温度之间的温度下测量粘度。
系统和药剂盒
在一些方面，本发明提供了一种系统，其包含以下中的一种或多种：根据本文描述的任何实施方案的缩窄部、T细胞悬浮液、抗原或佐剂，诸如用于本文描述的任何方法。所述系统可以包括针对本文公开的物质组合物和方法描述的任何实施方案，包括在以上标题为“微流体系统及其部件”的部分中所公开的那些。在一些实施方案中，细胞变形缩窄部的尺寸被确定为用于递送至T细胞。在一些实施方案中，优化递送参数，诸如操作流速、细胞和化合物浓度、温度、细胞在缩窄部中的速度、和细胞悬浮液的组成(例如，克分子渗透浓度、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)，以使化合物调节免疫应答的反应最大化。
还提供了用于调节个体的免疫应答的药剂盒或制品。在一些实施方案中，所述药剂盒包括包含抗原和/或佐剂的经修饰的T细胞，包括本文描述的任何一种经修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述药剂盒包含以下中的一种或多种：缩窄部、T细胞悬浮液、抗原或佐剂，以用于产生用于调节个体的免疫应答的经修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述药剂盒包含在合适的包装中的本文描述的组分(例如，微流体通道或含有孔的表面、细胞悬浮液、和/或化合物)。合适的包装材料是本领域已知的，并且包括例如小瓶(诸如密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶、罐、软包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。可以进一步将这些制品灭菌和/或密封。
本发明还提供了包含本文描述的方法的组分的药剂盒，并且可以进一步包含用于执行所述方法以调节个体的免疫应答的说明书和/或用于将抗原和/或佐剂引入T细胞的说明书。本文描述的药剂盒可以进一步包含其他材料，包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器、和包装插页，所述包装插页具有用于执行本文描述的任何方法的说明书；例如用于调节个体的免疫应答的说明书或用于修饰T细胞以含有抗原和/或佐剂的说明书。
示例性实施方案
实施方案1.一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原对于所述经修饰的T细胞是外源的并且包含免疫原性表位，并且其中所述佐剂存在于细胞内。
实施方案2.一种经修饰的T细胞，其包含抗原，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
实施方案3.一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原包含免疫原性表位，所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；以及b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞；从而产生包含所述抗原和佐剂的所述经修饰的T细胞。
实施方案4.根据实施方案3所述的经修饰的T细胞，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间和/或与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案5.根据实施方案3或4所述的经修饰的T细胞，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的抗原与佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
实施方案6.一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原包含免疫原性表位，所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含所述佐剂，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使所述抗原通过以形成扰动的输入T细胞；以及b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的所述经修饰的T细胞。
实施方案7.根据实施方案6所述的经修饰的T细胞，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案8.一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原包含免疫原性表位，所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含所述抗原，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；以及b)将所述扰动的输入T细胞与所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的所述经修饰的T细胞。
实施方案9.根据实施方案8所述的经修饰的T细胞，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案10.根据实施方案3-9中任一项所述的经修饰的T细胞，其中当所述输入T细胞通过所述缩窄部时向所述输入T细胞施加变形力，从而引起所述输入T细胞的扰动。
实施方案11.根据实施方案3-10中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述方法还包括以下步骤：将所述输入T细胞和/或所述经修饰的T细胞与一种药剂一起孵育，与在没有所述进一步孵育步骤的情况下制备的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。
实施方案12.根据实施方案11所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂是增强内吞作用或充当稳定剂或辅助因子的化合物。
实施方案13.根据实施方案3-12中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述缩窄部的直径小于所述输入T细胞的直径。
实施方案14.根据实施方案13所述的经修饰的T细胞，其中所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约99％。
实施方案15.根据实施方案14所述的经修饰的T细胞，其中所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约60％。
实施方案16.根据实施方案1-15中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原和/或佐剂存在于所述经修饰的T细胞的细胞质液和/或囊泡中。
实施方案17.根据实施方案1-16中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述囊泡是胞内体。
实施方案18.根据实施方案1-17中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原和/或所述佐剂存在于所述经修饰的T细胞的多个隔室中。
实施方案19.根据实施方案1-18中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原或免疫原性表位结合至所述经修饰的T细胞的表面。
实施方案20.根据实施方案1-19中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述佐剂是CpG寡聚脱氧核苷酸(ODN)、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、咪喹莫特、瑞喹莫德、或脂多糖(LPS)
实施方案21.根据实施方案20所述的经修饰的T细胞，其中所述佐剂是CpG ODN。
实施方案22.根据实施方案21所述的经修饰的T细胞，其中所述CpG ODN是A类CpGODN、B类CpG ODN、或C类CpG ODN。
实施方案23.根据实施方案1-22中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述免疫原性表位源自疾病相关抗原。
实施方案24.根据实施方案23所述的经修饰的T细胞，其中所述免疫原性表位源自从患病细胞分离的肽或mRNA。
实施方案25.根据实施方案1-24中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述免疫原性表位源自非自身抗原。
实施方案26.根据实施方案1-25中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述免疫原性表位源自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、或真菌抗原。
实施方案27.根据实施方案26所述的经修饰的T细胞，其中所述免疫原性表位源自人乳头瘤病毒(HPV)抗原。
实施方案28.根据实施方案27所述的经修饰的T细胞，其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。
实施方案29.根据实施方案27或28所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。
实施方案30.根据实施方案29所述的经修饰的T细胞，其中所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:1-4中任何一个的氨基酸序列。
实施方案31.根据实施方案30所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原包含SEQ IDNO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
实施方案32.根据实施方案1-30中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞包含多种抗原，所述多种抗原包含多种免疫原性表位。
实施方案33.根据实施方案32所述的经修饰的T细胞，其中在向个体给予包括包含所述多种免疫原性表位的所述多种抗原的所述经修饰的T细胞之后，所述多种免疫原性表位的任一个不降低所述个体对任何其他免疫原性表位的免疫应答。
实施方案34.根据实施方案1-33中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原是多肽并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。
实施方案35.根据实施方案30所述的经修饰的T细胞，其中所述免疫原性肽表位与N末端侧翼多肽和/或C末端侧翼多肽融合。
实施方案36.根据实施方案30所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原是包含免疫原性肽表位和一个或多个异源肽序列的多肽。
实施方案37.根据实施方案34所述的经修饰的T细胞，所述抗原是包含免疫原性肽表位的多肽，所述免疫原性肽表位在N末端和/或C末端侧接异源肽序列
实施方案38.根据实施方案35所述的经修饰的T细胞，所述侧翼异源肽序列源自疾病相关免疫原性肽。
实施方案39.根据实施方案35所述的经修饰的T细胞，所述N末端侧翼多肽包含SEQID NO:5-10中任何一个的氨基酸序列和/或所述C末端侧翼多肽包含SEQ ID NO:11-17中任何一个的氨基酸序列。
实施方案40.根据实施方案1-39中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
实施方案41.根据实施方案1-40中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。
实施方案42.根据实施方案1-41中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述抗原。
实施方案43.根据实施方案1-42中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述HPV抗原与所述佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
实施方案44.根据实施方案1-43中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞包含复合物，所述复合物包含：a)所述抗原，b)所述抗原和至少一种其他抗原，和/或c)所述抗原和所述佐剂。
实施方案45.根据实施方案1-44中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。
实施方案46.根据实施方案45所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。
实施方案47.根据实施方案45所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂是白蛋白。
实施方案48.根据实施方案47所述的经修饰的T细胞，其中所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。
实施方案49.根据实施方案45所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。
实施方案50.根据实施方案49所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂包含小鼠血清白蛋白(MSA)。
实施方案51.根据实施方案1-50中任一项所述的经修饰的T细胞，其中将所述细胞进一步修饰以增加一种或多种共刺激分子的表达。
实施方案52.根据实施方案51所述的经修饰的T细胞，其中所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、或CD112。
实施方案53.根据实施方案51或52所述的经修饰的T细胞，其中所述细胞包含导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。
实施方案54.根据实施方案1-53中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。
实施方案55.根据实施方案1-54中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。
实施方案56.根据实施方案54所述的经修饰的T细胞，其中与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。
实施方案57.根据实施方案54或56所述的经修饰的T细胞，其中与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经修饰的T细胞在被给予所述经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期增加。
实施方案58.根据实施方案1-57中任一项所述的经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、或自然杀伤T细胞。
实施方案59.根据实施方案1-58中任一项所述的经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、或γδ-T细胞。
实施方案60.一种包含根据实施方案1-59中任一项所述的经修饰的T细胞的组合物。实施方案61.一种药物组合物，其包含根据实施方案1-59中任一项所述的经修饰的T细胞和药学上可接受的载体。
实施方案62.一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括向所述个体给予根据实施方案1-59中任一项所述的经修饰的T细胞、根据实施方案60所述的组合物、或根据实施方案62所述的药物组合物。
实施方案63.一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)向所述个体给予包含抗原的经修饰的T细胞，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列；以及b)向所述个体给予佐剂。
实施方案64.一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原和佐剂通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和佐剂的经修饰的T细胞；以及c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。
实施方案65.根据实施方案64所述的方法，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间和/或与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案66.根据实施方案64或65所述的方法，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的抗原与佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
实施方案67.一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含佐剂，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的经修饰的T细胞；以及c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。
实施方案68.根据实施方案67所述的方法，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案69.一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含抗原，其中所述抗原包含免疫原性表位，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；b)将所述扰动的输入T细胞与所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的经修饰的T细胞；以及c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。
实施方案70.根据实施方案69所述的方法，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案71.根据实施方案64-70中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述抗原。
实施方案72.根据实施方案64-71中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。
实施方案73.根据实施方案64-72中任一项所述的方法，其中经修饰的T细胞中的所述抗原与所述佐剂的比率在约10000:1与约1:10000之间。
实施方案74.根据实施方案64-73中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞包含复合物，所述复合物包含：a)所述抗原，b)所述抗原和至少一种其他抗原，和/或c)所述抗原和所述佐剂。
实施方案75.一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原的经修饰的T细胞；c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞；以及d)向所述个体给予佐剂。
实施方案76.根据实施方案75所述的方法，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案77.根据实施方案64-76中任一项所述的方法，其中当所述输入T细胞通过所述缩窄部时向所述输入T细胞施加变形力，从而引起所述输入T细胞的扰动。
实施方案78.根据实施方案64-77中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：将所述输入T细胞和/或经修饰的T细胞与一种药剂一起孵育，与在没有所述进一步孵育步骤的情况下制备的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。
实施方案79.根据实施方案78所述的方法，其中所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。
实施方案80.实施方案64-79中任一项所述的方法，其中所述免疫应答增强。
实施方案81.根据实施方案80所述的方法，其中所述增强的免疫应答是针对所述抗原的。
实施方案82.根据实施方案64-81中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径小于所述输入T细胞的直径。
实施方案83.根据实施方案82所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约99％。
实施方案84.根据实施方案83所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约60％。
实施方案85.根据实施方案64-84中任一项所述的方法，其中所述抗原和/或佐剂存在于所述经修饰的T细胞的细胞质液和/或囊泡中。
实施方案86.根据实施方案64-85中任一项所述的方法，其中所述囊泡是胞内体。
实施方案87.根据实施方案64-86中任一项所述的方法，其中所述抗原和/或所述佐剂存在于所述经修饰的T细胞的多个隔室中。
实施方案88.根据实施方案64-87中任一项所述的方法，其中所述抗原或免疫原性表位结合至所述经修饰的T细胞的表面。
实施方案89.根据实施方案64-88中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、咪喹莫特、瑞喹莫德、和/或脂多糖(LPS)。
实施方案90.根据实施方案89所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN。
实施方案91.根据实施方案90所述的方法，其中所述CpG ODN是A类CpG ODN、B类CpG ODN、或C类CpG ODN。
实施方案92.根据实施方案64-91中任一项所述的方法，其中所述免疫原性表位源自疾病相关抗原。
实施方案93.根据实施方案92所述的方法，其中所述免疫原性表位源自从患病细胞分离的肽或mRNA。
实施方案94.根据实施方案64-93中任一项所述的方法，其中所述免疫原性表位源自非自身抗原。
实施方案95.根据实施方案64-94中任一项所述的方法，其中所述免疫原性表位源自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、或真菌抗原。
实施方案96.根据实施方案95所述的方法，其中所述免疫原性表位源自人乳头瘤病毒(HPV)抗原。
实施方案97.根据实施方案96所述的方法，其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。
实施方案98.根据实施方案96或97所述的方法，其中所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。
实施方案99.根据实施方案98所述的方法，其中所述HLA-A2限制性肽包含SEQ IDNO:1-4中任何一个的氨基酸序列。
实施方案100.根据实施方案99所述的方法，其中所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
实施方案101.根据实施方案64-100中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞包含多种抗原，所述多种抗原包含多种免疫原性表位。
实施方案102.根据实施方案64-101中任一项所述的方法，其中所述多种免疫原性表位的任一个不降低所述个体对任何其他免疫原性表位的免疫应答。
实施方案103.根据实施方案64-102中任一项所述的方法，其中所述抗原是多肽并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。
实施方案104.根据实施方案103所述的方法，其中所述免疫原性肽表位与N末端侧翼多肽和/或C末端侧翼多肽融合。
实施方案105.根据实施方案104所述的经修饰的T细胞，其中所述免疫原性肽表位与所述N末端侧翼多肽融合和/或所述C末端侧翼多肽是非天然存在的序列。
实施方案106.根据实施方案105所述的方法，其中所述N末端和/或C末端侧翼多肽源自免疫原性合成长肽(SLP)。
实施方案107.根据实施方案105所述的方法，其中所述N末端和/或C末端侧翼多肽源自疾病相关免疫原性SLP。
实施方案108.根据实施方案105所述的方法，所述N末端侧翼多肽包含SEQ ID NO:5-10中任何一个的氨基酸序列和/或所述C末端侧翼多肽包含SEQ ID NO:11-17中任何一个的氨基酸序列。
实施方案109.根据实施方案64-108中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
实施方案110.根据实施方案64-109中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。
实施方案111.根据实施方案110所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。
实施方案112.根据实施方案111所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂是白蛋白。
实施方案113.根据实施方案112所述的经修饰的T细胞，其中所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。
实施方案114.根据实施方案110所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。
实施方案115.根据实施方案64-114中任一项所述方法，其中所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。
实施方案116.根据实施方案64-115中任一项所述方法，其中所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。
实施方案117.根据实施方案115所述的方法，其中与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经修饰的T细胞而在所述个体中产生的先天性免疫应答降低。
实施方案118.根据实施方案115或117所述的方法，其中与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经修饰的T细胞在被给予所述经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期增加。
实施方案119.根据实施方案64-118中任一项所述的方法，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、或自然杀伤T细胞。
实施方案120.根据实施方案64-119中任一项所述的方法，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、或γδ-T细胞。
实施方案121.根据实施方案64-120中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞对所述个体而言是同种异体的。
实施方案122.根据实施方案64-121中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞对所述个体而言是自体的。
实施方案123.根据实施方案64-122中任一项所述的方法，其中将所述个体预调理以调节炎症和/或免疫应答。
实施方案124.根据实施方案64-123中任一项所述的方法，其中其还包括向所述受试者给予第二佐剂。
实施方案125.根据实施方案124所述的方法，其中所述第二佐剂是IFN-α、LPS或CpG ODN。
实施方案126.根据实施方案124或125所述的方法，其中并行地或同时给予所述经修饰的T细胞和所述第二佐剂。
实施方案127.根据实施方案124或125所述的方法，其中依序给予所述经修饰的T细胞和所述第二佐剂。
实施方案128.根据实施方案124-127中任一项所述的方法，其中在给予所述第二佐剂之前给予所述经修饰的T细胞。
实施方案129.根据实施方案124-128中任一项所述的方法，其中在给予所述第二佐剂之后给予所述经修饰的T细胞。
实施方案130.根据实施方案64-129中任一项所述的方法，其中在给予免疫检查点抑制剂之前、并行地或之后给予所述经修饰的T细胞。
实施方案131.根据实施方案130所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的任何一种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。
实施方案132.根据实施方案64-131中任一项所述的方法，在给予化学疗法之前、并行地或之后给予所述经修饰的T细胞。
实施方案133.根据实施方案132所述的方法，其中所述化学疗法包括顺铂。
实施方案134.根据实施方案64-133中任一项所述的方法，其中向所述个体给予所述经修饰的T细胞导致对所述抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。
实施方案135.根据实施方案64-134中任一项所述的方法，其中向所述个体给予所述经修饰的T细胞导致对所述抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。
实施方案136.根据实施方案64-135中任一项所述的方法，其中给予所述个体的所述经修饰的T细胞的量在约1x 106个与约1x 1012个细胞之间。
实施方案137.根据实施方案64-136中任一项所述的方法，其中所述方法包括多次给予所述经修饰的T细胞。
实施方案138.根据实施方案137所述的方法，其中在两次相继给予所述经修饰的T细胞之间的时间间隔在约1天与约30天之间。
实施方案139.一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：向所述个体给予与抗原缔合的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：a)将输入T细胞与抗原和/或佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原与所述输入T细胞的细胞表面缔合，其中所述抗原包含免疫原性表位，从而产生与所述抗原缔合的经修饰的T细胞；以及b)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。
实施方案140.根据实施方案139所述的方法，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
实施方案141.根据实施方案140所述的方法，其中所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
实施方案142.根据实施方案139-141中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpGODN或LPS。
实施方案143.根据实施方案142所述的方法，其中所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
实施方案144.一种包含根据实施方案1-59中任一项所述的经修饰的T细胞的组合物，其用于通过手术、疗法或诊断治疗人体或动物体的方法。
实施方案145.一种包含根据实施方案1-59中任一项所述的经修饰的T细胞的组合物，其用于调节个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予所述经修饰的T细胞。
实施方案146.一种包含所述经修饰的T细胞的组合物，其用于通过手术、疗法或诊断治疗人体或动物体的方法，其中所述经修饰的T细胞包含抗原，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
实施方案147.一种包含所述经修饰的T细胞的组合物，其用于调节个体的免疫应答的方法，其中所述经修饰的T细胞包含抗原，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
实施方案148.一种包含所述经修饰的T细胞的组合物，其用于通过手术、疗法或诊断治疗人体或动物体的方法，其中所述经修饰的T细胞通过包括以下的方法制备：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原和佐剂通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和佐剂的经修饰的T细胞。
实施方案148.一种包含所述经修饰的T细胞的组合物，其用于调节个体的免疫应答的方法，其中所述经修饰的T细胞通过包括以下的方法制备：a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原和佐剂通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和佐剂的经修饰的T细胞。
实施例
本领域技术人员将认识到，在本发明的范围和精神内可以有若干种实施方案。本发明现在将通过引用以下非限制性实施例进行更加详细的描述。以下实施例进一步说明了本发明，但是当然不应该解释为以任何方式限制其范围。
实施例1.
为了确定在治疗性设置中导致肿瘤生长抑制所需最小有效细胞剂量TAPC，在TC1肿瘤模型中测试四种不同剂量的初免/加强TAPC，并且绘制肿瘤面积随时间变化的曲线图。
在第0天，向C57BL/6J雌性小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)。在第4天(初免)和第7天(加强)，从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载200μg/mL CpG ODN 1826和预复合的40μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)+40μM小鼠血清白蛋白(MSA)。向动物(10只小鼠/组)静脉注射相关剂量的E7+MSA+CpG负载的T细胞(50M细胞/mL)，并且在肿瘤植入后1周开始测量TC-1肿瘤生长，每周两次，并且与未治疗的小鼠的肿瘤生长进行比较。图1A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
图1B示出了在图1A中概述的来自未治疗组(无T细胞的过继转移)的小鼠与来自治疗组B-E的小鼠之间比较如通过式((长度x宽度2)/2)测量的肿瘤生长。所有治疗条件均导致完全肿瘤减小，表明测试的最低细胞剂量(2.5M细胞初免，1M细胞加强)仍然能够实现与较高细胞剂量相同的肿瘤减小，在第18天相对于未治疗，每种均达到统计显著性(#P<0.0001)。
实施例2
为了确定E7 SLP设计，将两种不同的E7 SLP、天然E7 SLP以及其中天然序列的所有半胱氨酸均被丝氨酸替代的物质SQZ到T APC中，同时进行CpG共给予，并且通过ICS评估每种条件的IFN-γ产生。
从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载不同剂量的(左-200μg/mL，右-25μg/mL)CpG ODN 1826和预复合的40μM E7天然或经典SLP+40μM小鼠血清白蛋白(MSA)，或在不存在SQZ的情况下用相同的条件孵育T细胞，作为阴性对照(Endo-组B和D)。向动物(5只小鼠/组)静脉内注射100μL体积(50M细胞/mL)的5M负载或孵育的T细胞。在第8天，收获脾脏，并且通过ICS定量产生IFN-γ的CD8+ T细胞的％。图2A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
使用cE7的Endo对照组中产生IFN-γ的CD8+ T细胞的％最高，其与使用cE7的SQZ或使用nE7的Endo无显著差异。出乎意料地，SQZ与Endo相比没有益处，但相对于所有其他情况，在SQZ nE7条件下产生IFN-γ的CD8+T细胞的％显著下降。此数据显示，SLP序列对响应于T APC疫苗接种而产生的产生IFN-γ的CD8+ T细胞的％具有影响，特别是当使用SQZ将抗原负载到T细胞中时。
实施例3
为了确定在体外人模型中E6 SLP在E6应答T细胞中诱导抗原特异性免疫应答的能力，向原代人T细胞中负载E6 SLP，并且通过ELISA测量应答细胞IFN-γ分泌。
从HLA-A02+供体的PBMC中分离出人T细胞(10M细胞/mL)，并且通过SQZ在细胞内递送50μM含有HLA-A02限制性最小E629-38表位(LPQLSTELQTTIHDIILECVYSKQQLLRREVYDFAF)的E6 SLP，并且在SQZ条件与其中在不存在SQZ的情况下E6 SLP与TAPC一起孵育的对照(Endo)之间比较如通过ELISA测量的IFN-γ水平。然后将TAPC与E6特异性CD8+应答细胞以1:1的刺激物:效应子的比率共培养，并且在IL-2(100U/mL)的存在下培养。18h后，从每种条件下收集上清液，并且通过IFN-γELISA(Biolegend)评估IFN-γ的产生水平。
当与E6应答CD8+ T细胞共培养时，测试的E6 SLP(当使用SQZ在细胞内递送时)导致IFN-γ产生的增加>10倍(#P<0.0001)，如图3所示。这些发现显示了T APC引发针对多种HPV抗原(E6和E7)的抗原特异性免疫应答的能力。
实施例4
为了确定E7 SLP诱导E711-20应答T细胞中抗原特异性免疫应答的能力以及SLP序列在体外人模型中对SQZ T细胞APC(Tapc)激活的影响，向来自多个供体的原代人T细胞中负载不同的E7 SLP，并且通过ELISA测量应答细胞IFN-γ分泌。
从HLA-A02+供体的PBMC中分离出人T细胞(10M细胞/mL)，并且通过SQZ在细胞内递送50μM OL-E71-35(MHGDTPTLHEYMLDLQPE TTDLYCYEQLNDSSEEE)或E7.6(QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL)SLP，并且在SQZ条件与其中在不存在SQZ的情况下E7 SLP与Tapc一起孵育的对照(Endo)之间比较如通过ELISA测量的IFN-γ水平。然后将TAPC与E711-20特异性CD8+应答细胞以4:1的刺激物:效应子的比率共培养，并且在IL-2(100U/mL)的存在下培养。24h后，从每种条件下收集上清液，并且通过IFN-γELISA(Biolegend)评估IFN-γ的产生水平。
与Endo相比，当使用SQZ递送时，天然OL-E71-35 SLP引发最小IFN-γ应答(图4)。然而，在当与Endo对照比较时测试的所有三个供体中，包含在另一个反应性SLP的侧翼区域(E621-45-QLCTELQTXXXXXXXXXY CKQQLL)之间插入的E7最小表位(YMLDLQPETT)的E7.6相对于匹配的Endo对照诱导了更大的IFN-γ响应(*P<0.05，**P<0.01；#P<0.0001)。此发现突出了侧翼区域序列在SLP的免疫原性中的重要性，并且提供了对以下的支持：已知具有反应性的其他SLP的侧翼区域可以与正交最小表位结合使用以实现增加的免疫应答。
实施例5
为了在体外人模型中评估SQZ T细胞APC的抗原剂量，向原代人T细胞中负载不同剂量的E7 SLP，并且通过ELISA评估IFN-γ。
从HLA-A02+供体的PBMC中分离出人T细胞(10M细胞/mL)，并且通过SQZ在细胞内递送不同剂量的(50和100μM)E7 SLP(QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL)，并且在SQZ条件与其中在不存在SQZ的情况下将E7 SLP与T APC一起孵育的对照(Endo)之间比较如通过ELISA测量的IFN-γ水平。然后将T APC与E711-20特异性CD8+应答细胞以4:1的刺激物:效应子的比率共培养，并且在IL-2(100U/mL)的存在下培养。24h后，从每种条件下收集上清液，并且通过IFN-γELISA(Biolegend)评估IFN-γ的产生水平。另外，使用肽脉冲阳性对照，其中在ELISA之前将B-LCL细胞在最小E7表位(YMLDLQPETT)的存在下孵育1h。
在测试的三个供体中，相对于其中在不存在SQZ的情况下将SLP与T细胞一起孵育的可比较对照(Endo)，在所有SQZ条件下均出现一致的IFN-γ增加(图5)。供体1和3展现出在50μM E7 SLP的情况下统计学上显著的增加(8668-*P<0.05；8299-#P<0.0001)，以及在更高的100μM E7SLP下趋于显著的趋势。尽管对于任何供体，在50μM与100μM之间没有统计学上显著的差异，但是在50μM E7 SLP的情况下，存在始终相等或更高的IFN-γ应答。
实施例6
为了确定在体外人模型中SQZ T细胞APC的供体变异性以及鉴定诱导针对E7的显著免疫应答的E6和E7 SLP的最佳组合和剂量，在来自多个HLA-A02+供体的原代人T细胞中负载E6和E7 SLP并且通过ELISA评估IFN-γ。
从HLA-A02+供体的PBMC中分离出人T细胞(10M细胞/mL)，并且通过SQZ在细胞内递送25或50μM E6 SLP(QLCTELQTTIHDIILECV YCKQQLL)和E7.6 SLP(QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL)，并且在SQZ条件与其中在不存在SQZ的情况下将SLP与TAPC一起孵育的对照(End o)之间比较如通过ELISA测量的IFN-γ水平。使用肽脉冲阳性对照，其中在最小E7表位(YMLDLQPETT)的存在下在TAPC产生的同时孵育B-LCL细胞。然后将TAPC和阳性对照与E711-20特异性CD8+应答细胞以4:1的刺激物:效应子的比率共培养，并且在IL-2(100U/mL)的存在下培养。24h后，从每种条件下收集上清液，并且通过IFN-γELISA(Biolegend)评估IFN-γ的产生水平。
相对于其中在不存在SQZ的情况下将SLP与T细胞一起孵育的可比较对照(Endo)，当用SQZ E6+E7 SLP治疗时，所示出的七个供体中的五个展现出一致的IFN-γ增加(供体1-3、5-6：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005)，如图6所示。在相对于Endo对照当用经SQZ的T APC治疗时没有统计学上显著的增加的两个供体中，两个供体(供体4和7)均具有这样的情况，其中在测试一个剂量的经SQZ的T APC的情况下存在可检测的增加(供体4-50μm，供体7-25μM)，趋于显著。总的来说，这些数据显示，尽管不同的供体T APC具有不同的免疫刺激活性，但我们可以看到在多个供体之间IFN-γ的产生一致增加，并且当与多种抗原/SLP组合使用时，E7特异性免疫应答仍然显著，在这种情况下是HPV特异性E6抗原。
实施例7
为了帮助确定导致最稳健免疫应答的佐剂，我们测试了作用于不同途径的两种佐剂对T APC诱导体内抗原特异性应答的能力的作用。通过四聚体和通过流式细胞术的ICS染色来定量这种作用。
从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载400μg/mL Ova+各种浓度的高分子量和低分子量聚I:C(10、30、100、300、1000μg/mL)，并且与在不存在SQZ的情况下在相同条件下孵育的T细胞(作为阴性对照(Endo-组C和E))进行比较。将SQZ有Ova+200μg/mL CpG的T细胞用作阳性对照(组F)。在第0天，向小鼠(5只/组，3只未治疗的)注射100μL体积的5M负载或孵育的T细胞(50M细胞/mL)。在第7天，收获脾脏并且使用流式细胞术通过四聚体染色对Ova特异性T细胞进行定量，同时将一些脾细胞通透化并且固定过夜。第二天(第8天)，通过ICS确定IFN-γ水平，其中PMA/离子霉素作为阳性对照。图7A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在其中CpG为佐剂的组中，四聚体或产生IFN-γ的CD8+ T细胞的％最高，而其中LMW或HMW聚I:C为佐剂的所有条件相对于未治疗的情况没有增加Ova特异性或产生IFNγ的CD8+ T细胞的百分比(图7B)。由于聚I:C是TLR3激动剂并且CpG是TLR9激动剂，因此此数据支持了CpG相对于聚I:C在T APC疫苗接种的情况下作为佐剂的优越性，同时表明TLR3激活在这种设置中可能没有益处。
实施例8
为了帮助确定导致最稳健免疫应答的CpG佐剂的浓度，我们测试了多种剂量的CpG对T APC诱导体内抗原特异性应答的能力的作用。通过四聚体和通过流式细胞术的ICS染色来定量这种作用。
从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载400μg/mL Ova+各种浓度的CpG 1826(50、100、200μg/mL)，并且与在不存在SQZ的情况下在相同条件下孵育的T细胞(作为阴性对照(Endo-组B、D和F))进行比较。在第0天，向小鼠(5只/组，3只未治疗的)注射100μL体积的5M负载或孵育的T细胞(50M细胞/mL)。在第7天，收获脾脏并且使用流式细胞术通过四聚体染色对Ova特异性T细胞进行定量，同时将一些脾细胞通透化并且固定过夜。第二天(第8天)，通过ICS确定IFN-γ水平，其中PMA/离子霉素作为阳性对照。图8A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在用200μg/mL CpG的组中，四聚体或产生IFN-γ的CD8+ T细胞的％最高并且对于I类肽/MHC-I，与相关的Endo对照存在显著差异(对于四聚体为*P<0.05，对于IFN-γ为#P<0.0001)，而相对于未治疗的情况或其相应的Endo对照，所有其他条件均未引发显著的应答(图8B)。仅在I类肽的情况下观察到Ova特异性T细胞的激活，支持了Ova抗原的直接呈递实现CD8+ T细胞应答。
实施例9
为了帮助评估导致稳健免疫应答的CpG佐剂给予时间表，我们测试了多种CpG给药时间表对T APC诱导体内抗原特异性应答的能力的作用。通过四聚体和通过流式细胞术的ICS染色来定量这种作用。
从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载400μg/mL Ova，并且向小鼠(5只/组，3只未治疗的)注射100μL体积的5M负载或孵育的T细胞(50M细胞/mL)。在TAPC初免(第0天)的同时或者在初免后第1天或第2天(分别为第1天或第2天)进行供体小鼠的CpG 1826(25μg/mL)全身共给予，并且与在不存在SQZ的情况下在相同条件下孵育的T细胞(作为阴性对照(组B、D和F))进行比较。将SQZ有(Ova+200μg/mL CpG)的T细胞用作阳性对照(组H)。在第7天，收获脾脏并且使用流式细胞术通过四聚体染色对Ova特异性T细胞进行定量，同时将一些脾细胞通透化并且固定过夜。第二天(第8天)，通过ICS确定IFN-γ水平，其中PMA/离子霉素作为阳性对照。图9A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在其中将Ova和CpG共递送至T APC的组中，四聚体或产生IFN-γ的CD8+ T细胞的％最高，而与初免同一天的共给予(组B)是唯一的显示出一定水平的Ova特异性激活的共给予CpG组，趋向于显著(图9B)。然而，此数据支持以下观察结果：抗原+CpG共递送可以导致Ova特异性CD8+ T细胞的最大激活，而与同时初免和共给予佐剂相比，延迟CpG的全身给予导致较低的应答。
实施例10
为了确定针对T APC抗肿瘤功能的细胞内和全身佐剂给予的组合，在预防性TC-1鼠肿瘤模型中，与我们的E7特异性T APC结合来比较CpG与IFN-α的多种给予途径。通过四聚体染色和流式细胞术测量抗原特异性T细胞应答，而通过肿瘤生长预防测量抗肿瘤作用。
在第-14天(初免)和第-7天(加强)，从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载预复合的40μM E7 SLP(GQAEPDR AHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)+40μM小鼠血清白蛋白(MS A)(组B和C)或E7 SLP+MSA+200μg/mL CpG ODN 1826(组D、E和F)。向C57BL/6J雌性受体小鼠(10只小鼠/组)静脉注射100μL负载的T细胞(5M细胞/动物)，而组B和E的动物也接受静脉CpG(25μg)并且组C和F接受I V IFN-α(10k IU)。在第-8天和第-3天，收集100μL鼠血，并且通过四聚体染色和流式细胞术定量E7特异性CD8+ T细胞的％。在第0天，在受体小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(100k细胞/小鼠)，并且在第11天开始每周两次测量TC-1肿瘤生长，并且与未治疗小鼠的肿瘤生长进行比较。图10A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在用E7+MSA或E7+MSA+CpG SQZ T细胞+/-共给予CpG或IFN-α初免后(第-8天)和加强后(第-3天)通过E7四聚体染色测量在小鼠中E7特异性T细胞的百分比(图10B)。在SQZ E7+CpG共给予和SQZ(E7+CpG)+IFN-α共给予组中观察到最高相对比例的E7特异性T细胞。相对于SQZ E7+共给予CpG，在SQZ(E7+CpG)+共给予CpG中E7特异性初免后CD8+ T细胞的相对数量令人惊讶地更低(*P<0.05)，而共给予IFN-α与SQZ(E7+CpG)T细胞导致比共给予CpG与SQZ(E7+CpG)T细胞显著更高的E7特异性T细胞数量(*P<0.05)。加强后(第-3天)，观察到相似的趋势，其中SQZ E7+CpG共给予和SQZ(E7+CpG)+IFN-α共给予组导致最高的E7特异性T细胞％。然而，最高的应答来自SQZ(E7+CpG)+IFN-α共给予组，其显著高于SQZ E7+IFN-α共给予和SQZ(E7+CpG)+共给予CpG，显示了当与SQZ(E7+CpG)T细胞组合使用时，IFN-α共给予导致更高的抗原特异性T细胞百分比。在图10C中概述的来自未治疗组(无T细胞的过继转移)的小鼠与来自治疗组B-F的小鼠之间比较如通过式((长度x宽度2)/2)测量的肿瘤生长。SQZ(E7+CpG)+IFN-α共给予组的高肿瘤生长减少和生存优势很好地与四聚体染色对应，显示了E7特异性T细胞的最高诱导导致最佳的抗肿瘤活性。有趣的是，尽管SQZ(E7+CpG)组中的E7特异性T细胞％低，但这种治疗也提供了非常高水平的抗肿瘤活性，这是唯一的将所有小鼠的生存延长超过60天的其他组(除了SQZ(E7+CpG)+IFN-α共给予之外)。虽然比先前提到的组D和F略低，但在组C和E中存在可辨别的生存延长和肿瘤生长抑制。在第78天，将来自组D的7只无肿瘤小鼠在相对的(左)侧腹用50k细胞再激发并且与年龄相匹配的未处理动物(10只小鼠)进行比较(图10D)。与接受其首次激发的未治疗小鼠相比，来自组D的小鼠在再激发后具有显著减少的肿瘤生长(***P<0.005)，提供了对以下的支持：这种抗肿瘤作用可持续超过2个月。
实施例11
为了确定组合多种HPV抗原用于T APC抗肿瘤功能的作用，在预防性TC-1鼠肿瘤模型单独的E6和E7合成长肽(SLP)以及与我们的E7特异性T APC的组合。通过四聚体染色和流式细胞术测量E7特异性T细胞应答，而通过肿瘤生长预防测量抗肿瘤作用。
在第-14天(初免)和第-8天(加强)，从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且根据表XX，使用SQZ负载预复合的20μM小鼠血清白蛋白(MSA)+20μM E6(VYSKQQLLRREVYDFAFRDLSIVYRDGNPYAVSDK)和/或E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)或两者+/-200μg/mL CpG ODN 1826的组合。在不存在SQZ的情况下在与组B相同的条件下孵育的T细胞用作阴性对照(组C)。向C57BL/6J雌性受体小鼠(5-10只小鼠/组)静脉内注射100μL负载的T细胞(5M细胞/动物)。在第-3天，收集100μL鼠血，并且通过四聚体染色和流式细胞术定量E7特异性CD8+ T细胞的％。在第0天，在受体小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(100k细胞/小鼠)，并且在第11天开始每周两次测量TC-1肿瘤生长，并且与未治疗小鼠的肿瘤生长进行比较。图11A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在加强后(第-3天)通过E7四聚体染色测量小鼠中E7特异性T细胞的百分比，在CpG+E7 SQZ T APC(组B)的情况下观察到最大作用，如图11B所示。有趣的是，组B应答显著高于未治疗的情况以及E7和E6的组合(组F-#P<0.0001)，提供了证据表明E6 SLP的添加钝化了E7特异性应答。组B与其他治疗组显著不同，值得注意的例外是Endo对照(组C)，其中组B值得注意地更高并且趋于统计学显著性。如图11C所示，在图11A中概述的来自未治疗组(无T细胞的过继转移)的小鼠与来自治疗组B-G的小鼠之间比较如通过式((长度x宽度2)/2)测量的肿瘤生长。用SQZ有E7+CpG的T细胞以及在E7+CpG的存在下在不存在SQZ的情况下孵育的T细胞的组中出现高的肿瘤生长预防。相对于未治疗的情况(组A)和经E6+CpG SQZ的T细胞(组G)，组D-F显示出一定水平的肿瘤生长抑制，但均不如组B和C有效。
实施例12
为了确定CpG佐剂的给予途径对于E7特异性T APC抗肿瘤作用的重要性，将E7 SLP与CpG组合递送至T细胞，递送至T细胞或全身共给予于受体动物，并且通过肿瘤生长抑制测量抗肿瘤作用。
在第0天，向受体小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)。在第10天(初免)和第20天(加强)，从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载预复合的20μM小鼠血清白蛋白(MSA)+20μM E7(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)，并且通过SQZ共递送200μg/mL的ODN 1826(组D)或以25μg/小鼠全身共给予动物(组C)，并且与未治疗的情况(组A)和全身给予单独的CpG(组B)进行比较。将受体小鼠(8-10只小鼠/组)用100μL负载的T细胞(5M细胞/动物)治疗。从第10天开始，每周两次测量TC-1肿瘤生长。图12A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在HPV相关癌症(TC-1)的治疗性模型中，相对于未治疗的情况和单独注射CpG，SQZ有E7 SLP的T APC导致肿瘤负荷显著减小(第17天：组C-P<0.05；第20天：组C和D–P<0.0001)(图12B)。这些数据显示，在治疗性设置中，相对于未治疗的情况或单独的佐剂，CpG佐剂的全身共给予和细胞内递送两者均导致肿瘤负荷显著减小。
实施例13
为了评价共给予的佐剂导致E7特异性T细胞肿瘤浸润的能力，在治疗性TC-1鼠肿瘤模型中与我们的E7特异性T APC组合来比较CpG与IFN-α。通过四聚体染色和流式细胞术测量肿瘤浸润淋巴细胞中的抗原特异性T细胞应答。
在第0天，向受体小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)。在第10天，从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载预复合的20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)+20μM小鼠血清白蛋白(MSA)。将SQZ负载的T细胞(5M细胞/动物)单独给予(组C)、与CpG ODN 1826(25μg/小鼠-组D)一起给予、或与IFN-α(10k IU/小鼠-组E)一起给予，并且静脉注射100μL总体积。还向小鼠注射全身性CpG(25μg-组A)或单独的IFN-α(10k IU-组B)。在第17天，收获肿瘤并且分离CD8+肿瘤浸润T细胞，并且通过四聚体染色评价E7特异性反应性。图13中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在初免后7天(第17天)通过E7四聚体染色测量小鼠中E7特异性CD8+ T细胞的百分比，并且CD8+细胞中E7特异性T细胞的百分比的代表性例子在图13的下图中示出。虽然单独注射佐剂不会产生可察觉量的E7特异性T细胞，但SQZ递送E7 SLP提供了40％的E7特异性T细胞增加，并且E7递送的T细胞与CpG和IFN-α的组合导致甚至更高百分比的抗原特异性T细胞(分别为70％和80％)。此数据显示，当与全身性佐剂(诸如CpG或IFN-α)组合给予负载E7SLP的T细胞时，产生更稳健的E7特异性T细胞应答。
实施例14
为了确定用于负载有E7合成长肽(SLP)+CpG的T APC的初免和加强两者的疫苗接种时间表，我们使用在不同时间点用我们的T APC疫苗以及用不同的加强数量治疗的治疗性TC-1鼠肿瘤模型。通过肿瘤生长抑制来测量抗肿瘤作用。
在第0天，在受体小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)，并且在第11天开始每周两次测量TC-1肿瘤生长，并且与未治疗小鼠的肿瘤生长进行比较。在第3天或第6天，从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且根据表XX，使用SQZ负载预复合的20μM小鼠血清白蛋白(MSA)+20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)+200μg/mLCpG ODN 1826，然后向受体小鼠静脉注射100μL负载的T细胞(5M细胞/动物)。图14A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在SQZ有E7+CpG的T细胞的所有组中出现肿瘤生长抑制，并且在第20天出现相对于未治疗情况的统计显著性(第20天-所有组P<0.05；第24天-所有组P<0.0001)。此数据显示，在第6天与第3天进行初免时，用T APC疫苗的给药时间表可以表现得同样好，并且在第21天增加第二加强没有可辨别的益处。
实施例15
为了更好地理解通过已通过SQZ具有细胞内抗原递送的T细胞进行抗原呈递的机制，将Ova递送至注射到野生型小鼠或MHC-I敲除老鼠中的野生型T细胞或在不存在SQZ的情况下与其一起孵育。收获脾脏并且通过CFSE染色定量Ova特异性T细胞(OT-I)增殖的量。
在第0天，从OT-I雌性供体小鼠中分离出T细胞并且将其用2μM CFSE标记，并且将在100μL PBS中的2.5M细胞经眼眶后(RO)注射到野生型或MHC-I敲除小鼠中。同样在第0天，将400μg/mL Ova负载到从CD45.1供体小鼠(4只小鼠/组)中分离出的T细胞中或与其一起孵育，并且RO注射5M T细胞。在第3天，收获脾脏并且通过CFSE染色评价Ova特异性T细胞增殖水平。
通过CFSE标记Ova反应性OT-I CD8+ T细胞来评价Ova特异性T细胞增殖的量。为了确定负载抗原的TAPC的呈递机制，将缺乏MHC-I的小鼠用作受体小鼠。这将阻止内源性鼠APC呈递Ova抗原，这是由于正死亡的经SQZ的T细胞间接吸收抗原以及在MHC-I上交叉呈递给过继转移的OT-I细胞。已发现，当受体小鼠缺乏MHC-I时，仍然发生Ova特异性OT-I细胞增殖，提供了证据表明经SQZ的T APC直接呈递抗原(图15)。这些数据支持了SQZ介导的细胞内递送的抗原的直接呈递。
实施例16
为了评价SQZ改变细胞因子产生的倾向，向T细胞中SQZ递送CpG，并且评价在体外鼠模型中改变T细胞细胞因子水平的能力。使用多重细胞因子药剂盒剖析上清液中的细胞因子水平。
将C57BL/6J雌性受体小鼠用从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离并且SQZ有200μg/mLCpG的T细胞进行初免，并且在24h后收集上清液(N＝2)。通过Millipore Milliplex多重细胞因子药剂盒评价上清液的细胞因子水平，并且表示为相对于未治疗的T细胞的倍数变化差异。
相对于未治疗的细胞，经由SQZ负载CpG的T细胞的上清液中的细胞因子水平之间没有显著变化(图16)。此数据显示，佐剂的SQZ递送在体外不显著改变T细胞细胞因子水平。
实施例17
为了评价SQZ改变细胞因子产生的倾向，评价SQZ递送Ova或Ova+CpG的T细胞的在体外鼠模型中改变血清细胞因子水平的能力。使用多重细胞因子药剂盒剖析血清细胞因子。
将C57BL/6J雌性受体小鼠用从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离并且SQZ有400μg/mLOva或Ova+200μg/mL CpG的T细胞进行初免，并且在初免后6h从尾静脉抽血并且在24h通过心脏穿刺抽血。通过Millipore Milliplex多重细胞因子药剂盒评价血清的细胞因子水平，并且表示为相对于未治疗的T细胞的倍数变化。
用经由SQZ负载Ova或Ova+CpG的T细胞初免的小鼠血清中的细胞因子水平之间没有显著变化(图17)。此外，在初免后6h与24h之间未观察到显著差异。这些数据显示，抗原+/-佐剂的SQZ递送在体内不显著改变血清细胞因子水平。
实施例18
此实施例部分地证明了引入T细胞(T-APC)中的抗原被快速加工并且直接呈递。
为了确定作为抗原呈递细胞(T-APC)的T细胞的抗原呈递的动力学，通过SQZ将抗原递送至T细胞，并且通过免疫染色和流式细胞术随时间评价与MHC-I结合的最小肽的存在。
具体地，从C56BL/6J小鼠中分离出鼠T细胞，并且在无有效载荷(SQZ：无抗原)的情况下进行SQZ加工或SQZ加工有200μg/mL通过SQZ负载的Ova蛋白(SQZ：卵清蛋白-N＝3个技术重复)。在2h-24h之间的各个时间点，将治疗的T细胞用特异性识别Ova最小表位(SIINFEKL)的抗体(25-D1.16)染色，然后进行流式细胞术。将通过免疫染色检测从OVA蛋白加工并且呈递在MHC-I上的任何最小表位，并且通过流式细胞术确定抗原呈递量。
在MHC-I上呈递各种水平的SIINFEKL的细胞的相对群体通过在0、2、4和24h重叠的直方图(深灰色代表SQZ：No抗原；浅灰色代表SQZ：卵清蛋白)描绘(图18A)。与SQZ：无抗原对照相比，代表SQZ：卵清蛋白的直方图中的向右移位指示SIINFEKL染色增加的群体，并且因此指示在MHC-I上呈递加工抗原的细胞群体的增加。所描述的在负载抗原的T-APC中的移位在2h时明显，并且仅在24h后才观察到抗原呈递的小幅降低。通过细胞的平均荧光强度(MFI)测量随时间变化的在MHC-I上的SIINFEKL呈递的相对量/细胞(图18B)。SQZ：卵清蛋白群体在2h后显示出可察觉的SIINFEKL呈递，并且在4h观察到最大呈递，然后在4h与24h之间观察到随着时间略有降低。在整个测量时间过程中，SQZ：无抗原对照的抗原呈递没有观察到差异。总体来说，此数据支持了SQZ介导的抗原负载到T细胞中导致抗原的快速呈递(2-4h)。
实施例19
此实施例部分地证明了已SQZ负载疾病相关抗原的T细胞(T-APC)有效地刺激体外抗原特异性T细胞应答。
为了确定已SQZ负载疾病相关抗原的人T细胞(T-APC)刺激抗原特异性T细胞应答的能力，向T细胞SQZ负载CMV相关抗原，与抗原特异性应答T细胞共培养，并且通过ELISA测量炎性细胞因子的分泌水平。
具体地，从HLA-A2+供体分离出人T细胞，并且将CMV pp65SLP(50μM)与T细胞一起孵育(Endo)或通过SQZ递送至T细胞(SQZ)。然后将Endo T细胞或SQZ T细胞(60k细胞/孔)与pp65应答T细胞(30k细胞/孔)以2:1的比率一起孵育，并且在IL-2(100U/mL)和CpG 2006(1μM)的存在下共培养24h。然后收获上清液，并且通过ELISA分析IFN-γ分泌水平，这指示了体外抗原特异性免疫刺激的量。
当相比于与pp65 SLP一起孵育的T细胞(Endo)时，由SQZ负载的T细胞对pp65特异性应答者的刺激存在相当大且统计学上显著的增加，如通过IFN-γELISA测量(P<0.005)。这些数据显示，通过SQZ负载疾病相关抗原，可以修饰人T细胞，以成为体外刺激疾病相关抗原特异性T细胞应答的高效APC。
实施例20
为了评估佐剂对SQZ负载的疫苗诱导抗原特异性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的能力的重要性，向细胞负载模型抗原，与佐剂一起成熟并且注射到荷瘤小鼠中。通过流式细胞术测量募集到肿瘤的抗原特异性T细胞的相对百分比。
在第0天，向C57BL/6J雌性小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)。在第15天(初免)，从雌性C57BL/6J供体小鼠的脾脏中获取鼠T细胞，并且通过SQZ(40psi，3.5μm缩窄部，室温)负载预复合的5μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)+5μM小鼠血清白蛋白(MSA)，并且在37℃下孵育1h。在第15天经眼眶后向雌性C57BL/6J受体小鼠(10只/组)注射100μL媒介物(PBS-未治疗)或负载E7的T细胞(1M细胞/小鼠)+/-CpG 1826(25μg/小鼠)。在第25天，收获肿瘤并且通过流式细胞术测量E7特异性TIL的量。
单独的SQZ负载的T APC导致小(约15％)但统计学上不显著的E7特异性TIL数量增加，但是当与CpG共注射时，TIL数量存在更高和显著的增加(约55％，与单独的T APC相比，**P<0.01；与未治疗的情况相比，***P<0.0005)。此数据显示，与单独的T APC相比，将CpG与负载E7的T APC一起共注射导致高得多的TIL募集。
实施例21
为了评估T APC+佐剂疫苗在预防性设置中的耐久性，对于初始应答以及再激发60天后两者，比较经T APC治疗的小鼠与未治疗小鼠的表达HPV E7的TC1肿瘤模型的肿瘤生长，并且绘制肿瘤面积随时间变化的曲线图。
在第-14天，从C57BL/6J雌性供体小鼠收获脾细胞，并且通过免疫磁分离分离T细胞。接下来，经由SQZ(45psi；3.5μm缩窄部)向鼠T细胞负载预复合的20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLS VQSTHVDIR)+20μM小鼠血清白蛋白(MSA)，并且在37℃下孵育1小时。经眼眶后向雌性C57BL/6J受体小鼠(10只小鼠/组，除了20小鼠/组的未治疗组群I)注射100μL媒介物(PBS-未治疗)或负载E7的T细胞(1M细胞/小鼠)+CpG 1826(25μg/小鼠)[初免]。在第-7天，与第-14天完全一样，从C57BL/6J雌性供体小鼠中收获脾脏，并且分离T细胞，并且进行SQZ并且注射到受体小鼠中[强化]。在第0天，将C57BL/6J雌性小鼠在右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)(除了直到第64天才植入肿瘤细胞的10未治疗的组群2)。在高达120天内，在肿瘤植入后1周开始，每周两次测量T C-1肿瘤的生长，并且与未治疗小鼠的肿瘤生长进行比较。
在来自未治疗组的小鼠与在第0天用肿瘤细胞激发的T APC治疗组的小鼠之间比较如通过式((长度x宽度2)/2)测量的肿瘤生长，并且虽然到第47天，未治疗组中的所有小鼠均达到人道终点，但除2只T APC小鼠外，T APC组中的所有小鼠均存在显著的肿瘤生长延迟，并且其余小鼠(8只)保持无肿瘤直到用肿瘤再激发。有趣的是，当将在第64天植入肿瘤的未治疗的小鼠与具有在其相对腹侧再植入的肿瘤的T APC治疗小鼠进行比较时，仍然存在肿瘤生长延迟，其中3只小鼠从未生长出可测量的肿瘤，即使在二次肿瘤激发后也是如此。这些数据表明，用负载E7的T APC+佐剂的治疗不仅可以导致抗原特异性肿瘤生长抑制，而且还可以导致预防肿瘤，所述预防肿瘤甚至可以持续超过>100天，即使在二次肿瘤激发的情况下。
实施例22
为了评估不同的T APC浓度以及初免-加强时间表在治疗性疫苗设置中的影响，比较T APC治疗小鼠(多种浓度和初免-加强时间表)与未治疗的小鼠的表达HPV E7的TC1肿瘤模型的肿瘤生长，并且绘制肿瘤面积随时间变化的曲线图。
在第0天，向C57BL/6J雌性小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)。在第10天(初免)，通过免疫磁分离从雌性C57BL/6J供体小鼠的脾脏中获取鼠T细胞，并且通过SQZ(45psi，3.5μm缩窄部，室温)负载预复合的20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQS THVDIR)+20μM小鼠血清白蛋白(MSA)，并且在37℃下孵育1小时。然后，经眼眶后向雌性C57BL/6J受体小鼠(10只/组)注射100μL媒介物(P BS)或TAPC(0.25或1M细胞/小鼠)+CpG 1826(25μg/小鼠)。在第17天，初免/加强组以与第10天相同的方式接受用T APC的第二注射。在高达66天内，在肿瘤植入后1周开始，每周两次测量TC-1肿瘤的生长，并且与未治疗小鼠的肿瘤生长进行比较。
与未治疗的情况相比，如通过式((长度x宽度2)/2)测量肿瘤生长，并且低剂量TAPC组(0.25M细胞/小鼠)+CpG(仅初免)仅导致肿瘤生长速率略微延迟。从对在第17天用低剂量T APC+CpG(0.25M初免/加强)进行加强的包括，看出相对于仅相同浓度的初免的条件增强了肿瘤生长抑制并且相对于未治疗的情况，抑制大得多。将负载抗原的T APC的剂量增加至1M/小鼠(仅初免)导致相对于较低剂量T APC+CpG(仅初免)略微的肿瘤生长抑制。有趣的是，使用高剂量T APC+CpG(仅初免)导致免受肿瘤生长的最佳保护，其中肿瘤消退在第20-40天之间出现并且在观察的任何组中最高水平的生长抑制。总的来说，这些数据突出了增加细胞剂量、包含佐剂、或初免+加强给药时间表可以增强T APC疫苗的功效。
序列表
Figure BDA0002763166550000921
Figure BDA0002763166550000931
Figure BDA0002763166550000941
序列表
<110> SQZ生物技术公司
<120> 细胞内递送生物分子以修饰免疫应答
<130> 75032-20015.40
<160> 52
<170> FastSEQ Windows版4.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人乳头瘤病毒
<400> 1
Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人乳头瘤病毒
<400> 2
Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人乳头瘤病毒
<400> 3
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人乳头瘤病毒
<400> 4
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人乳头瘤病毒
<400> 6
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人乳头瘤病毒
<400> 7
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人乳头瘤病毒
<400> 9
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu
1 5 10
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人乳头瘤病毒
<400> 10
Gly Gln Ala Glu Pro Asp
1 5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe
1 5 10 15
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人乳头瘤病毒
<400> 12
Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人乳头瘤病毒
<400> 13
Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
1 5
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Ser Asp Lys
1 5 10 15
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人乳头瘤病毒
<400> 15
Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu
1 5 10 15
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人乳头瘤病毒
<400> 16
Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His
1 5 10 15
Val Asp Ile Arg
20
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Ser Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His
1 5 10 15
Val Asp Ile Arg
20
<210> 18
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile
1 5 10 15
Leu Glu Cys Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr
20 25 30
Asp Phe Ala Phe
35
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu
1 5 10 15
Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
20 25
<210> 20
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
1 5 10 15
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
20 25
<210> 21
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala
1 5 10 15
Phe Arg Asp Leu Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val
20 25 30
Ser Asp Lys
35
<210> 22
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu
35
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu
1 5 10 15
Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
20 25
<210> 24
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
1 5 10 15
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 25
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Ser
1 5 10 15
Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
ggggtcaacg ttgagggggg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
gggggacgat cgtcgggggg 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
ggggacgacg tcgtgggggg g 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
tccatgacgt tcctgatgct 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 26
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcgg 29
<210> 38
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu
35
<210> 39
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu
1 5 10 15
Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn
20 25 30
Ile Val Thr
35
<210> 40
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
1 5 10 15
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 41
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser
20 25 30
Gln Lys Pro
35
<210> 42
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
<210> 43
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile
1 5 10 15
Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr
20 25 30
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
1 5 10 15
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
20 25
<210> 45
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys
1 5 10 15
Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
20 25
<210> 46
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr
1 5 10 15
Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
20 25
<210> 47
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn
1 5 10 15
Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg
20 25
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu
1 5 10 15
Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys
20 25 30
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg
1 5 10 15
His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr
20 25 30
<210> 50
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg
1 5 10 15
Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
20 25 30
<210> 51
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17
<223> Xaa = 任何氨基酸
<400> 51
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
20
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5

Claims (149)

1.一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原对于所述经修饰的T细胞是外源的并且包含免疫原性表位，并且其中所述佐剂存在于细胞内。
2.一种经修饰的T细胞，其包含抗原，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
3.一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原包含免疫原性表位，所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：
a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；以及
b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞；
从而产生包含所述抗原和佐剂的所述经修饰的T细胞。
4.根据权利要求3所述的经修饰的T细胞，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间和/或与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
5.根据权利要求3或4所述的经修饰的T细胞，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的抗原与佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
6.一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原包含免疫原性表位，所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：
a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含所述佐剂，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使所述抗原通过以形成扰动的输入T细胞；以及
b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的所述经修饰的T细胞。
7.根据权利要求6所述的经修饰的T细胞，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
8.一种经修饰的T细胞，其包含抗原和佐剂，其中所述抗原包含免疫原性表位，所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：
a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含所述抗原，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使所述佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；以及
b)将所述扰动的输入T细胞与所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的所述经修饰的T细胞。
9.根据权利要求8所述的经修饰的T细胞，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
10.根据权利要求3-9中任一项所述的经修饰的T细胞，其中当所述输入T细胞通过所述缩窄部时向所述输入T细胞施加变形力，从而引起所述输入T细胞的扰动。
11.根据权利要求3-10中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述方法还包括以下步骤：将所述输入T细胞和/或所述经修饰的T细胞与一种药剂一起孵育，与在没有所述进一步孵育步骤的情况下制备的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。
12.根据权利要求11所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂是增强内吞作用或充当稳定剂或辅助因子的化合物。
13.根据权利要求3-12中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述缩窄部的直径小于所述输入T细胞的直径。
14.根据权利要求13所述的经修饰的T细胞，其中所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约99％。
15.根据权利要求14所述的经修饰的T细胞，其中所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约60％。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原和/或佐剂存在于所述经修饰的T细胞的细胞质液和/或囊泡中。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述囊泡是胞内体。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原和/或所述佐剂存在于所述经修饰的T细胞的多个隔室中。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原或免疫原性表位结合至所述经修饰的T细胞的表面。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述佐剂是CpG寡聚脱氧核苷酸(ODN)、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、咪喹莫特、瑞喹莫德、或脂多糖(LPS)。
21.根据权利要求20所述的经修饰的T细胞，其中所述佐剂是CpG ODN。
22.根据权利要求21所述的经修饰的T细胞，其中所述CpG ODN是A类CpG ODN、B类CpGODN、或C类CpG ODN。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述免疫原性表位源自疾病相关抗原。
24.根据权利要求23所述的经修饰的T细胞，其中所述免疫原性表位源自从患病细胞分离的肽或mRNA。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述免疫原性表位源自非自身抗原。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述免疫原性表位源自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、或真菌抗原。
27.根据权利要求26所述的经修饰的T细胞，其中所述免疫原性表位源自人乳头瘤病毒(HPV)抗原。
28.根据权利要求27所述的经修饰的T细胞，其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。
29.根据权利要求27或28所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。
30.根据权利要求29所述的经修饰的T细胞，其中所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:1-4中任何一个的氨基酸序列。
31.根据权利要求30所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
32.根据权利要求1-30中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞包含多种抗原，所述多种抗原包含多种免疫原性表位。
33.根据权利要求32所述的经修饰的T细胞，其中在向个体给予包含所述多种抗原的所述经修饰的T细胞之后，所述多种抗原包含所述多种免疫原性表位，所述多种免疫原性表位的任一个不降低所述个体对任何其他免疫原性表位的免疫应答。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原是多肽，并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。
35.根据权利要求30所述的经修饰的T细胞，其中所述免疫原性肽表位与N末端侧翼多肽和/或C末端侧翼多肽融合。
36.根据权利要求30所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原是包含免疫原性肽表位和一个或多个异源肽序列的多肽。
37.根据权利要求34所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原是包含免疫原性肽表位的多肽，所述免疫原性肽表位在N末端和/或C末端侧接异源肽序列。
38.根据权利要求35所述的经修饰的T细胞，其中所述侧翼异源肽序列源自疾病相关免疫原性肽。
39.根据权利要求35所述的经修饰的T细胞，其中所述N末端侧翼多肽包含SEQ ID NO:5-10中任何一个的氨基酸序列和/或所述C末端侧翼多肽包含SEQ ID NO:11-17中任何一个的氨基酸序列。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述抗原。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原与所述佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞包含复合物，所述复合物包含：a)所述抗原，b)所述抗原和至少一种其他抗原，和/或c)所述抗原和所述佐剂。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。
46.根据权利要求45所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。
47.根据权利要求45所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂是白蛋白。
48.根据权利要求47所述的经修饰的T细胞，其中所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。
49.根据权利要求45所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。
50.根据权利要求49所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂包含小鼠血清白蛋白(MSA)。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的经修饰的T细胞，其中将所述细胞进一步修饰以增加一种或多种共刺激分子的表达。
52.根据权利要求51所述的经修饰的T细胞，其中所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、或CD112。
53.根据权利要求51或52所述的经修饰的T细胞，其中所述细胞包含导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。
56.根据权利要求54所述的经修饰的T细胞，其中与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。
57.根据权利要求54或56所述的经修饰的T细胞，其中与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经修饰的T细胞在被给予所述经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期增加。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、或自然杀伤T细胞。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD45RA+T细胞、CD45RO+T细胞、或γδ-T细胞。
60.一种包含根据权利要求1-59中任一项所述的经修饰的T细胞的组合物。
61.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-59中任一项所述的经修饰的T细胞和药学上可接受的载体。
62.一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括向所述个体给予根据权利要求1-59中任一项所述的经修饰的T细胞、根据权利要求60所述的组合物、或根据权利要求61所述的药物组合物。
63.一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：
a)向所述个体给予包含抗原的经修饰的T细胞，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列；以及
b)向所述个体给予佐剂。
64.一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：
a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原和佐剂通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；
b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和佐剂的经修饰的T细胞；以及
c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。
65.根据权利要求64所述的方法，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间和/或与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
66.根据权利要求64或65所述的方法，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的抗原与佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
67.一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：
a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含佐剂，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；
b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的经修饰的T细胞；以及
c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。
68.根据权利要求67所述的方法，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
69.一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：
a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入T细胞包含抗原，其中所述抗原包含免疫原性表位，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使佐剂通过以形成扰动的输入T细胞；
b)将所述扰动的输入T细胞与所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的经修饰的T细胞；以及
c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。
70.根据权利要求69所述的方法，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
71.根据权利要求64-70中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述抗原。
72.根据权利要求64-71中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。
73.根据权利要求64-72中任一项所述的方法，其中经修饰的T细胞中的所述抗原与所述佐剂的比率在约10000:1与约1:10000之间。
74.根据权利要求64-73中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞包含复合物，所述复合物包含：a)所述抗原，b)所述抗原和至少一种其他抗原，和/或c)所述抗原和所述佐剂。
75.一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：
a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；
b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原的经修饰的T细胞；
c)向所述个体给予所述经修饰的T细胞；以及
d)向所述个体给予佐剂。
76.根据权利要求75所述的方法，其中与所述扰动的输入T细胞一起孵育的所述抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
77.根据权利要求64-76中任一项所述的方法，其中当所述输入T细胞通过所述缩窄部时向所述输入T细胞施加变形力，从而引起所述输入T细胞的扰动。
78.根据权利要求64-77中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：将所述输入T细胞和/或经修饰的T细胞与一种药剂一起孵育，与在没有所述进一步孵育步骤的情况下制备的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。
80.根据权利要求64-79中任一项所述的方法，其中所述免疫应答增强。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述增强的免疫应答是针对所述抗原的。
82.根据权利要求64-81中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径小于所述输入T细胞的直径。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约99％。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述输入T细胞的直径的约20％至约60％。
85.根据权利要求64-84中任一项所述的方法，其中所述抗原和/或佐剂存在于所述经修饰的T细胞的细胞质液和/或囊泡中。
86.根据权利要求64-85中任一项所述的方法，其中所述囊泡是胞内体。
87.根据权利要求64-86中任一项所述的方法，其中所述抗原和/或所述佐剂存在于所述经修饰的T细胞的多个隔室中。
88.根据权利要求64-87中任一项所述的方法，其中所述抗原或免疫原性表位结合至所述经修饰的T细胞的表面。
89.根据权利要求64-88中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、咪喹莫特、瑞喹莫德、和/或脂多糖(LPS)。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述CpG ODN是A类CpG ODN、B类CpG ODN、或C类CpG ODN。
92.根据权利要求64-91中任一项所述的方法，其中所述免疫原性表位源自疾病相关抗原。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述免疫原性表位源自从患病细胞分离的肽或mRNA。
94.根据权利要求64-93中任一项所述的方法，其中所述免疫原性表位源自非自身抗原。
95.根据权利要求64-94中任一项所述的方法，其中所述免疫原性表位源自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、或真菌抗原。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述免疫原性表位源自人乳头瘤病毒(HPV)抗原。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。
98.根据权利要求96或97所述的方法，其中所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:1-4中任何一个的氨基酸序列。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
101.根据权利要求64-100中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞包含多种抗原，所述多种抗原包含多种免疫原性表位。
102.根据权利要求64-101所述的方法，其中所述多种免疫原性表位的任一个不降低所述个体对任何其他免疫原性表位的免疫应答。
103.根据权利要求64-102中任一项所述的方法，其中所述抗原是多肽，并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述免疫原性肽表位与N末端侧翼多肽和/或C末端侧翼多肽融合。
105.根据权利要求104所述的经修饰的T细胞，其中所述免疫原性肽表位与所述N末端侧翼多肽融合和/或所述C末端侧翼多肽是非天然存在的序列。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述N末端和/或C末端侧翼多肽源自免疫原性合成长肽(SLP)。
107.根据权利要求105所述的方法，其中所述N末端和/或C末端侧翼多肽源自疾病相关免疫原性SLP。
108.根据权利要求105所述的方法，其中所述N末端侧翼多肽包含SEQ ID NO:5-10中任何一个的氨基酸序列和/或所述C末端侧翼多肽包含SEQ ID NO:11-17中任何一个的氨基酸序列。
109.根据权利要求64-108中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
110.根据权利要求64-109中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的T细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的T细胞的活力和/或功能。
111.根据权利要求110所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。
112.根据权利要求111所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂是白蛋白。
113.根据权利要求112所述的经修饰的T细胞，其中所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。
114.根据权利要求110所述的经修饰的T细胞，其中所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。
115.根据权利要求64-114中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。
116.根据权利要求64-115中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞包含进一步修饰以调节MHCII类表达。
117.根据权利要求115所述的方法，其中与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经修饰的T细胞而在所述个体中产生的先天性免疫应答降低。
118.根据权利要求115或117所述的方法，其中与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经修饰的T细胞在被给予所述经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期增加。
119.根据权利要求64-118中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、或自然杀伤T细胞。
120.根据权利要求64-119中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD45RA+T细胞、CD45RO+T细胞、或γδ-T细胞。
121.根据权利要求64-120中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞对所述个体而言是同种异体的。
122.根据权利要求64-121中任一项所述的方法，其中所述经修饰的T细胞对所述个体而言是自体的。
123.根据权利要求64-122中任一项所述的方法，其中将所述个体预调理以调节炎症和/或免疫应答。
124.根据权利要求64-123中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述个体给予第二佐剂。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述第二佐剂是IFN-α、LPS或CpG ODN。
126.根据权利要求124或125所述的方法，其中并行地或同时给予所述经修饰的T细胞和所述第二佐剂。
127.根据权利要求124或125所述的方法，其中依序给予所述经修饰的T细胞和所述第二佐剂。
128.根据权利要求124-127所述的方法，其中在给予所述第二佐剂之前给予所述经修饰的T细胞。
129.根据权利要求124-128所述的方法，其中在给予所述第二佐剂之后给予所述经修饰的T细胞。
130.根据权利要求64-129所述的方法，其中在给予免疫检查点抑制剂之前、并行地或之后给予所述经修饰的T细胞。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的任何一种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。
132.根据权利要求64-131所述的方法，其中在给予化学疗法之前、并行地或之后给予所述经修饰的T细胞。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述化学疗法包括顺铂。
134.根据权利要求64-133中任一项所述的方法，其中向所述个体给予所述经修饰的T细胞导致对所述抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。
135.根据权利要求64-134中任一项所述的方法，其中向所述个体给予所述经修饰的T细胞导致对所述抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。
136.根据权利要求64-135中任一项所述的方法，其中给予所述个体的所述经修饰的T细胞的量在约1x 106个与约1x 1012个细胞之间。
137.根据权利要求64-136中任一项所述的方法，其中所述方法包括多次给予所述经修饰的T细胞。
138.根据权利要求137所述的方法，其中在两次相继给予所述经修饰的T细胞之间的时间间隔在约1天与约30天之间。
139.一种用于调节个体的免疫应答的方法，其包括：向所述个体给予与抗原缔合的经修饰的T细胞，其中所述经修饰的T细胞通过包括以下步骤的方法制备：
a)将输入T细胞与抗原和/或佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原与所述输入T细胞的细胞表面缔合，其中所述抗原包含免疫原性表位，从而产生与所述抗原缔合的经修饰的T细胞；以及
b)向所述个体给予所述经修饰的T细胞。
140.根据权利要求139所述的方法，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
142.根据权利要求139-141中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN或LPS。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
144.一种包含根据权利要求1-59中任一项所述的经修饰的T细胞的组合物，其用于通过手术、疗法或诊断治疗人体或动物体的方法。
145.一种包含根据权利要求1-59中任一项所述的经修饰的T细胞的组合物，其用于调节个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予所述经修饰的T细胞。
146.一种包含所述经修饰的T细胞的组合物，其用于通过手术、疗法或诊断治疗人体或动物体的方法，其中所述经修饰的T细胞包含抗原，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
147.一种包含所述经修饰的T细胞的组合物，其用于调节个体的免疫应答的方法，其中所述经修饰的T细胞包含抗原，所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
148.一种包含所述经修饰的T细胞的组合物，其用于通过手术、疗法或诊断治疗人体或动物体的方法，其中所述经修饰的T细胞通过包括以下的方法制备：
a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原和佐剂通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；
b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和佐剂的经修饰的T细胞。
149.一种包含所述经修饰的T细胞的组合物，其用于调节个体的免疫应答的方法，其中所述经修饰的T细胞通过包括以下的方法制备：
a)使包含输入T细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入T细胞的直径的函数，从而引起所述输入T细胞的扰动足够大以使抗原和佐剂通过以形成扰动的输入T细胞，其中所述抗原包含免疫原性表位；
b)将所述扰动的输入T细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入T细胞，从而产生包含所述抗原和佐剂的经修饰的T细胞。
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