CN116218916A - 复合物的细胞内递送 - Google Patents

复合物的细胞内递送 Download PDF

Info

Publication number
CN116218916A
CN116218916A CN202211557721.3A CN202211557721A CN116218916A CN 116218916 A CN116218916 A CN 116218916A CN 202211557721 A CN202211557721 A CN 202211557721A CN 116218916 A CN116218916 A CN 116218916A
Authority
CN
China
Prior art keywords
complex
cell
molecules
constriction
cell suspension
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211557721.3A
Other languages
English (en)
Inventor
T·迪通马索
H·伯恩斯坦
A·R·沙瑞
J·B·吉尔伯特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SQZ Biotechnologies Co
Original Assignee
SQZ Biotechnologies Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SQZ Biotechnologies Co filed Critical SQZ Biotechnologies Co
Publication of CN116218916A publication Critical patent/CN116218916A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/71—Oxidoreductases (EC 1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了用于将瞬时和/或可逆的复合物递送到细胞中的方法，该方法包括使细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使该细胞变形，从而引起该细胞的扰动，这样使得该复合物进入该细胞。

Description

复合物的细胞内递送
本申请是申请日为2017年1月11日、申请号为201780015147.X、发明名称为“复合物的细胞内递送”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年1月12日提交的美国临时申请号62/277,858的优先权，将其通过引用以其全文特此结合。
技术领域
本公开文本总体上涉及通过使细胞悬浮液通过缩窄部以将复合物递送到细胞中的方法。
背景技术
细胞内递送是工程化有机体的研究和开发中的中心步骤。旨在对分子进行细胞内递送的现有技术依赖于电场、纳米粒子或成孔化学品。然而，这些方法遭遇许多并发症，包括非特异性分子递送、有效载荷分子的修饰或损坏、高细胞死亡、低通量和/或难以实施。由于它们的尺寸大，由诸如多肽、核酸、碳水化合物、脂质和/或小分子等生物分子构成的复合物不能容易地穿过细胞膜。因此，此类复合物的递送一直是一个挑战，并且对于在将复合物递送至多种细胞类型方面非常有效的细胞内递送技术存在未满足的需求。此外，允许快速、高通量细胞内递送复合物的技术可以更有效地应用于大规模临床、生产和药物筛选应用。描述使用通道将化合物递送至细胞的方法的参考文献包括WO 2013059343、WO2015023982、和PCT/US 2015/058489。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过引用以其全文并入。
发明内容
本发明提供了用于将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的方法，该方法包括使细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使细胞变形，从而引起细胞的扰动，这样使得分子的复合物进入细胞，其中所述细胞悬浮液与分子的复合物接触。在一些实施方案中，分子的复合物的形成是可逆的。在一些实施方案中，复合物的至少两种或更多种分子通过非共价相互作用缔合。在一些实施方案中，复合物中的至少两种分子在复合物中具有从约1μM至约1pM的结合亲和力。在一些实施方案中，复合物中的至少两种分子在复合物中具有从约1μM至约1nM或从约1nM至约1pM的结合亲和力。在一些实施方案中，复合物在细胞悬浮液中的半衰期为约1分钟至约48小时。在一些实施方案中，复合物在细胞悬浮液中的半衰期为约1分钟至约20分钟、约20分钟至约40分钟、约40分钟至约1小时、约1小时至约2小时、约2小时至约6小时、约6小时至约12小时、约12小时至约24小时、约24小时至约36小时、或约36小时至约48小时。
在一些实施方案中，复合物在洗涤剂的存在下解离。在一些实施方案中，复合物在洗涤剂的存在下以约0.1％(w/v)至约10％(w/v)的浓度解离。在一些实施方案中，复合物在洗涤剂的存在下以约0.1％(w/v)至约1％(w/v)、约1％(w/v)至约5％(w/v)、或约5％(w/v)至约10％(w/v)的浓度解离。
在一些实施方案中，在从约0℃至约40℃范围内的温度下使细胞悬浮液与分子的复合物接触。在一些实施方案中，分子的复合物在比细胞悬浮液与分子的复合物接触的温度高的温度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约50℃至约70℃的温度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约50℃至约60℃、或约60℃至约70℃的温度下解离。
在一些实施方案中，在从约50mM至约300mM范围内的离子强度下使细胞悬浮液与分子的复合物接触。在一些实施方案中，分子的复合物在比细胞悬浮液与分子的复合物接触的离子强度大的离子强度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约350mM至约1000mM的离子强度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约350mM至约400mM、约400mM至约500mM、约500mM至约600mM、约700mM至约800mM、约800mM至约900mM、或约900mM至约1000mM的离子强度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在比细胞悬浮液与分子的复合物接触的离子强度小的离子强度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约0mM至约50mM的离子强度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约0mM至约10mM、约10mM至约20mM、约20mM至约30mM、约30mM至约40mM、或约40mM至约50mM的离子强度下解离。
在一些实施方案中，在从约100mOsm/L至约500mOsm/L范围内的摩尔渗透压浓度下使细胞悬浮液与分子的复合物接触。在一些实施方案中，分子的复合物在比细胞悬浮液与分子的复合物接触的离子强度大的摩尔渗透压浓度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约600mOsm/L至约1000mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约600mOsm/L至约700mOsm/L、约700mOsm/L至约800mOsm/L、约800mOsm/L至约900mOsm/L、或约900mOsm/L至约1000mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在比细胞悬浮液与分子的复合物接触的摩尔渗透压浓度低的摩尔渗透压浓度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约0mOsm/L至约100mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约0mOsm/L至约20mOsm/L、约20mOsm/L至约20mOsm/L、约20mOsm/L至约40mOsm/L、约40mOsm/L至约60mOsm/L、约60mOsm/L至约80mOsm/L、或约80mOsm/L至约100mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。
在一些实施方案中，在从约5.5至约8.5范围内的pH下使细胞悬浮液与分子的复合物接触。在一些实施方案中，分子的复合物在比细胞悬浮液与分子的复合物接触的pH高或低的pH下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约4.0至约5.5的pH下或在约8.5至约10的pH下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约4.0至约4.5、约4.5至约5.0、约5.0至约5.5、约8.5至约9.0、约9.0至约9.5、或约9.5至约10.0的pH下解离。
在一些实施方案中，当细胞通过缩窄部时的剪切力范围为从约1kPa至约10kPa。在一些实施方案中，复合物在约10kPa至约100kPa的剪切力下解离。在一些实施方案中，复合物在约10kPa至约25kPa、约25kPa至约50kPa、约50kPa至约75kPa、或约75kPa至约100kPa的剪切力下解离。
在一些实施方案中，分子的复合物包含a)一种或多种多肽，b)一种或多种核酸，c)一种或多种脂质，d)一种或多种碳水化合物，e)一种或多种小分子，f)一种或多种含金属的化合物，g)一种或多种多肽和一种或多种核酸，h)一种或多种多肽和一种或多种脂质，i)一种或多种多肽和一种或多种碳水化合物，j)一种或多种多肽和一种或多种小分子，k)一种或多种多肽和一种或多种含金属的化合物，l)一种或多种核酸和一种或多种脂质，m)一种或多种核酸和一种或多种碳水化合物，n)一种或多种核酸和一种或多种小分子，o)一种或多种核酸和一种或多种含金属的化合物，p)一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，q)一种或多种脂质和一种或多种小分子，r)一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，s)一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，t)一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，u)一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，v)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种脂质，w)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种碳水化合物，x)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种小分子，y)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种含金属的化合物，z)一种或多种多肽、一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，aa)一种或多种多肽、一种或多种脂质和一种或多种小分子，ab)一种或多种多肽、一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，ac)一种或多种多肽、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，ad)一种或多种多肽、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，ae)一种或多种多肽、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，af)一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，ag)一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种小分子，ah)一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，ai)一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，aj)一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，ak)一种或多种核酸、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，al)一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，am)一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，an)一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，ao)一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，ap)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，aq)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种小分子，ar)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，as)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，at)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，au)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，av)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，aw)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，ax)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，ay)一种或多种多肽、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，az)一种或多种核酸酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，ba)一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，bb)一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bc)一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bd)一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，be)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，bf)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，bg)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bh)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bi)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bj)一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，或bk)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物。在一些实施方案中，复合物包含抗体。在一些实施方案中，复合物包含一种或多种转录因子。在一些实施方案中，复合物包含核糖体和mRNA。在一些实施方案中，复合物包含蛋白酶体、全酶、RNA聚合酶、DNA聚合酶、剪接体、穹窿体细胞质核糖核蛋白、小核核糖核蛋白(snRNP)、端粒酶、核小体、死亡信号传导复合物(DISC)、雷帕霉素复合物1的哺乳动物靶标(mTORC1)、雷帕霉素复合物2的哺乳动物靶标(mTORC2)、或I类磷酸肌醇3激酶(I类PI3K)、RNA诱导的沉默复合物(RISC)、组蛋白-DNA复合物、toll样受体(TLR)-激动剂复合物、转座酶/转座子复合物、tRNA核糖体复合物、多肽-蛋白酶复合物或酶-底物复合物。
在一些实施方案中，在细胞悬浮液通过缩窄部之后使该细胞悬浮液与复合物接触。在一些实施方案中，在细胞悬浮液通过缩窄部之前使该细胞悬浮液与复合物接触。在一些实施方案中，在细胞悬浮液通过缩窄部的同时使该细胞悬浮液与复合物接触。在一些实施方案中，复合物在与细胞悬浮液接触之前形成。在一些实施方案中，复合物在与细胞悬浮液接触之前约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时或约6小时形成。在一些实施方案中，在与细胞悬浮液接触之前将复合物进行纯化。在一些实施方案中，复合物在细胞悬浮液中形成。在一些实施方案中，在与细胞悬浮液接触之前将复合物的分子中的一种或多种进行纯化。
在一些实施方案中，细胞悬浮液包含混合的细胞群。在一些实施方案中，细胞悬浮液包含纯化的细胞群。在一些实施方案中，细胞悬浮液包含原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，细胞悬浮液包含细菌细胞、古细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞或动物细胞。在一些实施方案中，细胞悬浮液包含脊椎动物细胞。在一些实施方案中，细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞悬浮液包含人细胞。
在一些实施方案中，缩窄部被包含在微流体通道内。在一些实施方案中，缩窄部是孔或被包含在孔内。在一些实施方案中，孔被包含在表面中。在一些实施方案中，表面是过滤器。在一些实施方案中，表面是膜。在一些实施方案中，孔径为约0.4μm、约1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约8μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm或约14μm。在一些实施方案中，缩窄部尺寸是细胞直径的函数。在一些实施方案中，缩窄部尺寸为细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。在一些实施方案中，缩窄部具有约30μm的长度和约3μm至约8μm的宽度(如约4μm、5μm、6μm或7μm中的任一个)。在一些实施方案中，缩窄部具有约10μm的长度和约3μm至约8μm的宽度(如约4μm、5μm、6μm或7μm中的任一个)。在一些实施方案中，该方法进一步包括使细胞悬浮液和复合物与由至少一个电极产生的电场接触的步骤。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的系统，该系统包括包含缩窄部的微流体通道、包含细胞的细胞悬浮液、和两种或更多种分子的复合物；其中该缩窄部被配置成使得该细胞可通过该缩窄部，其中该缩窄部使该细胞变形从而引起该细胞的扰动，这样使得两种或更多种分子的该复合物进入该细胞。在其他实施方案中，本发明提供了一种用于将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的系统，该系统包括具有孔的表面、包含细胞的细胞悬浮液、和两种或更多种分子的复合物；其中具有孔的该表面被配置成使得该细胞可通过该孔，其中该孔使该细胞变形从而引起该细胞的扰动，这样使得两种或更多种分子的该复合物进入该细胞。在一些实施方案中，该表面是过滤器或膜。在一些实施方案中，该系统进一步包括至少一个电极以产生电场。在一些实施方案中，分子的复合物的形成是可逆的。在一些实施方案中，复合物的至少两种或更多种分子通过非共价相互作用缔合。在一些实施方案中，该系统用于通过本文所述的任何方法将包含两种或更多种分子的复合物递送到细胞中。
在一些实施方案中，本发明提供包括两种或更多种分子的复合物的细胞，其中通过本文所述的任何方法将该两种或更多种分子的复合物递送到细胞中。
附图说明
图1A显示代表性流式细胞术直方图，其展现经由通过具有7μM宽度缩窄部的微流体芯片将3kDa Cascade Blue葡聚糖和荧光标记的抗CAS9抗体递送至HEK293细胞。RNP+Ab：抗CAS9抗体/CAS9/gRNA复合物；RNP：CAS9/gRNA，抗体：抗CAS9抗体；内吞作用(无装置)：抗CAS9抗体/CAS9/gRNA复合物，无缩窄部。
图1B显示了来自图1A的对于3kDa Cascade Blue葡聚糖和荧光标记的抗CAS9抗体呈阳性的细胞的百分比定量。白色条：3kDa Cascade Blue葡聚糖；黑色条：荧光标记的抗CAS9抗体。
图2A显示代表性FACS等高线图，其展现在含有CAS9/gRNA RNP的功能性复合物的缩窄部介导的递送后第6天的B2M敲低。RNP+抗体：抗CAS9抗体/CAS9/gRNA复合物；RNP：CAS9/gRNA，抗体：抗CAS9抗体；内吞作用：抗CAS9抗体/CAS9/gRNA复合物，无缩窄部。
图2B显示了来自图2A的表现出B2M敲低的细胞的百分比定量。
图3A显示了代表性流式细胞术直方图，其展现经由通过具有7μM宽度缩窄部的微流体芯片将AlexaFluor 680标记的3kDa葡聚糖、太平洋蓝(Pacific Blue)标记的链霉亲和素、和FITC标记的生物素递送至HeLa细胞。S-B复合物(1:1)NC：生物素:链霉亲和素，摩尔比为1:1，在缩窄部介导的递送前不进行预孵育；S-B复合物(8:1)：生物素:链霉亲和素复合物，摩尔比为8:1；S-B复合物(4:1)：生物素:链霉亲和素复合物，摩尔比为4:1；S-B复合物(1:1)：生物素:链霉亲和素复合物，摩尔比为1:1；生物素(8当量)：单独的生物素，16μM；生物素(4当量)：单独的生物素，8μM；生物素(1当量)：单独的生物素，2μM；链霉亲和素：单独的链霉亲和素，2μM；内吞作用(无装置)：生物素:链霉亲和素复合物，摩尔比为1:1，无缩窄部。
图3B显示了来自图3A的针对3kDa AlexaFluor 680葡聚糖、Pacific Blue标记的链霉亲和素、或FITC标记的生物素呈阳性的细胞的百分比定量。
图3C显示了来自图3A的细胞的代表性FACS等高线图。
图4A显示了代表性流式细胞术直方图，其展现经由通过具有7μM宽度缩窄部的微流体芯片将3kDa AlexaFluor 680葡聚糖和Pacific Blue标记的链霉亲和素递送至HeLa细胞。SA+B-Phall：含有链霉亲和素和鬼笔环肽缀合的生物素的复合物；SA：单独的链霉亲和素；B-Phall：单独的鬼笔环肽-缀合的生物素；内吞作用(无装置)：含有链霉亲和素和鬼笔环肽缀合的生物素的复合物，无缩窄部。
图4B显示了来自图4A的针对3kDa AlexaFluor 680葡聚糖和Pacific Blue标记的链霉亲和素呈阳性的细胞的百分比定量。白色条：3kDa AlexaFluor 680葡聚糖；灰色条：Pacific Blue标记的链霉亲和素。
图5显示了来自图4A的细胞的代表性FACS图，其展现了在3kDa AlexaFluor 680葡聚糖递送和Pacific Blue标记的链霉亲和素递送之间的相关性。
图6A-6D显示了经由通过具有3μM宽度缩窄部的微流体芯片将3kDa-Cascade Blue葡聚糖与单独的HPV16 E7 SLP(未复合的E7 SLP)或含有HPV16 E7 SLP和小鼠血清白蛋白的复合物(复合的E7 SLP/MSA)的组合递送至从C57BL/6小鼠分离的T细胞的结果(图6A和6C)以及所得的细胞活力(图6B和6D)。SQZ：有缩窄部；Endo：无缩窄部。
图7显示了来自图6A和6C的细胞的代表性FACS直方图。
图8显示了在将来自图6A和6C的T细胞引回到小鼠中之后6天通过四聚体染色测量的内源性CD8 T细胞应答。NC：阴性对照T细胞，无抗原；Endo：单独的HPV16 E7 SLP，无缩窄部；Endo+MSA：含有HPV16 E7 SLP和MSA的复合物，无缩窄部；SQZ：单独的HPV16 E7 SLP，有缩窄部；SQZ+MSA：含有HPV16 E7 SLP和MSA的复合物，有缩窄部。
发明详述
本发明提供了用于将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的方法，该方法包括使细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使细胞变形，从而引起细胞的扰动，这样使得分子的复合物进入细胞，其中所述细胞悬浮液与分子的复合物接触。在一些实施方案中，复合物是瞬时的可逆的复合物。在一些实施方案中，复合物包含通过非共价相互作用保持在一起的组分化合物。在一些实施方案中，缩窄部被包含在微流体通道内。在一些实施方案中，缩窄部是孔或被包含在孔内。在一些实施方案中，孔被包含在表面中。在一些实施方案中，表面是过滤器。在一些实施方案中，表面是膜。
I.一般技术
本领域普通技术人员通常很好地理解和使用常规方法一般地采用本文所描述或引用的技术和方法，如，例如，在以下文献中所述的广泛使用的方法：Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Sambrook et al.,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.eds.,2003)；系列Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.,1995)；Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow and Lane,eds.,1988)；Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney,6th ed.,J.Wiley and Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,Academic Press,1998)；Introduction to Celland Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell andTissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,J.Wiley and Sons,1993-8)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weirand C.C.Blackwell,eds.,1996)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,J.Wileyand Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway et al.,2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,OxfordUniversity Press,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow andD.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti andJ.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)；以及Cancer:Principles andPractice of Oncology(V.T.DeVita et al.,eds.,J.B.Lippincott Company,2011)。
II.定义
出于解释本说明书的目的将应用以下定义，并且在适当时以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。如果下面列出的任何定义与通过引用并入本文的任何文件相冲突，则应以所列出的定义为准。
除非另有说明，否则如本文使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
应理解的是，本文描述的本公开文本的方面和实施方案包括“包含(comprising)”、“组成为(consisting)”方面和实施方案，以及“基本上由方面和实施方案组成(consisting essentially of)”。
对于本文所述的所有组合物和使用本文所述组合物的所有方法，组合物可包含所列的组分或步骤，或可“基本上由所列的组分或步骤组成”。当组合物被描述为“基本上由所列出的组分组成”时，该组合物含有所列出的组分，并且可含有实质上不影响所公开方法的其他组分，但不含有除了明确列出的那些组分之外的任何实质上影响所公开方法的其他组分；或者，如果该组合物确实含有除了所列出的实质上影响所公开方法的那些组分以外的额外组分，则该组合物不含有足够浓度或量的实质上影响所公开方法的额外组分。当方法被描述为“基本上由所列出的步骤组成”时，该方法含有所列出的步骤，并且可含有实质上不影响所公开方法的其他步骤，但该方法不含有除了明确列出的那些步骤之外的任何实质上影响所公开方法的其他步骤。作为非限制性具体示例，当组合物被描述为“基本上由一种组分组成”时，该组合物可另外含有任何量的药学上可接受的载体、媒介物或稀释剂和实质上不影响所公开方法的其他此类组分。
如本文使用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的一般误差范围。本文对“约”值或参数的引用包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
如本文使用的术语“复合物”是指两种或更多种分子、物质或化合物通过非共价键进行的化学缔合。两种或更多种分子例如但不限于通过弱静电键、疏水相互作用、范德华相互作用等连接。在一些实施例中，复合物可以由许多不同的化合物构成，这些化合物包括但不限于多肽、核酸、碳水化合物、脂质、小分子、和/或含金属的化合物。
术语“多肽复合物”和“蛋白质复合物”是指由多肽与结合配偶体特异性结合而产生的复合单位，其中所述结合配偶体可以是一种或多种多肽、一种或多种核酸、或者一种或多种多肽和一种或多种核酸的组合等，以形成所述多肽复合物。多肽复合物可以是多肽-多肽复合物、多肽-核酸复合物等。在某些实施方案中，多肽复合物可包含多肽-多肽相互作用，例如，在不同多肽之间、或者在相同多肽的二聚体、三聚体、四聚体或更高级寡聚体之间的相互作用。在多肽复合物的亚基之间(例如，在多肽-多肽复合物或包含多于一种多肽的多肽-核酸复合物中)的相互作用或在多肽与核酸之间(例如，在多肽-核酸复合物中)的相互作用通常是非结合相互作用，例如由氢桥、π电子系统(如(任选缀合的)C--C双键)或芳香环(例如苯基)和杂芳香环(例如，吡咯、咪唑、吲哚、嘧啶或嘌呤环)引起的那些相互作用，以及在金属原子与氧、氮或硫原子之间的相互作用，但是也可以是弱的、特别是可逆的共价结合的相互作用(例如硫-硫桥)。
“多肽-多肽”或“蛋白质-蛋白质复合物”是指复合单元，其是通过多肽之间的相互作用形成的两种或更多种多肽的组合。典型地但非必要地，“多肽复合物”是由两种或更多种多肽通过特异性非共价结合亲和力结合在一起而形成。
如本文使用的术语“缩窄部”是指狭窄的通道。在一些实施例中，缩窄部被包含在微流体通道内。在其他实施例中，缩窄部是孔或被包含在孔内。在缩窄部是孔的一些实施例中，孔被包含在表面中。
如本文使用的术语“孔”是指开口，包括但不限于，材料内的洞、撕裂、腔、孔口、断裂、间隙或穿孔。在一些实施例中，(在指示的情况下)该术语是指本公开文本的表面内的孔。在其他实施例中，(在指示的情况下)孔可以是指细胞壁和/或细胞膜中的孔。
如本文使用的术语“膜”是指含有孔的选择性屏障或薄片。该术语包括充当边界或衬里的柔韧的片状结构。在一些实施例中，该术语是指含有孔的表面或过滤器。该术语不同于术语“细胞膜”。
如本文使用的术语“过滤器”是指允许选择性通过孔的多孔物品。在一些实施例中，该术语是指含有孔的表面或膜。
如本文使用的术语“不均匀的”是指在结构或组成上是混合的或不均一的物质。在一些实施例中，该术语是指在给定表面内具有不同尺寸、形状或分布的孔。
如本文使用的术语“均匀的”是指在整个结构或组成上一致或均一的物质。在一些实施例中，该术语是指在给定表面内具有一致尺寸、形状或分布的孔。
如本文使用的术语“异源的”是指衍生自不同生物体的分子。在一些实施例中，该术语是指在给定生物体内通常不发现或不表达的核酸或多肽。
如本文使用的术语“同源的”是指衍生自相同生物体的分子。在一些实施例中，该术语是指在给定生物体内通常发现或表达的核酸或多肽。
如本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA，基因组DNA，cDNA，DNA-RNA杂合体，或包含以下项的聚合物：嘌呤和嘧啶碱基，或者其他天然的、化学的或生物化学修饰的非天然或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸的骨架可包含糖和磷酸基团(如通常可在RNA或DNA中发现的)、或经修饰或经取代的糖或磷酸基团。可替代地，多核苷酸的骨架可包含合成亚基(如氨基磷酸酯)的聚合物，并因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。此外，双链多核苷酸可以从化学合成的单链多核苷酸产物，通过合成互补链并在适当的条件下使这些链退火或者是通过使用DNA聚合酶用适当的引物从头合成互补链来获得。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。氨基酸残基的此类聚合物可含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。该定义涵盖了全长蛋白质及其片段两者。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指相对于天然序列包括修饰(如缺失、添加和取代)的蛋白质(通常在本质上是保守的)，只要该蛋白质保持所希望的活性。这些修饰可能是故意而为的，如通过定点诱变，或者可能是偶然发生的，如通过产生蛋白质的宿主的突变或通过由于PCR扩增而引起的错误。
对于本文所述的任何结构和功能特征，确定这些特征的方法在本领域中是已知的。
III.递送的复合物
在某些方面，本公开文本涉及用于将复合物递送到细胞中的方法。在一些实施方案中，复合物是单一复合物。在一些实施方案中，复合物是复合物的混合物。在一些实施方案中，将复合物或复合物的混合物递送至细胞以产生所希望的效果。
在一些实施方案中，复合物是瞬时的可逆的复合物。在一些实施方案中，复合物包含通过非共价相互作用保持在一起的组分化合物。在一些实施方案中，在复合物保持完整的条件下将复合物递送至细胞，这样使得复合物一旦进入细胞内部就发挥所希望的功能。在一些实施方案中，非共价相互作用允许复合物一旦递送至细胞就解离，从而允许单独的复合组分一旦进入细胞内部就执行所希望的功能。
可以使用一个或多个参数来通过如下概述的本发明的方法表征递送至细胞的两种或更多种分子的复合物。
在一些实施方案中，复合物中的至少两种分子在复合物中具有从约1μM至约1pM的结合亲和力。在一些实施方案中，复合物中的至少两种分子在复合物中具有在以下任一范围内的结合亲和力：约1μM至约10μM、约10μM至约100μM、约100μM至约1nM、约1nM至约10nM、约10nM至约100nM、或从约100nM至约1pM。
在一些实施方案中，本发明的复合物在生理条件下的半衰期为约1分钟至大于约48小时。在一些实施方案中，复合物在细胞悬浮液中的半衰期为约1分钟至大于约48小时。在一些实施方案中，复合物在细胞悬浮液中的半衰期大于以下中的任何一个：约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或60分钟。在一些实施方案中，复合物在细胞悬浮液中的半衰期大于以下中的任何一个：约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时或48小时。在一些实施方案中，复合物在细胞悬浮液中的半衰期为约1分钟至约20分钟、约20分钟至约40分钟、约40分钟至约1小时、约1小时至约2小时、约2小时至约6小时、约6小时至约12小时、约12小时至约24小时、约24小时至约36小时、或约36小时至约48小时。在一些实施方案中，复合物在细胞中的半衰期为约1分钟至大于约48小时。在一些实施方案中，复合物在细胞悬浮液中的半衰期大于以下中的任何一个：约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或60分钟。在一些实施方案中，复合物在细胞中的半衰期大于以下中的任何一个：约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时或48小时。在一些实施方案中，复合物在细胞中的半衰期为约1分钟至约20分钟、约20分钟至约40分钟、约40分钟至约1小时、约1小时至约2小时、约2小时至约6小时、约6小时至约12小时、约12小时至约24小时、约24小时至约36小时、或约36小时至约48小时。
在本发明的一些实施方案中，两种或更多种分子的复合物由复合物的分子的缔合表征或由导致复合物解离的参数表征。在一些实施方案中，解离的复合物是其中复合物中的两种或更多种分子的缔合被破坏的复合物。在一些实施方案中，解离的复合物是如下复合物，在该复合物中大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中任一者的复合物包含复合物中两种或更多种分子的缔合的破坏。
在一些实施方案中，复合物在洗涤剂、表面活性剂、有机溶剂、离液剂存在的情况下解离。洗涤剂和表面活性剂的例子包括但不限于聚山梨醇酯、十二烷基硫酸钠(SDS)、CHAPS、泊洛沙姆、Triton X-100、NP-40。有机溶剂的例子包括但不限于乙醇、丙醇、丁醇、乙酸、甲酸、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、二甲基甲酰胺、乙腈和二甲亚砜。离液剂的例子包括但不限于丁醇、乙醇、盐酸胍、过氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、丙醇、SDS、硫脲和脲。在一些实施方案中，本发明的复合物在洗涤剂的存在下以约0.1％至约10％的浓度解离。在一些实施方案中，本发明的复合物在洗涤剂的存在下以大于以下中任一者的浓度解离：约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％或10.0％。在一些实施方案中，复合物在洗涤剂的存在下以约0.1％至约0.2％、约0.2％至约0.3％、约0.3％至约0.4％、约0.4％至约0.5％、约0.5％至约0.6％、约0.6％至约0.7％、约0.7％至约0.8％、约0.8％至约0.9％、约0.9％至约1.0％、约1.0％至约2.0％、约2.0％至约3.0％、约3.0％至约4.0％、约4.0％至约5.0％、约5.0％至约6.0％、约6.0％至约7.0％、约07.0％至约8.0％、约8.0％至约9.0％、或约9.0％至约10.0％的浓度解离。在一些实施方案中，将洗涤剂或表面活性剂添加到细胞悬浮液中；例如，以防止微通道或孔堵塞。在一些实施方案中，将洗涤剂或表面活性剂以不会导致要递送至细胞的分子的复合物大量解离的浓度添加到细胞悬浮液中。在一些实施方案中，将洗涤剂或表面活性剂以导致递送至细胞的分子的复合物的小于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％解离的浓度添加到细胞悬浮液中。
在一些实施方案中，两种或更多种分子的复合物在升高的温度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在比细胞悬浮液与分子的复合物接触的温度高的温度下在细胞悬浮液中解离。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的温度低的温度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的温度低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的温度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在从约0℃至约40℃范围内的温度下使细胞悬浮液与分子的复合物接触。在一些实施方案中，分子的复合物在约50℃至约70℃的温度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约50℃至约60℃、或约60℃至约70℃的温度下解离。在一些实施方案中，在不会导致要递送至细胞的分子的复合物大量解离的温度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在导致要递送至细胞的分子的复合物少于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％解离的温度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。
在一些实施方案中，两种或更多种分子的复合物在升高的离子强度下在细胞悬浮液中解离。在一些实施方案中，分子的复合物在比细胞悬浮液与分子的复合物接触的离子强度大的离子强度下在细胞悬浮液中解离。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的离子强度小的离子强度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的离子强度小至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的离子强度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在从约50mM至约300mM范围内的离子强度下使细胞悬浮液与分子的复合物接触。在一些实施方案中，分子的复合物在约350mM至约1000mM的离子强度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约350mM至约400mM、约400mM至约500mM、约500mM至约600mM、约700mM至约800mM、约800mM至约900mM、或约900mM至约1000mM的离子强度下解离。在一些实施方案中，在不会导致要递送至细胞的分子的复合物大量解离的离子强度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在导致要递送至细胞的分子的复合物少于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％解离的离子强度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。
在一些实施方案中，两种或更多种分子的复合物在减小的离子强度下在细胞悬浮液中解离。在一些实施方案中，分子的复合物在比细胞悬浮液与分子的复合物接触的离子强度小的离子强度下在细胞悬浮液中解离。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的离子强度大的离子强度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的离子强度大至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的离子强度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在从约50mM至约300mM范围内的离子强度下使细胞悬浮液与分子的复合物接触。在一些实施方案中，分子的复合物在约0mM至约50mM的离子强度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约0mM至约10mM、约10mM至约20mM、约20mM至约30mM、约30mM至约40mM、或约40mM至约50mM的离子强度下解离。在一些实施方案中，在不会导致要递送至细胞的分子的复合物大量解离的离子强度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在导致要递送至细胞的分子的复合物少于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％解离的离子强度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。
在一些实施方案中，两种或更多种分子的复合物在升高的摩尔渗透压浓度下在细胞悬浮液中解离。在一些实施方案中，分子的复合物在比细胞悬浮液与分子的复合物接触的摩尔渗透压浓度高的摩尔渗透压浓度下在细胞悬浮液中解离。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的摩尔渗透压浓度低的摩尔渗透压浓度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的摩尔渗透压浓度低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的摩尔渗透压浓度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在从约100mOsm/L至约500mOsm/L范围内的摩尔渗透压浓度下使细胞悬浮液与分子的复合物接触。在一些实施方案中，分子的复合物在约600mOsm/L至约1000mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约600mOsm/L至约700mOsm/L、约700mOsm/L至约800mOsm/L、约800mOsm/L至约900mOsm/L、或约900mOsm/L至约1000mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。在一些实施方案中，在不会导致要递送至细胞的分子的复合物大量解离的摩尔渗透压浓度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在导致要递送至细胞的分子的复合物少于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％解离的摩尔渗透压浓度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。
在一些实施方案中，两种或更多种分子的复合物在降低的摩尔渗透压浓度下在细胞悬浮液中解离。在一些实施方案中，分子的复合物在比细胞悬浮液与分子的复合物接触的摩尔渗透压浓度低的摩尔渗透压浓度下在细胞悬浮液中解离。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的摩尔渗透压浓度高的摩尔渗透压浓度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的摩尔渗透压浓度高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的摩尔渗透压浓度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在从约100mOsm/L至约500mOsm/L范围内的摩尔渗透压浓度下使细胞悬浮液与分子的复合物接触。在一些实施方案中，分子的复合物在约0mOsm/L至约100mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约0mOsm/L至约20mOsm/L、约20mOsm/L至约40mOsm/L、约40mOsm/L至约60mOsm/L、约60mOsm/L至约80mOsm/L、或约80mOsm/L至约100mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。在一些实施方案中，在不会导致要递送至细胞的分子的复合物大量解离的摩尔渗透压浓度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在导致要递送至细胞的分子的复合物少于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％解离的摩尔渗透压浓度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。
在一些实施方案中，两种或更多种分子的复合物在升高的pH下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在比细胞悬浮液与分子的复合物接触的pH高的pH下在细胞悬浮液中解离。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的pH低的pH下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的pH低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的pH下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在从约5.5至约8.5范围内的pH下使细胞悬浮液与分子的复合物接触。在一些实施方案中，分子的复合物在约8.5至约10的pH下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约8.5至约9.0、约9.0至约9.5、约9.5至约10.0、约10.00至约11.0、或约11.0至约12.0的pH下解离。在一些实施方案中，在不会导致要递送至细胞的分子的复合物大量解离的pH下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在导致要递送至细胞的分子的复合物少于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％解离的pH下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。
在一些实施方案中，两种或更多种分子的复合物在降低的pH下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在比细胞悬浮液与分子的复合物接触的pH低的pH下在细胞悬浮液中解离。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的pH高的pH下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的pH高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的pH下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在从约5.5至约8.5范围内的pH下使细胞悬浮液与分子的复合物接触。在一些实施方案中，分子的复合物在约4.0至约5.5的pH下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在约2.0至约3.0、约3.5至约4.0、约4.0至约4.5、约4.5至约5.0、或约5.0至约5.5的pH下解离。在一些实施方案中，在不会导致要递送至细胞的分子的复合物大量解离的pH下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在导致要递送至细胞的分子的复合物少于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％解离的pH下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。
在一些实施方案中，本发明提供了将两种或更多种分子的复合物递送至细胞的方法，其中含有细胞的细胞悬浮液通过缩窄部，该缩窄部扰动细胞，从而允许复合物进入细胞。当细胞悬浮液通过缩窄部时，细胞悬浮液可能遭受剪切力。在一些实施方案中，两种或更多种分子的复合物在升高的剪切力下解离。在一些实施方案中，分子的复合物在比细胞悬浮液与分子的复合物接触的剪切力大的剪切力下在细胞悬浮液中解离。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的剪切力小的剪切力下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在比复合物在细胞悬浮液中解离的剪切力小至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的剪切力下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在从约1kPa至约10kPa范围内的剪切力下使细胞悬浮液与分子的复合物接触。在一些实施方案中，复合物在约10kPa至约100kPa的剪切力下解离。在一些实施方案中，复合物在约10kPa至约25kPa、约25kPa至约50kPa、约50kPa至约75kPa、或约75kPa至约100kPa的剪切力下解离。在一些实施方案中，在不会导致要递送至细胞的分子的复合物大量解离的剪切力下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在导致要递送至细胞的分子的复合物少于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％解离的剪切力下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在细胞悬浮液通过缩窄部后细胞悬浮液与包含两种或更多种分子的复合物接触，以减少剪切力对复合物的影响。
确定两种或更多种分子的复合物是否完整的方法是本领域已知的，包括但不限于高效液相色谱法(特别是尺寸排阻色谱法)、非变性凝胶电泳、免疫测定、质谱、功能测定、确定具有两个荧光团的复合物是否紧密接近的基于共振能量转移的测定(例如，FRET或BRET)、组织化学和免疫组织化学。
在本发明的一些实施方案中，在细胞悬浮液通过缩窄部之后该细胞悬浮液与复合物接触。在一些实施方案中，在细胞悬浮液通过缩窄部之前使该细胞悬浮液与复合物接触。在一些实施方案中，在细胞悬浮液通过缩窄部的同时使该细胞悬浮液与复合物接触。在一些实施方案中，复合物在与细胞悬浮液接触之前形成。在一些实施方案中，复合物在与细胞悬浮液接触之前约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时或约6小时形成。在一些实施方案中，复合物在与细胞悬浮液接触之前大于约6小时形成。在一些实施方案中，其中复合物在进入细胞中之前在细胞悬浮液中形成。
本发明提供了将两种或更多种分子的复合物递送至细胞的方法，其中含有细胞的细胞悬浮液通过缩窄部，该缩窄部扰动细胞，从而允许复合物进入细胞。在一些实施方案中，分子的复合物包含a)一种或多种多肽，b)一种或多种核酸，c)一种或多种脂质，d)一种或多种碳水化合物，e)一种或多种小分子，f)一种或多种含金属的化合物，g)一种或多种多肽和一种或多种核酸，h)一种或多种多肽和一种或多种脂质，i)一种或多种多肽和一种或多种碳水化合物，j)一种或多种多肽和一种或多种小分子，k)一种或多种多肽和一种或多种含金属的化合物，l)一种或多种核酸和一种或多种脂质，m)一种或多种核酸和一种或多种碳水化合物，n)一种或多种核酸和一种或多种小分子，o)一种或多种核酸和一种或多种含金属的化合物，p)一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，q)一种或多种脂质和一种或多种小分子，r)一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，s)一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，t)一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，u)一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，v)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种脂质，w)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种碳水化合物，x)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种小分子，y)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种含金属的化合物，z)一种或多种多肽、一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，aa)一种或多种多肽、一种或多种脂质和一种或多种小分子，ab)一种或多种多肽、一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，ac)一种或多种多肽、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，ad)一种或多种多肽、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，ae)一种或多种多肽、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，af)一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，ag)一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种小分子，ah)一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，ai)一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，aj)一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，ak)一种或多种核酸、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，al)一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，am)一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，an)一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，ao)一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，ap)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，aq)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种小分子，ar)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，as)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，at)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，au)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，av)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，aw)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，ax)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，ay)一种或多种多肽、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，az)一种或多种核酸酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，ba)一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，bb)一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bc)一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bd)一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，be)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，bf)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，bg)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bh)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bi)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bj)一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，或bk)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物。
在一些实施方案中，复合物是多肽-核酸复合物。在一些实施方案中，多肽-核酸复合物包括经由静电吸引与多肽复合的核酸分子；包裹在多肽周围的核酸分子；DNA和组蛋白(核小体)；核糖核蛋白(RNP)；核糖体；酶端粒酶；穹窿体核糖核蛋白；核糖核酸酶P(RNaseP)；异质核糖核蛋白颗粒(hnRNP)；小核RNP(snRNP)；或包含蛋白质的染色体。
本发明主题可用于向细胞递送各种各样的多肽复合物，包括蛋白酶体、全酶、RNA聚合酶、DNA聚合酶、剪接体、穹窿体细胞质核糖核蛋白、小核核糖核蛋白(snRNP)、端粒酶、核小体、死亡信号传导复合物(DISC)、雷帕霉素复合物1的哺乳动物靶标(mTORC1)、雷帕霉素复合物2的哺乳动物靶标(mTORC2)、或I类磷酸肌醇3激酶(I类PI3K)、组蛋白-DNA复合物、toll样受体(TLR)-激动剂复合物、转座酶/转座子复合物、tRNA核糖体复合物、多肽-蛋白酶复合物或酶-底物复合物。
在一些实施方案中，核糖核蛋白复合物是RNA诱导的沉默复合物(RISC)。RISC是一种具有催化活性的蛋白质-RNA复合物，是RNA干扰(RNAi)的重要介质。RISC掺入了双链RNA(dsRNA)片段的一条链，如小干扰RNA(siRNA)或microRNA(miRNA)。该链充当RISC识别互补信使RNA(mRNA)转录物的模板。RISC的蛋白质组分Argonaute随后激活并切割mRNA。
在一些实施方案中，核糖核蛋白复合物是核糖体。核糖体由小的和大的核糖体亚基组成，其中每个亚基由一个或多个核糖体RNA(rRNA)分子和多种蛋白质构成。总之，核糖体复合物介导mRNA翻译成多肽。在一些实施方案中，本发明提供了改进mRNA翻译的方法，该方法包括使细胞悬浮液通过缩窄部，从而允许摄取包含mRNA和核糖体的复合物，其中在使细胞悬浮液通过缩窄部之前、期间或之后该细胞悬浮液与mRNA-核糖体复合物接触。在一些方面，与向细胞递送单独的mRNA相比，用mRNA-核糖体复合物的翻译得到改进(例如，更快速地翻译或以更大的程度翻译)。
在一些实施方案中，该复合物是与靶DNA结合的转座酶。在一些实施方案中，递送转座酶-靶DNA复合物以介导靶DNA到细胞中的核酸整合。
在一些实施方案中，该复合物是转录因子复合物。在一些实施方案中，转录因子复合物由与调节基因转录所必需的起始前复合物(蛋白质和RNA聚合酶的大复合物)结合的转录因子组成。
用于在复合物中使用的示例性蛋白质或多肽包括但不限于治疗性蛋白质、抗体、生长因子或诱导物、融合蛋白、抗原、合成蛋白、报告标记或选择标记。
在一些实施方案中，多肽-核酸复合物不是规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-Cas9的复合物(例如，不是Cas9蛋白和指导RNA的复合物)。在一些实施方案中，两种或更多种分子的复合物不是选自锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶或CRE重组酶的用于基因编辑的复合物。
在一些实施方案中，用于在复合物中使用的多肽是报告标记或选择标记。示例性报告标记包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、发光蛋白质(auquorin)、β-半乳糖苷酶、尿卟啉原(urogen)III甲基转移酶(UMT)和荧光素酶。示例性选择标记包括但不限于杀稻瘟菌素、G418/遗传霉素、潮霉素B、嘌呤霉素、博莱霉素(Zeocin)、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶和胸苷激酶。
在一些实施方案中，用于在复合物中使用的多肽是高亲和力结合对的成员，如链霉亲和素或它的对生物素具有高亲和力的变体。包含多肽成员的高亲和力结合对是本领域熟知的，并且考虑将任何这种多肽用于在本文所述的组合物和方法中使用。
在一些实施方案中，用于在复合物中使用的多肽是抗原，例如疾病相关的抗原，如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。在一些实施方案中，抗原包含完整的全长(或未加工的)蛋白质抗原，例如超过7个、8个、9个或10个氨基酸长度的蛋白质或肽。在一些实施方案中，抗原是蛋白质片段，如MHC限制性蛋白质片段，例如，能够与MHC分子缔合以形成肽/MHC复合物的肽。示例性抗原包括例如HPV16 E7合成长肽(SLP)。
在一些实施方案中，复合物包含与载体蛋白缔合的抗原。合适的载体蛋白的例子包括通常在血液或血浆中发现的蛋白质，其包括但不限于白蛋白、免疫球蛋白(包括IgA)、脂蛋白、载脂蛋白B、α-酸性糖蛋白、β-2-巨球蛋白、甲状腺球蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X等。在一些实施方案中，载体蛋白是非血液蛋白，如酪蛋白、α-乳白蛋白或β-乳球蛋白。载体蛋白可以是天然来源的或合成制备的。在一些实施方案中，载体包含白蛋白，如人血清白蛋白(HSA)或小鼠血清白蛋白(MSA)。考虑了其他白蛋白，如牛血清白蛋白。例如，在非人类哺乳动物(如兽医动物(包括家养宠物和农业动物))中使用的背景中，此类非人白蛋白的使用可能是适当的。
在一些实施方案中，复合物包含与佐剂缔合的抗原。佐剂是本领域熟知的，并且考虑将可与抗原缔合以形成复合物的任何佐剂用于在本文所述的组合物和方法中使用。
在一些实施方案中，复合物包含与纳米粒子缔合的抗原。纳米粒子在本领域中是熟知的，并且考虑将可与抗原缔合以形成复合物的任何纳米粒子用于在本文所述的组合物和方法中使用(参见，例如，Taki,A.,和Smooker,P.(2015).Vaccines[疫苗],3(3),638-661)。示例性纳米粒子包括但不限于无机纳米粒子、脂质体纳米粒子、病毒样纳米粒子和聚合物纳米粒子。无机纳米粒子包括但不限于包含铁或二氧化硅的纳米粒子。脂质体纳米粒子包括但不限于常规脂质体、空间稳定化脂质体、配体靶向脂质体及其组合(参见，例如，Sercombe,L.,等人(2015).Frontiers in pharmacology[药理学前沿],6)。对于病毒样纳米粒子的例子，参见，例如，Plummer,E.M.,&Manchester,M.(2011).WileyInterdisciplinary Reviews:Nanomedicine and Nanobiotechnology,3(2),174-196。聚合物纳米粒子包括但不限于包含壳聚糖、PLGA或PEI的纳米粒子(参见，例如，Bolhassani,A.,et al.(2014)Human Vaccines&Immunotherapeutics,10:2,321-332)。
在一些实施方案中，用于在复合物中使用的多肽是毒素，包括例如双环七肽鬼笔环肽。
在一些实施方案中，用于在复合物中使用的多肽是抗体。在一些实施方案中，抗体是全长抗体或抗体片段。用于在本公开文本中使用的抗体包括但不限于抗体变体、标记抗体、抗体片段(如Fab或F(ab)2片段)、单域抗体、单链抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白和免疫粘附素。抗体可以是本领域已知的任何同种型，包括IgA、IgG、IgE、IgD或IgM。
用于在复合物中使用的示例性核酸包括但不限于重组核酸、DNA、重组DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、siRNA、mRNA、saRNA、miRNA、lncRNA、tRNA和shRNA。在一些实施方案中，该核酸与细胞中的核酸是同源的。在一些实施方案中，该核酸与细胞中的核酸是异源的。在一些实施方案中，该核酸是治疗性核酸。在一些实施方案中，该核酸编码治疗性多肽。在一些实施方案中，该核酸编码报告标记或选择标记。示例性报告标记包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、发光蛋白质(auquorin)、β-半乳糖苷酶、尿卟啉原(urogen)III甲基转移酶(UMT)和荧光素酶。示例性选择标记包括但不限于杀稻瘟菌素、G418/遗传霉素、潮霉素B、嘌呤霉素、博莱霉素(Zeocin)、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶和胸苷激酶。在一些实施方案中，该核酸编码生长因子或诱导物。
用于在复合物上使用的示例性小分子包括但不限于生物素、荧光标记、染料、药物试剂、代谢物或放射性核苷酸。在一些实施方案中，药物试剂是治疗药物和/或细胞毒性剂。
用于在复合物中使用的示例性含金属的化合物包括银、金、铂、铜、铁、氧化铁和锰。在一些实施方案中，金属化合物是纳米粒子。在一些实施方案中，该纳米粒子是有磁性的。
在本文所述的装置和方法的一些实施方案中，通过缩窄部通道的干细胞或祖细胞如诱导多能干细胞(iPSC)不会诱导分化，但确实可靠地诱导将复合物摄取到细胞中。例如，将分化因子复合物引入此类细胞中。在摄取分化因子复合物后，细胞继续行进在由引入的因子指令的分化途径上，而没有与将一种或多种因子引入细胞中的方法相关的并发症。
在一些实施方案中，将递送的复合物纯化。在一些实施方案中，复合物是按重量(干重)计至少约20％的感兴趣复合物。在一些实施方案中，纯化的复合物是至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的感兴趣复合物。在一些实施方案中，纯化的复合物是至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)的感兴趣复合物。纯度通过任何已知的方法确定，包括但不限于柱色谱法、薄层色谱法、HPLC分析、NMR、质谱或SDS-PAGE。将纯化的DNA或RNA定义为不含外源核酸、碳水化合物和脂质的DNA或RNA。
IV.细胞悬浮液
在一些方面，本发明提供了通过如下方式将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的方法：使细胞悬浮液通过缩窄部，并且在细胞悬浮液通过缩窄部之前、期间或之后使该细胞悬浮液与该复合物接触。在一些实施方案中，细胞悬浮液包含动物细胞。在一些实施方案中，细胞悬浮液包含青蛙、鸡、昆虫或线虫细胞。在一些实施方案中，细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊或兔细胞。在一些实施方案中，细胞是人类细胞。
在一些实施方案中，细胞悬浮液包含含有细胞壁的细胞。在一些实施方案中，细胞是植物、酵母、真菌、藻类或细菌细胞。在一些实施方案中，细胞是植物细胞。在一些实施方案中，植物细胞是作物、模型、观赏植物、蔬菜、豆科、针叶树或草本植物细胞。在一些实施方案中，细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，酵母细胞是假丝酵母属(Candida)或酵母属(Saccharomyces)细胞。在一些实施方案中，细胞是真菌细胞。在一些实施方案中，真菌细胞是曲霉属(Aspergillus)或青霉属(Penicillium)细胞。在一些实施方案中，细胞是藻类细胞。在一些实施方案中，藻类细胞是衣藻属(Chlamydomonas)、杜氏藻属(Dunaliella)或小球藻属(Chlorella)细胞。在一些实施方案中，细胞悬浮液包含细菌细胞。在一些实施方案中，细菌细胞是革兰氏阳性细菌细胞。革兰氏阳性细菌具有包含厚肽聚糖层的细胞壁。在一些实施方案中，细菌细胞是革兰氏阴性细菌细胞。革兰氏阴性细菌具有细胞壁，其包含在内部细胞质细胞膜与外膜之间的薄肽聚糖层。在一些实施方案中，细菌细胞是链球菌属(Streptococcus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)或沙门氏菌属(Salmonella)细胞。
细胞悬浮液可以是混合的或纯化的细胞群。在一些实施方案中，细胞悬浮液是混合的细胞群，如全血、淋巴和/或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，细胞悬浮液是纯化的细胞群。在一些实施方案中，细胞是原代细胞或细胞系细胞。在一些实施方案中，细胞是血细胞。在一些实施方案中，血细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞(DC)、NKT细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞或DC2.4树突细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是原代人T细胞。在一些实施方案中，血细胞是红血细胞。在一些实施方案中，细胞是癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞是癌细胞系细胞，如HeLa细胞。在一些实施方案中，癌细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，癌细胞是循环肿瘤细胞(CTC)。在一些实施方案中，细胞是干细胞。示例性干细胞包括但不限于诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、肝干细胞、心脏干细胞、神经干细胞和造血干细胞。在一些实施方案中，细胞是成纤维细胞，如原代成纤维细胞或新生儿人包皮成纤维细胞(Nuff细胞)。在一些实施方案中，细胞是永生化细胞系细胞，如HEK293细胞或CHO细胞。在一些实施方案中，细胞是皮肤细胞。在一些实施方案中，细胞是生殖细胞，如卵母细胞、卵子或受精卵。在一些实施方案中，细胞是神经元。在一些实施方案中，细胞是细胞簇，如胚，只要细胞簇在通过孔时不被破坏。
细胞悬浮液的组成(例如摩尔渗透压浓度、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)可影响复合物的递送。在一些实施方案中，悬浮液包含全血。可替代地，细胞悬浮液是生理盐水溶液中或除血液之外的生理介质中的细胞混合物。在一些实施方案中，细胞悬浮液包含水性溶液。在一些实施方案中，水性溶液包含细胞培养基、PBS、盐、糖、生长因子、动物衍生制品、填充材料、表面活性剂、润滑剂、维生素、多肽和/或影响肌动蛋白聚合的试剂。在一些实施方案中，细胞培养基是DMEM、OptiMEM、IMDM或RPMI。另外，溶液缓冲液可包括一种或多种润滑剂(普朗尼克(pluronic)或其他表面活性剂)，其可设计用于减少或消除表面堵塞并改善细胞活力。示例性表面活性剂包括但不限于泊洛沙姆、聚山梨醇酯、糖(如甘露醇)、动物来源的血清、和白蛋白蛋白。
在一些具有某些类型的细胞的配置中，可将细胞在一种或多种有助于将复合物递送至细胞内部的溶液中孵育。在一些实施方案中，水性溶液包含影响肌动蛋白聚合的试剂。在一些实施方案中，影响肌动蛋白聚合的试剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。例如，在递送之前，可将细胞在解聚溶液如拉春库林A(0.1μg/ml)中孵育1小时以使肌动蛋白细胞骨架解聚。作为另外的例子，在递送之前，可将细胞在10μM秋水仙碱(西格玛公司(Sigma))中孵育2小时以使微管网络解聚。
细胞悬浮液的粘度也可影响本文所公开的方法。在一些实施方案中，细胞悬浮液的粘度范围为约8.9×10-4Pa.s至约4.0×10-3Pa.s或在其间的任何值或值的范围。在一些实施方案中，粘度范围在以下中的任一者之间：约8.9×10-4Pa.s至约4.0×10-3Pa.s、约8.9×10-4Pa.s至约3.0×10-3Pa.s、约8.9×10-4Pa.s至约2.0×10-3Pa.s、或约8.9×10-3Pa.s至约1.0×10-3Pa.s。在一些实施方案中，粘度范围在以下中的任一者之间：约0.89cP至约4.0cP、约0.89cP至约3.0cP、约0.89cP至约2.0cP、或约0.89cP至约1.0cP。在一些实施方案中，观察到剪切稀化效应，其中细胞悬浮液的粘度在剪切应变条件下降低。粘度可通过本领域已知的任何方法测量，包括但不限于粘度计(如玻璃毛细管粘度计)、或流变仪。粘度计在一种流动条件下测量粘度，而流变仪用于测量随流动条件变化的粘度。在一些实施方案中，测量剪切稀化溶液如血液的粘度。在一些实施方案中，在约0℃与约45℃之间测量粘度。例如，在室温(例如，约20℃)、生理温度(例如，约37℃)、高于生理温度(例如，大于约37℃至45℃或更高)、降低的温度(例如，约0℃至约4℃)、或在这些示例性温度之间的温度下测量粘度。
V.提供使细胞变形的缩窄部的微流体通道
在一些方面，本发明提供了通过如下方式将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的方法：使细胞悬浮液通过缩窄部，并且在细胞悬浮液通过缩窄部之前、期间或之后使该细胞悬浮液与该复合物接触。在一些实施方案中，缩窄部被包含在微流体通道内。在一些实施方案中，可以在微流体通道内平行和/或串联放置多个缩窄部。用于在本文所公开的方法中使用的含有使细胞变形的缩窄部的示例性微流体通道描述于WO 2013059343中。
在一些实施方案中，微流体通道包括内腔并且被配置成使得悬浮在缓冲液中的细胞可以通过，其中该微流体通道包括缩窄部。微流体通道可由多种材料中的任一种制成，这些材料包括硅、金属(例如，不锈钢)、塑料(例如，聚苯乙烯)、陶瓷、玻璃、结晶基底、无定形基底、或聚合物(例如，聚-甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PDMS、环烯烃共聚物(COC)等)。微流体通道的制造可通过本领域已知的任何方法进行，包括干法蚀刻、湿法蚀刻、光刻、注射模制、激光烧蚀或SU-8掩模。
在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部包括入口部、中心点和出口部。在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部的长度、深度和宽度可以变化。在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部的直径是包含细胞壁的细胞直径的函数。在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部的直径为细胞直径的约20％至约99％。在一些实施方案中，缩窄部尺寸为细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。通道的横截面、入口部分、中心点和出口部分也可以变化。例如，横截面的形状可以是环形、椭圆形、细长狭缝、正方形、六边形或三角形。入口部分限定了缩窄部角度，其中该缩窄部角度被优化以减少通道的堵塞。出口部分的角度也可以变化。例如，出口部分的角度被配置成减小可导致非层流的湍流的可能性。在一些实施方案中，入口部分和/或出口部分的壁是线性的。在其他实施方案中，入口部分和/或出口部分的壁是弯曲的。
VI.提供使细胞变形的缩窄部的具有孔的表面
在一些方面，本发明提供了通过如下方式将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的方法：使细胞悬浮液通过缩窄部，并且在细胞悬浮液通过缩窄部之前、期间或之后使该细胞悬浮液与该复合物接触。在一些实施方案中，孔被包含在表面中。用于在本文所公开的方法中使用的具有孔的示例性表面描述于2015年9月4日提交的美国临时申请62/214,820中。
如本文所公开的表面可由许多材料中的任一种制成，并采取许多形式中的任一种。在一些实施方案中，表面是过滤器。在一些实施方案中，表面是膜。在一些实施方案中，过滤器是切向流动过滤器。在一些实施方案中，表面是海绵或海绵状基质。在一些实施方案中，表面是基质。
在一些实施方案中，表面是曲折的路径表面。在一些实施方案中，曲折的路径表面包含醋酸纤维素。在一些实施方案中，表面包含如下材料，该材料选自但不限于合成或天然的聚合物、聚碳酸酯、硅、玻璃、金属、合金、硝酸纤维素、银、醋酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚丙烯腈(PAN)、聚丙烯、PVDF、聚四氟乙烯、混合的纤维素酯、瓷和陶瓷。
本文所公开的表面可具有本领域已知的任何形状；例如三维形状。表面的二维形状可以是但不限于环形、椭圆形、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形或八边形。在一些实施方案中，表面的形状是圆形的。在一些实施方案中，表面的三维形状是圆柱形、圆锥形或立方形。
表面可具有各种横截面宽度和厚度。在一些实施方案中，表面横截面宽度在约1mm与约1m之间或在其间的任何横截面宽度或横截面宽度范围。在一些实施方案中，表面具有限定的厚度。在一些实施方案中，表面厚度是均一的。在一些实施方案中，表面厚度是可变的。例如，在一些实施方案中，表面的一些部分比表面的其他部分更厚或更薄。在一些实施方案中，表面厚度变化约1％至约90％或在其间的任何百分比或百分比范围。在一些实施方案中，表面的厚度在约0.01μm至约5mm之间或在其间的任何厚度或厚度范围。
在一些实施方案中，缩窄部是孔或被包含在孔内。孔的横截面宽度与待处理的细胞的类型有关。在一些实施方案中，孔径是待处理的细胞簇的细胞直径的函数。在一些实施方案中，孔径使得细胞在通过孔时被扰动。在一些实施方案中，孔径小于细胞的直径。在一些实施方案中，孔径为细胞直径的约20％至约99％。在一些实施方案中，孔径为细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。最佳孔径可根据应用和/或细胞类型而变化。在一些实施方案中，孔径为约0.4μm、约1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约8μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm或约14μm。
孔通道的入口和出口可具有各种角度。可选择孔角度以最小化在细胞通过时孔的堵塞。在一些实施方案中，通过表面的流速在约0.001mL/cm2/sec至约100L/cm2/sec之间或在其间的任何速度或速度范围。例如，入口或出口部分的角度可以在约0度与约90度之间。在一些实施方案中，孔具有相同的入口角度和出口角度。在一些实施方案中，孔具有不同的入口角度和出口角度。在一些实施方案中，孔边缘是光滑的，例如，圆形的或弯曲的。光滑的孔边缘具有连续、平坦且均匀的表面，没有凸起、脊或不均匀的部分。在一些实施方案中，孔边缘是尖锐的。尖锐的孔边缘具有锐利的或锐角的薄边缘。在一些实施方案中，孔通道是直的。直的孔通道不含有曲线、弯曲、角度或其他不规则性。在一些实施方案中，孔通道是弯曲的。弯曲的孔通道是弯曲的或偏离直线。在一些实施方案中，孔通道具有多条曲线，例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多条曲线。
孔可具有本领域已知的任何形状，包括二维或三维形状。孔的形状(例如，横截面形状)可以是但不限于环形、椭圆形、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。在一些实施方案中，孔的横截面的形状为圆形。在一些实施方案中，孔的三维形状是圆柱形或圆锥形。在一些实施方案中，孔具有带凹槽的入口和出口形状。在一些实施方案中，孔形状在给定表面内的孔之间是均匀的(即一致的或规则的)。在一些实施方案中，孔形状在给定表面内的孔之间是不均匀的(即混合的或变化的)。
本文所述的表面可具有一系列的总孔数。在一些实施方案中，孔涵盖总表面积的约10％至约80％。在一些实施方案中，表面含有约1.0×105至约1.0×1030个总孔或在其间的任何数量或数量范围。在一些实施方案中，表面包含每mm2表面积的在约10与约1.0×1015个之间的孔。
孔可在给定表面内以多种方式分布。在一些实施方案中，孔在给定表面内平行分布。在一个这样的实施例中，孔在相同方向上并排分布并且在给定表面内以相同的距离分开。在一些实施方案中，孔分布是有序的或均匀的。在一个这样的实施例中，孔以规则的系统的图案分布或在给定表面内以相同的距离分开。在一些实施方案中，孔分布是随机的或不均匀的。在一个这样的实施例中，孔以不规则的、无序的图案分布或在给定表面内以不同的距离分开。在一些实施方案中，多个表面串联分布。多个表面的表面尺寸、形状和/或粗糙度可以是均匀的或不均匀的。多个表面可以进一步包含具有均匀或不均匀的孔径、形状和/或数量的孔，从而能够将一系列复合物同时递送至不同的细胞类型中。
在一些实施方案中，单独的孔具有均一的宽度尺寸(即沿着孔通道的长度具有恒定的宽度)。在一些实施方案中，单独的孔具有可变的宽度(即沿着孔通道的长度渐增或渐减的宽度)。在一些实施方案中，在给定表面内的孔具有相同的单独的孔深度。在一些实施方案中，在给定表面内的孔具有不同的单独的孔深度。在一些实施方案中，孔彼此之间紧邻。在一些实施方案中，孔彼此之间分开一段距离。在一些实施方案中，孔彼此之间分开约0.001μm至约30mm的距离或在其间的任何距离或距离范围。
在一些实施方案中，表面涂覆有材料。该材料可选自本领域已知的任何材料，包括但不限于特氟隆(Teflon)、粘合剂涂层、表面活性剂、蛋白质、粘附分子、抗体、抗凝血剂、调节细胞功能的因子、核酸、脂质、碳水化合物或跨膜蛋白。在一些实施方案中，表面涂覆有聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施方案中，材料共价附着于表面。在一些实施方案中，材料非共价附着于表面。在一些实施方案中，表面分子在细胞通过孔时释放。
在一些实施方案中，表面具有修饰的化学特性。在一些实施方案中，表面是亲水的。在一些实施方案中，表面是疏水的。在一些实施方案中，表面是带电的。在一些实施方案中，表面带正电和/或带负电。在一些实施方案中，表面可以在一些区域带正电并在其他区域带负电。在一些实施方案中，表面具有总体正电荷或总体负电荷。在一些实施方案中，表面可以是光滑的、电解抛光的、粗糙的或经等离子体处理中的任一种。在一些实施方案中，表面包含两性离子或偶极化合物。在一些实施方案中，表面是经等离子体处理的。
在一些实施方案中，表面被包含在较大的模块内。在一些实施方案中，表面被包含在注射器内，例如塑料或玻璃注射器内。在一些实施方案中，表面被包含在塑料过滤器支架内。在一些实施方案中，表面被包含在移液管尖端内。
VII.细胞扰动
在一些实施方案中，本发明提供了通过使细胞悬浮液通过缩窄部将复合物递送至细胞的方法，其中该缩窄部使细胞变形从而引起细胞扰动，这样使得复合物进入细胞，其中该细胞中的扰动是细胞中允许来自细胞外部的材料移动进入细胞中的缺口(例如，洞、撕裂、腔、孔口、孔、断裂、间隙或穿孔)。变形可以由例如通过机械应变和/或剪切力诱导的压力引起。在一些实施方案中，扰动是细胞壁内的扰动。在一些实施方案中，扰动是细胞膜内的扰动。在一些实施方案中，扰动是瞬时的。在一些实施方案中，细胞扰动持续从约1.0x10-9秒至约2小时、或在其间的任何时间或时间范围。在一些实施方案中，细胞扰动持续约1.0x10-9秒至约1秒、约1秒至约1分钟、或约1分钟至约1小时。在一些实施方案中，细胞扰动的持续时间在以下中的任一者之间：约1.0x10-9至约1.0x10-1秒、约1.0x10-9至约1.0x10-2秒、约1.0x10-9至约1.0x10-3秒、约1.0x10-9至约1.0x10-4秒、约1.0x10-9至约1.0x10-5秒、约1.0x10-9至约1.0x10-6秒、约1.0x10-9至约1.0x10-7秒、或约1.0x10-9至约1.0x10-8秒。在一些实施方案中，细胞扰动的持续以下中的任一者：约1.0x10-8至约1.0x10-1秒、约1.0x10-7至约1.0x10-1秒、约1.0x10-6至约1.0x10-1秒、约1.0x10-5至约1.0x10-1秒、约1.0x10-4至约1.0x10-1秒、约1.0x10-3至约1.0x10-1秒、或约1.0x10-2至约1.0x10-1秒。通过本文所述的方法产生的细胞扰动(例如，孔或洞)不是由于多肽亚基组装形成多聚体孔结构(例如由补体或细菌溶血素产生的结构)而形成的。
当细胞通过缩窄部时，该缩窄部暂时对细胞膜造成损伤，导致材料通过扰动被动扩散。在一些实施方案中，使细胞变形仅持续大约100μs的短暂时间段，以最小化通过细胞信号传导机制激活凋亡途径的机会，但是其他持续时间是可能的(例如，从纳秒到数小时的范围)。在一些实施方案中，使细胞变形持续约1.0x10-9秒至约2小时、或在其间的任何时间或时间范围。在一些实施方案中，使细胞变形持续约1.0x10-9秒至约1秒、约1秒至约1分钟、或约1分钟至约1小时。在一些实施方案中，使细胞变形的持续时间在以下中的任一者之间：约1.0x10-9至约1.0x10-1秒、约1.0x10-9至约1.0x10-2秒、约1.0x10-9至约1.0x10-3秒、约1.0x10-9至约1.0x10-4秒、约1.0x10-9至约1.0x10-5秒、约1.0x10-9至约1.0x10-6秒、约1.0x10-9至约1.0x10-7秒、或约1.0x10-9至约1.0x10-8秒。在一些实施方案中，使细胞变形的持续时间在以下中的任一者之间：约1.0x10-8至约1.0x10-1秒、约1.0x10-7至约1.0x10-1秒、约1.0x10-6至约1.0x10-1秒、约1.0x10-5至约1.0x10-1秒、约1.0x10-4至约1.0x10-1秒、约1.0x10-3至约1.0x10-1秒、或约1.0x10-2至约1.0x10-1秒。在一些实施方案中，使细胞变形包括使细胞变形持续一段时间，该时间的范围为但不限于，约1μs到至少约750μs，例如，至少约1μs、10μs、50μs、100μs、500μs或750μs。
在一些实施方案中，复合物穿过进入细胞中与该细胞通过缩窄部和/或细胞的扰动同时发生。在一些实施方案中，复合物穿过进入细胞中发生在细胞通过缩窄部之后。在一些实施方案中，复合物穿过进入细胞中发生在细胞通过缩窄部之后大约几分钟。在一些实施方案中，复合物穿过进入细胞中发生在细胞通过缩窄部之后从约1.0x10-2秒到至少约30分钟。例如，复合物穿过进入细胞中发生在该细胞通过缩窄部之后从约1.0x10-2秒至约1秒、约1秒至约1分钟、或约1分钟至约30分钟。在一些实施方案中，复合物穿过进入细胞中发生在该细胞通过缩窄部之后约1.0x10-2秒至约10分钟、约1.0x10-2秒至约5分钟、约1.0x10-2秒至约1分钟、约1.0x10-2秒至约50秒、约1.0x10-2秒至约10秒、约1.0x10-2秒至约1秒、或约1.0x10-2秒至约0.1秒。在一些实施方案中，复合物穿过进入细胞中发生在该细胞通过缩窄部之后约1.0x10-1秒至约10分钟、约1秒至约10分钟、约10秒至约10分钟、约50秒至约10分钟、约1分钟至约10分钟、或约5分钟至约10分钟。在一些实施方案中，细胞通过缩窄部之后的细胞扰动在细胞通过缩窄部之后约5分钟左右内被纠正。
在一些实施方案中，通过缩窄部之后的细胞活力为约5％至约100％。在一些实施方案中，通过缩窄部之后的细胞活力为至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后从约1.0x10-2秒到至少约10天测量细胞活力。例如，在细胞通过缩窄部之后从约1.0x10-2秒至约1秒、约1秒至约1分钟、约1分钟至约30分钟、或约30分钟至约2小时测量细胞活力。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后约1.0x10-2秒至约2小时、约1.0x10-2秒至约1小时、约1.0x10-2秒至约30分钟、约1.0x10-2秒至约1分钟、约1.0x10-2秒至约30秒、约1.0x10-2秒至约1秒、或约1.0x10-2秒至约0.1秒测量细胞活力。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后约1.5小时至约2小时、约1小时至约2小时、约30分钟至约2小时、约15分钟至约2小时、约1分钟至约2小时、约30秒至约2小时、或约1秒至约2小时测量细胞活力。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后约2小时至约5小时、约5小时至约12小时、约12小时至约24小时、或约24小时至约10天测量细胞活力。
VIII.递送参数
许多参数可通过本文所述的方法影响复合物向细胞的递送。在一些实施方案中，细胞悬浮液在通过缩窄部之前、同时或之后与复合物接触。悬浮在包括待递送的复合物的溶液中的细胞可以通过缩窄部，但是可以在细胞通过缩窄部之后将复合物添加到细胞悬浮液中。在一些实施方案中，将待递送的复合物涂覆在缩窄部上。
可能影响将复合物递送到细胞中的参数的例子包括但不限于缩窄部的尺寸、缩窄部的入口角度、缩窄部的表面特性(例如，粗糙度、化学修饰、亲水性、疏水性等)、操作流速(例如，通过缩窄部的细胞传输时间)、细胞浓度、细胞悬浮液中复合物的浓度，并且细胞在通过缩窄部之后恢复或孵育的时间量可以影响递送的复合物穿过进入细胞中。影响复合物向细胞内的递送的另外的参数可包括细胞在缩窄部中的速度、缩窄部中的剪切速度、细胞悬浮液的粘度、垂直于流速的速度分量、以及在缩窄部中的时间。可以设计此类参数来控制复合物的递送。在一些实施方案中，细胞浓度范围为从约10个到至少约1012个细胞/ml或在其间的任何浓度或浓度范围。在一些实施方案中，递送复合物浓度的范围可为从约10ng/ml至约1g/mL或在其间的任何浓度或浓度范围。在一些实施方案中，递送复合物浓度的范围可为从约1pM到至少约2M或在其间的任何浓度或浓度范围。
可调节在本公开文本的方法中使用的温度以影响复合物递送和细胞活力以及复合物稳定性。在一些实施方案中，该方法在约-5℃与约45℃之间进行。例如，可在室温(例如，约20℃)、生理温度(例如，约37℃)、高于生理温度(例如，大于约37℃至45℃或更高)、或降低的温度(例如，约-5℃至约4℃)、或在这些示例性温度之间的温度下实施这些方法。在一些实施方案中，在不会导致要递送至细胞的分子的复合物大量解离的温度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。在一些实施方案中，在导致要递送至细胞的分子的复合物少于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％解离的温度下使细胞悬浮液与两种或更多种分子的复合物接触。
可利用各种方法来驱动细胞通过缩窄部。例如，可在入口侧通过泵(例如，气瓶或压缩机)施加压力，可在出口侧通过真空泵施加真空，可通过管施加毛细管作用，和/或系统可由重力进给。也可使用基于位移的流动系统(例如，注射泵、蠕动泵、手动注射器或移液器、活塞等)。在一些实施方案中，细胞通过正压或负压通过缩窄部。在一些实施方案中，细胞通过恒定压力或可变压力通过缩窄部。在一些实施方案中，使用注射器施加压力。在一些实施方案中，使用泵施加压力。在一些实施方案中，泵是蠕动泵或隔膜泵。在一些实施方案中，使用真空施加压力。在一些实施方案中，细胞通过重力通过缩窄部。在一些实施方案中，细胞通过毛细管压力通过缩窄部。
在一些实施方案中，流体流动引导细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之前，流体流动是湍流。湍流是一种流体流动，其中在给定点的速度在大小和方向上不规律地变化。在一些实施方案中，流过缩窄部的流体是层流。层流包括在固体边界附近的流体中的非中断流，其中在每个点的流动方向保持恒定。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后流体流动是湍流。细胞通过缩窄部的速度可以变化。在一些实施方案中，细胞以均一的细胞速度通过缩窄部。在一些实施方案中，细胞以波动的细胞速度通过缩窄部。
在其他实施方案中，使用组合治疗递送复合物，例如本文所述的方法之后暴露于缩窄部下游的电场。在一些实施方案中，细胞在通过缩窄部之后通过由至少一个电极产生的电场。在一些实施方案中，电场有助于将复合物递送至细胞内部的第二位置，如细胞核。在一些实施方案中，一个或多个电极靠近使细胞变形的缩窄部以产生电场。在一些实施方案中，电场在约0.1kV/m至约100MV/m之间、或在其间的任何数量或数量范围。在一些实施方案中，集成电路用于提供电信号以驱动电极。在一些实施方案中，将细胞暴露于脉冲宽度在约1ns至约1s之间、以及时间在约100ns至约10s之间或在其间的任何时间或时间范围的电场。
IX.系统和试剂盒
在一些方面，本发明提供了一种用于将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的系统，该系统包括包含缩窄部的微流体通道、包含细胞的细胞悬浮液、和两种或更多种分子的复合物；其中该缩窄部被配置成使得该细胞可通过该缩窄部，其中该缩窄部使该细胞变形从而引起该细胞的扰动，这样使得两种或更多种分子的该复合物进入该细胞。在其他方面中，本发明提供了一种用于将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的系统，该系统包括具有孔的表面、包含细胞的细胞悬浮液、和两种或更多种分子的复合物；其中具有孔的该表面被配置成使得该细胞可通过该孔，其中该孔使该细胞变形从而引起该细胞的扰动，这样使得两种或更多种分子的该复合物进入该细胞。在一些实施方案中，该表面是过滤器或膜。在以上方面的一些实施方案中，该系统进一步包括至少一个电极以产生电场。在一些实施方案中，分子的复合物的形成是可逆的。在一些实施方案中，复合物的至少两种或更多种分子通过非共价相互作用缔合。在一些实施方案中，将系统用于将如本文所述的两种或更多种分子的任何复合物递送到细胞中。在一些实施方案中，该系统用于通过本文所述的任何方法将包含两种或更多种分子的复合物递送到细胞中。系统可包括针对上文所公开的方法描述的任何实施方案，包括微流体通道或具有孔的表面(以提供使细胞变形的缩窄部)、细胞悬浮液、细胞扰动、递送参数、改变或诱导抗体产生的化合物、和/或应用等。在一些实施方案中，使细胞变形的缩窄部的大小适于递送至产生抗体的细胞以改变内源性抗体产生。在一些实施方案中，使细胞变形的缩窄部的大小适于递送在细胞中诱导从头产生抗体的化合物。在一些实施方案中，优化递送参数，如操作流速、细胞和化合物浓度、缩窄部中细胞的速度、和细胞悬浮液的组成(例如，摩尔渗透压浓度、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)以便将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中。
在一些实施方案中，本发明提供包括如本文所述的两种或更多种分子的复合物的细胞，其中通过本文所述的任何方法将该两种或更多种分子的复合物递送到细胞中。
还提供了用于在将如本文所述的两种或更多种分子的复合物递送到细胞中使用的试剂盒或制品。在一些实施方案中，试剂盒包含在合适的包装中的本文所述的组合物(例如微流体通道或含有孔的表面、细胞悬浮液、和/或两种或更多种分子的复合物)。合适的包装材料是本领域已知的，并且包括例如小瓶(如密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶子、罐子、软包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。可进一步将这些制品灭菌和/或密封。
本公开文本还提供了包含本文所述方法的组分的试剂盒，并且可进一步包含用于执行所述方法以将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的一个或多个说明书。本文所述的试剂盒可进一步包括其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器、和包装说明书(其具有用于执行本文所述的任何方法的说明书；例如用于将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的说明书)。
X.示例性实施方案
1.一种用于将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的方法，该方法包括使细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使该细胞变形，从而引起该细胞的扰动，这样使得分子的该复合物进入该细胞，其中所述细胞悬浮液与分子的该复合物接触。
2.实施方案1的方法，其中分子的该复合物的形成是可逆的。
3.实施方案1或2的方法，其中该复合物的至少两种或更多种分子通过非共价相互作用缔合。
4.实施方案1-3中任一项的方法，其中在该复合物中的至少两种分子在该复合物中具有从约1μM至约1pM范围内的结合亲和力。
5.实施方案1-4中任一项的方法，其中该复合物中的至少两种分子在该复合物中具有从约1μM至约1nM或从约1nM至约1pM范围内的结合亲和力。
6.实施方案1-5中任一项的方法，其中该复合物在该细胞悬浮液中具有约1分钟至约48小时的半衰期。
7.实施方案6的方法，其中该复合物在细胞悬浮液中具有约1分钟至约20分钟、约20分钟至约40分钟、约40分钟至约1小时、约1小时至约2小时、约2小时至约6小时、约6小时至约12小时、约12小时至约24小时、约24小时至约36小时、或约36小时至约48小时的半衰期。
8.实施方案1-7中任一项的方法，其中该复合物在洗涤剂的存在下解离。
9.实施方案8的方法，其中该复合物在洗涤剂的存在下以约0.1％(w/v)至约10％(w/v)的浓度解离。
10.实施方案8或9的方法，其中该复合物在洗涤剂的存在下以约0.1％(w/v)至约1％(w/v)、约1％(w/v)至约5％(w/v)、或约5％(w/v)至约10％(w/v)的浓度解离。
11.实施方案1-10中任一项的方法，其中在从约0℃至约40℃范围内的温度下使该细胞悬浮液与分子的该复合物接触。
12.实施方案11的方法，其中分子的该复合物在比该细胞悬浮液与分子的该复合物接触的温度高的温度下解离。
13.实施方案11或12的方法，其中分子的该复合物在约50℃至约70℃的温度下解离。
14.实施方案11-13中任一项的方法，其中分子的该复合物在约50℃至约60℃、或约60℃至约70℃的温度下解离。
15.实施方案1-14中任一项的方法，其中在从约50mM至约300mM范围内的离子强度下使该细胞悬浮液与分子的该复合物接触。
16.实施方案15的方法，其中分子的该复合物在比该细胞悬浮液与分子的该复合物接触的离子强度大的离子强度下解离。
17.实施方案15或16的方法，其中分子的该复合物在约350mM至约1000mM的离子强度下解离。
18.实施方案17的方法，其中分子的该复合物在约350mM至约400mM、约400mM至约500mM、约500mM至约600mM、约700mM至约800mM、约800mM至约900mM、或约900mM至约1000mM的离子强度下解离。
19.实施方案15的方法，其中分子的该复合物在比该细胞悬浮液与分子的该复合物接触的离子强度小的离子强度下解离。
20.实施方案15或19的方法，其中分子的该复合物在约0mM至约50mM的离子强度下解离。
21.实施方案20的方法，其中分子的该复合物在约0mM至约10mM、约10mM至约20mM、约20mM至约30mM、约30mM至约40mM、或约40mM至约50mM的离子强度下解离。
22.实施方案1-14中任一项的方法，其中在从约100mOsm/L至约500mOsm/L范围内的摩尔渗透压浓度下使该细胞悬浮液与分子的该复合物接触。
23.实施方案22的方法，其中分子的该复合物在比该细胞悬浮液与分子的该复合物接触的离子强度大的摩尔渗透压浓度下解离。
24.实施方案22或23的方法，其中分子的该复合物在约600mOsm/L至约1000mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。
25.实施方案24的方法，其中分子的该复合物在约600mOsm/L至约700mOsm/L、约700mOsm/L至约800mOsm/L、约800mOsm/L至约900mOsm/L、或约900mOsm/L至约1000mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。
26.实施方案22的方法，其中分子的该复合物在比该细胞悬浮液与分子的该复合物接触的摩尔渗透压浓度低的摩尔渗透压浓度下解离。
27.实施方案22或26的方法，其中分子的该复合物在约0mOsm/L至约100mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。
28.实施方案27的方法，其中分子的该复合物在约0mOsm/L至约20mOsm/L、约20mOsm/L至约20mOsm/L、约20mOsm/L至约40mOsm/L、约40mOsm/L至约60mOsm/L、约60mOsm/L至约80mOsm/L、或约80mOsm/L至约100mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。
29.实施方案1-28中任一项的方法，其中在从约5.5至约8.5范围内的pH下使该细胞悬浮液与分子的该复合物接触。
30.实施方案29的方法，其中分子的该复合物在比该细胞悬浮液与分子的该复合物接触的pH高或低的pH下解离。
31.实施方案29或30的方法，其中分子的该复合物在约4.0至约5.5的pH下或在约8.5至约10的pH下解离。
32.实施方案31的方法，其中分子的该复合物在约4.0至约4.5、约4.5至约5.0、约5.0至约5.5、约8.5至约9.0、约9.0至约9.5、或约9.5至约10.0的pH下解离。
33.实施方案1-32中任一项的方法，其中当该细胞通过该缩窄部时的剪切力在从约1kPa至约10kPa的范围内。
34.实施方案33的方法，其中该复合物在约10kPa至约100kPa的剪切力下解离。
35.实施方案33或34的方法，其中该复合物在约10kPa至约25kPa、约25kPa至约50kPa、约50kPa至约75kPa、或约75kPa至约100kPa的剪切力下解离。
36.实施方案1-35中任一项的方法，其中分子的该复合物包含a)一种或多种多肽，b)一种或多种核酸，c)一种或多种脂质，d)一种或多种碳水化合物，e)一种或多种小分子，f)一种或多种含金属的化合物，g)一种或多种多肽和一种或多种核酸，h)一种或多种多肽和一种或多种脂质，i)一种或多种多肽和一种或多种碳水化合物，j)一种或多种多肽和一种或多种小分子，k)一种或多种多肽和一种或多种含金属的化合物，l)一种或多种核酸和一种或多种脂质，m)一种或多种核酸和一种或多种碳水化合物，n)一种或多种核酸和一种或多种小分子，o)一种或多种核酸和一种或多种含金属的化合物，p)一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，q)一种或多种脂质和一种或多种小分子，r)一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，s)一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，t)一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，u)一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，v)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种脂质，w)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种碳水化合物，x)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种小分子，y)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种含金属的化合物，z)一种或多种多肽、一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，aa)一种或多种多肽、一种或多种脂质和一种或多种小分子，ab)一种或多种多肽、一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，ac)一种或多种多肽、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，ad)一种或多种多肽、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，ae)一种或多种多肽、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，af)一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，ag)一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种小分子，ah)一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，ai)一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，aj)一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，ak)一种或多种核酸、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，al)一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，am)一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，an)一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，ao)一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，ap)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，aq)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种小分子，ar)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，as)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，at)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，au)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，av)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，aw)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，ax)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，ay)一种或多种多肽、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，az)一种或多种核酸酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，ba)一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，bb)一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bc)一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bd)一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，be)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，bf)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，bg)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bh)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bi)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bj)一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，或bk)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物。
37.实施方案1-36中任一项的方法，其中该复合物包含抗体。
38.实施方案1-36中任一项的方法，其中该复合物包含一种或多种转录因子。
39.实施方案1-36中任一项的方法，其中该复合物包含核糖体和mRNA。
40.实施方案1-36中任一项的方法，其中该复合物包含蛋白酶体、全酶、RNA聚合酶、DNA聚合酶、剪接体、穹窿体细胞质核糖核蛋白、小核核糖核蛋白(snRNP)、端粒酶、核小体、死亡信号传导复合物(DISC)、雷帕霉素复合物1的哺乳动物靶标(mTORC1)、雷帕霉素复合物2的哺乳动物靶标(mTORC2)、或I类磷酸肌醇3激酶(I类PI3K)、RNA诱导的沉默复合物(RISC)、组蛋白-DNA复合物、toll样受体(TLR)-激动剂复合物、转座酶/转座子复合物、tRNA核糖体复合物、多肽-蛋白酶复合物或酶-底物复合物。
41.实施方案1-40中任一项的方法，其中在该细胞悬浮液通过该缩窄部之后使该细胞悬浮液与该复合物接触。
42.实施方案1-40中任一项的方法，其中在该细胞悬浮液通过该缩窄部之前使该细胞悬浮液与该复合物接触。
43.实施方案1-40中任一项的方法，其中在该细胞悬浮液通过该缩窄部的同时使该细胞悬浮液与该复合物接触。
44.实施方案1-42中任一项的方法，其中该复合物在与该细胞悬浮液接触之前形成。
45.实施方案44的方法，其中该复合物在与该细胞悬浮液接触之前约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时或约6小时形成。
46.实施方案1-45中任一项的方法，其中在与该细胞悬浮液接触之前将该复合物进行纯化。
47.实施方案40的方法，其中该复合物在该细胞悬浮液中形成。
48.实施方案47的方法，其中在与该细胞悬浮液接触之前将该复合物的该分子中的一种或多种进行纯化。
49.实施方案1-48中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含混合的细胞群。
50.实施方案1-48中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含纯化的细胞群。
51.实施方案1-48中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含原核细胞或真核细胞。
52.实施方案1-51中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含细菌细胞、古细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞或动物细胞。
53.实施方案1-52中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含脊椎动物细胞。
54.实施方案1-53中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。
55.实施方案1-54中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含人类细胞。
56.实施方案1-55中任一项的方法，其中该缩窄部被包含在微流体通道内。
57.实施方案1-55中任一项的方法，其中该缩窄部是孔或被包含在孔内。
58.实施方案57的方法，其中该孔被包含在表面中。
59.实施方案58的方法，其中该表面是过滤器。
60.实施方案58的方法，其中该表面是膜。
61.实施方案57-60中任一项的方法，其中该孔径为约0.4μm、约1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约8μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm或约14μm。
62.实施方案1-61中任一项的方法，其中该缩窄部尺寸是该细胞直径的函数。
63.实施方案1-62中任一项的方法，其中该缩窄部尺寸为该细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。
64.实施方案1-63中任一项的方法，其中该缩窄部具有约30μm的长度和约3μm至约8μm的宽度。
65.实施方案1-64中任一项的方法，其中该缩窄部具有约10μm的长度和约3μm至约8μm的宽度。
66.实施方案1-65中任一项的方法，其中该方法进一步包括使该细胞悬浮液和复合物与由至少一个电极产生的电场接触的步骤。
67.一种用于将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的系统，该系统包括包含缩窄部的微流体通道、包含该细胞的细胞悬浮液、以及两种或更多种分子的该复合物；其中该缩窄部被配置成使得该细胞可通过该缩窄部，其中该缩窄部使该细胞变形从而引起该细胞的扰动，这样使得两种或更多种分子的该复合物进入该细胞。
68.一种用于将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的系统，该系统包括具有孔的表面、包含该细胞的细胞悬浮液、以及两种或更多种分子的该复合物；其中具有孔的该表面被配置成使得该细胞可通过该孔，其中该孔使该细胞变形从而引起该细胞的扰动，这样使得两种或更多种分子的该复合物进入该细胞。
69.实施方案68的系统，其中该表面是过滤器或膜。
70.实施方案67-69中任一项的系统，其中该系统进一步包括至少一个电极以产生电场。
71.实施方案67-70中任一项的系统，其中分子的该复合物的形成是可逆的。
72.实施方案67-71中任一项的系统，其中该复合物的至少两种或更多种分子通过非共价相互作用缔合。
73.实施方案67-72中任一项的系统，其中该系统用于通过实施方案1-66中任一项的方法将包含两种或更多种分子的复合物递送到细胞中。
74.一种包含两种或更多种分子的复合物的细胞，其中通过实施方案1-66中任一项的方法将两种或更多种分子的该复合物递送到该细胞中。
实施例
实施例1：缩窄部介导的对复合物的递送
在细胞中进行一系列实验以展示缩窄部介导的对复合物的递送。
将培养的细胞收获、计数、洗涤并以10-20×106个细胞/mL重悬于细胞培养基中以用于递送。在与细胞接触之前在体外组装多肽-核酸复合物。将复合条件(包括复合物浓度、溶液摩尔渗透压浓度、盐浓度、温度、pH、血清和表面活性剂含量、以及粘度)优化以确保所形成的复合物保持在稳定、完整的形式直至递送至细胞后。在60和90psi的压力下，使细胞悬浮液通过两种不同的微流体芯片(10-6或10-7芯片)。芯片具有宽度相同(4微米)的缩窄部，但具有两种不同的缩窄部长度(30与10微米)。在通过缩窄部之后，将细胞与预组装的复合物一起孵育，以允许将复合物递送至细胞。将细胞孵育条件(包括溶液摩尔渗透压浓度、盐浓度、温度、pH、血清和表面活性剂含量、细胞和复合物浓度、以及粘度)优化以确保复合物保持在稳定、完整的形式直至递送至细胞后。在一些实施例中，将复合物与作为递送效率的代表的3kDa-Cascade Blue葡聚糖(0.15mg/mL)共同递送。
在递送后48小时，将基于FACS的读数用于确定复合物的递送。作为内吞作用的对照，将未通过缩窄部的细胞与预组装的复合物一起孵育，持续与细胞经历的由缩窄部介导的程序相同的时间。
实施例2：缩窄部介导的对复合物向T细胞的递送
在未刺激的人T细胞中进行一系列实验以展示缩窄部介导的对复合物的递送。
使用标准的Ficoll梯度从人血液中分离新鲜的PBMC。接下来，对T细胞进行阴性选择(人T细胞富集试剂盒(干细胞科技公司(StemCell Technologies)))、计数、洗涤并以10-20×106个细胞/mL重悬于OptiMEM中用于递送。在细胞缩窄部之前在体外组装多肽-核酸复合物。将复合条件(包括复合物浓度、溶液摩尔渗透压浓度、盐浓度、温度、pH、血清和表面活性剂含量、以及粘度)优化以确保所形成的复合物保持在稳定、完整的形式直至递送至T细胞后。在60和90psi的压力下，使T细胞悬浮液通过两种不同的微流体芯片(10-4和30-4)。芯片具有宽度相同(4微米)的缩窄部，但具有两种不同的缩窄部长度(30与10微米)。在通过缩窄部之后，将T细胞与预组装的复合物一起孵育，以允许将复合物递送至细胞。将细胞孵育条件(包括溶液摩尔渗透压浓度、盐浓度、温度、pH、血清和表面活性剂含量、细胞和复合物浓度、以及粘度)优化以确保复合物保持在稳定、完整的形式直至递送至T细胞后。将复合物与作为递送效率的代表的3kDa-Cascade Blue葡聚糖(0.15mg/mL)共同递送。
在递送后48小时，将基于FACS的读数用于确定复合物的递送。作为内吞作用的对照，将未通过缩窄部的T细胞与预组装的复合物一起孵育，持续与细胞经历的由缩窄部介导的程序相同的时间。
实施例3：缩窄部介导的对蛋白质/蛋白质/核酸复合物向HEK293细胞的递送
在该研究中，评价了缩窄部介导的对蛋白质/蛋白质/核酸复合物的递送。该复合物包含含有CAS9蛋白和指导RNA(gRNA)的核糖核蛋白(RNP)复合物，该指导RNA被设计用于敲低B2M基因座，该核糖核蛋白复合物在体外与荧光标记的抗CAS9 IgG抗体复合。
首先，通过将10μg的重组CAS9蛋白(PNA Bio)与2.5摩尔过量的设计用于特异性靶向B2M基因座的未修饰的gRNA(PNA Bio)组合，接着在冰上孵育20分钟来形成RNP复合物。接下来，在室温下将抗CAS9 IgG抗体(细胞信号传导技术公司(Cell SignalingTechnology))与RNP复合物以1:11摩尔比的抗体:RNP进行复合。将HEK293细胞进行计数、洗涤、并以10-20x 106个细胞/mL重悬于含有抗体/CAS9/gRNA复合物的OptiMEM中。在90psi下，通过使细胞悬浮液通过具有10微米的缩窄部长度和7微米的缩窄部宽度的微流体芯片将抗体/CAS9/gRNA复合物递送至细胞。将3kDa-Cascade Blue葡聚糖通过以0.15mg/mL包含在细胞悬浮液中，与复合物共同递送，并用作样品之间递送条件均一性的内标。实验对照包括在治疗的持续时间内没有缩窄部的情况下使细胞暴露于抗体/CAS9/gRNA复合物的样品(内吞作用对照)、其中使单独的RNP复合物经受缩窄部介导的递送的样品、以及其中使单独的抗体经受缩窄部介导的递送的样品。所有样品均包括3kDa-Cascade Blue葡聚糖内标。
在细胞悬浮液通过微流体芯片后24小时和6天进行FACS分析，以分别评估递送和B2M敲低。在24小时，通过FACS分析评估细胞以确定对3kDa-Cascade Blue葡聚糖和荧光标记的抗CAS9抗体的阳性。细胞对3kDa-Cascade Blue葡聚糖内标呈阳性的百分比在所有挤压样品中相似(60.5％、62.7％和60.3％)(图1A和1B)，表明缩窄期间的递送条件对于每个样品是一致的并允许对不同负荷的递送进行比较。我们发现，与单独递送时相反，当与RNP复合物预复合时抗体的递送较高(39.6％对比14.7％抗CAS9抗体+)(图1A和1B)。这一发现是意料之外的，因为该复合物比单独的抗体大。在第6天，针对B2M对细胞进行染色，并进行FACS分析以评估归因于RNP的B2M蛋白敲低的水平。单独的RNP和抗体/CAS9/gRNA复合物条件两者均显示B2M的敲低，表明功能性复合物的成功递送。编辑在使用单独RNP的条件下比在与抗体复合时略高(54.9％对比49.1％ B2M-)(图2)。
实施例4：缩窄部介导的对蛋白质/小分子复合物向HeLa细胞的递送
在该研究中，评价了缩窄部介导的对蛋白质/小分子复合物的递送。该复合物含有荧光标记的链霉亲和素和荧光标记的生物素。
在0℃下，将Pacific Blue标记的链霉亲和素在OptiMEM中的2μM溶液与不同浓度的在OptiMEM中的经FITC标记的生物素(2、8或16μM)组合以分别实现1:1、4:1和8:1的生物素:链霉亲和素摩尔比，并在冰上保持1小时。将HeLa细胞进行计数、洗涤并以1x 106个细胞/mL重悬于OptiMEM中。在90psi下，通过使细胞悬浮液通过具有10微米的缩窄部长度和7微米的缩窄部宽度的微流体芯片将链霉亲和素-生物素复合物递送至细胞。将3kDa-AlexaFluor 680葡聚糖通过以0.1mg/mL包含在细胞悬浮液中，与复合物共同递送，并用作样品之间递送条件均一性的内标。实验对照包括在治疗持续时间内没有缩窄部的情况下使细胞暴露于链霉亲和素-生物素复合物(所有摩尔比)的样品(内吞作用对照)、其中链霉亲和素和生物素(1:1摩尔比)在缩窄部介导的递送之前未进行预孵育的样品、其中使单独的链霉亲和素(2μM)经受缩窄部介导的递送的样品、以及其中使单独的生物素(2μM、8μM和16μM)经受缩窄部介导的递送的样品。所有样品均包括3kDa-AlexaFluor680葡聚糖内标。
在使细胞悬浮液通过微流体芯片后立即进行FACS分析，以通过确定对3kDa-AlexaFluor 680葡聚糖、链霉亲和素和生物素的阳性来评估复合物和葡聚糖的递送。细胞对3kDa-AlexaFluor 680葡聚糖内标呈阳性的百分比在所有挤压样品中是相似的(76％-86％，图3A和3B)，从而允许对不同负荷的递送进行比较。据观察，链霉亲和素递送在单独链霉亲和素条件下(20.1％链霉亲和素+)和在1:1链霉亲和素-生物素复合物条件下(28.9％链霉亲和素+，图3A、3B和3C)相似，表明链霉亲和素在测试的缩窄部条件下能够进入细胞。在单独施用时，生物素摄取以剂量依赖性方式发生(81％-97％生物素+，图3A、3B和3C)，但是以1:1和4:1的生物素:链霉亲和素摩尔比添加链霉亲和素导致生物素荧光信号几乎完全丧失(4％-15％生物素+)。这表明复合物形成，因为已知生物素-荧光素荧光一旦与链霉亲和素结合就被淬灭(Kada et al.,Biochim.Biophys.Acta,1427(1999)44-48)，并且链霉亲和素可以按每分子链霉亲和素结合高达4分子生物素。由于存在非复合的细胞内生物素，引入过量生物素(8:1的生物素:链霉亲和素摩尔比)增加了生物素相关的荧光。有趣的是，随着生物素相对浓度的增加，链霉亲和素信号降低，这可能是由于与链霉亲和素荧光团的交叉作用所致。试剂未预孵育的1:1“非复合”对照(NC)显示与链霉亲和素和生物素的1:1预复合的样品相比相似的递送水平，这证明非常快速的复合物结合或细胞内复合(图3A、3B和3C)。总之，这些结果表明，随着由通过微流体装置来递送复合物，复合物形成迅速发生，如细胞内链霉亲和素荧光与充分表征的仅在复合期间观察到的生物素荧光淬灭一致所表明的。
在另一项研究中，评价了缩窄部介导的对含有荧光标记的链霉亲和素和鬼笔环肽缀合的生物素的蛋白质/小分子复合物的递送。
将200pmol的Pacific Blue缀合的链霉亲和素(SA)与200pmol的鬼笔环肽缀合的生物素(B-Phall)预复合。将链霉亲和素-生物素复合物在冰上孵育40分钟(1:1比例)。将HeLa细胞进行计数、洗涤并以2-10x 106个细胞/mL重悬于含有2μM复合物的OptiMEM中。在90psi下，通过使细胞悬浮液通过具有10微米的缩窄部长度和7微米的缩窄部宽度的微流体芯片将链霉亲和素-生物素复合物递送至细胞。将3kDa-AlexaFluor 680葡聚糖通过以0.1mg/mL包含在细胞悬浮液中，与复合物共同递送，并用作样品之间递送条件均一性的内标。实验对照包括在治疗的持续时间内没有缩窄部的情况下使细胞暴露于链霉亲和素-生物素复合物的样品(内吞作用对照)、其中使单独的SA经受缩窄部介导的递送的样品、以及其中使单独的B-Phall经受缩窄部介导的递送的样品。所有样品均包括3kDa-AlexaFluor680葡聚糖内标。
在使细胞悬浮液通过微流体芯片后立即进行流式细胞术分析，以通过确定对3kDa-AlexaFluor 680葡聚糖和SA的阳性来评估复合物和葡聚糖的递送。细胞对3kDa-AlexaFluor 680葡聚糖内标呈阳性的百分比在所有挤压样品中是相似的(96.6％、96.7％和96.8％)(图4A和4B)，从而允许对不同负荷的递送进行比较。我们发现，与SA单独递送时相比，当其与B-Phall预复合时SA的递送较低(30.5％对比44.9％ SA+，图4A和4B)。在具有SA的样品中，我们发现3kDa-AlexaFluor 680葡聚糖递送与SA递送相关(图5)。
实施例5：缩窄部介导的对蛋白质/蛋白质复合物向T细胞的递送
在该研究中，评价了缩窄部介导的对蛋白质/蛋白质复合物的递送。该复合物含有HPV16 E7合成长肽(SLP)和小鼠血清白蛋白(MSA)。
将HPV 16E7 SLP以2.55μM的浓度重悬于水中。将MSA以132.2μM重悬于RPMI(赛默公司(Thermo))中。为了形成复合物，将两倍所希望的最终浓度的SLP在室温下与在RPMI中的40μM MSA孵育10分钟。使用EasySep小鼠全T细胞分离试剂盒(干细胞公司(StemCell))从C57BL/6小鼠中分离T细胞，将其洗涤、计数、并以20x 106个细胞/mL重悬于RPMI中以供立即使用。将未复合的SLP或SLP/MSA复合物以指定浓度(5μM、10μM或20μM)直接添加到鼠类T细胞，并且在90psi下，通过使细胞悬浮液通过具有10微米的缩窄部长度和3微米的缩窄部宽度的微流体芯片递送至细胞。将3kDa-Cascade Blue葡聚糖通过以0.15mg/mL包含在细胞悬浮液中，与复合物共同递送，并用作样品之间递送条件均一性的内标。实验对照包括在治疗持续时间内没有缩窄部的情况下使细胞暴露于SLP或SLP/MSA复合物的样品(内吞作用对照)、以及仅包括RPMI+水的仅媒介物样品。所有样品均包括3kDa-Cascade Blue葡聚糖内标。
用在第0天引发的C57BL/6小鼠进行体内研究，该引发是通过静脉内(i.v.)给予以下项来进行：a)经受SLP或SLP/MSA的经缩窄部介导的递送的5x 106个T细胞；b)没有缩窄部的情况下与SLP或SLP/MSA一起孵育作为内吞作用和/或非特异性结合对照的5x 106个T细胞；或c)经受用单独的媒介物(无抗原)进行缩窄部介导的递送的5x 106个T细胞。在第6天，对小鼠取血，并且使用iTAg四聚体/PE-H-2Db HPV 16E7四聚体(MBL)确定血液中循环的E7特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的水平。使用FlowJo进行流式细胞术分析。
在通过微流体芯片后立即进行FACS分析以通过确定针对3kDa-Cascade Blue葡聚糖的阳性来评估葡聚糖递送。图6A显示，在没有缩窄部的情况下，用单独的SLA，特别是在较高的SLP浓度下，葡聚糖+细胞的分数相对较高。我们还发现，在没有缩窄部的情况下，在较高SLP浓度下T细胞的活力(如通过碘化丙啶染色确定的)显著降低(图6B)。这表明与单独的SLP孵育导致高背景和高毒性。当SLP与MSA复合时，在没有缩窄部的情况下的对照信号显著降低(图6C)。我们还发现，在相同浓度下，复合物(在有和没有缩窄部的两种情况下)的毒性显著低于单独的SLP(图6B和6D)。总之，这表明复合物的形成显著地且出乎意料地改变了递送动态和所得的活力。图7显示了各种条件的代表性流式细胞术图。图8显示了在将经处理的T细胞引回小鼠中之后6天通过针对E7特异性CTL进行四聚体染色测量的内源性CD8 T细胞应答。如通过四聚体染色所见，相比于在没有缩窄部的情况下将T细胞与单独的SLP孵育(Endo)，在没有缩窄部的对照条件下将T细胞与SLP/MSA复合物一起孵育(Endo+MSA)导致CD8应答水平大大降低。出乎意料地，鉴于这些结果，相比于在有缩窄部的情况下将T细胞与单独的SLP孵育(SQZ)，在有缩窄部的情况下将T细胞与SLP/MSA复合物孵育(SQZ+MSA)导致CD8应答水平增加。
更具体地，本申请提供下列各项：
1.一种用于将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的方法，该方法包括使细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使该细胞变形，从而引起该细胞的扰动，这样使得分子的该复合物进入该细胞，其中所述细胞悬浮液与分子的该复合物接触。
2.项1的方法，其中分子的该复合物的形成是可逆的。
3.项1或2的方法，其中该复合物的至少两种或更多种分子通过非共价相互作用缔合。
4.项1-3中任一项的方法，其中在该复合物中的至少两种分子在该复合物中的结合亲和力在约1μM至约1pM范围内。
5.项1-4中任一项的方法，其中该复合物中的至少两种分子在该复合物中的结合亲和力为约1μM至约1nM或从约1nM至约1pM范围内。
6.项1-5中任一项的方法，其中该复合物在该细胞悬浮液中的半衰期为约1
分钟至约48小时。
7.项6的方法，其中该复合物在该细胞悬浮液中的半衰期为约1分钟至约20
分钟、约20分钟至约40分钟、约40分钟至约1小时、约1小时至约2小时、约2小时至约6小时、约6小时至约12小时、约12小时至约24小时、约24小时至约36小时、或约36小时至约48小时。
8.项1-7中任一项的方法，其中该复合物在洗涤剂的存在下解离。
9.项8的方法，其中该复合物在洗涤剂的存在下以约0.1％(w/v)至约10％
(w/v)的浓度解离。
10.项8或9的方法，其中该复合物在洗涤剂的存在下以约0.1％(w/v)至约1％(w/v)、约1％(w/v)至约5％(w/v)、或约5％(w/v)至约10％(w/v)
的浓度解离。
11.项1-10中任一项的方法，其中在从约0℃至约40℃范围内的温度下使该细胞悬浮液与分子的该复合物接触。
12.项11的方法，其中分子的该复合物在比该细胞悬浮液与分子的该复合物接触的温度高的温度下解离。
13.项11或12的方法，其中分子的该复合物在约50℃至约70℃的温度下解离。
14.项11-13中任一项的方法，其中分子的该复合物在约50℃至约60℃、或约
60℃至约70℃的温度下解离。
15.项1-14中任一项的方法，其中在从约50mM至约300mM范围内的离子强度下使该细胞悬浮液与分子的该复合物接触。
16.项15的方法，其中分子的该复合物在比该细胞悬浮液与分子的该复合物接触的离子强度大的离子强度下解离。
17.项15或16的方法，其中分子的该复合物在约350mM至约1000mM的离子强度下解离。
18.项17的方法，其中分子的该复合物在约350mM至约400mM、约400mM至约500mM、约500mM至约600mM、约700mM至约800mM、约800
mM至约900mM、或约900mM至约1000mM的离子强度下解离。
19.项15的方法，其中分子的该复合物在比该细胞悬浮液与分子的该复合物接触的离子强度小的离子强度下解离。
20.项15或19的方法，其中分子的该复合物在约0mM至约50mM的离子强度下解离。
21.项20的方法，其中分子的该复合物在约0mM至约10mM、约10mM至约20mM、约20mM至约30mM、约30mM至约40mM、或约40mM至约
50mM的离子强度下解离。
22.项1-14中任一项的方法，其中在从约100mOsm/L至约500mOsm/L范围内的摩尔渗透压浓度下使该细胞悬浮液与分子的该复合物接触。
23.项22的方法，其中分子的该复合物在比该细胞悬浮液与分子的该复合物接触的离子强度大的摩尔渗透压浓度下解离。
24.项22或23的方法，其中分子的该复合物在约600mOsm/L至约1000mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。
25.项24的方法，其中分子的该复合物在约600mOsm/L至约700mOsm/L、约700mOsm/L至约800mOsm/L、约800mOsm/L至约900mOsm/L、或约
900mOsm/L至约1000mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。
26.项22的方法，其中分子的该复合物在比该细胞悬浮液与分子的该复合物接触的摩尔渗透压浓度低的摩尔渗透压浓度下解离。
27.项22或26的方法，其中分子的该复合物在约0mOsm/L至约100mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。
28.项27的方法，其中分子的该复合物在约0mOsm/L至约20mOsm/L、约20mOsm/L至约20mOsm/L、约20mOsm/L至约40mOsm/L、约40mOsm/L至约60mOsm/L、约60mOsm/L至约80mOsm/L、或约80mOsm/L至约100mOsm/L的摩尔渗透压浓度下解离。
29.项1-28中任一项的方法，其中在从约5.5至约8.5范围内的pH下使该细胞悬浮液与分子的该复合物接触。
30.项29的方法，其中分子的该复合物在比该细胞悬浮液与分子的该复合物接触的pH高或低的pH下解离。
31.项29或30的方法，其中分子的该复合物在约4.0至约5.5的pH下或在约8.5
至约10的pH下解离。
32.项31的方法，其中分子的该复合物在约4.0至约4.5、约4.5至约5.0、约5.0
至约5.5、约8.5至约9.0、约9.0至约9.5、或约9.5至约10.0的pH下解离。
33.项1-32中任一项的方法，其中当该细胞通过该缩窄部时的剪切力在从约
1kPa至约10kPa的范围内。
34.项33的方法，其中该复合物在约10kPa至约100kPa的剪切力下解离。
35.项33或34的方法，其中该复合物在约10kPa至约25kPa、约25kPa至约50
kPa、约50kPa至约75kPa、或约75kPa至约100kPa的剪切力下解离。
36.项1-35中任一项的方法，其中分子的该复合物包含
a)一种或多种多肽，
b)一种或多种核酸，
c)一种或多种脂质，
d)一种或多种碳水化合物，
e)一种或多种小分子，
f)一种或多种含金属的化合物，
g)一种或多种多肽和一种或多种核酸，
h)一种或多种多肽和一种或多种脂质，
i)一种或多种多肽和一种或多种碳水化合物，
j)一种或多种多肽和一种或多种小分子，
k)一种或多种多肽和一种或多种含金属的化合物，
l)一种或多种核酸和一种或多种脂质，
m)一种或多种核酸和一种或多种碳水化合物，
n)一种或多种核酸和一种或多种小分子，
o)一种或多种核酸和一种或多种含金属的化合物，
p)一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，
q)一种或多种脂质和一种或多种小分子，
r)一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，
s)一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，
t)一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，
u)一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，
v)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种脂质，
w)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种碳水化合物，
x)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种小分子，
y)一种或多种多肽、一种或多种核酸和一种或多种含金属的化合物，
z)一种或多种多肽、一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，
aa)一种或多种多肽、一种或多种脂质和一种或多种小分子，ab)一种或多种多肽、一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，ac)一种或多种多肽、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，ad)一种或多种多肽、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，
ae)一种或多种多肽、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，af)一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，ag)一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种小分子，ah)一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，ai)一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，aj)一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，
ak)一种或多种核酸、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，al)一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，am)一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，
an)一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，ao)一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，
ap)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种碳水化合物，
aq)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种小分子，
ar)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质和一种或多种含金属的化合物，
as)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，
at)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，
au)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，
av)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，
aw)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，
ax)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，
ay)一种或多种多肽、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，
az)一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，
ba)一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，
bb)一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，
bc)一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，
bd)一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，
be)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种小分子，
bf)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物和一种或多种含金属的化合物，
bg)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，
bh)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bi)一种或多种多肽、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，bj)一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物，或
bk)一种或多种多肽、一种或多种核酸、一种或多种脂质、一种或多种碳水化合物、一种或多种小分子和一种或多种含金属的化合物。
37.项1-36中任一项的方法，其中该复合物包含抗体。
38.项1-36中任一项的方法，其中该复合物包含一种或多种转录因子。
39.项1-36中任一项的方法，其中该复合物包含核糖体和mRNA。
40.项1-36中任一项的方法，其中该复合物包含蛋白酶体、全酶、RNA聚合酶、DNA聚合酶、剪接体、穹窿体细胞质核糖核蛋白、小核核糖核蛋白(snRNP)、端粒酶、核小体、死亡信号传导复合物(DISC)、雷帕霉素复合物1的哺乳动物靶标(mTORC1)、雷帕霉素复合物2的哺乳动物靶标(mTORC2)、或I类磷酸肌醇3激酶(I类PI3K)、RNA诱导的沉默复合物(RISC)、组蛋白-DNA复合物、toll样受体(TLR)-激动剂复合物、转座酶/转座子复合物、tRNA核糖体复合物、多肽-蛋白酶复合物或酶-底物复合物。
41.项1-40中任一项的方法，其中在该细胞悬浮液通过该缩窄部之后使该细胞悬浮液与该复合物接触。
42.项1-40中任一项的方法，其中在该细胞悬浮液通过该缩窄部之前使该细胞悬浮液与该复合物接触。
43.项1-40中任一项的方法，其中在该细胞悬浮液通过该缩窄部的同时使该细胞悬浮液与该复合物接触。
44.项1-42中任一项的方法，其中该复合物在与该细胞悬浮液接触之前形成。
45.项44的方法，其中该复合物在与该细胞悬浮液接触之前约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时或约6小时形成。
46.项1-45中任一项的方法，其中在与该细胞悬浮液接触之前将该复合物进行纯化。
47.项40的方法，其中该复合物在该细胞悬浮液中形成。
48.项47的方法，其中在与该细胞悬浮液接触之前将该复合物的该分子中的一种或多种进行纯化。
49.项1-48中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含混合的细胞群。
50.项1-48中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含纯化的细胞群。
51.项1-48中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含原核细胞或真核细胞。
52.项1-51中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含细菌细胞、古细菌细胞、
酵母细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞或动物细胞。
53.项1-52中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含脊椎动物细胞。
54.项1-53中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。
55.项1-54中任一项的方法，其中该细胞悬浮液包含人类细胞。
56.项1-55中任一项的方法，其中该缩窄部被包含在微流体通道内。
57.项1-55中任一项的方法，其中该缩窄部是孔或被包含在孔内。
58.项57的方法，其中该孔被包含在表面中。
59.项58的方法，其中该表面是过滤器。
60.项58的方法，其中该表面是膜。
61.项57-60中任一项的方法，其中该孔径为约0.4μm、约1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约8μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm或约14μm。
62.项1-61中任一项的方法，其中该缩窄部尺寸是该细胞直径的函数。
63.项1-62中任一项的方法，其中该缩窄部尺寸为该细胞直径的约20％、约
30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。
64.项1-63中任一项的方法，其中该缩窄部具有约30μm的长度和约3μm至约8μm的宽度。
65.项1-64中任一项的方法，其中该缩窄部具有约10μm的长度和约3μm至约8μm的宽度。
66.项1-65中任一项的方法，其中该方法进一步包括使该细胞悬浮液和复合物与由至少一个电极产生的电场接触的步骤。
67.一种用于将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的系统，该系统包括包含缩窄部的微流体通道、包含该细胞的细胞悬浮液、以及两种或更多种分子的该复合物；其中该缩窄部被配置成使得该细胞可通过该缩窄部，其中该缩窄部使该细胞变形从而引起该细胞的扰动，这样使得两种或更多种分子的该复合物进入该细胞。
68.一种用于将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的系统，该系统包括具有孔的表面、包含该细胞的细胞悬浮液、以及两种或更多种分子的该复合物；其中具有孔的该表面被配置成使得该细胞可通过该孔，其中
该孔使该细胞变形从而引起该细胞的扰动，这样使得两种或更多种分子的该复合物进入该细胞。
69.项68的系统，其中该表面是过滤器或膜。
70.项67-69中任一项的系统，其中该系统进一步包括至少一个电极以产生电场。
71.项67-70中任一项的系统，其中分子的该复合物的形成是可逆的。
72.项67-71中任一项的系统，其中该复合物的至少两种或更多种分子通过非共价相互作用缔合。
73.项67-72中任一项的系统，其中该系统用于通过项1-66中任一项的方法将包含两种或更多种分子的复合物递送到细胞中。
74.一种包含两种或更多种分子的复合物的细胞，其中通过项1-66中任一项的方法将两种或更多种分子的该复合物递送到该细胞中。

Claims (10)

1.一种用于将两种或更多种分子的复合物递送到细胞中的方法，该方法包括使细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使该细胞变形，从而引起该细胞的扰动，这样使得分子的该复合物进入该细胞，其中所述细胞悬浮液与分子的该复合物接触。
2.权利要求1的方法，其中分子的该复合物的形成是可逆的。
3.权利要求1或2的方法，其中该复合物的至少两种或更多种分子通过非共价相互作用缔合。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中在该复合物中的至少两种分子在该复合物中的结合亲和力在约1μM至约1pM范围内。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中该复合物中的至少两种分子在该复合物中的结合亲和力为约1μM至约1nM或从约1nM至约1pM范围内。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中该复合物在该细胞悬浮液中的半衰期为约1分钟至约48小时。
7.权利要求6的方法，其中该复合物在该细胞悬浮液中的半衰期为约1分钟至约20分钟、约20分钟至约40分钟、约40分钟至约1小时、约1小时至约2小时、约2小时至约6小时、约6小时至约12小时、约12小时至约24小时、约24小时至约36小时、或约36小时至约48小时。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中该复合物在洗涤剂的存在下解离。
9.权利要求8的方法，其中该复合物在洗涤剂的存在下以约0.1％(w/v)至约10％(w/v)的浓度解离。
10.权利要求8或9的方法，其中该复合物在洗涤剂的存在下以约0.1％(w/v)至约1％(w/v)、约1％(w/v)至约5％(w/v)、或约5％(w/v)至约10％(w/v)的浓度解离。
CN202211557721.3A 2016-01-12 2017-01-11 复合物的细胞内递送 Pending CN116218916A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662277858P 2016-01-12 2016-01-12
US62/277,858 2016-01-12
CN201780015147.XA CN108779475A (zh) 2016-01-12 2017-01-11 复合物的细胞内递送
PCT/US2017/013055 WO2017123663A1 (en) 2016-01-12 2017-01-11 Intracellular delivery of complexes

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780015147.XA Division CN108779475A (zh) 2016-01-12 2017-01-11 复合物的细胞内递送

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116218916A true CN116218916A (zh) 2023-06-06

Family

ID=58010370

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780015147.XA Pending CN108779475A (zh) 2016-01-12 2017-01-11 复合物的细胞内递送
CN202211557721.3A Pending CN116218916A (zh) 2016-01-12 2017-01-11 复合物的细胞内递送

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780015147.XA Pending CN108779475A (zh) 2016-01-12 2017-01-11 复合物的细胞内递送

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20190017072A1 (zh)
EP (1) EP3402890A1 (zh)
JP (3) JP7033535B2 (zh)
CN (2) CN108779475A (zh)
WO (1) WO2017123663A1 (zh)

Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2852672C (en) 2011-10-17 2021-07-20 Massachusetts Institute Of Technology A microfluidic system and method for delivering a payload into a cell by causing perturbations in a cell membrane of the cell
JP6502940B2 (ja) 2013-08-16 2019-04-17 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 細胞への物質の選択的送達
KR20170074235A (ko) 2014-10-31 2017-06-29 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 면역 세포로의 생체분자의 전달
CN113897285A (zh) 2014-11-14 2022-01-07 麻省理工学院 化合物和组合物向细胞中的破坏和场实现的递送
CN107250373A (zh) 2015-01-12 2017-10-13 麻省理工学院 通过微流体递送实现的基因编辑
EP4257675A3 (en) 2015-07-09 2024-01-03 Massachusetts Institute of Technology Delivery of materials to anucleate cells
US11613759B2 (en) 2015-09-04 2023-03-28 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to cells comprising a cell wall
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
US10253316B2 (en) 2017-06-30 2019-04-09 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
WO2018039084A1 (en) 2016-08-20 2018-03-01 The Regents Of The University Of California High-throughput system and method for the temporary permeablization of cells
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10435713B2 (en) 2017-09-30 2019-10-08 Inscripta, Inc. Flow through electroporation instrumentation
CR20200251A (es) 2017-11-17 2020-07-17 Iovance Biotherapeutics Inc Expansión de til de aspirados con aguja fina y biopsias por punción
JP2021503885A (ja) 2017-11-22 2021-02-15 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 末梢血からの末梢血リンパ球（ｐｂｌ）の拡大培養
CN111683964A (zh) * 2017-12-05 2020-09-18 Sqz生物技术公司 细胞内递送生物分子来调节抗体产生
WO2019126146A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Xcell Biosciences, Inc. Methods of modulating cell phenotype by way of regulating the gaseous environment
US20200392444A1 (en) * 2017-12-21 2020-12-17 Politecnico Di Milano Erythrocytes for drug delivery
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
WO2019136459A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
EP3737743A1 (en) 2018-01-08 2020-11-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
CR20200460A (es) * 2018-03-12 2020-11-23 Sqz Biotechnologies Co Suministro intracelular de biomeléculas para modificar respuestas inmunes
CN112105383A (zh) * 2018-03-12 2020-12-18 Sqz生物技术公司 用于治疗hpv相关疾病的方法
WO2019200004A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
US10557216B2 (en) 2018-04-24 2020-02-11 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US10508273B2 (en) 2018-04-24 2019-12-17 Inscripta, Inc. Methods for identifying selective binding pairs
CA3108767A1 (en) 2018-06-30 2020-01-02 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
WO2020081149A2 (en) 2018-08-30 2020-04-23 Inscripta, Inc. Improved detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
EP3870697A4 (en) 2018-10-22 2022-11-09 Inscripta, Inc. MODIFIED ENZYMES
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
JP2022512899A (ja) 2018-11-05 2022-02-07 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 抗ｐｄ－１抗体に対して不応性のｎｓｃｌｃ患者の治療
MX2021005216A (es) 2018-11-05 2021-06-18 Iovance Biotherapeutics Inc Procesos para la produccion de linfocitos infiltrantes de tumor y usos de los mismos en inmunoterapia.
TW202039829A (zh) 2018-11-05 2020-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 改善之腫瘤反應性ｔ細胞的選擇
CA3118493A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors
EP3898949A1 (en) 2018-12-19 2021-10-27 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
SG11202109333SA (en) 2019-02-28 2021-09-29 Sqz Biotechnologies Co Delivery of biomolecules to pbmcs to modify an immune response
US20220133795A1 (en) 2019-03-01 2022-05-05 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of Tumor Infiltrating Lymphocytes From Liquid Tumors and Therapeutic Uses Thereof
AU2020247900A1 (en) 2019-03-25 2021-11-04 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
CA3136296A1 (en) 2019-04-08 2020-10-15 Sqz Biotechnologies Company Cartridge for use in a system for delivery of a payload into a cell
US20220249559A1 (en) 2019-05-13 2022-08-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
AU2020288623A1 (en) 2019-06-06 2022-01-06 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
IT201900009831A1 (it) 2019-06-21 2020-12-21 Milano Politecnico Eritrociti per la veicolazione di farmaci
EP3986909A4 (en) 2019-06-21 2023-08-02 Inscripta, Inc. GENOME-WIDE RATIONAL DESIGNED MUTATIONS LEADING TO INCREASED LYSINE PRODUCTION IN E. COLI
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
EP4069837A4 (en) 2019-12-10 2024-03-13 Inscripta, Inc. NEW MAD NUCLEASES
WO2021118990A1 (en) 2019-12-11 2021-06-17 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (tils) and methods of using the same
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US11008557B1 (en) 2019-12-18 2021-05-18 Inscripta, Inc. Cascade/dCas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
CA3157061A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 Christian SILTANEN Electroporation modules and instrumentation
US20210283565A1 (en) 2020-03-10 2021-09-16 Cellares Corporation Systems and methods for cell processing
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
EP4146794A1 (en) 2020-05-04 2023-03-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
EP4146793A1 (en) 2020-05-04 2023-03-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Selection of improved tumor reactive t-cells
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
EP4214314A4 (en) 2020-09-15 2024-10-16 Inscripta Inc CRISPR EDITING TO EMBED NUCLEIC ACID LANDING PADS INTO LIVING CELL GENOMES
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
US20230372397A1 (en) 2020-10-06 2023-11-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
CA3201944A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Cellfe, Inc. Methods and systems for mechanoporation-based payload delivery into biological cells
EP4259164A1 (en) 2020-12-11 2023-10-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with braf inhibitors and/or mek inhibitors
JP2024500403A (ja) 2020-12-17 2024-01-09 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球によるがんの治療
JP2023554395A (ja) 2020-12-17 2023-12-27 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｃｔｌａ－４及びｐｄ－１阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法による治療
EP4271802A1 (en) 2021-01-04 2023-11-08 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
TW202241508A (zh) 2021-01-29 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
EP4326287A2 (en) 2021-04-19 2024-02-28 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
US20240247285A1 (en) * 2021-05-10 2024-07-25 Sqz Biotechnologies Company Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof
WO2023004074A2 (en) 2021-07-22 2023-01-26 Iovance Biotherapeutics, Inc. Method for cryopreservation of solid tumor fragments
TW202327631A (zh) 2021-07-28 2023-07-16 美商艾歐凡斯生物治療公司 利用腫瘤浸潤性淋巴球療法與ｋｒａｓ抑制劑組合治療癌症患者
AR127482A1 (es) 2021-10-27 2024-01-31 Iovance Biotherapeutics Inc Sistemas y métodos para coordinar la fabricación de células para inmunoterapia específica de paciente
AU2022388729A1 (en) 2021-11-10 2024-05-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
WO2023147486A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Tumor infiltrating lymphocytes engineered to express payloads
WO2023147488A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
WO2023196877A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2023201369A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment
WO2023220608A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist
WO2024030758A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2024098024A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
WO2024112571A2 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom
WO2024112702A1 (en) 2022-11-23 2024-05-30 Cellares Corporation Systems, devices, and methods for cell processing
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2852672C (en) 2011-10-17 2021-07-20 Massachusetts Institute Of Technology A microfluidic system and method for delivering a payload into a cell by causing perturbations in a cell membrane of the cell
JP6502940B2 (ja) 2013-08-16 2019-04-17 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 細胞への物質の選択的送達
CA2945335A1 (en) * 2014-04-18 2015-10-22 Editas Medicine, Inc. Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
CN107250373A (zh) * 2015-01-12 2017-10-13 麻省理工学院 通过微流体递送实现的基因编辑

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019500886A (ja) 2019-01-17
US20190017072A1 (en) 2019-01-17
CN108779475A (zh) 2018-11-09
JP2022023163A (ja) 2022-02-07
JP2024029242A (ja) 2024-03-05
JP7033535B2 (ja) 2022-03-10
EP3402890A1 (en) 2018-11-21
WO2017123663A1 (en) 2017-07-20
US20230097861A1 (en) 2023-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230097861A1 (en) Intracellular delivery of complexes
US20230272427A1 (en) Intracellular delivery of biomolecules mediated by a surface with pores
Hengst et al. Functional and selective RNA interference in developing axons and growth cones
Colombo et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles
JP2021129584A (ja) マイクロ流体送達による遺伝子編集
Chen et al. Emerging roles of 1D vertical nanostructures in orchestrating immune cell functions
JP6779217B2 (ja) 細胞原形質膜を越える送達方法
Gibbings et al. Human prion protein binds Argonaute and promotes accumulation of microRNA effector complexes
CA2964138A1 (en) Disruption and field enabled delivery of compounds and compositions into cells
US12060570B2 (en) Vector-free intracellular delivery by reversible permeabilisation
CN111683964A (zh) 细胞内递送生物分子来调节抗体产生
Lee et al. Retina expression and cross-species validation of gene silencing by PF-655, a small interfering RNA against RTP801 for the treatment of ocular disease
Lappe-Siefke et al. Microinjection into cultured hippocampal neurons: A straightforward approach for controlled cellular delivery of nucleic acids, peptides and antibodies
US20240247285A1 (en) Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof
Reé et al. Partial Disturbance of Microprocessor Function in Human Stem Cells Carrying a Heterozygous Mutation in the DGCR8 Gene
WO2023230141A1 (en) Reprogramming of cells with self-amplifying rna
Bogolyubova Heterogeneity of coilin-containing nuclear domains in early mouse embryos
Bork et al. naRNA is a canonical neutrophil extracellular trap (NET) component and novel inflammation-amplifying composite DAMP
Morris Investigation of RNA binding proteins regulated by mTOR

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination