JP2022023163A - 複合体の細胞内送達 - Google Patents

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Abstract

【課題】種々の細胞型への複合体の送達において高度に有効な細胞内送達技法を提供する。【解決手段】本発明は、２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するための方法であって、細胞懸濁液を狭窄に通すステップを含み、前記狭窄が細胞を変形し、これにより、分子の複合体が細胞に進入するように、細胞の摂動を引き起こし、前記細胞懸濁液が、分子の複合体と接触される、方法を提供する。一部の実施形態では、複合体は、一過性の、可逆的な複合体である。一部の実施形態では、複合体は、非共有結合性相互作用によって一体に保持された構成成分の化合物を含む。【選択図】図１Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１６年１月１２日に出願された米国仮出願第６２／２７７，８５８号の優先権を主張し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示は、全般的には、細胞懸濁液を狭窄に通すことによって、複合体を細胞へと送達するための方法に関する。
細胞内送達は、操作された生物の研究および開発における中心的なステップである。分子の細胞内送達を目的とする現存する技術は、電場、ナノ粒子またはポア形成化学物質に頼る。しかし、これらの方法は、非特異的分子送達、ペイロード分子の修飾もしくは損傷、高い細胞死、ロースループットおよび／または実行困難を含む多数の複雑な要因に悩まされる。その大きなサイズのため、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質および／または小分子等、生体分子で構成された複合体は、細胞膜を容易に横断することができない。よって、斯かる複合体の送達は課題であり、種々の細胞型への複合体の送達において高度に有効な細胞内送達技法に対する必要が満たされていない。加えて、複合体の迅速でハイスループットな細胞内送達を可能にする技法は、大規模臨床、製造および薬物スクリーニング適用に、より有効に適用することができる。細胞へと化合物を送達するためにチャネルを使用する方法について記載する参考文献は、ＷＯ２０１３０５９３４３、ＷＯ２０１５０２３９８２およびＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５８４８９を含む。
特許出願および刊行物を含む、本明細書に引用されているあらゆる参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
国際公開第２０１３／０５９３４３号 国際公開第２０１５／０２３９８２号
本発明は、２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するための方法であって、細胞懸濁液を狭窄に通すステップを含み、前記狭窄が細胞を変形し、これにより、分子の複合体が細胞に進入するように、細胞の摂動を引き起こし、前記細胞懸濁液が、分子の複合体と接触される、方法を提供する。一部の実施形態では、分子の複合体の形成は、可逆的である。一部の実施形態では、複合体の少なくとも２個またはそれよりも多い分子は、非共有結合性相互作用によって会合する。一部の実施形態では、複合体における少なくとも２個の分子は、約１μＭ～約１ｐＭに及ぶ複合体における結合親和性を有する。一部の実施形態では、複合体における少なくとも２個の分子は、約１μＭ～約１ｎＭまたは約１ｎＭ～約１ｐＭに及ぶ複合体における結合親和性を有する。一部の実施形態では、複合体は、細胞懸濁液における、約１分間～約４８時間の半減期を有する。一部の実施形態では、複合体は、細胞懸濁液における、約１分間～約２０分間、約２０分間～約４０分間、約４０分間～約１時間、約１時間～約２時間、約２時間～約６時間、約６時間～約１２時間、約１２時間～約２４時間、約２４時間～約３６時間または約３６時間～約４８時間の半減期を有する。
一部の実施形態では、複合体は、洗浄剤の存在下で解離する。一部の実施形態では、複合体は、約０．１％（ｗ／ｖ）～約１０％（ｗ／ｖ）の濃度の洗浄剤の存在下で解離する。一部の実施形態では、複合体は、約０．１％（ｗ／ｖ）～約１％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）～約５％（ｗ／ｖ）または約５％（ｗ／ｖ）～約１０％（ｗ／ｖ）の濃度の洗浄剤の存在下で解離する。
一部の実施形態では、細胞懸濁液は、約０℃～約４０℃に及ぶ温度で分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、分子の複合体は、細胞懸濁液が分子の複合体と接触される温度を超える温度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約５０℃～約７０℃の温度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約５０℃～約６０℃または約６０℃～約７０℃の温度で解離する。
一部の実施形態では、細胞懸濁液は、約５０ｍＭ～約３００ｍＭに及ぶイオン強度で分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、分子の複合体は、細胞懸濁液が分子の複合体と接触されるイオン強度を超えるイオン強度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約３５０ｍＭ～約１０００ｍＭのイオン強度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約３５０ｍＭ～約４００ｍＭ、約４００ｍＭ～約５００ｍＭ、約５００ｍＭ～約６００ｍＭ、約７００ｍＭ～約８００ｍＭ、約８００ｍＭ～約９００ｍＭまたは約９００ｍＭ～約１０００ｍＭのイオン強度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、細胞懸濁液が分子の複合体と接触されるイオン強度に満たないイオン強度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約０ｍＭ～約５０ｍＭのイオン強度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約０ｍＭ～約１０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭまたは約４０ｍＭ～約５０ｍＭのイオン強度で解離する。
一部の実施形態では、細胞懸濁液は、約１００ｍＯｓｍ／Ｌ～約５００ｍＯｓｍ／Ｌに及ぶ容量オスモル濃度で分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、分子の複合体は、細胞懸濁液が分子の複合体と接触されるイオン強度を超える容量オスモル濃度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約６００ｍＯｓｍ／Ｌ～約１０００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約６００ｍＯｓｍ／Ｌ～約７００ｍＯｓｍ／Ｌ、約７００ｍＯｓｍ／Ｌ～約８００ｍＯｓｍ／Ｌ、約８００ｍＯｓｍ／Ｌ～約９００ｍＯｓｍ／Ｌまたは約９００ｍＯｓｍ／Ｌ～約１０００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、細胞懸濁液が分子の複合体と接触される容量オスモル濃度に満たない容量オスモル濃度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約０ｍＯｓｍ／Ｌ～約１００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２０ｍＯｓｍ／Ｌ～約４０ｍＯｓｍ／Ｌ、約４０ｍＯｓｍ／Ｌ～約６０ｍＯｓｍ／Ｌ、約６０ｍＯｓｍ／Ｌ～約８０ｍＯｓｍ／Ｌまたは約８０ｍＯｓｍ／Ｌ～約１００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する。
一部の実施形態では、細胞懸濁液は、約５．５～約８．５に及ぶｐＨで分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、分子の複合体は、細胞懸濁液が分子の複合体と接触されるｐＨを超えるまたはそれを下回るｐＨで解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約４．０～約５．５のｐＨまたは約８．５～約１０のｐＨで解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約４．０～約４．５、約４．５～約５．０、約５．０～約５．５、約８．５～約９．０、約９．０～約９．５または約９．５～約１０．０のｐＨで解離する。
一部の実施形態では、細胞が狭窄を通る際の剪断力は、約１ｋＰａ～約１０ｋＰａに及ぶ。一部の実施形態では、複合体は、約１０ｋＰａ～約１００ｋＰａの剪断力で解離する。一部の実施形態では、複合体は、約１０ｋＰａ～約２５ｋＰａ、約２５ｋＰａ～約５０ｋＰａ、約５０ｋＰａ～約７５ｋＰａまたは約７５ｋＰａ～約１００ｋＰａの剪断力で解離する。
一部の実施形態では、分子の複合体は、ａ）１種もしくは複数のポリペプチド、ｂ）１種もしくは複数の核酸、ｃ）１種もしくは複数の脂質、ｄ）１種もしくは複数の炭水化物、ｅ）１種もしくは複数の小分子、ｆ）１種もしくは複数の金属含有化合物、ｇ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の核酸、ｈ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の脂質、ｉ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の炭水化物、ｊ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の小分子、ｋ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の金属含有化合物、ｌ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の脂質、ｍ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の炭水化物、ｎ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の小分子、ｏ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｐ）１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、ｑ）１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、ｒ）１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｓ）１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ｔ）１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｕ）１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｖ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の脂質、ｗ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の炭水化物、ｘ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の小分子、ｙ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｚ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、ａａ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、ａｂ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｃ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ａｄ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｅ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｆ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、ａｇ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、ａｈ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｉ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ａｊ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｋ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｌ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ａｍ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｎ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｏ）１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｐ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、ａｑ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、ａｒ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｓ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ａｔ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｕ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｖ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ａｗ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｘ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｙ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｚ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ｂａ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｂ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｃ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｄ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｅ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ｂｆ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｇ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｈ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｉ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｊ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、またはｂｋ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物を含む。一部の実施形態では、複合体は、抗体を含む。一部の実施形態では、複合体は、１種または複数の転写因子を含む。一部の実施形態では、複合体は、リボソームおよびｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体は、プロテアソーム、ホロ酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、スプライセオソーム、ヴォールト細胞質リボヌクレオタンパク質、核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）、テロメラーゼ、ヌクレオソーム、デスシグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）、哺乳動物ラパマイシン標的複合体１（ｍＴＯＲＣ１）、哺乳動物ラパマイシン標的複合体２（ｍＴＯＲＣ２）、またはクラスＩホスホイノシチド３キナーゼ（クラスＩ ＰＩ３Ｋ）、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）、ヒストン－ＤＮＡ複合体、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）－アゴニスト複合体、トランスポサーゼ／トランスポゾン複合体、ｔＲＮＡリボソーム複合体、ポリペプチド－プロテアーゼ複合体、または酵素－基質複合体を含む。
一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液が狭窄を通った後に複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液が狭窄を通る前に複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液が狭窄を通るのと同時に複合体と接触される。一部の実施形態では、複合体は、細胞懸濁液との接触に先立ち形成される。一部の実施形態では、複合体は、細胞懸濁液との接触の約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約１時間、約２時間、約３時間または約６時間前に形成される。一部の実施形態では、複合体は、細胞懸濁液との接触に先立ち精製される。一部の実施形態では、複合体は、細胞懸濁液において形成される。一部の実施形態では、複合体の分子のうち１種または複数は、細胞懸濁液との接触に先立ち精製される。
一部の実施形態では、細胞懸濁液は、混合細胞集団を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、精製された細胞集団を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、原核細胞または真核細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細菌細胞、古細菌（archael）細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞または動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、脊椎動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、ヒト細胞を含む。
一部の実施形態では、狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含有される。一部の実施形態では、狭窄は、ポアである、またはポア内に含有される。一部の実施形態では、ポアは、表面に含有される。一部の実施形態では、表面は、フィルターである。一部の実施形態では、表面は、膜である。一部の実施形態では、ポアサイズは、約０．４μｍ、約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１１μｍ、約１２μｍ、約１３μｍまたは約１４μｍである。一部の実施形態では、狭窄サイズは、細胞直径の関数である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、細胞直径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である。一部の実施形態では、狭窄は、約３０μｍの長さおよび約３μｍ～約８μｍ（約４、５、６または７μｍのいずれか等）の幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約１０μｍの長さおよび約３μｍ～約８μｍ（約４、５、６または７μｍのいずれか等）の幅を有する。一部の実施形態では、本方法は、細胞懸濁液および複合体を、少なくとも１本の電極によって発生された電場と接触させるステップをさらに含む。
一部の実施形態では、本発明は、２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するためのシステムであって、システムが、狭窄を含むマイクロ流体チャネルと、細胞を含む細胞懸濁液と、２個またはそれよりも多い分子の複合体とを含み、狭窄が、細胞が狭窄を通ることができるように構成されており、狭窄が細胞を変形させ、これにより、２個またはそれよりも多い分子の複合体が細胞に進入するように、細胞の摂動を引き起こす、システムを提供する。他の実施形態では、本発明は、２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するためのシステムであって、システムが、ポアを有する表面と、細胞を含む細胞懸濁液と、２個またはそれよりも多い分子の複合体とを含み、ポアを有する表面が、細胞がポアを通ることができるように構成されており、ポアが細胞を変形させ、これにより、２個またはそれよりも多い分子の複合体が細胞に進入するように、細胞の摂動を引き起こす、システムを提供する。一部の実施形態では、表面は、フィルターまたは膜である。一部の実施形態では、システムは、電場を発生するための少なくとも１本の電極をさらに含む。一部の実施形態では、分子の複合体の形成は、可逆的である。一部の実施形態では、複合体の少なくとも２個またはそれよりも多い分子は、非共有結合性相互作用によって会合する。一部の実施形態では、システムは、本明細書に記載されている方法のいずれかによって、細胞への２個またはそれよりも多い分子を含む複合体を送達するために使用される。
一部の実施形態では、本発明は、２個またはそれよりも多い分子の複合体を含む細胞であって、２個またはそれよりも多い分子の複合体が、本明細書に記載されている方法のいずれかによって細胞へと送達された、細胞を提供する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するための方法であって、細胞懸濁液を狭窄に通すステップを含み、ここで前記狭窄は、前記細胞を変形し、これにより、分子の前記複合体が前記細胞に進入するように、前記細胞の摂動を引き起こし、前記細胞懸濁液が、分子の前記複合体と接触される、方法。
（項目２）
分子の前記複合体の形成が、可逆的である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記複合体の少なくとも２個またはそれよりも多い分子が、非共有結合性相互作用によって会合する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記複合体における少なくとも２個の分子が、約１μＭ～約１ｐＭに及ぶ前記複合体における結合親和性を有する、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記複合体における少なくとも２個の分子が、約１μＭ～約１ｎＭまたは約１ｎＭ～約１ｐＭに及ぶ前記複合体における結合親和性を有する、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記複合体が、前記細胞懸濁液における、約１分間～約４８時間の半減期を有する、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記複合体が、前記細胞懸濁液における、約１分間～約２０分間、約２０分間～約４０分間、約４０分間～約１時間、約１時間～約２時間、約２時間～約６時間、約６時間～約１２時間、約１２時間～約２４時間、約２４時間～約３６時間または約３６時間～約４８時間の半減期を有する、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記複合体が、洗浄剤の存在下で解離する、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記複合体が、約０．１％（ｗ／ｖ）～約１０％（ｗ／ｖ）の濃度の洗浄剤の存在下で解離する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記複合体が、約０．１％（ｗ／ｖ）～約１％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）～約５％（ｗ／ｖ）または約５％（ｗ／ｖ）～約１０％（ｗ／ｖ）の濃度の洗浄剤の存在下で解離する、項目８または９に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞懸濁液が、約０℃～約４０℃に及ぶ温度で分子の前記複合体と接触される、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
分子の前記複合体が、前記細胞懸濁液が分子の前記複合体と接触される前記温度を超える温度で解離する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
分子の前記複合体が、約５０℃～約７０℃の温度で解離する、項目１１または１２に記載の方法。
（項目１４）
分子の前記複合体が、約５０℃～約６０℃または約６０℃～約７０℃の温度で解離する、項目１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞懸濁液が、約５０ｍＭ～約３００ｍＭに及ぶイオン強度で分子の前記複合体と接触される、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
分子の前記複合体が、前記細胞懸濁液が分子の前記複合体と接触される前記イオン強度を超えるイオン強度で解離する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
分子の前記複合体が、約３５０ｍＭ～約１０００ｍＭのイオン強度で解離する、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
分子の前記複合体が、約３５０ｍＭ～約４００ｍＭ、約４００ｍＭ～約５００ｍＭ、約５００ｍＭ～約６００ｍＭ、約７００ｍＭ～約８００ｍＭ、約８００ｍＭ～約９００ｍＭまたは約９００ｍＭ～約１０００ｍＭのイオン強度で解離する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
分子の前記複合体が、前記細胞懸濁液が分子の前記複合体と接触される前記イオン強度に満たないイオン強度で解離する、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
分子の前記複合体が、約０ｍＭ～約５０ｍＭのイオン強度で解離する、項目１５または１９に記載の方法。
（項目２１）
分子の前記複合体が、約０ｍＭ～約１０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭまたは約４０ｍＭ～約５０ｍＭのイオン強度で解離する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞懸濁液が、約１００ｍＯｓｍ／Ｌ～約５００ｍＯｓｍ／Ｌに及ぶ容量オスモル濃度で分子の前記複合体と接触される、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
分子の前記複合体が、前記細胞懸濁液が分子の前記複合体と接触される前記イオン強度を超える容量オスモル濃度で解離する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
分子の前記複合体が、約６００ｍＯｓｍ／Ｌ～約１０００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する、項目２２または２３に記載の方法。
（項目２５）
分子の前記複合体が、約６００ｍＯｓｍ／Ｌ～約７００ｍＯｓｍ／Ｌ、約７００ｍＯｓｍ／Ｌ～約８００ｍＯｓｍ／Ｌ、約８００ｍＯｓｍ／Ｌ～約９００ｍＯｓｍ／Ｌまたは約９００ｍＯｓｍ／Ｌ～約１０００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
分子の前記複合体が、前記細胞懸濁液が分子の前記複合体と接触される前記容量オスモル濃度に満たない容量オスモル濃度で解離する、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
分子の前記複合体が、約０ｍＯｓｍ／Ｌ～約１００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する、項目２２または２６に記載の方法。
（項目２８）
分子の前記複合体が、約０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２０ｍＯｓｍ／Ｌ～約４０ｍＯｓｍ／Ｌ、約４０ｍＯｓｍ／Ｌ～約６０ｍＯｓｍ／Ｌ、約６０ｍＯｓｍ／Ｌ～約８０ｍＯｓｍ／Ｌまたは約８０ｍＯｓｍ／Ｌ～約１００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞懸濁液が、約５．５～約８．５に及ぶｐＨで分子の前記複合体と接触される、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
分子の前記複合体が、前記細胞懸濁液が分子の前記複合体と接触される前記ｐＨを超えるまたはそれを下回るｐＨで解離する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
分子の前記複合体が、約４．０～約５．５のｐＨまたは約８．５～約１０のｐＨで解離する、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３２）
分子の前記複合体が、約４．０～約４．５、約４．５～約５．０、約５．０～約５．５、約８．５～約９．０、約９．０～約９．５または約９．５～約１０．０のｐＨで解離する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞が前記狭窄を通る際の剪断力が、約１ｋＰａ～約１０ｋＰａに及ぶ、項目１から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記複合体が、約１０ｋＰａ～約１００ｋＰａの剪断力で解離する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記複合体が、約１０ｋＰａ～約２５ｋＰａ、約２５ｋＰａ～約５０ｋＰａ、約５０ｋＰａ～約７５ｋＰａまたは約７５ｋＰａ～約１００ｋＰａの剪断力で解離する、項目３３または３４に記載の方法。
（項目３６）
分子の前記複合体が、
ａ）１種もしくは複数のポリペプチド、
ｂ）１種もしくは複数の核酸、
ｃ）１種もしくは複数の脂質、
ｄ）１種もしくは複数の炭水化物、
ｅ）１種もしくは複数の小分子、
ｆ）１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｇ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の核酸、
ｈ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の脂質、
ｉ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の炭水化物、
ｊ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の小分子、
ｋ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｌ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の脂質、
ｍ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の炭水化物、
ｎ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の小分子、
ｏ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｐ）１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、
ｑ）１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、
ｒ）１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｓ）１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ｔ）１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｕ）１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｖ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の脂質、
ｗ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の炭水化物、
ｘ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の小分子、
ｙ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｚ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、
ａａ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、
ａｂ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｃ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ａｄ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｅ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｆ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、
ａｇ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、
ａｈ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｉ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ａｊ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｋ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｌ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ａｍ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｎ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｏ）１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｐ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、
ａｑ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、
ａｒ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｓ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ａｔ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｕ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｖ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ａｗ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｘ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｙ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｚ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ｂａ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｂ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｃ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｄ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｅ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ｂｆ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｇ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｈ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｉ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｊ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、または
ｂｋ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物
を含む、項目１から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記複合体が、抗体を含む、項目１から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記複合体が、１種または複数の転写因子を含む、項目１から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記複合体が、リボソームおよびｍＲＮＡを含む、項目１から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記複合体が、プロテアソーム、ホロ酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、スプライセオソーム、ヴォールト細胞質リボヌクレオタンパク質、核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）、テロメラーゼ、ヌクレオソーム、デスシグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）、哺乳動物ラパマイシン標的複合体１（ｍＴＯＲＣ１）、哺乳動物ラパマイシン標的複合体２（ｍＴＯＲＣ２）またはクラスＩホスホイノシチド３キナーゼ（クラスＩ ＰＩ３Ｋ）、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）、ヒストン－ＤＮＡ複合体、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）－アゴニスト複合体、トランスポサーゼ／トランスポゾン複合体、ｔＲＮＡリボソーム複合体、ポリペプチド－プロテアーゼ複合体または酵素－基質複合体を含む、項目１から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記細胞懸濁液が、前記細胞懸濁液が前記狭窄を通った後に前記複合体と接触される、項目１から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記細胞懸濁液が、前記細胞懸濁液が前記狭窄を通る前に前記複合体と接触される、項目１から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記細胞懸濁液が、前記細胞懸濁液が前記狭窄を通るのと同時に前記複合体と接触される、項目１から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記複合体が、前記細胞懸濁液との接触に先立ち形成される、項目１から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記複合体が、前記細胞懸濁液との接触の約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約１時間、約２時間、約３時間または約６時間前に形成される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記複合体が、前記細胞懸濁液との接触に先立ち精製される、項目１から４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記複合体が、前記細胞懸濁液において形成される、項目４０に記載の方法。
（項目４８）
前記複合体の前記分子の１個または複数が、前記細胞懸濁液との接触に先立ち精製される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記細胞懸濁液が、混合細胞集団を含む、項目１から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記細胞懸濁液が、精製された細胞集団を含む、項目１から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記細胞懸濁液が、原核細胞または真核細胞を含む、項目１から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記細胞懸濁液が、細菌細胞、古細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞または動物細胞を含む、項目１から５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記細胞懸濁液が、脊椎動物細胞を含む、項目１から５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記細胞懸濁液が、哺乳動物細胞を含む、項目１から５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記細胞懸濁液が、ヒト細胞を含む、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含有される、項目１から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記狭窄が、ポアである、またはポア内に含有される、項目１から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記ポアが、表面に含有される、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記表面が、フィルターである、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記表面が、膜である、項目５８に記載の方法。
（項目６１）
前記ポアサイズが、約０．４μｍ、約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１１μｍ、約１２μｍ、約１３μｍまたは約１４μｍである、項目５７から６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記狭窄サイズが、前記細胞の直径の関数である、項目１から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記狭窄サイズが、前記細胞の直径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である、項目１から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記狭窄が、約３０μｍの長さおよび約３μｍ～約８μｍの幅を有する、項目１から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記狭窄が、約１０μｍの長さおよび約３μｍ～約８μｍの幅を有する、項目１から６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記細胞懸濁液および前記複合体を、少なくとも１本の電極によって発生された電場と接触させるステップをさらに含む、項目１から６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するためのシステムであって、前記システムは、狭窄を含むマイクロ流体チャネルと、前記細胞を含む細胞懸濁液と、２個またはそれよりも多い分子の前記複合体とを含み、ここで前記狭窄は、前記細胞が前記狭窄を通ることができるように構成されており、前記狭窄が前記細胞を変形させ、これにより、２個またはそれよりも多い分子の前記複合体が前記細胞に進入するように、前記細胞の摂動を引き起こす、システム。
（項目６８）
２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するためのシステムであって、前記システムは、ポアを有する表面と、前記細胞を含む細胞懸濁液と、２個またはそれよりも多い分子の前記複合体とを含み、ここでポアを有する前記表面は、前記細胞が前記ポアを通ることができるように構成されており、前記ポアが前記細胞を変形させ、これにより、２個またはそれよりも多い分子の前記複合体が前記細胞に進入するように、前記細胞の摂動を引き起こす、システム。
（項目６９）
前記表面が、フィルターまたは膜である、項目６８に記載のシステム。
（項目７０）
電場を発生するための少なくとも１本の電極をさらに含む、項目６７から６９のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７１）
分子の前記複合体の形成が、可逆的である、項目６７から７０のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７２）
前記複合体の少なくとも２個またはそれよりも多い分子が、非共有結合性相互作用によって会合する、項目６７から７１のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７３）
項目１から６６のいずれか一項に記載の方法によって、細胞への２個またはそれよりも多い分子を含む複合体を送達するために使用される、項目６７から７２のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７４）
２個またはそれよりも多い分子の複合体を含む細胞であって、２個またはそれよりも多い分子の前記複合体が、項目１から６６のいずれか一項に記載の方法によって前記細胞に送達された、細胞。
図１Ａは、７μｍ幅狭窄を有するマイクロ流体チップに通すことによる、ＨＥＫ２９３細胞への３ｋＤａ Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅデキストランおよび蛍光標識された抗ＣＡＳ９抗体の送達を実証する代表的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。ＲＮＰ＋Ａｂ：抗ＣＡＳ９抗体／ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ複合体；ＲＮＰ：ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ、抗体：抗ＣＡＳ９抗体；エンドサイトーシス（デバイスなし）：狭窄なしの抗ＣＡＳ９抗体／ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ複合体。 図１Ｂは、３ｋＤａ Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅデキストランおよび蛍光標識された抗ＣＡＳ９抗体に関して陽性である、図１Ａの細胞のパーセンテージの定量化を示す。白色のバー：３ｋＤａ Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅデキストラン；黒色のバー：蛍光標識された抗ＣＡＳ９抗体。
図２Ａは、ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰを含有する機能的複合体の狭窄媒介性送達後６日目のＢ２Ｍノックダウンを実証する、代表的なＦＡＣＳ等高線プロットを示す。ＲＮＰ＋抗体：抗ＣＡＳ９抗体／ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ複合体；ＲＮＰ：ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ、抗体：抗ＣＡＳ９抗体；エンドサイトーシス：狭窄なしの抗ＣＡＳ９抗体／ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ複合体。
図２Ｂは、Ｂ２Ｍのノックダウンを示す、図２Ａの細胞のパーセンテージの定量化を示す。
図３Ａは、７μｍ幅狭窄を有するマイクロ流体チップに通すことによる、ＨｅＬａ細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０標識された３ｋＤａデキストラン、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識されたストレプトアビジンおよびＦＩＴＣ標識されたビオチンの送達を実証する、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。Ｓ－Ｂ複合体（１：１）ＮＣ：ビオチン：ストレプトアビジン、１：１モル比、狭窄媒介性送達に先立つプレインキュベーションなし；Ｓ－Ｂ複合体（８：１）：ビオチン：ストレプトアビジン複合体、８：１モル比；Ｓ－Ｂ複合体（４：１）：ビオチン：ストレプトアビジン複合体、４：１モル比；Ｓ－Ｂ複合体（１：１）：ビオチン：ストレプトアビジン複合体、１：１モル比；ビオチン（８当量）：ビオチン単独、１６μＭ；ビオチン（４当量）：ビオチン単独、８μＭ；ビオチン（１当量）：ビオチン単独、２μＭ；ストレプトアビジン：ストレプトアビジン単独、２μＭ；エンドサイトーシス（デバイスなし）：ビオチン：ストレプトアビジン複合体、１：１モル比、狭窄なし。 図３Ａは、７μｍ幅狭窄を有するマイクロ流体チップに通すことによる、ＨｅＬａ細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０標識された３ｋＤａデキストラン、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識されたストレプトアビジンおよびＦＩＴＣ標識されたビオチンの送達を実証する、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。Ｓ－Ｂ複合体（１：１）ＮＣ：ビオチン：ストレプトアビジン、１：１モル比、狭窄媒介性送達に先立つプレインキュベーションなし；Ｓ－Ｂ複合体（８：１）：ビオチン：ストレプトアビジン複合体、８：１モル比；Ｓ－Ｂ複合体（４：１）：ビオチン：ストレプトアビジン複合体、４：１モル比；Ｓ－Ｂ複合体（１：１）：ビオチン：ストレプトアビジン複合体、１：１モル比；ビオチン（８当量）：ビオチン単独、１６μＭ；ビオチン（４当量）：ビオチン単独、８μＭ；ビオチン（１当量）：ビオチン単独、２μＭ；ストレプトアビジン：ストレプトアビジン単独、２μＭ；エンドサイトーシス（デバイスなし）：ビオチン：ストレプトアビジン複合体、１：１モル比、狭窄なし。
図３Ｂは、３ｋＤａ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストラン、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識されたストレプトアビジンまたはＦＩＴＣ標識されたビオチンに関して陽性である、図３Ａの細胞のパーセンテージの定量化を示す。 図３Ｂは、３ｋＤａ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストラン、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識されたストレプトアビジンまたはＦＩＴＣ標識されたビオチンに関して陽性である、図３Ａの細胞のパーセンテージの定量化を示す。 図３Ｂは、３ｋＤａ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストラン、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識されたストレプトアビジンまたはＦＩＴＣ標識されたビオチンに関して陽性である、図３Ａの細胞のパーセンテージの定量化を示す。
図３Ｃは、図３Ａの細胞の代表的なＦＡＣＳ等高線プロットを示す。
図３Ｃは、図３Ａの細胞の代表的なＦＡＣＳ等高線プロットを示す。
図３Ｃは、図３Ａの細胞の代表的なＦＡＣＳ等高線プロットを示す。
図４Ａは、７μｍ幅狭窄を有するマイクロ流体チップに通すことによる、ＨｅＬａ細胞への３ｋＤａ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストランおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識されたストレプトアビジンの送達を実証する、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。ＳＡ＋Ｂ－Ｐｈａｌｌ：ストレプトアビジンおよびファロイジンコンジュゲートされたビオチンを含有する複合体；ＳＡ：ストレプトアビジン単独；Ｂ－Ｐｈａｌｌ：ファロイジンコンジュゲートされたビオチン単独；エンドサイトーシス（デバイスなし）：狭窄なしの、ストレプトアビジンおよびファロイジンコンジュゲートされたビオチンを含有する複合体。図４Ｂは、３ｋＤａ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストランおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識されたストレプトアビジンに関して陽性である、図４Ａの細胞のパーセンテージの定量化を示す。白色のバー：３ｋＤａ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストラン；灰色のバー：Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識されたストレプトアビジン。
図５は、３ｋＤａ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストラン送達およびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識されたストレプトアビジン送達の間の相関を実証する、図４Ａの細胞の代表的なＦＡＣＳプロットを示す。
図６Ａ～図６Ｄは、３μｍ幅狭窄を有するマイクロ流体チップに通すことによる、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離されたＴ細胞への、ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＳＬＰ単独（複合体形成されていないＥ７ ＳＬＰ）またはＨＰＶ１６ Ｅ７ ＳＬＰおよびマウス血清アルブミンを含有する複合体（複合体形成されたＥ７ ＳＬＰ／ＭＳＡ）と組み合わせた３ｋＤａ－Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅデキストランの送達の結果（図６Ａおよび図６Ｃ）、ならびに結果としての細胞生存率（図６Ｂおよび図６Ｄ）を示す。ＳＱＺ：狭窄あり；Ｅｎｄｏ：狭窄なし。
図７は、図６Ａおよび図６Ｃの細胞の代表的なＦＡＣＳヒストグラムプロットを示す。
図８は、図６Ａおよび図６ＣのＴ細胞がマウスに導入して戻されてから６日後にテトラマー染色によって測定される、内因性ＣＤ８ Ｔ細胞応答を示す。ＮＣ：抗原がない陰性対照Ｔ細胞；Ｅｎｄｏ：狭窄なしのＨＰＶ１６ Ｅ７ ＳＬＰ単独；Ｅｎｄｏ＋ＭＳＡ：狭窄なしの、ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＳＬＰおよびＭＳＡを含有する複合体；ＳＱＺ：狭窄ありのＨＰＶ１６ Ｅ７ ＳＬＰ単独；ＳＱＺ＋ＭＳＡ：狭窄ありの、ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＳＬＰおよびＭＳＡを含有する複合体。
本発明は、２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するための方法であって、細胞懸濁液を狭窄に通すステップを含み、前記狭窄が細胞を変形し、これにより、分子の複合体が細胞に進入するように、細胞の摂動を引き起こし、前記細胞懸濁液が、分子の複合体と接触される、方法を提供する。一部の実施形態では、複合体は、一過性の、可逆的な複合体である。一部の実施形態では、複合体は、非共有結合性相互作用によって一体に保持された構成成分の化合物を含む。一部の実施形態では、狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含有される。一部の実施形態では、狭窄は、ポアである、またはポア内に含有される。一部の実施形態では、ポアは、表面に含有される。一部の実施形態では、表面は、フィルターである。一部の実施形態では、表面は、膜である。
Ｉ．一般技法
本明細書に記載または参照されている技法および手順は、一般に、十分に理解されており、当業者によって従来の方法論を使用して一般的に用いられており、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Sambrookら、第４版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、２０１２年）；Current Protocols in Molecular Biology（F.M. Ausubelら編、２００３年）；Methods in Enzymologyシリーズ（Academic Press,Inc.）；PCR 2: A Practical Approach（M.J. MacPherson、B.D. HamesおよびG.R. Taylor編、１９９５年）；Antibodies, A Laboratory Manual（HarlowおよびLane編、１９８８年）；Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications（R.I. Freshney、第６版、J. Wiley and Sons、２０１０年）；Oligonucleotide Synthesis（M.J. Gait編、１９８４年）；Methods in Molecular Biology、Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook（J.E. Cellis編、Academic Press、１９９８年）；Introduction to Cell and Tissue Culture（J.P. MatherおよびP.E. Roberts、Plenum Press、１９９８年）；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures（A. Doyle、J.B. GriffithsおよびD.G. Newell編、J. Wiley and Sons、１９９３～８年）；Handbook of Experimental Immunology（D.M. WeirおよびC.C. Blackwell編、１９９６年）；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（J.M. MillerおよびM.P. Calos編、１９８７年）；PCR: The Polymerase Chain Reaction（Mullisら編、１９９４年）；Current Protocols in Immunology（J.E. Coliganら編、１９９１年）；Short Protocols in Molecular Biology（Ausubelら編、J. Wiley and Sons、２００２年）；Immunobiology（C.A. Janewayら、２００４年）；Antibodies（P. Finch、１９９７年）；Antibodies: A PracticalApproach（D. Catty.編、IRL Press、１９８８～１９８９年）；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach（P. ShepherdおよびC. Dean編、Oxford University Press、２０００年）；Using Antibodies: A Laboratory Manual（E. HarlowおよびD. Lane、Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９９９年）；The Antibodies（M. ZanettiおよびJ. D. Capra編、Harwood Academic Publishers、１９９５年）；およびCancer: Principles and Practice of Oncology（V.T. DeVitaら編、J.B. Lippincott Company、２０１１年）に記載されている広く利用されている方法論等が挙げられる。
ＩＩ．定義
本明細書を解釈する目的のため、次の定義が適用され、適切な場合は常に、単数形で使用されている用語は、複数形も含み、逆もまた同じとなるであろう。下に表明されているいずれの定義も、参照により本明細書に組み込むいずれかの文書と矛盾する場合には、表明されている定義が優先されるものとする。
本明細書において、単数形態である「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、別段の指示がない限り、複数形の参照を含む。
本明細書に記載されている本開示の態様および実施形態が、「を含む」、「からなる」および「から本質的になる」態様および実施形態を含むことが理解される。
本明細書に記載されているあらゆる組成物に関して、また、本明細書に記載されている組成物を使用するあらゆる方法に関して、組成物は、収載されている構成成分もしくはステップを含むことができる、または収載されている構成成分もしくはステップ「から本質的になる」ことができる、のいずれかであり得る。組成物が、収載されている構成成分「から本質的になる」として記載されている場合、この組成物は、収載されている構成成分を含有し、開示されている方法に実質的に影響を与えない他の構成成分を含有することができるが、明確に収載されている構成成分以外の、開示されている方法に実質的に影響を与える他のいずれかの構成成分を含有しない；あるいは、組成物が、開示されている方法に実質的に影響を与える、収載されている以外の余分な構成成分を含有する場合、この組成物は、開示されている方法に実質的に影響を与えるのに十分な濃度または量の余分な構成成分を含有しない。方法が、収載されているステップ「から本質的になる」として記載されている場合、この方法は、収載されているステップを含有し、開示されている方法に実質的に影響を与えない他のステップを含有することができるが、この方法は、明確に収載されているステップ以外の、開示されている方法に実質的に影響を与える他のいずれかのステップを含有しない。非限定的な具体例として、組成物が、ある構成成分「から本質的になる」として記載されている場合、この組成物は、開示されている方法に実質的に影響を与えない、いずれかの量の薬学的に許容される担体、ビヒクルまたは希釈剤および他の斯かる構成成分をその上含有することができる。
用語「約」は、本明細書において、本技術分野の当業者にとって容易に公知となる、それぞれの値に関する通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」ある値またはパラメータの参照は、当該の値またはパラメータそれ自体を対象にする実施形態を含む（および記載する）。
用語「複合体」は、本明細書において、非共有結合性結合による２個またはそれよりも多い分子、種または化合物の化学会合を指す。２個またはそれよりも多い分子は、例えば、限定することなく、弱い静電結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用等によって接合される。一部の例では、複合体は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、小分子および／または金属含有化合物を限定することなく含む、いくつかの異なる化合物で構成され得る。
用語「ポリペプチド複合体」および「タンパク質複合体」は、結合パートナーとポリペプチドとの特異的結合から生じる複合単位を指し、前記結合パートナーは、前記ポリペプチド複合体を形成するための、１個もしくは複数のポリペプチド、１個もしくは複数の核酸、または１個もしくは複数のポリペプチドおよび１個もしくは複数の核酸の組合せ、その他であり得る。ポリペプチド複合体は、ポリペプチド－ポリペプチド複合体、ポリペプチド－核酸複合体、その他であり得る。ある特定の実施形態では、ポリペプチド複合体は、ポリペプチド－ポリペプチド相互作用、例えば、異なるポリペプチド間、または同じポリペプチドのダイマー、トリマー、テトラマーもしくはより高次のオリゴマーの間の相互作用を含むことができる。ポリペプチド複合体（例えば、２個以上のポリペプチドを含む、ポリペプチド－ポリペプチド複合体またはポリペプチド－核酸複合体における）のサブユニット間のまたはポリペプチドおよび核酸（例えば、ポリペプチド－核酸複合体における）の間の相互作用は通常、水素架橋、（任意選択でコンジュゲートされた）Ｃ－－Ｃ二重結合等のパイ電子系または芳香環、例えば、フェニルおよび芳香族複素環、例えば、ピロール、イミダゾール、インドール、ピリミジンまたはプリン環に起因する相互作用等、非結合相互作用、ならびに金属原子および酸素、窒素または硫黄原子の間の相互作用であるが、弱い、特に、可逆的な共有結合性結合相互作用、例えば、硫黄－硫黄架橋となることもできる。
「ポリペプチド－ポリペプチド」または「タンパク質－タンパク質複合体」は、ポリペプチド間の相互作用によって形成された２個またはそれよりも多いポリペプチドの組合せである複合単位を指す。典型的には、ただし必ずしもそうではないが、「ポリペプチド複合体」は、特異的非共有結合性結合親和性による、２個またはそれよりも多いポリペプチドの一体的な結合によって形成される。
用語「狭窄」は、本明細書において、狭められた通路を指す。一部の例では、狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含有される。他の例では、狭窄は、ポアである、またはポア内に含有される。一部の例では、狭窄がポアである場合、ポアは、表面に含有される。
用語「ポア」は、本明細書において、材料内の孔、裂け目、空洞、開口部、割れ目、間隙または穿孔を限定することなく含む、開口を指す。一部の例では、（指し示されている場合）この用語は、本開示の表面内のポアを指す。他の例では、（指し示されている場合）ポアは、細胞壁および／または細胞膜におけるポアを指すことができる。
用語「膜」は、本明細書において、ポアを含有する選択的な障壁またはシートを指す。この用語は、境界または裏打ちとして作用する柔軟なシート状構造を含む。一部の例では、この用語は、ポアを含有する表面またはフィルターを指す。この用語は、用語「細胞膜」とは別個のものである。
用語「フィルター」は、本明細書において、ポアを通した選択的な通過を可能にする多孔性物品を指す。一部の例では、この用語は、ポアを含有する表面または膜を指す。
用語「不均一」は、本明細書において、構造または組成が混合していることまたは均一でないことを指す。一部の例では、この用語は、所与の表面内で変動的なサイズ、形状または分布を有するポアを指す。
用語「均質」は、本明細書において、全体にわたって構造または組成が一貫していることまたは均一であることを指す。一部の例では、この用語は、所与の表面内で一貫したサイズ、形状または分布を有するポアを指す。
用語「異種」は、本明細書において、異なる生物に由来する分子を指す。一部の例では、この用語は、所与の生物内で通常見出されないまたは発現されない核酸またはポリペプチドを指す。
用語「同種（homologous）」は、本明細書において、同じ生物に由来する分子を指す。一部の例では、この用語は、所与の生物内で通常見出されるまたは発現される核酸またはポリペプチドを指す。
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書において、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、いずれかの長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。よって、この用語は、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基または他の天然の、化学もしくは生化学修飾された、非天然のまたは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（ＲＮＡまたはＤＮＡに典型的に見出され得る通りの）、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホルアミデート等、合成サブユニットのポリマーを含むことができるため、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート（Ｐ－ＮＨ２）または混合されたホスホルアミデート－ホスホジエステルオリゴマーであり得る。加えて、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖の合成および適切な条件下での鎖のアニーリング、またはＤＮＡポリメラーゼと適切なプライマーを使用した相補鎖のｄｅ ｎｏｖｏ合成のいずれかにより、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用されており、最小の長さに限定されない。アミノ酸残基の斯かるポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有することができ、そのようなものとしては、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基のダイマー、トリマーおよびマルチマーが挙げられるがこれらに限定されない。全長タンパク質およびその断片の両方が、この定義によって包含される。この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化その他も含む。さらに、本発明の目的のため、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限りにおいて、ネイティブ配列に対する欠失、付加および置換（天然では一般に保存的）等の修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的変異誘発によるような計画的であっても、タンパク質を産生する宿主の変異またはＰＣＲ増幅によるエラーによる等、偶発的であってもよい。
本明細書に記載されている構造的および機能的特徴のいずれかに関して、これらの特徴を決定する方法は、本技術分野で公知である。
ＩＩＩ．送達するための複合体
ある特定の態様では、本開示は、複合体を細胞へと送達するための方法に関する。一部の実施形態では、複合体は、単一の複合体である。一部の実施形態では、複合体は、複合体の混合物である。一部の実施形態では、複合体または複合体の混合物を細胞へと送達して、所望の効果を得る。
一部の実施形態では、複合体は、一過性の、可逆的な複合体である。一部の実施形態では、複合体は、非共有結合性相互作用によって一体に保持された構成成分の化合物を含む。一部の実施形態では、複合体が、細胞の内側に入ると所望の機能を果たすように、複合体は、複合体がインタクトなままとなる条件下で細胞へと送達される。一部の実施形態では、非共有結合性相互作用は、複合体が細胞へと送達されると解離することを可能にし、別々の複合体構成成分が、細胞の内側に入ると所望の機能を果たすことを可能にする。
下に概要を述べる通り、１種または複数のパラメータを使用して、本発明の方法によって細胞へと送達される２個またはそれよりも多い分子の複合体を特徴付けることができる。
一部の実施形態では、複合体における少なくとも２個の分子は、約１μＭ～約１ｐＭに及ぶ複合体における結合親和性を有する。一部の実施形態では、複合体における少なくとも２個の分子は、約１μＭ～約１０μＭ、約１０μＭ～約１００μＭ、約１００μＭ～約１ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１００ｎＭまたは約１００ｎＭ～約１ｐＭのうちのいずれか１つに及ぶ複合体における結合親和性を有する。
一部の実施形態では、本発明の複合体は、生理的条件下で、約１分間～約４８時間超の半減期を有する。一部の実施形態では、複合体は、細胞懸濁液における、約１分間～約４８時間超の半減期を有する。一部の実施形態では、複合体は、細胞懸濁液における、約１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間または６０分間のいずれかを超える半減期を有する。一部の実施形態では、複合体は、細胞懸濁液における、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間または４８時間のいずれかを超える半減期を有する。一部の実施形態では、複合体は、細胞懸濁液における、約１分間～約２０分間、約２０分間～約４０分間、約４０分間～約１時間、約１時間～約２時間、約２時間～約６時間、約６時間～約１２時間、約１２時間～約２４時間、約２４時間～約３６時間または約３６時間～約４８時間の半減期を有する。一部の実施形態では、複合体は、細胞における、約１分間～約４８時間超の半減期を有する。一部の実施形態では、複合体は、細胞懸濁液における、約１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間または６０分間のいずれかを超える半減期を有する。一部の実施形態では、複合体は、細胞における、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間または４８時間のいずれかを超える半減期を有する。一部の実施形態では、複合体は、細胞における、約１分間～約２０分間、約２０分間～約４０分間、約４０分間～約１時間、約１時間～約２時間、約２時間～約６時間、約６時間～約１２時間、約１２時間～約２４時間、約２４時間～約３６時間または約３６時間～約４８時間の半減期を有する。
本発明の一部の実施形態では、２個またはそれよりも多い分子の複合体は、複合体の分子の会合によって、または複合体の解離をもたらすパラメータによって特徴付けされる。一部の実施形態では、解離された複合体は、複合体における２個またはそれよりも多い分子の会合が崩壊された複合体である。一部の実施形態では、解離された複合体は、複合体のうちの約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のいずれかを超えた割合が、複合体における２個またはそれよりも多い分子の会合の崩壊を含む複合体である。
一部の実施形態では、複合体は、洗浄剤、界面活性剤、有機溶媒、カオトロピック剤の存在下で解離する。洗浄剤および界面活性剤の例として、ポリソルベート、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＣＨＡＰＳ、ポロクサマー、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＮＰ－４０が挙げられるがこれらに限定されない。有機溶媒の例として、エタノール、プロパノール、ブタノール、酢酸、ギ酸、ジクロロメタン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルおよびジメチルスルホキシドが挙げられるがこれらに限定されない。カオトロピック剤の例として、ブタノール、エタノール、塩化グアニジウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、プロパノール、ＳＤＳ、チオ尿素および尿素が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本発明の複合体は、約０．１％～約１０％の濃度の洗浄剤の存在下で解離する。一部の実施形態では、本発明の複合体は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、６．０％、７．０％、８．０％、９．０％または１０．０％のいずれかを超える濃度の洗浄剤の存在下で解離する。一部の実施形態では、複合体は、約０．１％～約０．２％、約０．２％～約０．３％、約０．３％～約０．４％、約０．４％～約０．５％、約０．５％～約０．６％、約０．６％～約０．７％、約０．７％～約０．８％、約０．８％～約０．９％、約０．９％～約１．０％、約１．０％～約２．０％、約２．０％～約３．０％、約３．０％～約４．０％、約４．０％～約５．０％、約５．０％～約６．０％、約６．０％～約７．０％、約０７．０％～約８．０％、約８．０％～約９．０％または約９．０％～約１０．０％の濃度の洗浄剤の存在下で解離する。一部の実施形態では、洗浄剤または界面活性剤は、細胞懸濁液に添加されて；例えば、マイクロチャネルまたはポアの目詰まりを防止する。一部の実施形態では、洗浄剤または界面活性剤は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の実質的な解離をもたらさない濃度で細胞懸濁液に添加される。一部の実施形態では、洗浄剤または界面活性剤は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％未満の解離をもたらす濃度で細胞懸濁液に添加される。
一部の実施形態では、２個またはそれよりも多い分子の複合体は、上昇した温度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、細胞懸濁液が分子の複合体と接触される温度を超える温度で、細胞懸濁液において解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離する温度に満たない温度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離する温度よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％低い温度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、約０℃～約４０℃に及ぶ温度で分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、分子の複合体は、約５０℃～約７０℃の温度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約５０℃～約６０℃または約６０℃～約７０℃の温度で解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の実質的な解離をもたらさない温度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％未満の解離をもたらす温度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。
一部の実施形態では、２個またはそれよりも多い分子の複合体は、上昇したイオン強度で、細胞懸濁液において解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、細胞懸濁液が分子の複合体と接触されるイオン強度を超えるイオン強度で、細胞懸濁液において解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離するイオン強度に満たないイオン強度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離するイオン強度よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％低いイオン強度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、約５０ｍＭ～約３００ｍＭに及ぶイオン強度で分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、分子の複合体は、約３５０ｍＭ～約１０００ｍＭのイオン強度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約３５０ｍＭ～約４００ｍＭ、約４００ｍＭ～約５００ｍＭ、約５００ｍＭ～約６００ｍＭ、約７００ｍＭ～約８００ｍＭ、約８００ｍＭ～約９００ｍＭまたは約９００ｍＭ～約１０００ｍＭのイオン強度で解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の実質的な解離をもたらさないイオン強度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％未満の解離をもたらすイオン強度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。
一部の実施形態では、２個またはそれよりも多い分子の複合体は、減少したイオン強度で、細胞懸濁液において解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、細胞懸濁液が分子の複合体と接触されるイオン強度に満たないイオン強度で、細胞懸濁液において解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離するイオン強度を超えるイオン強度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離するイオン強度よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％大きいイオン強度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、約５０ｍＭ～約３００ｍＭに及ぶイオン強度で分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、分子の複合体は、約０ｍＭ～約５０ｍＭのイオン強度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約０ｍＭ～約１０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭまたは約４０ｍＭ～約５０ｍＭのイオン強度で解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の実質的な解離をもたらさないイオン強度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％未満の解離をもたらすイオン強度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。
一部の実施形態では、２個またはそれよりも多い分子の複合体は、上昇した容量オスモル濃度で、細胞懸濁液において解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、細胞懸濁液が分子の複合体と接触される容量オスモル濃度を超える容量オスモル濃度で、細胞懸濁液において解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離する容量オスモル濃度に満たない容量オスモル濃度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離する容量オスモル濃度よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％低い容量オスモル濃度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、約１００ｍＯｓｍ／Ｌ～約５００ｍＯｓｍ／Ｌに及ぶ容量オスモル濃度で分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、分子の複合体は、約６００ｍＯｓｍ／Ｌ～約１０００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約６００ｍＯｓｍ／Ｌ～約７００ｍＯｓｍ／Ｌ、約７００ｍＯｓｍ／Ｌ～約８００ｍＯｓｍ／Ｌ、約８００ｍＯｓｍ／Ｌ～約９００ｍＯｓｍ／Ｌまたは約９００ｍＯｓｍ／Ｌ～約１０００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の実質的な解離をもたらさない容量オスモル濃度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％未満の解離をもたらす容量オスモル濃度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。
一部の実施形態では、２個またはそれよりも多い分子の複合体は、減少した容量オスモル濃度で、細胞懸濁液において解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、細胞懸濁液が分子の複合体と接触される容量オスモル濃度に満たない容量オスモル濃度で、細胞懸濁液において解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離する容量オスモル濃度を超える容量オスモル濃度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離する容量オスモル濃度よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％大きい容量オスモル濃度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、約１００ｍＯｓｍ／Ｌ～約５００ｍＯｓｍ／Ｌに及ぶ容量オスモル濃度で分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、分子の複合体は、約０ｍＯｓｍ／Ｌ～約１００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２０ｍＯｓｍ／Ｌ～約４０ｍＯｓｍ／Ｌ、約４０ｍＯｓｍ／Ｌ～約６０ｍＯｓｍ／Ｌ、約６０ｍＯｓｍ／Ｌ～約８０ｍＯｓｍ／Ｌまたは約８０ｍＯｓｍ／Ｌ～約１００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の実質的な解離をもたらさない容量オスモル濃度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％未満の解離をもたらす容量オスモル濃度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。
一部の実施形態では、２個またはそれよりも多い分子の複合体は、上昇したｐＨで解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、細胞懸濁液が分子の複合体と接触されるｐＨを超えるｐＨで、細胞懸濁液において解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離するｐＨに満たないｐＨで、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離するｐＨよりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％低いｐＨで、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、約５．５～約８．５に及ぶｐＨで、分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、分子の複合体は、約８．５～約１０のｐＨで解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約８．５～約９．０、約９．０～約９．５、約９．５～約１０．０、約１０．００～約１１．０または約１１．０～約１２．０のｐＨで解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の実質的な解離をもたらさないｐＨで、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％未満の解離をもたらすｐＨで、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。
一部の実施形態では、２個またはそれよりも多い分子の複合体は、低減したｐＨで解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、細胞懸濁液が分子の複合体と接触されるｐＨに満たないｐＨで、細胞懸濁液において解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離するｐＨを超えるｐＨで、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離するｐＨよりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％大きいｐＨで、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、約５．５～約８．５に及ぶｐＨで、分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、分子の複合体は、約４．０～約５．５のｐＨで解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、約２．０～約３．０、約３．５～約４．０、約４．０～約４．５、約４．５～約５．０、約５．０～約５．５のｐＨで解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の実質的な解離をもたらさないｐＨで、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％未満の解離をもたらすｐＨで、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。
一部の実施形態では、本発明は、細胞を含有する細胞懸濁液が狭窄に通され、これが細胞を摂動して、複合体が細胞に進入することを可能にする、２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するための方法を提供する。細胞懸濁液が狭窄を通る際に、細胞懸濁液は、剪断力に曝され得る。一部の実施形態では、２個またはそれよりも多い分子の複合体は、上昇した剪断力下で解離する。一部の実施形態では、分子の複合体は、細胞懸濁液が分子の複合体と接触される剪断力よりも大きい剪断力で、細胞懸濁液において解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離する剪断力に満たない剪断力で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液において複合体が解離する剪断力よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％低い剪断力で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、約１ｋＰａ～約１０ｋＰａに及ぶ剪断力で、分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、複合体は、約１０ｋＰａ～約１００ｋＰａの剪断力で解離する。一部の実施形態では、複合体は、約１０ｋＰａ～約２５ｋＰａ、約２５ｋＰａ～約５０ｋＰａ、約５０ｋＰａ～約７５ｋＰａまたは約７５ｋＰａ～約１００ｋＰａの剪断力で解離する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の実質的な解離をもたらさない剪断力で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％未満の解離をもたらす剪断力で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液が狭窄を通った後で、細胞懸濁液を、２個またはそれよりも多い分子を含む複合体と接触させて、複合体に対する剪断力の効果を低下させる。
２個またはそれよりも多い分子の複合体がインタクトであるか否かを決定するための方法は、本技術分野で公知であり、そのようなものとしては、高速液体クロマトグラフィー（特に、サイズ排除クロマトグラフィー）、非変性ゲル電気泳動、イムノアッセイ、質量分析、機能アッセイ、２個のフルオロフォアを有する複合体が近接しているか否かを決定するための共鳴エネルギー移動に基づくアッセイ（例えば、ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴ）、組織化学および免疫組織化学が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液が狭窄を通った後に複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液が狭窄を通る前に複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞懸濁液が狭窄を通るのと同時に複合体と接触される。一部の実施形態では、複合体は、細胞懸濁液との接触に先立ち形成される。一部の実施形態では、複合体は、細胞懸濁液との接触の約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約１時間、約２時間、約３時間または約６時間前に形成される。一部の実施形態では、複合体は、細胞懸濁液との接触の約６時間超前に形成される。一部の実施形態では、複合体は、細胞への進入に先立ち、細胞懸濁液において形成される。
本発明は、細胞を含有する細胞懸濁液が狭窄を通され、これが細胞を摂動して、複合体が細胞に進入することを可能にする、２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するための方法を提供する。一部の実施形態では、分子の複合体は、ａ）１種もしくは複数のポリペプチド、ｂ）１種もしくは複数の核酸、ｃ）１種もしくは複数の脂質、ｄ）１種もしくは複数の炭水化物、ｅ）１種もしくは複数の小分子、ｆ）１種もしくは複数の金属含有化合物、ｇ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の核酸、ｈ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の脂質、ｉ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の炭水化物、ｊ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の小分子、ｋ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の金属含有化合物、ｌ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の脂質、ｍ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の炭水化物、ｎ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の小分子、ｏ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｐ）１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、ｑ）１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、ｒ）１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｓ）１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ｔ）１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｕ）１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｖ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の脂質、ｗ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の炭水化物、ｘ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の小分子、ｙ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｚ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、ａａ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、ａｂ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｃ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ａｄ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｅ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｆ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、ａｇ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、ａｈ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｉ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ａｊ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｋ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｌ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ａｍ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｎ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｏ）１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｐ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、ａｑ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、ａｒ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｓ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ａｔ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｕ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｖ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ａｗ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｘ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｙ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ａｚ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ｂａ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｂ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｃ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｄ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｅ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、ｂｆ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｇ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｈ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｉ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、ｂｊ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、またはｂｋ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物を含む。
一部の実施形態では、複合体は、ポリペプチド－核酸複合体である。一部の実施形態では、ポリペプチド－核酸複合体は、静電気引力によりポリペプチドと複合体形成された核酸分子；ポリペプチドに巻き付いた核酸分子；ＤＮＡおよびヒストン（ヌクレオソーム）；リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）；リボソーム；酵素テロメラーゼ；ヴォールトリボヌクレオタンパク質；リボヌクレアーゼＰ（ＲＮａｓｅ Ｐ）；不均一リボヌクレオタンパク質粒子（ｈｎＲＮＰ）；核内低分子ＲＮＰ（ｓｎＲＮＰ）；またはタンパク質を含む染色体を含む。
本主題は、プロテアソーム、ホロ酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、スプライセオソーム、ヴォールト細胞質リボヌクレオタンパク質、核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）、テロメラーゼ、ヌクレオソーム、デスシグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）、哺乳動物ラパマイシン標的複合体１（ｍＴＯＲＣ１）、哺乳動物ラパマイシン標的複合体２（ｍＴＯＲＣ２）またはクラスＩホスホイノシチド３キナーゼ（クラスＩ ＰＩ３Ｋ）、ヒストン－ＤＮＡ複合体、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）－アゴニスト複合体、トランスポサーゼ／トランスポゾン複合体、ｔＲＮＡリボソーム複合体、ポリペプチド－プロテアーゼ複合体または酵素－基質複合体を含む、幅広い種類のポリペプチド－複合体の細胞への送達に有用である。
一部の実施形態では、リボヌクレオタンパク質複合体は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）である。ＲＩＳＣは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の重要なメディエーターである、触媒活性タンパク質－ＲＮＡ複合体である。ＲＩＳＣは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）断片の鎖を取り込む。鎖は、ＲＩＳＣの鋳型として作用して、相補的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物を認識する。ＲＩＳＣのタンパク質構成成分であるアルゴノートはその後、ｍＲＮＡを活性化および切断する。
一部の実施形態では、リボヌクレオタンパク質複合体は、リボソームである。リボソームは、リボソーム小サブユニットおよびリボソーム大サブユニットからなり、各サブユニットは、１個または複数のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子および種々のタンパク質で構成されている。まとめると、リボソーム複合体は、ｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳を媒介する。一部の実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡの改善された翻訳の方法であって、細胞懸濁液を狭窄に通し、これにより、ｍＲＮＡおよびリボソームを含む複合体の取り込みを可能にするステップを含み、細胞懸濁液の狭窄通過の前、最中または後に、細胞懸濁液が、ｍＲＮＡ－リボソーム複合体と接触される、方法を提供する。一部の態様では、細胞へのｍＲＮＡ単独の送達と比較して、ｍＲＮＡ－リボソーム複合体による翻訳は、改善される（例えば、より迅速に翻訳される、またはより優れた程度まで翻訳される）。
一部の実施形態では、複合体は、標的ＤＮＡに結合されたトランスポサーゼである。一部の実施形態では、トランスポサーゼ酵素－標的ＤＮＡ複合体を送達して、細胞への標的ＤＮＡの核酸組み込みを媒介する。
一部の実施形態では、複合体は、転写因子複合体である。一部の実施形態では、転写因子複合体は、遺伝子転写のモジュレートに必要なタンパク質およびＲＮＡポリメラーゼの大型の複合体である、開始前複合体に結合された転写因子からなる。
複合体における使用のための例示的なタンパク質またはポリペプチドは、治療用タンパク質、抗体、増殖因子または誘導因子、融合タンパク質、抗原、合成タンパク質、レポーターマーカーまたは選択可能マーカーを限定することなく含む。
一部の実施形態では、ポリペプチド－核酸複合体は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ９の複合体ではない（例えば、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡの複合体ではない）。一部の実施形態では、２個またはそれよりも多い分子の複合体は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼまたはＣＲＥリコンビナーゼから選択される、遺伝子編集に使用される複合体ではない。
一部の実施形態では、複合体における使用のためのポリペプチドは、レポーターまたは選択可能マーカーである。例示的なレポーターマーカーは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、エクオリン（auquorin）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ウロポルフィリノーゲン（ｕｒｏｇｅｎ）ＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ＵＭＴ）およびルシフェラーゼを限定することなく含む。例示的な選択可能マーカーは、ブラストサイジン、Ｇ４１８／ジェネテシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン（Zeocin）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびチミジンキナーゼを限定することなく含む。
一部の実施形態では、複合体における使用のためのポリペプチドは、ビオチンに対し高い親和性を有するストレプトアビジンまたはそのバリアント等、高親和性結合ペアのメンバーである。ポリペプチドメンバーを含む高親和性結合ペアは、本技術分野で周知であり、いずれかの斯かるポリペプチドは、本明細書に記載されている組成物および方法における使用に企図される。
一部の実施形態では、複合体における使用のためのポリペプチドは、抗原、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原等の疾患関連抗原である。一部の実施形態では、抗原は、全長（またはプロセシングされていない）タンパク質抗原の全体、例えば、７、８、９または１０アミノ酸の長さを越えるタンパク質またはペプチドを含む。一部の実施形態では、抗原は、ＭＨＣ制限タンパク質断片、例えば、ＭＨＣ分子と会合して、ペプチド／ＭＨＣ複合体を形成することができるペプチド等、タンパク質断片である。例示的な抗原は、例えば、ＨＰＶ１６ Ｅ７合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）を含む。
一部の実施形態では、複合体は、担体タンパク質と会合した抗原を含む。適した担体タンパク質の例として、血液または血漿中に通常見出されるタンパク質が挙げられ、そのようなものとしては、アルブミン、ＩｇＡを含む免疫グロブリン、リポタンパク質、アポリポタンパク質Ｂ、α－酸性糖タンパク質、β－２－マクログロブリン、サイログロブリン、トランスフェリン、フィブロネクチン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、その他が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、担体タンパク質は、カゼイン、α－ラクトアルブミンまたはβ－ラクトグロブリン等、非血液タンパク質である。担体タンパク質は、天然起源または合成により調製されたもののいずれかであり得る。一部の実施形態では、担体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）等、アルブミンを含む。ウシ血清アルブミン等、他のアルブミンが企図される。斯かる非ヒトアルブミンの使用は、例えば、獣医学的動物（飼育ペット（domestic pet）および農業用動物を含む）等、非ヒト哺乳動物における使用の文脈において、適切な場合がある。
一部の実施形態では、複合体は、アジュバントと会合した抗原を含む。アジュバントは本技術分野で周知であり、抗原と会合して複合体を形成することができるいずれかのアジュバントが、本明細書に記載されている組成物および方法における使用に企図される。
一部の実施形態では、複合体は、ナノ粒子と会合した抗原を含む。ナノ粒子は本技術分野で周知であり、抗原と会合して複合体を形成することができるいずれかのナノ粒子が、本明細書に記載されている組成物および方法における使用に企図される（例えば、Taki, A.およびSmooker, P.（２０１５年）Vaccines、３巻（３号）６３８～６６１頁を参照）。例示的なナノ粒子は、無機ナノ粒子、リポソームナノ粒子、ウイルス様ナノ粒子およびポリマーナノ粒子を限定することなく含む。無機ナノ粒子は、鉄またはシリカを含むナノ粒子を限定することなく含む。リポソームナノ粒子は、従来のリポソーム、立体的に安定化されたリポソーム、リガンド標的化リポソーム、およびこれらの組合せを限定することなく含む（例えば、Sercombe, L.ら（２０１５年）Frontiers in pharmacology、６巻を参照）。ウイルス様ナノ粒子の例については、例えば、Plummer, E. M.およびManchester, M.（２０１１年）Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology、３巻（２号）、１７４～１９６頁を参照されたい。ポリマーナノ粒子は、キトサン、ＰＬＧＡまたはＰＥＩを含むナノ粒子を限定することなく含む（例えば、Bolhassani, A.ら（２０１４年）Human Vaccines &Immunotherapeutics、１０巻：２号、３２１～３３２頁を参照）。
一部の実施形態では、複合体における使用のためのポリペプチドは、例えば、二環式ヘプタペプチドファロイジンを含む毒素である。
一部の実施形態では、複合体における使用のためのポリペプチドは、抗体である。一部の実施形態では、抗体は、全長抗体または抗体断片である。本開示における使用のための抗体は、抗体バリアント、標識された抗体、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２断片等の抗体断片、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、多特異性抗体、抗体融合タンパク質およびイムノアドヘシンを限定することなく含む。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭを含む、本技術分野で公知のいずれかのアイソタイプであり得る。
複合体における使用のための例示的な核酸は、組換え核酸、ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを限定することなく含む。一部の実施形態では、核酸は、細胞における核酸に対して同種である。一部の実施形態では、核酸は、細胞における核酸に対して異種である。一部の実施形態では、核酸は、治療用核酸である。一部の実施形態では、核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、核酸は、レポーターまたは選択可能マーカーをコードする。例示的なレポーターマーカーは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、エクオリン、ベータ－ガラクトシダーゼ、ウロポルフィリノーゲン（ｕｒｏｇｅｎ）ＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ＵＭＴ）およびルシフェラーゼを限定することなく含む。例示的な選択可能マーカーは、ブラストサイジン、Ｇ４１８／ジェネテシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびチミジンキナーゼを限定することなく含む。一部の実施形態では、核酸は、増殖因子または誘導因子をコードする。
複合体における使用のための例示的な小分子は、ビオチン、蛍光マーカー、色素、医薬剤、代謝物（metabolities）または放射性ヌクレオチド（radionucleotide）を限定することなく含む。一部の実施形態では、医薬剤は、治療薬および／または細胞傷害性薬剤である。
複合体における使用のための例示的な金属含有化合物は、銀、金、白金、銅、鉄、酸化鉄およびマンガンを含む。一部の実施形態では、金属化合物は、ナノ粒子である。一部の実施形態では、ナノ粒子は、磁性である。
本明細書に記載されているデバイスおよび方法の一部の実施形態では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等、幹細胞または前駆細胞の狭窄チャネル通過は、分化を誘導しないが、細胞への複合体の取り込みを確実に誘導する。例えば、分化因子複合体が、斯かる細胞へと導入される。分化因子複合体の取り込み後に、細胞は、因子（複数可）を細胞へと導入した方法に伴う複雑な要因なしで、導入された因子によって指示される分化経路を進行する。
一部の実施形態では、送達するための複合体は、精製されている。一部の実施形態では、複合体は、目的の複合体の少なくとも約２０重量％（乾燥重量）である。一部の実施形態では、精製された複合体は、目的の複合体の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％である。一部の実施形態では、精製された複合体は、目的の複合体の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％、９９％または１００％（ｗ／ｗ）である。純度は、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ解析、ＮＭＲ、質量分析またはＳＤＳ－ＰＡＧＥを限定することなく含む、いずれか公知の方法によって決定される。精製されたＤＮＡまたはＲＮＡは、外因性核酸、炭水化物および脂質を含まないＤＮＡまたはＲＮＡとして定義される。
ＩＶ．細胞懸濁液
一部の態様では、本発明は、細胞懸濁液を狭窄に通し、細胞懸濁液を狭窄に通す前に、その最中にまたはその後に、複合体と細胞懸濁液とを接触させることにより、２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するための方法を提供する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、カエル、ニワトリ、昆虫または線虫細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギまたはウサギ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。
一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞壁を含む細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は、植物、酵母、真菌、藻類または細菌細胞である。一部の実施形態では、細胞は、植物細胞である。一部の実施形態では、植物細胞は、作物、モデル、観賞植物、野菜、マメ科、針葉樹または草本（grass）の植物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、酵母細胞である。一部の実施形態では、酵母細胞は、ＣａｎｄｉｄａまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、真菌細胞である。一部の実施形態では、真菌細胞は、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、藻類細胞である。一部の実施形態では、藻類細胞は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、ＤｕｎａｌｉｅｌｌａまたはＣｈｌｏｒｅｌｌａ細胞である。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細菌細胞を含む。一部の実施形態では、細菌細胞は、グラム陽性細菌細胞である。グラム陽性細菌は、厚いペプチドグリカン層を含む細胞壁を有する。一部の実施形態では、細菌細胞は、グラム陰性細菌細胞である。グラム陰性細菌は、内側細胞質の細胞膜および外膜の間に薄いペプチドグリカン層を含む細胞壁を有する。一部の実施形態では、細菌細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞である。
細胞懸濁液は、混合または精製された細胞集団であり得る。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、全血、リンパ液および／または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）等、混合細胞集団である。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、精製された細胞集団である。一部の実施形態では、細胞は、初代細胞または細胞株の細胞である。一部の実施形態では、細胞は、血球細胞である。一部の実施形態では、血球細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、リンパ球である。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ＮＫＴ細胞、マスト細胞、単球、マクロファージ、好塩基球、好酸球、好中球またはＤＣ２．４樹状細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、初代ヒトＴ細胞である。一部の実施形態では、血球細胞は、赤血球細胞である。一部の実施形態では、細胞は、がん細胞である。一部の実施形態では、がん細胞は、ＨｅＬａ細胞等、がん細胞株の細胞である。一部の実施形態では、がん細胞は、腫瘍細胞である。一部の実施形態では、がん細胞は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）である。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞である。例示的な幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、肝臓幹細胞、心臓幹細胞、神経幹細胞および造血幹細胞を限定することなく含む。一部の実施形態では、細胞は、初代線維芽細胞または新生児ヒト包皮線維芽細胞（Ｎｕｆｆ細胞）等、線維芽細胞の細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞等、不死化細胞株の細胞である。一部の実施形態では、細胞は、皮膚細胞である。一部の実施形態では、細胞は、卵母細胞、卵子または接合子等、生殖細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ニューロンである。一部の実施形態では、細胞のクラスターが、ポアに通す際に崩壊されないことを仮定すると、細胞は、胚等、細胞のクラスターである。
細胞懸濁液の組成（例えば、容量オスモル濃度、塩濃度、血清含量、細胞濃度、ｐＨ等）は、複合体の送達に影響を与えることができる。一部の実施形態では、懸濁液は、全血を含む。あるいは、細胞懸濁液は、血液以外の生理食塩溶液または生理的媒体における細胞の混合物である。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、水溶液を含む。一部の実施形態では、水溶液は、細胞培養培地、ＰＢＳ、塩、糖、増殖因子、動物由来産物、増量材料（bulking material）、界面活性剤、滑沢剤、ビタミン、ポリペプチドおよび／またはアクチン重合に影響を与える薬剤を含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ＤＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＩＭＤＭまたはＲＰＭＩである。その上、溶液バッファーは、表面の目詰まりを低下または排除し、細胞生存率を改善するように設計され得る、１種または複数の滑沢剤（プルロニックまたは他の界面活性剤）を含むことができる。例示的な界面活性剤は、ポロクサマー、ポリソルベート、マンニトール等の糖、動物由来血清およびアルブミンタンパク質を限定することなく含む。
ある種の細胞による一部の構成では、細胞は、細胞内部への複合体の送達に役立つ１種または複数の溶液においてインキュベートすることができる。一部の実施形態では、水溶液は、アクチン重合に影響を与える薬剤を含む。一部の実施形態では、アクチン重合に影響を与える薬剤は、ラトランクリンＡ、サイトカラシンおよび／またはコルヒチンである。例えば、細胞は、ラトランクリン（Lantrunculin）Ａ（０．１μｇ／ｍｌ）等、脱重合溶液において送達に先立ち１時間インキュベートして、アクチン細胞骨格を脱重合させることができる。追加的な例として、細胞は、１０μＭコルヒチン（Ｓｉｇｍａ）において送達に先立ち２時間インキュベートして、微小管ネットワークを脱重合させることができる。
細胞懸濁液の粘性が、本明細書に開示されている方法に影響を与える場合もある。一部の実施形態では、細胞懸濁液の粘性は、約８．９×１０－４Ｐａ・ｓ～約４．０×１０－３Ｐａ・ｓに及ぶ、またはその間のいずれかの値もしくは値の範囲である。一部の実施形態では、粘性は、約８．９×１０－４Ｐａ・ｓ～約４．０×１０－３Ｐａ・ｓ、約８．９×１０－４Ｐａ・ｓ～約３．０×１０－３Ｐａ・ｓ、約８．９×１０－４Ｐａ・ｓ～約２．０×１０－３Ｐａ・ｓまたは約８．９×１０－３Ｐａ・ｓ～約１．０×１０－３Ｐａ・ｓのいずれか１種の間に及ぶ。一部の実施形態では、粘性は、約０．８９ｃＰ～約４．０ｃＰ、約０．８９ｃＰ～約３．０ｃＰ、約０．８９ｃＰ～約２．０ｃＰまたは約０．８９ｃＰ～約１．０ｃＰのいずれか１種の間に及ぶ。一部の実施形態では、剪断ひずみの条件下で細胞懸濁液の粘性が減少する、ずり減粘効果が観察される。粘性は、ガラス毛細管粘度計等の粘度計またはレオメータを限定することなく含む、本技術分野で公知のいずれかの方法によって測定することができる。粘度計は、１種の流動条件下で粘性を測定する一方、レオメータは、流動条件と共に変動する粘性の測定に使用される。一部の実施形態では、粘性は、血液等、ずり減粘溶液に対して測定される。一部の実施形態では、粘性は、約０℃～約４５℃の間で測定される。例えば、粘性は、室温（例えば、約２０℃）、生理的温度（例えば、約３７℃）、生理的温度より高い温度（例えば、約３７℃～４５℃超またはそれよりも高い）、低下した温度（例えば、約０℃～約４℃）またはこれらの例示的な温度の間の温度で測定される。
Ｖ．細胞変形狭窄を提供するマイクロ流体チャネル
一部の態様では、本発明は、細胞懸濁液を狭窄に通し、細胞懸濁液を狭窄に通す前に、その最中にまたはその後に、複合体と細胞懸濁液とを接触させることにより、２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するための方法を提供する。一部の実施形態では、狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含有される。一部の実施形態では、複数の狭窄は、マイクロ流体チャネル内に並列におよび／または直列に配置することができる。本明細書に開示されている方法における使用のための細胞変形狭窄を含有する例示的なマイクロ流体チャネルは、ＷＯ２０１３０５９３４３に記載されている。
一部の実施形態では、マイクロ流体チャネルは、内腔を含み、バッファーに懸濁された細胞が通ることができるように構成されており、マイクロ流体チャネルは、狭窄を含む。マイクロ流体チャネルは、シリコン、金属（例えば、ステンレス鋼）、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、セラミック、ガラス、結晶性基材（crystalline substrate）、アモルファス基材（amorphous substrate）またはポリマー（例えば、ポリ－メチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ＰＤＭＳ、サイクリックオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等）を含む、いくつかの材料のいずれか１種でできていてよい。マイクロ流体チャネルの製作は、ドライエッチング、ウェットエッチング、フォトリソグラフィー、射出成形、レーザーアブレーションまたはＳＵ－８マスクを含む、本技術分野で公知のいずれかの方法によって行うことができる。
一部の実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄は、入口部分、中心点および出口部分を含む。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄の長さ、深さおよび幅は、変動し得る。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄の直径は、細胞壁を含む細胞の直径の関数である。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄の直径は、細胞の直径の約２０％～約９９％である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、細胞直径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である。チャネル、入口部分、中心点および出口部分の断面も変動し得る。例えば、断面は、円形（circular）、楕円形、細長いスリット、四角形、六角形または三角形の形状であり得る。入口部分は、狭窄角度を画定し、狭窄角度は、チャネルの目詰まりを低下させるように最適化される。出口部分の角度も同様に変動し得る。例えば、出口部分の角度は、非層流を生じ得る乱流の可能性を低下させるように構成される。一部の実施形態では、入口部分および／または出口部分の壁は、直線的である。他の実施形態では、入口部分および／または出口部分の壁は、湾曲している。
ＶＩ．細胞変形狭窄を提供するためのポアを有する表面
一部の態様では、本発明は、細胞懸濁液を狭窄に通し、細胞懸濁液を狭窄に通す前に、その最中にまたはその後に、複合体と細胞懸濁液とを接触させることにより、２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するための方法を提供する。一部の実施形態では、ポアは、表面に含有される。本明細書に開示されている方法における使用のためのポアを有する例示的な表面は、２０１５年９月４日に出願された米国特許仮出願第６２／２１４，８２０号に記載されている。
本明細書に開示されている表面は、いくつかの材料のうちのいずれか１種でできていてよく、いくつかの形態のうちのいずれか１種を採ることができる。一部の実施形態では、表面は、フィルターである。一部の実施形態では、表面は、膜である。一部の実施形態では、フィルターは、接線流フィルターである。一部の実施形態では、表面は、スポンジまたはスポンジ様のマトリクスである。一部の実施形態では、表面は、マトリクスである。
一部の実施形態では、表面は、蛇行した通路表面である。一部の実施形態では、蛇行した通路表面は、酢酸セルロースを含む。一部の実施形態では、表面は、合成または天然ポリマー、ポリカーボネート、シリコン、ガラス、金属、合金、硝酸セルロース、銀、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリプロピレン、ＰＶＤＦ、ポリテトラフルオロエチレン（polytetrafluorethylene）、混合型セルロースエステル、ポーセレンおよびセラミックから限定することなく選択される材料を含む。
本明細書に開示されている表面は、本技術分野で公知のいずれかの形状；例えば、３次元形状を有することができる。表面の２次元形状は、限定することなく、円形、楕円形、丸(round)、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形または八角形であり得る。一部の実施形態では、表面は、丸い形状である。一部の実施形態では、表面３次元形状は、円柱状、円錐状または立方体状である。
表面は、様々な断面幅および厚さを有することができる。一部の実施形態では、表面断面幅は、約１ｍｍ～約１ｍの間、またはその間のいずれかの断面幅もしくは断面幅範囲である。一部の実施形態では、表面は、画定された厚さを有する。一部の実施形態では、表面厚さは、均一である。一部の実施形態では、表面厚さは、可変的である。例えば、一部の実施形態では、表面のある部分は、表面の他の部分よりも厚いまたは薄い。一部の実施形態では、表面厚さは、約１％～約９０％、またはその間のいずれかのパーセンテージもしくはパーセンテージ範囲だけ変動する。一部の実施形態では、表面は、約０．０１μｍ～約５ｍｍ厚の間、またはその間のいずれかの厚さもしくは厚さ範囲である。
一部の実施形態では、狭窄は、ポアである、またはポア内に含有される。ポアの断面幅は、処理されるべき細胞の型に関係付けられる。一部の実施形態では、ポアサイズは、処理されるべき細胞のクラスターの細胞の直径の関数である。一部の実施形態では、ポアサイズは、ポアに通すと細胞が摂動されるようなものである。一部の実施形態では、ポアサイズは、細胞の直径未満である。一部の実施形態では、ポアサイズは、細胞の直径の約２０％～約９９％である。一部の実施形態では、ポアサイズは、細胞直径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である。最適なポアサイズは、適用および／または細胞型に基づき変動し得る。一部の実施形態では、ポアサイズは、約０．４μｍ、約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１１μｍ、約１２μｍ、約１３μｍまたは約１４μｍである。
ポア通路の入口および出口は、種々の角度を有することができる。ポア角度は、細胞を通しつつ、ポアの目詰まりを最小限にするように選択することができる。一部の実施形態では、表面を通る流量は、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒～約１００Ｌ／ｃｍ２／秒の間、またはその間のいずれかの速度もしくは速度範囲である。例えば、入口または出口部分の角度は、約０～約９０度の間であり得る。一部の実施形態では、ポアは、同一の入口および出口角度を有する。一部の実施形態では、ポアは、異なる入口および出口角度を有する。一部の実施形態では、ポアの縁は、滑らかである、例えば、丸くなっているかまたは湾曲している。滑らかなポアの縁は、突起も隆線も起伏のある部分もない、連続的、平坦かつ平らな表面を有する。一部の実施形態では、ポアの縁は、鋭い。鋭いポアの縁は、尖ったまたは鋭角の細い縁を有する。一部の実施形態では、ポア通路は、真直ぐである。真直ぐなポア通路は、曲線も屈曲も角度も他の凸凹も含有しない。一部の実施形態では、ポア通路は、湾曲している。湾曲したポア通路は、屈曲している、または直線から逸脱する。一部の実施形態では、ポア通路は、複数の曲線、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多い曲線を有する。
ポアは、２次元または３次元形状を含む、本技術分野で公知のいずれかの形状を有することができる。ポア形状（例えば、断面形状）は、限定することなく、円形、楕円形、丸、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形および八角形であり得る。一部の実施形態では、ポアの断面は、丸い形状である。一部の実施形態では、ポアの３次元形状は、円柱状または円錐状である。一部の実施形態では、ポアは、溝付きの（fluted）入口および出口形状を有する。一部の実施形態では、ポア形状は、所与の表面内のポアの間で同質である（すなわち、一貫したまたは規則的である）。一部の実施形態では、ポア形状は、所与の表面内のポアの間で不均一である（すなわち、混合型であるまたは変動されている）。
本明細書に記載されている表面は、ある範囲の総ポア数を有することができる。一部の実施形態では、ポアは、総表面積の約１０％～約８０％を包含する。一部の実施形態では、表面は、約１．０×１０５～約１．０×１０３０個の総ポア、またはその間のいずれかの数もしくは数範囲を含有する。一部の実施形態では、表面は、表面積１ｍｍ２当たり約１０～約１．０×１０１５個の間のポアを含む。
ポアは、所与の表面内に多数の仕方で分布され得る。一部の実施形態では、ポアは、所与の表面内に並行に分布される。斯かる一例では、ポアは、同じ方向に並んで（side-by-side）分布され、所与の表面内で同じ距離離れている。一部の実施形態では、ポア分布は、秩序立っているまたは均質である。斯かる一例では、ポアは、規則的、系統的パターンで分布される、または所与の表面内で同じ距離離れている。一部の実施形態では、ポア分布は、ランダムまたは不均一である。斯かる一例では、ポアは、不規則、無秩序なパターンで分布される、または所与の表面内で異なる距離離れている。一部の実施形態では、複数の表面は、直列に分布される。複数の表面は、均質または不均一な表面サイズ、形状および／または粗さであり得る。複数の表面は、均質または不均一なポアサイズ、形状および／または数を有するポアをさらに含有し、これにより、異なる細胞型へのある範囲の複合体の同時送達を可能にすることができる。
一部の実施形態では、個々のポアは、均一な幅寸法（すなわち、ポア通路の長さに沿って一定の幅）を有する。一部の実施形態では、個々のポアは、可変的な幅（すなわち、ポア通路の長さに沿って増加または減少する幅）を有する。一部の実施形態では、所与の表面内のポアは、同じ個々のポア深さを有する。一部の実施形態では、所与の表面内のポアは、異なる個々のポア深さを有する。一部の実施形態では、ポアは、互いに直接隣接している。一部の実施形態では、ポアは、ある距離だけ互いに離れている。一部の実施形態では、ポアは、約０．００１μｍ～約３０ｍｍの距離、またはその間のいずれかの距離もしくは距離範囲だけ互いに離れている。
一部の実施形態では、表面は、材料でコーティングされる。材料は、テフロン（登録商標）、接着性コーティング、界面活性剤、タンパク質、接着分子、抗体、抗凝固薬、細胞機能をモジュレートする因子、核酸、脂質、炭水化物または膜貫通タンパク質を限定することなく含む、本技術分野で公知のいずれかの材料から選択することができる。一部の実施形態では、表面は、ポリビニルピロリドンでコーティングされる。一部の実施形態では、材料は、表面へと共有結合により取り付けられる。一部の実施形態では、材料は、表面へと非共有結合により取り付けられる。一部の実施形態では、表面分子は、細胞がポアを通ると放出される。
一部の実施形態では、表面は、修飾された化学的特性を有する。一部の実施形態では、表面は、親水性である。一部の実施形態では、表面は、疎水性である。一部の実施形態では、表面は、荷電している。一部の実施形態では、表面は、正におよび／または負に荷電している。一部の実施形態では、表面は、ある領域が正に荷電し、他の領域が負に荷電し得る。一部の実施形態では、表面は、全体として正電荷または全体として負電荷を有する。一部の実施形態では、表面は、滑らか、電解研磨、粗いまたはプラズマ処理のうちのいずれか１つであり得る。一部の実施形態では、表面は、双性イオンまたは双極性化合物を含む。一部の実施形態では、表面は、プラズマ処理されている。
一部の実施形態では、表面は、より大型のモジュール内に含有される。一部の実施形態では、表面は、プラスチックまたはガラスシリンジ等、シリンジ内に含有される。一部の実施形態では、表面は、プラスチックフィルターホルダー内に含有される。一部の実施形態では、表面は、ピペットチップ内に含有される。
ＶＩＩ．細胞摂動
一部の実施形態では、本発明は、細胞懸濁液を狭窄に通すことによる、細胞への複合体の送達のための方法であって、狭窄が細胞を変形し、これにより、複合体が細胞に進入するように細胞の摂動を引き起こし、細胞における摂動が、細胞外部由来の材料を細胞内に移動させることができる、細胞における穴（例えば、孔、裂け目、空洞、開口部、ポア、割れ目、間隙、穿孔）である、方法を提供する。変形は、例えば、機械的ひずみによって誘導される圧力および／または剪断力に起因し得る。一部の実施形態では、摂動は、細胞壁内の摂動である。一部の実施形態では、摂動は、細胞膜内の摂動である。一部の実施形態では、摂動は、一過性である。一部の実施形態では、細胞摂動は、約１．０×１０－９秒間～約２時間、またはその間のいずれかの時間もしくは時間範囲持続する。一部の実施形態では、細胞摂動は、約１．０×１０－９秒間～約１秒間、約１秒間～約１分間または約１分間～約１時間持続する。一部の実施形態では、細胞摂動は、約１．０×１０－９～約１．０×１０－１、約１．０×１０－９～約１．０×１０－２、約１．０×１０－９～約１．０×１０－３、約１．０×１０－９～約１．０×１０－４、約１．０×１０－９～約１．０×１０－５、約１．０×１０－９～約１．０×１０－６、約１．０×１０－９～約１．０×１０－７または約１．０×１０－９～約１．０×１０－８秒間のいずれか１つの間持続する。一部の実施形態では、細胞摂動は、約１．０×１０－８～約１．０×１０－１、約１．０×１０－７～約１．０×１０－１、約１．０×１０－６～約１．０×１０－１、約１．０×１０－５～約１．０×１０－１、約１．０×１０－４～約１．０×１０－１、約１．０×１０－３～約１．０×１０－１または約１．０×１０－２～約１．０×１０－１秒間のいずれか１つにわたり持続する。本明細書に記載されている方法によって作られた細胞摂動（例えば、ポアまたは孔）は、補体または細菌溶血素によって作られるもの等、マルチマーポア構造を形成するためのポリペプチドサブユニットの組み立ての結果として形成されない。
細胞が狭窄を通る際に、狭窄は、細胞膜に損傷を一時的に与え、これが、摂動による材料の受動的拡散を引き起こす。一部の実施形態では、細胞は、１００μｓのオーダーの短い期間に限り変形されて、細胞シグナル伝達機構によりアポトーシス経路を活性化する機会が最小限にされるが、他の持続時間も可能である（例えば、ナノ秒間～数時間に及ぶ）。一部の実施形態では、細胞は、約１．０×１０－９秒間～約２時間、またはその間のいずれかの時間もしくは時間範囲にわたり変形される。一部の実施形態では、細胞は、約１．０×１０－９秒間～約１秒間、約１秒間～約１分間または約１分間～約１時間にわたり変形される。一部の実施形態では、細胞は、約１．０×１０－９～約１．０×１０－１、約１．０×１０－９～約１．０×１０－２、約１．０×１０－９～約１．０×１０－３、約１．０×１０－９～約１．０×１０－４、約１．０×１０－９～約１．０×１０－５、約１．０×１０－９～約１．０×１０－６、約１．０×１０－９～約１．０×１０－７または約１．０×１０－９～約１．０×１０－８秒間のいずれか１つの間にわたり変形される。一部の実施形態では、細胞は、約１．０×１０－８～約１．０×１０－１、約１．０×１０－７～約１．０×１０－１、約１．０×１０－６～約１．０×１０－１、約１．０×１０－５～約１．０×１０－１、約１．０×１０－４～約１．０×１０－１、約１．０×１０－３～約１．０×１０－１または約１．０×１０－２～約１．０×１０－１秒間のいずれか１つにわたり変形される。一部の実施形態では、細胞の変形は、限定することなく、約１μｓ～少なくとも約７５０μｓに及ぶ時間、例えば、少なくとも約１μｓ、１０μｓ、５０μｓ、１００μｓ、５００μｓまたは７５０μｓにわたる、細胞の変形を含む。
一部の実施形態では、細胞への複合体の通過は、細胞が狭窄を通るのと、および／または細胞の摂動と同時に起こる。一部の実施形態では、細胞への複合体の通過は、細胞が狭窄を通った後に起こる。一部の実施形態では、細胞への複合体の通過は、細胞が狭窄を通ってから、数分後のオーダーで起こる。一部の実施形態では、細胞への複合体の通過は、細胞が狭窄を通ってから、約１．０×１０－２秒～少なくとも約３０分後に起こる。例えば、細胞への複合体の通過は、細胞が狭窄を通ってから、約１．０×１０－２秒～約１秒、約１秒～約１分または約１分～約３０分後に起こる。一部の実施形態では、細胞への複合体の通過は、細胞が狭窄を通ってから、約１．０×１０－２秒～約１０分、約１．０×１０－２秒～約５分、約１．０×１０－２秒～約１分、約１．０×１０－２秒～約５０秒、約１．０×１０－２秒～約１０秒、約１．０×１０－２秒～約１秒または約１．０×１０－２秒～約０．１秒後に起こる。一部の実施形態では、細胞への複合体の通過は、細胞が狭窄を通ってから、約１．０×１０－１秒～約１０分、約１秒～約１０分、約１０秒～約１０分、約５０秒～約１０分、約１分～約１０分または約５分～約１０分後に起こる。一部の実施形態では、狭窄を通った後の細胞における摂動は、細胞が狭窄を通ってから、約５分のオーダー以内の後に補正される。
一部の実施形態では、狭窄を通った後の細胞生存率は、約５％～約１００％である。一部の実施形態では、狭窄を通った後の細胞生存率は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％である。一部の実施形態では、細胞生存率は、細胞が狭窄を通ってから、約１．０×１０－２秒～少なくとも約１０日後に測定される。例えば、細胞生存率は、細胞が狭窄を通ってから、約１．０×１０－２秒～約１秒、約１秒～約１分、約１分～約３０分または約３０分～約２時間後に測定される。一部の実施形態では、細胞生存率は、細胞が狭窄を通ってから、約１．０×１０－２秒～約２時間、約１．０×１０－２秒～約１時間、約１．０×１０－２秒～約３０分、約１．０×１０－２秒～約１分、約１．０×１０－２秒～約３０秒、約１．０×１０－２秒～約１秒または約１．０×１０－２秒～約０．１秒後に測定される。一部の実施形態では、細胞生存率は、細胞が狭窄を通ってから、約１．５時間～約２時間、約１時間～約２時間、約３０分～約２時間、約１５分～約２時間、約１分～約２時間、約３０秒～約２時間または約１秒～約２時間後に測定される。一部の実施形態では、細胞生存率は、細胞が狭窄を通ってから、約２時間～約５時間、約５時間～約１２時間、約１２時間～約２４時間または約２４時間～約１０日後に測定される。
ＶＩＩＩ．送達パラメータ
いくつかのパラメータが、本明細書に記載されている方法による細胞への複合体の送達に影響し得る。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、複合体と接触される。細胞は、送達するための複合体を含む溶液に懸濁された狭窄を通ることができるが、複合体は、細胞が狭窄を通った後に細胞懸濁液に添加することができる。一部の実施形態では、送達されるべき複合体は、狭窄にコーティングされている。
細胞への複合体の送達に影響し得るパラメータの例として、狭窄の寸法、狭窄の入口角度、狭窄の表面特性（例えば、粗さ、化学修飾、親水性、疎水性等）、動作流動スピード（例えば、狭窄の細胞通過時間）、細胞濃度、細胞懸濁液における複合体の濃度、および狭窄を通した後に細胞が回復するまたはインキュベートする時間の量が挙げられるがこれらに限定されず、これらは細胞へと送達される複合体の通過に影響し得る。細胞への複合体の送達に影響する追加的なパラメータは、狭窄における細胞の速度、狭窄におけるずり速度、細胞懸濁液の粘性、流動速度に垂直な速度成分、および狭窄における時間を含むことができる。斯かるパラメータは、複合体の送達を制御するように設計することができる。一部の実施形態では、細胞濃度は、約１０～少なくとも約１０１２細胞／ｍｌ、またはその間のいずれかの濃度もしくは濃度範囲に及ぶ。一部の実施形態では、送達複合体濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１ｇ／ｍＬ、またはその間のいずれかの濃度もしくは濃度範囲に及び得る。一部の実施形態では、送達複合体濃度は、約１ｐＭ～少なくとも約２Ｍ、またはその間のいずれかの濃度もしくは濃度範囲に及び得る。
本開示の方法において使用される温度は、複合体送達および細胞生存率ならびに複合体安定性に影響を与えるように調整することができる。一部の実施形態では、本方法は、約－５℃～約４５℃の間で行われる。例えば、本方法は、室温（例えば、約２０℃）、生理的温度（例えば、約３７℃）、生理的温度よりも高い温度（例えば、約３７℃～４５℃超またはそれよりも高い）もしくは低下した温度（例えば、約－５℃～約４℃）、またはこれらの例示的な温度の間の温度で実行することができる。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の実質的な解離をもたらさない温度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、細胞へと送達されるべき分子の複合体の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％未満の解離をもたらす温度で、２個またはそれよりも多い分子の複合体と接触される。
様々な方法を利用して、狭窄を通して細胞を駆動することができる。例えば、入口側のポンプ（例えば、ガスシリンダーまたはコンプレッサ）によって圧力を加えることができる、出口側の真空ポンプによって真空をかけることができる、チューブにより毛細管作用をかけることができる、および／またはシステムは重力により供給（gravity fed）され得る。変位に基づく流動システムを使用することもできる（例えば、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、手動シリンジまたはピペット、ピストン等）。一部の実施形態では、細胞は、陽圧または陰圧によって狭窄を通される。一部の実施形態では、細胞は、一定圧力または可変圧力によって狭窄を通される。一部の実施形態では、圧力は、シリンジを使用して加えられる。一部の実施形態では、圧力は、ポンプを使用して加えられる。一部の実施形態では、ポンプは、蠕動ポンプまたはダイヤフラムポンプである。一部の実施形態では、圧力は、真空を使用して加えられる。一部の実施形態では、細胞は、ｇ力によって狭窄を通される。一部の実施形態では、細胞は、毛細管圧によって狭窄を通される。
一部の実施形態では、流体の流動は、狭窄を通して細胞を方向づける。一部の実施形態では、流体の流動は、細胞が狭窄を通る前の乱流である。乱流は、所与のポイントにおける速度の大きさおよび方向が一定でなく変動する流体の流動である。一部の実施形態では、狭窄を通る流体の流動は、層流である。層流は、全ポイントにおける流動の方向が一定を保つ、固体境界付近の流体における中断されていない流動を伴う。一部の実施形態では、流体の流動は、細胞が狭窄を通った後の乱流である。細胞が狭窄を通る速度は、変動され得る。一部の実施形態では、細胞は、均一な細胞スピードで狭窄を通る。一部の実施形態では、細胞は、変動する細胞スピードで狭窄を通る。
他の実施形態では、複合体を送達するために組合せ処理を使用する、例えば、本明細書に記載されている方法に続いて、狭窄下流に電場への曝露が為される。一部の実施形態では、細胞は、狭窄に通した後に、少なくとも１本の電極によって発生された電場に通される。一部の実施形態では、電場は、細胞核等、細胞内側の第２の場所への複合体の送達を支援する。一部の実施形態では、１本または複数の電極は、電場を発生するために細胞変形狭窄に近接している。一部の実施形態では、電場は、約０．１ｋＶ／ｍ～約１００ＭＶ／ｍの間、またはその間のいずれかの数もしくは数範囲である。一部の実施形態では、集積回路を使用して、電極を駆動するための電気的シグナルを提供する。一部の実施形態では、細胞は、約１ｎｓ～約１ｓの間のパルス幅および約１００ｎｓ～約１０ｓの間、またはその間のいずれかの時間もしくは時間範囲の期間にわたり電場に曝露される。
ＩＸ．システムおよびキット
一部の態様では、本発明は、細胞への２個またはそれよりも多い分子の複合体の送達のためのシステムであって、システムが、狭窄を含むマイクロ流体チャネルと、細胞を含む細胞懸濁液と、２個またはそれよりも多い分子の複合体とを含み、狭窄が、細胞が狭窄を通ることができるように構成されており、狭窄が細胞を変形し、これにより、２個またはそれよりも多い分子の複合体が細胞に進入するように、細胞の摂動を引き起こす、システムを提供する。他の態様では、本発明は、２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するためのシステムであって、システムが、ポアを有する表面と、細胞を含む細胞懸濁液と、２個またはそれよりも多い分子の複合体とを含み、ポアを有する表面が、細胞がポアを通ることができるように構成されており、ポアが細胞を変形し、これにより、２個またはそれよりも多い分子の複合体が細胞に進入するように、細胞の摂動を引き起こす、システムを提供する。一部の実施形態では、表面は、フィルターまたは膜である。上述の態様の一部の実施形態では、システムは、電場を発生するための少なくとも１本の電極をさらに含む。一部の実施形態では、分子の複合体の形成は、可逆的である。一部の実施形態では、複合体の少なくとも２個またはそれよりも多い分子は、非共有結合性相互作用によって会合する。一部の実施形態では、システムは、本明細書に記載されている２個またはそれよりも多い分子のいずれかの複合体を細胞に送達するために使用される。一部の実施形態では、システムは、本明細書に記載されている方法のいずれかによって、２個またはそれよりも多い分子を含む複合体を細胞に送達するために使用される。システムは、細胞変形狭窄をもたらすためのマイクロ流体チャネルもしくはポアを有する表面、細胞懸濁液、細胞摂動、送達パラメータ、抗体産生を変更もしくは誘導するための化合物、および／または適用等を含む、上に開示されている方法について記載したいずれかの実施形態を含むことができる。一部の実施形態では、細胞変形狭窄は、内因性抗体産生を変更するために、抗体産生細胞への送達のためにサイズ調整される。一部の実施形態では、細胞変形狭窄は、細胞におけるｄｅ ｎｏｖｏ抗体産生を誘導する化合物の送達のためにサイズ調整される。一部の実施形態では、動作流動スピード、細胞および化合物濃度、狭窄における細胞の速度、ならびに細胞懸濁液の組成（例えば、容量オスモル濃度、塩濃度、血清含量、細胞濃度、ｐＨ等）等、送達パラメータは、細胞への２個またはそれよりも多い分子の複合体の送達のために最適化される。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されている２個またはそれよりも多い分子の複合体を含む細胞であって、２個またはそれよりも多い分子の複合体が、本明細書に記載されている方法のいずれかによって細胞へと送達された、細胞を提供する。
本明細書に記載されている２個またはそれよりも多い分子の複合体の細胞への送達における使用のためのキットまたは製造品も提供される。一部の実施形態では、キットは、適した包装において、本明細書に記載されている組成物（例えば、マイクロ流体チャネルもしくはポアを含有する表面、細胞懸濁液、および／または２個またはそれよりも多い分子の複合体）を含む。適した包装材料は、本技術分野で公知であり、例えば、バイアル（密封されたバイアル等）、容器、アンプル、ボトル、広口瓶、可撓性包装（例えば、密封されたＭｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）その他を含む。このような製造品は、さらに滅菌および／または密封されていてよい。
本開示は、本明細書に記載されている方法の構成成分を含むキットも提供し、細胞への２個またはそれよりも多い分子の複合体を送達するために前記方法を行うための指示（複数可）をさらに含むことができる。本明細書に記載されているキットは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび本明細書に記載されているいずれかの方法を行うための指示を含む添付文書；例えば、２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するための指示を含む、他の材料をさらに含むことができる。
Ｘ．例示的な実施形態
１． ２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するための方法であって、細胞懸濁液を狭窄に通すステップを含み、ここで前記狭窄は、前記細胞を変形し、これにより、分子の前記複合体が前記細胞に進入するように、前記細胞の摂動を引き起こし、前記細胞懸濁液が、分子の前記複合体と接触される、方法。
２． 分子の前記複合体の形成が、可逆的である、実施形態１に記載の方法。
３． 前記複合体の少なくとも２個またはそれよりも多い分子が、非共有結合性相互作用によって会合する、実施形態１または２に記載の方法。
４． 前記複合体における少なくとも２個の分子が、約１μＭ～約１ｐＭに及ぶ前記複合体における結合親和性を有する、実施形態１から３のいずれか一項に記載の方法。
５． 前記複合体における少なくとも２個の分子が、約１μＭ～約１ｎＭまたは約１ｎＭ～約１ｐＭに及ぶ前記複合体における結合親和性を有する、実施形態１から４のいずれか一項に記載の方法。
６． 前記複合体が、前記細胞懸濁液における、約１分間～約４８時間の半減期を有する、実施形態１から５のいずれか一項に記載の方法。
７． 前記複合体が、前記細胞懸濁液における、約１分間～約２０分間、約２０分間～約４０分間、約４０分間～約１時間、約１時間～約２時間、約２時間～約６時間、約６時間～約１２時間、約１２時間～約２４時間、約２４時間～約３６時間または約３６時間～約４８時間の半減期を有する、実施形態６に記載の方法。
８． 前記複合体が、洗浄剤の存在下で解離する、実施形態１から７のいずれか一項に記載の方法。
９． 前記複合体が、約０．１％（ｗ／ｖ）～約１０％（ｗ／ｖ）の濃度の洗浄剤の存在下で解離する、実施形態８に記載の方法。
１０． 前記複合体が、約０．１％（ｗ／ｖ）～約１％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）～約５％（ｗ／ｖ）または約５％（ｗ／ｖ）～約１０％（ｗ／ｖ）の濃度の洗浄剤の存在下で解離する、実施形態８または９に記載の方法。
１１． 前記細胞懸濁液が、約０℃～約４０℃に及ぶ温度で分子の前記複合体と接触される、実施形態１から１０のいずれか一項に記載の方法。
１２． 分子の前記複合体が、前記細胞懸濁液が分子の前記複合体と接触される前記温度を超える温度で解離する、実施形態１１に記載の方法。
１３． 分子の前記複合体が、約５０℃～約７０℃の温度で解離する、実施形態１１または１２に記載の方法。
１４． 分子の前記複合体が、約５０℃～約６０℃または約６０℃～約７０℃の温度で解離する、実施形態１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
１５． 前記細胞懸濁液が、約５０ｍＭ～約３００ｍＭに及ぶイオン強度で分子の前記複合体と接触される、実施形態１から１４のいずれか一項に記載の方法。
１６． 分子の前記複合体が、前記細胞懸濁液が分子の前記複合体と接触される前記イオン強度を超えるイオン強度で解離する、実施形態１５に記載の方法。
１７． 分子の前記複合体が、約３５０ｍＭ～約１０００ｍＭのイオン強度で解離する、実施形態１５または１６に記載の方法。
１８． 分子の前記複合体が、約３５０ｍＭ～約４００ｍＭ、約４００ｍＭ～約５００ｍＭ、約５００ｍＭ～約６００ｍＭ、約７００ｍＭ～約８００ｍＭ、約８００ｍＭ～約９００ｍＭまたは約９００ｍＭ～約１０００ｍＭのイオン強度で解離する、実施形態１７に記載の方法。
１９． 分子の前記複合体が、前記細胞懸濁液が分子の前記複合体と接触される前記イオン強度に満たないイオン強度で解離する、実施形態１５に記載の方法。
２０． 分子の前記複合体が、約０ｍＭ～約５０ｍＭのイオン強度で解離する、実施形態１５または１９に記載の方法。
２１． 分子の前記複合体が、約０ｍＭ～約１０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭまたは約４０ｍＭ～約５０ｍＭのイオン強度で解離する、実施形態２０に記載の方法。
２２． 前記細胞懸濁液が、約１００ｍＯｓｍ／Ｌ～約５００ｍＯｓｍ／Ｌに及ぶ容量オスモル濃度で分子の前記複合体と接触される、実施形態１から１４のいずれか一項に記載の方法。
２３． 分子の前記複合体が、前記細胞懸濁液が分子の前記複合体と接触される前記イオン強度を超える容量オスモル濃度で解離する、実施形態２２に記載の方法。
２４． 分子の前記複合体が、約６００ｍＯｓｍ／Ｌ～約１０００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する、実施形態２２または２３に記載の方法。
２５． 分子の前記複合体が、約６００ｍＯｓｍ／Ｌ～約７００ｍＯｓｍ／Ｌ、約７００ｍＯｓｍ／Ｌ～約８００ｍＯｓｍ／Ｌ、約８００ｍＯｓｍ／Ｌ～約９００ｍＯｓｍ／Ｌまたは約９００ｍＯｓｍ／Ｌ～約１０００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する、実施形態２４に記載の方法。
２６． 分子の前記複合体が、前記細胞懸濁液が分子の前記複合体と接触される前記容量オスモル濃度に満たない容量オスモル濃度で解離する、実施形態２２に記載の方法。
２７． 分子の前記複合体が、約０ｍＯｓｍ／Ｌ～約１００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する、実施形態２２または２６に記載の方法。
２８． 分子の前記複合体が、約０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２０ｍＯｓｍ／Ｌ～約４０ｍＯｓｍ／Ｌ、約４０ｍＯｓｍ／Ｌ～約６０ｍＯｓｍ／Ｌ、約６０ｍＯｓｍ／Ｌ～約８０ｍＯｓｍ／Ｌまたは約８０ｍＯｓｍ／Ｌ～約１００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度で解離する、実施形態２７に記載の方法。
２９． 前記細胞懸濁液が、約５．５～約８．５に及ぶｐＨで分子の前記複合体と接触される、実施形態１から２８のいずれか一項に記載の方法。
３０． 分子の前記複合体が、前記細胞懸濁液が分子の前記複合体と接触される前記ｐＨを超えるまたはそれを下回るｐＨで解離する、実施形態２９に記載の方法。
３１． 分子の前記複合体が、約４．０～約５．５のｐＨまたは約８．５～約１０のｐＨで解離する、実施形態２９または３０に記載の方法。
３２． 分子の前記複合体が、約４．０～約４．５、約４．５～約５．０、約５．０～約５．５、約８．５～約９．０、約９．０～約９．５または約９．５～約１０．０のｐＨで解離する、実施形態３１に記載の方法。
３３． 前記細胞が前記狭窄を通る際の剪断力が、約１ｋＰａ～約１０ｋＰａに及ぶ、実施形態１から３２のいずれか一項に記載の方法。
３４． 前記複合体が、約１０ｋＰａ～約１００ｋＰａの剪断力で解離する、実施形態３３に記載の方法。
３５． 前記複合体が、約１０ｋＰａ～約２５ｋＰａ、約２５ｋＰａ～約５０ｋＰａ、約５０ｋＰａ～約７５ｋＰａまたは約７５ｋＰａ～約１００ｋＰａの剪断力で解離する、実施形態３３または３４に記載の方法。
３６． 分子の前記複合体が、
ａ）１種もしくは複数のポリペプチド、
ｂ）１種もしくは複数の核酸、
ｃ）１種もしくは複数の脂質、
ｄ）１種もしくは複数の炭水化物、
ｅ）１種もしくは複数の小分子、
ｆ）１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｇ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の核酸、
ｈ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の脂質、
ｉ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の炭水化物、
ｊ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の小分子、
ｋ）１種もしくは複数のポリペプチドおよび１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｌ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の脂質、
ｍ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の炭水化物、
ｎ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の小分子、
ｏ）１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｐ）１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、
ｑ）１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、
ｒ）１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｓ）１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ｔ）１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｕ）１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｖ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の脂質、
ｗ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の炭水化物、
ｘ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の小分子、
ｙ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｚ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、
ａａ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、
ａｂ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｃ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ａｄ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｅ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｆ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、
ａｇ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、
ａｈ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｉ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ａｊ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｋ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｌ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ａｍ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｎ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｏ）１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｐ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の炭水化物、
ａｑ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の小分子、
ａｒ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｓ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ａｔ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｕ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｖ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ａｗ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｘ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｙ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ａｚ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ｂａ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｂ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｃ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｄ）１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｅ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の小分子、
ｂｆ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｇ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｈ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｉ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、
ｂｊ）１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物、または
ｂｋ）１種もしくは複数のポリペプチド、１種もしくは複数の核酸、１種もしくは複数の脂質、１種もしくは複数の炭水化物、１種もしくは複数の小分子および１種もしくは複数の金属含有化合物
を含む、実施形態１から３５のいずれか一項に記載の方法。
３７． 前記複合体が、抗体を含む、実施形態１から３６のいずれか一項に記載の方法。
３８． 前記複合体が、１種または複数の転写因子を含む、実施形態１から３６のいずれか一項に記載の方法。
３９． 前記複合体が、リボソームおよびｍＲＮＡを含む、実施形態１から３６のいずれか一項に記載の方法。
４０． 前記複合体が、プロテアソーム、ホロ酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、スプライセオソーム、ヴォールト細胞質リボヌクレオタンパク質、核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）、テロメラーゼ、ヌクレオソーム、デスシグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）、哺乳動物ラパマイシン標的複合体１（ｍＴＯＲＣ１）、哺乳動物ラパマイシン標的複合体２（ｍＴＯＲＣ２）またはクラスＩホスホイノシチド３キナーゼ（クラスＩ ＰＩ３Ｋ）、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）、ヒストン－ＤＮＡ複合体、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）－アゴニスト複合体、トランスポサーゼ／トランスポゾン複合体、ｔＲＮＡリボソーム複合体、ポリペプチド－プロテアーゼ複合体または酵素－基質複合体を含む、実施形態１から３６のいずれか一項に記載の方法。
４１． 前記細胞懸濁液が、前記細胞懸濁液が前記狭窄を通った後に前記複合体と接触される、実施形態１から４０のいずれか一項に記載の方法。
４２． 前記細胞懸濁液が、前記細胞懸濁液が前記狭窄を通る前に前記複合体と接触される、実施形態１から４０のいずれか一項に記載の方法。
４３． 前記細胞懸濁液が、前記細胞懸濁液が前記狭窄を通るのと同時に前記複合体と接触される、実施形態１から４０のいずれか一項に記載の方法。
４４． 前記複合体が、前記細胞懸濁液との接触に先立ち形成される、実施形態１から４２のいずれか一項に記載の方法。
４５． 前記複合体が、前記細胞懸濁液との接触の約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約１時間、約２時間、約３時間または約６時間前に形成される、実施形態４４に記載の方法。
４６． 前記複合体が、前記細胞懸濁液との接触に先立ち精製される、実施形態１から４５のいずれか一項に記載の方法。
４７． 前記複合体が、前記細胞懸濁液において形成される、実施形態４０に記載の方法。
４８． 前記複合体の前記分子の１個または複数が、前記細胞懸濁液との接触に先立ち精製される、実施形態４７に記載の方法。
４９． 前記細胞懸濁液が、混合細胞集団を含む、実施形態１から４８のいずれか一項に記載の方法。
５０． 前記細胞懸濁液が、精製された細胞集団を含む、実施形態１から４８のいずれか一項に記載の方法。
５１． 前記細胞懸濁液が、原核細胞または真核細胞を含む、実施形態１から４８のいずれか一項に記載の方法。
５２． 前記細胞懸濁液が、細菌細胞、古細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞または動物細胞を含む、実施形態１から５１のいずれか一項に記載の方法。
５３． 前記細胞懸濁液が、脊椎動物細胞を含む、実施形態１から５２のいずれか一項に記載の方法。
５４． 前記細胞懸濁液が、哺乳動物細胞を含む、実施形態１から５３のいずれか一項に記載の方法。
５５． 前記細胞懸濁液が、ヒト細胞を含む、実施形態１から５４のいずれか一項に記載の方法。
５６． 前記狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含有される、実施形態１から５５のいずれか一項に記載の方法。
５７． 前記狭窄が、ポアである、またはポア内に含有される、実施形態１から５５のいずれか一項に記載の方法。
５８． 前記ポアが、表面に含有される、実施形態５７に記載の方法。
５９． 前記表面が、フィルターである、実施形態５８に記載の方法。
６０． 前記表面が、膜である、実施形態５８に記載の方法。
６１． 前記ポアサイズが、約０．４μｍ、約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１１μｍ、約１２μｍ、約１３μｍまたは約１４μｍである、実施形態５７から６０のいずれか一項に記載の方法。
６２． 前記狭窄サイズが、前記細胞の直径の関数である、実施形態１から６１のいずれか一項に記載の方法。
６３． 前記狭窄サイズが、前記細胞の直径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である、実施形態１から６２のいずれか一項に記載の方法。
６４． 前記狭窄が、約３０μｍの長さおよび約３μｍ～約８μｍの幅を有する、実施形態１から６３のいずれか一項に記載の方法。
６５． 前記狭窄が、約１０μｍの長さおよび約３μｍ～約８μｍの幅を有する、実施形態１から６４のいずれか一項に記載の方法。
６６． 前記細胞懸濁液および前記複合体を、少なくとも１本の電極によって発生された電場と接触させるステップをさらに含む、実施形態１から６５のいずれか一項に記載の方法。
６７． ２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するためのシステムであって、前記システムは、狭窄を含むマイクロ流体チャネルと、前記細胞を含む細胞懸濁液と、２個またはそれよりも多い分子の前記複合体とを含み、ここで前記狭窄は、前記細胞が前記狭窄を通ることができるように構成されており、前記狭窄が前記細胞を変形させ、これにより、２個またはそれよりも多い分子の前記複合体が前記細胞に進入するように、前記細胞の摂動を引き起こす、システム。
６８． ２個またはそれよりも多い分子の複合体を細胞へと送達するためのシステムであって、前記システムは、ポアを有する表面と、前記細胞を含む細胞懸濁液と、２個またはそれよりも多い分子の前記複合体とを含み、ここでポアを有する前記表面は、前記細胞が前記ポアを通ることができるように構成されており、前記ポアが前記細胞を変形させ、これにより、２個またはそれよりも多い分子の前記複合体が前記細胞に進入するように、前記細胞の摂動を引き起こす、システム。
６９． 前記表面が、フィルターまたは膜である、実施形態６８に記載のシステム。
７０． 電場を発生するための少なくとも１本の電極をさらに含む、実施形態６７から６９のいずれか一項に記載のシステム。
７１． 分子の前記複合体の形成が、可逆的である、実施形態６７から７０のいずれか一項に記載のシステム。
７２． 前記複合体の少なくとも２個またはそれよりも多い分子が、非共有結合性相互作用によって会合する、実施形態６７から７１のいずれか一項に記載のシステム。
７３． 実施形態１から６６のいずれか一項に記載の方法によって、細胞への２個またはそれよりも多い分子を含む複合体を送達するために使用される、実施形態６７から７２のいずれか一項に記載のシステム。
７４． ２個またはそれよりも多い分子の複合体を含む細胞であって、２個またはそれよりも多い分子の前記複合体が、実施形態１から６６のいずれか一項に記載の方法によって前記細胞に送達された、細胞。
（実施例１：複合体の狭窄媒介性送達）
細胞において一連の実験を行って、複合体の狭窄媒介性送達を実証する。
培養細胞を、収集し、計数し、洗浄し、送達のために細胞培養培地に１０～２０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁する。ポリペプチド－核酸複合体は、細胞との接触に先立ちｉｎ ｖｉｔｒｏで組み立てられる。複合体濃度、溶液容量オスモル濃度、塩濃度、温度、ｐＨ、血清および界面活性剤含量ならびに粘性を含む複合体形成条件は、形成された複合体が、細胞への送達後まで安定したインタクトな形態を保つことを確実にするように最適化される。細胞懸濁液は、２種の異なるマイクロ流体チップ、１０－６または１０－７チップに、６０および９０ｐｓｉの圧力で通される。チップは、同じ幅（４ミクロン）の狭窄を有するが、２種の異なる狭窄長さ（３０ミクロン 対 １０ミクロン）を有する。狭窄に通した後に、細胞を、事前に組み立てられた複合体と共にインキュベートして、細胞への複合体の送達を可能にする。溶液容量オスモル濃度、塩濃度、温度、ｐＨ、血清および界面活性剤含量、細胞および複合体濃度ならびに粘性を含む、細胞インキュベーション条件は、複合体が、細胞への送達後まで安定したインタクトな形態を保つことを確実にするように最適化される。一部の例では、複合体は、送達効率のための代替物としての３ｋＤａ－Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅデキストラン（０．１５ｍｇ／ｍＬ）と同時送達される。
送達後４８時間目に、ＦＡＣＳに基づく読み取りを使用して、複合体の送達を決定する。エンドサイトーシスのための対照として、狭窄を通さなかった細胞は、狭窄媒介手順に供された細胞と同じ時間にわたり、事前に組み立てられた複合体と共にインキュベートされる。
（実施例２：Ｔ細胞への複合体の狭窄媒介性送達）
無刺激ヒトＴ細胞において一連の実験を行って、複合体の狭窄媒介性送達を実証する。
新鮮ＰＢＭＣは、標準フィコール勾配を使用して、ヒト血液から単離される。次に、Ｔ細胞をネガティブ選択し（ヒトＴ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、計数し、洗浄し、送達のためにＯｐｔｉＭＥＭに１０～２０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁する。ポリペプチド－核酸複合体は、細胞狭窄に先立ちｉｎ ｖｉｔｒｏで組み立てられる。複合体濃度、溶液容量オスモル濃度、塩濃度、温度、ｐＨ、血清および界面活性剤含量ならびに粘性を含む、複合体形成条件は、形成された複合体が、Ｔ細胞への送達後まで安定したインタクトな形態を保つことを確実にするように最適化される。Ｔ細胞懸濁液は、２種の異なるマイクロ流体チップ、１０－４および３０－４に、６０および９０ｐｓｉの圧力で通される。チップは、同じ幅（４ミクロン）の狭窄を有するが、２種の異なる狭窄長さ（３０ミクロン 対 １０ミクロン）を有する。狭窄に通した後に、Ｔ細胞を、事前に組み立てられた複合体と共にインキュベートして、細胞への複合体の送達を可能にする。溶液容量オスモル濃度、塩濃度、温度、ｐＨ、血清および界面活性剤含量、細胞および複合体濃度ならびに粘性を含む、細胞インキュベーション条件は、複合体が、Ｔ細胞への送達後まで安定したインタクトな形態を保つことを確実にするように最適化される。複合体は、送達効率のための代替物としての３ｋＤａ－Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅデキストラン（０．１５ｍｇ／ｍＬ）と同時送達される。
送達後４８時間目に、ＦＡＣＳに基づく読み取りを使用して、複合体の送達を決定する。エンドサイトーシスのための対照として、狭窄を通さなかったＴ細胞は、狭窄媒介手順に供された細胞と同じ時間にわたり、事前に組み立てられた複合体と共にインキュベートされる。
（実施例３：ＨＥＫ２９３細胞へのタンパク質／タンパク質／核酸複合体の狭窄媒介性送達）
本研究において、タンパク質／タンパク質／核酸複合体の狭窄媒介性送達を評価した。複合体は、蛍光標識された抗ＣＡＳ９ ＩｇＧ抗体とｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体形成された、ＣＡＳ９タンパク質、およびＢ２Ｍ遺伝子座をノックダウンするように設計されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含有するリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を含有した。
先ず、１０μｇの組換えＣＡＳ９タンパク質（ＰＮＡ Ｂｉｏ）を、Ｂ２Ｍ遺伝子座を特異的に標的化するように設計された２．５モル過剰の無修飾ｇＲＮＡ（ＰＮＡ Ｂｉｏ）と組み合わせ、続いて氷上で２０分間インキュベーションすることにより、ＲＮＰ複合体を形成した。次に、抗ＣＡＳ９ ＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、１：１１の抗体：ＲＮＰモル比で、室温でＲＮＰ複合体と複合体形成させた。ＨＥＫ２９３細胞を計数し、洗浄して、抗体／ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ複合体を含有するＯｐｔｉＭＥＭに１０～２０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。狭窄長さ１０ミクロンおよび狭窄幅７ミクロンを有するマイクロ流体チップに９０ｐｓｉで細胞懸濁液を通すことにより、抗体／ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ複合体を細胞に送達した。細胞懸濁液に０．１５ｍｇ／ｍＬで含めることにより、３ｋＤａ－Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅデキストランを複合体と同時送達し、これを試料間の送達条件の均一性のための内部標準として使用した。実験対照は、細胞が、狭窄なしで抗体／ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ複合体に処理持続時間にわたり曝露された試料（エンドサイトーシス対照）、ＲＮＰ複合体単独が狭窄媒介性送達に供された試料、および抗体単独が狭窄媒介性送達に供された試料を含んだ。全試料が、３ｋＤａ－Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅデキストラン内部標準を含んだ。
細胞懸濁液をマイクロ流体チップに通してから２４時間および６日後に、ＦＡＣＳ解析を実行して、それぞれ送達およびＢ２Ｍノックダウンを評価した。２４時間目に、ＦＡＣＳ解析によって細胞を評価して、３ｋＤａ－Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅデキストランおよび蛍光標識された抗ＣＡＳ９抗体についての陽性を決定した。３ｋＤａ－Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅデキストラン内部標準が陽性の細胞のパーセンテージは、全ての圧搾試料にわたって同様であり（６０．５％、６２．７％および６０．３％）（図１Ａおよび図１Ｂ）、狭窄における送達条件が試料毎に一貫したことを示し、異なるカーゴの送達の比較を可能にする。本発明者らは、単独で送達された場合とは対照的に、ＲＮＰ複合体と予め複合体形成された場合に、抗体の送達が高かった（３９．６％ 対 １４．７％抗ＣＡＳ９抗体＋）ことを見出した（図１Ａおよび図１Ｂ）。複合体は、抗体単独よりも大きいため、この知見は予想外であった。６日目に、Ｂ２Ｍに関して細胞を染色し、ＦＡＣＳ解析を行って、ＲＮＰに起因するＢ２Ｍタンパク質ノックダウンのレベルを評価した。ＲＮＰ単独および抗体／ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ複合体条件は共に、Ｂ２Ｍのノックダウンを示し、機能的複合体の成功裏の送達を示す。編集は、ＲＮＰ単独による条件において、抗体と複合体形成された場合よりも僅かに高かった（５４．９％ 対 ４９．１％ Ｂ２Ｍ－）（図２）。
（実施例４：ＨｅＬａ細胞へのタンパク質／小分子複合体の狭窄媒介性送達）
本研究において、タンパク質／小分子複合体の狭窄媒介性送達を評価した。複合体は、蛍光標識されたストレプトアビジンおよび蛍光標識されたビオチンを含有した。
ＯｐｔｉＭＥＭ中のＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識されたストレプトアビジンの２μＭ溶液を、ＯｐｔｉＭＥＭ中の変動濃度のＦＩＴＣ標識されたビオチン（２、８または１６μＭ）と組み合わせて、それぞれビオチン：ストレプトアビジンモル比１：１、４：１および８：１を０℃において達成し、１時間氷上で維持した。ＨｅＬａ細胞を計数し、洗浄して、ＯｐｔｉＭＥＭに１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。狭窄長さ１０ミクロンおよび狭窄幅７ミクロンを有するマイクロ流体チップに細胞懸濁液を９０ｐｓｉで通すことにより、ストレプトアビジン－ビオチン複合体を細胞に送達した。細胞懸濁液に０．１ｍｇ／ｍＬで含めることによって、３ｋＤａ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストランを複合体と同時送達し、これを試料間の送達条件の均一性の内部標準として使用した。実験対照は、細胞が、狭窄なしでストレプトアビジン－ビオチン複合体（全モル比）に処理持続時間にわたり曝露された試料（エンドサイトーシス対照）、ストレプトアビジンおよびビオチン（１：１モル比）が狭窄媒介性送達に先立ちプレインキュベートされなかった試料、ストレプトアビジン単独（２μＭ）が狭窄媒介性送達に供された試料、ならびにビオチン単独（２μＭ、８μＭおよび１６μＭ）が狭窄媒介性送達に供された試料を含んだ。全試料が、３ｋＤａ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストラン内部標準を含んだ。
細胞懸濁液をマイクロ流体チップに通した直後にＦＡＣＳ解析を実行し、３ｋＤａ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストラン、ストレプトアビジンおよびビオチンについての陽性を決定することにより、複合体およびデキストラン送達を評価した。３ｋＤａ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストラン内部標準が陽性の細胞のパーセンテージは、全ての圧搾試料にわたって同様であり（７６～８６％、図３Ａおよび図３Ｂ）、異なるカーゴの送達の比較を可能にする。ストレプトアビジン単独条件（２０．１％ストレプトアビジン＋）および１：１ストレプトアビジン－ビオチン複合体条件（２８．９％ストレプトアビジン＋、図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃ）におけるストレプトアビジン送達が同様であることが観察され、ストレプトアビジンが、検査された狭窄条件下で細胞に進入することができることを示す。単独で投与された場合、ビオチン取り込みが用量依存的様式で起こった（８１～９７％ビオチン＋、図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃ）が、ストレプトアビジンの添加は、１：１および４：１ビオチン：ストレプトアビジンモル比においてビオチン蛍光シグナルのほとんど完全な喪失を引き起こした（４～１５％ビオチン＋）。ビオチン－フルオレセイン蛍光は、ストレプトアビジンに結合されるとクエンチされることが公知であり（Kadaら、Biochim. Biophys. Acta、１４２７巻（１９９９年）４４～４８頁）、ストレプトアビジンは、ストレプトアビジン１分子につき最大４分子のビオチンに結合することができるため、このことは、複合体形成を示す。過剰ビオチン（８：１ビオチン：ストレプトアビジンモル比）の導入は、複合体を形成しない細胞内ビオチンの存在により、ビオチン関連の蛍光を増加させた。興味深いことに、ストレプトアビジンシグナルは、おそらく、ストレプトアビジンフルオロフォアとのクロストークにより、ビオチンの相対濃度が増大するにつれて減少した。試薬がプレインキュベートされていない１：１「非複合体」対照（ＮＣ）は、ストレプトアビジンおよびビオチンの両方に関して、１：１の予め複合体形成された試料と比較して、同様のレベルの送達を示し、複合体の非常に迅速な結合または細胞内複合体形成を支持する（図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃ）。総合すると、複合体形成の間に限り観察されるビオチン蛍光の十分に特徴付けられたクエンチングと一致する細胞内ストレプトアビジン蛍光によって示される通り、これらの結果は、複合体の形成が、マイクロ流体デバイスに通すことによる複合体の送達により迅速に起こったことを示す。
別の研究において、蛍光標識されたストレプトアビジンおよびファロイジンコンジュゲートされたビオチンを含有するタンパク質／小分子複合体の狭窄媒介性送達を評価した。
２００ｐｍｏｌのＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅコンジュゲートされたストレプトアビジン（ＳＡ）を、２００ｐｍｏｌのファロイジンコンジュゲートされたビオチン（Ｂ－Ｐｈａｌｌ）と予め複合体形成させた。ストレプトアビジン－ビオチン複合体を氷上で４０分間インキュベートした（１：１比）。ＨｅＬａ細胞を計数し、洗浄して、２μＭの複合体を含有するＯｐｔｉＭＥＭに２～１０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。狭窄長さ１０ミクロンおよび狭窄幅７ミクロンを有するマイクロ流体チップに細胞懸濁液を９０ｐｓｉで通すことにより、ストレプトアビジン－ビオチン複合体を細胞に送達した。細胞懸濁液に０．１ｍｇ／ｍＬで含めることにより、３ｋＤａ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストランを複合体と同時送達し、これを試料間の送達条件の均一性の内部標準として使用した。実験対照は、細胞が、狭窄なしでストレプトアビジン－ビオチン複合体に処理持続時間にわたり曝露された試料（エンドサイトーシス対照）、ＳＡ単独が狭窄媒介性送達に供された試料、およびＢ－Ｐｈａｌｌ単独が狭窄媒介性送達に供された試料を含んだ。全試料が、３ｋＤａ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストラン内部標準を含んだ。
細胞懸濁液をマイクロ流体チップに通した直後にフローサイトメトリー解析を実行して、３ｋＤａ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストランおよびＳＡについての陽性を決定することにより、複合体およびデキストラン送達を評価した。３ｋＤａ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストラン内部標準が陽性の細胞のパーセンテージは、全ての圧搾試料にわたって同様であり（９６．６％、９６．７％および９６．８％）（図４Ａおよび図４Ｂ）、異なるカーゴの送達の比較を可能にする。本発明者らは、ＳＡの送達が、単独で送達された場合と比較して、Ｂ－Ｐｈａｌｌと予め複合体形成された場合に低かったことを見出した（３０．５％ 対 ４４．９％ ＳＡ＋、図４Ａおよび図４Ｂ）。ＳＡを有する試料において、本発明者らは、３ｋＤａ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０デキストラン送達が、ＳＡ送達と相関することを見出した（図５）。
（実施例５：Ｔ細胞へのタンパク質／タンパク質複合体の狭窄媒介性送達）
本研究において、タンパク質／タンパク質複合体の狭窄媒介性送達を評価した。複合体は、ＨＰＶ１６ Ｅ７合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）およびマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）を含有した。
ＨＰＶ １６ Ｅ７ ＳＬＰを、２．５５μＭの濃度で水に再懸濁した。ＭＳＡを、１３２．２μＭでＲＰＭＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）に再懸濁した。複合体を形成するために、所望の最終濃度の２倍のＳＬＰを、ＲＰＭＩ中の４０μＭ ＭＳＡと共に１０分間室温でインキュベートした。ＥａｓｙＳｅｐマウス汎Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからＴ細胞を単離し、洗浄し、計数して、即時使用のために２０×１０６細胞／ｍＬでＲＰＭＩに再懸濁した。複合体形成されていないＳＬＰまたはＳＬＰ／ＭＳＡ複合体を、示されている濃度（５μＭ、１０μＭまたは２０μＭ）でマウスＴ細胞に直接添加し、狭窄長さ１０ミクロンおよび狭窄幅３ミクロンを有するマイクロ流体チップに細胞懸濁液を９０ｐｓｉで通すことにより、細胞に送達した。細胞懸濁液に０．１５ｍｇ／ｍＬで含めることにより、３ｋＤａ－Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅデキストランを複合体と同時送達し、これを試料間の送達条件の均一性の内部標準として使用した。実験対照は、細胞が、狭窄なしでＳＬＰまたはＳＬＰ／ＭＳＡ複合体に処理持続時間にわたり曝露された試料（エンドサイトーシス対照）、およびＲＰＭＩ＋水のみを含むビヒクル単独試料を含んだ。全試料が、３ｋＤａ－Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅデキストラン内部標準を含んだ。
ａ）ＳＬＰもしくはＳＬＰ／ＭＳＡのいずれかの狭窄媒介性送達に供された５×１０６個のＴ細胞；ｂ）エンドサイトーシスおよび／または非特異的結合の対照として狭窄なしでＳＬＰもしくはＳＬＰ／ＭＳＡと共にインキュベートされた５×１０６個のＴ細胞；またはｃ）ビヒクル単独で狭窄媒介性送達に供された５×１０６個のＴ細胞（抗原なし）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与により０日目に初回刺激（prime）したＣ５７ＢＬ／６マウスにより、ｉｎ ｖｉｖｏ研究を実行した。６日目に、マウスを出血させ、ｉＴＡｇテトラマー／ＰＥ－Ｈ－２ Ｄｂ ＨＰＶ １６ Ｅ７テトラマー（ＭＢＬ）を使用して、血液中を循環するＥ７特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のレベルを決定した。ＦｌｏｗＪｏを使用してフローサイトメトリー解析を行った。
マイクロ流体チップ通過直後にＦＡＣＳ解析を実行して、３ｋＤａ－Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅデキストランについての陽性を決定することにより、デキストラン送達を評価した。図６Ａは、狭窄なしでは、デキストラン＋細胞の割合は、ＳＬＡ単独で、特に、より高いＳＬＰ濃度において相対的に高かったことを示す。本発明者らは、狭窄なしでは、より高いＳＬＰ濃度におけるＴ細胞の生存率（ヨウ化プロピジウム染色によって決定される）が、有意に減少したことも分かった（図６Ｂ）。このことは、ＳＬＰ単独とのインキュベーションが、高いバックグラウンドおよび高い毒性をもたらしたことを示す。ＳＬＰが、ＭＳＡと複合体形成された場合、狭窄なしの対照シグナルは、有意に低下した（図６Ｃ）。本発明者らは、複合体（狭窄ありおよび狭窄なしの両方）の毒性が、同じ濃度におけるＳＬＰ単独よりも有意に低いことも見出した（図６Ｂおよび図６Ｄ）。まとめると、このことは、複合体の形成が、有意にかつ予想外に、送達動力学および結果としての生存率を変更したことを示す。図７は、様々な条件の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。図８は、処理されたＴ細胞がマウスに導入して戻されてから６日後の、Ｅ７特異的ＣＴＬのテトラマー染色によって測定された内因性ＣＤ８ Ｔ細胞応答を示す。テトラマー染色によって分かる通り、狭窄なしの対照条件下でＳＬＰ／ＭＳＡ複合体と共にインキュベートされたＴ細胞（Ｅｎｄｏ＋ＭＳＡ）は、狭窄なしでＳＬＰ単独と共にインキュベートされたＴ細胞（Ｅｎｄｏ）と比較して、大幅に低下したレベルのＣＤ８応答をもたらした。これらの結果を考慮すると予想外なことに、狭窄ありでＳＬＰ／ＭＳＡ複合体と共にインキュベートされたＴ細胞（ＳＱＺ＋ＭＳＡ）は、狭窄ありでＳＬＰ単独と共にインキュベートされたＴ細胞（ＳＱＺ）と比較して、増加したレベルのＣＤ８応答をもたらした。

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