CN111683964A - 细胞内递送生物分子来调节抗体产生 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过使细胞悬浮液通过缩窄部来调节抗体产生的方法和系统，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得调节抗体产生的化合物进入所述细胞。在一些实施方案中，本发明提供了用于诱导细胞中的从头抗体产生的方法和系统。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月5日提交的美国临时申请号62/594,981的优先权，将其内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开文本总体上涉及通过使细胞悬浮液通过使细胞变形的缩窄部将化合物递送至细胞中来调节抗体产生的方法。
背景技术
抗体通常用于许多诊断、研究和治疗目的，并在介导有效的免疫应答中发挥关键作用。在体液免疫应答期间，一系列复杂的信号传导事件协调抗体产生。充足的体内抗体产生对于对抗感染性疾病、在癌症期间介导抗肿瘤反应及产生有效的疫苗介导的免疫至关重要。相反，针对内源性抗原的抗体产生有助于致病性自身免疫应答。
快速产生具有所需抗体数量和特异性的抗体库是引发有效体液免疫应答的关键部分。刺激内源性抗体产生或诱导从头抗体产生的蛋白质、核酸或小分子的细胞内递送可以使抗原特异性抗体的产生进行微调，以用于研究和治疗目的。例如，诱导针对肿瘤相关抗原的强化的或从头的体液免疫应答可能对治疗癌症有用。
目前的细胞内递送方法不能有效地将分子递送至敏感细胞类型(如原代免疫细胞和干细胞)以刺激或诱导抗体产生。因此，对于高度有效地递送一系列分子来调节抗体产生的细胞内递送技术的需求尚未得到满足。此外，允许快速、高通量的细胞内递送分子以调节抗体产生的方法可以更有效地应用于利用治疗和研发抗体的大规模临床和工业应用。描述使用通道将化合物递送至细胞的方法的参考文献包括WO 2013059343、WO 2015023982和PCT/US2015/058489。
本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)均通过引用以其整体并入。
发明内容
本发明的某些方面提供了一种改变在产生抗体的细胞中的内源性抗体产生的方法，所述方法包括使包含所述产生抗体的细胞的细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得改变抗体产生的化合物进入所述产生抗体的细胞，其中改变了在所述产生抗体的细胞中的内源性抗体产生。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被增强。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被减少。在一些实施方案中，所述缩窄部被包含在微流体通道内。在一些实施方案中，所述缩窄部是孔或被包含在孔内。在一些实施方案中，所述孔被包含在表面中。在一些实施方案中，所述表面是过滤器。在一些实施方案中，所述表面是膜。在一些实施方案中，所述缩窄部大小是所述细胞直径的函数。在一些实施方案中，所述缩窄部大小是所述细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。
在可与先前实施方案组合的一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含混合的细胞群。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液是全血。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含纯化的细胞群。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊或兔细胞。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含人细胞。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含非哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含细菌、酵母、鸡、青蛙、昆虫或线虫细胞。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含外周血单核细胞。在一些实施方案中，所述产生抗体的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述产生抗体的细胞是B细胞或B细胞前体。在一些实施方案中，所述产生抗体的细胞是B细胞前体、幼稚B细胞、激活的B细胞、记忆B细胞、浆细胞、B-1细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、调节性B细胞或B细胞淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，所述产生抗体的细胞是骨髓源性B细胞前体。
在可与先前实施方案组合的一些实施方案中，所述化合物包含核酸。在一些实施方案中，核酸编码siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、saRNA或shRNA。在一些实施方案中，所述核酸是质粒。在一些实施方案中，所述化合物包含肽核酸(PNA)。在一些实施方案中，所述化合物包含蛋白质-核酸复合物。在一些实施方案中，所述蛋白质-核酸复合物包含Cas9蛋白和指导RNA。在一些实施方案中，所述蛋白质-核酸复合物还包含供体DNA。在一些实施方案中，所述核酸编码Cas9蛋白和指导RNA。在一些实施方案中，所述蛋白质-核酸复合物还包含供体DNA。
在一些实施方案中，所述化合物包含蛋白质或多肽。在一些实施方案中，所述蛋白质是TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶或CRE重组酶。在一些实施方案中，所述蛋白质是转录因子。在一些实施方案中，所述蛋白质是转座酶或整合酶。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗凋亡蛋白。
在一些实施方案中，所述化合物是B细胞激活因子。在一些实施方案中，所述化合物是增殖诱导配体。在一些实施方案中，所述化合物是B细胞受体信号传导分子的激活剂。在一些实施方案中，所述化合物是ATP。在一些实施方案中，所述化合物是细胞激活因子。在一些实施方案中，所述化合物是细胞分化因子。在一些实施方案中，所述化合物是小分子。在一些实施方案中，所述化合物是在纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述化合物是在脂质体中。在一些实施方案中，所述化合物是在核酸递送媒介物中。在一些实施方案中，所述化合物是在病毒中。在一些实施方案中，所述化合物是在病毒颗粒中。在一些实施方案中，所述化合物是在包含病毒衣壳的媒介物中。在一些实施方案中，所述化合物是在腺相关病毒中。在一些实施方案中，所述化合物是在腺相关病毒颗粒中。在一些实施方案中，所述化合物是在包含腺相关病毒衣壳的媒介物中。
在一些实施方案中，所述抗体是人或人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗原结合抗体变体。在一些实施方案中，所述抗体类别是IgM、IgG、IgA、IgE或IgD。在一些实施方案中，所述抗体是抗原结合抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是Fab、Fab’、Fab’-SH、Fab2、F(ab’)2、Fv、scFv、scFab或dsFv片段。在一些实施方案中，所述抗体是全长抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单结构域抗体。在一些实施方案中，所述抗体是纳米抗体、VHH或VNAR抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是单链抗体。在一些实施方案中，所述抗体是多特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗体融合蛋白。
在一些实施方案中，所述细胞悬浮液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述化合物接触。在一些实施方案中，所述通道包括约30μm的缩窄部长度和约4μm的缩窄部宽度。在一些实施方案中，所述通道包括约10μm的缩窄部长度和约4μm的缩窄部宽度。在一些实施方案中，所述孔大小为约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。在一些实施方案中，所述方法是在约-5℃与约45℃之间进行。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生改变了至少约25％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％或大于约200％。在一些实施方案中，与由未通过所述缩窄部的细胞得到的抗体产生相比，所述内源性抗体产生持续约25％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％或大于约200％更长的时间。
在一些实施方案中，通过将根据上述方法中的任一种修饰的产生抗体的免疫细胞引入患者中来治疗所述患者。在一些实施方案中，将所述细胞从患者分离，根据上述方法中的任一种进行修饰并引入回所述患者中。在一些实施方案中，将所述细胞从不同个体分离，根据上述方法中的任一种进行修饰并引入到患者中。在一些实施方案中，通过将根据上述方法中的任一种修饰的产生抗体的免疫细胞引入个体来增强在所述个体中的抗体产生。在一些实施方案中，将所述细胞从个体分离，根据上述方法中的任一种进行修饰并引入回所述个体中。在一些实施方案中，将所述细胞从个体分离，根据上述方法中的任一种进行修饰并引入不同个体中。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述细胞与由至少一个电极产生的电场接触的步骤。本发明的某些方面涉及一种系统，其包括用于上述方法的任一种中的所述缩窄部、细胞悬浮液和化合物。在一些实施方案中，所述系统还包括至少一个电极以产生电场。
本发明的某些方面提供了一种用于诱导细胞中的从头抗体产生的方法，所述方法包括使细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得引发抗体产生的化合物进入所述细胞，其中诱导了在所述细胞中的从头抗体产生。在一些实施方案中，所述缩窄部被包含在微流体通道内。在一些实施方案中，所述缩窄部是孔或被包含在孔内。在一些实施方案中，所述孔被包含在表面中。在一些实施方案中，所述表面是过滤器。在一些实施方案中，所述表面是膜。在一些实施方案中，所述缩窄部大小是所述细胞直径的函数。在一些实施方案中，所述缩窄部大小是所述细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。
在可与先前实施方案组合的一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含混合的细胞群。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液是全血。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含纯化的细胞群。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊或兔细胞。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含人细胞。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含非哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含细菌、酵母、鸡、青蛙、昆虫或线虫细胞。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含外周血单核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞、干细胞、骨髓源性祖细胞、红细胞前体、成纤维细胞、心肌细胞或细胞系细胞。在一些实施方案中，所述细胞是B细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞或干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是B细胞或B细胞前体。在一些实施方案中，所述细胞是B细胞前体、幼稚B细胞、激活的B细胞、记忆B细胞、浆细胞、B-1细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、调节性B细胞或B细胞淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，所述细胞是骨髓源性B细胞前体。
在可与先前实施方案组合的一些实施方案中，所述化合物包含核酸。在一些实施方案中，所述核酸编码免疫球蛋白。在一些实施方案中，所述核酸编码从头抗体。在一些实施方案中，所述核酸被整合到所述细胞基因组中。在一些实施方案中，所述核酸未被整合到所述细胞基因组中。在一些实施方案中，核酸编码siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、saRNA或shRNA。在一些实施方案中，所述核酸是质粒。在一些实施方案中，所述化合物包含肽核酸(PNA)。在一些实施方案中，所述化合物包含蛋白质-核酸复合物。在一些实施方案中，所述蛋白质-核酸复合物包含Cas9蛋白和指导RNA。在一些实施方案中，所述蛋白质-核酸复合物还包含供体DNA。在一些实施方案中，所述核酸编码Cas9蛋白和指导RNA。在一些实施方案中，所述蛋白质-核酸复合物还包含供体DNA。
在可与先前实施方案组合的一些实施方案中，所述化合物包含蛋白质或多肽。在一些实施方案中，所述蛋白质是TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶或CRE重组酶。在一些实施方案中，所述蛋白质是转录因子。在一些实施方案中，所述蛋白质是转座酶或整合酶。
在可与先前实施方案组合的一些实施方案中，所述化合物是B细胞激活因子。在一些实施方案中，所述化合物是增殖诱导配体。在一些实施方案中，所述化合物是B细胞受体信号传导分子的激活剂。在一些实施方案中，所述化合物是细胞激活因子。在一些实施方案中，所述化合物是细胞分化因子。在一些实施方案中，所述化合物是小分子。在一些实施方案中，所述化合物是在纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述化合物是在脂质体中。在一些实施方案中，所述化合物是在核酸递送媒介物中。在一些实施方案中，所述化合物是在病毒中。在一些实施方案中，所述化合物是在病毒颗粒中。在一些实施方案中，所述化合物是在包含病毒衣壳的媒介物中。在一些实施方案中，所述化合物是在腺相关病毒中。在一些实施方案中，所述化合物是在腺相关病毒颗粒中。在一些实施方案中，所述化合物是在包含腺相关病毒衣壳的媒介物中。
在可与先前实施方案组合的一些实施方案中，所述抗体是人或人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗原结合抗体变体。在一些实施方案中，所述抗体类别是IgM、IgG、IgA、IgE或IgD。在一些实施方案中，所述抗体是抗原结合抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是Fab、Fab’、Fab’-SH、Fab2、F(ab’)2、Fv、scFv、scFab或dsFv片段。在一些实施方案中，所述抗体是全长抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单结构域抗体。在一些实施方案中，所述抗体是纳米抗体、VHH或VNAR抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是单链抗体。在一些实施方案中，所述抗体是多特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗体融合蛋白。
在可与先前实施方案组合的一些实施方案中，所述细胞悬浮液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述化合物接触。在一些实施方案中，所述通道包括约30μm的缩窄部长度和约4μm的缩窄部宽度。在一些实施方案中，所述通道包括约10μm的缩窄部长度和约4μm的缩窄部宽度。在一些实施方案中，所述孔大小为约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。在一些实施方案中，所述方法是在约-5℃与约45℃之间进行。
在可与先前实施方案组合的一些实施方案中，通过将根据上述方法中的任一种修饰的细胞引入患者来治疗所述患者。在一些实施方案中，将所述细胞从患者分离，根据上述方法中的任一种进行修饰并引入回所述患者中。在一些实施方案中，将所述细胞从不同个体分离，根据上述方法中的任一种进行修饰并引入到患者中。在一些实施方案中，通过将根据上述方法中的任一种修饰的细胞引入个体来诱导在所述个体中的从头抗体产生。在一些实施方案中，将所述细胞从个体分离，根据上述方法中的任一种进行修饰并引入回所述个体中。在一些实施方案中，将所述细胞从个体分离，根据上述方法中的任一种进行修饰并引入不同个体中。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述细胞与由至少一个电极产生的电场接触的步骤。本发明的某些方面涉及一种系统，其包括用于上述方法的任一种中的所述缩窄部、细胞悬浮液和化合物。在一些实施方案中，所述系统还包括至少一个电极以产生电场。
具体实施方式
本发明提供了通过使细胞悬浮液通过缩窄部从而能够将调节抗体产生的化合物递送至细胞来调节抗体产生的方法。本发明提供了通过使含有产生抗体的细胞的细胞悬浮液通过缩窄部来改变产生抗体的细胞中的内源性抗体产生的方法，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得改变抗体产生的化合物进入所述产生抗体的细胞，其中改变了在所述产生抗体的细胞中的内源性抗体产生。本发明还提供了通过使细胞悬浮液通过缩窄部来诱导细胞中的从头抗体产生的方法，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得引发抗体产生的化合物进入所述细胞，其中诱导了在所述细胞中的从头抗体产生。例如，可以将编码抗体的核酸递送至能够产生抗体的细胞。
I.一般技术
本文描述或提及的技术和程序是本领域技术人员通常充分了解的和通常使用常规方法所采用的，所述技术和程序是如例如在如下文献中所述的广泛利用的方法：Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook等人,第4版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,纽约,2012)；Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel等人编辑,2003)；the series Methods in Enzymology(AcademicPress,Inc.)；PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑,1995)；Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow和Lane编辑,1988)；Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney,第6版,J.Wiley和Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A LaboratoryNotebook(J.E.Cellis编辑,Academic Press,1998)；Introduction to Cell and TissueCulture(J.P.Mather和P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,J.Wiley和Sons,1993-8)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,1996)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑,1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编辑,J.Wiley和Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等人,2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A PracticalApproach(D.Catty.编辑,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A PracticalApproach(P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford University Press,2000)；UsingAntibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,Harwood AcademicPublishers,1995)；及Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人编辑,J.B.Lippincott Company,2011)。
II.定义
出于解释本说明书的目的将应用以下定义，并且在适当时以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。如果下面列出的任何定义与通过引用并入本文的任何文件相冲突，则应以所列出的定义为准。
除非另有说明，否则如本文使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
应理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含多个方面和实施方案”、“由多个方面和实施方案组成”和“基本上由多个方面和实施方案组成”。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子)、单价抗体以及抗体片段(例如Fab、F(ab′)2和Fv)。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”可互换使用。在一些例子中，抗体可以与另一种多肽(例如，毒性多肽、报告多肽等)融合。
术语“全长抗体”、“完整抗体(intact antibody)”或“整个抗体(wholeantibody)”可互换使用，是指基本上完整形式的抗体，与抗体片段相反。具体地，整个抗体包括具有重链和轻链(包括Fc区)的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，所述完整抗体可以具有一种或多种效应物功能。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分；例如，完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“单链抗体”或“单链可变片段”也缩写为“sFv”或“scFv”，是指包含连接到单个多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施方案中，sFv多肽还包含在VH与VL结构域之间的多肽接头，其使sFv能够形成用于抗原结合的所需结构。
术语“单结构域抗体”或“纳米抗体”也缩写为“sdAb”或“VHH”，是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。
术语“人源化”是指非人(例如鼠)抗体的形式，其是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。例如，人源化抗体可以是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体抗体的高变区(HVR)的残基被具有所需特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠，兔或非人灵长类动物)的HVR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架(“FR”)残基被相应的非人残基替代。
术语“人抗体”是指具有对应于由人产生的抗体的序列的氨基酸序列的抗体。
术语“从头抗体产生”是指先前不是由特定细胞产生的抗体的产生。在一些实施方案中，所述由细胞产生的抗体具有与所述细胞先前产生的一种或多种抗体不同的抗原结合特异性或不同的同种型。在一些实施方案中，所述抗体是由先前不产生抗体的细胞产生。
术语“融合蛋白”和“融合多肽”是指具有共价连接在一起的两个部分的多肽，其中每个部分是具有不同特性的多肽。在一些实施方案中，所述融合蛋白含有与异源蛋白结合的抗体。所述特性可以是生物特性，如体外或体内活性。
如本文使用的术语“孔”是指开口，包括但不限于，材料内的洞、裂缝、腔、孔隙、断裂、间隙或穿孔。在一些例子中，(在指示的情况下)所述术语是指本公开文本的表面内的孔。在其他例子中(在指明的情况下)，孔可以指细胞膜中的孔。
如本文使用的术语“膜”是指含有孔的选择性屏障或薄片。该术语包括充当边界或衬里的柔韧的片状结构。在一些实施例中，该术语是指含有孔的表面或过滤器。此术语不同于术语“细胞膜”。
如本文所用的术语“过滤器”是指允许选择性通过孔的多孔制品。在一些例子中，所述术语是指含有孔的表面或膜。
如本文所用的术语“不均匀的”是指在结构或组成上是混合的或不均一的物质。在一些例子中，所述术语是指在给定表面内具有不同尺寸、形状或分布的孔。
如本文所用的术语“均匀的”是指在整个结构或组成上一致或均一的物质。在一些例子中，所述术语是指在给定表面内具有一致尺寸、形状或分布的孔。
如本文所用的术语“异源的”是指源自不同生物体的分子。在一些例子中，所述术语是指通常在给定生物体中未发现或表达的核酸或蛋白质。
如本文所用的术语“同源的”是指源自相同生物体的分子。在一些例子中，所述术语是指通常在给定生物体中发现或表达的核酸或蛋白质。
如本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的聚合形式的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA；基因组DNA；cDNA；DNA-RNA杂合体；或者包括嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学修饰的或生化修饰的核苷酸碱基、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的骨架可包括糖和磷酸基团(正如典型地可在RNA或DNA中所见的)或者经修饰或取代的糖或磷酸基团。可替代地，多核苷酸的骨架可以包含合成亚基(如氨基磷酸酯)的聚合物，并因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。此外，双链多核苷酸可以从化学合成的单链多核苷酸产物，通过合成互补链并在适当的条件下使这些链退火或者是通过使用DNA聚合酶用适当的引物从头合成互补链来获得。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物且不限于最小长度。氨基酸残基的此类聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖了全长蛋白质及其片段两者。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指这样的蛋白质，其包括对天然序列的修饰，如缺失、添加和取代(通常本质上是保守的)，只要该蛋白质保持所需的活性即可。这些修饰可以是故意的(如通过定点诱变)，或者可以是偶然的(如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增导致的错误)。
对于本文描述的任何结构和功能特征，确定这些特征的方法是本领域已知的。
III.内源性抗体产生
在某些方面，本发明提供了用于改变产生抗体的细胞中的内源性抗体产生的方法，所述方法包括使含有所述产生抗体的细胞的细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得改变抗体产生的化合物进入所述产生抗体的细胞，其中改变了在所述产生抗体的细胞中的内源性抗体产生。在一些实施方案中，内源性抗体产生被增加或增强。在一些实施方案中，内源性抗体产生被减少或下调。
在一些实施方案中，所述抗体是人或人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗原结合抗体变体。在一些实施方案中，所述抗体类别是IgM、IgG、IgA、IgE或IgD。在一些实施方案中，所述抗体是抗原结合抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是Fab、Fab’、Fab’-SH、Fab2、F(ab’)2、Fv、scFv、scFab或dsFv片段。在一些实施方案中，所述抗体是全长抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单结构域抗体。在一些实施方案中，所述抗体是纳米抗体、VHH或VNAR抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是单价抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单链抗体。在一些实施方案中，所述抗体是多特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗体融合蛋白。
在一些实施方案中，所述内源性抗体产生改变了至少约25％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％或大于约200％。在一些实施方案中，与由通过缩窄部之前的细胞产生的抗体水平相比，所述内源性抗体产生被增加。在一些实施方案中，由细胞群产生的总内源性抗体产生被增加。在一些实施方案中，与由通过缩窄部之前的细胞产生的抗体水平相比，所述内源性抗体产生减少。在一些实施方案中，由细胞群产生的总内源性抗体产生减少。在一些实施方案中，在每个细胞基础上改变了内源性抗体产生(即各个细胞产生改变的抗体水平)。在一些实施方案中，与通过装置之前细胞或细胞群的抗体产生水平相比，改变了所述内源性抗体产生。在一些实施方案中，增强的抗体产生是指抗体产生随时间更持久或更长的持续时间。在一些实施方案中，与由未通过所述缩窄部的细胞得到的抗体产生相比，所述内源性抗体产生持续约25％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％或大于约200％更长的时间。在一些实施方案中，与由未通过缩窄部的细胞得到的抗体产生相比，内源性抗体产生的持续时间缩短了约25％、约50％、约75％或约100％。
在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后的培养基中的内源性抗体产生的范围是从约0ng/L至约1g/L或在其间的任何浓度或浓度的范围。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后的培养基中的内源性抗体产生的范围是从约0ng/L至约750mg/L、约0ng/L至约500mg/L、约0ng/L至约250mg/L、约0ng/L至约1mg/L、约0ng/L至约750μg/L、约0ng/L至约500μg/L、约0ng/L至约250μg/L、约0ng/L至约1μg/L、约0ng/L至约750ng/L、约0ng/L至约500ng/L、约0ng/L至约250ng/L、约0ng/L至约100ng/L、约0ng/L至约50ng/L、约0ng/L至约25ng/L、约0ng/L至约10ng/L或约0ng/L至约5ng/L。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后的培养基中的内源性抗体产生的范围是从约5ng/L至约1g/L、约10ng/L至约1g/L、约25ng/L至约1g/L、约50ng/L至约1g/L、约75ng/L至约1g/L、约100ng/L至约1g/L、约250ng/L至约1g/L、约500ng/L至约1g/L、约750ng/L至约1g/L、约1μg/L至约1g/L、约250μg/L至约1g/L、约500μg/L至约1g/L、约750μg/L至约1g/L、约1mg/L至约1g/L、约250mg/L至约1g/L、约500mg/L至约1g/L或约750mg/L至约1g/L。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后的内源性抗体产生的范围是从在约0pg/细胞/天至约100pg/细胞/天或在其间的任何量或量的范围。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后的内源性抗体产生的范围是从约0pg/细胞/天至约75pg/细胞/天、约0pg/细胞/天至约50pg/细胞/天、约0pg/细胞/天至约25pg/细胞/天、约0pg/细胞/天至约10pg/细胞/天、约0pg/细胞/天至约5pg/细胞/天、约0pg/细胞/天至约2.5pg/细胞/天、约0pg/细胞/天至约1pg/细胞/天、约0pg/细胞/天至约0.75pg/细胞/天、约0pg/细胞/天至约0.5pg/细胞/天、约0pg/细胞/天至约0.25pg/细胞/天、约0pg/细胞/天至约0.1pg/细胞/天或约0pg/细胞/天至约0.05pg/细胞/天。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后的内源性抗体产生的范围是从约0.05pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约0.1pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约0.25pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约0.5pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约0.75pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约1pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约2.5pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约5pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约10pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约25pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约50pg/细胞/天至约100pg/细胞/天或约75pg/细胞/天至约100pg/细胞/天。
内源性抗体产生可以通过本领域已知的任何方法来测量，所述方法包括但不限于使用如下技术的直接或竞争性结合测定：如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定。在一些实施方案中，内源性抗体产生可以使用色谱方法(如高效液相色谱(HPLC)或尺寸排阻色谱(SEC))来测量。
在一些实施方案中，本发明提供了用于改变产生抗体的细胞中的内源性抗体产生的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊或兔细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含非哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含细菌、酵母、鸡、青蛙、昆虫或线虫细胞。在一些实施方案中，所述细胞先前被工程化以产生抗体；例如，被工程化以产生抗体的细菌细胞。
所述细胞悬浮液可以是混合或纯化的细胞群。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液是混合的细胞群，如全血细胞、淋巴细胞和/或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液是纯化的细胞群。在一些实施方案中，所述产生抗体的细胞是原代细胞或细胞系细胞(例如，永生化细胞系)。在一些实施方案中，所述细胞是杂交瘤细胞。在一些实施方案中，所述产生抗体的细胞是血细胞。在一些实施方案中，所述血细胞是产生抗体的免疫细胞。在一些实施方案中，所述产生抗体的免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述产生抗体的细胞是B细胞或B细胞前体。在一些实施方案中，所述产生抗体的细胞是B细胞前体、幼稚B细胞、激活的B细胞、记忆B细胞、浆细胞、B-1细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、调节性B细胞或B细胞淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，所述产生抗体的细胞是骨髓源性B细胞前体。
IV.从头抗体产生
在某些方面，本发明提供了用于诱导细胞中的从头抗体产生的方法，所述方法包括使细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得引发抗体产生的化合物进入所述细胞，其中诱导了在所述细胞中的从头抗体产生。
在一些实施方案中，所述抗体是人或人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗原结合抗体变体。在一些实施方案中，所述抗体类别是IgM、IgG、IgA、IgE或IgD。在一些实施方案中，所述抗体是抗原结合抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是Fab、Fab’、Fab’-SH、Fab2、F(ab’)2、Fv、scFv、scFab或dsFv片段。在一些实施方案中，所述抗体是全长抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单结构域抗体。在一些实施方案中，所述抗体是纳米抗体、VHH或VNAR抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是单价抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单链抗体。在一些实施方案中，所述抗体是多特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗体融合蛋白。
在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后的培养基中的从头抗体产生的范围是从约10ng/L至约1g/L或在其间的任何浓度或浓度的范围。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后的培养基中的从头抗体产生的范围是从约10ng/L至约750mg/L、约10ng/L至约500mg/L、约10ng/L至约250mg/L、约10ng/L至约1mg/L、约10ng/L至约750μg/L、约10ng/L至约500μg/L、约10ng/L至约250μg/L、约10ng/L至约1μg/L、约10ng/L至约750ng/L、约10ng/L至约500ng/L、约10ng/L至约250ng/L、约10ng/L至约100ng/L、约10ng/L至约50ng/L或约10ng/L至约25ng/L。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后的培养基中的从头抗体产生的范围是从约25ng/L至约1g/L、约50ng/L至约1g/L、约75ng/L至约1g/L、约100ng/L至约1g/L、约250ng/L至约1g/L、约500ng/L至约1g/L、约750ng/L至约1g/L、约1μg/L至约1g/L、约250μg/L至约1g/L、约500μg/L至约1g/L、约750μg/L至约1g/L、约1mg/L至约1g/L、约250mg/L至约1g/L、约500mg/L至约1g/L或约750mg/L至约1g/L。
在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后的从头抗体产生的范围是从约0.1pg/细胞/天至约100pg/细胞/天或在其间的任何量或量的范围。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后的从头抗体产生的范围是从约0.1pg/细胞/天至约75pg/细胞/天、约0.1pg/细胞/天至约50pg/细胞/天、约0.1pg/细胞/天至约25pg/细胞/天、约0.1pg/细胞/天至约10pg/细胞/天、约0.1pg/细胞/天至约5pg/细胞/天、约0.1pg/细胞/天至约2.5pg/细胞/天、约0.1pg/细胞/天至约1pg/细胞/天、约0.1pg/细胞/天至约0.75pg/细胞/天、约0.1pg/细胞/天至约0.5pg/细胞/天或约0.1pg/细胞/天至约0.25pg/细胞/天。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后的从头抗体产生的范围是从约0.25pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约0.5pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约0.75pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约1pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约2.5pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约5pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约10pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约25pg/细胞/天至约100pg/细胞/天、约50pg/细胞/天至约100pg/细胞/天或约75pg/细胞/天至约100pg/细胞/天。
从头抗体产生可以通过本领域已知的任何方法来测量，所述方法包括但不限于使用如下技术的直接或竞争性结合测定：如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定。在一些实施方案中，从头抗体产生可以使用色谱方法(如高效液相色谱(HPLC)或尺寸排阻色谱(SEC))来测量。
在一些实施方案中，本发明提供了用于诱导细胞中的从头抗体产生的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊或兔细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含非哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含细菌、酵母、鸡、青蛙、昆虫或线虫细胞。
所述细胞悬浮液可以是混合或纯化的细胞群。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液是混合的细胞群，如全血细胞、淋巴细胞和/或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液是纯化的细胞群。在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞或细胞系细胞。在一些实施方案中，所述细胞是血细胞。在一些实施方案中，所述血细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是B细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，所述细胞是B细胞或B细胞前体。在一些实施方案中，所述细胞是B细胞前体、幼稚B细胞、激活的B细胞、记忆B细胞、浆细胞、B-1细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、调节性B细胞或B细胞淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，所述细胞是骨髓源性B细胞前体。
在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。示例性干细胞包括但不限于诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、肝干细胞、心脏干细胞、神经干细胞和造血干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是骨髓源性祖细胞或红细胞前体。在一些实施方案中，所述细胞是源自iPSC或ESC的分化细胞。在一些实施方案中，所述细胞是源自造血干细胞的分化细胞(例如，从造血干细胞分化的B细胞)。在一些实施方案中，所述细胞是成纤维细胞，如原代成纤维细胞或新生儿人包皮成纤维细胞(Nuff细胞)。在一些实施方案中，所述细胞是永生化细胞系细胞，如HEK293细胞或CHO细胞。在一些实施方案中，所述细胞是皮肤细胞。在一些实施方案中，所述细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是生殖细胞，如卵母细胞、卵子或受精卵。在一些实施方案中，所述细胞是神经元。在一些实施方案中，所述细胞是细胞簇(如胚胎)，只要所述细胞簇在通过缩窄部时不被破坏即可。
V.提供使细胞变形的缩窄部的微流体通道
在一些实施方案中，本发明提供了通过使细胞悬浮液通过缩窄部来改变抗体产生或诱导从头抗体产生的方法，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得调节抗体产生的化合物进入所述细胞，其中所述缩窄部被包含在微流体通道内。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被增强。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被减少。在一些实施方案中，可以在微流体通道内平行和/或串联放置多个缩窄部。用于本文所公开的方法中的含有使细胞变形的缩窄部的示例性微流体通道描述于WO2013059343中。
在一些实施方案中，所述微流体通道包括内腔并且被配置为使得悬浮于缓冲液中的细胞可以通过，其中所述微流体通道包括缩窄部。微流体通道可以由多种材料中的任一种制成，所述材料包括硅、金属(例如不锈钢)、塑料(例如聚苯乙烯)、陶瓷、玻璃、晶体衬底、无定形衬底或聚合物(例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PDMS、环烯烃共聚物(COC)等)。可以通过本领域已知的任何方法来进行微流体通道的制造，所述方法包括干法蚀刻、湿法蚀刻、光刻、注射模制、激光烧蚀或SU-8掩模。
在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部包括入口部分、中心点和出口部分。在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部的长度、深度和宽度可以变化。在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部的直径是细胞或细胞簇的直径的函数。在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部的直径是细胞直径的约20％至约99％。在一些实施方案中，所述缩窄部大小是所述细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。在一些实施方案中，所述通道包括约30um的缩窄部长度和约4um的缩窄部宽度。在一些实施方案中，所述通道包括约10um的缩窄部长度和约4um的缩窄部宽度。通道的横截面、入口部分、中心点和出口部分也可以变化。例如，横截面的形状可以是环形、椭圆形、细长狭缝、正方形、六边形或三角形。入口部分限定缩窄部角度，其中所述缩窄部角度被优化以减少通道的堵塞并且被优化用于增强化合物向细胞内的递送。出口部分的角度也可以变化。例如，出口部分的角度被配置为减小可能导致非层流的湍流的可能性。在一些实施方案中，入口部分和/或出口部分的壁是线性的。在其他实施方案中，入口部分和/或出口部分的壁是弯曲的。
VI.具有提供使细胞变形的缩窄部的孔的表面
在一些实施方案中，本发明提供了通过使细胞悬浮液通过缩窄部来改变抗体产生或诱导从头抗体产生的方法，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得调节抗体产生的化合物进入所述细胞，其中所述缩窄部是孔或被包含在孔内。在一些实施方案中，所述孔被包含在表面中。用于本文所公开的方法中的具有孔的示例性表面描述于2015年9月4日提交的美国临时申请62/214,820中。
本文所公开的表面可以由多种材料中的任一种制成并且采取多种形式中的任一种。在一些实施方案中，所述表面是过滤器。在一些实施方案中，所述表面是膜。在一些实施方案中，所述过滤器是切向流过滤器。在一些实施方案中，所述表面是海绵或海绵状基质。在一些实施方案中，所述表面是基质。
在一些实施方案中，所述表面是曲折的路径表面。在一些实施方案中，所述曲折的路径表面包含醋酸纤维素。在一些实施方案中，所述表面包括如下材料，所述材料选自但不限于：合成或天然聚合物、聚碳酸酯、硅、玻璃、金属、合金、硝酸纤维素、银、醋酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚丙烯腈(PAN)、聚丙烯、PVDF、聚四氟乙烯、混合纤维素酯、瓷器和陶瓷。
本文所公开的表面可以具有本领域已知的任何形状；例如，三维形状。所述表面的二维形状可以是但不限于环形、椭圆形、圆形、正方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形或八边形。在一些实施方案中，所述表面的形状是圆形的。在一些实施方案中，所述表面的三维形状为圆柱形、圆锥形或立方形。
所述表面可以具有各种横截面宽度和厚度。在一些实施方案中，所述表面横截面宽度是在约1mm与约1m之间或在其间的任何横截面宽度或横截面宽度的范围。在一些实施方案中，所述表面具有限定的厚度。在一些实施方案中，所述表面厚度是均匀的。在一些实施方案中，所述表面厚度是可变的。例如，在一些实施方案中，表面的一些部分比表面的其他部分更厚或更薄。在一些实施方案中，表面厚度变化为约1％至约90％或在其间的任何百分比或百分比的范围。在一些实施方案中，表面厚度是在约0.01μm至约5mm之间或在其间的任何厚度或厚度的范围。
在一些实施方案中，所述缩窄部是孔或被包含在孔内。孔的横截面宽度与要处理的细胞的类型有关。在一些实施方案中，所述孔大小是要处理的细胞簇的细胞直径的函数。在一些实施方案中，所述孔大小使得细胞在通过孔时被扰动。在一些实施方案中，所述孔大小小于所述细胞的直径。在一些实施方案中，所述孔大小是所述细胞的直径的约20％至约99％。在一些实施方案中，所述孔大小是细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。最佳孔大小可以根据应用和/或细胞类型而变化。在一些实施方案中，所述孔大小为约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。
孔道的入口和出口可以具有多种角度。可以选择孔角度以使细胞通过时孔的堵塞最小化。在一些实施方案中，通过表面的流速是在约0.001mL/cm2/秒至约100L/cm2/秒之间或在其间的任何速度或速度的范围。例如，入口或出口部分的角度可以在约0度与约90度之间。在一些实施方案中，所述孔具有相同的入口和出口角度。在一些实施方案中，所述孔具有不同的入口和出口角度。在一些实施方案中，所述孔边缘是光滑的，例如圆形或弯曲的。光滑的孔边缘具有连续、平坦且平滑的表面，没有隆起、脊或不平滑的部分。在一些实施方案中，所述孔边缘是尖锐的。尖锐的孔边缘具有尖的或成锐角的薄边缘。在一些实施方案中，所述孔道是直的。直的孔道不含曲线、弯曲、角度或其他不规则性。在一些实施方案中，所述孔道是弯曲的。弯曲的孔道是弯的或偏离直线的。在一些实施方案中，所述孔道具有多个弯道(curve)，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个弯道。
所述孔可以具有本领域已知的任何形状，包括二维或三维形状。所述孔形状(例如横截面形状)可以是但不限于环形、椭圆形、圆形、正方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。在一些实施方案中，所述孔的横截面的形状是圆形的。在一些实施方案中，所述孔的三维形状是圆柱形或圆锥形。在一些实施方案中，所述孔具有带凹槽的入口和出口。在一些实施方案中，所述孔形状在给定表面内的孔之间是均匀的(即一致的或规则的)。在一些实施方案中，所述孔形状在给定表面内的孔之间是不均匀的(即混合的或变化的)。
本文所述的表面可以具有一定范围的总孔数量。在一些实施方案中，孔涵盖总表面积的约10％至约80％。在一些实施方案中，所述表面含有约1.0x105至约1.0x1030个总孔或在其间的任何数量或数量的范围。在一些实施方案中，所述表面每mm2表面积包含在约10与约1.0x1015个之间的孔。
所述孔可以在给定表面内以多种方式分布。在一些实施方案中，所述孔在给定表面内平行分布。在一个这种例子中，所述孔在相同方向上并排分布并且在给定表面内相隔相同的距离。在一些实施方案中，所述孔分布是有序的或均匀的。在一个这种例子中，所述孔以规则的、系统的图案分布或在给定表面内相隔相同的距离。在一些实施方案中，所述孔分布是随机的或不均匀的。在一个这种例子中，所述孔以不规则的、无序的图案分布或在给定的表面内相隔不同的距离。在一些实施方案中，多个表面串联分布。所述多个表面在表面大小、形状和/或粗糙度方面可以是均匀的或不均匀的。所述多个表面还可以含有具有均匀或不均匀的孔大小、形状和/或数量的孔，从而能够将一系列化合物同时递送至不同的细胞类型中。
在一些实施方案中，单独的孔具有均一的宽度尺寸(即沿着孔道长度的恒定宽度)。在一些实施方案中，单独的孔具有可变的宽度(即，沿着孔道长度渐增或渐减的宽度)。在一些实施方案中，给定表面内的孔具有相同的单独的孔深度。在一些实施方案中，给定表面内的孔具有不同的单独的孔深度。在一些实施方案中，所述孔彼此紧邻。在一些实施方案中，所述孔彼此隔开一定距离。在一些实施方案中，所述孔彼此隔开约0.001μm至约30mm的距离或在其间的任何距离或距离的范围。
在一些实施方案中，表面涂覆有材料。所述材料可以选自本领域已知的任何材料，包括但不限于特氟隆(Teflon)、粘合剂涂料、表面活性剂、蛋白质、粘附分子、抗体、抗凝剂、调节细胞功能的因子、核酸、脂质、碳水化合物或跨膜蛋白。在一些实施方案中，所述表面涂覆有聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施方案中，所述材料共价附着于表面。在一些实施方案中，所述材料非共价附着于表面。在一些实施方案中，所述表面分子在细胞通过孔时释放。
在一些实施方案中，所述表面具有修饰的化学特性。在一些实施方案中，所述表面是亲水的。在一些实施方案中，所述表面是疏水的。在一些实施方案中，所述表面是带电的。在一些实施方案中，所述表面带正电和/或负电。在一些实施方案中，所述表面可以在一些区域带正电并在其他区域带负电。在一些实施方案中，所述表面具有总体正电荷或总体负电荷。在一些实施方案中，所述表面可以是经光滑、电抛光、粗糙或等离子体处理中的任何一种。在一些实施方案中，所述表面包含两性离子或偶极化合物。在一些实施方案中，所述表面是经等离子体处理的。
在一些实施方案中，所述表面被包含在较大的模块内。在一些实施方案中，所述表面被包含在注射器(如塑料或玻璃注射器)内。在一些实施方案中，所述表面被包含在塑料过滤器支架内。在一些实施方案中，所述表面被包含在移液器尖端内。
VII.细胞扰动
在一些实施方案中，本发明提供了通过使细胞悬浮液通过缩窄部来改变抗体产生或诱导从头抗体产生的方法，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得调节抗体产生的化合物进入所述细胞，其中所述细胞中的扰动是细胞中允许来自细胞外部的材料移动进入细胞中的缺口(例如，洞、裂缝、腔、孔隙、孔、断裂、间隙、穿孔)。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被增强。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被减少。变形可以由例如通过机械应变和/或剪切力诱导的压力引起。在一些实施方案中，所述扰动是细胞膜内的扰动。在一些实施方案中，所述扰动是短暂的。在一些实施方案中，所述细胞扰动持续从约1.0x10-9秒至约2小时或在其间的任何时间或时间的范围。在一些实施方案中，所述细胞扰动持续约1.0x10-9秒至约1秒、约1秒至约1分钟、或约1分钟至约1小时。在一些实施方案中，所述细胞扰动持续如下时间中的任一种：在约1.0x10-9至约1.0x10-1、约1.0x10-9至约1.0x10-2、约1.0x10-9至约1.0x10-3、约1.0x10-9至约1.0x10-4、约1.0x10-9至约1.0x10-5、约1.0x10-9至约1.0x10-6、约1.0x10-9至约1.0x10-7或约1.0x10-9至约1.0x10-8秒之间。在一些实施方案中，所述细胞扰动持续如下时间中的任一种：约1.0x10-8至约1.0x10-1、约1.0x10-7至约1.0x10-1、约1.0x10-6至约1.0x10-1、约1.0x10-5至约1.0x10-1、约1.0x10-4至约1.0x10-1、约1.0x10-3至约1.0x10-1或约1.0x10-2至约1.0x10-1秒。由本文描述的方法产生的细胞扰动(例如，孔或洞)不是由于蛋白质亚基组装形成多聚体孔结构(如由补体或细菌溶血素产生的)的结果而形成。
当细胞通过缩窄部时，缩窄部会暂时对细胞膜造成伤害，从而导致材料通过扰动被动扩散。在一些实施方案中，使细胞变形仅持续大约100μs的短暂时间段，以最小化通过细胞信号传导机制激活凋亡途径的机会，但是其他持续时间是可能的(例如，从纳秒到数小时的范围)。在一些实施方案中，使细胞变形持续约1.0x10-9秒至约2小时、或在其间的任何时间或时间的范围。在一些实施方案中，使细胞变形持续约1.0x10-9秒至约1秒、约1秒至约1分钟、或约1分钟至约1小时。在一些实施方案中，使细胞变形持续如下时间中的任一种：在约1.0x10-9至约1.0x10-1、约1.0x10-9至约1.0x10-2、约1.0x10-9至约1.0x10-3、约1.0x10-9至约1.0x10-4、约1.0x10-9至约1.0x10-5、约1.0x10-9至约1.0x10-6、约1.0x10-9至约1.0x10-7或约1.0x10-9至约1.0x10-8秒之间。在一些实施方案中，使细胞变形持续如下时间中的任一种：约1.0x10-8至约1.0x10-1、约1.0x10-7至约1.0x10-1、约1.0x10-6至约1.0x10-1、约1.0x10-5至约1.0x10-1、约1.0x10-4至约1.0x10-1、约1.0x10-3至约1.0x10-1或约1.0x10-2至约1.0x10-1秒。在一些实施方案中，使细胞变形包括使细胞变形持续一定的时间，所述时间的范围是从但不限于约1μs至至少约750μs，例如至少约1μs、10μs、50μs、100μs、500μs或750μs。
在一些实施方案中，所述化合物穿过进入细胞与细胞通过缩窄部和/或细胞的扰动同时发生。在一些实施方案中，所述化合物穿过进入细胞发生在细胞通过缩窄部之后。在一些实施方案中，所述化合物穿过进入细胞发生在细胞通过缩窄部之后大约几分钟。在一些实施方案中，所述化合物穿过进入细胞发生在细胞通过缩窄部之后从约1.0x10-2秒至至少约30分钟。例如，所述化合物穿过进入细胞发生在细胞通过缩窄部之后从约1.0x10-2秒至约1秒、约1秒至约1分钟或约1分钟至约30分钟。在一些实施方案中，所述化合物穿过进入细胞发生在细胞通过缩窄部之后约1.0x10-2秒至约10分钟、约1.0x10-2秒至约5分钟、约1.0x10-2秒至约1分钟、约1.0x10-2秒至约50秒、约1.0x10-2秒至约10秒、约1.0x10-2秒至约1秒或约1.0x10-2秒至约0.1秒。在一些实施方案中，所述化合物穿过进入细胞发生在细胞通过缩窄部之后约1.0x10-1秒至约10分钟、约1秒至约10分钟、约10秒至约10分钟、约50秒至约10分钟、约1分钟至约10分钟或约5分钟至约10分钟。在一些实施方案中，细胞通过缩窄部之后的细胞中的扰动在细胞通过缩窄部之后大约五分钟内被纠正。
在一些实施方案中，通过缩窄部之后的细胞活力为约5％至约100％。在一些实施方案中，通过缩窄部之后的细胞活力为至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后从约1.0x10-2秒到至少约10天测量细胞活力。例如，在细胞通过缩窄部之后从约1.0x10-2秒至约1秒、约1秒至约1分钟、约1分钟至约30分钟、或约30分钟至约2小时测量细胞活力。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后约1.0x10-2秒至约2秒、约1.0x10-2秒至约1小时、约1.0x10-2秒至约30分钟、约1.0x10-2秒至约1分钟、约1.0x10-2秒至约30秒、约1.0x10-2秒至约1秒或约1.0x10-2秒至约0.1秒测量细胞活力。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后约1.5小时至约2小时、约1小时至约2小时、约30分钟至约2小时、约15分钟至约2小时、约1分钟至约2小时、约30秒至约2小时或约1秒至约2小时测量细胞活力。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后约2小时至约5小时、约5小时至约12小时、约12小时至约24小时或约24小时至约10天测量细胞活力。
VIII.递送参数
许多参数可以影响化合物向细胞的递送，所述化合物向细胞的递送用于通过本文所述的方法改变抗体产生或诱导从头抗体产生。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被增强。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被减少。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液在通过缩窄部之前、同时或之后与化合物接触。细胞可以通过悬浮于包含要递送的化合物的溶液中的缩窄部，但是可以在细胞通过缩窄部之后将化合物添加到细胞悬浮液中。在一些实施方案中，将要递送的化合物涂覆在缩窄部上。
可能影响将化合物递送至细胞中的参数的例子包括但不限于缩窄部的尺寸、缩窄部的入口角度、缩窄部的表面特性(例如，粗糙度、化学修饰、亲水性、疏水性等)、操作流速(例如，通过缩窄部的细胞传输时间)、细胞浓度、细胞悬浮液中化合物的浓度，并且细胞在通过缩窄部之后恢复或孵育的时间量可以影响递送的化合物穿过进入细胞中。影响化合物向细胞内的递送的另外的参数可以包括细胞在缩窄部中的速度、缩窄部中的剪切速度、细胞悬浮液的粘度、垂直于流速的速度分量、以及在缩窄部中的时间。可以将此类参数设计成控制所述化合物的递送。在一些实施方案中，细胞浓度的范围是从约10至至少约1012个细胞/ml或在其间的任何浓度或浓度的范围。在一些实施方案中，递送化合物浓度的范围可以是从约10ng/ml至约1g/mL或在其间的任何浓度或浓度的范围。在一些实施方案中，递送化合物浓度的范围可以是从约1pM至至少约2M或在其间的任何浓度或浓度的范围。
可以调整本公开文本的方法中使用的温度以影响化合物递送和细胞活力。在一些实施方案中，所述方法是在约-5℃与约45℃之间进行。例如，所述方法可以在如下温度下进行：室温(例如，约20℃)、生理温度(例如，约37℃)、高于生理温度(例如，大于约37℃至45℃或更高)、或降低的温度(例如，约-5℃至约4℃)或在这些示例性温度之间的温度。
可以利用各种方法来驱动细胞通过缩窄部。例如，可以在入口侧通过泵(例如，气瓶或压缩机)施加压力，可以在出口侧通过真空泵施加真空，可通过管施加毛细管作用，和/或系统可由重力进给。也可以使用基于位移的流动系统(例如，注射泵、蠕动泵、手动注射器或移液器、活塞等)。在一些实施方案中，细胞通过正压或负压通过缩窄部。在一些实施方案中，细胞通过恒定压力或可变压力通过缩窄部。在一些实施方案中，使用注射器施加压力。在一些实施方案中，使用泵施加压力。在一些实施方案中，泵是蠕动泵或隔膜泵。在一些实施方案中，使用真空施加压力。在一些实施方案中，细胞通过重力通过缩窄部。在一些实施方案中，细胞通过毛细管压力通过缩窄部。
在一些实施方案中，流体流动引导细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之前，流体流动是湍流。湍流是一种流体流动，其中在给定点的速度在大小和方向上不规律地变化。在一些实施方案中，流过缩窄部的流体是层流。层流包括在固体边界附近的流体中的非中断流，其中在每个点的流动方向保持恒定。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后流体流动是湍流。细胞通过缩窄部的速度可以变化。在一些实施方案中，细胞以均一的细胞速度通过缩窄部。在一些实施方案中，细胞以波动的细胞速度通过缩窄部。
在其他实施方案中，组合治疗用于改变抗体产生或诱导从头抗体产生，所述组合治疗是例如本文所述的方法，接着暴露于缩窄部下游的电场。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被增强。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被减少。在一些实施方案中，细胞在通过缩窄部之后通过由至少一个电极产生的电场。在一些实施方案中，电场有助于将增强抗体产生或诱导从头抗体产生的化合物递送至细胞内部的第二位置，如细胞核。例如，使细胞变形的缩窄部与电场的组合将编码抗体的质粒递送至细胞(例如，细胞核)中，从而导致抗体的从头产生。在一些实施方案中，一个或多个电极靠近使细胞变形的缩窄部以产生电场。在一些实施方案中，电场是在约0.1kV/m至约100MV/m之间、或在其间的任何数量或数量的范围。在一些实施方案中，集成电路用于提供电信号以驱动电极。在一些实施方案中，将细胞暴露于脉冲宽度在约1ns至约1s之间、以及时间在约100ns至约10s之间或在其间的任何时间或时间的范围的电场。
IX.用于抗体产生的细胞悬浮液
所述细胞悬浮液的组成(例如摩尔渗透压浓度、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)可以影响用于改变抗体产生或诱导从头抗体产生的化合物的递送。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被增强。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被减少。在一些实施方案中，所述悬浮液包含全血。可替代地，细胞悬浮液是生理盐水溶液中或除血液之外的生理介质中的细胞混合物。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液包含水溶液。在一些实施方案中，所述水溶液包含细胞培养基、PBS、盐、糖、生长因子、动物来源的产品、填充材料、表面活性剂、润滑剂、维生素、多肽和/或影响肌动蛋白聚合的试剂。在一些实施方案中，所述细胞培养基是DMEM、Opti-MEMTM、IMDM或RPMI。另外，溶液缓冲液可以包含一种或多种润滑剂(普朗尼克(pluronics)或其他表面活性剂)，其可被设计用于例如减少或消除表面堵塞并改善细胞活力。示例性表面活性剂包括但不限于泊洛沙姆、聚山梨醇酯、糖或糖醇(如甘露醇、山梨醇)、动物来源的血清和白蛋白。
在使用某些类型的细胞的一些配置中，所述细胞可以在有助于将化合物递送至细胞内部的一种或多种溶液中孵育。在一些实施方案中，水溶液包含影响肌动蛋白聚合的试剂。在一些实施方案中，影响肌动蛋白聚合的试剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。例如，在递送之前，可将细胞在解聚溶液如拉春库林A(0.1μg/ml)中孵育1小时以使肌动蛋白细胞骨架解聚。作为另外的例子，在递送之前，可将细胞在10μM秋水仙碱(西格玛公司(Sigma))中孵育2小时以使微管网络解聚。
在一些实施方案中，细胞群是在所公开的方法中使用之前富集的。例如，细胞从体液例如外周血获得，并任选地富集或纯化以浓缩B细胞。可以用本领域已知的任何方法富集细胞，所述方法包括但不限于磁性细胞分离、荧光激活细胞分选(FACS)或密度梯度离心。
所述细胞悬浮液的粘度也可以影响本文所公开的方法。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液的粘度的范围是从约8.9x104Pa·s至约4.0x10-3Pa·s或在其间的任何值或值的范围。在一些实施方案中，粘度范围是如下各项中的任一种：在约8.9x10-4Pa·s至约4.0x10-3Pa·s、约8.9x10-4Pa·s至约3.0x10-3Pa·s、约8.9x10-4Pa·s至约2.0x10-3Pa·s或约8.9x10-3Pa·s至约1.0x10-3Pa·s之间。在一些实施方案中，粘度范围是如下各项中的任一种：在约0.89cP至约4.0cP、约0.89cP至约3.0cP、约0.89cP至约2.0cP或约0.89cP至约1.0cP之间。在一些实施方案中，观察到剪切稀化效应，其中细胞悬浮液的粘度在剪切应变条件下降低。粘度可通过本领域已知的任何方法测量，所述方法包括但不限于粘度计(如玻璃毛细管粘度计)、或流变仪。粘度计在一种流动条件下测量粘度，而流变仪用于测量随流动条件变化的粘度。在一些实施方案中，测量剪切稀化溶液如血液的粘度。在一些实施方案中，粘度是在约-5℃与约45℃之间测量。例如，粘度是在如下温度下测量：室温(例如，约20℃)、生理温度(例如，约37℃)、高于生理温度(例如，大于约37℃至45℃或更高)、或降低的温度(例如，约-5℃至约4℃)或在这些示例性温度之间的温度。
X.改变或诱导抗体产生的化合物
在一些实施方案中，本发明提供了用于改变产生抗体的细胞中的内源性抗体产生或诱导细胞中的从头抗体产生的化合物，其中将所述化合物通过本文所述的任何方法递送至细胞。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被增强。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被减少。在一些实施方案中，所述化合物是单一化合物。在一些实施方案中，所述化合物是化合物的混合物。在一些实施方案中，所述化合物包含核酸。在一些实施方案中，所述化合物是核酸。示例性核酸包括但不限于重组核酸、DNA、重组DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、siRNA、mRNA、saRNA、miRNA、lncRNA、tRNA和shRNA。在一些实施方案中，所述核酸与细胞中的核酸是同源的。在一些实施方案中，所述核酸与细胞中的核酸是异源的。在一些实施方案中，所述核酸是质粒。
在一些实施方案中，所述核酸编码抗体以进行从头抗体产生。在一些实施方案中，所述核酸编码人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，所述核酸编码抗原结合抗体变体。在一些实施方案中，所述核酸编码IgM、IgG、IgA、IgE或IgD抗体。在一些实施方案中，所述核酸编码抗原结合抗体片段。在一些实施方案中，所述核酸编码Fab、Fab’、Fab’-SH、Fab2、F(ab’)2、Fv、scFv、scFab或dsFv抗体片段。在一些实施方案中，所述核酸编码全长抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体、多特异性抗体或抗体融合蛋白。在一些实施方案中，所述核酸编码纳米抗体、VHH或VNAR抗体片段。
在一些实施方案中，所述化合物包含蛋白质-核酸复合物。在一些实施方案中，所述化合物是蛋白质-核酸复合物。在一些实施方案中，在基因组编辑应用中使用蛋白质-核酸复合物，如规则间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-Cas9。这些复合物含有与非特异性DNA切割核酸酶组合的序列特异性DNA结合结构域。这些复合物能够进行靶向基因组编辑，包括添加、破坏或改变特定基因的序列。在一些实施方案中，有缺陷的(disabled)CRISPR用于阻断或诱导靶基因的转录。在一些实施方案中，所述蛋白质-核酸复合物含有Cas9蛋白和指导RNA。在一些实施方案中，所述蛋白质-核酸复合物还包含用于同源重组的供体DNA。在一些实施方案中，所述化合物包括编码Cas9蛋白和指导RNA的核酸。在一些实施方案中，Cas9蛋白和指导RNA是在同一质粒构建体上。在一些实施方案中，Cas9蛋白和指导RNA是在不同的质粒构建体上。在一些实施方案中，所述化合物还包括编码用于同源重组的供体DNA的核酸。在一些实施方案中，递送酶(如转座酶或整合酶)以介导核酸整合。在一些实施方案中，通过本文公开的方法进行的基因编辑组分的递送可以用于改变参与介导疾病的抗体的表达。例如，CRISPR化合物的递送可以用于抑制介导自身免疫疾病的自身反应性抗体的表达。
在一些实施方案中，所述化合物包含蛋白质或多肽。在一些实施方案中，所述化合物是蛋白质或多肽。在一些实施方案中，所述蛋白质是基因编辑蛋白或核酸酶，如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶或CRE重组酶。在一些实施方案中，所述蛋白质是转录因子。示例性转录因子包括但不限于BLIMP1、XBP1、IRF4和BCL-6。
在一些实施方案中，所述蛋白质是抗凋亡蛋白。示例性抗凋亡蛋白包括但不限于Bcl-2家族蛋白。抗凋亡Bcl-2蛋白包括Bcl-2本身、Bcl-XL、Bcl-w、MCl-1、A1和Diva。在一些实施方案中，所述蛋白质是B细胞激活因子。示例性B细胞激活和增殖诱导因子包括但不限于增殖诱导配体(APRIL)和B细胞激活因子(BAFF)。B细胞激活因子(BAFF)也称为BLyS、TALL-1、THANK、zTNF4或TNFSF-13B，是TNF家族的成员，并且通过与其同源受体结合启动下游信号传导途径并调节B细胞存活、成熟和分化。BAFF和另外三个配体(APRIL、EDA和TWEAK)具有相似的功能和结构特征。BAFF和APRIL是B细胞成熟、增殖和存活的有效刺激剂。BAFF的三个受体包括BCMA(B细胞成熟抗原)、TACI(跨膜激活剂和CAML相互作用子)和BAFF-R(BAFF受体，Br3)，全部都是跨膜蛋白。BAFF和APRIL能够以高亲和力与TACI和BCMA结合，并且BAFF也可以与BAFF-R结合。除促进B细胞存活的功能外，BAFF在生发中心、同种型转换和T细胞激活的调节方面也发挥作用。
在一些实施方案中，所述化合物是B细胞受体信号传导分子的激活剂。示例性B细胞受体信号传导分子包括但不限于激酶(如Src、Syk、Btk、Erk、Akt和JNK)、衔接蛋白(如CD19和BLNK)、酶(如PLC和PIK3)、GTP酶和核因子(如NFkB和Ap-1)。在一些实施方案中，所述化合物是ATP。在一些实施方案中，所述化合物是细胞激活因子。在一些实施方案中，所述化合物是编码细胞激活因子的核酸。示例性细胞激活因子包括但不限于TLR激动剂，如CPG和LPS、CD40、CD21、CD19和CD81。例如，CD19参与B细胞受体信号传导并降低B细胞的抗原受体刺激的阈值。在一些实施方案中，所述化合物是募集CD4 T辅助细胞的因子，包括但不限于趋化因子、细胞因子或粘附分子。
在一些实施方案中，所述化合物是改变细胞分化状态的因子。在一些实施方案中，改变细胞分化状态的因子是细胞分化因子。示例性细胞分化因子包括但不限于CXCL12、FLT3L、IL-7、SCF、RANKL和神经白细胞素。B细胞发育和分化受到谱系特异性生长因子和细胞粘附分子的严格调节。由基质细胞分泌的白介素7(IL-7)是用于早期B细胞发育的重要生长因子并且可以刺激祖B细胞和前B细胞增殖。IL-7依赖性祖B细胞增殖通过两种基质生长因子(即胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和干细胞因子(SCF))得到加强。由骨髓基质细胞产生的基质细胞衍生因子1或前B细胞生长刺激因子(SDF-1/PBSF)诱导祖B细胞和前B细胞的增殖。IL-3通过与B细胞上的IL-3受体相互作用来刺激前B细胞增殖，并且IL-3可以与IL-6一起刺激多能干细胞和B细胞祖细胞。神经白细胞素即葡萄糖-6-磷酸异构体同系物也具有刺激B细胞发育的能力。在一些实施方案中，改变细胞分化状态的因子是重编程因子。在一些实施方案中，重编程因子的递送导致产生抗体的细胞转化为较低的分化状态(例如，浆细胞转化为记忆B细胞)。在一些实施方案中，重编程因子的递送导致抗体类别转换。例如，重编程因子的递送导致抗体类别从IgG转换为IgA抗体。通过本文所公开的方法将重编程因子递送至细胞可以导致改变的抗体特异性、功能活性或分泌。
在一些实施方案中，所述化合物包含小分子。在一些实施方案中，所述化合物是小分子。示例性小分子包括但不限于药剂、代谢物或放射性核素。在一些实施方案中，所述药剂是治疗药物。
在一些实施方案中，所述化合物是在纳米颗粒中。纳米颗粒的例子包括金纳米颗粒、量子点、碳纳米管、纳米壳、树状聚合物和脂质体。在一些实施方案中，所述纳米壳包含天然或合成聚合物。在一些实施方案中，所述化合物是在脂质体中。在一些实施方案中，所述纳米颗粒含有治疗分子。在一些实施方案中，所述纳米颗粒含有核酸，如mRNA。
在一些实施方案中，要递送的化合物是纯化的。在一些实施方案中，所述化合物为目的化合物的至少约60重量％(干重)。在一些实施方案中，所述纯化的化合物为目的化合物的至少约75％、90％或99％。在一些实施方案中，所述纯化的化合物为目的化合物的至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)。纯度通过任何已知方法测定，所述方法包括但不限于柱色谱法、薄层色谱法、HPLC分析、NMR、质谱法或SDS-PAGE。纯化的DNA或RNA被定义为不含外源核酸、碳水化合物和脂质的DNA或RNA。
在一些实施方案中，所述化合物是中间体化合物。所述中间体化合物可以是由前述中间体形成的分子实体，并且进一步反应以得到最终反应产物。在一些实施方案中，所述中间体化合物是蛋白质前体或原蛋白，其被酶切割以产生成熟的功能形式的蛋白质。在一些实施方案中，所述中间体化合物是非活性酶前体或酶原，需要修饰或切割以产生活性酶。
XI.应用
在一些方面，本发明提供了通过将产生抗体的免疫细胞引入患者来治疗所述患者的方法，所述产生抗体的免疫细胞经由通过缩窄部进行修饰，使得调节抗体产生的化合物进入所述细胞。在一些实施方案中，将所述细胞从患者分离，根据所公开的方法进行修饰并引入回所述患者中。例如，将B细胞群从患者分离，使其通过缩窄部以实现调节抗体产生的化合物的递送，然后重新注入所述患者中以强化治疗性免疫应答。在一些实施方案中，将所述细胞从个体分离，根据所公开的方法进行修饰并引入回所述个体中。例如，将B细胞群从个体分离，使其通过缩窄部以实现调节抗体产生的化合物的递送，然后重新注入所述患者中以增强个体中的抗体产生。
在一些实施方案中，本发明提供了下调细胞中的抗体产生的方法。在一些实施方案中，基因编辑化合物(如蛋白质-核酸复合物(例如CRISPR)或核酸酶(例如ZFN、TALEN))的递送或siRNA介导的敲除能够阻断参与病原性抗体产生的特定基因。例如，基因编辑化合物或siRNA的递送可以用于减少细胞的自身反应性抗体产生以治疗自身免疫疾病。在一些实施方案中，本发明提供了控制细胞中的抗体产生的方法。例如，将化合物递送至细胞中使得能够响应于刺激或因子而分泌抗体，从而允许阳性或阴性反馈机制。在一些实施方案中，将化合物递送至细胞中使得能够以时间依赖性方式分泌抗体。例如，所述细胞在特定时间范围内或在特定时间长度内产生抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了通过将所述细胞引入患者来治疗所述患者的方法，所述细胞经由通过缩窄部进行修饰，使得诱导从头抗体产生的化合物进入所述细胞。在一些实施方案中，所述细胞是自体细胞。例如，将所述细胞从患者分离，根据所公开的方法进行修饰并引入回所述患者中。在一些实施方案中，将所述细胞从个体分离，根据所公开的方法进行修饰并引入回同一个体中。在一些实施方案中，所述细胞是同种异体细胞。例如，将所述细胞从不同个体分离，根据所公开的方法进行修饰并引入患者中。在一些实施方案中，将所述细胞从个体分离，根据所公开的方法进行修饰并引入不同个体中。在一些实施方案中，将细胞群从患者或不同个体分离，使其通过缩窄部以实现诱导从头抗体产生的化合物的递送，然后注入患者中以强化治疗反应。
以上所述的任何方法是在体外、离体或体内进行。对于体内应用，所述装置可以植入血管内腔中，例如动脉或静脉中的内嵌式支架。在一些实施方案中，所述方法用作床旁系统的一部分，用于离体治疗患者细胞并立即将所述细胞重新引入所述患者中。此类方法可以用作响应于癌症或感染激活免疫系统的手段或用于疫苗开发中。在一些实施方案中，所述方法可以在具有最低限度训练的技术人员的典型医院实验室中实施。在一些实施方案中，可以使用患者操作的治疗系统。在一些实施方案中，使用内嵌式血液治疗系统实施所述方法，其中将血液直接从患者转移，通过缩窄部，导致化合物递送至血细胞，并且在治疗后直接输注回所述患者中。
XII.系统和试剂盒
在一些方面，本发明提供了包括用于本文所公开的方法中的缩窄部、细胞悬浮液和化合物的系统，所述化合物改变在产生抗体的细胞中的内源性抗体产生或诱导细胞中的从头抗体产生。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被增强。在一些实施方案中，所述内源性抗体产生被减少。所述系统可以包括针对以上所公开的方法描述的任何实施方案，包括用于提供使细胞变形的缩窄部的微流体通道或具有孔的表面、细胞悬浮液、细胞扰动、递送参数、改变或诱导抗体产生的化合物和/或应用等。在一些实施方案中，所述使细胞变形的缩窄部的大小适于递送至产生抗体的细胞以改变内源性抗体产生。在一些实施方案中，所述使细胞变形的缩窄部的大小适于递送诱导细胞中的从头抗体产生的化合物。在一些实施方案中，将所述递送参数(如操作流速、细胞和化合物浓度、缩窄部中细胞的速度以及细胞悬浮液的组成(例如，摩尔渗透压浓度、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等))针对用于改变抗体产生或诱导从头抗体产生的化合物的最大抗体反应进行了优化。
还提供了用于递送化合物以调节细胞中的抗体产生的试剂盒或制品。在一些实施方案中，所述试剂盒在合适的包装中包含本文所述的组合物(例如，微流体通道或含有孔的表面、细胞悬浮液和/或用于改变内源性抗体产生或诱导从头抗体产生的化合物)。合适的包装材料是本领域已知的，并且包括例如小瓶(如密封的小瓶)、器皿、安瓿、瓶子、罐子、软包装(例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。这些制品可进一步被灭菌和/或密封。
本公开文本还提供了试剂盒，其包含本文所述方法的组分，并且还可包含用于执行所述方法以改变内源性抗体产生或诱导从头抗体产生的一个或多个说明书。本文所述的试剂盒还可以包含其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和包装插页(其具有用于执行本文所述任何方法的说明书；例如，用于调节抗体产生或诱导从头抗体产生的说明书)。
XIII.示例性实施方案
1.一种改变在产生抗体的细胞中的内源性抗体产生的方法，所述方法包括使包含所述产生抗体的细胞的细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得改变抗体产生的化合物进入所述产生抗体的细胞，其中改变了在所述产生抗体的细胞中的内源性抗体产生。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述内源性抗体产生被增强。
3.根据实施方案1所述的方法，其中所述内源性抗体产生被减少。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述缩窄部被包含在微流体通道内。
5.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述缩窄部是孔或被包含在孔内。
6.根据实施方案5所述的方法，其中所述孔被包含在表面中。
7.根据实施方案6所述的方法，其中所述表面是过滤器。
8.根据实施方案6所述的方法，其中所述表面是膜。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述缩窄部大小是所述细胞直径的函数。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述缩窄部大小是所述细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含混合的细胞群。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液是全血。
13.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含纯化的细胞群。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊或兔细胞。
16.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含人细胞。
17.根据实施方案1-13中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含非哺乳动物细胞。
18.根据实施方案1-13或17中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含细菌、酵母、鸡、青蛙、昆虫或线虫细胞。
19.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含外周血单核细胞。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述产生抗体的细胞是免疫细胞。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述产生抗体的细胞是B细胞或B细胞前体。
22.根据实施方案21所述的方法，其中所述产生抗体的细胞是B细胞前体、幼稚B细胞、激活的B细胞、记忆B细胞、浆细胞、B-1细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、调节性B细胞或B细胞淋巴瘤细胞。
23.根据实施方案21或22所述的方法，其中所述产生抗体的细胞是骨髓源性B细胞前体。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物包含核酸。
25.根据实施方案24所述的方法，其中所述核酸编码siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、saRNA或shRNA。
26.根据实施方案24所述的方法，其中所述核酸是质粒。
27.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物包含肽核酸。
28.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物包含蛋白质-核酸复合物。
29.根据实施方案28所述的方法，其中所述蛋白质-核酸复合物包含Cas9蛋白和指导RNA。
30.根据实施方案29所述的方法，其还包含供体DNA。
31.根据实施方案24所述的方法，其中所述核酸编码Cas9蛋白和指导RNA。
32.根据实施方案31所述的方法，其还包含供体DNA。
33.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物包含蛋白质或多肽。
34.根据实施方案33所述的方法，其中所述蛋白质是TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶或CRE重组酶。
35.根据实施方案33所述的方法，其中所述蛋白质是转录因子。
36.根据实施方案33所述的方法，其中所述蛋白质是转座酶或整合酶。
37.根据实施方案33所述的方法，其中所述蛋白质是抗凋亡蛋白。
38.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是B细胞激活因子。
39.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是增殖诱导配体。
40.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是B细胞受体信号传导分子的激活剂。
41.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是ATP。
42.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是细胞激活因子。
43.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是细胞分化因子。
44.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是小分子。
45.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是在纳米颗粒中。
46.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是在脂质体中。
47.根据实施方案24所述的方法，其中所述化合物是在病毒、病毒颗粒或包含病毒衣壳的媒介物中。
48.根据实施方案24所述的方法，其中所述化合物是在腺相关病毒、腺相关病毒颗粒或包含腺相关病毒衣壳的媒介物中。
49.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述抗体是人或人源化抗体。
50.根据实施方案1-49中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗原结合抗体变体。
51.根据实施方案1-50中任一项所述的方法，其中所述抗体类别是IgM、IgG、IgA、IgE或IgD。
52.根据实施方案1-50中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗原结合抗体片段。
53.根据实施方案52所述的方法，其中所述抗体是Fab、Fab’、Fab’-SH、Fab2、F(ab’)2、Fv、scFv、scFab或dsFv片段。
54.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述抗体是全长抗体。
55.根据实施方案1-50中任一项所述的方法，其中所述抗体是单结构域抗体、纳米抗体、VHH或VNAR抗体片段。
56.根据实施方案1-50中任一项所述的方法，其中所述抗体是单链抗体。
57.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述抗体是多特异性抗体。
58.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗体融合蛋白。
59.根据实施方案1-58中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述化合物接触。
60.根据实施方案1-2中任一项所述的方法，其中所述通道包括约30μm的缩窄部长度和约4μm的缩窄部宽度。
61.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述通道包括约10μm的缩窄部长度和约4μm的缩窄部宽度。
62.根据实施方案1-3或5中任一项所述的方法，其中所述孔大小为约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。
63.根据实施方案1-62中任一项所述的方法，其中所述方法是在约-5℃与约45℃之间进行。
64.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述内源性抗体产生改变了至少约25％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％或大于约200％。
65.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中与由未通过所述缩窄部的细胞得到的抗体产生相比，所述内源性抗体产生持续约25％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％或大于约200％更长的时间。
66.一种通过将根据实施方案1-16或19-65中任一项修饰的产生抗体的免疫细胞引入患者来治疗所述患者的方法。
67.根据实施方案66所述的方法，其中将所述细胞从患者分离，根据实施方案1-16或19-65中任一项所述的方法进行修饰并引入回所述患者中。
68.根据实施方案66所述的方法，其中将所述细胞从不同个体分离，根据实施方案1-16或19-65中任一项所述的方法进行修饰并引入患者中。
69.一种通过将根据实施方案1-16或19-65中任一项修饰的产生抗体的免疫细胞引入个体来增强所述个体中的抗体产生的方法。
70.根据实施方案69所述的方法，其中将所述细胞从个体分离，根据实施方案1-16或19-65中任一项所述的方法进行修饰并引入回所述个体中。
71.根据实施方案69所述的方法，其中将所述细胞从个体分离，根据实施方案1-16或19-65中任一项所述的方法进行修饰并引入不同个体中。
72.根据实施方案1-71中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述细胞与由至少一个电极产生的电场接触的步骤。
73.一种系统，其包括用于实施方案1-72中任一项所述的方法中的所述缩窄部、细胞悬浮液和化合物。
74.根据实施方案73所述的系统，其还包括至少一个电极以产生电场。
75.一种用于诱导细胞中的从头抗体产生的方法，所述方法包括使细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得引发抗体产生的化合物进入所述细胞，其中诱导了在所述细胞中的从头抗体产生。
76.根据实施方案75所述的方法，其中所述缩窄部被包含在微流体通道内。
77.根据实施方案75所述的方法，其中所述缩窄部是孔或被包含在孔内。
78.根据实施方案77所述的方法，其中所述孔被包含在表面中。
79.根据实施方案78所述的方法，其中所述表面是过滤器。
80.根据实施方案78所述的方法，其中所述表面是膜。
81.根据实施方案75-80中任一项所述的方法，其中所述缩窄部大小是所述细胞直径的函数。
82.根据实施方案75-81中任一项所述的方法，其中所述缩窄部大小是所述细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。
83.根据实施方案75-82中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含混合的细胞群。
84.根据实施方案75-83中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液是全血。
85.根据实施方案75-84中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含纯化的细胞群。
86.根据实施方案75-85中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。
87.根据实施方案75-86中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊或兔细胞。
88.根据实施方案75-86中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含人细胞。
89.根据实施方案75-85中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含非哺乳动物细胞。
90.根据实施方案75-85或89中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含细菌、酵母、鸡、青蛙、昆虫或线虫细胞。
91.根据实施方案75-89中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含外周血单核细胞。
92.根据实施方案75-91中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞、干细胞、骨髓源性祖细胞、红细胞前体、成纤维细胞、心肌细胞或细胞系细胞。
93.根据实施方案75-92中任一项所述的方法，其中所述细胞是B细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞或干细胞。
94.根据实施方案75-93中任一项所述的方法，其中所述细胞是B细胞或B细胞前体。
95.根据实施方案94所述的方法，其中所述细胞是B细胞前体、幼稚B细胞、激活的B细胞、记忆B细胞、浆细胞、B-1细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、调节性B细胞或B细胞淋巴瘤细胞。
96.根据实施方案94或95所述的方法，其中所述细胞是骨髓源性B细胞前体。
97.根据实施方案75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物包含核酸。
98.根据实施方案97所述的方法，其中所述核酸编码免疫球蛋白。
99.根据实施方案98所述的方法，其中所述核酸被整合到所述细胞基因组中。
100.根据实施方案98所述的方法，其中所述核酸未被整合到所述细胞基因组中。
101.根据实施方案97所述的方法，其中所述核酸编码siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、saRNA或shRNA。
102.根据实施方案97所述的方法，其中所述核酸是质粒。
103.根据实施方案75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物包含肽核酸。
104.根据实施方案75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物包含蛋白质-核酸复合物。
105.根据实施方案104所述的方法，其中所述蛋白质-核酸复合物包含Cas9蛋白和指导RNA。
106.根据实施方案105所述的方法，其还包含供体DNA。
107.根据实施方案97所述的方法，其中所述核酸编码Cas9蛋白和指导RNA。
108.根据实施方案107所述的方法，其还包含供体DNA。
109.根据实施方案75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物包含蛋白质或多肽。
110.根据实施方案109所述的方法，其中所述蛋白质是TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶或CRE重组酶。
111.根据实施方案109所述的方法，其中所述蛋白质是转录因子。
112.根据实施方案109所述的方法，其中所述蛋白质是转座酶或整合酶。
113.根据实施方案75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是B细胞激活因子。
114.根据实施方案75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是增殖诱导配体。
115.根据实施方案75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是B细胞受体信号传导分子的激活剂。
116.根据实施方案75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是细胞激活因子。
117.根据实施方案75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是细胞分化因子。
118.根据实施方案75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是小分子。
119.根据实施方案75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是在纳米颗粒中。
120.根据实施方案75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是在脂质体中。
121.根据实施方案97所述的方法，其中所述化合物是在病毒、病毒颗粒或包含病毒衣壳的媒介物中。
122.根据实施方案97所述的方法，其中所述化合物是在腺相关病毒、腺相关病毒颗粒或包含腺相关病毒衣壳的媒介物中。
123.根据实施方案75-122中任一项所述的方法，其中所述抗体是人或人源化抗体。
124.根据实施方案75-123中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗原结合抗体变体。
125.根据实施方案75-124中任一项所述的方法，其中所述抗体类别是IgM、IgG、IgA、IgE或IgD。
126.根据实施方案75-124中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗原结合抗体片段。
127.根据实施方案126所述的方法，其中所述抗体是Fab、Fab’、Fab’-SH、Fab2、F(ab’)2、Fv、scFv、scFab或dsFv片段。
128.根据实施方案75-125中任一项所述的方法，其中所述抗体是全长抗体。
129.根据实施方案75-124中任一项所述的方法，其中所述抗体是单结构域抗体、纳米抗体、VHH或VNAR抗体片段。
130.根据实施方案75-124中任一项所述的方法，其中所述抗体是单链抗体。
131.根据实施方案75-125中任一项所述的方法，其中所述抗体是多特异性抗体。
132.根据实施方案75-125中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗体融合蛋白。
133.根据实施方案75-132中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述化合物接触。
134.根据实施方案75-76中任一项所述的方法，其中所述通道包括约30μm的缩窄部长度和约4μm的缩窄部宽度。
135.根据实施方案75-76中任一项所述的方法，其中所述通道包括约10μm的缩窄部长度和约4μm的缩窄部宽度。
136.根据实施方案75或77中任一项所述的方法，其中所述孔大小为约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。
137.根据实施方案75-136中任一项所述的方法，其中所述方法是在约-5℃与约45℃之间进行。
138.一种通过将根据实施方案75-88或91-137中任一项修饰的细胞引入患者来治疗所述患者的方法。
139.根据实施方案138所述的方法，其中将所述细胞从患者分离，根据实施方案75-88或91-137中任一项所述的方法进行修饰并引入回所述患者中。
140.根据实施方案138所述的方法，其中将所述细胞从不同个体分离，根据实施方案75-88或91-137中任一项所述的方法进行修饰并引入患者中。
141.一种通过将根据实施方案75-88或91-137中任一项修饰的细胞引入个体来诱导在所述个体中的从头抗体产生的方法。
142.根据实施方案141所述的方法，其中将所述细胞从个体分离，根据实施方案75-88或91-137中任一项所述的方法进行修饰并引入回所述个体中。
143.根据实施方案141所述的方法，其中将所述细胞从个体分离，根据实施方案75-88或91-137中任一项所述的方法进行修饰并引入不同个体中。
144.根据实施方案75-143中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述细胞与由至少一个电极产生的电场接触的步骤。
145.一种系统，其包括用于实施方案75-144中任一项所述的方法中的所述缩窄部、细胞悬浮液和化合物。
146.根据实施方案145所述的系统，其还包括至少一个电极以产生电场。
XIV.实施例
出于说明本公开文本的各种实施方案的目的给出以下实施例，而不意味着以任何方式限制本公开文本。本领域技术人员将容易理解，本公开文本很好地适用于实现该目的并获得所提及的目标和优点以及本文固有的那些目的、目标和优点。本领域技术人员将会想到包含在由权利要求书的范围限定的本公开文本的精神内的其中的变化以及其他用途。
实施例1：用于诱导从头B细胞抗体产生的编码抗体的mRNA的缩窄部介导的递送
从C57BL/6J雌性小鼠收获脾脏，并将其通过70μm细胞过滤网捣碎。将红细胞裂解，并按照说明书使用B细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从细胞悬浮液进一步分离B细胞。将B细胞以1-10X106个细胞/mL的浓度悬浮于PBS中，其中mRNA的浓度为0.1-0.4mg/mL。作为对照，在无mRNA的情况下处理B细胞。将细胞悬浮液在90psi的压力下通过10-4芯片或30-4芯片处理。处理后，将细胞在R10中洗涤三次，在中间进行离心，并且最后重悬于R10中，并以10-50,000个细胞/孔铺板于96孔u型底中，其中有R848 1ug/ml+IL-2100单位/ml。将细胞培养3天，然后将上清液收集并通过ELISA测定总抗体含量。将由递送了mRNA的B细胞产生的总抗体含量与由未接受mRNA的B细胞产生的总抗体进行比较。
实施例2：用于增强B细胞抗体产生的化合物的缩窄部介导的递送
从C57BL/6J雌性小鼠收获脾脏，并将其通过70μm细胞过滤网捣碎。将红细胞裂解，并按照说明书使用B细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从细胞悬浮液进一步分离B细胞。将B细胞以1-10X106个细胞/mL的浓度悬浮于具有用于增强B细胞抗体产生的PBS中。作为对照，在无所述化合物的情况下处理B细胞。将细胞悬浮液在90psi的压力下通过10-4芯片或30-4芯片处理。处理后，将细胞在R10中洗涤三次，在中间进行离心，并且最后重悬于R10中，并以10-50,000个细胞/孔铺板于96孔u型底中，其中有R848 1ug/ml+IL-2 100单位/ml。将细胞培养3天，然后将上清液收集并通过ELISA测定总抗体含量。将由递送了所述化合物的B细胞产生的总抗体含量与由未接受所述化合物的B细胞产生的总抗体进行比较。
Claims (146)
1.一种改变在产生抗体的细胞中的内源性抗体产生的方法，所述方法包括使包含所述产生抗体的细胞的细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得改变抗体产生的化合物进入所述产生抗体的细胞，其中改变了在所述产生抗体的细胞中的内源性抗体产生。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述内源性抗体产生被增强。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述内源性抗体产生被减少。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述缩窄部被包含在微流体通道内。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述缩窄部是孔或被包含在孔内。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述孔被包含在表面中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述表面是过滤器。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述表面是膜。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述缩窄部大小是所述细胞直径的函数。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述缩窄部大小是所述细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含混合的细胞群。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液是全血。
13.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含纯化的细胞群。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊或兔细胞。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含人细胞。
17.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含非哺乳动物细胞。
18.根据权利要求1-13或17中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含细菌、酵母、鸡、青蛙、昆虫或线虫细胞。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含外周血单核细胞。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述产生抗体的细胞是免疫细胞。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述产生抗体的细胞是B细胞或B细胞前体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述产生抗体的细胞是B细胞前体、幼稚B细胞、激活的B细胞、记忆B细胞、浆细胞、B-1细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、调节性B细胞或B细胞淋巴瘤细胞。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述产生抗体的细胞是骨髓源性B细胞前体。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物包含核酸。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述核酸编码siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、saRNA或shRNA。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述核酸是质粒。
27.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物包含肽核酸。
28.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物包含蛋白质-核酸复合物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述蛋白质-核酸复合物包含Cas9蛋白和指导RNA。
30.根据权利要求29所述的方法，其还包含供体DNA。
31.根据权利要求24所述的方法，其中所述核酸编码Cas9蛋白和指导RNA。
32.根据权利要求31所述的方法，其还包含：供体DNA。
33.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物包含蛋白质或多肽。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述蛋白质是TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶或CRE重组酶。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述蛋白质是转录因子。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述蛋白质是转座酶或整合酶。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述蛋白质是抗凋亡蛋白。
38.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是B细胞激活因子。
39.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是增殖诱导配体。
40.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是B细胞受体信号传导分子的激活剂。
41.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是ATP。
42.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是细胞激活因子。
43.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是细胞分化因子。
44.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是小分子。
45.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是在纳米颗粒中。
46.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述化合物是在脂质体中。
47.根据权利要求24所述的方法，其中所述化合物是在病毒、病毒颗粒或包含病毒衣壳的媒介物中。
48.根据权利要求24所述的方法，其中所述化合物是在腺相关病毒、腺相关病毒颗粒或包含腺相关病毒衣壳的媒介物中。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述抗体是人或人源化抗体。
50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗原结合抗体变体。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述抗体类别是IgM、IgG、IgA、IgE或IgD。
52.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗原结合抗体片段。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗体是Fab、Fab’、Fab’-SH、Fab2、F(ab’)2、Fv、scFv、scFab或dsFv片段。
54.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述抗体是全长抗体。
55.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述抗体是单结构域抗体、纳米抗体、VHH或VNAR抗体片段。
56.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述抗体是单链抗体。
57.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述抗体是多特异性抗体。
58.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗体融合蛋白。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述化合物接触。
60.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述通道包括约30μm的缩窄部长度和约4μm的缩窄部宽度。
61.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述通道包括约10μm的缩窄部长度和约4μm的缩窄部宽度。
62.根据权利要求1-3或5中任一项所述的方法，其中所述孔大小为约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中所述方法是在约-5℃与约45℃之间进行。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述内源性抗体产生改变了至少约25％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％或大于约200％。
65.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中与由未通过所述缩窄部的细胞得到的抗体产生相比，所述内源性抗体产生持续约25％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％或大于约200％更长的时间。
66.一种通过将根据权利要求1-16或19-65中任一项修饰的产生抗体的免疫细胞引入患者来治疗所述患者的方法。
67.根据权利要求66所述的方法，其中将所述细胞从患者分离，根据权利要求1-16或19-65中任一项所述的方法进行修饰并引入回所述患者中。
68.根据权利要求66所述的方法，其中将所述细胞从不同个体分离，根据权利要求1-16或19-65中任一项所述的方法进行修饰并引入患者中。
69.一种通过将根据权利要求1-16或19-65中任一项修饰的产生抗体的免疫细胞引入个体来增强所述个体中的抗体产生的方法。
70.根据权利要求69所述的方法，其中将所述细胞从个体分离，根据权利要求1-16或19-65中任一项所述的方法进行修饰并引入回所述个体中。
71.根据权利要求69所述的方法，其中将所述细胞从个体分离，根据权利要求1-16或19-65中任一项所述的方法进行修饰并引入不同个体中。
72.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述细胞与由至少一个电极产生的电场接触的步骤。
73.一种系统，其包括用于权利要求1-72中任一项所述的方法中的所述缩窄部、细胞悬浮液和化合物。
74.根据权利要求73所述的系统，其进一步包括至少一个电极以产生电场。
75.一种用于诱导细胞中的从头抗体产生的方法，所述方法包括使细胞悬浮液通过缩窄部，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得引发抗体产生的化合物进入所述细胞，其中诱导了在所述细胞中的从头抗体产生。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述缩窄部被包含在微流体通道内。
77.根据权利要求75所述的方法，其中所述缩窄部是孔或被包含在孔内。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述孔被包含在表面中。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述表面是过滤器。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述表面是膜。
81.根据权利要求75-80中任一项所述的方法，其中所述缩窄部大小是所述细胞直径的函数。
82.根据权利要求75-81中任一项所述的方法，其中所述缩窄部大小是所述细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。
83.根据权利要求75-82中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含混合的细胞群。
84.根据权利要求75-83中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液是全血。
85.根据权利要求75-84中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含纯化的细胞群。
86.根据权利要求75-85中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含哺乳动物细胞。
87.根据权利要求75-86中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊或兔细胞。
88.根据权利要求75-86中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含人细胞。
89.根据权利要求75-85中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含非哺乳动物细胞。
90.根据权利要求75-85或89中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含细菌、酵母、鸡、青蛙、昆虫或线虫细胞。
91.根据权利要求75-89中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含外周血单核细胞。
92.根据权利要求75-91中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞、干细胞、骨髓源性祖细胞、红细胞前体、成纤维细胞、心肌细胞或细胞系细胞。
93.根据权利要求75-92中任一项所述的方法，其中所述细胞是B细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞或干细胞。
94.根据权利要求75-93中任一项所述的方法，其中所述细胞是B细胞或B细胞前体。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述细胞是B细胞前体、幼稚B细胞、激活的B细胞、记忆B细胞、浆细胞、B-1细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、调节性B细胞或B细胞淋巴瘤细胞。
96.根据权利要求94或95所述的方法，其中所述细胞是骨髓源性B细胞前体。
97.根据权利要求75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物包含核酸。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述核酸编码免疫球蛋白。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述核酸被整合到所述细胞基因组中。
100.根据权利要求98所述的方法，其中所述核酸未被整合到所述细胞基因组中。
101.根据权利要求97所述的方法，其中所述核酸编码siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、saRNA或shRNA。
102.根据权利要求97所述的方法，其中所述核酸是质粒。
103.根据权利要求75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物包含肽核酸。
104.根据权利要求75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物包含蛋白质-核酸复合物。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述蛋白质-核酸复合物包含Cas9蛋白和指导RNA。
106.根据权利要求105所述的方法，其还包含：供体DNA。
107.根据权利要求97所述的方法，其中所述核酸编码Cas9蛋白和指导RNA。
108.根据权利要求107所述的方法，其还包含：供体DNA。
109.根据权利要求75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物包含蛋白质或多肽。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述蛋白质是TALEN蛋白、锌指核酸酶、大范围核酸酶或CRE重组酶。
111.根据权利要求109所述的方法，其中所述蛋白质是转录因子。
112.根据权利要求109所述的方法，其中所述蛋白质是转座酶或整合酶。
113.根据权利要求75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是B细胞激活因子。
114.根据权利要求75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是增殖诱导配体。
115.根据权利要求75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是B细胞受体信号传导分子的激活剂。
116.根据权利要求75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是细胞激活因子。
117.根据权利要求75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是细胞分化因子。
118.根据权利要求75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是小分子。
119.根据权利要求75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是在纳米颗粒中。
120.根据权利要求75-96中任一项所述的方法，其中所述化合物是在脂质体中。
121.根据权利要求97所述的方法，其中所述化合物是在病毒、病毒颗粒或包含病毒衣壳的媒介物中。
122.根据权利要求97所述的方法，其中所述化合物是在腺相关病毒、腺相关病毒颗粒或包含腺相关病毒衣壳的媒介物中。
123.根据权利要求75-122中任一项所述的方法，其中所述抗体是人或人源化抗体。
124.根据权利要求75-123中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗原结合抗体变体。
125.根据权利要求75-124中任一项所述的方法，其中所述抗体类别是IgM、IgG、IgA、IgE或IgD。
126.根据权利要求75-124中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗原结合抗体片段。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述抗体是Fab、Fab’、Fab’-SH、Fab2、F(ab’)2、Fv、scFv、scFab或dsFv片段。
128.根据权利要求75-125中任一项所述的方法，其中所述抗体是全长抗体。
129.根据权利要求75-124中任一项所述的方法，其中所述抗体是单结构域抗体、纳米抗体、VHH或VNAR抗体片段。
130.根据权利要求75-124中任一项所述的方法，其中所述抗体是单链抗体。
131.根据权利要求75-125中任一项所述的方法，其中所述抗体是多特异性抗体。
132.根据权利要求75-125中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗体融合蛋白。
133.根据权利要求75-132中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述化合物接触。
134.根据权利要求75-76中任一项所述的方法，其中所述通道包括约30μm的缩窄部长度和约4μm的缩窄部宽度。
135.根据权利要求75-76中任一项所述的方法，其中所述通道包括约10μm的缩窄部长度和约4μm的缩窄部宽度。
136.根据权利要求75或77中任一项所述的方法，其中所述孔大小为约0.4μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm或约14μm。
137.根据权利要求75-136中任一项所述的方法，其中所述方法是在约-5℃与约45℃之间进行。
138.一种通过将根据权利要求75-88或91-137中任一项修饰的细胞引入患者来治疗所述患者的方法。
139.根据权利要求138所述的方法，其中将所述细胞从患者分离，根据权利要求75-88或91-137中任一项所述的方法进行修饰并引入回所述患者中。
140.根据权利要求138所述的方法，其中将所述细胞从不同个体分离，根据权利要求75-88或91-137中任一项所述的方法进行修饰并引入患者中。
141.一种通过将根据权利要求75-88或91-137中任一项修饰的细胞引入个体来诱导在所述个体中的从头抗体产生的方法。
142.根据权利要求141所述的方法，其中将所述细胞从个体分离，根据权利要求75-88或91-137中任一项所述的方法进行修饰并引入回所述个体中。
143.根据权利要求141所述的方法，其中将所述细胞从个体分离，根据权利要求75-88或91-137中任一项所述的方法进行修饰并引入不同个体中。
144.根据权利要求75-143中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述细胞与由至少一个电极产生的电场接触的步骤。
145.一种系统，其包括用于权利要求75-144中任一项所述的方法中的所述缩窄部、细胞悬浮液和化合物。
146.根据权利要求145所述的系统，其还包括至少一个电极以产生电场。
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